WO2013073684A1 - 哺乳動物個体における前肢帯筋異常症を診断するためのマーカーおよびそれを用いた検出方法 - Google Patents

哺乳動物個体における前肢帯筋異常症を診断するためのマーカーおよびそれを用いた検出方法 Download PDF

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哲夫 国枝
貴 平野
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Okayama University NUC
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Definitions

  • the present invention relates to a marker for diagnosing forelimb girdle dysplasia in a mammal individual and a method for diagnosing forelimb girdle dysplasia in a mammal individual using the same.
  • Forelimb-girdle muscular anomaly also known as the three shoulders in livestock, is known to be a genetic disorder whose main symptoms are tremor and difficulty in standing up due to low formation of the forelimb girdle muscle. (Masoudi et al., Animal Science Journal 78 (6), 672-675, 2007). In cattle, individuals with forelimb band myopathy are often abandoned, and the onset of this disease causes significant economic losses to producers. Although this genetic disease is known to be due to a recessive mutation, the causative gene is unknown and the carrier individual cannot be identified, and thus the occurrence of the disease could not be prevented.
  • An object of the present invention is to provide a marker for diagnosing a forelimb band myogenesis abnormality in a mammal individual and a method for diagnosing a forelimb band myogenesis abnormality in a mammal individual using the marker.
  • the inventors have suffered from forelimb band myopathy, although the base on the bovine genome corresponding to the 1060th base of the cDNA of the GFRA1 gene (GenBank accession number: NM_001105411.1) is C in healthy individuals. It was found that bovine individuals and bovine individuals who are carriers of forelimb band myopathy have a nonsense mutation in which this base is mutated to T, and lack the function of the GFRA1 gene. It came.
  • the mammal may be a human or non-human, and may be a laboratory animal such as a mouse, rat, rabbit or monkey, a pet such as a dog or cat, or a domestic animal such as a cow, horse, sheep or pig. .
  • cow refers to an animal belonging to the genus Bos, and includes, for example, livestock cattle of the Bos taurus species, Banten (wild cattle) of the Bos javanicus species, and Bob indicus species of cows.
  • the base position is indicated by the base of the sense strand in the DNA duplex.
  • the base position is, for example, the 1060th base sequence of GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) family receptor alpha 1 (GFRA1) gene cDNA (NM_001105411.1, SEQ ID NO: 1).
  • the base sequence is specified by counting from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the base sequence.
  • the base is the base specified in the base sequence. If there is a deletion or insertion of a base on the genomic DNA containing the base, it is not always necessary to match the number representing the base position.
  • the marker according to the present invention is a marker for diagnosing a mammal individual suffering from forelimb band myopathy, or a carrier of forelimb band myopathy, and is one of the GFRA1 genes. It consists of an isolated polynucleotide having part or all, wherein the polynucleotide contains a loss-of-function mutation of the gene.
  • the mammal individual is preferably a bovine individual.
  • the loss-of-function mutation is more preferably a mutation at the 1060th base of the cDNA of the GFRA1 gene having SEQ ID NO: 1.
  • the marker according to the present invention is a marker for diagnosing that a mammal individual suffers from forelimb band myopathy, or is a carrier of forelimb band myopathy, and lacks a function. It is characterized in that it is mRNA encoding the GFRA1 protein or GFRA1 protein lacking the function.
  • the kit according to the present invention is a kit for diagnosing a mammal individual suffering from forelimb band myopathy, or being a carrier for forelimb band myopathy, and one of the GFRA1 genes.
  • An isolated polynucleotide having a part or all of the polynucleotide comprises a primer pair for amplifying a base having a loss-of-function mutation of the gene.
  • the mammal individual is preferably a bovine individual.
  • the loss-of-function mutation is more preferably a mutation at the 1060th base of the cDNA of the GFRA1 gene having SEQ ID NO: 1.
  • the kit according to the present invention further comprises a restriction enzyme, which is amplified by the primer pair depending on whether the base amplified by the primer pair has a loss-of-function mutation of the gene. It is further preferred that the cleavage pattern of the polypeptide containing the generated base is different. More preferably, the restriction enzyme is MwoI.
  • a diagnostic method is a diagnostic method for diagnosing that a mammal individual other than a human suffers from forelimb band myopathy, or is a carrier for forelimb band myopathy. And a step of examining whether the GFRA1 gene is a wild type or has a loss-of-function mutation in genomic DNA or mRNA isolated from the mammal individual.
  • this diagnosis method when the wild-type GFRA1 gene is not present in the genomic DNA or when the mRNA transcribed from the wild-type GFRA1 gene is not present in the mRNA, the individual mammal is treated with a forelimb band myopathy.
  • the mammal individual is a carrier individual of forelimb band myopathy.
  • the mammal individual when both alleles of the GFRA1 locus have a loss-of-function mutation, the mammal individual is diagnosed as an affected individual with a forelimb band myopathy, and the GFRA1 gene It is more preferable that the method further comprises a step of diagnosing that the mammal individual is a carrier individual of forelimb band myopathy when one of the alleles has a loss-of-function mutation. More preferably, the mammalian individual is a bovine individual.
  • the loss-of-function mutation is a nonsense mutation at the 1060th base in the cDNA of the GFRA1 gene having SEQ ID NO: 1. More preferably, the nonsense mutation is a C to T mutation.
  • the diagnostic method according to the present invention is a diagnostic method for diagnosing the presence of a forelimb girdle myopathy in a non-human mammal individual, which encodes a wild-type GFRA1 protein in the mammalian individual.
  • the expression level cannot be detected, it is preferable to diagnose that the individual mammal is suffering from forelimb band myopathy.
  • the identification method according to the present invention is a method for identifying a non-human mammal individual who is a carrier of forelimb band myopathy, isolated from a non-human mammal individual who does not develop forelimb band myopathy.
  • a step of examining whether or not the GFRA1 gene has a loss-of-function mutation in the genomic DNA or mRNA, and a non-human mammal having a wild-type GFRA1 gene and a GFRA1 gene having a loss-of-function mutation in the genomic DNA Identifying an animal individual or a non-human mammal individual in which mRNA transcribed from the wild-type GFRA1 gene and mRNA transcribed from a GFRA1 gene having a loss-of-function mutation are present in the mRNA.
  • the mammal individual is a bovine individual.
  • the loss-of-function mutation is more preferably a nonsense mutation from C to T in the 1060th base of the cDNA of the GFRA1 gene having SEQ ID NO: 1.
  • the method for determining whether the GFRA1 gene is a cause of the forelimb girdle myopathy in a mammal individual suffering from forelimb girdle myopathy is a mammal individual suffering from forelimb girdle myopathy.
  • a step of determining a part or all of the base sequence of the GFRA1 gene in a mammal individual who is a carrier of forelimb band myopathy, the determined base sequence, and the base sequence of the wild-type GFRA1 gene is a step of comparing, and a step of determining whether or not there is a loss-of-function mutation in the determined base sequence.
  • the marker according to the present invention is a marker for diagnosing that a bovine individual suffers from forelimb band myopathy, or is a carrier for forelimb band myopathy, and includes MOK2630, MOK2637, SNP. B, and an isolated polynucleotide having one or more bases or base sequences selected from the group consisting of SNP D.
  • the kit according to the present invention is a kit for diagnosing that a bovine individual suffers from forelimb band myopathy, or is a carrier of forelimb band myopathy, and includes MOK2630, MOK2637, SNP. B and one or more primer pairs for amplifying one or more selected from the group consisting of SNP D.
  • the diagnostic method according to the present invention is a diagnostic method for diagnosing that a bovine individual suffers from forelimb band myopathy, or is a carrier for forelimb band myopathy, comprising the bovine individual And examining whether one or more genotypes selected from the group consisting of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D are healthy or diseased.
  • the diagnostic method according to the present invention further comprises a step of examining whether the genotype of MOK2630 is a healthy type or a disease type in genomic DNA isolated from a bovine individual, wherein the MOK2630 genotype is a disease type.
  • the bovine individual is diagnosed as an affected individual of a forelimb girdle myopathy, and when the genotype of the MOK2630 is a heterozygous of a normal type and a disease type, the bovine individual is a forelimb It is preferable to diagnose that the bovine individual is a healthy individual when diagnosing as a carrier individual for dystrophy of the band and when the genotype of the MOK2630 is a healthy homozygote.
  • the diagnostic method according to the present invention further comprises a step of examining whether the genotype of MOK2637 is a healthy type or a disease type in genomic DNA isolated from a bovine individual, wherein the MOK2637 genotype is a disease type.
  • the bovine individual is diagnosed as an affected individual of a forelimb girdle myopathy, and when the genotype of the MOK2637 is a heterozygous of a healthy type and a disease type, the bovine individual is a forelimb It is preferable to diagnose that the bovine individual is a healthy individual when diagnosing as a carrier individual for dystrophy of the girdle and when the genotype of the MOK2637 is a healthy homozygote.
  • the diagnostic method according to the present invention further comprises a step of examining whether the SNP B genotype is a healthy type or a disease type in genomic DNA isolated from a bovine individual, wherein the SNP B genotype is When the diseased type is homozygous, it is diagnosed that the bovine individual is affected by a forelimb girdle myopathy, and when the SNP-B genotype is a heterozygous between a healthy type and a diseased type, the bovine individual It is preferable to diagnose that the bovine individual is a healthy individual when the individual is diagnosed as a carrier individual for forelimb band myopathy and the genotype of the SNP B is a healthy homozygote.
  • the diagnostic method according to the present invention further comprises a step of examining whether the SNP D genotype is a healthy type or a disease type in genomic DNA isolated from a bovine individual, wherein the SNP D genotype is When the diseased type is homozygous, the bovine individual is diagnosed as having a forelimb girdle myopathy, and the SNP D genotype is a healthy type and a diseased type heterozygote. It is preferable to diagnose that the bovine individual is a healthy individual when the individual is diagnosed as a carrier individual with forelimb band myopathy and the genotype of the SNP D is a healthy homozygote.
  • the identification method according to the present invention is an identification method of bovine individuals that are carriers of forelimb band myopathy, and in genomic DNA isolated from bovine individuals that do not develop forelimb band myopathy, MOK2630, MOK2637 , SNP B, and SNP D, a step of examining whether one or more genotypes selected from the group consisting of normal type and disease type, and the examined genotype is a heterozygote of normal type and disease type
  • the method includes the step of identifying a bovine individual.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram of healthy type (1-7) and disease type (8) of MOK2630, which is an embodiment of the present invention. It is an electrophoretogram of healthy type (1, 2, 4) and disease type (No. 3) of MOK2637, which is an embodiment of the present invention. It is a figure which shows the nonsense variation
  • healthy Japanese black hair (lane 1, Normal), forelimb girdle muscular dysfunction carrier black hair Japanese (lane 2, Carrier), forelimb girdle muscular abnormality affected black hair (lane 3, Affected) It is a figure which shows the pattern of the DNA fragment obtained by digesting the PCR product which used the genomic DNA of (2) with MwoI.
  • Forelimb girdle myopathy is a disease caused by a recessive mutation that deletes the function of the GFRA1 gene (deficient mutation). That is, when the wild type GFRA1 gene is not present on the genomic DNA, the individual (also referred to as an affected individual in this specification) suffers from forelimb band myopathy. In this case, all GFRA1 genes possessed by the individual are also mutant GFRA1 genes having a loss-of-function mutation. Moreover, if the individual has at least one wild-type GFRA1 gene, the phenotype of the individual is normal and no forelimb band myopathy is developed.
  • the individual does not develop forelimb band myopathy It ’s not a career.
  • This healthy individual is an individual in which all copies of the GFRA1 gene are wild-type GFRA1 gene, and even if the phenotype is normal, the affected individual does not develop a carrier individual or a forelimb band myopathy Is not included.
  • the individual has two copies of the GFRA1 gene allele, one at the GFRA1 locus on the genome, ie, no extra gene copies other than the normal GFRA1 gene, If the allele has a loss-of-function mutation, it becomes an individual affected with a forelimb band dysfunction, and if only one allele has a loss-of-function mutation, it becomes a carrier for forelimb band dysfunction. If wild type, it becomes a healthy individual.
  • forelimb girdle myopathy refers to a disease known as “forelimb girdle myopathy” or “three shoulders” in cattle and bovine “forelimb girdle muscle” in mammals other than cattle. It refers to a disease corresponding to “abnormality” or a disease that shows poor formation of forelimb or upper limb girdle muscle, and may be a disease that is not known by the name of the “forelimb band muscle abnormality” in the mammal. .
  • a mammal individual “has developed forelimb girdle myopathy” means that the individual suffers from forelimb girdle myopathy, resulting in poor formation of forelimb or upper limb girdle muscles. It means that is recognized.
  • limb mammals in addition to morphological features such as scapular protrusion due to poorly formed forelimb girdle muscles and drooping of the auricles, it is not seen in healthy individuals such as difficulty standing up and decreased motor function such as tremor Abnormalities may also be present.
  • these physical abnormalities and motor function abnormalities are not limited by the degree.
  • An individual “being suffered from forelimb band myopathy” may or may not have developed forelimb band myopathy. This refers to the case where the type GFRA1 gene is not present.
  • forelimb band myopathy is also related to mRNA transcribed from the GFRA1 gene.
  • mRNA transcribed from the wild type GFRA1 gene in mRNA transcribed from the GFRA1 gene. Does not exist.
  • mRNA transcribed from a wild-type GFRA1 gene and mRNA transcribed from a GFRA1 gene having a loss-of-function mutation exist in healthy individuals. In healthy individuals, only mRNA transcribed from the wild-type GFRA1 gene is present, and mRNA transcribed from the GFRA1 gene having a loss-of-function mutation is absent.
  • an isolated polynucleotide having a part or all of the GFRA1 gene and containing a mutation that deletes the function of the GFRA1 gene the individual suffers from forelimb muscular abnormalities Or, it can be used as a marker for diagnosing a carrier of forelimb band myopathy.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA such as mRNA.
  • the wild-type GFRA1 gene refers to base substitution, insertion, deletion, etc. in the GFRA1 gene that does not have a loss-of-function mutation and the GFRA1 gene that does not have a loss-of-function mutation. It refers to a gene that is occurring and causes forelimb muscular abnormalities when its expression is lost in the individual.
  • the animal from which the wild-type GFRA1 gene is derived may be appropriately selected from mammals depending on the diagnosis target.
  • the wild-type GFRA1 gene is a gene in which base substitution, insertion, deletion, etc.
  • GFRA1 gene of SEQ ID NO: 2 (Gene ID: 534801) and the GFRA1 gene of SEQ ID NO: 2. It refers to the gene that causes forelimb girdle myopathy when its expression is lost in an individual.
  • the mutation when an individual having only the GFRA1 gene having a mutation develops forelimb band myopathy, the mutation is referred to as a loss-of-function mutation.
  • the GFRA1 gene is referred to as a mutant GFRA1 gene having a loss-of-function mutation.
  • the mutation is not included in the loss-of-function mutation.
  • the loss-of-function mutation in the GFRA1 gene is not limited by the position on the gene and the type of base as long as it causes forelimb girdle myopathy, for example, point mutation, deletion Any of mutation, insertion mutation and the like may be used. Moreover, if the forelimb girdle myopathy is developed due to the loss-of-function mutation, the mutant GFRA1 protein may or may not be expressed.
  • the mutation occurs if the mutation is a mutation that deletes the function of the wild-type GFRA1 gene
  • the position of the base on the gene is not limited.
  • the loss-of-function mutation is a nonsense mutation from C to T in the base corresponding to the 1060th base of the cDNA of the GFRA1 gene (NM_001105411.1, SEQ ID NO: 1), and 5 It may be a nonsense mutation in the 'base.
  • a nonsense mutation at the base corresponding to the 1060th base of the above-mentioned bovine GFRA1 gene cDNA or a nonsense mutation at the base 5 ′ side thereof may be.
  • a mutant GFRA1 mRNA is generated by transcription of a mutant GFRA1 gene having a loss-of-function mutation in an individual suffering from forelimb band myopathy, or an individual who is a carrier for forelimb band myopathy, and a mutant GFRA1 protein is generated.
  • wild-type GFRA1 protein is reduced or disappeared to the extent of developing forelimb band myopathy, compared to healthy individuals. Therefore, the expression levels of wild-type GFRA1 protein and mRNA encoding wild-type GFRA1 protein can also be used as markers for diagnosing that an individual suffers from forelimb band myopathy.
  • the wild-type GFRA1 protein is a protein encoded by the wild-type GFRA1 gene and a protein in which amino acid substitution, insertion, deletion or the like occurs in the protein encoded by the wild-type GFRA1 gene, A protein that causes forelimb girdle myopathy when its expression is lost in an individual.
  • the animal from which the wild-type GFRA1 protein is derived may be appropriately selected from mammals according to the diagnostic object.
  • the wild-type GFRA1 protein includes amino acid substitutions, insertions in the GFRA1 protein of SEQ ID NO: 3 (GenBank accession number: NP_0010988881.1) and homologs thereof, and the GFRA1 protein of SEQ ID NO: 3 or homologs thereof. It refers to a protein in which a deletion or the like has occurred and causes forelimb band muscle abnormalities when its expression is lost in bovine individuals.
  • a mammalian individual suffers from forelimb band myopathy, or is a carrier for forelimb band myopathy, first isolate genomic DNA from the mammal individual, On the other hand, it can be diagnosed by examining whether the GFRA1 gene has a loss-of-function mutation.
  • the individual can be diagnosed as suffering from forelimb band myopathy, and (2) function In the case of having a GFRA1 gene having a deletion mutation and a wild-type GFRA1 gene, the individual can be diagnosed as a carrier of forelimb band myopathy, (3) having a wild-type GFRA1 gene, and having a loss-of-function mutation When it does not have the GFRA1 gene, it can be diagnosed as a healthy individual.
  • the method for examining whether or not the GFRA1 gene has a loss-of-function mutation is not particularly limited.
  • the base sequence of the GFRA1 gene may be determined, or a known specific base substitution is detected. If so, RFLP may be used.
  • the loss-of-function mutation is a mutation from C to T at the 1060th base of the cDNA of the GFRA1 gene (SEQ ID NO: 1)
  • a genomic DNA fragment containing the base is amplified using PCR
  • the resulting DNA fragment may be reacted with MwoI to determine whether the PCR product is cleaved.
  • the base is mutated from C to T
  • the PCR product is not cleaved by MwoI, but if not mutated, it is cleaved by MwoI. Can be easily determined.
  • the individual when PCR products after cleavage with an enzyme are separated by electrophoresis and only PCR products cleaved with MwoI are detected, the individual is a healthy individual who is not a carrier of forelimb band myopathy and is not affected.
  • a PCR product that is not cleaved with MwoI and a PCR product that is cleaved with MwoI are detected, it is a carrier individual of forelimb band myopathy, and only a PCR product that is not cleaved with MwoI is detected. It can be diagnosed that the affected individual suffers from myopathy.
  • a mammal individual suffers from forelimb band myopathy by examining the expression of wild-type GFRA1 protein or mRNA encoding wild-type GFRA1 protein in the tissue of the individual. Good. Examples of the tissue include blood, semen, muscle, nerve, bone, kidney, liver, thymus, skin, and fertilized egg.
  • wild-type GFRA1 protein or mRNA encoding wild-type GFRA1 protein is expressed. It is not limited to the extent that the organization is doing.
  • the individual can be diagnosed as suffering from forelimb band muscular abnormalities.
  • a mammal individual is a carrier of forelimb girdle muscular abnormality indicates that wild-type GFRA1 protein and mutant GFRA1 protein, or wild-type GFRA1 protein and mutant GFRA1 protein in the forelimb girdle muscle tissue of the individual. Diagnosis may be made by examining the expression of the encoded mRNA. As a result, when wild-type GFRA1 protein and mutant-type GFRA1 protein, or mRNA encoding mutant-type GFRA1 protein and mRNA encoding wild-type GFRA1 protein are both detected, the individual has abnormalities in forelimb muscles. It can be diagnosed as a carrier individual with the disease.
  • the individual When the expression of mRNA encoding the wild type GFRA1 protein or the wild type GFRA1 protein is detected and the expression of the mRNA encoding the mutant GFRA1 protein or the mutant GFRA1 protein is not detected, the individual is It can be diagnosed as a carrier individual with forelimb band myopathy or a healthy individual.
  • the method for detecting the expression of the protein or mRNA encoding the protein may be any method that can specifically detect wild-type or mutant GFRA1 protein or mRNA encoding wild-type or mutant GFRA1 protein. It may be a method for detecting the full length of protein or mRNA, or a method for detecting a part thereof. As a detection method, a method well known to those skilled in the art may be used as appropriate. Examples thereof include Northern blotting and reverse transcription PCR for mRNA, and Western blotting and ELISA using a specific antibody for protein.
  • the forelimb band It can be determined that myopathy is caused by a mutation in the GFRA1 gene.
  • MOK2630 a microsatellite marker on bovine chromosome 26, MOK2637, SNP B, and SNPD (Table 1), which are microsatellite markers on bovine chromosome 26
  • MOK2637 a microsatellite marker on bovine chromosome 26
  • SNP B a microsatellite marker on bovine chromosome 26
  • SNPD SNPD
  • one or more isolated polynucleotides including one or more selected from the group consisting of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D, can cause bovine individuals to suffer from forelimb band myopathy. It can be used as a marker for diagnosing being a carrier of a forelimb band myopathy.
  • MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D are in linkage disequilibrium, and the genotypes of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D have a strong correlation with each other, so MOK2630, MOK2637, SNP If any one of B and SNP D is determined, any other genotype can be estimated. For example, if any one of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D is a healthy type, the other three genotypes are also healthy, and MOK2630, MOK2637, SNP B, and If any one genotype of SNP D is a disease type, it is estimated that the other three genotypes are also a disease type.
  • MOK2630 is a DNA having a repetitive sequence starting from the 36222000th position of the bovine genome of the bovine genome assembly (Btau4.0), and the MOK2637 is 369777078 of the bovine genome of the bovine genome bovine genome assembly (Btau4.0).
  • DNA having a repetitive sequence starting from the second position SNP B is the 373373727th base of cattle chromosome 26 of bovine genome assembly (Btau4.0), and SNP D is bovine 26 of bovine genome assembly (Btau4.0) It is the 37013762 base of the chromosome (Table 1).
  • SNPs There are two types of SNPs, T and G, in SNP B, where T is a normal type and G is a disease type. There are two types of SNPs, A and G, in SNP D, where A is a healthy type and G is a disease type (Table 1).
  • the allele of MOK2630 is specified by the number of GT repetitions included in the base sequence.
  • the allele of MOK2637 is specified by the number of AT repeats contained in the base sequence.
  • the alleles of MOK2630 and MOK2637 were examined in each of one or more healthy individuals and affected individuals, and each of MOK2630 and MOK2637 was hardly detected in healthy individuals. What is necessary is just to determine the allele detected in an affected individual at a significantly high frequency. Further, in order to identify healthy alleles of MOK2630 and MOK2637, it is only necessary to determine alleles that are hardly detected in affected individuals but significantly detected in healthy individuals in each of MOK2630 and MOK2637.
  • MOK2630 contains 8 types of alleles with different numbers of GT repeats. Existed. Numbers 1 to 7 from the smallest number of repetitions are healthy, and number 8 from the largest number of repetitions is the disease type (FIG. 1, numbers 1 to 8 from the top). In addition, in MOK2637, there were four types of alleles with different numbers of AC repetitions. Counting from the least number of repetitions, No. 1, No. 2, and No. 4 are healthy types, and No. 3 is a disease type (FIG. 2, No. 1 to No. 4 from the top).
  • the number of bases constituting the polynucleotide used as the marker is not particularly limited.
  • the polynucleotide used as the marker may have at least one of the bases in MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D, and in the case of having a plurality, It does not matter.
  • the genotypes of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D may be determined, for example, by directly determining their base sequences or by using PCR or RFLP, and the determination method is not particularly limited. These may be determined using methods well known to those skilled in the art. When determining the base sequence by PCR, for example, primer pairs shown in Table 1 may be used. When the base sequence is directly determined, all bases in the polynucleotide constituting the marker may be determined, but the base sequence of MOK2630, the base sequence of MOK2637, SNPSNB included in the polynucleotide constituting the marker It is sufficient to be able to determine one or more selected from the group consisting of bases in and bases in SNPSND.
  • MOK2630 and MOK2637 have a certain number of repetitions of GT and AC in the case of healthy allele and disease allele, respectively, in order to determine the genotype of MOK2630 or MOK2637 in the bovine individual to be diagnosed Examines the base sequence, or examines the base length by electrophoresis or the like, and detects whether the allyl is a disease type or a healthy type.
  • the base length of MOK2630 or MOK2637 obtained from the individual to be diagnosed is changed to the known disease type allele of MOK2630 and MOK2637, or healthy. Compared to the base length of the type allele, it may be determined whether the genotype of MOK2630 or MOK2637 in the individual to be diagnosed is a healthy type or a disease type.
  • the type and amount of tissue for isolating genomic DNA are not particularly limited as long as the amount of DNA necessary for determining the base sequence of microsatellite and the base of SNP can be obtained.
  • MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D are in linkage disequilibrium, if at least one of the genotypes is determined, the mammal individual will develop forelimb girdle myopathy. It can be diagnosed that it is affected or a carrier of forelimb band myopathy, but if any 2 or more, more preferably 3 or more, most preferably 4 genotypes are determined, more Diagnosis can be made accurately.
  • the combination when determining genotypes in two or three of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D, the combination is not particularly limited.
  • the combinations include MOK2630 and MOK2637; MOK2630 and SNP B; MOK2630 and SNP D; MOK2630, MOK2637 and SNP B; MOK2630, MOK2637 and SNP D; And SNP D; MOK2637 and SNP B; MOK2637 and SNP D; MOK2637, SNP B, and SNP D; SNP B and SNP D.
  • the genotypes of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D are homozygous haplotypes consisting of disease-type allele and disease-type SNP, respectively.
  • a haplotype composed of a disease-type allele and a disease-type SNP respectively
  • a haplotype composed of a normal-type allele and a healthy-type SNP respectively.
  • Example 3 in healthy individuals, there is no bovine individual having a haplotype consisting of a disease-type allele and a disease-type SNP.
  • any one or more genotypes of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D are examined. If you are suffering from an abnormality and are heterozygous for each of the healthy and diseased types, the individual is a carrier for forelimb band myopathy, and if each is a healthy homozygous, the individual is a healthy individual. Can be diagnosed.
  • the genotypes of a plurality of markers are examined, if different results are obtained, the result of the marker having a high linkage rate with the GFRA1 gene may be preferentially judged. You may judge.
  • Example 1 the presence or absence of a loss-of-function mutation in the bovine GFRA1 gene is detected by the RFLP method, and it is diagnosed that it is suffering from forelimb band myopathy and its carrier. Show what you can do.
  • a 345 bp region containing exon 4 of the GFRA1 gene was amplified by PCR using the following primer pair.
  • GFRA1-F2 ATGCTCCTCACGGTACCTCTGTCCTAAA (SEQ ID NO: 12)
  • GFRA1-R3 GTTCCCTTCCAGAGCTCAAGC (SEQ ID NO: 13)
  • mutation occurs in both alleles in affected individuals and in one allele in carrier individuals.
  • This mutation is a nonsense mutation from C to T in the 1060th base of the coding region of the GFRA1 gene, and is a mutation that loses the function of the GFRA1 gene.
  • An amplified fragment amplified by PCR is not cleaved with MwoI when it has this mutation, but is cleaved with MwoI when it does not have this mutation.
  • 199 bp and 146 bp bands were detected in healthy individuals (lane 1), 345 bp, 199 bp and 146 bp bands were detected in carrier individuals (lane 2), and affected individuals (lane 3). A 345 bp band was detected.
  • the individual suffers from forelimb band myopathy, or the forelimb band myopathy Can be diagnosed.
  • Example 2 the presence or absence of a loss-of-function mutation in the GFRA1 gene indicates that the patient is diagnosed as having a forelimb band myopathy and being a carrier.
  • a 345 bp region containing exon 4 of the bovine GFRA1 gene was amplified by PCR using the primer pair of Example 1 (SEQ ID NOs: 12 and 13). The carrier individual was determined based on the fact that its offspring was an onset individual.
  • the 1060th base of the bovine GFRA1 gene cDNA (SEQ ID NO: 1) is homozygous for T, and in all 6 carrier individuals, the 1060th of the bovine GFRA1 gene cDNA The bases of C and T were heterozygous, and in all 37 healthy individuals, the 1060th base of the bovine GFRA1 gene cDNA was C homozygous.
  • the bovine suffers from forelimb band myopathy, and is a carrier for forelimb band myopathy This can be diagnosed with a probability of 100%.
  • the 1060th mutation of the cDNA of the GFRA1 gene is a loss-of-function mutation of the GFRA1 gene, this result depends on whether the GFRA1 gene has a loss-of-function mutation or not. Showing that it can be diagnosed as having a disorder or being a carrier of a forelimb girdle myopathy, and in a mammal other than a bovine, suffering from a disease exhibiting forelimb or upper limb girdle malformation, It shows that the carrier can be diagnosed.
  • genotypes of MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D indicates that the patient has a forelimb girdle muscular abnormality and can be diagnosed as a carrier. .
  • DNA was isolated by the phenol / chloroform method from the semen, blood, or muscle tissue of 26 Japanese black cats with forelimb band myopathy. This DNA was subjected to PCR using each detection primer pair described in Table 1 to amplify a DNA fragment containing MOK2630, MOK2637, SNP B, and SNP D. For detection of the genotypes of SNP B and SNP D, cleavage with MseI (SNP B) and BamAI (SNP D) was further performed.
  • the MOK2630, MOK2637, and SNP D genotypes were all diseased, ie homozygous for Nos. 8, 3, G (Table 1) in 26 individuals.
  • the genotype of SNP B was a disease type, that is, a homozygote of G (Table 1) in 25 individuals, but only one individual was a heterozygote of disease type (G) and healthy type (T) (Table 2). ).
  • MOK2630 61 individuals
  • MOK2637 119 individuals
  • SNP B 118 individuals
  • SNP D 117 individuals
  • MOK2630 was 11 individuals
  • MOK2637 was 18 individuals
  • SNP B was 8 individuals
  • SNP D was 28 individuals
  • MOK2630 was 50 individuals
  • MOK2637 was 100 individuals
  • SNP B was 110 individuals
  • SNP D was 89 individuals
  • the present invention it is possible to provide a marker for diagnosing forelimb band myopathy in a mammal individual and a method for diagnosing forelimb band myopathy in a mammal individual using the marker.

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Abstract

　本発明では、ＧＦＲＡ１機能欠失型変異を含む、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチド、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、個体が前肢帯筋異常症であること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用する。また、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄから成る群より選択される１つ以上を含む、単離されたポリヌクレオチドは、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用することができる。

Description

哺乳動物個体における前肢帯筋異常症を診断するためのマーカーおよびそれを用いた検出方法
　本発明は、哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常を診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常の診断方法に関する。
　前肢帯筋異常症（forelimb-girdle muscular anomaly）は、家畜では三枚肩ともよばれ、前肢帯筋の低形成による振戦と起立困難を主な症状とする遺伝子疾患であることが知られている（Masoudi et al., Animal Science Journal 78(6), 672-675, 2007）。ウシでは、前肢帯筋異常症発症個体は多くの場合廃用とせざるを得ないため、本疾患の発症は生産者に多大な経済的損失を与える。この遺伝子疾患は、劣性突然変異によるものであることが知られているが、その原因遺伝子は不明でキャリア個体を同定することができないため、疾患の発生を予防することができなかった。
　本発明は、哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常を診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常の診断方法を提供することを目的とする。
　発明者らは、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１０５４１１．１）の１０６０番目の塩基に対応する、ウシゲノム上の塩基が、健常個体ではＣであるが、前肢帯筋異常症に罹患したウシ個体、および、前肢帯筋異常症のキャリアであるウシ個体は、この塩基がＴに変異したナンセンス変異を有し、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させていることを見出し、本発明の完成に至った。
　本明細書において、哺乳動物は、ヒトでもヒト以外でもよく、マウス、ラット、ウサギ、サル等の実験動物、イヌ、ネコ等のペット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等の家畜であってもよい。
　本明細書において「ウシ」はBos属の動物を指し、例えば、Bos taurus種の家畜牛、Bos javanicus種のバンテン（野生牛）、Bos indicus種のコブウシなどが含まれる。
　本明細書において、塩基の位置に関する記載は特記しない限り、ＤＮＡ２重鎖のうち、センス鎖の塩基によって示す。また、塩基の位置は、例えば、GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) family receptor alpha 1（ＧＦＲＡ１）遺伝子のｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１１０５４１１．１、配列番号１）の１０６０番目というように、基準となる塩基配列中で、当該塩基配列の５’側から３’側方向に数えることで特定されているが、実際のウシ個体の塩基配列中では、その塩基は、基準となる塩基配列中で特定した塩基に対応する位置にあればよく、その塩基が含まれるゲノムＤＮＡ上に塩基の欠失や挿入がある場合には、必ずしも塩基の位置を表わす数字まで一致する必要はない。
　本発明に係るマーカーは、哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドからなり、前記ポリヌクレオチドは、前記遺伝子の機能欠失型変異を含むことを特徴とする。ここで、哺乳動物個体はウシ個体であることが好ましい。また、機能欠失型変異が、配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異であることがより好ましい。
　本発明に係るマーカーは、哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、機能を欠失したＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ、あるいは、機能を欠失したＧＦＲＡ１タンパク質であることを特徴とする。
　本発明に係るキットは、哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのキットであって、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の機能欠失型変異を有する塩基を増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とする。ここで、哺乳動物個体はウシ個体であることが好ましい。また、機能欠失型変異が、配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異であることがより好ましい。
　本発明に係るキットは、さらに制限酵素を含み、この制限酵素は、前記プライマーペアによって増幅された塩基が前記遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かに依存して、前記プライマーペアによって増幅された塩基を含むポリペプチドの切断様式が異なることがさらに好ましい。前記制限酵素は、ＭｗｏＩであることがさらに好ましい。
　本発明に係る診断方法は、ヒト以外の哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するための診断方法であって、前記哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子が野生型であるか機能欠失型変異を有するかを調べる工程を含む。ここで、この診断方法は、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子が存在しない場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない場合、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子と機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子が存在する場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する場合、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断することが好ましい。
　本発明に係る診断方法は、ＧＦＲＡ１遺伝子座の両方のアリルで機能欠失型変異を有している場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、ＧＦＲＡ１遺伝子の一方のアリルで機能欠失型変異を有している場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断する工程とを含むことがより好ましい。哺乳動物個体がウシ個体であることがさらに好ましい。
　本発明に係る診断方法は、前記機能欠失型変異が配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡにおける１０６０番目の塩基のナンセンス変異であることがさらに好ましい。また、ナンセンス変異がＣからＴへの変異であることがさらに好ましい。
　本発明に係る診断方法は、ヒト以外の哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していることを診断するための診断方法であって、前記哺乳動物個体における、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量、あるいは、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。ここで、前記発現量が検出できない場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していると診断することが好ましい。
　本発明に係る同定方法は、前肢帯筋異常症のキャリアであるヒト以外の哺乳動物個体の同定方法であって、前肢帯筋異常症を発症していないヒト以外の哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かを調べる工程と、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子と機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子が存在するヒト以外の哺乳動物個体、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在するヒト以外の哺乳動物個体を同定する工程とを含むことを特徴とする。なお、哺乳動物個体がウシ個体であることが好ましい。また、機能欠失型変異が、配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における、ＣからＴへのナンセンス変異であることがより好ましい。
　本発明に係る前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子が、前記前肢帯筋異常症の原因であるかどうかを決定する方法は、前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアである哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列の一部または全部を決定する工程と、決定された前記塩基配列と、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列とを比較する工程と、決定された前記塩基配列に機能欠失型変異が存在するか否かを決定する工程と、を含むことを特徴とする。
　本発明に係るマーカーは、ウシ個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群から選択される１以上の塩基または塩基配列を有する単離されたポリヌクレオチドであることを特徴とする。
　本発明に係るキットは、ウシ個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのキットであって、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群から選択される１以上を増幅するための１以上のプライマーペアを含むことを特徴とする。
　本発明に係る診断方法は、ウシ個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するための診断方法であって、前記ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群より選択される１つ以上のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含む。
　本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
　本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
　本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
　本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
　本発明に係る同定方法は、前肢帯筋異常症のキャリアであるウシ個体の同定方法であって、前肢帯筋異常症を発症していないウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群から選択される１以上のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程と、調べたジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合であるウシ個体を同定する工程を含むことを特徴とする。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１１年１１月１８日付で出願した日本国特許出願２０１１－２５３３１４に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施形態である、ＭＯＫ２６３０の健常型（１～７番）および疾患型（８番）の泳動図である。 本発明の一実施形態である、ＭＯＫ２６３７の健常型（１、２、４番）および疾患型（３番）の泳動図である。 本発明の一実施形態である、ＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４におけるナンセンス変異を示す図である。 本発明の一実施形態において、健常黒毛和種（レーン１、Normal）、前肢帯筋異常症キャリア黒毛和種（レーン２、Carrier）、前肢帯筋異常症罹患黒毛和種（レーン３、Affected）のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物をＭｗｏＩで消化して得られたＤＮＡ断片のパターンを示す図である。
　以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
　実施の形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
　なお、本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子、ＧＦＲＡ１タンパク質に関連するマーカー＝＝
　前肢帯筋異常症は、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させる劣性の変異（機能欠失型変異）に起因する疾患である。すなわち、ゲノムＤＮＡ上に野生型ＧＦＲＡ１遺伝子が存在しない場合、その個体（本明細書では、罹患個体とも呼ぶ）は前肢帯筋異常症に罹患している。なお、その場合には、個体の有する全てのＧＦＲＡ１遺伝子が、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子である場合も含まれる。また、その個体が、少なくとも一つの野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有すれば、その個体の表現型は正常であり、前肢帯筋異常症を発症しない。ただし、その個体が野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有する場合であっても、少なくとも一つの機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子を有すれば、その個体（本明細書では、キャリア個体とも呼ぶ）は前肢帯筋異常症のキャリアとなり、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子を有さなければ、その個体（本明細書では、健常個体とも呼ぶ）は、前肢帯筋異常症を発症せず、キャリアにもならない。なお、この健常個体は、そのＧＦＲＡ１遺伝子の全てのコピーが野生型ＧＦＲＡ１遺伝子である個体であって、表現型が正常であっても、キャリア個体や前肢帯筋異常症を発症していない罹患個体は含まない。
　従って、例えば、その個体が、ゲノム上のＧＦＲＡ１遺伝子座に１つずつ、２コピーのＧＦＲＡ１遺伝子のアリルを有する場合、すなわち、通常のＧＦＲＡ１遺伝子以外に、余分な遺伝子コピーを有しない場合、２つのアリルが機能欠失型変異を有すれば、前肢帯筋異常症の罹患個体となり、一方のアリルだけが機能欠失型変異を有すれば、前肢帯筋異常症のキャリアとなり、両方のアリルが野生型なら、健常個体となる。
　ここで、本明細書において「前肢帯筋異常症」は、ウシにおいて「前肢帯筋異常症」または「三枚肩」として知られる疾患、および、ウシ以外の哺乳動物においてウシの「前肢帯筋異常症」に対応する疾患、あるいは前肢帯筋または上肢帯筋の形成不良を呈する疾患を指し、その哺乳動物において「前肢帯筋異常症」という疾患名で知られていない疾患であってもよい。
　ここで、哺乳動物個体が「前肢帯筋異常症を発症している」とは、個体が前肢帯筋異常症に罹患していることに起因して、前肢帯筋または上肢帯筋の形成不良が認められることを指す。特に、四肢哺乳動物では、前肢帯筋の形成不良による肩甲部の突出、耳介の下垂等の形態的特徴に加え、起立困難や振戦等の運動機能低下等の健常個体では見られない異常も呈することがある。ただし、これらの身体的異常、運動機能の異常は、その程度により限定されないものとする。そして、個体が「前肢帯筋異常症に罹患している」とは、その個体が前肢帯筋異常症を発症していても、発症していなくてもよく、遺伝的に、ゲノム上に野生型ＧＦＲＡ１遺伝子が存在しない場合をいう。
　また、前肢帯筋異常症は、ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡとも関係があり、前肢帯筋異常症の罹患個体では、ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中に、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない。前肢帯筋異常症のキャリア個体では、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する。そして、健常個体では、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡのみが存在し、機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡは存在しない。
　このように、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドであって、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させる変異を含むポリヌクレオチドは、個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用できる。ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもｍＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい。
　なお、本明細書において、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子とは、機能欠失型変異を有さないＧＦＲＡ１遺伝子、および機能欠失型変異を有さないＧＦＲＡ１遺伝子において、塩基の置換、挿入、欠失などが生じている遺伝子であって、個体内でその発現が失われたときに前肢帯筋異常症を引き起こす遺伝子を指す。ここで、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の由来する動物は、哺乳動物の中から、診断対象によって適宜選択すればよい。例えば、ウシの場合、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子は、配列番号２のＧＦＲＡ１遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５３４８０１）、並びに、配列番号２のＧＦＲＡ１遺伝子において、塩基の置換、挿入、欠失などが生じている遺伝子であって、個体内でその発現が失われたときに前肢帯筋異常症を引き起こす遺伝子を指す。
　ここで、変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子のみを有する個体が前肢帯筋異常症を発症する場合に、その変異を機能欠失型変異であるという。そして、そのＧＦＲＡ１遺伝子を、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子という。一方、ＧＦＲＡ１遺伝子に変異が生じても、その変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子のみを有する個体が前肢帯筋異常症を発症しない場合には、その変異は機能欠失型変異に含めないものとする。
　ＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異は、その変異に起因して前肢帯筋異常症を発症するものであれば、遺伝子上の位置、塩基の種類によって限定されず、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異等のいずれであってもよい。また、その機能欠失型変異に起因して、前肢帯筋異常症を発症するならば、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質を発現していても、あるいは、発現していなくてもよい。
　例えば、ＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異がナンセンス変異であって、翻訳により生成されるタンパク質が短鎖化される場合、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させる変異であれば、変異が生じた塩基の遺伝子上の位置は限定されない。その機能欠失型変異は、例えば、ウシであれば、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１１０５４１１．１、配列番号１）の１０６０番目の塩基に対応する塩基におけるＣからＴへのナンセンス変異や、それより５’側の塩基におけるナンセンス変異であってもよい。ウシ以外の哺乳動物の場合、その動物のＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡにおいて、前述のウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基に対応する塩基のナンセンス変異、または、それより５’側の塩基におけるナンセンス変異であってもよい。
　前肢帯筋異常症に罹患した個体、あるいは、前肢帯筋異常症のキャリアである個体において、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子が転写されて変異型ＧＦＲＡ１ｍＲＮＡが生成され、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質が発現する場合には、このような機能を失った変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、および、機能を失った変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ等も、個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用できる。
　また、前肢帯筋異常症に罹患した個体では、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質の発現量が、健常個体と比較して、前肢帯筋異常症罹患を発症させる程度に低下しているか、無くなっている。従って、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、および、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ等の発現量も、個体が前肢帯筋異常症に罹患していることを診断するためのマーカーとして使用できる。
　なお、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質とは、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質、並びに、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質において、アミノ酸の置換、挿入、欠失などが生じているタンパク質であって、個体内でその発現が失われたときに前肢帯筋異常症を引き起こすタンパク質を指す。ここで、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質の由来する動物は、哺乳動物の中から、診断対象によって適宜選択すればよい。ウシの場合、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質は、配列番号３のＧＦＲＡ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１０９８８８１．１）、およびそのホモログ、並びに、配列番号３のＧＦＲＡ１タンパク質またはそのホモログにおいて、アミノ酸の置換、挿入、欠失などが生じているタンパク質であって、ウシ個体内でその発現が失われた時に前肢帯筋異常症を引き起こすタンパク質を指す。
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子、ＧＦＲＡ１タンパク質に関連するマーカーを用いた診断方法＝＝
　これらのマーカーを用いて、以下のように、哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断することができる。
　哺乳動物個体が、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることは、まず哺乳動物個体からゲノムＤＮＡを単離し、その単離されたゲノムＤＮＡに対し、ＧＦＲＡ１遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かを調べることで診断できる。すなわち、（１）機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子の存在に関わらず、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有しない場合、その個体は前肢帯筋異常症に罹患していると診断でき、（２）機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子と野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有する場合、その個体は前肢帯筋異常症のキャリアであると診断でき、（３）野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有し、機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子を有しない場合、健常個体と診断できる。ここで、ＧＦＲＡ１遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かを調べる方法は特に限定されず、例えば、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列を決定してもよく、あるいは、既知である特定の塩基置換を検出する場合には、ＲＦＬＰを利用してもよい。
　特に、機能欠失型変異が、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の１０６０番目の塩基におけるＣからＴへの変異である場合、ＰＣＲを用いて、当該塩基を含むゲノムＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片に対してＭｗｏＩを反応させ、ＰＣＲ産物が切断されるかどうか調べてもよい。この場合、当該塩基がＣからＴに変異している場合にはＰＣＲ産物がＭｗｏＩで切断されないが、変異していない場合にはＭｗｏＩで切断されるため、当該塩基が野生型か変異型かを容易に決定することができる。例えば、酵素で切断後のＰＣＲ産物を、電気泳動で分離し、ＭｗｏＩで切断されたＰＣＲ産物のみが検出される場合、その個体は、前肢帯筋異常症のキャリアでなく罹患もしていない健常個体であり、ＭｗｏＩで切断されないＰＣＲ産物とＭｗｏＩで切断されたＰＣＲ産物とが検出される場合、前肢帯筋異常症のキャリア個体であり、ＭｗｏＩで切断されないＰＣＲ産物のみが検出される場合、前肢帯筋異常症に罹患している罹患個体である、と診断できる。
　あるいは、哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していることは、その個体の組織において、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を調べることによって診断してもよい。組織は、例えば、血液、精液、筋肉、神経、骨、腎臓、肝臓、胸腺、皮膚、受精卵が挙げられるが、健常個体において野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡが発現している組織である範囲で制限されない。その結果、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出されない場合には、その個体は、前肢帯筋異常症に罹患していると診断することができる。
　また、哺乳動物個体が、前肢帯筋異常症のキャリアであることは、その個体の前肢帯筋組織において、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質と変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質と変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を調べることによって診断してもよい。その結果、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質と変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡと野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡが両方とも検出された場合には、その個体は、前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断することができる。
　なお、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出され、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出されない場合には、その個体は、前肢帯筋異常症のキャリア個体、または、健常個体であると診断することができる。
　ここで、タンパク質、またはそのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現の検出方法は、野生型または変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、あるいは、野生型または変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを特異的に検出できる方法であればよく、タンパク質やｍＲＮＡの全長を検出する方法であっても、一部を検出する方法であってもよい。検出方法は、当業者に周知の方法を適宜用いればよく、ｍＲＮＡであればノザンブロット法や逆転写ＰＣＲ法、タンパク質であれば特異的抗体を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などが例示できる。
　このようにして、哺乳動物個体を診断することにより、外見的には正常であっても、将来前肢帯筋異常症を発症するであろう罹患個体を特定できる。また、前肢帯筋異常症のキャリアの個体も、表現型として疾患の症状が認められないが、以上の診断方法によって、キャリア個体を同定し、キャリア個体を交配集団から隔離あるいは除去したり、キャリア個体同士を交配させないようにしたりすることによって、前肢帯筋異常症の罹患個体が発生することを未然に防ぐことが可能である。
＝＝遺伝子治療＝＝
　前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体は、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有しておらず、従って、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を遺伝子導入したトランスジェニック個体を作出することによって、治療可能である。
　また、ＧＦＲＡ１遺伝子の一方のアリルに機能欠失型変異を有している、前肢帯筋異常症のキャリアである哺乳動物個体の場合、この機能欠失型変異を有するアリルにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異を修復し、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子にすればよい。これまで哺乳動物を用いて、胚幹細胞が樹立され（Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.309, p.104-113, 2003）、ノックアウト個体も作出されている（Nat. Ganet. vol.36, p.671-672, 2004）。このような発生工学的な遺伝子組換え技術を用い、哺乳動物個体において、特定の塩基を目的の塩基に置換することが可能であり、機能欠失型変異を修復することができる。
＝＝前肢帯筋異常症の原因となる変異を特定する方法＝＝
　前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアである個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列の一部、または、全部を決定し、得られた塩基配列を、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列と比較し、ＧＦＲＡ１遺伝子に機能欠失型変異が存在するか否かを決定することにより、前肢帯筋異常症の原因がＧＦＲＡ１遺伝子にあるかどうか、また、前肢帯筋異常症の原因がＧＦＲＡ１遺伝子にある場合、どのような変異が原因になっているのかを調べることができる。
　例えば、前肢帯筋異常症に罹患した個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアの個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子に変異が存在し、その変異が機能欠失型変異である場合には、その前肢帯筋異常症はＧＦＲＡ１遺伝子の変異に起因するものであると判定することができる。
　この方法によって決定された機能欠失型変異を含む、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドは、哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用できる。
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子周辺のマーカー＝＝
　実施例２に示すように、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失変異をホモ接合で有する哺乳動物個体は前肢帯筋異常症を発症し、ヘテロ接合で有する哺乳動物個体は前肢帯筋異常症のキャリアである。ウシ第２６番染色体上のマイクロサテライトマーカーであるＭＯＫ２６３０、ウシ第２６番染色体上のマイクロサテライトマーカーであるＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄ（表１）のジェノタイプは、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることと強い相関があり、それによって、ウシＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異とも強い相関を有する。従って、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄから成る群より選択される１つ以上を含む、１本以上の単離されたポリヌクレオチドは、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用することができる。
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　なお、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄは連鎖不平衡の状態にあって、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプは互いに強い相関があるため、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうちいずれか１個のジェノタイプのうち、いずれか１個を決定すれば、他のジェノタイプが推定できる。例えば、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうちいずれか１個のジェノタイプが健常型であれば、他３個のジェノタイプも健常型であり、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうちいずれか１個のジェノタイプが疾患型であれば、他３個のジェノタイプも疾患型であると推定される。
　ここで、ＭＯＫ２６３０はウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３６２２２０００番目から始まる繰り返し配列を有するＤＮＡであり、ＭＯＫ２６３７はウシゲノムウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３６９７７０７８番目から始まる繰り返し配列を有するＤＮＡであり、ＳＮＰ Ｂはウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３３７３３７２７番目の塩基であり、ＳＮＰ Ｄはウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３７０１３７６２番目の塩基である（表１）。
　ＳＮＰ ＢにはＴとＧの２種類のＳＮＰが存在し、Ｔが健常型、Ｇが疾患型である。ＳＮＰ ＤにはＡとＧの２種類のＳＮＰが存在し、Ａが健常型、Ｇが疾患型である（表１）。
　ＭＯＫ２６３０のアリルは、その塩基配列に含まれるＧＴの繰り返し回数により特定される。また、ＭＯＫ２６３７のアリルは、その塩基配列に含まれるＡＴの繰り返し回数により特定される。ＭＯＫ２６３０、およびＭＯＫ２６３７の疾患型アリルを同定するためには、各１個体以上の健常個体と罹患個体において、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のアリルを調べ、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のそれぞれで、健常個体にはほとんど検出されず、罹患個体に有意に高頻度で検出されるアリルを決定すればよい。また、ＭＯＫ２６３０、およびＭＯＫ２６３７の健常型アリルを同定するためには、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のそれぞれで、罹患個体にはほとんど検出されず、健常個体に有意に高頻度で検出されるアリルを決定すればよい
　例えば、表１に示すプライマーペアを用いて黒毛和種のウシ複数個体においてＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のアリルを調べ、健常個体と罹患個体において比較すると、ＭＯＫ２６３０には、ＧＴの繰り返し回数が異なる８種類のアリルが存在した。繰り返し回数の少ない方から１番～７番は健常型、繰り返し回数の最も多い８番が疾患型である（図１、上から、１番～８番）。また、ＭＯＫ２６３７には、ＡＣの繰り返し回数が異なる４種類のアリルが存在した。繰り返し回数の少ない方から数えて１番、２番、および４番が健常型、３番が疾患型である（図２、上から１番～４番）。
　なお、マーカーとして使用するポリヌクレオチドを構成する塩基数は特に限定されない。また、マーカーとして使用するポリヌクレオチドは、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂにおける塩基、および、ＳＮＰ Ｄにおける塩基のうち、１個以上を有していればよく、複数を有している場合、どの組み合わせであっても構わない。
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子周辺のマーカーを用いた診断方法＝＝
　ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄを用いて、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患している、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためには、その個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、マイＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうち少なくとも１個以上のジェノタイプを決定する。
　ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄのジェノタイプは、例えば、それらの塩基配列を直接決定することによって、あるいはＰＣＲやＲＦＬＰを利用することによって決定してもよく、特に決定方法は限定されず、当業者に周知の方法を用いて決定すればよい。塩基配列をＰＣＲにより決定する場合には、例えば表１に示すプライマーペアを用いてもよい。塩基配列を直接決定する場合には、マーカーを構成するポリヌクレオチドにおける全ての塩基を決定してもよいが、マーカーを構成するポリヌクレオチドに含まれる、ＭＯＫ２６３０の塩基配列、ＭＯＫ２６３７の塩基配列、ＳＮＰ Ｂにおける塩基、および、ＳＮＰ Ｄにおける塩基から成る群より選択される１個以上を決定することができれば十分である。
　なお、ＭＯＫ２６３０、およびＭＯＫ２６３７は、健常型アリルおよび疾患型アリルの場合にはそれぞれＧＴとＡＣの一定の繰り返し回数を有するから、診断対象のウシ個体におけるＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７のジェノタイプを決定するためには、その塩基配列を調べたり、あるいは、電気泳動等で塩基長を調べ、そのアリルが、それぞれ疾患型であるか、健常型であるかを検出する。または、診断対象のウシ個体におけるＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７のジェノタイプを決定するために、診断対象の個体から得られたＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７の塩基長を、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７の既知の疾患型アリル、または健常型アリルの塩基長と比較し、診断対象の個体におけるＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型であるか、疾患型であるかを調べてもよい。
　なお、ゲノムＤＮＡを単離する組織の種類や量は、マイクロサテライトの塩基配列やＳＮＰの塩基を決定するために必要なＤＮＡ量が得られる範囲で特に制限されない。
　上述したように、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄは連鎖不平衡の状態にあるので、少なくともいずれか１個のジェノタイプを決定すれば、その哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることが診断できるが、いずれか２個以上、より好ましくは３個以上、最も好ましくは４個のジェノタイプを決定すれば、より正確に診断を行うことができる。
　なお、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうち、２個あるいは３個におけるジェノタイプを決定して診断を行う場合には、その組み合わせは特に限定されない。例えば、その組み合わせは、ＭＯＫ２６３０およびＭＯＫ２６３７；ＭＯＫ２６３０およびＳＮＰ Ｂ；ＭＯＫ２６３０およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｂ；ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３０、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｂ；ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄ；ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄが例示できる。
　具体的には、前肢帯筋異常症に罹患しているウシ個体では、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプは、それぞれ疾患型アリルと疾患型ＳＮＰから成るハプロタイプのホモ接合であり、前肢帯筋異常症のキャリア個体では、それぞれ疾患型アリルと疾患型ＳＮＰから成るハプロタイプと、それぞれ健常型アリルと健常型ＳＮＰから成るハプロタイプとのヘテロ接合である。健常個体では、それぞれ健常型アリルと健常型ＳＮＰから成るハプロタイプのホモ接合である。実施例３に示すように、健常個体では、疾患型アリルと疾患型ＳＮＰから成るハプロタイプを有するウシ個体は全く存在しない。
　従って、ウシ個体から単離したゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄのいずれか１個以上のジェノタイプを調べ、それぞれ疾患型のホモ接合であれば、その個体は前肢帯筋異常症に罹患しており、それぞれ健常型と疾患型のヘテロ接合であれば、その個体は前肢帯筋異常症のキャリアであり、それぞれ健常型のホモ接合であれば、その個体は健常個体であると診断できる。なお、複数のマーカーのジェノタイプを調べた場合に、異なる結果が得られた場合、ＧＦＲＡ１遺伝子と連鎖率の高いマーカーの結果を優先して判断してもよいが、さらに調べるマーカー数を増やして判断してもよい。
　このようにして、ウシ個体を診断することにより、外見的には正常であっても、将来前肢帯筋異常症を発症するであろう罹患個体を特定できる。また、前肢帯筋異常症のキャリアの個体も、表現型として疾患の症状が認められないが、以上の診断方法によって、キャリア個体を同定し、キャリア個体を交配集団から隔離あるいは除去したり、キャリア個体同士を交配させないようにしたりすることによって、前肢帯筋異常症の罹患個体が発生することを未然に防ぐことが可能である。
[実施例１]　本実施例では、ウシＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異の有無を、ＲＦＬＰ法により検出し、前肢帯筋異常症に罹患していること、および、そのキャリアであることを診断できることを示す。
　前肢帯筋異常症発症黒毛和種２６個体、健常黒毛和種３７個体、前肢帯筋異常症キャリア黒毛和種６個体（罹患ウシおよび健常ウシの父親ウシ１個体、母親ウシ３個体、父親ウシの父１個体、父親ウシの祖父ウシ１個体）の精液、血液、または筋肉組織から、フェノール／クロロフォルム法によってＤＮＡを単離した。なお、キャリア個体は、その産子が発症個体であることにより判別した。その個体を下記のプライマーペアを用いたＰＣＲ法により、ＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４を含む３４５ｂｐの領域を増幅した。
ＧＦＲＡ１－Ｆ２：ATGCTCCTCACGGTACCTCTGTCCTAAA（配列番号１２）
ＧＦＲＡ１－Ｒ３：GTTCCCTTCCAGAGCTCAAGC（配列番号１３）
　このＰＣＲ産物を、制限酵素ＭｗｏＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離した。
　なお、図３に示すように、ＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４においては、罹患個体では両方のアリルで、キャリア個体では一方のアリルで変異が生じている。この変異はＧＦＲＡ１遺伝子のコード領域の１０６０番目の塩基におけるＣからＴへのナンセンス変異であって、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を失わせる変異である。ＰＣＲにより増幅された増幅断片において、この変異を有する場合はＭｗｏＩで切断されないが、この変異を有さない場合はＭｗｏＩで切断される。
　図４に示すように、健常個体（レーン１）では、１９９ｂｐおよび１４６ｂｐのバンドが検出され、キャリア個体（レーン２）では、３４５ｂｐ、１９９ｂｐおよび１４６ｂｐのバンドが検出され、罹患個体（レーン３）では、３４５ｂｐのバンドが検出された。
　このように、ＧＦＲＡ１遺伝子のコード領域の１０６０番目の塩基におけるＣからＴへの変異を調べることで、その個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断できる。
[実施例２]　本実施例では、ＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異の有無により、前肢帯筋異常症に罹患していること、および、そのキャリアであることを診断できることを示す。
　前肢帯筋異常症発症黒毛和種２６個体、健常黒毛和種３７個体、前肢帯筋異常症キャリア黒毛和種６個体（罹患ウシおよび健常ウシの父親ウシ１個体、母親ウシ３個体、父親ウシの父１個体、父親ウシの祖父ウシ１個体）の精液、血液、または筋肉組織から、フェノール／クロロフォルム法によってＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡについて、実施例１のプライマーペア（配列番号１２、１３）を用いたＰＣＲ法により、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４を含む３４５ｂｐの領域を増幅した。なお、キャリア個体は、その産子が発症個体であることにより判別した。
　前肢帯筋異常症発症個体全２６個体において、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の１０６０番目の塩基がＴのホモ接合であり、キャリア個体全６個体において、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基がＣとＴのヘテロ接合であり、健常個体全３７個体において、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基がＣのホモ接合であった。
　また、上記の黒毛和種家系とは別の集団内の健常個体１２５個体について、同様にＧＦＲＡ１遺伝子ｃＤＮＡの１０６０番目の塩基を調べたところ、全ての個体でＣのホモ接合であった。
　このように、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基のＣからＴへの変異を調べることで、そのウシが前肢帯筋異常症に罹患していること、前肢帯筋異常症のキャリアであることを１００％の確率で診断することができる。
　また、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の変異は、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異であることから、この結果は、ＧＦＲＡ１遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かによって、ウシが前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断できることを示し、ウシ以外の哺乳動物においても、前肢または上肢の帯筋の形成不良を呈する疾患の罹患、保因を診断できることを示している。
[実施例３]　本実施例では、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプの検出により、前肢帯筋異常症に罹患していること、および、そのキャリアであることを診断できることを示す。
　前肢帯筋異常症発症黒毛和種２６個体の精液、血液、または筋肉組織から、フェノール／クロロフォルム法によってＤＮＡを単離した。このＤＮＡについて、表１に記載の各検出用プライマーペアを用いてＰＣＲを行い、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄが含まれるＤＮＡ断片を増幅した。ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプの検出には、さらに、ＭｓｅＩ（ＳＮＰ Ｂ）、ＢａｍＡＩ（ＳＮＰ Ｄ）の制限酵素による切断を行った。
　ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、およびＳＮＰ Ｄのジェノタイプは、２６個体において、全て疾患型、すなわち８番、３番、Ｇ（表１）のホモ接合であった。ＳＮＰ Ｂのジェノタイプは、２５個体で疾患型、すなわちＧ（表１）のホモ接合であったが、１個体のみ疾患型（Ｇ）と健常型（Ｔ）のヘテロ接合であった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、健常黒毛和種について、同様にＭＯＫ２６３０（６１個体）、ＭＯＫ２６３７（１１９個体）、ＳＮＰ Ｂ（１１８個体）、ＳＮＰ Ｄ（１１７個体）のジェノタイプを調べたところ、ＭＯＫ２６３０、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄが疾患型のホモ接合の個体は存在しなかった。なお、ＭＯＫ２６３７が疾患型のホモ接合の個体は１個体のみであった。また、疾患型と健常型のヘテロ接合については、ＭＯＫ２６３０が１１個体、ＭＯＫ２６３７が１８個体、ＳＮＰ Ｂが８個体、ＳＮＰ Ｄが２８個体であった。健常型のホモ接合については、ＭＯＫ２６３０が５０個体、ＭＯＫ２６３７が１００個体、ＳＮＰ Ｂが１１０個体、ＳＮＰ Ｄが８９個体であった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　このように、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄを調べることで、そのウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患しているかどうかを高い確率で診断できる。
　本発明によると、哺乳動物個体における前肢帯筋異常症を診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋異常症の診断方法を提供することができる。

Claims (18)

  1. 　哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、
    　ＧＦＲＡ１遺伝子ゲノムＤＮＡの一部又は全部、当該遺伝子ｃＤＮＡの一部または全部、または当該遺伝子ｍＲＮＡの一部または全部である、単離されたポリヌクレオチドからなり、
    　前記ポリヌクレオチドは、配列番号１を有するＧＦＲＡ１遺伝子ｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を含むことを特徴とするマーカー。
  2. 　前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項１に記載のマーカー。
  3. 　前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項１または２に記載のマーカー。
  4. 　哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのキットであって、
    　ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたＤＮＡにおいて、配列番号１を有するＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とするキット。
  5. 　前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項４に記載のキット。
  6. 　前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項４または５に記載のキット。
  7. 　請求項４～６のいずれか１項に記載のキットであって、
    　さらに制限酵素を含み、
    　前記制限酵素は、前記プライマーペアによって増幅された塩基が前記変異を有するか否かに依存して、前記プライマーペアによって増幅された塩基を含むポリペプチドの切断様式が異なることを特徴とするキット。
  8. 　請求項７のキットであって、
    　前記制限酵素がＭｗｏＩであることを特徴とするキット。
  9. 　ヒト以外の哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するための診断方法であって、
    　前記哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、配列番号１を有するＧＦＲＡ１遺伝子ｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を有するか否か、を調べる工程を含む診断方法。
  10. 　請求項９に記載の診断方法であって、
    　ＧＦＲＡ１遺伝子座の両方のアリルで前記変異を有している場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、
    　ＧＦＲＡ１遺伝子の一方のアリルで前記変異を有している場合に、
    前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断する工程とを含む診断方法。
  11. 　前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の診断方法。
  12. 　前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項９～１１のいずれか１項に記載の診断方法。
  13. 　前肢帯筋異常症のキャリアであるヒト以外の哺乳動物個体の同定方法であって、
    　前肢帯筋異常症を発症していないヒト以外の哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子の配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を有するか否かを調べる工程と、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子と前記変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子が存在するヒト以外の哺乳動物個体、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと前記変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在するヒト以外の哺乳動物個体を同定する工程とを含むことを特徴とする同定方法。
  14. 　前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項１３に記載の同定方法。
  15. 　前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の同定方法。
  16. 　前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子が、前記前肢帯筋異常症の原因であるかどうかを決定する方法であって、
    　前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアである哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列の一部または全部を決定する工程と、
    　決定された前記塩基配列と、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列とを比較する工程と、
    　決定された前記塩基配列に配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異が存在するか否かを決定する工程と、
    　を含むことを特徴とする方法。
  17. 　前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
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