WO2013119045A1 - 온도감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 및 신경분화용 조성물 - Google Patents

온도감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 및 신경분화용 조성물 Download PDF

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    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a neural differentiation composition necessary for inducing neuronal differentiation of mesenchymal stem cells in a temperature sensitive hydrogel and inducing differentiation into neurons. More specifically, the present invention provides an injection-type cell transporter through culturing mesenchymal stem cells and inducing differentiation into neurons in a temperature sensitive hydrogel.
  • Degenerative neurological disease means a neurological disease that cannot be cured because the underlying cause is unknown.
  • Representative degenerative neurological diseases include Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • Alzheimer's disease is a disease caused by the accumulation of amyloid protein in brain cells, and there are 27 million patients worldwide. The cause is unknown.
  • Parkinson's disease is a degenerative neurological disease caused by the breakdown of dopaminergic neurons in the substantia nigra (substantia nigra).
  • degenerative nervous system diseases are caused by central nervous system diseases caused by stroke, industrial accidents and traffic accidents. Recently, the application of stem cells has emerged as a treatment for such degenerative neurological diseases.
  • Stem cells are cells that continue to replicate in an undifferentiated state and can differentiate into specific cells under specific culture conditions, and are classified into embryonic stem cells and adult stem cells. Embryonic stem cells have infinite differentiation capacity, but there are ethical issues and risks of tumor formation when embryonic stem cells are transplanted.
  • Adult stem cells are stem cells that exist in mature tissues. Has the ability but high safety.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • cartilage cells adipocytes, muscle cells, etc.
  • Woodbury succeeded in inducing differentiation into neurons rather than mesenchymal cells in 2000, and interest in treating degenerative neurological diseases using mesenchymal stem cells increased rapidly.
  • Cell transfer technology in degenerative neurological diseases is the technique of inducing differentiation of undifferentiated stem cells such as neural progenitor cells, adult stem cells, and embryonic stem cells into neurons, and delivering stem cells induced to differentiation into nerve cells to nerve damage sites. Means.
  • Conventional cell transfer technology is based on direct injection of differentiation-induced stem cells at the site of injury or delivery of cells using a scaffold, but this requires surgical surgery.
  • Temperature sensitive hydrogel is a polymer that shows a sudden change in solubility according to temperature change. It is an intelligent hydrogel that can be used as an injection without surgical operation by being in a sol state at room temperature and forming a gel near human temperature. Application of the temperature-sensitive hydrogel to cell delivery technology allows neuron differentiation-induced cells to be delivered to the site of injury as an injection without surgical intervention.
  • the present inventors have found a method for efficiently differentiating neurons into mesenchymal stem cells, and culturing and culturing stem cells in a temperature-sensitive hydrogel for use as a carrier of stem cells induced differentiation into neurons.
  • the present invention was completed through induction of differentiation.
  • An object of the present invention is to provide a method of preparing an injection for delivering neurons to an injury site without surgical operation by effectively inducing the culture of mesenchymal stem cells and inducing differentiation into neurons in a temperature sensitive hydrogel.
  • the proliferation of mesenchymal stem cells in the temperature-sensitive hydrogel occurs well and there is no influence on the induction of differentiation into neurons. Therefore, it is possible to use the temperature-sensitive hydrogel as an injection delivery vehicle of cell delivery technology. I want to show
  • the present invention cell culture substrate; It provides a temperature-sensitive support for the purpose of inducing neuronal differentiation of mesenchymal stem cells comprising a; and gelled temperature-sensitive hydrogel applied to the cell culture substrate.
  • the temperature sensitive hydrogel is in a sol state at room temperature, and may be gelated at 30 ° C. or higher.
  • the present invention also comprises the steps of dispensing and gelling the temperature-sensitive hydrogel; Seeding the mesenchymal stem cells on the temperature sensitive hydrogel and inducing differentiation into neural progenitor cells; It provides a method for obtaining neurons using a temperature-sensitive hydrogel comprising a; and inducing the neural precursor cells to neurons.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from bone marrow, muscle or fat.
  • Inducing differentiation into neural progenitor cells includes basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (PDGF), pigment epithelium derived factor, PEDF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), epidermal growth factor (EGF), neuronal proliferation
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • PEDF pigment epithelium derived factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • EGF epidermal growth factor
  • NGF growth factor
  • other neurotrophic factors may be selected and used as a growth factor to induce mesenchymal stem cells to neuronal progenitor cells.
  • Serum may be contained in the growth factor treatment, and the step of inducing the neural progenitor cells into the neural cells may differentiate the neural progenitor cells into the neural cells using valonic acid.
  • concentration of valonic acid may be 0.5-4 mmol / L, more preferably 0.5-2 mmol / L.
  • potassium chloride 10-40 mmol / L, insulin 1-10 g / mL, forskolin 1-30 mol / L, hydrocortisone 0.1-5 mol / L may be added.
  • the temperature sensitive hydrogel is Pluronic (Poly (ethylen oxide) poly (propylene oxide) poly (ethylene oxide), Pluronic), polycaprolactone (PCL), methoxy polyethylene glycol-polycaprolactone (MPEG-PCL), Methoxypolyethyleneglycol- (polycaprolactone-co-polylactide) (MPEG- (PCL-co-PLLA)), carboxymethylcellulose (CMC), algin, alginic acid or alginate, polypeptide or protein, gelatin or casein, One or two or more selected from chitin derivatives and chitosan may be included.
  • the present invention also comprises the steps of seeding the mesenchymal stem cells in the gelled temperature sensitive hydrogel to differentiate into neural progenitor cells and induction into neurons; Solvating the temperature sensitive hydrogel; It provides a method for producing a neuron-containing temperature-sensitive hydrogel injection comprising a; and obtaining an injection comprising the obtained neuron and the temperature-sensitive hydrogel.
  • the present invention also provides a composition for treating neurological diseases comprising a neuron and a temperature sensitive hydrogel obtained by the above obtaining method.
  • the neurological disease may be any one of central nervous system diseases caused by Alzheimer's disease, Parkinson's disease, stroke and spinal cord injury.
  • Neuronal differentiation of mesenchymal stem cells according to the present invention could be induced relatively simply using a medium having a suitable composition, and even in a temperature sensitive hydrogel through induction of neuronal mesenchymal stem cells in a temperature sensitive hydrogel and induction of neuronal differentiation.
  • Proliferation of mesenchymal stem cells occurs and does not affect the induction of differentiation into neurons, and thermosensitive hydrogel is a neurotransmitter of neuronal differentiation-induced mesenchymal stem cells, which can be used to inject cells in injection form without surgery. There is an advantage that it can.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process of inducing neuronal differentiation according to the present invention.
  • Figure 2 is an image showing the phase change behavior according to the temperature of the prepared chitosan hydrogel after performing Experimental Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the result of measuring the viscosity of chitosan hydrogel after performing Experimental Example 2.
  • DMEM medium 4 shows the mesenchyme in DMEM medium containing (a) DMEM medium, (b) DMEM medium containing basic fibroblast growth factor, and (c) basic fibroblast growth factor and fetal calf serum after performing Experimental Example 3. It is an image showing the morphology change of stem cells.
  • Figure 5 is carried out after Experiment 4, (a) the growth factor and the group was not treated with valphonic acid, and valonic acid (b) 0.5 mmol / L, (c) 1 mmol / L, (d) 2 mmol / L, (e) Image showing morphology change of mesenchymal stem cells at (1) 1 day, (2) 4 day, and (3) 7 day by 4 mmol / L.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of cytotoxicity evaluation of mesenchymal stem cells according to the concentration of valonic acid after performing Experimental Example 5 (* P ⁇ 0.05).
  • FIG. 13 is an image showing a protein band through Western blotting after performing Experimental Example 10.
  • 15 is a schematic view showing the preparation of the preparation by injection in the method of Example 8.
  • the present invention provides an injection-type cell carrier for inducing neuronal differentiation of mesenchymal stem cells made in a temperature sensitive hydrogel.
  • a temperature-sensitive support for the purpose of inducing neuronal differentiation of mesenchymal stem cells comprising a cell culture substrate, and gelled temperature sensitive hydrogel applied to the cell culture substrate.
  • Temperature-sensitive hydrogel is a polymer that shows a sudden change with the change of temperature.
  • a temperature-sensitive hydrogel exists in a sol state at room temperature and forms a gel near human body temperature.
  • Such temperature sensitive hydrogels can be used in the form of injections without surgical intervention.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from bone marrow, muscle or fat.
  • the differentiation of stem cells into cultures and neurons, followed by mixing with a temperature sensitive hydrogel to make injections firstly requires the neural cells to be separated and separated and mixed with a temperature sensitive hydrogel, and secondly, Differentiated neurons are not preferred because they have a problem of being exposed to a sudden environment different from that of the culture and differentiation.
  • the temperature-sensitive hydrogel is a sol state at room temperature, it can be used that gelled at 30 °C or more, more preferably has a property that is gelled at a body temperature of about 37 °C, biodegradable and biodegradable material is limited Can be used without it.
  • Pluronic Poly (ethylen oxide) poly (propylene oxide) poly (ethylene oxide), Pluronic), polycaprolactone (PCL), methoxypolyethylene glycol-polycaprolactone (MPEG-PCL), methoxypolyethylene Glycol- (polycaprolactone-co-polylactide) (MPEG- (PCL-co-PLLA)), carboxymethylcellulose (CMC), algin, alginic acid or alginate, polypeptide or protein, gelatin or casein, chitin derivatives and At least one selected from chitosan is preferably included.
  • the polymer may be added to a phosphate buffer solution or the like to be prepared as a hydrogel, but is not limited thereto. Various preparation methods may be used according to the type of the polymer.
  • the step of dispensing and gelling the temperature-sensitive hydrogel sowing the mesenchymal stem cells to the temperature-sensitive hydrogel and induce differentiation into neuronal precursor cells, and neuronal precursor cells Inducing into neurons.
  • the present invention enables the proliferation of stem cells in the temperature sensitive hydrogel through the culture of the mesenchymal stem cells and differentiation into the neurons in the temperature sensitive hydrogel, and does not affect the induction of differentiation into the neurons. It has been found that temperature sensitive hydrogels can be usefully used.
  • thermosensitive hydrogel is dispensed and gelled. Dedicated descriptions of temperature sensitive hydrogels are omitted.
  • the mesenchymal stem cells are sown on the temperature sensitive hydrogel to induce differentiation into neural progenitor cells.
  • Inducing differentiation into neural progenitor cells is characterized in that mesenchymal stem cells are first induced into neural progenitor cells using proliferation factors.
  • mesenchymal stem cells can be cultured in DMEM medium before differentiating mesenchymal stem cells into neural progenitor cells.
  • DMEM medium containing 5% fetal calf serum, 5% horse serum and 1% penicillin-streptomycin.
  • the medium used for differentiation into neuroprogenitor cells is not limited as long as it can achieve the desired differentiation induction.
  • DMEM medium containing serum may be used, since differentiation of cells may not occur if serum is not present.
  • DMEM medium containing 10-30% serum may be used.
  • Proliferation factors for differentiating mesenchymal stem cells into neural progenitor cells include basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and epithelial cell growth factor ( epidermal growth factor (EGF), nerve growth factor (Nerve growth factor, NGF) can be achieved by treatment for 12 to 24 hours in a medium containing at least one selected growth factor.
  • basic fibroblast growth factor (bFGF) is preferable.
  • nerve precursor cells are induced into neurons.
  • BHA butylated hydroxyanisole
  • VA valproic acid
  • At least one or more of neuronal differentiation inducers such as retinoic acid (RA) may be used.
  • RA retinoic acid
  • valonic acid can be used.
  • the concentration of valonic acid is preferably in the range of 0.5 to 4 mmol / L, particularly in the range of 0.5 to 2 mmol / L (see Examples described later). If less than 0.5 mmol / L induction of differentiation effect to the neurons is less than, if more than 2 mmol / L may be a problem due to the death of neurons due to cytotoxicity.
  • Neuronal differentiation-induced cells by adding potassium chloride 10-40 mmol / L, insulin 1-10 g / mL, forskolin 1-30 mol / L, and hydrocortisone 0.1-5 mol / L after the treatment with valproic acid It is maintained, the differentiation induction time to neurons is preferably 5 hours or more.
  • the present invention also comprises seeding mesenchymal stem cells into gelled temperature sensitive hydrogels to differentiate into neural progenitor cells and inducing them into neurons, soaking the temperature sensitive hydrogels, and solvated with the obtained neurons. It provides a method for producing a neuron-containing temperature-sensitive hydrogel injection, comprising the step of obtaining an injection comprising a temperature-sensitive hydrogel.
  • the present invention confirmed that the temperature-sensitive hydrogel can be used as a cell transporter through the proliferation and differentiation of stem cells in the temperature-sensitive hydrogel which exists in a sol state at room temperature and forms a gel near human temperature.
  • the neurons distributed in the solvated thermosensitive hydrogel can be obtained by soaking the thermosensitive hydrogel.
  • Injectable forms are preferred as the formulation of the cell carrier, but are not limited thereto, and may be prepared in various formulations for treating neurological diseases.
  • Such neurological disease treatment compositions may include neurons and temperature sensitive hydrogels obtained by the method described above.
  • Neurological diseases are not limited but may be any of central nervous system diseases caused by Alzheimer's disease, Parkinson's disease, stroke and spinal cord injury.
  • Example 1 Preparation of temperature sensitive hydrogel using chitosan
  • a temperature sensitive hydrogel using chitosan having a viscosity of 200 to 800 cP (medium molecular weight, Sigma Aldrich Co.)
  • 0.4 g of chitosan was added to 18 ml of 0.1 mol / L acetic acid to prepare a chitosan solution.
  • Beta-glycerol phosphate disodium salt hydrate ( ⁇ -GP, Sigma Aldrich Co.) was dissolved in phosphate buffer solution so as to be 30 wt% with respect to 4 mL of the prepared chitosan solution, and slowly added to the chitosan solution using a syringe.
  • the prepared chitosan hydrogel was stabilized by storing at 4 °C for one day.
  • the vial tilting method was performed before and after storing the chitosan temperature sensitive hydrogel prepared in Example 1 at 37 ° C.
  • the viscosity of the chitosan hydrogel prepared in Example 1 was measured using a viscometer (Brookfield Engineering Laboratories, Inc., MA USA).
  • Mesenchymal stem cells were cultured in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum, 5% horse serum and 1% penicillin-streptomycin during passage. After seeding the mesenchymal stem cells with a well plate, the cells were incubated for 24 hours in DMEM medium containing 20% fetal bovine serum and containing 20% fetal bovine serum and 10 ng / ml basic fibroblast growth factor. Differentiation into neuroprogenitor cells was induced for 12-24 hours using DMEM medium.
  • Valfuric acid which is used as a therapeutic agent for neurological diseases, was used to induce neural progenitor cells into neurons, and 0.5, 1, 2, and 4 mmol / L of Valfuric acid were used to determine the concentration of the neuronal differentiation inducers. Neuronal progenitor cells were induced to differentiate into neurons for 5 hours or more using DMEM medium.
  • Mesenchymal stem cells that did not induce neuronal differentiation were seeded in well plates, and then cultured in DMEM medium containing 20% fetal bovine serum for 24 hours, and treated with 12 to 24 hours using the same composition. Next, cultured for 5 hours or more using only DMEM medium.
  • Example 2 the morphology change by the proliferation factor and fetal bovine serum was observed in the process of inducing mesenchymal stem cells into neuronal progenitor cells.
  • Example 2 Cell morphologies of Example 2 and Comparative Example 1 were observed using a phase contrast microscope (Nicon ECLIPSETS100, JAPAN).
  • WST-1 assay was performed to evaluate the cytotoxicity according to the neuronal differentiation inducer concentration of Experimental Example 2.
  • WST-1 reagent was added at a ratio of 1/10 of the volume of the medium, and after treatment, the WST-1 reagent was incubated for 4 hours in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • cytotoxicity was evaluated by dispensing 100 ⁇ l into 96-well plates and measuring the absorbance at 450 nm through an EL808 ultra microplate reader (Bio-tek instrument, USA).
  • Example 2 In the process of Example 2 to induce differentiation of neural progenitor cells into neurons, neuronal differentiation of mesenchymal stem cells was induced using only 1 mmol / L of valonic acid.
  • Chitosan hydrogel prepared by the method of Example 1 was dispensed on a well plate to form a gel at 37 ° C, and mesenchymal stem cells were seeded therein to induce neuronal differentiation of mesenchymal stem cells in the same manner as in Example 3. It was.
  • Chitosan hydrogel prepared by the method of Example 1 was dispensed on a well plate to form a gel at 37 ° C.
  • mesenchymal stem cells that did not induce neuronal differentiation were cultured in the same manner as in Comparative Example 1.
  • Example 3 Comparative Example 2
  • Example 4 was carried out WST-1 assay in the same process as Experimental Example 5.
  • Chitosan hydrogel was dispensed into the well plate and hardened at 37 ° C., and then cultured by seeding mesenchymal stem cells.
  • the well plate cultured by inducing neuronal differentiation in the same manner as in Example 2 was rapidly cooled with liquid nitrogen and lyophilized and observed through a scanning electron microscope (SEM).
  • the chitosan hydrogel prepared by the method of Preparation Example 1 was dispensed on the well plate and hardened at 37 ° C., then rapidly cooled with liquid nitrogen and freeze-dried. Observation was made by scanning electron microscopy (SEM) (FIG. 9).
  • chitosan hydrogel was dispensed and hardened at 37 ° C., and then cultured by seeding mesenchymal stem cells labeled with green fluorescence with PKH67. After 4 days of incubation, the green fluorescence was confirmed by fixation with paraformaldehyde (Carl Zeizz, Germany) (FIG. 11), and confirmed by confocal laser microscopy (OLYMPUS, Japan) (FIG. 12).
  • Example 4 protein was isolated on day 1, day 4 and day 7 to confirm neuronal specific protein expression of neuronal differentiation induced stem cells.
  • the cell medium was removed, washed with phosphate buffer solution, and 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (Trypsin-EDTA) was added thereto, followed by treatment for 3 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 . It was.
  • the separated cells were centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes and proteins were separated using Liparisis buffer (AMRESCO, USA).
  • Example 5 Western blotting was performed using the protein separated using Example 5. In order to prevent nonspecific binding of the blotting membrane, it was treated with 0.1% tween-phosphate buffer solution (blocking buffer solution) containing 5 wt% skim milk. Next, the block buffer solution containing the primary antibody (Table 1) was treated at room temperature for 2 hours or at 4 ° C. overnight, and washed with 0.1% Tween-phosphate buffer solution at least 5 times, followed by attaching the secondary antibody at room temperature for 2 hours. . Finally, it was washed six times with 0.1% twin-phosphate solution.
  • block buffer solution containing the primary antibody (Table 1) was treated at room temperature for 2 hours or at 4 ° C. overnight, and washed with 0.1% Tween-phosphate buffer solution at least 5 times, followed by attaching the secondary antibody at room temperature for 2 hours. . Finally, it was washed six times with 0.1% twin-phosphate solution.
  • Example 6 In order to confirm the results of Example 6, it was measured using ImageQuant LAS 4000 mini (GE healthcare Bio-science AB, Japan), the program was used ImageQuant LAS 4000.
  • the protein band was quantified by using a program called Image J. After calculating the expression amount relative to ⁇ -actin, the expression amount of each group was divided by the expression amount compared to the control group.
  • Example 7 Preparation of Injectable Formulation Using Hydrogels Including Neuronal Differentiation-Induced Mesenchymal Stem Cells
  • Example 3 was performed after chitosan hydrogel was dispensed into the well plate.
  • the gelated chitosan hydrogel was collected in a centrifuge tube using a scraper, and then centrifuged at 4 ° C. and 2000 rpm for 5 minutes. Chitosan hydrogel dozed at 4 ° C. was taken using a syringe (FIG. 15).
  • thermosensitive hydrogel according to the present invention is a cell transporter of neuronal differentiation-induced mesenchymal stem cells, which is industrially useful because it can be used to inject cells in an injection form without surgical operation.

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Abstract

본 발명은 온도 감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도 및, 신경세포로의 분화 유도에 필요한 신경분화용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 온도감응성 하이드로젤에서 중간엽 줄기세포의 배양과 신경세포로의 분화 유도를 통하여 주사제형 세포전달체를 제공하기 위한 것이다.

Description

온도감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 및 신경분화용 조성물
본 발명은 온도 감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도 및, 신경세포로의 분화 유도에 필요한 신경분화용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 온도감응성 하이드로젤에서 중간엽 줄기세포의 배양과 신경세포로의 분화 유도를 통하여 주사제형 세포전달체를 제공하기 위한 것이다.
퇴행성 신경계 질환이란 근본적인 원인을 알 수 없어 완치가 되지 않는 신경계 질환을 의미한다. 대표적인 퇴행성 신경계 질환으로는 알츠하이머병과 파킨슨병 등이 있다. 알츠하이머병은 아밀로이드 단백질이 뇌세포에 쌓여 발생하는 질환으로 세계적으로 2700만 명의 환자가 있고, 그 원인은 밝혀지지 않고 있다. 또한 파킨슨병은 중뇌 흑핵(substantia nigra)에 있는 도파민 분비 세포(dopaminergic neuron)가 망가져 도파민이 분비되지 않아 발생하는 퇴행성 신경계 질환으로 요즘 급증하고 있는 추세이며, 이에 따라 도파민성 신경세포로의 분화에 대한 연구도 많이 진행되고 있다. 이외에도 뇌졸중, 산업 재해 및 교통사고에 의한 중추신경계 질환에 의해 퇴행성 신경계 질환이 발생하고 있다. 최근 이러한 퇴행성 신경계 질환의 치료법으로 줄기세포의 응용 가능성이 대두되었다.
줄기세포란 미분화 상태로 계속 복제되고 특정 배양 조건에서 특정 세포로 분화가 가능한 세포를 말하며 배아줄기세포와 성체줄기세포로 구분된다. 배아줄기세포는 무한한 분화능력을 가지나 윤리적 문제와 배아줄기세포를 이식했을 때 종양이 형성될 수 있는 위험이 있고, 성체줄기세포는 성숙된 조직에 존재하는 줄기세포로, 배아줄기세포에 비하여 제한된 분화능력을 가지나 안전성이 높다.
퇴행성 신경계 질환에 사용되는 성체줄기세포로는 대표적으로 신경유래 줄기세포가 존재한다. 그러나 신경유래 줄기세포는 뇌의 특정 부위에만 존재하며, 다량의 동질 세포를 얻기 어렵다. 이에 반해 성체줄기세포의 한 종류인 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 간단한 방법에 의해 다량의 동질 세포를 얻기 쉽고, 외부 환경에 의해 일반적으로 연골세포, 지방세포, 및 근육세포 등의 중간엽성의 세포로만 분화가 일어난다고 알려져 있었으나 2000년 Woodbury에 의해 중간엽성 세포가 아닌 신경세포로의 분화 유도에 성공하면서 중간엽 줄기세포를 이용한 퇴행성 신경계 질환의 치료에 대한 관심이 급증하였다.
상기 퇴행성 신경계 질환의 치료에 사용되는 신경세포로 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 특정 부위로 전달하기 위해서는 세포전달기술을 필요로 한다. 퇴행성 신경계 질환에서의 세포전달기술이란 신경전구세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포 등의 미분화 줄기세포를 신경세포로의 분화를 유도하여 신경 손상 부위로 신경세포로 분화 유도된 줄기세포를 전달하는 기술을 의미한다. 기존의 세포전달기술은 손상 부위에 분화 유도된 줄기세포를 직접적으로 주입하거나, 지지체를 이용해 세포를 전달하는데 기반을 두고 있으나 이는 외과적인 수술을 필요로 한다.
온도감응성 하이드로젤은 온도의 변화에 따라 용해도의 갑작스러운 변화를 보이는 고분자로써, 상온에서는 졸 상태로 존재하고 인체온도 부근에서는 젤을 형성함으로써 외과적인 수술 없이 주사제형으로 사용이 가능한 지능형 하이드로젤이다. 상기 온도감응성 하이드로젤을 세포전달기술에 적용하게 되면 외과적인 수술 없이 신경분화 유도된 세포를 주사제형으로서 손상 부위로 전달할 수 있게 된다.
이에 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 이용하여 효율적으로 신경세포로의 분화 방법을 발견하였고, 신경세포로 분화 유도된 줄기세포들의 전달체로 사용하기 위한 온도감응성 하이드로젤 내에서 줄기세포의 배양 및 신경세포로의 분화를 유도를 통하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 온도감응성 하이드로젤에서 중간엽 줄기세포의 배양 및 신경세포로의 분화 유도를 효과적으로 진행하여 신경세포를 외과적인 수술없이 손상 부위로 전달하기 위한 주사제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이에 따라 본 발명에서는 온도감응성 하이드로젤 내에서 중간엽 줄기세포의 증식이 잘 일어나고 신경세포로의 분화 유도에 대한 영향이 없으며, 따라서 세포전달기술의 주사제형 전달체로서 온도감응성 하이드로젤을 사용할 수 있다는 것을 보여주고자 한다.
상기의 과제를 해결하기 위한 수단으로서,
본 발명은 세포배양 기판; 및 상기 세포배양 기판에 도포되어 젤화된 온도감응성 하이드로젤;을 포함하여 이루어진 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도 용도의 온도 감응성 지지체를 제공한다. 상기 온도감응성 하이드로젤은 상온에서 졸 상태이며, 30℃ 이상에서 젤화될 수 있다.
본 발명은 또한, 온도감응성 하이드로젤을 분주하여 젤화하는 단계; 상기 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하고 신경전구세포로의 분화를 유도하는 단계; 및 신경전구세포를 신경세포로 유도하는 단계;를 포함하여 이루어진 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법을 제공한다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 근육 또는 지방 유래일 수 있다.
상기 신경전구세포로의 분화를 유도하는 단계는 염기성 섬유아세포 증식인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈소판 유래 증식인자 (platelet-derived growth factor, PDGF), 색소 상피성 인자 (pigment epithelium derived factor, PEDF), 뇌유래신경성장인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 인슐린 유사생장인자 (insulin-like growth factor-1, IGF-1), 상피세포 증식인자 (epidermal growth factor, EGF), 신경 증식인자 (nerve growth factor, NGF) 및 기타 향신경성 물질(neurotrophic factors) 중에서 적어도 하나 이상 선택되어 증식인자로 이용되어 중간엽 줄기세포를 신경전구세포로 유도할 수 있다.
상기 증식인자 처리시에 혈청을 함유할 수 있으며, 신경전구세포를 신경세포로 유도하는 단계는 발프론산을 이용하여 신경전구세포를 신경세포로 분화시킬 수 있다. 발프론산의 농도는 0.5 ~ 4 mmol/L, 보다 바람직하게는 0.5 ~ 2 mmol/L일 수 있다.
상기 발프론산의 처리 뒤에 염화포타슘 10~40 mmol/L, 인슐린 1~10 g/mL, 포스콜린 1~30 mol/L, 하이드로코티존 0.1~5 mol/L를 첨가할 수 있다.
상기 온도감응성 하이드로젤은 플루로닉 (Poly(ethylen oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide), Pluronic), 폴리카프로락톤 (PCL), 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 (MPEG-PCL), 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) (MPEG-(PCL-co-PLLA)), 카복시메틸셀룰로오스 (CMC), 알긴, 알긴산 또는 알지네이트, 폴리펩타이드 또는 단백질, 젤라틴 또는 카세인, 키틴 유도체 및 키토산 중에서 선택된 1종 또는 2개 이상이 포함되어 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 젤화된 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하여 신경전구세포로 분화시킨 후 신경세포로 유도하는 단계; 온도감응성 하이드로젤을 졸화시키는 단계; 및 상기 얻어진 신경세포와 졸화된 온도감응성 하이드로젤을 포함하는 주사제를 얻는 단계;를 포함하여 이루어진, 신경세포 함유 온도감응성 하이드로젤 주사제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기의 수득방법으로 수득된 신경세포와 온도감응성 하이드로젤을 포함하여 이루어진 신경질환 치료용 조성물을 제공한다. 상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 척수 손상에 의한 중추신경계 질환 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 신경분화는 그에 적합한 조성의 배지를 이용하여 비교적 간단히 유도할 수 있었고, 온도감응성 하이드로젤에서의 중간엽 줄기세포의 배양 및 신경분화 유도를 통해 온도감응성 하이드로젤내에서도 중간엽 줄기세포의 증식이 일어나고 신경세포로 분화 유도에 영향을 끼치지 않으며, 또한 온도감응성 하이드로젤은 신경분화 유도된 중간엽 줄기세포의 세포전달체로서 외과적인 수술 없이 주사제형으로 세포를 주입하는데 사용될 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 신경분화 유도의 과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 실험예 1을 실시한 후, 제조된 키토산 하이드로젤의 온도에 따른 상전이 거동을 보여주는 이미지이다.
도 3은 실험예 2를 실시한 후, 키토산 하이드로젤의 점도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 3을 실시한 후, (a) DMEM 배지, (b) 염기성 섬유아세포 증식인자를 포함한 DMEM 배지, 그리고 (c) 염기성 섬유아세포 증식인자 및 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서의 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화를 나타내는 이미지이다.
도 5는 실험예 4를 실시한 후, (a) 증식인자와 발프론산을 처리하지 않은 군, 그리고 발프론산 (b) 0.5 mmol/L, (c) 1 mmol/L, (d) 2 mmol/L, (e) 4 mmol/L에 의한 (1)1 일, (2) 4 일, (3) 7 일에서의 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화를 나타내는 이미지이다.
도 6은 실험예 5를 실시한 후, 발프론산의 농도에 따른 중간엽 줄기세포의 세포독성 평가의 결과를 나타내는 그래프이다(*P<0.05).
도 7은 실험예 6을 실시한 후, 1 mmol/L의 발프론산에 의한 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화를 관찰한 이미지이다. (a, b) 증식인자와 발프론산을 처리하지 않은 군, 그리고 (c, d) 발프론산에 의한 (1)1 일, (2) 4 일, (3) 7 일에서의 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화를 (a, c) 40배, (b, d) 100배로 관찰한 이미지이다.
도 8은 실험예 7을 실시한 후, 웰플레이트 및 키토산 하이드로젤에서의 세포독성 평가의 결과를 나타낸 그래프이다(*P<0.001).
도 9는 비교예 3을 실시한 후, 키토산 하이드로젤의 (a) 표면과 (b) 내부의 몰폴로지를 보여주는 이미지이다.
도 10은 실험예 8을 실시한 후, 키토산 하이드로젤 내에서 증식 및 분화된 중간엽 세포를 (a) ~ (d) 300배, (e) ~ (g) 200배의 배율로 관찰한 이미지이다.
도 11은 실험예 9를 실시한 후, 키토산 하이드로젤 표면에서의 세포 부착을 초록 형광을 통하여 관찰한 이미지이다.
도 12는 실험예 9를 실시한 후, 키토산 하이드로젤 표면에서의 세포 부착을 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰한 이미지이다.
도 13는 실험예 10을 실시한 후, 웨스턴 블로팅을 통한 단백질 밴드를 나타낸 이미지이다.
도 14는 실험예 10을 실시한 후, 각 항체에 대한 단백질 밴드를 β-actin 대비 발현량을 계산한 뒤 각 군의 발현량을 대조군 대비 발현량으로 나누어 수치화 한 그래프이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 15은 실시예 8의 방법으로 주사제형으로 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
이하, 도면 및 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기의 설명은 본 발명의 구체적 일례에 대한 것이므로, 비록 단정적, 한정적 표현이 있더라도 특허청구범위로부터 정해지는 권리범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 일실시예로서, 온도 감응성 하이드로젤에서 이루어진 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도 용도의 주사제형 세포전달체를 제공한다. 구체적 일례로서, 세포배양 기판, 및 상기 세포배양 기판에 도포되어 젤화된 온도감응성 하이드로젤;을 포함하여 이루어진 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도 용도의 온도 감응성 지지체를 제공한다. 온도 감응성 하이드로젤은 온도의 변화에 따라 갑작스러운 변화를 보이는 고분자로써, 일례로서 상온에서는 졸 상태로 존재하고 인체온도 부근에서는 젤을 형성하는 것이 존재한다. 이러한 온도 감응성 하이드로젤은 외과적인 수술 없이 주사제형으로 사용할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 근육 또는 지방 유래인 것을 사용할 수 있다.
줄기세포를 배양 및 신경세포로 분화시키고, 이후에 온도 감응성 하이드로젤과 혼합하여 주사제를 만드는 것은 첫째, 신경세포를 떼어내서 분리해야 하며, 온도 감응성 하이드로젤과 혼합해야 되는 불편함이 있고, 둘째, 분화된 신경세포가 배양 및 분화시의 환경과는 다른 갑작스런 환경에 노출되는 문제점이 있어 바람직하지 않다.
본 발명에서는 온도 감응성 하이드로젤을 적용하여, 하이드로젤에 줄기세포를 직접 파종하고 배양, 분화시킴으로써 상기의 문제점을 해결하였다.
상기 온도감응성 하이드로젤은 상온에서 졸 상태이며, 30℃ 이상에서 젤화되는 것을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 37℃ 내외의 체온에서 젤화되는 특성을 갖고, 생체 적합성을 갖고 생분해될 수 있는 재료라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 일례로, 플루로닉 (Poly(ethylen oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide), Pluronic), 폴리카프로락톤 (PCL), 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 (MPEG-PCL), 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) (MPEG-(PCL-co-PLLA)), 카복시메틸셀룰로오스 (CMC), 알긴, 알긴산 또는 알지네이트, 폴리펩타이드 또는 단백질, 젤라틴 또는 카세인, 키틴 유도체 및 키토산 중에서 선택된 1종 이상이 포함되어 제조되는 것이 좋다. 상기 고분자를 인산완충용액 등에 넣어 하이드로젤로 제조할 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니며, 고분자의 종류에 따라 다양한 제조 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예로서, 온도감응성 하이드로젤을 분주하여 젤화하는 단계, 상기 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하고 신경전구세포로의 분화를 유도하는 단계, 및 신경전구세포를 신경세포로 유도하는 단계를 포함한다. 본 발명자는 온도감응성 하이드로젤에서 중간엽 줄기세포의 배양 및 신경세포로의 분화를 통해 온도감응성 하이드로젤에서 줄기세포의 증식이 가능하며 신경세포로의 분화 유도에도 영향을 끼치지 않으며, 세포전달체로서 온도감응성 하이드로젤이 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
먼저, 온도감응성 하이드로젤을 분주하여 젤화한다. 온도 감응성 하이드로젤에 관하여 설명한 내용을 전용하고 설명을 생략한다.
다음, 상기 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하고 신경전구세포로의 분화를 유도한다. 신경전구세포로의 분화를 유도하는 단계는 증식인자를 이용하여 중간엽 줄기세포를 먼저 신경전구세포로 유도하는 것을 특징으로 한다.
한편, 중간엽 줄기세포를 신경전구세포로 분화시키기 전에, DMEM 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양할 수 있다. 일례로, 5%의 우태아혈청과 5%의 마혈청 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양할 수 있다.
신경전구세포로 분화시키기 위해 사용되는 배지로는 원하는 분화 유도를 달성할 수 있는 배지라면 제한되지 않는다. 일례로서, 혈청이 포함된 DMEM 배지를 이용할 수 있는데, 이는 혈청이 존재하지 않는 경우 세포의 분화가 일어나지 않을 수 있기 때문이다. 바람직하기로는 10~30%의 혈청이 포함된 DMEM 배지를 이용할 수 있다.
중간엽 줄기세포를 신경전구세포로 분화시키기 위한 증식인자로는, 염기성 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈소판 유래 증식인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 상피세포 증식인자(epidermal growth factor, EGF), 신경 증식인자(nerve growth factor, NGF) 중에서 적어도 하나 이상 선택된 증식인자를 포함하는 배지에서 12 ~ 24 시간 정도 처리함으로써 달성될 수 있다. 바람직하기로는 염기성 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)가 좋다.
다음, 신경전구세포를 신경세포로 유도한다. 신경세포로 분화시키기 위해서는 신경분화 유도물질로서 부틸 하이드록시아니솔 (butylated hydroxyanisole, BHA), 베타-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), 포스콜린 (forskolin), 발프론산 (valproic acid, VA), 레티노산 (retinoic acid, RA) 등의 신경분화 유도물질 중 적어도 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하기로는 발프론산을 이용할 수 있다.
이 때, 발프론산의 농도는 0.5 ~ 4 mmol/L 범위 내, 특히 0.5 ~ 2 mmol/L 범위내인 것이 좋음을 발견하였다(후술하는 실시예 참고). 0.5 mmol/L 미만에서는 신경세포로 분화유도 효과가 떨어지며, 2 mmol/L 을 넘어서는 경우에는 세포독성으로 인해 오히려 신경세포가 사멸하여 문제될 수 있다. 상기 발프론산의 처리 후에 염화포타슘 10~40 mmol/L, 인슐린 1~10 g/mL, 포스콜린 1~30 mol/L, 하이드로코티존 0.1~5 mol/L를 첨가하여 주면 신경분화 유도된 세포가 유지되며, 신경세포로의 분화유도 시간은 5시간 이상인 것이 좋다.
본 발명은 또한, 젤화된 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하여 신경전구세포로 분화시킨 후 신경세포로 유도하는 단계, 온도감응성 하이드로젤을 졸화시키는 단계, 및 상기 얻어진 신경세포와 졸화된 온도감응성 하이드로젤을 포함하는 주사제를 얻는 단계를 포함하여 이루어진, 신경세포 함유 온도감응성 하이드로젤 주사제의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 상온에서는 졸 상태로 존재하고 인체온도 부근에서는 젤을 형성하는 온도감응성 하이드로젤 내에서 줄기세포의 증식 및 분화를 통해 온도감응성 하이드로젤이 세포전달체로 사용 가능함을 확인하였다.
전술한 방법에 의해 신경세포로 유도한 후, 온도감응성 하이드로젤을 졸화시켜서 졸화된 온도감응성 하이드로젤내에 분포된 신경세포를 얻을 수 있다.
세포전달체의 제형으로서 주사제 형태가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 제형의 신경 질환 치료용 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 신경질환 치료용 조성물에는 전술한 방법으로 수득된 신경세포와 온도감응성 하이드로젤을 포함할 수 있다. 신경 질환은 제한되지 않으나 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 척수 손상에 의한 중추신경계 질환 중 어느 하나일 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 키토산을 이용한 온도감응성 하이드로젤의 제조
점성이 200 ~ 800 cP (medium molecular weight, Sigma Aldrich Co.)인 키토산을 이용하여 온도감응성 하이드로젤을 제조하기 위하여 먼저 0.1 mol/L 농도의 아세트산 18 ㎖에 0.4 g의 키토산을 넣어 키토산 용액을 제조하고 하루 동안 교반한다. 제조된 키토산 용액 4 ㎖에 대하여 30 wt%가 되도록 베타-글리세롤포스페이트 디소듐 솔트 하이드레이트 (β-GP, Sigma Aldrich Co.)를 인산완충용액에 녹여 주사기를 이용하여 키토산 용액에 천천히 첨가시켜 주었다. 제조된 키토산 하이드로젤은 4℃ 에서 하루 동안 보관하여 안정화 시켰다.
실험예 1: 키토산 하이드로젤의 바이알 기울임법 실시
실시예 1에서 제조한 키토산 온도감응성 하이드로젤을 37℃ 에서 보관하기 전과 후에 바이알 기울임법을 실시하였다.
그 결과, 상온에서는 졸 상태이고, 인체온도 부근에서는 젤 상태인 것을 확인할 수 있었고, 젤이 형성된 바이알에 3차 증류수를 첨가하여도 젤의 형태를 유지하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실험예 2: 키토산 하이드로젤의 점도 측정
실시예 1에서 제조한 키토산 하이드로젤의 점도를 점도계 (Brookfield Engineering Laboratories, Inc., MA USA)를 이용하여 측정하였다.
상기 실험의 결과, 키토산 하이드로젤의 점도가 인체 온도인 37℃ 부근에서 급격히 상승하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 2: 신경분화 유도물질의 농도에 따른 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도
중간엽 줄기세포는 계대 배양하는 동안 5%의 우태아혈청과 5%의 마혈청 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 웰플레이트로 중간엽 줄기세포를 파종하고 난 후, 20%의 우태아혈청을 포함하는 DMEM 배지로 24 시간을 배양하였고, 20%의 우태아혈청과 10 ng/㎖의 염기성 섬유아세포 증식인자를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 12 ~ 24 시간 동안 신경전구세포로의 분화를 유도하였다. 신경전구세포를 신경세포로 유도하기 위하여 신경계 질환 치료제로 사용되고 있는 발프론산 사용하였으며, 상기 신경분화 유도물질의 농도를 결정하기 위하여 각각 0.5, 1, 2, 4 mmol/L의 발프론산을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 신경전구세포를 신경세포로 5 시간 이상 분화 유도하였다.
비교예 1: 신경분화를 유도하지 않은 중간엽 줄기세포의 배양
신경분화를 유도하지 않은 중간엽 줄기세포는 웰플레이트로 파종하고 난 후, 20%의 우태아혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 24 시간을 배양하였고, 같은 조성의 배지를 이용하여 12 ~ 24 시간 처리해 준 다음 DMEM 배지만을 이용해서 5시간 이상 배양하였다.
실험예 3: 증식인자 및 우태아혈청에 의한 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 관찰
상기 실시예 2에서 중간엽 줄기세포를 신경전구세포로 유도하는 과정에서 증식인자와 우태아혈청에 의한 몰폴로지 변화를 관찰하였다.
그 결과, 증식인자와 우태아혈청에 의해 신경전구세포로 유도가 많이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
실험예 4: 신경분화 유도물질의 농도에 따른 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화 관찰
상기 실시예 2와 비교예 1의 세포 몰폴로지를 위상차 현미경 (Nicon ECLIPSETS100, JAPAN)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 0.5 mmol/L의 발프론산을 포함한 경우에는 신경세포로의 분화가 많이 일어나지 않은 반면, 1, 2, 4 mmol/L의 경우에는 신경세포로의 분화가 잘 일어났다. 그러나 2, 4 mmol/L의 경우에는 신경분화 유도물질의 독성에 의해 사멸된 세포의 몰폴로지를 관찰하였다(도 5).
실험예 5: 신경분화 유도물질의 농도에 따른 중간엽 줄기세포의 세포독성 평가
상기 실험예 2의 신경분화 유도물질 농도 별로 세포독성을 평가하기 위하여 WST-1 assay를 실시하였다. WST-1 시약은 배지 부피의 1/10 비로 넣어주었고, 시약을 처리한 후에는 37℃, 5% CO2의 배양기에서 4 시간 동안 배양하였다. 4 시간 후, 96-웰플레이트로 100 ㎕씩 분주하여 EL808 ultra microplate reader (Bio-tek instrument, USA)를 통해 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다.
다양한 농도의 발프론산에 대한 WST-1 assay를 실시한 결과와 실험예 4의 결과를 보았을 때(도 6), 발프론산의 경우, 0.5 ~ 2 mmol/L 범위, 특히 1 mmol/L의 농도가 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도에 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 1 mmol/L의 발프론산을 이용한 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도
상기 실시예 2의 과정에서 신경전구세포를 신경세포로 분화 유도하는 과정에서 1 mmol/L의 발프론산만을 이용하여 중간엽 줄기세포의 신경분화를 유도하였다.
실험예 6: 1 mmol/L의 발프론산에 의한 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화 관찰
상기 비교예 1과 실시예 3에 의한 중간엽 줄기세포의 몰폴로지 변화를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다(도 7).
실시예 4: 키토산 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도
웰플레이트에 실시예 1의 방법으로 제조한 키토산 하이드로젤을 분주하여 37℃에서 젤을 형성하였고, 여기에 중간엽 줄기 세포를 파종하여 실시예 3과 동일한 방법으로 중간엽 줄기세포의 신경분화를 유도하였다.
비교예 2: 키토산 하이드로젤 내에서 신경분화를 유도하지 않은 중간엽 줄기세포의 배양
웰플레이트에 실시예 1의 방법으로 제조한 키토산 하이드로젤을 분주하여 37℃에서 젤을 형성하였고, 여기에 비교예 1과 같은 방법으로 신경분화를 유도하지 않은 중간엽 줄기세포를 배양하였다.
실험예 7: 신경분화 유도물질 및 키토산 하이드로젤에 의한 세포독성 평가
상기 비교예 1, 실시예 3, 비교예 2, 실시예 4의 세포독성을 평가하기 위하여 실험예 5과 동일한 과정으로 WST-1 assay를 실시하였다.
1 mmol/L의 발프론산을 이용해 키토산 하이드로젤에서 신경분화를 유도하였을 때, 1 일, 4 일, 7 일로 갈수록 흡광도가 증가한 것을 보아 키토산 하이드로젤 내에서도 줄기세포가 증식한다는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
실험예 8: 온도감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 증식 확인
웰플레이트에 키토산 하이드로젤을 분주하고 37℃에서 굳힌 다음 중간엽 줄기세포를 파종하여 배양하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 신경분화를 유도하여 배양한 웰플레이트를 액체 질소를 이용해 급속으로 냉각 시키고 이를 동결 건조하여 주사전자현미경 (SEM)을 통해 관찰하였다.
그 결과, 키토산 하이드로젤 내에서 중간엽 줄기세포 및 분화된 중간엽 줄기세포 몰폴로지를 확인할 수 있었고, 이를 통해 키토산 하이드로젤 내에서 중간엽 줄기세포의 증식 및 분화용 배양을 유도하는 것을 확인 하였다(도 10).
비교예 3: 주사전자현미경을 통한 키토산 하이드로젤의 몰폴로지 관찰
세포가 증식하지 않은 키토산 하이드로젤만의 몰폴로지를 보기 위해 웰플레이트에 제조예 1의 방법으로 제조한 키토산 하이드로젤을 분주하고 37℃에서 굳힌 다음, 액체질소를 이용해 급속으로 냉각 시키고 이를 동결 건조하여 주사전자현미경 (SEM)을 통해 관찰하였다(도 9).
실험예 9: 키토산 하이드로젤 표면에서의 세포부착 확인
웰플레이트에 멸균된 커버글라스를 넣은 후, 키토산 하이드로젤을 분주하고 37℃에서 굳힌 다음 PKH67로 초록 형광으로 표시한 중간엽 줄기세포를 파종하여 배양하였다. 배양 4 일 후, 파라포름알데히드에 고정하여 형광현미경 (Carl Zeizz, Germany)를 통해 초록 형광을 확인하였고(도 11), 공초점 레이저 현미경 (OLYMPUS, Japan)을 통하여 확인하였다(도 12).
실시예 5: 신경분화 유도된 줄기세포의 단백질 분리
실시예 4에서 신경분화 유도된 줄기세포의 신경세포 특이적 단백질 발현을 확인하기 위하여 1 일, 4 일, 7 일에 단백질을 분리하였다. 먼저 세포의 배지를 걷어내고 인산완충용액을 이용하여 세척해준 다음 0.05% 트립신-에틸렌다이아민테트라아세트산을 (Trypsin-EDTA)를 넣고 37℃, 5% CO2의 환경에서 3 분간 처리하여 세포를 분리하였다. 상기의 분리된 세포를 1500 rpm에서 3 분간 원심분리하고 리파 라이시스 버퍼 (AMRESCO, USA)를 이용해 단백질을 분리하였다.
실시예 6: 단백질을 이용한 웨스턴 블로팅
상기 실시예 5를 이용해 분리된 단백질로 웨스턴 블로팅을 실시하였다. 블로팅된 멤브레인의 비특이적 결합을 막기 위하여 5 wt% 스킴밀크를 포함한 0.1% 트윈-인산완충용액 (차단 완충용액)으로 2시간 처리해 주었다. 다음으로 일차항체(표 1)를 포함한 차단완충용액으로 상온에서 2 시간 혹은 4℃에서 밤새 처리하였고, 0.1% 트윈-인산완충용액으로 5번 이상 세척한 후 이차 항체를 상온에서 2 시간 동안 붙여주었다. 마지막으로 0.1% 트윈-인산충용액으로 6번 세척 하였다.
표 1
이름 희석 비율 숙주
β-actin 1:10000 마우스
NSE 1:7000 래빗
GFAP 1:50000 래빗
Tuj-1 1:1000 마우스
Olig2 1:5000 래빗
NeuN 1:1000 마우스
웨스턴 블로팅 일차 항체의 희석 비율
실험예 10: 웨스턴 블로팅한 단백질의 발현량 확인
상기 실시예 6의 결과를 확인하기 위해 ImageQuant LAS 4000 mini (GE healthcare Bio-science AB, Japan)를 이용해 측정하였고, 프로그램은 ImageQuant LAS 4000을 사용하였다.
또한, 단백질 밴드의 정량은 Image J라는 프로그램을 이용하였으며 β-actin 대비 발현량을 계산한 뒤 각 군의 발현양을 대조군 대비 발현량으로 나누어 수치화 하였다.
그 결과, 발프론산을 처리해 준 경우 1 일, 4 일에는 NSE, GFAP, Tuj-1, Olig2, NeuN 등의 발현량이 비슷하게 나타났고, 7 일로 갈수록 발현량이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
실시예 7: 신경분화 유도된 중간엽 줄기세포를 포함하는 하이드로젤을 이용한 주사제형의 제조
웰플레이트에 키토산 하이드로젤을 분주한 후 실시예 3을 실시하였다. 젤화된 상태의 키토산 하이드로젤을 스크래퍼를 이용해 원심관에 모은 후, 4℃, 2000 rpm에서 5 분 동안 원심분리 하였다. 4℃에서 졸화된 키토산 하이드로젤을 주사기를 이용해서 취하였다(도 15).
본 발명에 따른 온도감응성 하이드로젤은 신경분화 유도된 중간엽 줄기세포의 세포전달체로서 외과적인 수술 없이 주사제형으로 세포를 주입하는데 사용될 수 있어 산업적으로 유용하다.

Claims (14)

  1. 세포배양 기판; 및
    상기 세포배양 기판에 도포되어 젤화된 온도감응성 하이드로젤;을 포함하여 이루어진 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도 용도의 온도 감응성 지지체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 온도감응성 하이드로젤은 상온에서 졸 상태이며, 30℃ 이상에서 젤화하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도 용도의 온도 감응성 지지체.
  3. 온도감응성 하이드로젤을 분주하여 젤화하는 단계;
    상기 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하고 신경전구세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
    신경전구세포를 신경세포로 유도하는 단계;를 포함하여 이루어진 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  4. 제3항에 있어서,
    신경전구세포로의 분화를 유도하는 단계는 염기성 섬유아세포 증식인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈소판 유래 증식인자 (platelet-derived growth factor, PDGF), 색소 상피성 인자 (pigment epithelium derived factor, PEDF), 뇌유래신경성장인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 인슐린 유사생장인자 (insulin-like growth factor-1, IGF-1), 상피세포 증식인자 (epidermal growth factor, EGF), 신경 증식인자 (nerve growth factor, NGF) 및 기타 향신경성 물질(neurotrophic factors) 중에서 적어도 하나 이상 선택되어 증식인자로 이용되어 중간엽 줄기세포를 신경전구세포로 유도하는 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 증식인자 처리 시에 혈청을 함유하는 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  6. 제3항에 있어서,
    신경전구세포를 신경세포로 유도하는 단계는 발프론산을 이용하여 신경전구세포를 신경세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  7. 제6항에 있어서,
    발프론산의 농도가 0.5 ~ 4 mmol/L인 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  8. 제7항에 있어서,
    발프론산의 농도가 0.5 ~ 2 mmol/L인 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 발프론산의 처리 뒤에 염화포타슘 10~40 mmol/L, 인슐린 1~10 g/mL, 포스콜린 1~30 mol/L, 하이드로코티존 0.1~5 mol/L를 첨가하는 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 온도감응성 하이드로젤은 플루로닉 (Poly(ethylen oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide), Pluronic), 폴리카프로락톤 (PCL), 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 (MPEG-PCL), 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) (MPEG-(PCL-co-PLLA)), 카복시메틸셀룰로오스 (CMC), 알긴, 알긴산 또는 알지네이트, 폴리펩타이드 또는 단백질, 젤라틴 또는 카세인, 키틴 유도체 및 키토산 중에서 선택된 1종 이상이 포함되어 제조되는 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수, 근육 또는 지방 유래인 것을 특징으로 하는 온도감응성 하이드로젤을 이용한 신경세포 수득방법.
  12. 젤화된 온도감응성 하이드로젤에 중간엽 줄기세포를 파종하여 신경전구세포로 분화시킨 후 신경세포로 유도하는 단계;
    온도감응성 하이드로젤을 졸화시키는 단계; 및
    상기 얻어진 신경세포와 졸화된 온도감응성 하이드로젤을 포함하는 주사제를 얻는 단계;를 포함하여 이루어진, 신경세포 함유 온도감응성 하이드로젤 주사제의 제조방법.
  13. 제3항 내지 제11항 중에서 선택된 어느 한 항의 수득방법으로 수득된 신경세포와 온도감응성 하이드로젤을 포함하여 이루어진 신경질환 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 척수 손상에 의한 중추신경계 질환 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경질환 치료용 조성물.
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