WO2013072584A2 - Méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic - Google Patents

Méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic Download PDF

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Marianne OULHEN
Alexander VALENT
Philippe Vielh
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the subject of the present invention is a new method for characterizing circulating tumor cells (CTC) as well as the uses of this method for deciding on the implementation of an antitumor treatment, diagnosing the progress of a cancer and to predict the evolution of the disease in a patient.
  • CTC circulating tumor cells
  • the detection of the presence in CTCs of molecular markers targeted for antitumor treatment may make it possible to select the patients likely to benefit from this treatment, or even to evaluate at the individual level the response or resistance to this same treatment.
  • the selection of patients likely to benefit from targeted antitumor therapy is currently based on the search for molecular markers in metastasis biopsies.
  • the present method makes it possible to carry out this research on CTCs, completing or even substituting for the analysis of the tumor biopsy.
  • the method according to the present invention provides an alternative solution for the detection of CTCs not requiring the presence of a licensed cytopathologist, as it combines a true morphological analysis, phenotypic identification of the cells by fluorescent immunostaining and genomic detection of the presence of particular DNA sequences, such as characteristic rearrangements of cancer cells.
  • the detection method according to the invention is now described in detail.
  • the subject of the present invention is a method of identifying, in a biological sample and in particular a blood sample, circulating tumor cells (CTC) bearing at least one marker that is characteristic of the tumor nature of the cell, said marker being chosen from groups consisting of:
  • said method comprising the following steps: at. Identification, on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the CTC tumor nature, b. Detection, on a support comprising the cells from the biological sample, using a FISH-type technique, of the signal associated with the presence of a gene characteristic of the tumor nature of the cell, c. Comparison of the location on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs.
  • the invention has the advantage of combining, on the same support, a phenotypic labeling and an analysis by a method of FISH type, which preserve the integrity of CTC.
  • the biological sample comes from a patient with cancer.
  • the circulating tumor cells are of epithelial and mesenchymal origin.
  • the CTC identification method is also referred to as the CTC enrichment method or the CTC characterization method.
  • the three expressions are equivalent and can be used interchangeably.
  • the enrichment method used according to the present invention is the ISET method.
  • the cells coming from the biological sample serving for identifying at least one signal that is a control signal for the presence of CTC and for detecting the signal associated with the presence of a gene characteristic of the tumor nature of the cell, with the exception of the EML4-ALK fusion gene are isolated according to their size which varies from 8 pm to at least 40 pm.
  • the subject of the invention is a method for identifying circulating tumor cells (CTCs) carrying the EML4-ALK fusion gene in a biological sample originating from a patient, said method comprising the following steps: :
  • Identification on a support comprising the cells originating from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • the method detects the presence of the EML4-ALK fusion gene, by the FISH technique, and identifies CTC morphologically and phenotypically, and in particular the presence of the protein encoded by said fusion gene.
  • the EML4-ALK fusion protein has potent oncogenic activity and a key role in carcinogenesis in a subpopulation of patients with non-small cell lung cancer (also referred to as non-small cell lung cancer (NSCLC)). This activity, which can be blocked by small molecules, including tyrosine kinase inhibitors targeting ALK, is an important molecular target in the treatment of these cancers.
  • the subject of the invention is a method of identifying, in a biological sample originating from a patient, circulating tumor cells (CTC) carrying at least one marker that is characteristic of the tumor nature of the cell.
  • CTC circulating tumor cells
  • said method comprising the following steps a. Identification, on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the CTC tumor nature, except for a protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, b. Detection, on a support comprising the cells from the biological sample, using a FISH-type technique, of the signal associated with the presence of a gene characteristic of the tumor nature of the cell, with the exception the EML4-ALK fusion gene, c. Comparison of the location on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs,
  • the subject of the invention is a method of identifying, in a biological sample, in particular a blood sample, circulating tumor cells (CTC) bearing at least one marker that is characteristic of the tumor nature of the cell.
  • CTC circulating tumor cells
  • said method comprising the following steps:
  • Identification on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the CTC tumor nature, except for a protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, b.
  • Detection on a support comprising the cells from the biological sample, using a FISH type technique using specific reshaping or amplification probes, the signal associated with the presence a gene characteristic of the tumor nature of the cell, with the exception of the EML4-ALK fusion gene, c. Comparison of the location on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs.
  • the method for detecting CTCs described in the publication by Charpentier et al (2011) describes an XTC detection method comprising, on the one hand, the combined use of three fluorescent labels and, on the other hand, a morphocytological analysis performed by an experienced cytopathologist.
  • This document does not disclose a CTC detection method combining fluorescent phenotypic markings and automated analysis of cell morphology; it also does not disclose a method combining the phenotypic detection of cells by fluorescent immunostaining and the chromosomal detection of the presence of particular DNA sequences.
  • this document does not disclose a detection method combining automated detection of cell morphology, phenotypic detection by fluorescent immunostaining and molecular detection by the use of FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) methods.
  • FISH Fluorescence In Situ Hybridization
  • the identification method according to the invention comprises the following steps:
  • Identification on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of the EML4-ALK fusion protein gene,
  • the method detects, on the one hand, the presence of the EML4-ALK fusion gene and, on the other hand, the presence of a protein other than a protein encoded by said fusion gene.
  • the identification method according to the invention comprises the following steps: a. Identification, on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell except for a protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, b.
  • Detection on a support comprising the cells originating from the biological sample, using a FISH type technique using specific reshaping or amplification probes, of the signal associated with the presence of the gene coding for the aforesaid protein , vs. Comparison of the location on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs.
  • the subject of the invention is a method comprising the following steps:
  • the identification method comprises the following steps: a.
  • Identification on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a tumor marker, b.
  • Detection on a support comprising the cells coming from the biological sample, using a FISH-type technique using specific reshaping or amplification probes, of the signal associated with the presence of a gene coding for a oncogenic protein characteristic of CTCs, with the exception of proteins encoded by the EML4-ALK fusion gene, and c. Comparison of the location on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs.
  • the method detects, on the one hand, the presence of the gene coding for an oncogenic protein characteristic of CTCs and, on the other hand, the presence of a tumor marker.
  • the method according to the invention comprises a step of enriching the biological sample in CTC, preliminary or inherent to the steps of identification of the different signals, the enrichment factor of the cells in CTC being understood as about 1/100 to about 1 / 100,000.
  • the support comprising the cells coming from the biological sample is a filter, in particular an ISET filter (sold by the company Rarecell or Screencell)
  • the filtration of the blood sample leads, in a manner inherently to the filtration, to an enrichment of the cells in CTC.
  • the approach of filters provides ⁇ generally more cells to establish the diagnosis.
  • Filters are very delicate than any other medium (no flatness, background noise and pore problems).
  • the size of the pores of these filters determines the size of the cells that will be able to be retained on the filter, said size of cells being able to vary from 8 ⁇ to at least 40 ⁇ .
  • the enrichment step takes place during the immunomagnetic separation, and is prior to the slide deposit.
  • This enrichment is of the order of a factor of about 1/100 to a factor of about 1 / 100,000, depending on the enrichment method used and varies from one patient to another.
  • the subject of the invention is a method in which the deposition of the cells originating from the patient's biological sample is carried out on a suitable support that can be analyzed using a microscope-type device.
  • fluorescence or scanner said support may be a filter or a blade.
  • the support used for depositing the biological sample can be analyzed in a microscope, such as for example a fluorescence microscope, a scanner, or any other device for reading a support, whether the reading is manual or automated.
  • the support can be a filter, a blade, or any other support adapted to the deposit of the sample and the reading of the signals in a suitable apparatus.
  • the inventors have thus developed an automated strategy using a blade scanner (in particular the ARIOL ® system from LEICA) which consists in sorting the cells recovered after filtration (or after enrichment by negative selection) into 2 fractions, one CD45 (+) and the other CD45 (-).
  • the CD45 (-) fraction containing the different CTC populations is then extensively analyzed to identify purely epithelial CTCs, mesenchymal, hybrid (epithelial and mesenchymal) CTCs as well as other populations that do not express these markers.
  • FISH the signals of FISH (rearrangement ALK EML4) are relocated in these different populations.
  • CTCs can be characterized phenotypically and genotypically in their entirety.
  • the cells from the biological sample of the patient are collected during filtration, for filter deposition, or deposited on a slide after magnetic immuno-separation, or by any appropriate method known to the patient. skilled person.
  • step a that is to say the identification of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal that is a witness of the presence of CTC is carried out by means of fluorescence immunolabeling using at least one marker chosen in one of the groups consisting of:
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal which is a control signal for the presence of CTC is carried out by means of a fluorescence immunolabeling using, in combination, at least two markers, each selected from one of the groups consisting of:
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, at least three markers, each being chosen from one of groups consisting of:
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, four markers, each being chosen from the one of the groups consisting of:
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC is carried out by means of fluorescence immunolabeling using at least one marker selected from one of the groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, ii. a nuclear membrane marker or a nuclear marker, iii. a hematopoietic cell marker,
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal which is a control signal for the presence of CTC is carried out by means of a fluorescence immunolabeling using, in combination, at least two markers, each selected from one of the groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • a nuclear membrane marker or a nuclear marker ii. a nuclear membrane marker or a nuclear marker; a hematopoietic cell marker
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, at least three markers, each being chosen from one of groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, four markers, each being chosen from the one of the groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the invention relates to a method wherein the specific marker of the EML4-ALK fusion gene encoded protein clones are 5A4 or D5F3, marketed by companies AbCam ®, Cell Signaling Technology ®.
  • the subject of the invention is a method in which the specific marker of the oncogenic proteins characteristic of CTCs is chosen from the markers of the proteins encoded by the HER2, ERG and cMet genes.
  • the subject of the invention is a method in which the nuclear membrane marker used is the Emerin marker.
  • emerin is used as a CTC nuclear membrane marker to identify the tumor nature of CTCs by differentiating them from hematopoietic cells and other normal cells. It can be used for CTCs from any type of tumor.
  • the morphological characterization step is based either on the introduction of a nuclear membrane marker (such as emerin) into the quadruple fluorescent labeling, or on the completion of a staining step of the nuclei (such as hematoxylin / eosin) after IF labeling which must also be removed in the intermediate washing step between IF and FISH.
  • a nuclear membrane marker such as emerin
  • the subject of the invention is a method in which the nuclear marker used is chosen from the group consisting of: the DAPI marker, the Syto59, Sytox Orange, TOPRO 3 and Hoescht 33342 markers.
  • the subject of the invention is a method in which the hematopoietic cell marker is chosen from the group consisting of: CD45 and CD31.
  • the marker used is preferably CD45.
  • CTCs are known to be heterogeneous and composed of different subpopulations.
  • the approach according to the present invention makes it possible to identify and characterize the different subpopulations of CTC, purely epithelial, purely mesenchymal, hybrid (epithelial and mesenchymal) as well as other populations that ⁇ do not express these markers. Only the approaches of filtration or negative selection of CTCs by elimination of hematopoietic cells can give access to these cells.
  • CTCs in number
  • the methods of the prior art only recover a small fraction of CTC (epithelial CTC) and this too rare fraction is not used in this clinical context.
  • the subject of the invention is a method in which the protein marker characteristic of epithelial cells is selected from the group consisting of: EpCAM markers, pan-cytokeratin markers and epithelial cadherin markers .
  • the subject of the invention is a method in which the protein marker characteristic of mesenchymal cells is chosen from the group consisting of: vimentin markers and markers of neural cadherin.
  • a particular embodiment of the invention which is the subject of the invention comprises a step of identifying at least one signal which is a control signal for the presence of CTC carried out by means of a fluorescence immunolabeling using: i. the marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene or the marker of a protein encoded by a gene chosen from the HER2, ERG and cMet genes,
  • Another particular aspect of the invention relates to a method of the FISH type comprising the following successive steps:
  • the method according to the invention comprises a FISH test carried out according to a particular and advantageous protocol, developed by the inventors, and using specific reshaping or amplification probes, and not centromeric probes. This method therefore makes it possible to specifically detect the presence of reshaped or amplified genes in the cells.
  • the IF plus FISH sequence requires very mild methods for both IF and FISH and has an intermediate stage of fluorescence elimination before FISH. If the fluorescence is poorly eliminated, it follows a significant background noise that makes the FISH uninterpretable. Photobleaching is very aggressive towards cells and can not be used to eliminate fluorescence before FISH. Moreover, it is well known that FISH is already very delicate by itself. The inventors have developed successive gentle washes that respect the fragility of CTC and avoid cell losses,
  • the method according to the invention is carried out on a blood sample of a patient.
  • the biological samples necessary to diagnose the presence of an ALK gene rearrangement and to decide on a targeted anti-ALK treatment in the tests according to the prior art are necessarily tumor biopsies, invasive and often of poor quality, in particular in patients certain cancers such as NSCLC.
  • Another aspect relates to the use of a method according to the invention for analyzing a biological sample from a cancer patient presenting the translocated ALK gene for monitoring tumor progression, for the prediction of a tumor event. metastatic type or for measuring the effectiveness of an anti-cancer treatment.
  • Another aspect relates to the use of a method according to the invention for analyzing a biological sample from a cancer patient having the translocated ALK gene for the diagnosis of the indication of a tumor treatment against the ALK protein. More particularly, the invention relates to the use of the method described in the context of cancer patients likely to lead to the presence of metastases, including non-small cell lung cancer, and any other cancer presenting with reshaping the ALK gene.
  • a method according to the invention therefore falls within the scope of personalized medicine with targeted antitumor therapy.
  • the method according to the invention is carried out on a blood sample of a patient.
  • the biological samples necessary to diagnose the presence of a molecular anomaly such as translocation or gene amplification and decide on a targeted treatment in the tests according to the prior art are necessarily tumor biopsies, invasive and often of poor quality, in particular in patients with certain cancers such as NSCLC or prostate cancer.
  • Another aspect relates to the use of a method according to the invention for analyzing a biological sample, in particular a blood sample coming from a cancer patient presenting a molecular defect such as a translocation or a gene amplification for monitoring the evolution. tumor, for predicting a metastatic event or for measuring the effectiveness of an anti-cancer treatment.
  • a biological sample in particular a blood sample coming from a cancer patient presenting a molecular defect such as a translocation or a gene amplification for monitoring the evolution. tumor, for predicting a metastatic event or for measuring the effectiveness of an anti-cancer treatment.
  • Another aspect relates to the use of a method according to the invention for analyzing a biological sample from a cancer patient having a molecular defect such as translocation or gene amplification for the diagnosis of the indication of a treatment.
  • tumor targeting oncogenic proteins encoded by these genes More particularly, the invention relates to the use of the method described in the context of cancer patients likely to lead to the presence of metastases, including non-small cell lung cancer, and any other cancer presenting a reworking of the ALK gene.
  • a method according to the invention therefore falls within the scope of personalized medicine with targeted antitumor therapy.
  • Figure 1 Fluorescence microscopy image on ISET filter showing the labeling obtained on line H2228 (EML4-ALK translocation carrier) with the monoclonal antibody (5A4 or D5F3) specific for translocated ALK protein.
  • 1A Marking obtained with the nuclear dye DAPI;
  • B Labeling obtained with the specific antibody of the ALK protein;
  • C Marking obtained, with the specific antibody of the ALK protein and the DAPI.
  • Figure 2 Fluorescence microscopy image showing a FISH experiment on ISET filter performed on CTC of a patient with non-small cell lung cancer.
  • 2A Example of a hematopoietic cell retained on the filter having no translocation;
  • 2B and 2C Example of two CTCs with translocation. 2p23 break point specific probes were used.
  • FIG. 3 Fluorescence microscopy images in three representative patients (P2, P6, P11) showing FISH detection of ALK rearrangement in CTC and tumor of the same patient.
  • Various CTC examples are presented: individual CTCs carrying only ALK (P2) shuffling, individual CTCs carrying both a native ALK gain and ALK (P6) shuffling, CLC in ALK shuffling (P11) clusters .
  • Figure 4 Microscopy images illustrating the method combining 4-color immunofluorescence labeling (vimentin / cytokeratines / CD45 / DAPI and N-cadherin / E-cadherin / CD45 / DAPI) and FISH for the detection of CTCs carriers of the ALK reshuffle.
  • 4A Example of two patients showing the mesenchymal phenotype of CTCs carrying the ALK rearrangement
  • 4B Positive control of immunofluorescence markings on the A549 bronchial cancer line.
  • Figure 5 Fluorescence microscopy images illustrating the possibility of following by FISH the presence of CTCs carrying ALK rearrangement in patients with ALK positive NKLC treated with an inhibitor of ALK.
  • Figure 6 Fluorescence microscopy image showing detection of amplification of HER2 on ISET filter.
  • 6A Example of a FISH experiment on the SKBR3 cell line
  • 6B Example of a FISH experiment on CTCs of a patient carrying HER2 amplification
  • 6C Example of immunofluorescence staining with the monoclonal antibody directed against the HER2 protein on the CTCs of a patient carrying the HER2 amplification.
  • Figure 7 Fluorescence microscopy image showing in cell lines and prostate and breast cancer patients collected on ISET filter, the detection by FISH of various molecular abnormalities.
  • A Detection of the ERG gene amplification in the LnCAP cell line;
  • B Detection of the rearrangement of the ERG gene in the VCAP cell line;
  • C Detection of the amplification of the AR gene in the LnCAP cell line;
  • D Detection of the amplification of the HER2 gene in the SKBR3 cell line;
  • E Detection of ERG gene amplification in a patient with prostate cancer;
  • F Detection of cMYC gene amplification in a patient with prostate cancer;
  • G Detection of AR gene amplification in a patient with prostate cancer;
  • H Detection of HER2 gene amplification in a patient with breast cancer.
  • FIG. 8 Microscopy images illustrating in cell lines (FIG. 8A) and CTCs of patients suffering from prostate cancer (FIG. 8B) the automated method combining, on an ISET filter, the 4-color immunofluorescence labeling (vimentin / cytokeratines / CD45 / DAPI) and FISH for the detection of CTCs carrying amplification of ERG or cMYC or AR genes.
  • FIG. 9 Microscopy images illustrating in the 1975 bronchial cancer cell line the method combining on ISET filter the immunofluorescence labeling (cMet / CD45 / DAPI) and FISH; 9A: 3-Color Immunofluorescence Detection of cMET Protein; 9B: Detection of cMET amplification; 9C: Method combining immunofluorescence labeling and FISH.
  • the blood sample is enriched in CTC by filtration based on the ISET technique (isolation by size of epithelial tumors).
  • the filters are subjected to very low pressure filtration on the ISET machine (7mBar), then dried on a hot plate at 45 ° C for 2 min.
  • the filters are wrapped in aluminum foil and then frozen.
  • the cells are identified by immunofluorescent staining, on ISET filter, nuclei, cytokeratin, CD45 and ALK protein.
  • 1X EDTA buffer pH9 is prepared from 10X EDTA and then warmed to 98 ° C. Preparation of the antibodies:
  • the antibodies are diluted in 0.2% TBS-Triton and a total volume of 0 ⁇ .
  • the different antibody solutions are prepared independently and then mixed.
  • the anti-cytokeratin antibodies (CK A1 / A3 - DAKO) are coupled to the AF546 fluorochrome according to the Zenon IGAF546 kit coupling protocol (Invitrogen).
  • Anti-ALK (Novo-Castra) antibodies are coupled to AF488 fluorochrome according to the Zenon IGAF488 kit coupling protocol (Invitrogen).
  • the different antibody solutions are pooled and their volume supplemented to 100 ⁇ in 0.4% TBS-Triton.
  • the filters are taken out of the freezer and placed at room temperature for about 15 minutes.
  • the filters are attached to the blade using high temperature resistant tape, which also identifies the filters.
  • the filters are then rehydrated in TBS for 5 minutes and then drained.
  • the slides are immersed for 5 min in EDTA buffer 1X pH 9 heated in a water bath at 98 ° C, they are then rinsed for 2 min in TBS and for 1 min in distilled water and then drained. On the filter, the spots (8 mm diameter) are surrounded using DakoPen (hydrophobic). Wet chambers are prepared using an absorbent paper previously passed under tap water. On each spot, 0 ⁇ of the prepared solution of antibodies are deposited, then each spot is covered with a 12mm diameter round blade. All incubated overnight in a humid chamber at 4 ° C and in the dark.
  • the chambers are placed at room temperature for 15 min and then rinsed in 0.05% TBS-Tween for 2 min and drained, rinsed in distilled water and then drained.
  • DAPI mounting solution 100 ⁇ l of diluted DAPI mounting solution are deposited on each slide, all incubated for 15 min at room temperature and in the dark.
  • the slides are then rinsed in 0.05% TBS-Tween for 2 min and then drained, then rinsed in distilled water and drained.
  • the slides and coverslips are then mounted fluoromount, after 1 hour at room temperature and in the dark, they are sealed, before being stored at 4 ° C.
  • the reading is performed under the microscope the next day, the CTCs are identified, and their positions are stored.
  • Example 3 Test for Detection of the EML4-ALK Fusion Gene by the FISH Technique This test is carried out after the immunofluorescence labeling.
  • the blade and coverslip system is disassembled and the filter is washed in a 1X PBS solution before being fixed with a solution of methanol / acetic acid (9: 1) for 2 hours at room temperature. room.
  • a solution of 80 ml of 0.01 N HCl (8 ml 0.1N HCl + 72 ml H 2 O) is preheated in a 37 ° C water bath.
  • the slides kept at + 4 ° C. are incubated for 5 min in a bath of 4xSSCT.
  • pepsin is added to the 0.01 N HCl at 37 ° C.
  • the filter is incubated for a few minutes in the pepsin solution, shaking it every two minutes.
  • a fixing solution, formaldehyde of final concentration 1%, is prepared extemporaneously.
  • the resulting solution is stable for a day.
  • the slides are washed in a 1X PBS for 5 minutes without moistening the adhesive tape and without agitation.
  • the slides are then fixed by soaking for 2 minutes in the fixing solution, without moistening the adhesive tape.
  • the slides are then dehydrated successively for two minutes at 70%, 85% and 100% ethanol, without allowing the slides to dry between the alcohols.
  • the back of the blade is wiped gently, the dryer then dries for a few minutes, and for a maximum of one hour, on a plate at 37 ° C, or dry at room temperature.
  • an airtight box is placed on the lit plate at 37 ° C, this box will allow the possible transport of the blade.
  • the hybridization apparatus, or hybridizer is turned on and programmed to obtain a temperature of 37 ° C.
  • the blades are inserted, in their respective places, in ⁇ "hybridizer".
  • the two strips on the cover are moistened with water, and then replaced on the cover of the hybridizer to minimize evaporation of the probe.
  • the blade is placed on the platen at 37 ° C.
  • On each spot (8 mm in diameter) are deposited ⁇ of hybridization mixture probe ALK (Vysis) (for each spot are deposited 7 ⁇ of buffer, 2 ⁇ of water, 1 ⁇ of probe).
  • a small round blade (12 mm in diameter) is placed gently on the spots.
  • the area of interest is sealed with glue placed around it to completely isolate this area.
  • the glue is dried by depositing the slide on the plate at 37 ° C. for about 5 minutes.
  • the slide is then immediately placed in the hybridizer so as not to change the temperature of the probe.
  • the denaturation program is started at 85 ° C for 10 min, then hybridization typically takes place at 44 ° C overnight (12 hours) at 44 ° C.
  • This hybridization can be carried out in the hybridizer or in an oven placed at 44 ° C. In the latter case, after the step at 85 ° C, the blade is very quickly placed in the box already at 37 ° C on the platen, then transferred into the special wet black box set in advance in the oven. 44 ° C.
  • the water bath is connected at 65 ° C and the plate at 37 ° C, Dako Wash Buffer 1X buffer is prepared extemporaneously.
  • the buffer is then preheated, placing half of the buffer in a porcelain tray which is placed in the water bath at 65 ° C without the temperature being reached (to avoid thermal shock), the temperature is reached at the end about 30 min.
  • the other half of the buffer is placed in a slide tray at room temperature.
  • the blade is extracted from the hybridizer or oven and transported if necessary into a special black box to protect the blade from light. Without light, the glue is removed very gently with pliers, without damaging the filter.
  • the slide is washed for about 7 minutes in the Stringent Wash Buffer at room temperature without agitation.
  • the slide is washed for 5 min in the preheated buffer at 65 ° C. and then for 5 min in Wash Buffer 1X DAKO wash buffer at room temperature.
  • the slide is dehydrated for 2 min with successively 70%, 85% 100% ethanol, without letting it dry between the alcohols.
  • the back of the blade is wiped gently with absorbent paper, then allowed to dry for a few minutes on the plate at 37 ° C, checking that no alcohol remains between the blade and the filter.
  • the slides can be rewashed at 70 ° C for 1-5 min.
  • the blades are covered by a slat of 22x22 or 24x40, the whole is sealed on one side of the slat, on the opposite side to the spot.
  • the slide is dried on the hot plate at 37 ° C for about 5 minutes.
  • the slide is transported in a black box to the microscope, and observed using successively x20 magnifications, to spot the spot, then x100, with immersion oil.
  • the slide can be kept in the dark for 1 week at room temperature or for 1 year at -20 ° C.
  • the reading is carried out under a fluorescence microscope or scanner. CTCs are relocated from the positions already identified during immunostaining.
  • This test is performed after immunofluorescence staining.
  • a solution of 80 ml of 0.01 N HCl (8 ml 0.1N HCl + 72 ml H 2 O) is preheated in a 37 ° C water bath for at least 30 minutes.
  • the slides kept at + 4 ° C are incubated successively for 5 min in a bath of 4xSSCT to take off the coverslip, if necessary the slide can be peeled off using a clamp, the mounting medium is removed and the filter is rinsed off in a 1X PBS bath.
  • pepsin is added to the 0.01N HCl, at 37 ° C, the whole is thoroughly mixed. The filter is incubated for 6 min in the pepsin solution, shaking it every two minutes.
  • a fixing solution containing 1% formaldehyde is prepared extemporaneously.
  • the slides are washed in a tub of PBS x for 5 minutes without moistening the adhesive tape and without agitation.
  • the slides are then fixed by soaking for 2 minutes in the fixing solution, without moistening the adhesive tape.
  • the slides are then dehydrated successively for two minutes at 70%, 85% and 100% ethanol, without allowing the blades to dry between the alcohols.
  • the backside of the blade is wiped gently, the filter then dries for a few minutes, and at most for one hour, on a plate at 37 ° C, or it dries at room temperature.
  • J1 Denaturation of slides and hybridization
  • the Hybridizer is turned on and programmed to obtain a temperature of 37 ° C.
  • the blades are inserted in their respective places in the "hybridizer".
  • the two strips on the cover are moistened with water, and then replaced on the cover of the hybridizer to minimize evaporation of the probe.
  • the blade is placed on the platen at 37 ° C.
  • On each spot (8 mm in diameter) are deposited 6 ⁇ of probe HER-2 (Dako).
  • a small round blade (12 mm in diameter) is placed gently on the spots. Any bubbles are pushed gently outside the surface of the slat, for example with a cone.
  • the area of interest is sealed with glue placed around it, such as Rubber-cement, to completely isolate this area.
  • the glue is dried by depositing the blade on the plate at 37 ° C for about 5 minutes, the perfect quality of the gluing on the edges is verified.
  • the slide is then immediately placed in the hybridizer so as not to change the temperature of the probe.
  • the denaturation program is started at 85 ° C for 10 minutes, followed by hybridization at 44 ° C overnight (12 hours) at 44 ° C.
  • This hybridization can be carried out in the hybridizer or in an oven placed at 44 ° C. In the latter case, after the step at 85 ° C, the blade is very quickly placed in the box already at 37 ° C on the platen, then transferred into the special wet black box set in advance in the oven. 44 ° C.
  • Dako Wash Buffer 1X buffer is prepared extemporaneously.
  • the buffer is then preheated, placing half of the buffer in a porcelain tray which is placed in the water bath at 65 ° C without the temperature being reached (to avoid thermal shock), the temperature is reached at the end about 30 min.
  • the other half of the buffer is placed in a slide tray at room temperature.
  • the blade is extracted from the hybridizer or oven and transported if necessary into a special black box to protect the blade from light. Without light, the glue is removed very gently with pliers, without damaging the filter.
  • the slide is washed for about 7 minutes in the Stringent Wash Buffer at room temperature without agitation.
  • the slide is washed for 5 min the slide in the buffer preheated to 65 ° C, then 5 min in Wash Buffer Wash buffer 1X DAKO at room temperature.
  • the slide is dehydrated for 2 min with successively 70%, 85% 100% ethanol, without letting it dry between the alcohols.
  • the back of the blade is wiped gently with absorbent paper, then allowed to dry for a few minutes on the plate at 37 ° C, checking that no alcohol remains between the blade and the filter.
  • the slides can be rewashed at 70 ° C for 1-5 min.
  • the blades are covered by a slat of 22x22 or 24x40, the whole is sealed on one side of the slat, on the opposite side to the spot.
  • the slide is dried on the hot plate at 37 ° C for about 5 minutes.
  • the slide is transported in a black box to the microscope, and observed using successively x20 magnifications, to spot the spot, then x100, with immersion oil.
  • the slide can be kept in the dark for 1 week at room temperature or for 1 year at -20 ° C.
  • the FISH technique is carried out in the same way as described in Example 4, using a probe specific for c-MET.
  • Example 6 Test for Detection of the Erg Gene by the FISH Technique
  • the FISH technique is implemented in the same manner as described in Example 4, using a specific Erg probe.

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode de caractérisation, dans un échantillon biologique de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par : - les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, à l'exception des protéines codées par le gène de fusion EML4-ALK, et - les marqueurs tumoraux. L'invention concerne également l'utilisation de cette méthode pour décider de la mise en œuvre d'un traitement chez un patient atteint d'un cancer.

Description

Méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes
et application au diagnostic
La présente invention a pour objet une nouvelle méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes (CTC) ainsi que les utilisations de cette méthode pour décider de la mise en œuvre d'un traitement antitumoral, diagnostiquer l'état d'avancement d'un cancer et prognostiquer l'évolution de la maladie chez un patient.
Les cellules tumorales circulantes jouent un rôle crucial dans le processus métastatique, et leur analyse peut fournir des informations importantes pour le pronostic d'un patient. Elles constituent en outre un matériel tumoral facilement accessible par des méthodes non invasives, représentatif en temps réel de la maladie métastatique. Dans le contexte du développement de la médecine personnalisée des cancers, la détection de la présence dans des CTC de marqueurs moléculaires cibles d'un traitement antitumoral, peut permettre de sélectionner les patients susceptibles de bénéficier de ce traitement voire d'évaluer au niveau individuel la réponse ou la résistance à ce même traitement. La sélection des patients susceptibles de bénéficier d'un traitement ciblé antitumoral est actuellement basée sur la recherche de marqueurs moléculaires dans des biopsies de métastases. La présente méthode permet de réaliser cette recherche sur des CTC, complétant voire se substituant à l'analyse de la biopsie tumorale.
Les difficultés actuelles de détection des CTC sont liées à leur présence en faible nombre dans le sang. Dans le contexte des traitements ciblés antitumoraux, le diagnostic de la présence d'un marqueur moléculaire dans des CTC doit donc être réalisé sur très peu de cellules. Pour établir de façon certaine ce diagnostic, différentes analyses doivent donc être réalisées en parallèle sur les cellules afin de montrer d'une part la nature tumorale des CTC sur la base du phénotype (marqueurs tumoraux), de la morphologie et d'une anomalie moléculaire impliquée dans l'oncogénèse (exemple : remaniement du gène ALK, amplification du gène HE 2). Lecharpentier et al (2011) décrit une méthode de détection des CTC dans un échantillon sanguin, basée sur la co-expression par lesdites cellules de marqueurs spécifiques de cellules épithéliales et de marqueurs spécifiques de cellules mésenchymateuses. Cette méthode met en œuvre l'utilisation combinée de trois marquages fluorescents et requiert une analyse morphocytologique complémentaire, pratiquée par un cytopathologiste expérimenté.
La méthode selon la présente invention offre une solution alternative pour la détection des CTC ne requérant pas la présence d'un cytopathologiste patenté, car elle combine une véritable analyse morphologique, une identification phénotypique des cellules par immunomarquage fluorescent et la détection au niveau génomique de la présence de séquences particulières d'ADN, telles que des réarrangements caractéristiques de cellules cancéreuses.
La combinaison, selon la méthode de l'invention, de deux techniques différentes de détection et de deux niveaux d'analyse différents, appliquées sur un même échantillon biologique, confère à ce diagnostic une sensibilité et une fiabilité élevée. Plus particulièrement, la méthode selon la présente invention constitue un test diagnostic permettant de poser l'indication d'un traitement antitumoral ciblé contre la protéine oncogénique ALK chez les patients atteints de cancer.
La méthode de détection selon l'invention est maintenant décrite de façon détaillée. La présente invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon biologique et notamment un échantillon sanguin, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par :
- les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, et
- les marqueurs tumoraux,
ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale des CTC, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
L'invention a pour avantage de combiner, sur le même support, un marquage phénotypique et une analyse par une méthode de type FISH, qui préservent l'intégrité des CTC.
L'échantillon biologique, et notamment l'échantillon sanguin, provient d'un patient atteint d'un cancer. Selon un mode particulier de la méthode d'identification, les cellules tumorales circulantes (CTC) sont d'origine épithéliale et mésenchymateuse.
Au sens de la présente invention, la méthode d'identification des CTC est également appelée méthode d'enrichissement des CTC ou méthode de caractérisation des CTC. Les trois expressions sont équivalentes et peuvent être employées indifféremment. La méthode d'enrichissement utilisée selon la présente invention est la méthode ISET.
Selon un mode particulier de la méthode d'identification, les cellules provenant de l'échantillon biologique servant à l'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC et à la détection du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK sont isolées selon leur taille qui varie de 8 pm à au moins 40 pm. Selon un premier aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon biologique provenant d'un patient, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses du gène de fusion EML4-ALK, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK,
c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC. Selon ce premier aspect de l'invention, la méthode détecte la présence du gène de fusion EML4-ALK, par la technique de FISH, et identifie morphologiquement et phénotypiquement les CTC, et notamment la présence de la protéine codée > par ledit gène de fusion. La protéine de fusion EML4-ALK a une puissante activité oncogénique et un rôle clé dans la cancérogénèse chez une sous population de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (également appelé cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC)). Cette activité qui peut être bloquée par des petites molécules, notamment des inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant ALK, est une cible moléculaire importante dans le traitement de ces cancers.
Selon un deuxième aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon biologique provenant d'un patient, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par :
- les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, et
- les marqueurs tumoraux, ladite méthode comprenant les étapes suivantes a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale des CTC, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC,
Toujours selon ce deuxième aspect, l'invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon biologique, notamment un échantillon sanguin, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par :
- les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, et
- les marqueurs tumoraux,
ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale des CTC, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
La méthode de détection des CTC décrite dans la publication de Charpentier et al (2011) décrit une méthode de détection deXTC comprenant, d'une part, l'utilisation combinée de trois marquages fluorescents et, d'autre part, une analyse morphocytologique pratiquée par un cytopathologiste expérimenté. Ce document ne divulgue pas une méthode de détection de CTC combinant des marquages phénotypiques fluorescents et une analyse automatisée de la morphologie des cellules ; il ne divulgue pas non plus une méthode combinant la détection phénotypique des cellules par immunomarquage fluorescent et la détection au niveau chromosomique de la présence de séquences particulières d'ADN. Enfin, ce document ne divulgue pas une méthode de détection combinant une détection automatisée de la morphologie des cellules, une détection phénotypique par immunomarquage fluorescent et une détection moléculaire par l'utilisation de procédés de type FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation).
Selon un autre aspect, la méthode d'identification selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule à l'exception du gène de la protéine de fusion EML4-ALK,
b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK,
c. Comparaison de la localisation sùr le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC, Selon cet aspect, la méthode détecte, d'une part, la présence du gène de fusion EML4-ALK et, d'autre part, la présence d'une protéine autre qu'une protéine codée par ledit gène de fusion. Selon un autre aspect, la méthode d'identification selon l'invention comprend les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence du gène codant pour la susdite protéine, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode comprenant les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'un marqueur tumoral, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence d'un gène codant pour une protéine oncogénique caractéristique des CTC, à l'exception des protéines codées par le gène de fusion EML4-ALK, et c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC, Toujours selon cet autre aspect, la méthode d'identification selon l'invention comprend les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'un marqueur tumoral, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence d'un gène codant pour une protéine oncogénique caractéristique des CTC, à l'exception des protéines codées par le gène de fusion EML4-ALK, et c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
Selon cet aspect, la méthode détecte, d'une part, la présence du gène codant pour une protéine oncogénique caractéristique des CTC et d'autre part, la présence d'un marqueur tumoral.
La combinaison de marqueurs de nature différente dans les étapes a et b de la méthode présente l'avantage particulier d'offrir une meilleure caractérisation des cellules, d'où la plus grande fiabilité du diagnostic. Selon un aspect particulier, la méthode selon l'invention comporte une étape d'enrichissement de l'échantillon biologique en CTC, préalable ou inhérente aux étapes d'identification des différents signaux, le facteur d'enrichissement des cellules en CTC étant compris d'environ 1/100 à environ 1/100.000. Lorsque le support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique est un filtre, notamment un filtre ISET (commercialisé par la société Rarecell ou Screencell) , la filtration de l'échantillon sanguin conduit, de façon inhérente à la filtration, à un enrichissement des cellules en CTC. L'approche sur filtres permet d'obtenir^ généralement plus de cellules pour asseoir le diagnostic. Les filtres sont beaucoup délicats que tout autre support (pas de planéité, problèmes de bruit de fond et de pores). La taille des pores de ces filtres détermine la taille des cellules qui vont pouvoir être retenues sur le filtre, ladite taille des cellules pouvant varier de 8 μηη à au moins 40 μηι.
Lorsque le support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique est une lame, l'étape d'enrichissement a lieu lors de la séparation immunomagnétique, et est préalable au dépôt sur lame. Cet enrichissement est de l'ordre d'un facteur environ 1/100 à un facteur environ 1/100.000, selon la méthode d'enrichissement utilisée et varie d'un patient à l'autre.
Selon un aspect plus particulier, l'invention a pour objet une de méthode dans laquelle le dépôt des cellules provenant de l'échantillon biologique du patient est réalisé sur un support approprié pouvant être analysé à l'aide d'un appareil de type microscope à fluorescence ou scanner, ledit support pouvant être un filtre ou une lame. Le support utilisé pour le dépôt de l'échantillon biologique peut être analysé dans un microscope, comme par exemple un microscope à fluorescence, un scanner, ou tout autre appareil permettant la lecture d'un support, que la lecture soit manuelle ou automatisée. Comme indiqué précédemment, le support peut être un filtre, une lame, ou tout autre support adapté au dépôt de l'échantillon et à la lecture des signaux dans un appareil approprié.
Les inventeurs ont ainsi mis au point une stratégie automatisée grâce à un scanner de lames (notamment le système ARIOL® de LEICA) qui consiste à trier les cellules récupérées après filtration (ou après enrichissement par sélection négative) en 2 fractions, l'une CD45(+) et l'autre CD45(-). La fraction CD45(-) contenant les différentes populations de CTC est ensuite extensivement analysées pour identifier les CTCs purement épithéliales, les CTCs mésenchymateuses, hybrides (épithéliales et mésenchymateuses) ainsi que d'autres populations qui n'exprimerait pas ces marqueurs. Après FISH, les signaux de FISH (réarrangement ALK EML4) sont relocalisés dans ces différentes populations. C'est ainsi que les CTCs peuvent être caractérisées phénotypiquement et génotypiquement dans leur globalité.
Dans la méthode selon l'invention, les cellules issues de l'échantillon biologique du patient sont recueillies lors de la filtration, pour le dépôt sur filtre, ou déposées sur lame après immuno-séparation magnétique, ou par toute méthode appropriée connue de l'homme du métier.
La méthode selon l'invention est maintenant plus particulièrement détaillée pour ce qui concerne l'étape a, c'est à dire l'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale.
Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre au moins un marqueur choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses. Plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre de façon combinée au moins deux marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques, iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses. Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée au moins trois marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée quatre marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Dans un autre aspect de l'invention en ce qui concerne l'étape a, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre au moins un marqueur choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire, iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre de façon combinée au moins deux marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire;- iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée au moins trois marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée quatre marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur spécifique de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK sont les clones 5A4 ou D5F3, commercialisés par les sociétés AbCam®, Cell Signaling Technology®.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur spécifique des protéines oncogéniques caractéristiques des CTC est choisi parmi les marqueurs des protéines codées par les gènes HER2, ERG et cMet.
Dans un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de membrane nucléaire utilisé est le marqueur Emerin.
Ainsi, l'émerine est utilisée en tant que marqueur de la membrane nucléaire des CTC pour identifier la nature tumorale des CTC en les différenciant des cellules hématopoïétiques et autres cellules normales. Il peut être utilisé pour les CTC provenant de tout type de tumeurs.
L'étape de caractérisation morphologique repose soit sur l'introduction d'un marqueur de la membrane nucléaire (comme l'émerine) dans le quadruple marquage fluorescent, soit sur la réalisation d'une étape de coloration des noyaux (comme l'hématoxyline/éosine) après le marquage IF qui doit aussi être éliminée dans l'étape intermédiaire de lavage entre IF et FISH. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur nucléaire utilisé est choisi dans le groupe constitué par : le marqueur DAPI, les marqueurs Syto59, Sytox Orange, TOPRO 3, Hoescht 33342.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de cellules hématopoiétiques est choisi dans le groupe constitué par : CD45 et CD31. Le marqueur utilisé est de préférence CD45.
Bien que très rares, les CTCs sont connues pour être hétérogènes et composées de différentes sous populations. L'approche selon la présente invention permet d'identifier et de caractériser les différentes sous populations de CTC, purement épithéliales, purement mésenchymateuses, hybrides (épithéliales et mésenchymateuses) ainsi que d'autres populations qui · n'exprimeraient pas ces marqueurs. Seules les approches de filtration ou de sélection négative des CTCs par élimination des cellules hématopoiétiques peuvent donner accès à ces cellules.
Le fait d'analyser et de caractériser toutes les CTCs est un élément important du point de vue de l'application clinique à deux niveaux :
- plus de CTCs (en nombre) sont identifiées et il devient donc possible de les utiliser pour diagnostiquer une anomalie moléculaire et décider d'un traitement ciblé, puis suivre son efficacité ; les méthodes dé l'art antérieur ne permettent de récupérer qu'une petite fraction des CTC (CTC épithéliales) et cette fraction trop rare n'est pas utilisable dans ce contexte clinique.
- l'émergence des sous populations très minoritaires, qui vont être porteuses de la résistance aux traitements ciblés et pourront être suivies dans les CTCs de façon à détecter précocement ces résistances, devient détectable ; le clinicien peut offrir ainsi plus tôt, un traitement plus adapté. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules épithéliales est choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de EpCAM, les marqueurs de pan-cytokératines et les marqueurs de la cadhérine épithéliale. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses est choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de la vimentine et les marqueurs de la cadhérine neurale.
Une réalisation particulière de l'invention objet de l'invention comprend une étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre : i. le marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK ou le marqueur d'une protéine codée par un gène choisi parmi les gènes HER2, ERG et cMet,
ii. le marqueur nucléaire DAPI,
iii. le marqueur de cellules hématopoïétiques CD45,
iv. un marqueur de pan-cytokératines.
Un autre aspect particulier de l'invention a pour objet une méthode de type FISH comprenant les étapes successives suivantes :
- traitement enzymatique du support après fixation,
- hybridation sur le support en présence d'au moins une sonde,
- localisation de la sonde hybridée sur le support.
La méthode selon l'invention comprend un test de FISH réalisé selon un protocole particulier et avantageux, mis au point par les inventeurs, et utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, et non des sondes centromériques. Cette méthode permet donc de détecter spécifiquement la présence de gènes remaniés ou amplifiés dans les cellules.
Lors de la mise en oeuvre sur des CTC de tests de FISH réalisés selon des protocoles standards dé l'art antérieur, les cellules, qui sont très fragiles, ne résistent pas aux tests, les résultats de ces tests ne sont donc pas utilisables. Le couplage de l'immunofluorescence (IF) et de la FISH est en fait très délicat pour les raisons suivantes : - les CTC sont par nature très fragiles du fait du détachement de la tumeur et il est communément admis qu'une très grande partie d'entrés elles sont en apoptose,
- l'enchaînement IF plus FISH nécessite d'avoir des méthodes très douces à la fois pour l'IF et la FISH et d'avoir une étape intermédiaire d'élimination de la fluorescence avant la FISH. Si la fluorescence est mal éliminée, il s'en suit un bruit de fond important qui rend la FISH ininterprétable. Le photobleaching est très agressif vis-à-vis des cellules et ne peut en aucun cas être utilisé pour éliminer la fluorescence avant la FISH. Par ailleurs, il est notoire que la FISH est déjà par elle-même très délicate. Les inventeurs ont mis au point des lavages doux successifs qui respectent la fragilité des CTC et évitent les pertes cellulaires,
- compte tenu de la rareté des CTCs, il est important d'en conserver le plus grand nombre. Lors du travail sur filtre, il est indispensable de chauffer les filtres 5min à 98°C pour ancrer les cellules dans le filtre sinon les cellules sont perdues.
Selon un aspect particulier, la méthode selon l'invention est réalisée sur un échantillon sanguin d'un patient. Les échantillons biologiques nécessaires pour diagnostiquer la présence d'un remaniement des gènes ALK et décider d'un traitement ciblé anti-ALK dans les tests selon l'art antérieur sont nécessairement des biopsies tumorales, invasives et souvent de mauvaise qualité, notamment chez les patients atteints de certains cancers tels le CBNPC. Un autre aspect concerne l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour analyser un échantillon biologique provenant d'un patient atteint de cancer présentant le gène ALK transloqué pour le suivi de l'évolution tumorale, pour la prédiction d'un événement de type métastatique ou pour la mesure de l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux.
Un autre aspect concerne l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour analyser un échantillon biologique provenant d'un patient atteint de cancer présentant le gène ALK transloqué pour le diagnostic de l'indication d'un traitement tumoral contre la protéine ALK. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation de la méthode décrite dans le cadre de patients atteints d'un cancer susceptible de conduire à la présence de métastases, notamment le cancer bronchique non à petites cellules, et tout autre cancer présentant un remaniement du gène ALK.
Une méthode selon l'invention entre donc dans le cadre de la médecine ' personnalisée avec thérapie antitumorale ciblée.
Selon un aspect particulier, la méthode selon l'invention est réalisée sur un échantillon sanguin d'un patient. Les échantillons biologiques nécessaires pour diagnostiquer la présence d'une anomalie moléculaire comme une translocation ou une amplification génique et décider d'un traitement ciblé dans les tests selon l'art antérieur sont nécessairement des biopsies tumorales, invasives et souvent de mauvaise qualité, notamment chez les patients atteints de certains cancers tels le CBNPC ou le cancer de la prostate.
Un autre aspect concerne l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour analyser un échantillon biologique notamment un échantillon sanguin provenant d'un patient atteint de cancer présentant une anomalie moléculaire comme une translocation ou une amplification génique pour le suivi de l'évolution tumorale, pour la prédiction d'un événement de type métastatique ou pour la mesure de l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux.
Un autre aspect concerne l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour analyser un échantillon biologique provenant d'un patient atteint de cancer présentant une anomalie moléculaire comme une translocation ou une amplification génique pour le diagnostic de l'indication d'un traitement tumoral ciblant les protéines oncogéniques codée par ces gènes. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation de la méthode décrite dans la cadre de patients atteints d'un cancer susceptible de conduire à la présence de métastases, notamment le cancer du poumon non à petites cellules, et tout autre cancer présentant un remaniement du gène ALK. Une méthode selon l'invention entre donc dans le cadre de la médecine personnalisée avec thérapie antitumorale ciblée.
L'invention est maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples et des figures qui les accompagnent.
Légende des Figures Figure 1 : Image de microscopie en fluorescence sur filtre ISET montrant le marquage obtenu sur la lignée H2228 (porteuse de la translocation EML4- ALK) avec l'anticorps monoclonal (5A4 ou D5F3) spécifique de la protéine ALK transloquée. 1A. Marquage obtenu avec le colorant nucléaire DAPI ; 1 B. Marquage obtenu avec l'anticorps spécifique de la protéine ALK ; 1C. Marquage obtenu, avec l'anticorps spécifique de la protéine ALK et le DAPI.
Figure 2 : Image de microscopie en fluorescence montrant une expérience de FISH sur filtre ISET réalisée sur les CTC d'un patient atteint de carcinome bronchique non à petites cellules. 2A. Exemple d'une cellule hématopoïétique retenue sur le filtre ne présentant pas de translocation; 2B et 2C. Exemple de deux CTCs présentant une translocation. Des sondes spécifiques du point de cassure 2p23 ont été utilisées.
Figure 3: Images de microscopie en fluorescence chez trois patients (P2, P6, P11) représentatifs montrant la détection par FISH du réarrangement ALK dans les CTC et la tumeur du même patient. Différents exemples de CTC sont présentés: CTCs individuelles porteuses uniquement du remaniement ALK (P2), CTCs individuelles porteuses à la fois d'un gain du gène ALK natif et du remaniement ALK (P6), CTC en clusters porteuses du remaniement ALK (P11).
Figure 4: Images de microscopie illustrant la méthode combinant marquage en immunofluorescence 4 couleurs (vimentine/cytokeratines/CD45/DAPI et N-cadherine/E-cadherine/CD45/DAPI) et FISH pour la détection de CTCs porteuses du remaniement ALK. 4A: Exemple de deux patients montrant le phénotype mésenchymateux des CTC porteuses du réarrangement ALK; 4B: Contrôle positif des marquages en immunofluorescence sur la lignée de cancer bronchique A549.
Figure 5: Images de microscopie en fluorescence illustrant la possibilité de suivre par FISH la présence de CTC porteuses d'un remaniement ALK chez des patients atteints de CBNPC ALK positif et traités par un inhibiteur de ALK. Exemple de CTCs détectées chez un patient avant et à jour 30 d'un traitement par le crizotinib. L'utilisation de la méthode permet de mettre en évidence chez ce patient la diminution importante de la taille et du nombre de clusters de CTCs dont certaines portent le réarrangement ALK.
Figure 6 : Image de microscopie en fluorescence montrant la détection de l'amplification de HER2 sur filtre ISET. 6A. Exemple d'une expérience de FISH sur la lignée cellulaire SKBR3; 6B. Exemple d'une expérience de FISH sur les CTC d'une patiente porteuse de l'amplification HER2 ; 6C : Exemple de marquage en immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal dirigé contre la protéine HER2 sur les CTC d'une patiente porteuse de l'amplification HER2.
Figure 7: Image de microscopie en fluorescence montrant dans des lignées cellulaires et des patients atteints de cancer de la prostate ou du sein recueillies sur filtre ISET, la détection par FISH de diverses anomalies moléculaires. A: Détection de l'amplification du gène ERG dans la lignée cellulaire LnCAP; B: Détection du réarrangement du gène ERG dans la lignée cellulaire VCAP; C: Détection de l'amplification du gène AR dans la lignée cellulaire LnCAP; D: Détection de l'amplification du gène HER2 dans la lignée cellulaire SKBR3; E: Détection de l'amplification du gène ERG chez un patient atteint de cancer de la prostate; F: Détection de l'amplification du gène cMYC chez un patient atteint de cancer de la prostate; G: Détection de l'amplification du gène AR chez un patient atteint de cancer de la prostate; H: Détection de l'amplification du gène HER2 chez une patient atteinte de cancer du sein. Figure 8: Images de microscopie illustrant dans des lignées cellulaires (figure 8A) et des CTCs de patients atteint de cancer de la prostate (figure 8B) la méthode automatisée combinant sur filtre ISET le marquage en immunofluorescence 4 couleurs (vimentine/cytokeratines/CD45/DAPI) et FISH pour la détection de CTCs porteuses d'amplification des gènes ERG ou cMYC ou AR.
Figure 9: Images de microscopie illustrant dans la lignée cellulaire de cancer bronchique H 1975 la méthode combinant sur filtre ISET le marquage en immunofluorescence (cMet/CD45/DAPI) et FISH; 9A: Détection en immunofluorescence 3 couleurs de la protéine cMET; 9B: Détection de l'amplification cMET; 9C: Méthode combinant marquage immunofluorescence et FISH.
Exemples
Exemple 1 : Préparation du support d'analyse
L'échantillon sanguin est enrichi en CTC par filtration basée sur la technique ISET (isolation by size of epithelial tumour cells). Les filtres sont soumis à filtration à très basse pression sur la machine ISET (7mBar), puis séchés sur platine chauffante à 45°C pendant 2 min.
Les filtres sont emballés dans du papier aluminium et ensuite congelés.
Exemple 2 : Identification morphologique et phénotypique des CTC.
Les cellules sont identifiées par marquage immunofluorescent, sur filtre ISET, des noyaux, de la cytokératine, de CD45 et de la protéine ALK.
Le tampon EDTA 1X pH9 est préparé à partir d'EDTA 10X, puis réchauffé à 98°C. Préparation des anticorps :
Les anticorps sont dilués dans du TBS-Triton à 0,2% et à un volume total de 0ΟμΙ. Les différentes solutions d'anticorps sont préparées indépendamment puis mélangées.
Les anticorps anti-cytokératine (CK A1/A3 - DAKO) sont couplés au fluorochrome AF546 selon le protocole de couplage du kit Zenon IGAF546 (Invitrogen) .
30μΙ d'anticorps anti-CD45 APC (BD Biosciences) sont prélevés et seront ajoutés au mélange des différents anticorps.
Les anticorps anti-ALK (Novo-Castra) sont couplés au fluorochrome AF488 selon le protocole de couplage du kit Zenon IGAF488 (Invitrogen).
préparés de la façon suivante :4 μΙ d'anticorps à coupler avec le kit de couplage Zenon lgAF488 « mouse » sont ajoutés à 5μΙ d'lgAF488 et incubés 5min à température ambiante.5μΙ de bloquant AF488 sont ajoutés et incubés 5min à température ambiante. La solution d'anticorps est stable 30min.
Les différentes solutions d'anticorps sont rassemblées et leur volume complété à 100μΙ dans du TBS-Triton 0,4%.
Préparation des filtres :
Les filtres sont sortis du congélateur et placés à température ambiante pendant environ 15 min. Les filtres sont fixés sur la lame en utilisant du ruban adhésif résistant aux hautes températures, celui-ci permet également d'identifier les filtres. Les filtres sont ensuite réhydratés dans du TBS pendant 5 mn puis égouttés.
Démasquage et immunomarquage :
Les lames sont immergées 5min dans le tampon EDTA 1X pH 9 chauffé au bain-marie à 98°C, elles sont ensuite rincées pendant 2 min dans du TBS et pendant 1min à l'eau distillée puis égoutées. Sur le filtre, les spots (8 mm de diamètre) sont entourés en utilisant le DakoPen (hydrophobe). Des chambres humides sont préparées à l'aide d'un papier absorbant préalablement passé sous l'eau du robinet. Sur chaque spot, 0ΟμΙ de la solution préparée d'anticorps sont déposés, puis chaque spot est recouvert avec une lamelle ronde 12mm de diamètre. Le tout incube pendant une nuit en chambre humide à 4°C et à l'obscurité.
Après incubation, les chambres sont placées à température ambiante pendant 15 min puis rincées dans du TBS-Tween à 0,05% pendant 2 min et égouttées, rincées dans de l'eau distillée puis égouttées.
100 μΙ de solution de montage DAPI préalablement diluée sont déposés sur chaque lame, le tout incube pendant 15 min à température ambiante et à l'obscurité. Les lames sont ensuite rincées dans du TBS-Tween à 0,05% pendant 2 min puis égouttées, puis rincées dans de l'eau distillée et égouttées. Les lames et lamelles sont ensuite montées au fluoromount, après 1 h à température ambiante et à l'obscurité, elles sont scellées, avant d'être stockées à 4°C.
La lecture est effectuée au microscope le lendemain, les CTC sont identifiées, et leurs positions sont mémorisées.
Exemple 3 : Test de détection du gène de fusion EML4-ALK par la technique de FISH Ce test est réalisé après le marquage en immunofluorescence.
A. Fixation du matériel
Après l'analyse des résultats en immunofluorescence, le système lame et lamelle est démonté et le filtre est lavé dans une solution de PBS 1X avant d'être fixé avec une solution de méthanol/ acide acétique (9 :1) pendant 2 heures à température ambiante.
B. Traitement du filtre immobilisé sur la lame Préparation de là pepsine 10% :
Peser 1g à dissoudre dans 10 ml H20, sous agitation magnétique, dans un Erlen. Une fois bien dissous, placer l'Erlen dans de la glace. Aliquoter par 100μΙ puis les conserver à -20°C).
Une solution de 80 ml de Hcl à 0,01 N (8 ml HCI 0.1N + 72 ml H20)est préchauffée dans un bain-marie à 37°C. Les lames conservées à +4°C sont incubées 5 min dans un bain de 4xSSCT.
Une aliquote de pepsine est ajoutée au HCI 0,01 N, à 37°C. Le filtre est incubé pendant quelques min dans la solution de pepsine, en l'agitant toutes les deux minutes.
Une solution de fixation, formaldéhyde de concentration finale 1 %, est préparée de façon extemporanée.
La solution obtenue est stable pendant une journée. Les lames sont lavées dans un bac de PBS 1X pendant 5 min sans humidifier le ruban adhésif et sans agitation. Les lames sont ensuite fixées par trempage pendant 2 mn dans la solution de fixation, sans humidifier le ruban adhésif. Les lames sont ensuite déshydratées successivement pendant deux minutes à 70%, 85% et 100% éthanol, sans laisser sécher les lames entre les alcools. L'envers de la lame est essuyé délicatement, le fitre sèche ensuite quelques minutes, et au maximum pendant une heure, sur une plaque à 37°C, ou bien sèche à température ambiante.
C. Dénatu ration des lames et hybridation (J1)
Dans l'obscurité, une boîte hermétique est placée sur la platine allumée à 37°C, cette boîte permettra le transport éventuel de la lame. L'appareil permettant l'hybridation, ou « hybridizer », est mis en marche et programmé afin d'obtenir une température à 37°C. Les lames sont insérées, dans leurs places respectives, dans Γ « hybridizer ». Les deux barrettes se trouvant sur le capot sont humidifiées avec de l'eau, puis replacées sur le couvercle de l'hybridizer afin de minimiser l'évaporation de la sonde. La lame est placée sur la platine à 37°C. Sur chaque spot (8 mm de diamètre) sont déposés ΟμΙ de mélange d'hybridation sonde ALK (Vysis) (pour chaque spot sont déposés 7μΙ de tampon, 2 μΙ d'eau, 1 μΙ de sonde). Une petite lamelle ronde (12 mm de diamètre) est posée délicatement sur les spots. La zone d'intérêt est scellée avec de la colle placée autour, afin d'isoler entièrement cette zone. Le séchage de la colle est assuré par dépôt de la lame sur la platine à 37°C pendant environ5 min. La lame est ensuite immédiatement placée dans l'hybridizer afin de ne pas modifier la température de la sonde.
Le programme de dénaturation est démarré à 85°C pendant 10 min, puis l'hybridation a lieu classiquement à 44°C pendant toute une nuit (12 heures) à 44°C. Cette hybridation peut être effectuée dans l'hybridizer ou dans une étuve placée à 44°C. Dans ce dernier cas, après l'étape à 85°C, la lame est très rapidement placée dans la boite déjà à 37°C sur la platine, puis transférée dans la boite noire spéciale humide mise à l'avance dans l'étuve à 44°C.
L'hybridizer, lorsqu'il est refroidi à 37°C, est arrêté. D. Lavage et montage (J2)
Le bain marie est branché à 65°C et la plaque à 37°C, le tampon Wash Buffer 1X Dako est préparé extemporanément.
Le tampon est ensuite préchauffé, en plaçant la moitié du tampon dans un bac en porcelaine qui est placé dans le bain-marie à 65°C sans que la température ne soit atteinte (pour éviter les chocs thermiques), la température est atteinte au bout d'environ 30 min.
L'autre moitié du tampon est placé dans un bac à lames, à température ambiante. La lame est extraite de l'hybridizer ou de l'étuve et transportée si nécessaire dans une boite noire spéciale pour protéger la lame de la lumière. Sans lumière, la colle est enlevée très délicatement avec une pince, sans détériorer le filtre. La lame est lavée pendant environ 7 min dans le tampon Stringent Wash Buffer à température ambiante sans agitation. La lame est lavée 5 min dans le tampon préchauffé à 65°C, puis 5 min dans un tampon de lavage Wash Buffer 1X DAKO à température ambiante.
La lame est déshydratée pendant 2 min avec successivement 70%, 85% 100% éthanol, sans laisser sécher entre les alcools.
Le dos de la lame est essuyé délicatement avec du papier absorbant, puis laissée sécher pendant quelques minutes sur la plaque à 37°C, en vérifiant qu'il ne reste pas d'alcool entre la lame et le filtre.
En cas de bruit de fond, les lames peuvent être re-lavées à 70°C pendant 1- 5 min.
De 15 à 20 μΙ d'une solution « antifFad+DAPI » sont déposés sur le filtre et répartis en plusieurs gouttes sur la surface du filtre.
Les lames sont couvertes par une lamelle de 22x22 ou 24x40, le tout est scellé d'un côté de la lamelle, du côté opposé au spot.
La lame est séchée sur la platine chauffante à 37°C pendant environ 5 min.
La lame est transportée dans une boite noire jusqu'au microscope, et observée en utilisant successivement les grossissements x20, pour repérer le spot, puis x100, avec de l'huile à immersion.
La lame peut être conservée dans l'obscurité pendant 1 semaine à température ambiante ou pendant 1 an à -20°C.
La lecture s'effectue au microscope à fluorescence ou scanner. Les CTC sont relocalisées à partir des positions déjà identifiées lors de l'immunomarquage.
Exemple 4 : Test de détection du gène HER-2par la technique de FISH
Ce test est réalisé après le marquage en immunofluorescence.
A. Fixation du matériel Après l'analyse des résultats en immunofluorescence, le système lame et lamelle est démonté et le filtre est lavé dans une solution de PBS 1X avant d'être fixé avec une solution de méthanol/ acide acétique (9 :1) pendant 2 heures à température ambiante.
B. Traitement du filtre immobilisé sur la lame
Préparation de la pepsine 10% :
Peser 1g à dissoudre dans 10 ml H20, sous agitation magnétique, dans un Erlen.Une fois bien dissous, placer l'Erlen dans de la glace. Aliquoter par 100μΙ puis les conserver à -20°C).
Une solution de 80 ml de HCI à 0,01 N (8 ml HCI 0.1 N + 72 ml H20)est préchauffée dans un bain-marie à 37°C pendant au moins 30 min.
Les lames conservées à +4°C sont incubées successivement 5 min dans un bain de 4xSSCT pour décoller la lamelle, si nécessaire la lamelle peut être décollée à l'aide d'une pince, le milieu de montage est éliminé puis le filtre est rincé dans un bain de PBS 1X.
Une aliquote de pepsine est ajoutée au HCI 0,01 N, à 37°C, le tout est soigneusement mélangé. Le filtre est incubé pendant 6 min dans la solution de pepsine, en l'agitant toutes les deux minutes.
Une solution de fixation contenant 1 % de formaldéhyde est préparée de façon extemporanée.
Les lames sont lavées dans un bac de PBS x pendant 5 min sans humidifier le ruban adhésif et sans agitation. Les lames sont ensuite fixées par trempage pendant 2 mn dans la solution de fixation, sans humidifier le ruban adhésif. Les lames sont ensuite déshydratées successivement pendant deux minutes à 70%, 85% et 100% éthanol, sans laisser sécher les lames entre les alcools.. L'envers de la lame est essuyé délicatement, le filtre sèche ensuite quelques minutes, et au maximum pendant une heure, sur une plaque à 37°C, ou bien il sèche à température ambiante. C. Dénaturation des lames et hybridation (J1)
Dans l'obscurité, une boîte hermétique est placée sur la platine allumée à 37°C, cette boîte permettra le transport éventuel de la lame.
L'appareil permettant l'hybridation, ou « hybridizer » est mis en marche et programmé afin d'obtenir une température à 37°C. Les lames sont insérées, dans leurs places respectives, dans Γ « hybridizer ». Les deux barrettes se trouvant sur le capot sont humidifiées avec de l'eau, puis replacées sur le couvercle de l'hybridizer afin de minimiser l'évaporation de la sonde. La lame est placée sur la platine à 37°C. Sur chaque spot (8 mm de diamètre) sont déposés 6 μΙ de sonde HER-2 (Dako).
Une petite lamelle ronde (12 mm de diamètre) est posée délicatement sur les spots. Les bulles éventuelles sont poussées délicatement en dehors de la surface de la lamelle, par exemple avec un cône. La zone d'intérêt est scellée avec de la colle placée autour, telle du « Rubber-cement », afin d'isoler entièrement cette zone. Le séchage de la colle est assuré par dépôt de la lame sur la platine à 37°C pendant environ5 min, la qualité parfaite du collage sur les bords est vérifiée. La lame est ensuite immédiatement placée dans l'hybridizer afin de ne pas modifier la température de la sonde.
Le programme de dénaturation est démarré à 85°C pendant 10 min, puis l'hybridation a lieu à 44°C pendant toute une nuit (12 heures) à 44°C. Cette hybridation peut être effectuée dans l'hybridizer ou dans une étuve placée à 44°C. Dans ce dernier cas, après l'étape à 85°C, la lame est très rapidement placée dans la boite déjà à 37°C sur la platine, puis transférée dans la boite noire spéciale humide mise à l'avance dans l'étuve à 44°C.
L'hybridizer, lorsqu'il est refroidi à 37°C, est arrêté. D. Lavage et montage (J2)
Le bain marie est branché à 65°C et la plaque à 37°C, le tampon Wash Buffer 1X Dako est préparé extemporanément. Le tampon est ensuite préchauffé, en plaçant la moitié du tampon dans un bac en porcelaine qui est placé dans le bain-marie à 65°C sans que la température ne soit atteinte (pour éviter les chocs thermiques), la température est atteinte au bout d'environ 30 min.
L'autre moitié du tampon est placé dans un bac à lames, à température ambiante. La lame est extraite de l'hybridizer ou de l'étuve et transportée si nécessaire dans une boite noire spéciale pour protéger la lame de la lumière. Sans lumière, la colle est enlevée très délicatement avec une pince, sans détériorer le filtre. La lame est lavée pendant environ 7 min dans le tampon Stringent Wash Buffer à température ambiante sans agitation. La lame est lavée 5 min la lame dans le tampon préchauffé à 65°C, puis 5 min dans un tampon de lavage Wash Buffer 1X DAKO à température ambiante.
La lame est déshydratée pendant 2 min avec successivement 70%, 85% 100% éthanol, sans laisser sécher entre les alcools.
Le dos de la lame est essuyé délicatement avec du papier absorbant, puis laissée sécher pendant quelques minutes sur la plaque à 37°C, en vérifiant qu'il ne reste pas d'alcool entre la lame et le filtre.
En cas de bruit de fond, les lames peuvent être re-lavées à 70°C pendant 1- 5 min.
Selon la surface de la lamelle, 10 à 15 pL de la solution « antifFad+DAPI » sont déposés sur le filtre et répartis en plusieurs gouttes sur la surface du filtre.
Les lames sont couvertes par une lamelle de 22x22 ou 24x40, le tout est scellé d'un côté de la lamelle, du côté opposé au spot.
La lame est séchée sur la platine chauffante à 37°C pendant environ 5 min. La lame est transportée dans une boite noire jusqu'au microscope, et observée en utilisant successivement les grossissements x20, pour repérer le spot, puis x100, avec de l'huile à immersion.
La lame peut être conservée dans l'obscurité pendant 1 semaine à température ambiante ou pendant 1 an à -20°C.
La lecture s'effectue au microscope à fluorescence ou scanner. Les CTC sont relocalisées à partir des positions déjà identifiées lors de l'immunomarquage. Exemple 5 : Test de détection du gène c-MET par la technique de FISH
La technique de FISH est mise en œuvre de la même façon que décrit dans l'exemple 4, en utilisant une sonde spécifique de c-MET.
Exemple 6 : Test de détection du gène Erg par la technique de FISH La technique de FISH est mise en œuvre de la même façon que décrit dans l'exemple 4, en utilisant une sonde spécifique de Erg.
Références
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Claims

Revendications
1. Méthode d'identification, dans un échantillon biologique, notamment un échantillon sanguin, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par :
- les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, et
- les marqueurs tumoraux,
ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale des CTC, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
2. Méthode d'identification, selon la revendication 1 , dans laquelle les cellules tumorales circulantes (CTC) sont d'origine épithéliale et mésenchymateuse.
3. Méthode d'identification, selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les cellules provenant de l'échantillon biologique servant à l'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC et à la détection du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, sont isolées selon leur taille qui varie de 8 pm à au moins 40 pm.
4. Méthode d'identification, selon l'une des revendications 1 à 3, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence du gène codant pour la susdite protéine, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
5. Méthode d'identification, selon l'une des revendications 1 à 4, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'un marqueur tumoral, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence d'un gène codant pour une protéine oncogénique caractéristique des CTC, à l'exception des protéines codées par le gène de fusion EML4-ALK, et c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, comportant une étape d'enrichissement de l'échantillon biologique en CTC, préalable ou inhérente aux étapes d'identification des différents signaux, le facteur d'enrichissement des cellules en CTC étant compris d'environ 1/100 à environ 1/100.000.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le dépôt des cellules provenant de l'échantillon biologique du patient est réalisé sur un support approprié pouvant être analysé à l'aide d'un appareil de type microscope à fluorescence ou scanner, ledit support pouvant être un filtre ou une lame.
8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle les cellules sont recueillies sur le support par filtration ou déposées sur le support après immuno-séparation magnétique.
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre au moins un marqueur choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature turriorale de la cellule,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en uvre de façon combinée au moins deux marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par : i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
11. Méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée au moins trois marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
12. Méthode selon l'une des revendications 9 à 11 , dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée quatre marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
13. Méthode selon l'une des revendications à 12, dans laquelle le marqueur spécifique d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, est choisi dans le groupe constitué par : HER2, Erg et c-Met.
14. Méthode selon l'une des revendications 9 à 13, dans laquelle le marqueur de membrane nucléaire utilisé est le marqueur Emerin.
15. Méthode selon l'une des revendications 9 à 14, dans laquelle le marqueur nucléaire utilisé est choisi dans le groupe constitué par : le marqueur DAPI, les marqueurs Syto59, Sytox Orange, TOPRO 3, Hoescht 33342.
16. Méthode selon l'une des revendications 9 à 15, dans laquelle le marqueur de cellules hématopoiétiques est choisi dans le groupe constitué par : CD45 et CD31.
17. Méthode selon l'une des revendications 9 à 16, dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules épithéliales est choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de EpCAM, les marqueurs de pan-cytokératines, les marqueurs de la cadhérine épithéliale.
18. Méthode selon l'une des revendications 9 à 17, dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses est choisi dans le group constitué par : les marqueurs de la vimentine et les marqueurs de la cadhérine neurale.
19. Méthode selon l'une des revendications 9 à 18, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre :
i. le marqueur de la protéine codée par HER2,
ii. le marqueur nucléaire DAPI,
iii. le marqueur de cellules hématopoiétiques CD45,
iv. un marqueur de pan-cytokératines.
20. Méthode selon l'une des revendications 1 à 19, dans laquelle la méthode de type FISH comprend les étapes successives suivantes : - traitement enzymatique du support après fixation,
- hybridation sur le support en présence d'au moins une sonde,
- localisation de la sonde hybridée sur le support.
21. Méthode selon l'une des revendications 1 à 20, dans laquelle l'échantillon biologique provenant d'un patient est du sang.
22. Utilisation d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 21 , pour analyser un échantillon biologique, et notamment un échantillon sanguin, provenant d'un patient atteint de cancer, pour diagnostiquer dans les CTC la présence d'une anomalie moléculaire, notamment une translocation ou une amplification génique, et pour décider de la mise en œuvre, pour ledit patient, d'un traitement spécifique.
23. Utilisation d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 21 , pour analyser un échantillon biologique, et notamment un échantillon sanguin, provenant d'un patient atteint d'un cancer présentant une anomalie moléculaire, notamment une translocation ou une amplification génique, pour le suivi de l'évolution tumorale, pour la prédiction d'un événement de type métastatique ou pour la mesure de l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux.
24. Utilisation selon l'une des revendications 22 ou 23, dans laquelle le patient est atteint d'un cancer susceptible de conduire à la présence de métastases, notamment le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer de la prostate, le cancer du sein.
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