WO2013110837A1 - Haptens, conjugates and antibodies for pyrimethanil fungicide - Google Patents

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WO2013110837A1 PCT/ES2013/070013 ES2013070013W WO2013110837A1 WO 2013110837 A1 WO2013110837 A1 WO 2013110837A1 ES 2013070013 W ES2013070013 W ES 2013070013W WO 2013110837 A1 WO2013110837 A1 WO 2013110837A1
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Josep Vicent Mercader Badia
Antonio Abad Fuentes
Antonio Abad Somovilla
Consuelo AGULLÓ BLANES
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universitat De València
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Abstract

The invention relates to haptens, conjugates and antibodies for pyrimethanil fungicide. In addition, the invention relates to the use of pyrimethanil conjugates as assay antigens or immunogens in order to obtain antibodies of the aforementioned fungicide, and to the use of the labelled derivatives of pyrimethanil as assay antigens. The invention also relates to a pyrimethanil analysis method using the antibodies obtained, at times together with assay antigens which are conjugates or labelled derivatives. The invention also provides a kit for analysing pyrimethanil, which includes antibodies of said fungicide, at times together with assay antigens which are conjugates or labelled derivatives.

Description

Haptenos, conjugados y anticuerpos para el fungicida pirimetanil  Haptenes, conjugates and antibodies to the fungicide pyrimethanil
La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para pirimetanil. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de pirimetanil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. The present invention relates to haptens, conjugates, labeled derivatives and antibodies to pyrimethanil. In addition, the present invention also relates to a method of analysis of pyrimethanil using the antibodies obtained, sometimes together with test antigens that are conjugated or labeled derivatives.
ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE
Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es así no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos productos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posterioridad (fungicidas postcosecha). Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales, como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los últimos años a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor eficacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia, las empresas agroquímicas pusieron en marcha programas de l+D encaminados a desarrollar nuevos productos que presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de forma eficaz las infecciones fúngicas, al tiempo que fueran seguros y compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más antiguos, que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y medioambiental. Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década con aplicaciones en postcosecha destaca el pirimetanil [H.J. Rosslenbroich y D. Stuebler, Crop Prot. 2000, 19, 557-561 ]. Este plaguicida pertenece a la familia de las anilinopirimidinas cuyo modo bioquímico de acción es común a esta familia y diferente al del resto de fungicidas. El pirimetanil (4,6-dimet¡l-/V- fenilpirimidin-2-amina) es un producto desarrollado por AgrEvo y comercializado a nivel mundial por compañías como Bayer CropScience, BASF o Janssen Pharmaceutical. En la actualidad las denominaciones comerciales más habituales son Scala y Penbotec, encontrándose también en forma de formulaciones combinadas con una gran variedad de fungicidas diferentes, entre las que destacan Philabuster (con imazalil) y FlintStar (con trifloxistrobin). Su utilización como fungicida postcosecha está autorizada tanto en cítricos como en frutas de hueso y pepita. El pirimetanil fue incluido en el anexo I de la UE en el 2006. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido límites máximos de residuos de forma explícita se encuentran los cítricos (10 ppm), frutas de hueso (3-10 ppm), frutas de pepita (5 ppm), uva y fresa (5 ppm), además de en una gran variedad de vegetales y hortalizas. Fungicides are the group of pesticides that most frequently appear in surveillance and control programs. This is so not only because of its high use, but mainly because these plant protection products are used to fight fungal infections at times near harvest or even later (postharvest fungicides). This fact considerably increases the likelihood that residues from such treatments will remain when the food reaches the consumer, forcing regulatory and control bodies to be more vigilant and ideally to increase controls. Fungal attacks on stored fruits are one of the main reasons for economic losses in agriculture. The intensive use of conventional fungicides, such as thiabendazole or imazalil, has led in recent years to the emergence of resistant strains and therefore to a less effective treatment with these products. Given this circumstance, the agrochemical companies launched R&D programs aimed at developing new products that presented innovative mechanisms of action and that allowed to effectively combat fungal infections, while being safe and compatible with integrated management programs. Of pests. These products are beginning to gradually replace older products, which are less acceptable from a toxicological and environmental point of view. Among the most relevant fungicides developed in the last decade with postharvest applications, pyrimethanil [HJ Rosslenbroich and D. Stuebler, Crop Prot. 2000, 19, 557-561] stands out. This pesticide belongs to the family of anilinopyrimidines whose biochemical mode of action is common to this family and different from that of other fungicides. Pyrimethanil (4,6-dimethyl- / V-phenylpyrimidin-2-amine) is a product developed by AgrEvo and marketed worldwide by companies such as Bayer CropScience, BASF or Janssen Pharmaceutical. Currently, the most common commercial names are Scala and Penbotec, also in the form of formulations combined with a wide variety of different fungicides, among which Philabuster (with imazalil) and FlintStar (with trifloxistrobin). Its use as a postharvest fungicide is authorized both in citrus fruits and in stone fruits and seeds. Pyrimethanil was included in Annex I of the EU in 2006. Among the crops for which the EU has explicitly set maximum residue limits are citrus fruits (10 ppm), stone fruits (3-10 ppm) , fruits of seeds (5 ppm), grapes and strawberries (5 ppm), in addition to a wide variety of vegetables.
Las metodologías analíticas empleadas para el análisis de estos fungicidas son fundamentalmente de tipo instrumental, en especial cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), acopladas a diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad requerida. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud. Sin embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias, con frecuencia implican la utilización de metodologías labonosas y de elevado coste, que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener resultados en breve plazo, dos aspectos que contribuirían a garantizar la seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios más exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a estos fungicidas a través de los alimentos. The analytical methodologies used for the analysis of these fungicides are fundamentally instrumental, especially gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC), coupled to different detectors according to the type of compound to be analyzed and the sensitivity required. These techniques are characterized by their ability to simultaneously analyze several residues with high precision and accuracy. However, although they are essential in many circumstances, they often involve the use of high-cost and labile methodologies, which must be carried out by highly qualified personnel in well-equipped centralized laboratories and usually away from production areas. These limitations condition the suitability of these techniques to undertake the analysis of large numbers of samples and to obtain results in the short term, two aspects that would contribute to guaranteeing the safety of commercialized foods and conducting further studies. exhaustive on the exposure of consumers to these fungicides through food.
Los inmunoensayos son técnicas bioanalíticas basadas en la interacción de un antígeno (el analito) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No obstante, un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un único sitio de unión al anticuerpo, por lo que en este tipo de técnicas analíticas la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo, en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente, el mareaje se realiza con una actividad enzimática, dando así lugar a los enzimoinmunoensayos. Cuando además uno de los participantes en la reacción se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido, la técnica se denomina ELISA (del inglés Enzyme- Linked Immunosorbent Assay). Los primeros inmunoensayos enzimáticos para plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80. Desde entonces hasta la actualidad el número de plaguicidas para los cuales se han desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente, suponiendo varias decenas y cubriendo los principales grupos de compuestos: insecticidas, herbicidas y fungicidas. De hecho, un gran número de estos ensayos están disponibles comercialmente en forma de kits con diferentes formatos. La creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a las cromatográficas para el análisis de pequeñas moléculas orgánicas se debe a que se trata de una metodología sencilla, rápida y de bajo coste, exhibiendo al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos permiten detectar específicamente el analito diana en mezclas muy complejas, simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en formatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorios centralizados y los convierte en ¡dóneos para el análisis en los puntos de producción. Las excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas [M.C. Hennion, Analysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agrie. Food Chem. 2001 , 49, 1707-1712; N A. Lee y I.R. Kennedy, J. AOAC Int. 2001 , 84, 1393-1406; F.A. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta 2010, 682, 93-103]. Immunoassays are bioanalytical techniques based on the interaction of an antigen (the analyte) with an antibody that specifically recognizes it. However, a pesticide is a small organic molecule that constitutes a single antibody binding site, so in this type of analytical techniques the interaction between the analyte and the antibody is performed by displacing the binding between the antibody and an analogue. analyte marking. Thus, in the presence of the analyte a competition is established between it and the analog marked by antibody binding. Usually, the marking is carried out with an enzymatic activity, thus giving rise to enzyme immunoassays. When one of the participants in the reaction is also immobilized on a solid support, the technique is called ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). The first enzymatic immunoassays for pesticides were developed during the first half of the 80s. Since then until now the number of pesticides for which immunoassays have been developed has increased dramatically, assuming several tens and covering the main groups of compounds: insecticides, herbicides and fungicides. In fact, a large number of these tests are commercially available in the form of kits with different formats. The growing acceptance of immunoassays as complementary techniques to chromatography for the analysis of small organic molecules is due to the fact that it is a simple, fast and low-cost methodology, exhibiting at the same time high sensitivity and specificity. Immunoassays allow the target analyte to be specifically detected in very complex mixtures, considerably simplifying the laborious sample preparation procedures, which in turn results in an increase in sampling capacity. In addition, immunoassays can be performed in portable formats, which makes them independent of centralized laboratories and makes them ideal for analysis at production points. The analytical excellencies attributed to immunoassays have already been demonstrated in many practical applications, where they have competed favorably with chromatographic techniques [MC Hennion, Analysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agrie. Food Chem. 2001, 49, 1707-1712; N A. Lee and IR Kennedy, J. AOAC Int. 2001, 84, 1393-1406; FA Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Minutes 2010, 682, 93-103].
Sin embargo, hasta la fecha no se ha descrito la utilización de la tecnología de inmunoensayo para analizar el contenido del fungicida pirimetanil en una muestra. However, to date the use of immunoassay technology to analyze the content of the fungicide pyrimethanil in a sample has not been described.
Por lo tanto, existe una necesidad, en particular en la industria alimentaria y/o agrícola, de desarrollar un método analítico que permita la determinación o detección mediante la tecnología de inmunoensayo de pirimetanil, fungicida ampliamente utilizado en la actualidad, preferentemente mediante la utilización de un kit que comprenda al menos un anticuerpo de pirimetanil. Therefore, there is a need, particularly in the food and / or agricultural industry, to develop an analytical method that allows the determination or detection by means of the pyrimethanil immunoassay technology, fungicide widely used today, preferably by the use of a kit comprising at least one pyrimethanil antibody.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención proporciona haptenos de pirimetanil, compuestos de fórmula (I), que presentan una funcionalización adecuada, en diferentes posiciones de la molécula, para la obtención de conjugados de pirimetanil o derivados marcados de pirimetanil. The present invention provides pyrimethanil haptens, compounds of formula (I), which have adequate functionalization, in different positions of the molecule, for obtaining pyrimethanil conjugates or pyrimethanil labeled derivatives.
Un primer aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula general (I): A first aspect of the present invention describes a compound of general formula (I):
T-L-Y T-L-Y
(i) caracterizado porque (i) characterized in that
T se selecciona del grupo que consiste en R-l, R-ll, R-lll, R-IV y R-V;
Figure imgf000006_0001
T is selected from the group consisting of Rl, R-ll, R-lll, R-IV and RV;
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000006_0002
donde where
R-l se selecciona del grupo que consiste en [2-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo];  Rl is selected from the group consisting of [2 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
R-ll es [4,6-dimetil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-ll is [4,6-dimethyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl];
R-lll se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-metilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4-metilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  R-lll is selected from the group consisting of [2 - ((4-methylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4- ( (4-methylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4- ¡lo] y [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y  R-IV is selected from the group consisting of [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4- ¡lo] and [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; Y
R-V es [/V-(4,6-dimetilpinmidin-2-il)-/V-(fenil)amino];  R-V is [/ V- (4,6-dimethylpinmidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;  L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said hydrocarbon chain comprises between 0 and 10 heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N;
Y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -COOH, -NH2, -N3, -CH2Br, -CH2I, -CHO, -SH, -S03H, -OS02Ph, -NH-NH2, y -OS02Ar; Y is a functional group selected from the group consisting of -COOH, -NH 2 , -N 3 , -CH 2 Br, -CH 2 I, -CHO, -SH, -S0 3 H, -OS0 2 Ph, -NH -NH 2, and -OS0 2 Ar;
con la condición de que: a) cuando T es [4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo], -L-Y es diferente
Figure imgf000007_0001
with the condition of: a) when T is [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], -LY is different
Figure imgf000007_0001
b) cuando T es [4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo], -L-Y es diferente de -CONHCH2-CO2H;  b) when T is [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], -L-Y is different from -CONHCH2-CO2H;
c) cuando T es [4-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], -L-Y es diferente de
Figure imgf000007_0002
c) when T is [4 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], -LY is different from
Figure imgf000007_0002
d) cuando T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo], -L-Y es diferente de
Figure imgf000007_0003
d) when T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl], -LY is different from
Figure imgf000007_0003
e) cuando T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no comprende ningún heteroátomo;  e) when T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino], L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, linear or branched, saturated or unsaturated , with the proviso that said hydrocarbon chain does not comprise any heteroatom;
f) cuando T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino], -L-Y es diferente de -(CH2)3-NH2. f) when T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino], -LY is different from - (CH 2 ) 3 -NH 2 .
En la presente solicitud de patente se entiende por arilo (-Ar) un grupo carbocíclico aromático con un único anillo, por ejemplo fenilo, múltiples anillos, por ejemplo bifenilo, o múltiples anillos condensados donde al menos uno de ellos es aromático, por ejemplo 1 ,2,3,4-tetrahidronaftilo, 1 -naftilo, 2-naftilo. El grupo arilo puede estar sustituido o no. Preferentemente, el grupo arilo es 4- metilfenilo. In the present patent application, aryl (-Ar) means an aromatic carbocyclic group with a single ring, for example phenyl, multiple rings, for example biphenyl, or multiple condensed rings where at least one of them is aromatic, for example 1 , 2,3,4-tetrahydronaphthyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl. The aryl group may be substituted or not. Preferably, the aryl group is 4- methylphenyl.
Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (I) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, dicha cadena hidrocarbonada lineal comprende entre 2 y 8 átomos de carbono. According to a preferred embodiment, the compound of formula (I) is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms. Preferably, said linear hydrocarbon chain comprises between 2 and 8 carbon atoms.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (I) de la presente invención se caracteriza porque Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (I) objeto de la presente invención se caracteriza porque Y es -COOH. Según otra realización preferida, el compuesto de formula (I) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [3-((4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (I) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (I) of the present invention is characterized in that Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH. Preferably, the compound of formula (I) object of the present invention is characterized in that Y is -COOH. According to another preferred embodiment, the compound of formula (I) as described in this patent application is characterized in that T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4- ( (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH. Preferably, the compound of formula (I) of the present invention is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) de esta invención se selecciona del grupo que consiste en According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (I) of this invention is selected from the group consisting of
Figure imgf000008_0001
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Según otra realización preferida, el compuesto de formula (I) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [6-metil-2- (fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (I) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. According to another preferred embodiment, the compound of formula (I) as described in this patent application is characterized in that T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH. Preferably, the compound of formula (I) of the present invention is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) de esta invención es According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (I) of this invention is
Figure imgf000008_0002
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (I) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [Λ/-(4,6- dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (I) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono.
Figure imgf000008_0002
According to another preferred embodiment, the compound of formula (I) as described in this patent application is characterized in that T is [Λ / - (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino] ; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, NH 2 and -SH. Preferably, the compound of formula (I) of the present invention is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) de esta invención esAccording to an even more preferred embodiment, the compound of formula (I) of this invention is
H
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H
Figure imgf000009_0001
Un segundo aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (II): A second aspect of the present invention describes a compound of formula (II):
[T-L-Z]n-P [TLZ] n -P
(II) caracterizado porque (II) characterized in that
T se selecciona del grupo que consiste en R-l, R-ll, R-lll, R-IV y R-V;  T is selected from the group consisting of R-l, R-ll, R-lll, R-IV and R-V;
donde where
Figure imgf000009_0002
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R-l se selecciona del grupo que consiste en [2-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; Rl is selected from the group consisting of [2 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
R-ll es [4,6-dimetil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo];  R-ll is [4,6-dimethyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl];
R-lll se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-metilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4-metilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  R-lll is selected from the group consisting of [2 - ((4-methylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4- ( (4-methylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2-(fenilam¡no) pirimidin-4- ¡lo] y [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y  R-IV is selected from the group consisting of [6-methyl-2- (phenylamine) pyrimidin-4- [lo] and [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; Y
R-V es [/V-(4,6-dimetilpinmidin-2-il)-/V-(fenil)amino];  R-V is [/ V- (4,6-dimethylpinmidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;  L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said hydrocarbon chain comprises between 0 and 10 heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N;
Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, - -, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-,  Z is a functional group selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, - -, -S-, -SS-, -NH (C = NH) -, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N = N-,
Figure imgf000010_0002
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P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons; y P is a natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons; Y
n es un número con un valor entre 1 y 500.  n is a number with a value between 1 and 500.
El valor de n indica el grado de conjugación, es decir la relación molar entre la fracción derivada del compuesto de fórmula (I) y P, el polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons en el compuesto de fórmula (II) resultante. The value of n indicates the degree of conjugation, ie the molar ratio between the fraction derived from the compound of formula (I) and P, the natural polypeptide or Synthetic molecular weight greater than 2000 daltons in the resulting compound of formula (II).
El compuesto de fórmula (II) de la presente invención puede utilizarse para la producción de anticuerpos o junto con un anticuerpo de pirimetanil, para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo competitivo. The compound of formula (II) of the present invention can be used for the production of antibodies or together with a pyrimethanil antibody, to determine or detect this fungicide in a sample by competitive immunoassay technology.
Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (II) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, dicha cadena hidrocarbonada lineal comprende entre 2 y 8 átomos de carbono. According to a preferred embodiment, the compound of formula (II) is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms. Preferably, said linear hydrocarbon chain comprises between 2 and 8 carbon atoms.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (II) de la presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO
Figure imgf000011_0001
According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO
Figure imgf000011_0001
Preferentemente, el compuesto de fórmula (II) objeto de la presente invención se caracteriza porque Z es -CONH-. Preferably, the compound of formula (II) object of the present invention is characterized in that Z is -CONH-.
Según otra realización preferida de la presente invención, el compuesto de fórmula (II) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, β- galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. Preferentemente, cuando P es albúmina, es albúmina de huevo o albúmina sérica. According to another preferred embodiment of the present invention, the compound of formula (II) described in this patent application is characterized in that P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, β-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase. Preferably, when P is albumin, it is egg albumin or serum albumin.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (II) de la presente invención se caracteriza porque According to another preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that
T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo]; T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; se selecciona del ru o ue consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000012_0001
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, /3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms; is selected from ru or ue consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000012_0001
P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, / 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (II) de la presente invención se caracteriza porque T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that T is [3- ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4- ((4, 6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 5 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (II) de la presente invención se caracteriza porque According to another preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that
T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];  T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en-CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of-CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000012_0002
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, /3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.  P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, / 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (II) de la presente invención se caracteriza porque T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin- 4-¡lo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. Según otra realización preferida, el compuesto de formula (II) de la presente invención se caracteriza porque According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50. According to another preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that
T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000013_0001
Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000013_0001
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, 3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (II) de la presente invención se caracteriza porque T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V- (fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (II) of the present invention is characterized in that T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
Un tercer aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (III): A third aspect of the present invention describes a compound of formula (III):
[T-L-Z]m-Q [TLZ] m -Q
(III) caracterizado porque (III) characterized in that
T, L y Z tienen el mismo significado definido antenormente para el compuesto de fórmula (II);  T, L and Z have the same meaning defined above for the compound of formula (II);
Q es un marcador no isotópico; y  Q is a non-isotopic marker; Y
m es un número entero con un valor entero entre 1 y 1000. En la presente invención se entiende por marcador cualquier molécula o fragmento que dé lugar a una señal medible por cualquier tipo de técnica analítica. En la presente invención, Q del compuesto de fórmula (III) identifica un fragmento o una molécula química detectora, marcadora o trazadora. m is an integer with an integer value between 1 and 1000. In the present invention a marker is understood as any molecule or fragment that gives rise to a signal measurable by any type of technique analytics. In the present invention, Q of the compound of formula (III) identifies a fragment or a chemical detector, marker or tracer molecule.
Este compuesto de fórmula (III) puede utilizarse con un anticuerpo de pirimetanil para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo competitivo. This compound of formula (III) can be used with a pyrimethanil antibody to determine or detect this fungicide in a sample by competitive immunoassay technology.
Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (III) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. According to a preferred embodiment, the compound of formula (III) is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms. Preferably, L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (III) de la presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-,
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According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (III) of the present invention is characterized in that Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-,
Figure imgf000014_0001
Preferentemente, el compuesto de fórmula (III) se caracteriza porque Z es -CONH-.  Preferably, the compound of formula (III) is characterized in that Z is -CONH-.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (III) de la presente invención se caracteriza porque Q es biotina, un compuesto luminiscente, un fluoroforo, un marcador acoplado a un sistema de detección indirecta, micro o nanopartículas u otros. Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoroforo de cianina, un fluoroforo de rodamina, un fluoroforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. Según otra realización preferida, el compuesto de formula (III) de la presente invención se caracteriza porque T es [3-((4,6-dimetilpinmidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpihmidin-2- il)amino)fenilo]; According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (III) of the present invention is characterized in that Q is biotin, a luminescent compound, a fluorophore, a label coupled to an indirect detection system, micro or nanoparticles or others. Preferably, Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an ester of acridinium and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex. According to another preferred embodiment, the compound of formula (III) of the present invention is characterized in that T is [3 - ((4,6-dimethylpinmidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpihmidin-2- yl) amino) phenyl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000015_0001
Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000015_0001
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoroforo de cianina, un fluoroforo de rodamina, un fluoroforo de cumanna, un bipirilo de rutenio, lucifehna o uno cualquiera de sus derivados, un éster de achdinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a cumanna fluorophore, a ruthenium bipyril, lucifehna or any one of its derivatives, an achdinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (III) de la presente invención se caracteriza porque According to another preferred embodiment, the compound of formula (III) of the present invention is characterized in that
T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];  T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000015_0002
Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000015_0002
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoroforo de cianina, un fluoroforo de rodamina, un fluoroforo de cumanna, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de achdinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.  Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a cumanna fluorophore, a ruthenium bipyril, luciferin or any one of its derivatives, an achdinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (III) de la presente invención se caracteriza porque According to another preferred embodiment, the compound of formula (III) of the present invention is characterized in that
T es [/V-(4,6-dimetilpihmidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; T is [/ V- (4,6-dimethylpihmidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000016_0001
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Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. Un cuarto aspecto de la presente invención describe un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fórmula (II) tal como se describe en esta solicitud de patente.  Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex. A fourth aspect of the present invention describes an antibody generated in response to a compound of formula (II) as described in this patent application.
Según una realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (II) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque According to a preferred embodiment of the invention, the compound of formula (II) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that
T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
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P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y hemocianina. Preferentemente, el compuesto de formula (II) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin and hemocyanin. Preferably, the compound of formula (II) that generates an antibody as described in this patent application, is characterized in that T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 5 atoms of carbon; Z is -CONH-; P is albumin; and n is a value selected between 1 and 50.
Según otra realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (II) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque According to another preferred embodiment of the invention, the compound of formula (II) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that
T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];  T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del rupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y hemocianina.  P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin and hemocyanin.
Preferentemente, el compuesto de fórmula (II) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [6- metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. Preferably, the compound of formula (II) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that T is [6- methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is albumin; and n is a value selected between 1 and 50.
Según otra realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (II) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque According to another preferred embodiment of the invention, the compound of formula (II) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that
T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino];  T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
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Figure imgf000017_0002
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y hemocianina. Preferentemente, el compuesto de fórmula (II) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [N- (4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin and hemocyanin. Preferably, the compound of formula (II) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that T is [N- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino ]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is albumin; and n is a value selected between 1 and 50.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de análisis in vitro de pirimetanil en una muestra que comprende las siguientes etapas: a. poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en esta solicitud de patente; b. incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y c. determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación del paso (b). A fifth aspect of the present invention relates to a method of in vitro analysis of pyrimethanil in a sample comprising the following steps: a. contacting the sample with the antibody described in this patent application; b. incubate the sample and the antibody of step (a) for a suitable period of time for an immunochemical reaction to take place; and c. determine the existence of immunochemical reaction after the incubation of step (b).
El método de la presente invención permite la determinación cuantitativa o análisis cualitativo del contenido del fungicida pirimetanil en una muestra. Así mismo, el método de la presente invención permite analizar el contenido de pirimetanil en diferentes tipos de muestras, por ejemplo, muestras de alimentos, muestras medioambientales tales como agua, suelo o superficie, y muestras biológicas tales como orina. Preferentemente, la presente invención proporciona un método de análisis in vitro de pirimetanil en un alimento. The method of the present invention allows quantitative determination or qualitative analysis of the content of the fungicide pyrimethanil in a sample. Likewise, the method of the present invention allows analyzing the content of pyrimethanil in different types of samples, for example, food samples, environmental samples such as water, soil or surface, and biological samples such as urine. Preferably, the present invention provides a method of in vitro analysis of pyrimethanil in a food.
Según una realización preferida, la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de fórmula (II) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA. Según otra realización preferida, la determinación de la reacción ¡nmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de fórmula (III) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA. According to a preferred embodiment, the determination of the immunochemical reaction in step (c) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a compound of formula (II) as described in this patent application. Preferably, the competitive immunoassay is of the ELISA type. According to another preferred embodiment, the determination of the immunochemical reaction in step (c) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a compound of formula (III) as described in this patent application. Preferably, the competitive immunoassay is of the ELISA type.
El término inmunoensayo hace referencia a un ensayo analítico en el que ocurre una reacción ¡nmunoquímica para la detección o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquellos en los que el analito compite con otra molécula por la unión con el anticuerpo. El término antígeno en esta solicitud de patente se refiere a una molécula capaz de interaccionar específicamente con un anticuerpo. La interacción o reacción ¡nmunoquímica consiste en la unión específica y no covalente entre un anticuerpo y un antígeno, pudiendo ser éste el analito o un antígeno de ensayo. The term "immunoassay" refers to an analytical assay in which an immunochemical reaction for the detection or quantification of an analyte occurs. Competitive immunoassays are those in which the analyte competes with another molecule for binding with the antibody. The term "antigen" in this patent application refers to a molecule capable of interacting specifically with an antibody. The interaction or immunochemical reaction consists in the specific and non-covalent binding between an antibody and an antigen, which may be the analyte or a test antigen.
En la presente memoria el término antígeno de ensayo, antígeno enzimático o trazador se refiere a un compuesto de fórmula (II) o de fórmula (III) que se utiliza en el ensayo competitivo. Here the term "test antigen, enzyme antigen or tracer" refers to a compound of formula (II) or of formula (III) that is used in the competitive assay.
Un sexto aspecto de la presente invención también se refiere a un kit de detección de pirimetanil que utiliza al menos un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente. Adicionalmente, el kit de detección de pirimetanil puede comprender un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III) tal como se describen en la presente solicitud de patente. A sixth aspect of the present invention also relates to a pyrimethanil detection kit that uses at least one antibody as described in this patent application. Additionally, the pyrimethanil detection kit may comprise a compound selected from the group consisting of a compound of formula (II) and a compound of formula (III) as described in the present patent application.
El compuesto de fórmula (II) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (I) con P, un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor a 2000 daltons, por métodos ampliamente conocidos en la técnica. El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (II) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y. The compound of formula (II) of the present invention can be obtained by a process comprising reacting a compound of formula (I) with P, a natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons, by methods widely known in the technique. The process for obtaining the compound of formula (II) may also comprise, if necessary, an additional step of activating the functional group Y.
Por otro lado, el compuesto de fórmula (III) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (I) con Q, un marcador no isotópico, por métodos ampliamente conocidos en la técnica. On the other hand, the compound of formula (III) of the present invention can be obtained by a process comprising reacting a compound of formula (I) with Q, a non-isotopic marker, by methods widely known in the art.
El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (III) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y. The process for obtaining the compound of formula (III) may also comprise, if necessary, an additional step of activating the functional group Y.
Cuando el compuesto de fórmula (I) se caracteriza porque Y es un grupo carboxílico, la activación mencionada anteriormente puede tener lugar haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (I) con Ν,Ν'- disuccinimidilcarbonato. Este procedimiento de activación puede tener lugar en un disolvente orgánico como por ejemplo acetonitrilo, propanonitrilo, diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, benceno o tolueno; en presencia de una base como por ejemplo trietilamina, triisopropilamina, piridina, 4-N,N- dimetilaminopiridina, picolina o diazo(1 ,3)biciclo-[5.4.0]undecano; en un intervalo de temperatura entre 0 y 30 °C. Los términos inmunógeno e inmunogénico tal como se utilizan en la presente invención se refieren a una sustancia que es reconocida como extraña al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped. When the compound of formula (I) is characterized in that Y is a carboxylic group, the above-mentioned activation can take place by reacting the compound of formula (I) with Ν, Ν ' - disuccinimidylcarbonate. This activation procedure can take place in an organic solvent such as acetonitrile, propanonitrile, dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, benzene or toluene; in the presence of a base such as triethylamine, triisopropylamine, pyridine, 4-N, N-dimethylaminopyridine, picoline or diazo (1,3) bicyclo- [5.4.0] undecano; in a temperature range between 0 and 30 ° C. The terms immunogenic and immunogenic as used in the present invention refer to a substance that is recognized as foreign to the living organism and is therefore capable of producing or generating an immune response in a host.
Así mismo, la obtención de anticuerpos a partir de compuestos de fórmula (II) también puede tener lugar por métodos de inmunización ampliamente conocidos en la técnica. Likewise, obtaining antibodies from compounds of formula (II) can also take place by immunization methods widely known in the art.
Los anticuerpos generados a partir de un compuesto de fórmula (II) tal como se describe en esta solicitud de patente pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo. Antibodies generated from a compound of formula (II) as described in this patent application may be polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies or antibody fragments.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
Para preparar anticuerpos frente a pirimetanil se requiere la preparación de derivados funcionalizados de dicho fungicida, es decir, análogos estructurales de pirimetanil que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugación a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional está separado del esqueleto de la molécula de pirimetanil por un espaciador L. La posición de incorporación del grupo funcional a la estructura de pirimetanil para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser determinante para la viabilidad de los compuestos de fórmula (II) como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a pirimetanil e incluso de compuestos de fórmula (II) o (III) que actúen como moléculas competidoras y que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y específico para dicho fungicida, objeto último de la presente invención. A continuación se ¡lustra con algunos ejemplos y figuras la forma en que puede efectuarse la preparación de varios derivados de pirimetanil que son compuestos de fórmula (I) y los correspondientes compuestos de fórmula (II), que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no solo la forma en que puede efectuarse la preparación de los mismos sino también la importancia que puede tener la naturaleza estructural del compuesto de fórmula (II) para la producción de anticuerpos de afinidad adecuada hacia el analito, aptos para el desarrollo de un buen inmunoensayo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS In order to prepare antibodies against pyrimethanil, the preparation of functionalized derivatives of said fungicide is required, that is, structural analogues of pyrimethanil that incorporate a functional group that can be used for conjugation to a P carrier or Q marker. This functional group is separated from Skeleton of the pyrimethanil molecule by a spacer L. The position of incorporation of the functional group into the structure of pyrimethanil for conjugation is not an obvious aspect and can be decisive for the viability of the compounds of formula (II) as inducers of the production of antibodies of suitable affinity and selectivity against pyrimethanil and even of compounds of formula (II) or (III) that act as competing molecules and that allow the development of a sensitive and specific immunoassay for said fungicide, the ultimate object of the present invention . The following illustrates with some examples and figures the way in which the preparation of various pyrimethanil derivatives which are compounds of formula (I) and the corresponding compounds of formula (II), which are not intended to be limiting of the present, can be carried out invention, and which serve to show not only the way in which they can be prepared, but also the importance that the structural nature of the compound of formula (II) may have for the production of antibodies of suitable affinity towards the analyte, suitable for the development of a good immunoassay. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1 . Esquema de la síntesis de los compuestos de fórmula (I) PMm6 y PMp6. Figure 1 . Scheme of the synthesis of the compounds of formula (I) PMm6 and PMp6.
Figura 2. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (I) PMb5. Figure 2. Scheme of the synthesis of the compound of formula (I) PMb5.
Figura 3. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (I) PMn5. Figure 3. Scheme of the synthesis of the compound of formula (I) PMn5.
Figura 4. Esquema de la preparación de un compuesto de fórmula (II) a partir del correspondiente compuesto de fórmula (I), donde el término ll-INM significa compuesto de fórmula (II) que se puede utilizar para generar un anticuerpo de pirimetanil, y el término ll-ANT significa compuesto de fórmula (II) que puede actuar como competidor en un ensayo inmunológico competitivo. Figure 4. Scheme of the preparation of a compound of formula (II) from the corresponding compound of formula (I), where the term ll-INM means compound of formula (II) that can be used to generate a pyrimethanil antibody, and the term ll-ANT means a compound of formula (II) that can act as a competitor in a competitive immunological assay.
Figura 5. Título de los anticuerpos anti-pirimetanil determinado con 0.1 g de compuesto de fórmula (II) homólogo inmovilizado. Figure 5. Title of the anti-pyrimethanil antibodies determined with 0.1 g of compound of formula (II) immobilized homolog.
Figura 6. Curvas estándar para pirimetanil en diferentes formatos de ELISA competitivo. Se indica mediante (·) los resultados obtenidos en el ensayo indirecto descrito en el apartado 3.1 de los ejemplos, y mediante ( A) los resultados obtenidos en ensayo directo descrito en el apartado 3.2 de los ejemplos. Figure 6. Standard curves for pyrimethanil in different formats of competitive ELISA. The results obtained in the indirect test described in section 3.1 of the examples are indicated by (·), and by (A) the results obtained in direct test described in section 3.2 of the examples.
EJEMPLOS EXAMPLES
A continuación se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de fórmula (II) para la obtención de anticuerpos anti-pirimetanil. En los siguientes ejemplos los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas de las Figuras 1 a 3. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención. 1. Preparación de compuestos de fórmula (II) 1.1. Síntesis de compuestos de fórmula (I) The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which shows the specificity and effectiveness of the compounds of formula (II) for obtaining anti-pyrimethanil antibodies. In the following examples the numbers in bold make reference to the corresponding structure shown in the diagrams of Figures 1 to 3. These examples are presented by way of demonstration but in no way can they constitute a limit to the invention. 1. Preparation of compounds of formula (II) 1.1. Synthesis of compounds of formula (I)
Ejemplo 1 : Síntesis de PMm6 (2) y PMp6 (3) [radical de tipo T= R-l] Example 1: Synthesis of PMm6 (2) and PMp6 (3) [radical of type T = R-l]
La síntesis de los compuestos PMm6 (2) y PMp6 (3) se describe en la Figura 1 e implica la reacción de sustitución nucleofílica aromática del átomo de cloro de la 2-cloro-4,6-dimetil-pirimidina (1 ) por el grupo amino del correspondiente ácido aminofenilalcanoico que incorpora la cadena hidrocarbonada de seis átomos de carbono que constituye el brazo espaciador (C. Suárez-Pantaleón et al. , J. Agrie. Food Chem. 2008, 56, 1 1 122-1 1 131 ). La reacción tiene lugar sin necesidad de catálisis básica o ácida, produciéndose eficazmente por calentamiento prolongado de los dos reactantes en dioxano como disolvente a reflujo. A continuación se ¡lustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula (I). The synthesis of compounds PMm6 (2) and PMp6 (3) is described in Figure 1 and involves the aromatic nucleophilic substitution reaction of the chlorine atom of 2-chloro-4,6-dimethyl-pyrimidine (1) by amino group of the corresponding aminophenylalkanoic acid that incorporates the six-carbon hydrocarbon chain that constitutes the spacer arm (C. Suárez-Pantaleón et al., J. Agrie. Food Chem. 2008, 56, 1 1 122-1 1 131) . The reaction takes place without the need for basic or acid catalysis, taking place effectively by prolonged heating of the two reactants in dioxane as a reflux solvent. The details of the preparation and characterization of this compound of formula (I) are illustrated below.
Síntesis del ácido 6-(3-((4, 6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenil)hexanoico Synthesis of 6- (3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl) hexanoic acid
(2, compuesto PMm6) (2, compound PMm6)
Una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetilpirimidina (1 , 71 mg, 0.5 mmol) y ácido 6-(3-aminofenil)hexano¡co (103 mg, 0.5 mmol) en dioxano seco recién destilado se calienta a reflujo con agitación bajo atmósfera de nitrógeno durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se concentra a sequedad a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido se disuelve en la mínima cantidad de ácido fórmico (aproximadamente 0.2 mL) y el producto se precipita por adición lenta de agua (aproximadamente 3 mL). El sólido precipitado se recoge por filtración a vacío y se seca, obteniéndose el hapteno PMm6 (2) como un sólido blanco (109 mg, 70%). Pf: 199-202 °C (cristalizado de DMSO-H20); 1 H RMN (300 MHz, DMSO-de) δ (ppm) 1 1 .97 (1 H, sa, COOH), 9.35 (1 H, s, N-H), 7.64 (1 H, da, J = 8.0 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.60 (2H, sa, H-2 Ph), 7.13 (1 H, ta, J = 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.72 (1 H, da, J = 7.6 Hz, H-4 Ph), 6.60 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.30 (6H, s, Mex2), 2.50 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-6), 2.20 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1 .54 (4H, m, H-3 y H- 5), 1 .30 (2H, m, H-4); 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 174.4 (C-1 ), 166.7 (C-4 and C-2 Pirim), 159.7 (C-6 Pirim), 142.1 (C-3 Ph), 140.7 (C-1 Ph), 128.1 (C-5 Ph), 120.9 (C-6 Ph), 1 18.5(C-4 Ph), 1 15.9 (C-2 Ph), 1 10.8 (C-5 Pirim), 35.2 (C-6), 33.5 (C-2), 30.5 (C-5), 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.4 (Mex2); IR (KBr) /cm"1 3284, 3207, 3142, 3104, 2945, 2918, 2858, 2600-2400, 1689, 1618, 1596, 1558, 1492, 880, 776, 744, 552; EM (Impacto Electrónico, 70 Ev) m/z (%) 313 (Μ+, 77), 312 (20), 254 (12), 226 (81 ), 213 (80), 212 (20), 199 (12), 198 (4), 73 (100); EMAR, m/z (M+) encontrada para C18H23N3O2 313.17882, requerida 313.17903. A mixture of 2-chloro-4,6-dimethylpyrimidine (1, 71 mg, 0.5 mmol) and 6- (3-aminophenyl) hexane acid (103 mg, 0.5 mmol) in freshly distilled dry dioxane is heated to reflux with stirring under nitrogen atmosphere for 24 hours. After this time, the reaction mixture is cooled to room temperature and concentrated to dryness under reduced pressure on the rotary evaporator. The residue obtained is dissolved in the minimum amount of formic acid (approximately 0.2 mL) and the product is precipitated by slow addition of water (approximately 3 mL). The precipitated solid is collected by vacuum filtration and dried, obtaining the PMm6 hapten (2) as a white solid (109 mg, 70%). Mp: 199-202 ° C (crystallized from DMSO-H 2 0); 1 H NMR (300 MHz, DMSO-de) δ (ppm) 1 1 .97 (1 H, sa, COOH), 9.35 (1 H, s, NH), 7.64 (1 H, da, J = 8.0 Hz, H-2 / H-6 Ph), 7.60 (2H, sa, H-2 Ph), 7.13 (1 H, ta, J = 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.72 (1 H, da, J = 7.6 Hz, H-4 Ph), 6.60 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.30 (6H, s, Mex2), 2.50 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-6), 2.20 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1.54 (4H, m, H-3 and H-5), 1 .30 (2H, m, H-4); 13 C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm) 174.4 (C-1), 166.7 (C-4 and C-2 Pirim), 159.7 (C-6 Pirim), 142.1 (C-3 Ph) , 140.7 (C-1 Ph), 128.1 (C-5 Ph), 120.9 (C-6 Ph), 1 18.5 (C-4 Ph), 1 15.9 (C-2 Ph), 1 10.8 (C-5 Pirim ), 35.2 (C-6), 33.5 (C-2), 30.5 (C-5), 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.4 (Mex2); IR (KBr) / cm "1 3284, 3207, 3142, 3104, 2945, 2918, 2858, 2600-2400, 1689, 1618, 1596, 1558, 1492, 880, 776, 744, 552; EM (Electronic Impact, 70 Ev) m / z (%) 313 (Μ +, 77), 312 (20), 254 (12), 226 (81), 213 (80), 212 (20), 199 (12), 198 (4) , 73 (100); EMAR, m / z (M + ) found for C18H23N3O2 313.17882, required 313.17903.
Síntesis del ácido 6-(4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenil)hexanoico Synthesis of 6- (4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl) hexanoic acid
(3, compuesto PMp6) (3, compound PMp6)
Una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetilpirimidina (1 , 142.8 mg, 1.00 mmol) y ácido 6-(4-aminofenil)hexano¡co (207 mg, 1.00 mmol) en dioxano seco recién destilado se calentó a reflujo con agitación bajo atmósfera de nitrógeno durante 30 h. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se enfrío a temperatura ambiente y se concentró a sequedad a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido se disolvió en aproximadamente 0.5 mL de ácido fórmico y el producto se precipitó por adición lenta de agua (aproximadamente 3 mL). El sólido precipitado se recogió por filtración a vacío y se secó, obteniéndose el compuesto PMp6 (3) como un polvo blanco (235 mg, 75%). Pf: 180-183 °C (cristalizado de DMSO-H20); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1 1 .98 (1 H, sa, COOH), 9.33 (1 H, s, N-H), 7.67 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.06 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3/H-5 Ph), 6.58 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.47 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.29 (6H, s, Mex2), 2.19 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1 .52 (4H, m, H-3 y H-5), 1 .28 (2H, m, H-4); 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 174.4 (C-1 ), 166.8 (C-4/ C-6 Pirim), 159.7 (C-2 Pirim), 138.5 (C-4 Ph), 134.5 (C-1 Ph), 128.1 (C- 3/C-5 Ph), 1 18.5 (C-2/C-6 Ph), 1 10.6 (C-5 Pirim), 34.3 (C-6), 33.6 (C-2), 30.8 (C-5), 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.4 (Mex2); IR (KBr) /crrf1: 3295, 3202, 3125, 3082, 2918, 2847, 2600-2400, 1698, 1618, 1585, 1547, 1410, 1377, 1274, 842, 733, 634, 547, 504; EM (Impacto Electrónico, 70 Ev) m/z (%): 313 (Μ+, 45), 312 (9), 238 (3), 226 (5), 213 (7), 212 (100), 21 1 (4); EMAR, m/z (M+): encontrada para C18H23N3O2 313.17896, requerida 313.17903. A mixture of 2-chloro-4,6-dimethylpyrimidine (1,142.8 mg, 1.00 mmol) and 6- (4-aminophenyl) hexane acid (207 mg, 1.00 mmol) in freshly distilled dry dioxane was heated to reflux with stirring under nitrogen atmosphere for 30 h. After this time, the reaction mixture was cooled to room temperature and concentrated to dryness under reduced pressure on the rotary evaporator. The obtained residue was dissolved in approximately 0.5 mL of formic acid and the product was precipitated by slow addition of water (approximately 3 mL). The precipitated solid was collected by vacuum filtration and dried, obtaining the PMp6 compound (3) as a white powder (235 mg, 75%). Mp: 180-183 ° C (crystallized from DMSO-H 2 0); 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm): 1 1 .98 (1 H, sa, COOH), 9.33 (1 H, s, NH), 7.67 (2H, d, J = 8.4 Hz , H-2 / H-6 Ph), 7.06 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3 / H-5 Ph), 6.58 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.47 (2H, t , J = 7.5 Hz, H-6), 2.29 (6H, s, Mex2), 2.19 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1 .52 (4H, m, H-3 and H- 5), 1.28 (2H, m, H-4); 13 C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm): 174.4 (C-1), 166.8 (C-4 / C-6 Pirim), 159.7 (C-2 Pirim), 138.5 (C-4 Ph ), 134.5 (C-1 Ph), 128.1 (C- 3 / C-5 Ph), 1 18.5 (C-2 / C-6 Ph), 1 10.6 (C-5 Pirim), 34.3 (C-6) , 33.6 (C-2), 30.8 (C-5), 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.4 (Mex2); IR (KBr) / crrf 1 : 3295, 3202, 3125, 3082, 2918, 2847, 2600-2400, 1698, 1618, 1585, 1547, 1410, 1377, 1274, 842, 733, 634, 547, 504; MS (Electronic Impact, 70 Ev) m / z (%): 313 (Μ +, 45), 312 (9), 238 (3), 226 (5), 213 (7), 212 (100), 21 1 (4); EMAR, m / z (M + ): found for C18H23N3O2 313.17896, required 313.17903.
Ejemplo 2: Síntesis del compuesto PMb5 (8) [radical del tipo T= R-IV] La síntesis del compuesto que incorpora el brazo espaciador por el anillo de pirimidina se basa en la preparación previa de un compuesto 1 ,3-dicarbonílico que incorpora en la posición adecuada la cadena hidrocarbonada carboxilada que constituye el brazo espaciador del compuesto en cuestión. Una vez preparado este intermedio se completa la elaboración del anillo de pirimidina a través de una reacción de condensación de los grupos carbonilo con los grupos amino de la fenilguanidina. Tal como se ¡lustra en la Figura 2, la preparación del compuesto 1 ,3-dicarbonílico (6) se lleva a cabo a través de la reacción de acilación del 3-oxobutanoato de alilo (4) con el 6-cloro-6-oxohexanoato de metilo, seguido de reacción de desalilación-descarboxilativa catalizada por Pd(0). La condensación de la 1 ,3-dicetona (6) con el nitrato de fenilguanidinio en medio básico genera el esqueleto completo del compuesto de fórmula (I) cuya síntesis finaliza con la hidrólisis del éster metílico de (7) con base. A continuación se ¡lustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula (I) y todos los intermedios de su síntesis. i) Síntesis de 8-metil 2-acetil-3-oxooctanedioato de 1 -alilo (5) Example 2: Synthesis of compound PMb5 (8) [radical of type T = R-IV] The synthesis of the compound that incorporates the spacer arm by the pyrimidine ring is based on the previous preparation of a 1,3-dicarbonyl compound that incorporates in the proper position the carboxylated hydrocarbon chain that constitutes the spacer arm of the compound in question. Once this intermediate is prepared, the preparation of the pyrimidine ring is completed through a condensation reaction of the carbonyl groups with the amino groups of the phenylguanidine. As illustrated in Figure 2, the preparation of 1,3-dicarbonyl compound (6) is carried out through the acylation reaction of allyl 3-oxobutanoate (4) with 6-chloro-6- Methyl oxohexanoate, followed by Pd (0) catalyzed dealylation-decarboxylation reaction. The condensation of 1,3-diketone (6) with phenylguanidinium nitrate in basic medium generates the complete skeleton of the compound of formula (I) whose synthesis ends with the hydrolysis of the methyl ester of (7) with base. The details of the preparation and characterization of this compound of formula (I) and all the intermediates of its synthesis are illustrated below. i) Synthesis of 1-allyl 8-methyl 2-acetyl-3-oxooctanedioate (5)
3-Oxobutanoato de alilo (4, 0.288 mL, 2.1 mmol) se adicionó gota a gota sobre una suspensión agitada de MgC anhidro (200 mg, 2.1 mmol) en CH2CI2 seco (2.5 mL) bajo atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La mezclase enfrió a 0 °C en un baño de hielo y se adicionó piridina seca (0.339 mL, 4.2 mmol). La agitación se continuó a esta temperatura durante 15 minutos y se adicionó gota a gota el 6-cloro-6-oxohexanoato de metilo (0.327 mL, 2.1 mmol), tras lo cual se mantuvo la agitación a 0 °C durante 15 minutos adicionales. Seguidamente se retiró el baño de hielo y la mezcla se dejó agitando a temperatura ambiente durante 5 h. A continuación se enfrió de nuevo la mezcla en un baño de hielo y se adicionó HCI 6 M hasta pH ácido (aproximadamente 1 .5 ml_), se diluyo con agua y se extrajo con éter etílico. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con disolución saturada de NaCI, se secaron sobre MgS04 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida, obteniéndose el compuesto 5 (580 mg, 97%) como un aceite incoloro denso que no requiere purificación y cuyo espectro de 1H RMN muestra que se encuentra exclusivamente en la forma tautomérica ceto-enólica. 1H RMN (300 MHz, CDCIs) δ (ppm): 15.6 (1 H, sa, OH), 5.98 (1 H, ddt, J = 17.2, 10.3, 6.0 Hz, HC=), 5.37 (1 H, dq, J = 17.2, 1 .4 Hz, =CH2), 5.29 (1 H, dq, J = 10.3, 1 .1 Hz, =CH2), 4.70 (2H, dt, J = 6.0, 1 .2 Hz, OCH2), 3.66 (3H, s, CO2CH3), 2.66 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-4), 2.36 (3H, s, CH3CO), 2.33 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-7), 1 .67 (4H, m, H-5 y H-6); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ (ppm): 198.8 (COCH3), 195.8 (C-3), 173.7 (CO2CH3), 166.8 (C-1 ), 131 .8 (HC=), 1 19.3 (=CH2), 108.3 (C-2), 65.6 (OCH2), 51 .5 (CO2CH3), 37.5 (C-4), 33.7 (C-7), 25.7 (COCH3), 25.0 (C-6), 24.5 (C-5); IR (NaCI) /crrf1: 2951 , 2869, 1732, 171 1 , 1563, 1437, 1219, 1077, 755; EM (Impacto Electrónico, 70 Ev) m/z (%): 284 (M+, 1 .7), 226 (12), 21 1 (13), 194 (21 ), 177 (7), 169 (199), 153 (84), 143 (58); EMAR, m/z (M+): encontrada para CuH20O6 284.12639, requerida 284.12599. Allyl 3-Oxobutanoate (4, 0.288 mL, 2.1 mmol) was added dropwise over a stirred suspension of anhydrous MgC (200 mg, 2.1 mmol) in dry CH2CI2 (2.5 mL) under a nitrogen atmosphere at room temperature. The mixture was cooled to 0 ° C in an ice bath and dried pyridine (0.339 mL, 4.2 mmol) was added. Stirring was continued at this temperature for 15 minutes and methyl 6-chloro-6-oxohexanoate (0.327 mL, 2.1 mmol) was added dropwise, after which stirring was maintained at 0 ° C for an additional 15 minutes. The ice bath was then removed and the mixture was allowed to stir at room temperature for 5 h. He then cooled off Again the mixture in an ice bath and 6M HCI was added until acidic pH (approximately 1.5 ml_), diluted with water and extracted with ethyl ether. The combined organic extracts were washed with saturated NaCl solution, dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure, obtaining compound 5 (580 mg, 97%) as a dense colorless oil that does not require purification and whose 1 H NMR spectrum shows that it is found exclusively in the keto-enol tautomeric form. 1 H NMR (300 MHz, CDCIs) δ (ppm): 15.6 (1 H, sa, OH), 5.98 (1 H, ddt, J = 17.2, 10.3, 6.0 Hz, HC =), 5.37 (1 H, dq , J = 17.2, 1 .4 Hz, = CH 2 ), 5.29 (1 H, dq, J = 10.3, 1 .1 Hz, = CH 2 ), 4.70 (2H, dt, J = 6.0, 1 .2 Hz , OCH 2 ), 3.66 (3H, s, CO 2 CH 3 ), 2.66 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-4), 2.36 (3H, s, CH 3 CO), 2.33 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-7), 1.67 (4H, m, H-5 and H-6); 13 C NMR (75 MHz, CDCI 3 ) δ (ppm): 198.8 (COCH 3 ), 195.8 (C-3), 173.7 (CO 2 CH 3 ), 166.8 (C-1), 131 .8 (HC =) , 1 19.3 (= CH 2 ), 108.3 (C-2), 65.6 (OCH 2 ), 51 .5 (CO 2 CH 3 ), 37.5 (C-4), 33.7 (C-7), 25.7 (COCH 3 ), 25.0 (C-6), 24.5 (C-5); IR (NaCI) / crrf 1 : 2951, 2869, 1732, 171 1, 1563, 1437, 1219, 1077, 755; MS (Electronic Impact, 70 Ev) m / z (%): 284 (M + , 1 .7), 226 (12), 21 1 (13), 194 (21), 177 (7), 169 (199) , 153 (84), 143 (58); EMAR, m / z (M + ): found for CuH 20 O 6 284.12639, required 284.12599.
¡i) Síntesis del 6,8-dioxononanoato de metilo (6) Sobre una disolución de Pd(OAc)2 en THF seco (1.5 ml_) se añadieron de forma consecutiva ácido fórmico (0.064 ml_, 1.7 ml_) y Et3N (0.1 13 ml_, 0.81 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Tras unos minutos de agitación se adicionó una disolución del compuesto 5 (200 mg, 0.70 mmol) en THF seco (1 .5 ml_) y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 4 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de una pequeña columna de sílice usando éter etílico para el lavado. La disolución etérea obtenida se lavó con agua, disolución saturada de NaCI, se secó, se filtró y se concentró a sequedad, obteniéndose el compuesto 6 (127 mg, 90%) un aceite viscoso, cuyo espectro de 1H RMN muestra que se trata de una mezcla en equilibrio de las formas tautoméricas ceto-enólica (72%) y dicarbonílica (28%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ (ppm, sólo señales del tautómero ceto-enólico): 15.45 (1 H, sa, OH), 5.49 (1 H, s, H-7), 3.67 (3H, s, CO2CH3), 2.29 (4H, m, H-2 y H-5), 2.05 (3H, s, CH3CO), 1 .65 (4H, m, H-3 y H-4); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ (ppm, sólo señales del tautómero ceto- enólico): 193.6 (C-8), 191 .4 (C-6), 173.8 (C-1 ), 99.8 (C-7), 51 .5 (OCH3), 37.8 (C-5), 33.7 (C-2), 25.0 (C-3), 24.9 (C-9), 24.4 (C-4); IR (NaCI) /cm"1: 2945, 2869, 1738, 1618, 1432, 1203, 1 170, 782; EM (Impacto Electrónico, 70 Ev) m/z (%): 200 (M+, 20), 182 (3), 169 (1 1 ), 168 (8), 143 (24), 127 (16), 126 (12), 1 15 (13), 1 14 (19), 1 13 (28), 1 1 1 (54), 100 (42), 85 (100); EMAR, m/z (M+): encontrada para Ci0H 6O4 200.10514, requerida 200.10486. iii) Síntesis del 5-(6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-il)pentanoato de metilo (7) I) Synthesis of methyl 6,8-dioxononanoate (6) On a solution of Pd (OAc) 2 in dry THF (1.5 ml_), formic acid (0.064 ml_, 1.7 ml_) and Et 3 N (consecutively) were added consecutively 0.1 13 ml_, 0.81 mmol) under nitrogen atmosphere at room temperature. After a few minutes of stirring, a solution of compound 5 (200 mg, 0.70 mmol) in dry THF (1.5 ml) was added and the resulting mixture was heated at reflux for 4 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and filtered through a small silica column using ethyl ether for washing. The ethereal solution obtained was washed with water, saturated NaCl solution, dried, filtered and concentrated to dryness, obtaining compound 6 (127 mg, 90%) a viscous oil, whose 1 H NMR spectrum shows that it is treated. of an equilibrium mixture of keto-enol tautomeric forms (72%) and dicarbonyl (28%). 1 H NMR (300 MHz, CDCI 3 ) δ (ppm, only keto-enol tautomer signals): 15.45 (1 H, sa, OH), 5.49 (1 H, s, H-7), 3.67 (3H, s , CO 2 CH3), 2.29 (4H, m, H-2 and H-5), 2.05 (3H, s, CH 3 CO), 1.65 (4H, m, H-3 and H-4); 13 C NMR (75 MHz, CDCI 3 ) δ (ppm, only ketoenolic tautomer signals): 193.6 (C-8), 191 .4 (C-6), 173.8 (C-1), 99.8 (C- 7), 51.5 (OCH 3 ), 37.8 (C-5), 33.7 (C-2), 25.0 (C-3), 24.9 (C-9), 24.4 (C-4); IR (NaCI) / cm "1 : 2945, 2869, 1738, 1618, 1432, 1203, 1 170, 782; MS (Electronic Impact, 70 Ev) m / z (%): 200 (M + , 20), 182 (3), 169 (1 1), 168 (8), 143 (24), 127 (16), 126 (12), 1 15 (13), 1 14 (19), 1 13 (28), 1 1 1 (54), 100 (42), 85 (100); EMAR, m / z (M + ): found for Ci 0 H 6 O 4 200.10514, required 200.10486 iii) Synthesis of 5- (6-methyl-2 - (Phenylamino) pyrimidin-4-yl) methyl pentanoate (7)
Se introdujeron en una ampolla de vidrio nitrato de /V-fenilguanidinio (175 mg, 0.88 mmol), Na2CO3 (47 mg, 0.44 mmol), dicetona 6 (161 mg, 0.8 mmol) y una pequeña varilla magnética recubierta de PTFE. La ampolla se purgó con nitrógeno, se añadió EtOH (3 ml_), se cerró a vacio y se calentó en un baño a 80 °C con buena agitación durante 18 h. Al cabo de este tiempo se abrió la ampolla, la mezcla de reacción se transfirió a un matraz de fondo redondo y se eliminó el disolvente en el rotavapor. El residuo obtenido se cromatografió de gel de sílice, usando hexano-EtOAc 9: 1 como eluyente, para obtener el compuesto 7 (169 mg, 70%) como un aceite. 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7.66 (2H, da, J = 8.2 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.31 (2H, ta, J = 7.5 Hz, H-3/H-5 Ph), 7.04 (1 H, sa, NH), 7.00 (1 H, tt, J = 7.5, 1 .2 Hz, H-4 Ph), 6.47 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.67 (3H, s, CO2CH3), 2.62 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5), 2.38 (3H, s, CH3-Pirim), 2.37 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-2), 1 .74 (4H, m, H-3 y H-4); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ (ppm): 173.9 (C-1 ), 170.7 (C-4 Pirim), 167.7 (C-6 Pirim), 159.7 (C-2 Pirim), 139.9 (C-1 Ph), 128.8 (C-3/C-5 Ph), 121 .9 (C-4 Ph), 1 18.6 (C-2/C-6 Ph), 1 1 1 .1 (C-5 Pirim), 51 .5 (OCH3), 37.2 (C-5), 33.9 (C-2), 27.9 (C-4), 24.6 (C- 3), 24.0 (CHs-Pirim); IR (NaCI) /crrf1: 3359, 2945, 2858, 1739, 1585, 1432, 750, 689; EMAR, m/z (M+): encontrada para C17H21 N3O2 299.16321 , requerida 299.16338. iv) Síntesis del ácido5-(6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-il)pentanoico They were placed in a glass vial of / V-phenylguanidinium nitrate (175 mg, 0.88 mmol), Na 2 CO3 (47 mg, 0.44 mmol), diketone 6 (161 mg, 0.8 mmol) and a small PTFE coated magnetic rod. The ampoule was purged with nitrogen, EtOH (3 ml_) was added, closed in vacuo and heated in a bath at 80 ° C with good stirring for 18 h. After this time the vial was opened, the reaction mixture was transferred to a round bottom flask and the solvent was removed in the rotary evaporator. The obtained residue was chromatographed on silica gel, using hexane-EtOAc 9: 1 as eluent, to obtain compound 7 (169 mg, 70%) as an oil. 1 H NMR (300 MHz, CDCI 3 ) δ (ppm): 7.66 (2H, da, J = 8.2 Hz, H-2 / H-6 Ph), 7.31 (2H, ta, J = 7.5 Hz, H-3 / H-5 Ph), 7.04 (1 H, sa, NH), 7.00 (1 H, tt, J = 7.5, 1 .2 Hz, H-4 Ph), 6.47 (1 H, s, H-5 Pirim ), 3.67 (3H, s, CO 2 CH 3 ), 2.62 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5), 2.38 (3H, s, CH 3 -Pirim), 2.37 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-2), 1.74 (4H, m, H-3 and H-4); 13 C NMR (75 MHz, CDCI3) δ (ppm): 173.9 (C-1), 170.7 (C-4 Pirim), 167.7 (C-6 Pirim), 159.7 (C-2 Pirim), 139.9 (C-1 Ph), 128.8 (C-3 / C-5 Ph), 121 .9 (C-4 Ph), 1 18.6 (C-2 / C-6 Ph), 1 1 1 .1 (C-5 Pirim), 51.5 (OCH 3 ), 37.2 (C-5), 33.9 (C-2), 27.9 (C-4), 24.6 (C-3), 24.0 (CHs-Pirim); IR (NaCI) / crrf 1 : 3359, 2945, 2858, 1739, 1585, 1432, 750, 689; EMAR, m / z (M + ): found for C17H21 N3O2 299.16321, required 299.16338. iv) Synthesis of 5- (6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl) pentanoic acid
(8, compuesto PMb5) Una disolución acuosa de NaOH 2M (1 ml_) se añadió sobre una disolución del éster metílico 7 (167 mg, 0.56 mmol) en MeOH (3 ml_) y la mezcla se calentó a reflujo con agitación durante 1.5 h. Al cabo de este tiempo se eliminó el disolvente en el rotavapor y el residuo seco obtenido se disolvió en la mínima cantidad de HCO2H y posteriormente se adicionó agua hasta la total precipitación del producto que se recogió por filtración a vacío, el sólido recogido se lavó con agua fría y se secó para obtener el compuesto PMb5 (143 mg, 90%) como un sólido blanco. Pf: 201-204 °C (cristalizado de DMSO-H20); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 12.06 (1 H, sa, COOH), 9.44 (1 H, sa, NH), 7.80 (2H, da, J = 7.6 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.24 (2H, ta, J = 7.9 Hz, H-3/H-5 Ph), 6.89 (1 H, tt, J = 7.3, 1 .2 Hz, H-4 Ph), 6.62 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5 Pirim), 2.57 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-5), 2.32 (3H, s, CH3-Pirim), 2.25 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1 .69 (2H, m. H-4), 1 .54 (2H, m, H-3); 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 174.3 (C-1 ), 170.3 (C-4 Pirim), 167.0 (C-6 Pirim), 159.7 (C-2 Pirim), 140.9 (C-1 Ph), 128.3 (C-3/C-5 Ph), 120.7 (C-4 Ph), 1 18.4 (C-2/C-6 Ph), 1 10.4 (C-5 Pirim), 36.4 (C-5), 33.4 (C-2), 27.4 (C-4), 24.1 (C-3), 23.5 (CH3-Pirim); IR (KBr) /cm"1: 3295, 3202, 3082, 2918, 2852, 2503, 1694, 1618, 1585, 1552, 1508, 1372, 842, 727; EM (Impacto Electrónico, 70 Ev) m/z (%): 285 (M+, 10), 284 (2), 226 (7), 212 (5), 199 (40), 178 (7), 73 (100); EMAR, m/z (M+) encontrada para Ci6H 9N302 285.14819, requerida 285.14773. Ejemplo 3: Síntesis del compuesto PMn5 (11 ) [radical del tipo T= R-VII] (8, compound PMb5) An aqueous solution of 2M NaOH (1 ml_) was added over a solution of methyl ester 7 (167 mg, 0.56 mmol) in MeOH (3 ml_) and the mixture was heated under reflux with stirring for 1.5 h . After this time the solvent in the rotary evaporator was removed and the dry residue obtained was dissolved in the minimum amount of HCO 2 H and subsequently water was added until the total precipitation of the product that was collected by vacuum filtration, the solid collected was washed with cold water and dried to obtain compound PMb5 (143 mg, 90%) as a white solid. Mp: 201-204 ° C (crystallized from DMSO-H 2 0); 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm): 12.06 (1 H, sa, COOH), 9.44 (1 H, sa, NH), 7.80 (2H, da, J = 7.6 Hz, H- 2 / H-6 Ph), 7.24 (2H, ta, J = 7.9 Hz, H-3 / H-5 Ph), 6.89 (1 H, tt, J = 7.3, 1 .2 Hz, H-4 Ph) , 6.62 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5 Pirim), 2.57 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-5), 2.32 (3H, s, CH 3 -Pirim), 2.25 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1.69 (2H, m. H-4), 1.54 (2H, m, H-3); 13 C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm): 174.3 (C-1), 170.3 (C-4 Pirim), 167.0 (C-6 Pirim), 159.7 (C-2 Pirim), 140.9 ( C-1 Ph), 128.3 (C-3 / C-5 Ph), 120.7 (C-4 Ph), 1 18.4 (C-2 / C-6 Ph), 1 10.4 (C-5 Pirim), 36.4 ( C-5), 33.4 (C-2), 27.4 (C-4), 24.1 (C-3), 23.5 (CH 3 -Pirim); IR (KBr) / cm "1 : 3295, 3202, 3082, 2918, 2852, 2503, 1694, 1618, 1585, 1552, 1508, 1372, 842, 727; MS (Electronic Impact, 70 Ev) m / z (% ): 285 (M + , 10), 284 (2), 226 (7), 212 (5), 199 (40), 178 (7), 73 (100); EMAR, m / z (M + ) found for Ci6H 9 N 3 02 285.14819, required 285.14773 Example 3: Synthesis of compound PMn5 (11) [radical of type T = R-VII]
La síntesis del compuesto de fórmula (I) que incorpora el brazo espaciador por el nitrógeno amínico de pirimetanil se lleva a cabo a través de una reacción de alquilación del anión amiduro derivado del mismo con el ω-bromo éster de longitud de cadena adecuada, seguido de hidrólisis básica del grupo éster al correspondiente ácido carboxílico, tal como se ¡lustra en la Figura 3 y se detalla a continuación. i) Síntesis del 5-((4,6-dimetipirimidin-2-il)(fenil)amino)pentanoato de metilo (10) The synthesis of the compound of formula (I) incorporating the spacer arm by the pyrimethanil amine nitrogen is carried out through an alkylation reaction of the amide anion derived therefrom with the ω-bromine ester of suitable chain length, followed of basic hydrolysis of the ester group to corresponding carboxylic acid, as illustrated in Figure 3 and detailed below. i) Synthesis of methyl 5 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino) pentanoate (10)
En un matraz de fondo redondo se pesó hidruro sódico al 60% en aceite mineral (24.1 mg, 0.60 mmol) y a continuación se lavó tres veces con pentano seco bajo atmósfera de nitrógeno, secándolo después con una corriente suave del mismo gas. El polvo blanco suelto resultante se suspendió en dimetilfomamida seca (1 .5 mL) y sobre la suspensión obtenida se añadió gota a gota con agitación una disolución de pirimetanil (9, 100 mg, 0.5 mmol) en dimetilformamida seca (1 .5 mL) a temperatura ambiente. La mezcla, que va adquiriendo una coloración amarillenta, se agitó bajo nitrógeno durante 1 h y a continuación se añadió vía jeringa 5-bromovalerato de metilo (0.148 mL, 1 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 72 h, se vertió sobre agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron sucesivamente con agua, disolución 20% de LiCI y disolución saturada de NaCI. Se secaron sobre Na2S04 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, usando hexano-EtOAc 9: 1 como eluyente, para obtener una mezcla aproximadamente 1 :2 del pirimetanil inicial no reaccionado y 5-((4,6-dimetipirimidin-2-il)(fenil)amino)pentanoato de metilo (10) (145 mg). In a round bottom flask, 60% sodium hydride in mineral oil (24.1 mg, 0.60 mmol) was weighed and then washed three times with dry pentane under a nitrogen atmosphere, then dried with a gentle stream of the same gas. The resulting loose white powder was suspended in dry dimethylfomamide (1.5 mL) and a solution of pyrimethanil (9.5 mg, 0.5 mmol) in dry dimethylformamide (1.5 mL) was added dropwise with stirring at room temperature. The mixture, which becomes yellowish in color, was stirred under nitrogen for 1 h and then 5-bromovalerate methyl syringe (0.148 mL, 1 mmol) was added via syringe. The resulting mixture was stirred at room temperature for approximately 72 h, poured into water and extracted with EtOAc. The combined organic extracts were washed successively with water, 20% LiCI solution and saturated NaCl solution. They were dried over anhydrous Na 2 S0 4 , filtered and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by column chromatography on silica gel, using hexane-EtOAc 9: 1 as eluent, to obtain an approximately 1: 2 mixture of the initial unreacted pyrimethanil and 5 - ((4,6-dimethylpyrimidine-2- il) (phenyl) amino) methyl pentanoate (10) (145 mg).
¡i) Síntesis del ácido 5-((4, 6-dimetilpirimidin-2-il)(fenil)amino)pentanoico I) Synthesis of 5 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino) pentanoic acid
(11 , compuesto PMn5) (11, compound PMn5)
A una disolución de la mezcla anterior en THF se añadió gota a gota agua (0.85 mL) y posteriormente L¡OH H20 sólido (81 .6 mg, 1 .94 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y posteriormente se eliminó el disolvente en el rotavapor. El residuo obtenido se diluyó en H20 (3 mL) y se acidificó cuidadosamente con KHS04 sólido hasta pH 3-4. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc, las fases orgánicas reunidas se secaron sobre MgS04 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, usando CHCl3-MeOH 9: 1 como eluyente, para obtener pirimetanil no reaccionado (36 mg) seguido del compuesto PMn5 (11 ) como un aceite denso (89.8 mg, 60% desde pirimetanil). 1 H RMN (300 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7.36 (2H, m, H-3/H-5 Ph), 7.27 (2H, m, H-2/H-6 Ph), 7.18 (1 H, tt, J = 7.2, 1 .5 Hz, H-4 Ph), 6.32 (1 H, s, H-5 Pirim), 4.04 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-5), 2.37 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-2), 2.24 (6H, s, Mex2), 1 .66 (4H, m, H-3 y H-4); 13C RMN (75 MHz, CDCIs) δ (ppm): 179.0 (C-1 ), 166.9 (C-4/ C-6 Pirim), 161 .7 (C-2 Pirim), 144.5 (C-1 Ph), 128.8 (C-3/C-5 Ph), 127.5 (C-2/C-6 Ph), 125.3 (C-4 Ph), 109.9 (C-5 Pirim), 49.5 (C-5), 33.7 (C-2), 27.2 (C-4), 24.0 (Mex2), 21 .8 (C-3); IR (NaCI) v /cm"1 : 3044, 2928, 2864, 1708, 1578, 1563, 1498, 1475, 1376, 1339, 1219, 694; EM (Impacto Electrónico, 70 Ev) m/z (%): 299 (M+, 21 ), 298 (10), 226 (24), 224 (5), 213 (16), 212 (100), 209 (1 1 ), 208 (17), 207 (84), 200 (2), 199 (15), 198 (25); EMAR, m/z (M+): encontrada para C17H21 N3O2 299.16426, requerida 299.16338. To a solution of the above mixture in THF was added dropwise water (0.85 mL) and subsequently solid LOH 2 H (81.6 mg, 1.94 mmol). The resulting mixture was stirred at room temperature for 24 h and subsequently the solvent was removed in the rotary evaporator. The obtained residue was diluted in H 2 0 (3 mL) and carefully acidified with solid KHS0 4 to pH 3-4. The resulting mixture was extracted with EtOAc, the combined organic phases were dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by chromatography on silica gel, using CHCl3-MeOH 9: 1 as eluent, to obtain unreacted pyrimethanil (36 mg) followed by compound PMn5 (11) as a dense oil (89.8 mg, 60% from pyrimethanil ). 1 H NMR (300 MHz, CDCI 3 ) δ (ppm): 7.36 (2H, m, H-3 / H-5 Ph), 7.27 (2H, m, H-2 / H-6 Ph), 7.18 (1 H, tt, J = 7.2, 1.5 Hz, H-4 Ph), 6.32 (1 H, s, H-5 Pirim), 4.04 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-5), 2.37 ( 2H, t, J = 7.0 Hz, H-2), 2.24 (6H, s, Mex2), 1.66 (4H, m, H-3 and H-4); 13 C NMR (75 MHz, CDCIs) δ (ppm): 179.0 (C-1), 166.9 (C-4 / C-6 Pirim), 161 .7 (C-2 Pirim), 144.5 (C-1 Ph) , 128.8 (C-3 / C-5 Ph), 127.5 (C-2 / C-6 Ph), 125.3 (C-4 Ph), 109.9 (C-5 Pirim), 49.5 (C-5), 33.7 ( C-2), 27.2 (C-4), 24.0 (Mex2), 21 .8 (C-3); IR (NaCI) v / cm "1 : 3044, 2928, 2864, 1708, 1578, 1563, 1498, 1475, 1376, 1339, 1219, 694; MS (Electronic Impact, 70 Ev) m / z (%): 299 (M +, 21), 298 (10), 226 (24), 224 (5), 213 (16), 212 (100), 209 (1 1), 208 (17), 207 (84), 200 (2) ), 199 (15), 198 (25); EMAR, m / z (M + ): found for C17H21 N3O2 299.16426, required 299.16338.
1.2. Activación de los compuestos de fórmula (I) 1.2. Activation of the compounds of formula (I)
Los ejemplos de compuestos de fórmula (I) aquí presentados contienen un grupo carboxilo como grupo químico funcional para su conjugación a proteínas portadoras, concretamente por reacción con los grupos amino libres de la proteína. El grupo carboxilo se activó utilizando carbonato de Λ/,Λ/'- disuccinimidilo (DSC) siguiendo protocolos previamente publicados [F.A. Esteve-Turrillas et al. , Anal. Chim. Acta 201 0, 682, 93-103]. En concreto, se disolvió 0.082 mmol del correspondiente compuesto de fórmula (I) de pirimetanil y 0.14 mmol de DSC en 0.8 ml_ de acetonitrilo seco en atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadió 0.31 mmol de trietilamina y se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución se diluyó en cloroformo, se lavó con una disolución saturada de NaHCÜ3 y salmuera y se secó con Na2S04 anhidro. Después de evaporar el disolvente, el residuo restante se purificó por cromatografía en columna, usando cloroformo como eluyente, obteniéndose el éster de /V-hidroxisuccinimida del compuesto de fórmula (I) de pirimetanil en forma pura. Examples of compounds of formula (I) presented herein contain a carboxyl group as a functional chemical group for conjugation to carrier proteins, specifically by reaction with the free amino groups of the protein. The carboxyl group was activated using Λ /, Λ / '- disuccinimidyl carbonate (DSC) following previously published protocols [FA Esteve-Turrillas et al. Anal Chim. Minutes 201 0, 682, 93-103]. In particular, 0.082 mmol of the corresponding compound of formula (I) of pyrimethanil and 0.14 mmol of DSC was dissolved in 0.8 ml_ of dry acetonitrile under a nitrogen atmosphere. Then, 0.31 mmol of triethylamine was added and stirred at room temperature overnight. The solution was diluted in chloroform, washed with a saturated NaHCÜ3 solution and brine and dried over anhydrous Na 2 S0 4 . After evaporating the solvent, the remaining residue was purified by column chromatography, using chloroform as eluent, obtaining the / V-hydroxysuccinimide ester of the compound of formula (I) of pyrimethanil in pure form.
1.3. Conjugación de los compuestos de fórmula (I) a proteínas para obtener compuestos de fórmula (II) Tampones y disoluciones: 1.3. Conjugation of the compounds of formula (I) to proteins to obtain compounds of formula (II) Buffers and solutions:
PB: Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 7.4;  PB: 100 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4;
PBS: Tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7.4 con NaCI 140 mM;  PBS: 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 with 140 mM NaCl;
PBST: Tampón PBS conteniendo 0.05% (v/v) de polioxietilen (20) sorbitanmonolaurato (conocido como Tween 20);  PBST: PBS buffer containing 0.05% (v / v) of polyoxyethylene (20) sorbitanmonolaurate (known as Tween 20);
CB: Tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9.6;  CB: 50 mM sodium carbonate buffer, pH 9.6;
Disolución de lavado: NaCI 150 mM conteniendo 0.05% (v/v) de Tween 20.  Washing solution: 150 mM NaCI containing 0.05% (v / v) Tween 20.
Los analitos se disolvieron en Λ/,/V-dimetilformamida (DMF) anhidra y se almacenaron a -20 °C. The analytes were dissolved in anhydrous / /, / V-dimethylformamide (DMF) and stored at -20 ° C.
Los compuestos de fórmula (II) se prepararon como se esquematiza en la Figura 4, según los procedimientos siguientes. The compounds of formula (II) were prepared as outlined in Figure 4, according to the following procedures.
1 .3.1 . Compuesto de fórmula (II) donde P es BSA 1 .3.1. Compound of formula (II) where P is BSA
A 2.0 mL de una disolución de 15 mg/mL de proteína albúmina de suero bovino (BSA) en tampón CB se añadió gota a gota 200 μί de una disolución 50 mM de compuesto de fórmula (I) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1 .2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el compuesto de fórmula (II) se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (II), medido espectrofotom ófricamente fue de 16, 1 1 , 14 y 14 para PMm6, PMp6, PMb5 y PMn5, respectivamente. To 2.0 mL of a 15 mg / mL solution of bovine serum albumin protein (BSA) in CB buffer, 200 μί of a 50 mM solution of compound of formula (I) activated, obtained as indicated in Section 1 .2, in DMF. The reaction was carried out for 4 h at room temperature with gentle stirring and then, the compound of formula (II) was purified by molecular exclusion chromatography on Sephadex G-25 using PB buffer as eluent. The degree of conjugation, n as described in the compound of formula (II), measured African spectrophotomally was 16, 1 1, 14 and 14 for PMm6, PMp6, PMb5 and PMn5, respectively.
1 .3.2. Compuesto de fórmula (II) donde P es OVA A 2.0 ml_ de una disolución de 15 mg/mL de proteína albúmina de huevo (OVA) en tampón CB se añadió gota a gota 100 μΙ_ de una disolución 100 mM del compuesto de fórmula (I) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1 .2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 2.5 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el compuesto de fórmula (II) se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (II), medido espectrofotométricamente fue de 12, 8, 8 y 9 moléculas para PMm6, PMp6, PMb5 y PMn5, respectivamente. 1 .3.3. Compuesto de fórmula (II) donde P es HRP 1 .3.2. Compound of formula (II) where P is OVA To 2.0 ml_ of a solution of 15 mg / mL of egg albumin protein (OVA) in CB buffer was added dropwise 100 μ 100_ of a 100 mM solution of the compound of formula (I) activated, obtained as indicated in the section 1 .2, in DMF. The reaction was carried out for 2.5 h at room temperature with gentle stirring and then, the compound of formula (II) was purified by molecular exclusion chromatography on Sephadex G-25 using PB buffer as eluent. The degree of conjugation, n as described in the compound of formula (II), measured spectrophotometrically was 12, 8, 8 and 9 molecules for PMm6, PMp6, PMb5 and PMn5, respectively. 1 .3.3. Compound of formula (II) where P is HRP
A 1 .0 mL de una disolución de 2.2 mg/mL de proteína peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón CB se añadió gota a gota 100 μί de una disolución 10 mM (o 5 mM) de compuesto de fórmula (I) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1 .2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el compuesto de fórmula (II) se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (II), medido espectrofotométricamente fue de 7, 6, 5 y 3 para PMm6, PMp6, PMb5 y PMn5, respectivamente. 2. Inmunización de conejos To 1.0 mL of a solution of 2.2 mg / mL of horseradish peroxidase protein (HRP) in CB buffer 100 µί of a 10 mM (or 5 mM) solution of compound of formula (I) activated was added dropwise , obtained as indicated in section 1 .2, in DMF. The reaction was carried out for 4 h at room temperature with gentle stirring and then, the compound of formula (II) was purified by molecular exclusion chromatography on Sephadex G-25 using PB buffer as eluent. The degree of conjugation, n as described in the compound of formula (II), measured spectrophotometrically was 7, 6, 5 and 3 for PMm6, PMp6, PMb5 and PMn5, respectively. 2. Immunization of rabbits
Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo blancas de la raza New Zealand con cada compuesto de fórmula (II) donde P es BSA obtenido tal como se describe en el apartado 1 .3.1 . [C. Suárez- Pantaleón et al. , J. Agrie. Food Chem. 2010, 58, 8502-851 1 ]. Cada animal recibió 0.3 mg de uno de los compuestos de fórmula (II) disuelto en 1 mL de una mezcla 1 : 1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de conjugado pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre obtenida se dejó coagular a 4 °C durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperaron los sueros por centrifugación, se diluyeron a ½ con PBS frío y se les añadió un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico. El precipitado proteico resultante de cada suero se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frío. Finalmente, las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4°C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteínas que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. Se obtuvieron dos anticuerpos de cada compuesto de fórmula (II) donde P es BSA, identificados como #1 y #2. Two white rabbit females of the New Zealand breed were immunized following standardized protocols with each compound of formula (II) where P is BSA obtained as described in section 1.3.1. [C. Suárez- Pantaleón et al. J. Agrie. Food Chem. 2010, 58, 8502-851 1]. Each animal received 0.3 mg of one of the compounds of formula (II) dissolved in 1 mL of a 1: 1 mixture of PB buffer and complete Freund's adjuvant. Immunization continued with the inoculation of a booster dose every 21 days with the same amount of conjugate but using incomplete Freund's adjuvant. Ten days after the fourth injection, the animals they were bled and the blood obtained was allowed to clot at 4 ° C overnight. The next day, the sera were recovered by centrifugation, diluted to ½ with cold PBS and a volume of a saturated solution of ammonium sulfate was added. The resulting protein precipitate from each serum was collected by centrifugation and redissolved in cold PBS buffer. Finally, the proteins were reprecipitated as before and stored in this state at 4 ° C. This precipitate contains an indeterminate mixture of proteins that we call antiserum, polyclonal antibody or simply antibody. Two antibodies were obtained from each compound of formula (II) where P is BSA, identified as # 1 and # 2.
3. Procedimiento ELISA 3. ELISA procedure
Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocilios. Cada anticuerpo se evaluó en los dos formatos clásicos de ELISA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa) usando tanto antígenos de ensayo homólogos, es decir un antígeno de ensayo a partir del mismo compuesto de fórmula (I) que el utilizado para obtener el inmunógeno; como antígenos de ensayo heterólogos, es decir obtenidos a partir de un compuesto de fórmula (I) diferente al empleado para obtener el inmunógeno. Se emplearon pipetas electrónicas de 8 canales para la dispensación rápida y precisa de los inmunorreactivos. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, USA). La actividad peroxidasa usada como marcador se reveló con 100 μί por pocilio de una disolución 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampón 25 mM citrato, 62 mM fosfato, pH 5.4 conteniendo 0.012% (v/v) de H2O2. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 μί por pocilio de H2S04 2.5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocilio se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, USA). Las curvas patrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de analito se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando el paquete informático SigmaPlot de SPSS (Chicago, USA). El título del anticuerpo se definió como el recíproco de la dilución del anticuerpo que proporciona una señal máxima (Amax) alrededor de 1 .0 en ausencia de analito libre en ensayo de ELISA competitivo en el formato de conjugado inmovilizado homólogo a 0.1 mg/mL con detección indirecta. La afinidad del anticuerpo (IC50) se estimó como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la señal máxima. 96-well polystyrene plates were used. Each antibody was evaluated in the two classic formats of competitive ELISA (the one of antigen or conjugate immobilized with indirect detection and the one of immobilized antibody with direct detection) using both homologous test antigens, that is to say a test antigen from the same compound of formula (I) than that used to obtain the immunogen; as heterologous test antigens, that is, obtained from a compound of formula (I) different from that used to obtain the immunogen. 8-channel electronic pipettes were used for rapid and accurate dispensing of immunoreactive agents. After each incubation step, the plates were washed four times with a wash solution, using a 96 channel ELx405 washer (Biotek Instruments, Winooski, USA). The peroxidase activity used as a marker was revealed with 100 μί per well of a 2 mg / mL solution of o-phenylenediamine in 25 mM citrate buffer, 62 mM phosphate, pH 5.4 containing 0.012% (v / v) of H 2 O 2 . This development was developed for 10 min at room temperature and stopped using 100 μί per well of H 2 S0 4 2.5 M. At the end of the tests, the absorbance of each well was read at 492 nm using a reference wavelength of 650 nm in a PowerWave HT microplate reader (Biotek Instruments, Winooski, USA). The sigmoid pattern curves obtained by representing absorbance versus analyte concentration were adjusted to a four-parameter logistic equation using the SPSS SigmaPlot software package (Chicago, USA). The antibody titer was defined as the reciprocal of the antibody dilution that provides a maximum signal (A max ) around 1.0 in the absence of free analyte in a competitive ELISA assay in the immobilized immobilized conjugate format at 0.1 mg / mL with indirect detection. The affinity of the antibody (IC50) was estimated as the concentration of free analyte capable of halving the maximum signal.
3.1. Ensayos ELISA competitivos en formato de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto) 3.1. Competitive ELISA assays in immobilized antigen or conjugate format with indirect detection (indirect assay)
Las placas se tapizaron con 100 μί por pocilio de una disolución de antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (II) donde P es OVA a 0.01 o a 0.1 pg/mL en tampón CB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 μί por pocilio de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 μί por pocilio de una dilución concreta de un determinado anticuerpo en PBST. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un antígeno de ensayo diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocilio recibió 100 μί de una dilución 1/104 de GAR-HRP en PBST conteniendo 10% de suero bovino fetal. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente. 3.2. Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa (ensayo directo) The plates were upholstered with 100 μί per well of a test antigen solution which is a compound of formula (II) where P is OVA at 0.01 or 0.1 pg / mL in CB buffer by overnight incubation at room temperature. After washing the plates, 50 μί per well of a complete standard analyte curve in PBS was dispensed in each column followed by 50 μί per well of a specific dilution of a given antibody in PBST. The same reagent distribution was repeated for each plate with a different test antigen. The immunochemical reaction was carried out for 1 h at room temperature and then the plates were washed. Next, each well received 100 μί of a 1/10 4 dilution of GAR-HRP in PBST containing 10% fetal bovine serum. This reaction was left at room temperature for 1 h. After washing the plates, the retained peroxidase activity was revealed and the absorbance at 492 nm was read as described above. 3.2. Competitive ELISA assays in immobilized antibody format with direct detection (direct assay)
Las placas se tapizaron con 100 μί por pocilio de una dilución de anticuerpo en tampón CB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 μί por pocilio de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 μΙ_ por pocilio de una dilución concreta en PBST de un trazador enzimático determinado que es un compuesto de fórmula (II) donde P es HRP. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un anticuerpo diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito. The plates were upholstered with 100 μί per well of an antibody dilution in CB buffer by overnight incubation at room temperature. After washing the plates, 50 μί was dispensed in each column per well of a complete standard analyte curve in PBS followed by 50 μΙ_ per well of a specific dilution in PBST of a given enzyme tracer which is a compound of formula (II) where P is HRP. The same reagent distribution was repeated for each plate with a different antibody. The immunochemical reaction was carried out for 1 h at room temperature and then the plates were washed. Finally, the retained peroxidase activity was revealed and the absorbance at 492 nm was read as described.
4. Resultados 4. Results
4.1. Respuesta inmune Los cuatro inmunógenos produjeron respuestas inmunes semejantes y equivalentes, con títulos entorno a 105 (Figura 5). 4.1. Immune response The four immunogens produced similar and equivalent immune responses, with titers around 10 5 (Figure 5).
4.1 .1. Determinación de la afinidad de los anticuerpos 4.1 .1. Determination of antibody affinity
Cada uno de los anticuerpos obtenidos se ensayó frente a su antígeno de ensayo homólogo usando el ensayo de tipo ELISA competitivo, tanto en formato de ensayo de antígeno inmovilizado con detección indirecta como en el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Se ensayaron diferentes concentraciones de antígeno de ensayo frente a diferentes concentraciones de anticuerpo en ensayo competitivo utilizando como competidor diferentes concentraciones de pirimetanil preparadas por dilución senada. Solamente a partir de tres de los compuestos de fórmula (I) sintetizados, PMm6, PMp6, y PMb5, fue posible generar anticuerpos capaces de reconocer al pirimetanil con elevada afinidad. Este resultado confirma que dichas estructuras son idóneas para el objetivo que se persigue y demuestra la dificultad para predecir la posición óptima de funcionalización de los compuestos de fórmula (I). Los valores de la señal máxima, la IC50 y de la pendiente de la curva de inhibición resultante para cada anticuerpo con su antígeno de ensayo homólogo se han incluido en las Tablas 1 (a-d) y las Tablas 2 (a-d). Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de antígeno inmovilizado con detección indirecta: Each of the antibodies obtained was tested against its homologous test antigen using the competitive ELISA type assay, both in immobilized antigen assay format with indirect detection and in the immobilized antibody format with direct detection. Different concentrations of test antigen were tested against different concentrations of antibody in competitive assay using different concentrations of pyrimethanil prepared by designated dilution as a competitor. Only from three of the compounds of formula (I) synthesized, PMm6, PMp6, and PMb5, was it possible to generate antibodies capable of recognizing pyrimethanil with high affinity. This result confirms that said structures are suitable for the objective pursued and demonstrates the difficulty in predicting the optimal functionalization position of the compounds of formula (I). The values of the maximum signal, the IC50 and the slope of the resulting inhibition curve for each antibody with its homologous test antigen have been included in Tables 1 (ad) and Tables 2 (ad). Result of tests in competitive ELISA format of immobilized antigen with indirect detection:
Tabla 1a Table 1a
OVA-PMm6  OVA-PMm6
Conjugado Título Ac.  Conjugate Title Ac.
Anticuerpo (Mg/mL) (x103) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (Mg / mL) (x10 3 ) Amax Slope IC 50 (nM)
rPMm6#1 0.1 300 0.58 0.64 12.99  rPMm6 # 1 0.1 300 0.58 0.64 12.99
0.1 100 1.36 0.54 19.97  0.1 100 1.36 0.54 19.97
rPMm6#2 0.1 300 0.75 0.57 10.44  rPMm6 # 2 0.1 300 0.75 0.57 10.44
0.1 100 1.59 0.60 19.44  0.1 100 1.59 0.60 19.44
Tabla 1 b Table 1b
OVA-PMp6  OVA-PMp6
Conjugado Título Ac.  Conjugate Title Ac.
Anticuerpo ( Q/mL) (x103) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (Q / mL) (x10 3 ) Amax Pending IC 50 (nM)
rPMp6#1 0.01 300 0.80 0.55 7.0  rPMp6 # 1 0.01 300 0.80 0.55 7.0
0.1 100 1.12 0.56 14.2  0.1 100 1.12 0.56 14.2
rPMp6#2 0.01 1000 0.74 0.44 5.6  rPMp6 # 2 0.01 1000 0.74 0.44 5.6
0.1 300 1.09 0.57 22.6  0.1 300 1.09 0.57 22.6
Tabla 1 c Table 1 c
OVA-PMb5  OVA-PMb5
Conjugado Título Ac.  Conjugate Title Ac.
Anticuerpo (Mg/ml) (x103) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (Mg / ml) (x10 3 ) Amax Pending IC 50 (nM)
rPMb5#1 0.01 100 1.13 0.64 2.2  rPMb5 # 1 0.01 100 1.13 0.64 2.2
0.1 300 1.30 0.57 5.3  0.1 300 1.30 0.57 5.3
rPMb5#2 0.01 100 0.92 0.57 3.0  rPMb5 # 2 0.01 100 0.92 0.57 3.0
0.1 300 0.95 0.50 9.0  0.1 300 0.95 0.50 9.0
Tabla 1 d Table 1 d
OVA-PMn5  OVA-PMn5
Conjugado Título Ac.  Conjugate Title Ac.
Anticuerpo ( Q/mL) (x103) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (Q / mL) (x10 3 ) Amax Pending IC 50 (nM)
rPMn5#1 0.01 300 1.13 0.64 57.7  rPMn5 # 1 0.01 300 1.13 0.64 57.7
0.1 1000 0.69 — —  0.1 1000 0.69 - -
rPMn5#2 0.01 1000 0.87 0.69 754.7  rPMn5 # 2 0.01 1000 0.87 0.69 754.7
0.1 1000 0.82 ... ... Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de anticuerpo inmovilizado con detección directa: 0.1 1000 0.82 ... ... Result of tests in competitive ELISA format of immobilized antibody with direct detection:
Tabla 2a Table 2a
HRP-PMm6  HRP-PMm6
Trazador Título Ac.  Tracer Title Ac.
Anticuerpo (ng/mL) (x1 03) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (ng / mL) (x1 0 3 ) Amax Pending IC 50 (nM)
rPMm6#1 10 30 0.81 0.67 5.75  rPMm6 # 1 10 30 0.81 0.67 5.75
10 10 1 .30 1 .00 7.32  10 10 1 .30 1 .00 7.32
rPMm6#2 30 3 0.59 0.43 194.65  rPMm6 # 2 30 3 0.59 0.43 194.65
100 3 1 .07 0.43 592.47  100 3 1 .07 0.43 592.47
Tabla 2b Table 2b
HRP-PMp6  HRP-PMp6
Trazador Título Ac.  Tracer Title Ac.
Anticuerpo (ng/mL) (x1 03) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (ng / mL) (x1 0 3 ) A max Slope IC 50 (nM)
rPMp6#1 3 30 1 .1 1 0.61 6.9  rPMp6 # 1 3 30 1 .1 1 0.61 6.9
10 30 1 .50 0.72 14.8  10 30 1 .50 0.72 14.8
rPMp6#2 1 30 1 .98 0.60 58.6  rPMp6 # 2 1 30 1 .98 0.60 58.6
3 100 1 .14 0.50 12.8  3 100 1 .14 0.50 12.8
Tabla 2c Table 2c
HRP-PMb5  HRP-PMb5
Trazador Título Ac.  Tracer Title Ac.
Anticuerpo (ng/mL) (x1 03) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (ng / mL) (x1 0 3 ) Amax Pending IC 50 (nM)
rPMb5#1 3 10 0.86 0.75 0.9  rPMb5 # 1 3 10 0.86 0.75 0.9
10 30 0.65 0.84 1 .9  10 30 0.65 0.84 1 .9
rPMb5#2 3 3 0.62 0.80 1 .1  rPMb5 # 2 3 3 0.62 0.80 1 .1
10 3 1 .45 1 .02 0.6  10 3 1 .45 1 .02 0.6
Tabla 2d 2d table
HRP-PMn5  HRP-PMn5
Trazador Título Ac.  Tracer Title Ac.
Anticuerpo (ng/mL) (x1 03) Amax Pendiente IC50 (nM) Antibody (ng / mL) (x1 0 3 ) A max Slope IC 50 (nM)
rPMn5#1 3 30 0.76 0.74 46.2  rPMn5 # 1 3 30 0.76 0.74 46.2
10 30 1 .97 0.79 63.1  10 30 1 .97 0.79 63.1
rPMn5#2 3 30 0.78 0.63 144.0  rPMn5 # 2 3 30 0.78 0.63 144.0
10 30 2.18 0.72 205.4  10 30 2.18 0.72 205.4
En la Figura 6 se muestran las curvas de inhibición obtenidas con el anticuerpo rPMp6#1 y el compuesto de fórmula (II) que es un antígeno de ensayo homólogo, tanto en formato de antígeno de ensayo inmovilizado con detección indirecta como con el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Para el ensayo indirecto los pocilios se tapizaron con 0.01 g de compuesto de fórmula (II) que es un antígeno de ensayo y la dilución del anticuerpo en la etapa de competición fue de 1/105. En el caso del ensayo con formato directo, el pocilio se tapizó con 100 μΙ_ de una dilución del anticuerpo a 1/2x104 y en la etapa competitiva se usó 0.3 ng de trazador enzimático homólogo. Figure 6 shows the inhibition curves obtained with the rPMp6 # 1 antibody and the compound of formula (II) which is a homologous test antigen, both in test antigen format immobilized with Indirect detection as with the immobilized antibody format with direct detection. For the indirect assay, the wells were upholstered with 0.01 g of compound of formula (II) which is a test antigen and the dilution of the antibody in the competition stage was 1/10 5 . In the case of the direct format test, the well was upholstered with 100 μΙ_ of a dilution of the antibody to 1 / 2x10 4 and in the competitive stage 0.3 ng of homologous enzyme tracer was used.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un compuesto de fórmula (I): one . A compound of formula (I):
T-L-Y  T-L-Y
(I)  (I)
caracterizado porque characterized because
T se selecciona del grupo que consiste en R-l, R-ll, R-lll, R-IV y R-V;  T is selected from the group consisting of R-l, R-ll, R-lll, R-IV and R-V;
Figure imgf000039_0001
donde
Figure imgf000039_0001
where
R-l se selecciona del grupo que consiste en [2-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo];  Rl is selected from the group consisting of [2 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
R-ll es [4,6-dimetil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo];  R-ll is [4,6-dimethyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl];
R-lll se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-metilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4-metilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  R-lll is selected from the group consisting of [2 - ((4-methylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4- ( (4-methylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4- ilo] y [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [/V-(4,6-dimetilpinmidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; R-IV is selected from the group consisting of [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4- yl] and [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; Y RV is [/ V- (4,6-dimethylpinmidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;  L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said hydrocarbon chain comprises between 0 and 10 heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N;
Y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -COOH, -NH2, -N3, -CH2Br, -CH2I, -CHO, -SH, -S03H, -OS02Ph, -NH-NH2 y -OS02Ar; Y is a functional group selected from the group consisting of -COOH, -NH 2 , -N 3 , -CH 2 Br, -CH 2 I, -CHO, -SH, -S0 3 H, -OS0 2 Ph, -NH -NH 2 and -OS0 2 Ar;
con la condición de que: with the condition of:
a) cuando T es [4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo], -L-Y es diferente de -CH2CH2-NH2; a) when T is [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], -LY is different from -CH 2 CH 2 -NH 2 ;
b) cuando T es [4-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo], -L-Y es diferente de -CONHCH2-C02H; b) when T is [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], -LY is different from -CONHCH 2 -C0 2 H;
c) cuando T es [4-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], -L-Y es diferente de -CHCH3-C02H; c) when T is [4 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], -LY is different from -CHCH 3 -C0 2 H;
d) cuando T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo], -L-Y es diferente de -OCH2-C02H; d) when T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl] -LY is different from -OCH 2 -C0 2 H;
e) cuando T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no comprende ningún heteroátomo;  e) when T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino], L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, linear or branched, saturated or unsaturated , with the proviso that said hydrocarbon chain does not comprise any heteroatom;
f) cuando T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino], -L-Y es diferente de -(CH2)3-NH2. f) when T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino], -LY is different from - (CH 2 ) 3 -NH 2 .
2. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 , caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono. 2. A compound of formula (I) according to claim 1, characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms.
3. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. 3. A compound of formula (I) according to any one of the preceding claims, characterized in that Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH.
4. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpinmidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. 4. A compound of formula (I) according to any one of the preceding claims, characterized in that T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpinmidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH.
5. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona dentro del grupo que consiste en 5. A compound of formula (I) according to claim 4, characterized in that it is selected from the group consisting of
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6. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. 6. A compound of formula (I) according to any one of claims 1 to 3, characterized in that T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH.
7. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 6, caracterizado porque es
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7. A compound of formula (I) according to claim 6, characterized in that it is
Figure imgf000041_0002
8. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. A compound of formula (I) according to any one of claims 1 to 3, characterized in that T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH.
9. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 8, caracterizado porque es 9. A compound of formula (I) according to claim 8, characterized in that it is
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10. Un compuesto de fórmula (II): 10. A compound of formula (II):
[T-L-Z]n-P [T-L-Z] n-P
(II)  (II)
caracterizado porque characterized because
T se selecciona del grupo que consiste en R-l, R-ll, R-lll, R-IV y R-V;  T is selected from the group consisting of R-l, R-ll, R-lll, R-IV and R-V;
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donde where
R-l se selecciona del grupo que consiste en [2-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-([(4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo];  Rl is selected from the group consisting of [2 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ([(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
R-ll es [4,6-dimetil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo];  R-ll is [4,6-dimethyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl];
R-lll se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-metilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4-metilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  R-lll is selected from the group consisting of [2 - ((4-methylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4- ( (4-methylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4- ilo] y [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y  R-IV is selected from the group consisting of [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4- yl] and [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; Y
R-V es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino];  R-V is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said chain hydrocarbon comprises between 0 and 10 heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N;
Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH- - -, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)- -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-  Z is a functional group selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH- - -, -S-, -SS-, - NH (C = NH) - -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N = N-
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P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons; y  P is a natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons; Y
n es un número con un valor entre 1 y 500. n is a number with a value between 1 and 500.
1 1 . Un compuesto de fórmula (II) según la reivindicación 10, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono. eleven . A compound of formula (II) according to claim 10, characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms.
12. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 1 1 , caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000043_0002
12. A compound of formula (II) according to any one of claims 10 or 1, characterized in that Z is selected from the group consisting of
Figure imgf000043_0002
13. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, 3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. 13. A compound of formula (II) according to any one of claims 10 to 12, characterized in that P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
14. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque 14. A compound of formula (II) according to any one of claims 10 to 13, characterized in that
T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo]; T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-
Figure imgf000044_0001
L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-
Figure imgf000044_0001
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, /3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.  P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, / 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
15. Un compuesto de formula (II) según la reivindicación 14, caracterizado porque T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. 15. A compound of formula (II) according to claim 14, characterized in that T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2 -yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 5 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
16. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque 16. A compound of formula (II) according to any one of claims 10 to 13, characterized in that
T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];  T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0002
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, /3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.  P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, / 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
17. Un compuesto de formula (II) según la reivindicación 16, caracterizado porque T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. 17. A compound of formula (II) according to claim 16, characterized in that T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
18. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones18. A compound of formula (II) according to any one of the claims
10 a 13, caracterizado porque 10 to 13, characterized in that
T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000045_0001
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, 3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.  P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
19. Un compuesto de formula (II) según la reivindicación 18, caracterizado porque T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. 19. A compound of formula (II) according to claim 18, characterized in that T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
20. Un compuesto de fórmula (III): 20. A compound of formula (III):
[T-L-Z]m-Q [TLZ] m -Q
(III)  (III)
caracterizado porque characterized because
T se selecciona del grupo que consiste R-l, R-ll, R-lll, R-IV y R-V;  T is selected from the group consisting of R-l, R-ll, R-lll, R-IV and R-V;
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000045_0002
R-lll R-IV R-lll R-IV
Figure imgf000045_0003
donde
Figure imgf000045_0003
where
R-l se selecciona del grupo que consiste en 2-((4,6-dimetilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4,6- dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo];  Rl is selected from the group consisting of 2 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4- ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
R-ll es [4,6-dimetil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-ll is [4,6-dimethyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl];
R-lll se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-metilpirimidin-2- il)amino)fenilo], [3-((4-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4-metilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  R-lll is selected from the group consisting of [2 - ((4-methylpyrimidin-2- yl) amino) phenyl], [3 - ((4-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4- ( (4-methylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4- ¡lo] y [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo];y  R-IV is selected from the group consisting of [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4- ¡lo] and [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; and
R-V es [/V-(4,6-dimetilpinmidin-2-il)-/V-(fenil)amino];  R-V is [/ V- (4,6-dimethylpinmidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;  L is a hydrocarbon chain of 2 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said hydrocarbon chain comprises between 0 and 10 heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N;
Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-,  Z is a functional group selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -SS- , -NH (C = NH) -, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N = N-,
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0001
Q es un marcador no isotópico; y  Q is a non-isotopic marker; Y
m es un número entero con un valor entero entre 1 y 1000. m is an integer with an integer value between 1 and 1000.
21 . Un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 20, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono. twenty-one . A compound of formula (III) according to claim 20, characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms.
22. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21 , caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, ■
Figure imgf000046_0002
22. A compound of formula (III) according to any one of claims 20 or 21, characterized in that Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, ■
Figure imgf000046_0002
23. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. 23. A compound of formula (III) according to any one of claims 20 to 22, characterized in that Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a Coumarin fluorophore, a ruthenium bipyril, luciferin or any of its derivatives, an acridinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
24. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque 24. A compound of formula (III) according to any one of claims 20 to 23, characterized in that
T es [3-((4,6-dimetilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4,6-dimetilpirimidin-2- ¡l)amino)fenilo];  T is [3 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4,6-dimethylpyrimidin-2- 1) amino) phenyl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,  Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0001
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.  Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
25. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones25. A compound of formula (III) according to any one of the claims
20 a 23, caracterizado porque 20 to 23, characterized in that
T es [6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];  T is [6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;  L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000047_0002
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000047_0002
Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
26. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque 26. A compound of formula (III) according to any one of claims 20 to 23, characterized in that
T es [/V-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-/V-(fenil)amino];  T is [/ V- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) - / V- (phenyl) amino];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms;
Z se selecciona del ru o ue consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, Z is selected from ru or ue consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0001
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.  Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
27. Un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fórmula (II) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19. 27. An antibody generated in response to a compound of formula (II) as described in any one of claims 10 to 19.
28. Método de análisis in vitro de pirimetanil en una muestra que comprende las siguientes etapas: a. poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en la reivindicación 27; b. incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y c. determinar la existencia de reacción ¡nmunoquímica tras la incubación del paso (b). 28. Method of in vitro analysis of pyrimethanil in a sample comprising the following steps: a. contacting the sample with the antibody described in claim 27; b. incubate the sample and the antibody of step (a) for a suitable period of time for an immunochemical reaction to take place; Y C. determine the existence of an immunochemical reaction after the incubation of step (b).
29. Método de análisis de pirimetanil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción ¡nmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de formula (II) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19. 29. Method of analysis of pyrimethanil according to claim 28, characterized in that the determination of the immunochemical reaction in step (c) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a compound of formula (II) as described in a any of claims 10 to 19.
30. Método de análisis de pirimetanil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción ¡nmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de formula (III) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26. 30. Method of analysis of pyrimethanil according to claim 28, characterized in that the determination of the immunochemical reaction in step (c) is carried out by a competitive immunoassay, using as a competitor a compound of formula (III) as described in a any of claims 20 to 26.
31 . Kit de detección de pirimetanil, caracterizado porque comprende al menos un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 27 y un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de fórmula (II) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 y un compuesto de fórmula (III) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26. 31. Pyrimethanil detection kit, characterized in that it comprises at least one antibody as defined in claim 27 and a compound selected from the group consisting of a compound of formula (II) as defined in any of claims 10 to 19 and a compound of formula (III) as defined in any one of claims 20 to 26.
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