WO2013073610A1 - 塩基配列決定装置 - Google Patents

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WO2013073610A1
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stranded dna
base sequence
sequence determination
electron microscope
determination apparatus
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國昭 永山
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ナガヤマ アイピー ホールディングス エルエルシー
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for determining the base sequence of a nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a base sequence determination apparatus using an electron microscope.
  • nucleobase species such as adenine (A), thymine (T), nucleic acid guanine (G), and cytosine (C) are selectively labeled with fluorescent molecules. Then, each base species is identified on the DNA molecule by detecting the luminescence.
  • an integrated semiconductor chip that measures hydrogen ion release when a double strand is formed based on a single strand DNA of a template by a polymerase has been commercialized.
  • DNA array refers to a state in which single-molecule DNAs are two-dimensionally developed and arranged at predetermined intervals.
  • optical method and the semiconductor integration method described above have limitations in these respects, and introduction of completely different methods and ideas is required.
  • the conventional techniques described above have the following problems.
  • the method of using a DNA chain extension synthesis reaction by a polymerase for each base identification step is generally rate-determining because the reading of each base is rate-limiting in the polymerase synthesis reaction. slow. Therefore, in order to cover the slow reading speed, one million or more DNA molecules are arranged in a two-dimensional array and are read simultaneously in parallel.
  • reaction sites for DNA double-strand synthesis by one molecule of polymerase are arranged as a two-dimensional array on a two-dimensional substrate, which is converted into an optical chip for fluorescence observation and an IC chip for hydrogen ion release observation.
  • a large number of reactions are simultaneously measured by detecting current. Even in that case, the density and total number of DNA reaction fields developed in a two-dimensional array form an indicator of the decoding speed.
  • the method using the scanning probe microscope described in Patent Document 6 uses a slight difference in electrical characteristics exhibited by the base as a basis for base discrimination reading, so the signal is extremely weak, and the reading accuracy and There is a problem that antagonism tends to occur between the reading speed and the reading speed. That is, in this method, the reading speed decreases when attempting to increase the reading accuracy, and conversely, if the reading speed is increased, the reading accuracy decreases.
  • the methods using the electron microscopes described in Patent Documents 7 to 10 also provide (i) a resolution capable of discriminating four types of bases because a strong electron beam cannot be irradiated due to electron beam damage.
  • (Ii) It was also attempted to perform base discrimination labeling of heavy atoms that are resistant to electron beam damage, but in the case of heavy atom cluster labeling that provides sufficient sensitivity, the labeling rate is low due to steric hindrance between adjacent bases, (Iii) When small-size heavy atom labeling is used, the labeling rate increases but the sensitivity is low due to low sensitivity.
  • the sample is observed in a vacuum, so even if sample preparation is automated, There is a problem that reading efficiency is low.
  • the main object of the present invention is to provide a base sequence determination apparatus that can determine the base sequence of a single molecule of nucleic acid at a higher speed than in the past.
  • the present inventor has conducted extensive experimental studies to overcome the weaknesses of the base sequencing method using the electron microscope described above. As a result, the length between adjacent groups of single-stranded DNA is increased by a specific method and 1
  • the inventors have found that an ultrahigh-speed DNA sequencer can be realized by fully extending the high-resolution performance inherent in an electron microscope by elongating and developing heavy chain DNA, and the present invention has been achieved.
  • the base sequence determination apparatus is a base sequence determination apparatus that determines the base sequence of one molecule of nucleic acid using an electron microscope, and contains single-stranded DNA with an extended length between adjacent groups.
  • a sample storage part for storing a sample solution to be stored, a sample fixing part for introducing and extending the single-stranded DNA in the sample solution on a sheet-like substrate, and a nucleus for decoding the base sequence
  • An atmospheric pressure scanning composite electron microscope capable of observing an electron microscope image and an optical microscope image in the same field of view, and the single-stranded DNA immobilized on the substrate by the atmospheric pressure scanning composite electron microscope
  • a sample observation unit that continuously observes the sample while moving in the length direction.
  • the single-stranded DNA to be read is one in which the length between adjacent groups is expanded by inserting another single-stranded DNA between bases, and the other single-stranded DNA inserted is an electron microscope. It may be labeled with a metal cluster or an inorganic phosphor nanoparticle that emits light by an electron beam. In that case, the size of the metal cluster or the inorganic phosphor nanoparticle can be made smaller than the length when the single-stranded DNA inserted between the bases is extended. Moreover, the single-stranded DNA inserted between bases may be labeled with metal clusters having different sizes or inorganic phosphor nanoparticles having different emission wavelengths for each base type.
  • the substrate is a water-repellent sheet, and the hydrophobic interaction with the hydrophobic substance introduced into one end point of the single-stranded DNA of the final product in which the length between adjacent groups is expanded by the single-stranded DNA to be read
  • the single-stranded DNA can be immobilized on the substrate.
  • a carbon nanotube sheet can also be used as the substrate.
  • a polycyclic carbon compound may be introduced as a hydrophobic substance at one end point of the single-stranded DNA of the final product with the length between adjacent groups expanded.
  • an imaging processing unit for processing a scanning electron microscope image and / or a scanning fluorescence image observed by the atmospheric pressure scanning composite electron microscope, and a display unit for displaying an image processed by the imaging processing unit.
  • the display unit can also display a one-dimensional or two-dimensional image.
  • the base sequence of one molecule of nucleic acid is It is possible to realize a base sequence determination apparatus capable of determining at a higher speed than in the past.
  • FIG. 2 is an enlarged view showing the vicinity of an observation window of the atmospheric pressure scanning composite electron microscope shown in FIG. 1.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the configuration of a base sequence determination apparatus according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is an enlarged view showing the vicinity of an observation window of the atmospheric pressure scanning composite electron microscope shown in FIG.
  • the base sequence determination apparatus 1 of this embodiment reads the base sequence of one molecule of nucleic acid continuously, and includes at least a sample storage unit, a sample fixing unit, a sample observation unit, Is provided.
  • sample reservoir A tank 10 is provided in the sample reservoir, and the sample solution 2 containing the nucleic acid to be read is stored.
  • the nucleic acid contained in the sample solution 2 is a single-stranded DNA in which the length between adjacent groups is expanded.
  • the method for pretreatment of the nucleic acid to be read is not particularly limited. For example, there is a circular DNA conversion (CDC) method (see International Publication No. 2010/053820). In this CDC method, another single-stranded DNA having an arbitrary sequence and length (which itself can hold a label) is inserted between each base connected to the single-stranded DNA, thereby extending the DNA chain length. It is a molecular biological technique.
  • the single-stranded DNA to be read is chemically extended by the CDC method or the like, it is desirable to introduce a label that can be identified by an electron microscope in advance to a part of the single-stranded DNA to be inserted. Labeling of single-stranded DNA inserted between bases can be performed by, for example, metal clusters that can be identified with an electron microscope, such as gold colloid, or inorganic phosphor nanoparticles that emit light by an electron beam.
  • the single-stranded DNA inserted between the bases may be labeled with metal clusters having different sizes or inorganic phosphor nanoparticles having different emission wavelengths for each base type.
  • each nucleobase species such as A, T, G, and C can be labeled with metal clusters having different sizes (particle diameters).
  • each nucleobase species can be labeled with inorganic phosphor nanoparticles that emit light of different wavelengths upon electron beam (cathode ray) irradiation.
  • the atmospheric pressure scanning composite electron microscope used in the base sequence determination apparatus of the present embodiment also detects fluorescence from inorganic phosphor nanoparticles excited by an electron beam with an optical microscope, and images (Scanning fluorescence image).
  • cathodoluminescence The phenomenon in which electrons in the inorganic phosphor are excited by the electron beam irradiation to emit light is called cathodoluminescence (CL), and has been conventionally applied to color image display of a television cathode ray tube.
  • CL cathodoluminescence
  • the size of the color development point of about 100 ⁇ m was sufficient.
  • the color development is not observed with the naked eye, but is observed with an electron microscopic resolution. For this reason, in order to guarantee high resolution, a coloring point on the order of nm is necessary.
  • the resolution of the atmospheric pressure SEM depends on the convergence of the electron beam.
  • the resolution of cathodoluminescence is determined not by the emission wavelength but by the size of the inorganic phosphor irradiated with this convergent beam.
  • the inorganic phosphor that labels the single-stranded DNA inserted between the bases is preferably a nanoparticle having a particle size of 100 nm or less, and a more preferable particle size is 50 nm or less.
  • the size (particle diameter) of the metal cluster for labeling the single-stranded DNA inserted between the bases is preferably 100 nm or less, more preferably 50 nm or less.
  • gold colloids with particle sizes of 10 nm, 20 nm, 30 nm, and 40 nm can be used. .
  • the size (particle size) of the inorganic phosphor nanoparticles and the metal clusters are not so overlapped with each other so that adjacent ones do not overlap each other.
  • the length of the single-stranded DNA inserted into the single-stranded DNA to be read is required to be adjusted.
  • the size (particle size) of the inorganic phosphor nanoparticles and the metal clusters is preferably smaller than the single-stranded DNA to be inserted, but in the case of the base sequence determination device 1 of the present embodiment, a single layer spread on the sheet substrate 3. Since both sides of the strand DNA can be labeled, the particle size can be about 1.5 times the length of the DNA to be inserted.
  • the solvent in the sample solution 2 may be any solvent as long as it does not aggregate the nucleic acid to be read. However, avoid the inorganic salt that causes background noise in the scanning electron microscope image, and use a solvent in the pH range in which the nucleic acid dissolves. Is desirable. Further, it is desirable to use HCl or the like that evaporates during the drying process for adjusting the pH of the sample solution 2. Then, the sample solution 2 in the tank 10 is introduced into the sample fixing unit by a liquid feeding unit including a pump (not shown), a liquid feeding pipe 11 and the like.
  • a single-stranded DNA extended by the CDC method or the like and a beacon labeled with inorganic phosphor nanoparticles or metal clusters are hybridized.
  • Soy double-stranded DNA can also be used.
  • the extended single-stranded DNA is more than twice as long as the extended double-stranded DNA. Therefore, in the CDC method of stretching between adjacent bases, Is more advantageous.
  • the nucleic acid to be read has a single base that can reduce the number of DNA bases inserted when chemically extended compared to a double-stranded labeled DNA. It is desirable to use strand-labeled DNA.
  • sample fixing part The sample fixing part is provided with a dipping tank 21, a rotating roller 22, and the like, and the end product between the adjacent groups contained in the sample solution 2 is expanded, and a label such as an inorganic phosphor is introduced as necessary. These single-stranded DNAs are fixed to a sheet-like substrate 3 and expanded. At that time, a method for extending and developing the single-stranded DNA of the final product is not particularly limited, and for example, a molecular combing method can be applied.
  • the extended strands are irregular, but all the extended DNA strands are parallel, and there is no vertical or horizontal overlap between the DNA molecules.
  • DNA molecule arrays that are convenient for imaging can be made. In this way, the DNA strands are straightened as much as possible and attached to the observation substrate in parallel, thereby preventing overlapping of adjacent bases in microscopic observation and facilitating image analysis.
  • examples of the sheet substrate 3 include a carbon nanotube (CNT) sheet and a water-repellent plastic sheet, and a CNT sheet is particularly preferable.
  • the CNT sheet is obtained by knitting carbon nanotubes (CNT) in a planar shape, and is extremely thin with a thickness of 50 nm or less, and has water repellency (hydrophobicity), which is an original property of nanotubes. Therefore, if the single-stranded DNA of the final product is anchored somewhere on the CNT sheet, the DNA molecule can be extended by using the above-described Molecular® Combing method.
  • the method of attaching the end points of one molecule of DNA to the sheet substrate 3 to form the anchor is not particularly limited, but the simplest method is the final product DNA chain in which the length between adjacent groups is expanded.
  • a hydrophobic substance is introduced into one end point, and a hydrophobic interaction (hydrophobic bond) between the end-point introducing hydrophobic substance and the CNT sheet surface is utilized.
  • examples of the hydrophobic substance to be introduced include polycyclic carbon compounds such as fullerene, anthracene and tetracene.
  • the roll-shaped sheet substrate 3 is placed at the end of the atmospheric pressure scanning composite electron microscope of the sample observation unit, and the sheet is conveyed while being rolled up on the other side. Further, it can be continuously passed over the silicon nitride window 38 for sample observation of the atmospheric pressure scanning composite electron microscope.
  • a roll-like CNT sheet is immersed in the immersion tank 21 into which the sample solution 2 containing the single-stranded DNA of the final product holding the anchor end point is injected, and this is wound up by the rotating roller 22, whereby molecular combing A DNA molecule array can be automatically formed by the action.
  • sample observation section The sample observation unit is provided with an atmospheric pressure scanning composite electron microscope that serves as a nucleus for decoding the base sequence.
  • the greatest feature of this atmospheric pressure scanning composite electron microscope is that the electron beam converging beam 32 emitted from the electron gun 31 is guided to the atmosphere through a thin vacuum barrier (window) made of silicon nitride, and the specimen under atmospheric pressure is detected.
  • An electron microscope image can be taken, and a resolution of about 8 nm can be obtained by observing the atmospheric pressure of the sample.
  • the atmospheric pressure scanning composite electron microscope has an optical microscope 36 mounted in an open air space (external light blocking housing 35) above the atmospheric pressure SEM, and an electron microscope image and an optical microscope image are obtained. It is possible to observe in the same field of view. Thus, by integrating the atmospheric pressure SEM and the optical microscope 36, a scanning electron microscope image and a scanning fluorescence image of the same visual field can be taken simultaneously or at different times for one molecule of nucleic acid to be read.
  • the atmospheric pressure SEM includes an electron beam scanning control system, an electron beam acceleration electron gun 31, an electron beam condenser lens, an aperture, a silicon nitride electron beam transmission observation window 38, an electron detector 39, a vacuum system control, data acquisition / A computer for analysis and storage is provided.
  • the optical microscope 36 is provided with, for example, a condenser lens, an objective lens, a projection lens, a color light receiver, a multicolor laser light source, a multicolor simultaneous observation fluorescent filter system, and the like.
  • the electron beam 32 is emitted from below, converged by the magnetic lens 33, passes through the vacuum chamber 34, and is irradiated onto the silicon nitride window 38.
  • the electron beam 32 transmitted through the silicon nitride window 38 is irradiated onto the sample (substrate 3) disposed thereon, and the reflected electrons generated thereby are detected by the electron detector 39 of the atmospheric pressure SEM and optically detected.
  • the fluorescence is detected by the microscope 36.
  • the space (external light blocking housing 35) in which the substrate 3 is disposed is at atmospheric pressure, and is partitioned from the vacuum chamber 34 by a silicon nitride window 38.
  • the silicon nitride window 38 may have a strip shape having a thickness of 10 to 50 nm, a width of 1 to 10 ⁇ m, and a length of 1 to 10 mm, for example. Further, a plurality of strip-shaped windows having the same shape may be arranged in a two-dimensional array so as to be parallel to each other.
  • the sample observation section may be provided with an imaging processing section (not shown) for performing digital imaging processing on the scanning electron microscope image and / or the scanning fluorescence image observed with the atmospheric pressure scanning composite electron microscope.
  • an imaging processing section (not shown) for performing digital imaging processing on the scanning electron microscope image and / or the scanning fluorescence image observed with the atmospheric pressure scanning composite electron microscope.
  • an electron beam scanning synchronous imaging control system and a digital image processing system are provided in the imaging processing unit of the atmospheric pressure SEM
  • an external control color digital signal acquisition system and a digital image processing system are provided in the imaging processing unit of the optical microscope.
  • an electron microscope image and an optical microscope image at the same field simultaneously or differently and record a one-dimensional image corresponding to one scanning of an electron beam in an atmospheric pressure scanning composite electron microscope.
  • DNA is labeled with a metal cluster
  • an electron microscopic image and a bright-field optical microscopic image are displayed simultaneously or differently
  • an electron microscopic image and a fluorescent image are displayed. Displayed simultaneously or at different times.
  • the roll-up of the sheet substrate 3 is performed in a stepwise manner, and one molecule of DNA on the sheet substrate 3 that has successively moved to the observation window of the atmospheric pressure scanning composite electron microscope is continuously observed.
  • DNA observations can be recorded as a two-dimensional image. These image data are displayed on the display unit 37, for example.
  • the operation of the atmospheric pressure scanning composite electron microscope and the operation of the continuous sending system for the sheet substrate 3 can be integrally performed by the computer control unit. Moreover, the whole apparatus may be covered with the external environment interruption
  • the base sequence determination apparatus 1 of the present embodiment the length between adjacent groups of the single-stranded DNA to be read is expanded and the single-stranded DNA is expanded and developed, and an atmospheric pressure scanning composite electron microscope is used.
  • an atmospheric pressure scanning composite electron microscope is used.

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Abstract

　１分子の核酸の塩基配列を、従来よりも高速で決定することができる塩基配列決定装置を提供する。　電子顕微鏡を使用して１分子の核酸の塩基配列を決定する塩基配列決定装置１に、隣接基間長が拡大された１重鎖ＤＮＡを含有する試料溶液２が貯留される試料貯留部と、試料溶液２が導入され、試料溶液２中の１重鎖ＤＮＡをシート状の基板３に固定して伸長展開する試料固定部と、電子顕微鏡像及び光学顕微鏡像を同視野で観察可能な大気圧走査型複合電子顕微鏡を備え、この大気圧走査型複合電子顕微鏡により基板３に固定された１重鎖ＤＮＡを、基板３を長さ方向に移動させながら連続的に観察する試料固定部とを設ける。

Description

塩基配列決定装置
　本発明は、核酸の塩基配列を決定するための装置に関する。より詳しくは、電子顕微鏡を使用した塩基配列決定装置に関する。
　近年、米国を中心に、超廉価なヒトゲノム解読法、いわゆる「千ドルゲノム」に向けて激烈な開発競争が行われている。この分野で現在用いられている最先端技術は、１分子のＤＮＡを対象として塩基配列解読を高速に行うもので、第３世代又は第４世代ＤＮＡ塩基配列解読機（シーケンサー）と呼ばれており、いくつかの手法が提案されている（例えば、特許文献１～３参照）。
　例えば、特許文献１，２に記載の塩基配列決定方法では、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、核酸グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）などの核酸塩基種を、蛍光分子により選択的に標識し、その発光を検出することにより、ＤＮＡ分子上で各塩基種の同定を行っている。また、特許文献３に記載の技術のように、ポリメラーゼによりテンプレートの１重鎖ＤＮＡを基に２重鎖形成を行う際の水素イオン放出を計測する集積半導体チップなども製品化されている。
　一方、千ドルゲノムの手法を完成させるためには、核酸塩基解読法について、「塩基読み取り高速化」及び「ＤＮＡ分子アレイの高密度化」の２つのコストダウン化要素を徹底させることが重要である。ここで、「ＤＮＡアレイ」とは、１分子ＤＮＡが所定の間隔で２次元的に展開して並んでいる状態をいう。しかしながら、前述した光学的手法や半導体集積化手法は、これらの点について限界が見えており、これまでとは全く異なる手法とアイデアの導入が求められている。
　そこで、１ｎｍ程度の微小孔を利用し、ＤＮＡ１分子が孔を通過する際の電気的変化又は光学的変化を検出するナノポア法が注目されている（例えば、特許文献４，５参照。）。また、従来、走査型プローブ顕微鏡を使用することにより、単一の核酸分子の塩基配列を、核酸鎖を化学修飾せずに、直接的に決定する方法も提案されている（例えば、特許文献６参照。）。
　更に、電子顕微鏡を使用して塩基配列を決定する方法も提案されている（例えば、特許文献７～１０参照。）。分解能の点において、電子顕微鏡は、光学顕微鏡に比べて２桁以上高い性能を有しており、ＤＮＡ分子アレイの１００倍以上の高密度化が可能である。このため、電子顕微鏡を利用し、その高解像度を高速読み取り手法に結び付けられれば、ＤＮＡ塩基読み取りの効率を一気に１００倍以上に向上させることができると、期待されている。
特表２０１０－５１６２８５号公報 米国特許出願公開第２０１１／０２１２４３７明細書 米国特許出願公開第２０１０／０３０１３９８明細書 米国特許出願公開第２００７／０１９０５４２明細書 特表２００８－５８０９６７１号公報 特開２００６－２６２８３４号公報 特開平８－１１２０９９号公報 特開２００２－１５３２７１号公報 米国特許第７４１９８３３号明細書 特表２０１０－５３９９９１号公報
　しかしながら、前述した従来の技術には、以下に示す問題点がある。特許文献１～３に記載されている技術のように、塩基同定ステップ毎にポリメラーゼによるＤＮＡ鎖伸長合成反応を用いる方法は、ポリメラーゼ合成反応で各塩基の読み取りが律速となるため、一般に読み取り速度が遅い。そこで、読み取り速度の遅さをカバーするため、百万以上のＤＮＡ分子を２次元アレイ状に並べ、超並列同時読み取りされている。
　具体的には、１分子のポリメラーゼによるＤＮＡ２重鎖合成の反応部位を、２次元基板上に２次元アレイとして並べ、蛍光観測の場合は光学顕微鏡で、水素イオン放出観察の場合はＩＣチップ化された電流検出で、多数の反応の同時計測を行っている。その場合でも、２次元アレイ状に展開されたＤＮＡ反応場の密度及び総数が、解読速度の指標となる。
　また、使用されている光学顕微鏡の空間分解能限界や半導体チップの加工精度限界から、現況、ＤＮＡ分子アレイにおける１分子ＤＮＡの密度は１μｍ平方あたり１０ＤＮＡ分子を超えられない。このため、ヒトゲノム解読におけるコストダウンに限界が見えはじめている。更に、特許文献４，５に記載されているナノポア法も、現行の半導体加工精度以上の集積化は困難と考えられており、更なる高速化及び高密度化は難しい状況にある。
　一方、特許文献６に記載されている走査型プローブ顕微鏡を使用する方法は、塩基が示すわずかな電気的特性の差を、塩基弁別読み取りの基盤にしているため、信号が極めて弱く、読み取り精度と読み取り速度との間に拮抗作用が生じやすいという問題点がある。即ち、この方法では、読み取り精度を上げようとすると、読み取り速度が遅くなり、逆に、読み取り速度を速くしようとすると、読み取り精度が低下する。
　また、特許文献７～１０に記載されている電子顕微鏡を使用した方法にも、（ｉ）電子線損傷のため強力な電子線を照射できず、塩基４種を弁別可能な程度の分解能が得られない、（ii）電子線損傷に強い重原子の塩基弁別標識を行うことも試みられたが、充分な感度を得る重原子クラスター標識の場合、隣接塩基間の立体障害により標識率が低い、（iii）サイズの小さな重原子標識を利用した場合、標識率は高まるが低感度のため精度が低い、（iv）試料は真空中での観察のため、試料調整を自動化しても全体としては読み取り効率が低いといった問題点がある。
　そこで、本発明は、１分子の核酸の塩基配列を、従来よりも高速で決定することができる塩基配列決定装置を提供することを主目的とする。
　本発明者は、前述した電子顕微鏡を使用した塩基配列決定方法の弱点を克服するために、鋭意実験検討を行った結果、特定の方法により１重鎖ＤＮＡの隣接基間長を拡大すると共に１重鎖ＤＮＡを伸長展開することにより、電子顕微鏡本来の高分解能性能を十分に発揮させて、超高速ＤＮＡシーケンサーを実現できることを見出し、本発明に至った。
　即ち、本発明に係る塩基配列決定装置は、電子顕微鏡を使用して１分子の核酸の塩基配列を決定する塩基配列決定装置であって、隣接基間長が拡大された１重鎖ＤＮＡを含有する試料溶液が貯留される試料貯留部と、前記試料溶液が導入され、該試料溶液中の１重鎖ＤＮＡをシート状の基板に固定して伸長展開する試料固定部と、塩基配列解読の核となる電子顕微鏡像及び光学顕微鏡像を同視野で観察可能な大気圧走査型複合電子顕微鏡を備え、該大気圧走査型複合電子顕微鏡により前記基板に固定された１重鎖ＤＮＡを、前記基板を長さ方向に移動させながら連続的に観察する試料観察部と、を有するものである。
　この装置において読み取り対象の１重鎖ＤＮＡは、塩基間に他の１重鎖ＤＮＡを差し込むことにより隣接基間長が拡大されたものであり、差し込まれた他の１重鎖ＤＮＡは、電子顕微鏡により識別可能な金属クラスター又は電子線により発光する無機蛍光体ナノ粒子で標識されていてもよい。
　その場合、前記金属クラスターや前記無機蛍光体ナノ粒子の大きさは、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡの伸長時の長さよりも小さくすることができる。また、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡは、塩基種毎に、大きさが異なる金属クラスターや発光波長が異なる無機蛍光体ナノ粒子で標識されていてもよい。
　一方、前記基板が撥水性シートであり、読み取り対象の１重鎖ＤＮＡで隣接基間長が拡大された最終産物の１重鎖ＤＮＡの一方の端点に導入された疎水物質との疎水性相互作用により、前記基板に前記１重鎖ＤＮＡを固定することもできる。その場合、前記基板としてカーボンナノチューブシートを使用することもできる。また、隣接基間長が拡大された最終産物の１重鎖ＤＮＡの一方の端点に疎水物質として多環式炭素化合物を導入してもよい。
　更に、前記大気圧走査型複合電子顕微鏡により観察した走査電子顕微鏡画像及び／又は走査蛍光画像を処理するイメージング処理部と、該イメージング処理部で処理された画像を表示する表示部と、を有し、前記表示部において１次元又は２次元画像を表示することもできる。
　本発明によれば、隣接基間長を拡大すると共に伸長展開した１重鎖ＤＮＡを、大気圧走査型複合電子顕微鏡により大気中で連続観察しているため、１分子の核酸の塩基配列を、従来よりも高速で決定することが可能な塩基配列決定装置を実現することができる。
本発明の実施形態の塩基配列決定装置の構成を模式的に示す図である。 図１に示す大気圧走査型複合電子顕微鏡の観測窓近傍を示す拡大図である。
　以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。
　図１は本発明の実施形態に係る塩基配列決定装置の構成を模式的に示す図であり、図２は図１に示す大気圧走査型複合電子顕微鏡の観測窓近傍を示す拡大図である。図１に示すように、本実施形態の塩基配列決定装置１は、１分子の核酸の塩基配列を連続的に読み取るものであり、少なくとも、試料貯留部と、試料固定部と、試料観察部とが設けられている。
［試料貯留部］
　試料貯留部には、タンク１０が設けられており、読み取り対象の核酸を含有する試料溶液２が貯留される。この試料溶液２に含有されている核酸は、隣接基間長を拡大された１重鎖ＤＮＡである。読み取り対象の核酸の前処理方法は、特に限定されるものではないが、例えばCircular ＤＮＡ Conversion（ＣＤＣ）法（国際公開第２０１０／０５３８２０号参照）がある。このＣＤＣ法は、１重鎖ＤＮＡに連なる各塩基の間に、任意の配列と長さの他の１重鎖ＤＮＡ（それ自体標識を一部に保持できる）を差し込み、ＤＮＡ鎖長を伸長させる分子生物学的手法である。
　特許文献５に記載されているような従来のＯｐｔｉｐｏｒｅシーケンサーでは、蛍光標識された相補的ＤＮＡ鎖を、差し込まれたＤＮＡ鎖とハイブリダイズ（分子交雑）させ、２重鎖ＤＮＡとなった標識化ＤＮＡが、ナノポアを通過する際の蛍光発光を塩基弁別として利用している。これに対して、ＣＤＣ法では、読み取り対象の１重鎖ＤＮＡに対して、短鎖ＤＮＡなどの他の１重鎖ＤＮＡを差し込むことができるため、隣接塩基間長を拡大することができる。これにより、塩基弁別のための分解能要求が大幅に軽減されるため、通常電子顕微鏡よりも分解能が低い走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope；ＳＥＭ）を利用することが可能となる。
　また、ＣＤＣ法などにより読み取り対象の１重鎖ＤＮＡが化学的に伸長される際、差し込まれる１重鎖ＤＮＡの一部に、予め電子顕微鏡により同定可能な標識を導入しておくことが望ましい。塩基間に差し込む１重鎖ＤＮＡの標識は、例えば、金コロイドなどのように電子顕微鏡で識別可能な金属クラスターや、電子線により発光する無機蛍光体ナノ粒子により行うことができる。
　この場合、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡを、塩基種毎に、大きさが異なる金属クラスターや発光波長が異なる無機蛍光体ナノ粒子で標識してもよい。具体的には、走査電子顕微鏡像用としては、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃなどの核酸塩基種毎に、大きさ（粒子径）の異なる金属クラスターで標識することができる。また、走査蛍光像用としては、核酸塩基種毎に、電子線（陰極線）照射により異なる波長の光を発光する無機蛍光体ナノ粒子で標識することができる。
　これにより、後述する大気圧走査型複合電子顕微鏡による観察で、容易に塩基弁別を行うことが可能となる。通常の走査型電子顕微鏡では、細い電子線で観察対象の試料を走査（scan）し、電子線照射により放出される二次電子を検出して、画像（走査電子顕微鏡画像）を得ている。これに対して、本実施形態の塩基配列決定装置で使用している大気圧走査型複合電子顕微鏡は、電子ビームにより励起される無機蛍光体ナノ粒子からの蛍光も、光学顕微鏡で検出し、画像（走査蛍光画像）化することが可能である。
　この電子線照射により無機蛍光体内の電子が励起して光が発せられる現象は、カソードルミネッセンス（Cathode luminescence；ＣＬ）と称され、従来、テレビ用ブラウン管のカラー画像表示などに応用されていた。しかしながら、ブラウン管の場合は、発色点の大きさは１００μｍ程度で十分であったが、本実施形態の塩基配列決定装置１では、肉眼で発色を見るのではなく、電子顕微鏡的分解能での観察であるため、高解像度を保証するためにはｎｍオーダーの発色点が必要である。
　一般に、大気圧ＳＥＭの分解能は、電子線ビームの収束度に依存する。これに対して、カソードルミネッセンスの分解能は、発光波長ではなく、この収束ビームが照射される無機蛍光体の大きさで決まる。このため、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡを標識する無機蛍光体は、粒子径が１００ｎｍ以下のナノ粒子であることが好ましく、より好適な粒子径は５０ｎｍ以下である。
　同様の理由から、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡを標識する金属クラスターのサイズ（粒子径）も、１００ｎｍ以下が好ましく、より好ましくは５０ｎｍ以下である。そして、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡを、塩基種毎に大きさの異なる金属クラスターで標識する場合は、例えば、粒子径が１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ及び４０ｎｍの金コロイドを利用することができる。
　更に、配列順序を正確に読み取るためには、無機蛍光体ナノ粒子及び金属クラスターについて、隣接しているもの同士が重なり合わないように、これら無機蛍光体ナノ粒子及び金属クラスターの大きさ（粒径）と、読み取り対象の１重鎖ＤＮＡに差し込まれる１重鎖ＤＮＡの長さを調節することが必要である。無機蛍光体ナノ粒子及び金属クラスターの大きさ（粒径）は、差し込まれる１重鎖ＤＮＡよりも小さいことが望ましいが、本実施形態の塩基配列決定装置１の場合、シート基板３上に広がる一重鎖ＤＮＡの両側に標識できるため、差し込まれるＤＮＡの長さの１．５倍程度の粒径まで可能である。
　ここで、試料溶液２における溶媒は、読み取り対象の核酸を凝集させないものであればよいが、走査電子顕微鏡画像の背景ノイズとなる無機塩は避け、核酸が溶解するｐＨ範囲のものを使用することが望ましい。また、試料溶液２のｐＨ調整には、乾燥過程で蒸発するＨＣｌなどを使用することが望ましい。そして、タンク１０内の試料溶液２は、ポンプ（図示せず）や送液管１１などを備える送液部によって、試料固定部に導入される。
　なお、読み取り対象の核酸には、前述した１重鎖ＤＮＡの他に、例えばＣＤＣ法などにより伸長された１重鎖ＤＮＡと、無機蛍光体ナノ粒子や金属クラスターで標識されたビーコンとを、ハイブリダイズさせた２重鎖ＤＮＡを使用することもできる。ただし、配列の塩基数が同じ場合、伸長した１重鎖ＤＮＡは、伸長した２重鎖ＤＮＡの２倍以上の長さになるため、隣接した塩基間を引き伸ばすＣＤＣ法には１重鎖ＤＮＡの方が有利である。即ち、電子顕微鏡の分解能の観点からは、読み取り対象の核酸には、２重鎖の標識化ＤＮＡよりも、化学的に伸長される際に差し込まれるＤＮＡの塩基数を少なくすることができる１重鎖の標識化ＤＮＡを使用することが望ましい。
［試料固定部］
　試料固定部は、浸漬槽２１及び回転ローラー２２などが設けられており、試料溶液２に含有される隣接基間長が拡大され、必要に応じて無機蛍光体などの標識が導入された最終産物の１重鎖ＤＮＡを、シート状の基板３に固定して伸長展開する。その際、最終産物の１重鎖ＤＮＡを伸長展開する方法は特に限定されるものではないが、例えば、Molecular Combing（分子櫛化）法などを適用することができる。
　このMolecular Combing法で最終産物の１重鎖ＤＮＡを伸長展開する場合は、水をはじく撥水性（疎水性）基板を用いることが重要である。具体的には、最終産物の１重鎖ＤＮＡの端点が基板３に付着アンカーされることを前提として、アンカーされたＤＮＡ分子を含む試料溶液２を、疎水性の基板３上で動かす。そうすると、基板３は濡れないため、試料溶液２全体がＤＮＡ分子を保持しつつ移動するが、アンカーされたＤＮＡ分子は動けないので、ＤＮＡ鎖を引っぱりながら溶液端が基板面上を動くことになる。これにより、アンカー端点から移動溶液方向と平行にＤＮＡ分子が伸長されることになる。
　そして、多数のＤＮＡアンカー点を、適当な密度で基板上に設けることにより、伸長鎖の間隔は不規則だが全ての伸長ＤＮＡ鎖が並行となり、ＤＮＡ分子間の縦方向及び横方向の重なりのない画像化に好都合のＤＮＡ分子アレイを作製することができる。このように、ＤＮＡ鎖を、できるだけまっすぐ伸ばして観察用基板に付着並列させることで、顕微鏡観察における隣接塩基の重なりを防止し、画像解析を容易にすることができる。
　ここで、シート基板３としては、例えば、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）シートや撥水性のプラスチックシートなどが挙げられるが、特にＣＮＴシートが好適である。ＣＮＴシートは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を平面状に編んだものであり、厚さが５０ｎｍ以下と極めて薄く、ナノチューブの本来の性質である撥水性（疎水性）を有する。従って、最終産物の１重鎖ＤＮＡが、ＣＮＴシート上のどこかにアンカーされれば、前述したMolecular Combing法を用いてＤＮＡ分子を伸長させることができる。
　なお、１分子ＤＮＡの端点をシート基板３に付着させ、アンカーを形成する方法は、特に限定されるものではないが、最も単純な方法は、隣接基間長が拡大された最終産物のＤＮＡ鎖の一方の端点に疎水物質を導入し、端点導入疎水性物質とＣＮＴシート表面との疎水性相互作用（疎水結合）を利用する方法がある。その際、導入される疎水性物質としては、例えばフラーレン、アントラセン及びテトラセンなど多環式炭素化合物が挙げられる。
　更に、図２に示すように、ＣＮＴシートの強靭さを利用し、ロール状のシート基板３を試料観察部の大気圧走査型複合電子顕微鏡の端に置き、もう一方で巻き上げながらシートを搬送し、大気圧走査型複合電子顕微鏡の試料観察用窒化シリコン窓３８上を持続的に通過させることもできる。この場合、アンカー端点を保持した最終産物の１重鎖ＤＮＡを含有する試料溶液２が注入された浸漬槽２１に、ロール状のＣＮＴシートを浸し、これを回転ローラー２２により巻き上げることによって、molecular combing作用で自動的にＤＮＡ分子アレイを形成することができる。
［試料観察部］
　試料観察部には、塩基配列解読の核となる大気圧走査型複合電子顕微鏡が設けられている。この大気圧走査型複合電子顕微鏡の最大の特徴は、電子銃３１から出射された電子線収束ビーム３２を、窒化シリコン製の薄い真空障壁（窓）を通して大気中に導き、大気圧下の試料の電子顕微鏡像を撮影できることであり、試料の大気圧観測で約８ｎｍの分解能が得られている。
　また、大気圧走査型複合電子顕微鏡は、大気圧ＳＥＭの上方の開放大気空間（外光遮断筐体３５）内に、光学顕微鏡３６が搭載されており、電子顕微鏡像と光学顕微鏡像とを、同視野で観察することが可能となっている。このように、大気圧ＳＥＭと光学顕微鏡３６を一体化することで、読み取り対象の１分子の核酸について、同一視野の走査電子顕微鏡画像と走査蛍光画像を、同時に又は異時に撮影することができる。
　一般に、大気圧ＳＥＭには、電子線走査制御系、電子線加速電子銃３１、電子線コンデンサーレンズ、絞り、窒化シリコン製電子線透過観測窓３８、電子検出器３９、真空系制御、データ取得・解析・保管用コンピュータなどが設けられている。また、光学顕微鏡３６には、例えばコンデンサーレンズ、対物レンズ、投影レンズ、カラー受光器、多色レーザー光源及び多色同時観測蛍光フィルターシステムなどが設けられている。
　そして、通常、電子線３２は、下方から出射され、磁場レンズ３３により収束されて、真空チャンバー３４を通過し、窒化シリコン窓３８に照射される。窒化シリコン窓３８を透過した電子線３２は、その上に配置されている試料（基板３）に照射され、それにより生じた反射電子が大気圧ＳＥＭの電子検出器３９で検出されると共に、光学顕微鏡３６で蛍光が検出される。この基板３が配置されている空間（外光遮断筐体３５）内は大気圧であり、窒化シリコン窓３８により真空チャンバー３４と区画されている。
　ここで、電子線透過度を上げるためには、窒化シリコン窓３８の厚さは、できるだけ薄くすることが望ましいが、そうすると窓の機械的強度が低下し、窓の真空耐圧性能が劣化する。このため、窒化シリコン窓３８の面積は、観察に支障のない程度に小さくすることが望ましい。窒化シリコン窓３８は、例えば、厚さ１０～５０ｎｍ、幅１～１０μｍ、長さ１～１０ｍｍの短冊形状とすることができる。また、この短冊形状窓は、同一形状のものを複数個、相互に平行になるよう２次元アレイ状に配設してもよい。
　また、試料観察部には、この大気圧走査型複合電子顕微鏡で観察した走査電子顕微鏡画像及び／又は走査蛍光画像を、ディジタルイメージング処理するイメージング処理部（図示せず）が設けられていてもよい。この場合、例えば、大気圧ＳＥＭのイメージング処理部には電子線走査同期イメージング制御システム及びディジタル画像処理システムを設け、光学顕微鏡のイメージング処理部には外部制御カラーディジタル信号取得システム及びディジタル画像処理システムを設ける。
　これにより、大気圧走査型複合電子顕微鏡における電子線１回の走査に対応し、電子顕微鏡像と光学顕微鏡像を、同視野で、同時観察又は異時観察し、１次元イメージ記録することができる。例えば、ＤＮＡを、金属クラスターで標識した場合は、電子顕微鏡像と明視野光学顕微鏡像とが同時又は異時表示され、また、無機蛍光体で標識した場合は、電子顕微鏡像と蛍光像とが同時又は異時表示される。
　更に、シート基板３のロール巻き上げをステップ的に行い、大気圧走査型複合電子顕微鏡の観測窓に次々に移動してきたシート基板３上の１分子ＤＮＡの観測を持続的に行うことにより、１分子ＤＮＡ観測を２次元イメージとして記録することができる。これらのイメージデータは、例えば表示部３７に表示される。
　なお、本実施形態の塩基配列決定装置１では、大気圧走査型複合電子顕微鏡の操作とシート基板３の連続送付システムの操作を、コンピュータ制御部により一体で行うこともできる。また、装置全体が、温度制御、除塵制御、除震制御をするための外界遮断コンソールで覆われていてもよい。
　以上詳述したように、本実施形態の塩基配列決定装置１では、読み取り対象の１重鎖ＤＮＡの隣接基間長を拡大すると共に１重鎖ＤＮＡを伸長展開し、大気圧走査型複合電子顕微鏡により、１分子の核酸の塩基配列を大気中で連続観察しているため、従来よりも高速で核酸の塩基配列を決定することができる。これにより、超高速ＤＮＡシーケンサーを実現することができる。
　１　塩基配列決定装置
　２　試料溶液
　３　基板
　１０　タンク
　１１　送液管
　２１　浸漬槽
　２２　回転ローラー
　３１　電子銃
　３２　電子線
　３３　磁場レンズ
　３４　真空チャンバー
　３５　外光遮断筐体
　３６　光学顕微鏡
　３７　表示部
　３８　窒化シリコン窓
　３９　電子検出器

Claims (11)

  1. 　電子顕微鏡を使用して１分子の核酸の塩基配列を決定する塩基配列決定装置であって、
    　隣接基間長が拡大された１重鎖ＤＮＡを含有する試料溶液が貯留される試料貯留部と、
    　前記試料溶液が導入され、該試料溶液中の１重鎖ＤＮＡをシート状の基板に固定して伸長展開する試料固定部と、
    　電子顕微鏡像及び光学顕微鏡像を同視野で観察可能な大気圧走査型複合電子顕微鏡を備え、該大気圧走査型複合電子顕微鏡により前記基板に固定された１重鎖ＤＮＡを、前記基板を長さ方向に移動させながら連続的に観察する試料観察部と、
    を有する塩基配列決定装置。
  2. 　前記１重鎖ＤＮＡは、塩基間に他の１重鎖ＤＮＡを差し込むことにより隣接基間長が拡大されたものであり、差し込まれた他の１重鎖ＤＮＡは、電子顕微鏡により識別可能な金属クラスターで標識されていることを特徴とする請求項１に記載の塩基配列決定装置。
  3. 　前記金属クラスターの大きさは、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡの伸長時の長さよりも小さいことを特徴とする請求項２に記載の塩基配列決定装置。
  4. 　塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡは、塩基種毎に大きさが異なる金属クラスターで標識されていることを特徴とする請求項２又は３に記載の塩基配列決定装置。
  5. 　前記１重鎖ＤＮＡは、塩基間に他の１重鎖ＤＮＡを差し込むことにより隣接基間長が拡大されたものであり、差し込まれた他の１重鎖ＤＮＡは、電子線により発光する無機蛍光体ナノ粒子で標識されていることを特徴とする請求項１に記載の塩基配列決定装置。
  6. 　前記無機蛍光体ナノ粒子の大きさは、塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡの伸長時の長さよりも小さいことを特徴とする請求項５に記載の塩基配列決定装置。
  7. 　塩基間に差し込まれる１重鎖ＤＮＡは、塩基種毎に発光波長が異なる無機蛍光体ナノ粒子で標識されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の塩基配列決定装置。
  8. 　前記基板が撥水性シートであり、前記隣接基間長が拡大された１重鎖ＤＮＡの一方の端点に導入された疎水物質との疎水性相互作用により、前記基板に前記１重鎖ＤＮＡが固定されることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の塩基配列決定装置。
  9. 　前記基板がカーボンナノチューブシートであることを特徴とする請求項８に記載の塩基配列決定装置。
  10. 　前記隣接基間長が拡大された１重鎖ＤＮＡの一方の端点に導入された疎水物質が、多環式炭素化合物であることを特徴とする請求項８又は９に記載の塩基配列決定装置。
  11. 　前記大気圧走査型複合電子顕微鏡により観察した電子顕微鏡画像及び／又は蛍光画像を処理するイメージング処理部と、
    　該イメージング処理部で処理された画像を表示する表示部と、を有し、
    　前記表示部において１次元又は２次元画像を表示することを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の塩基配列決定装置。
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