WO2013057357A1 - Método para la identificación de fármacos útiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Definitions
- the present invention relates to methodologies for the identification of suitable treatments for cardiovascular pathologies. For this, the degree of proliferation and / or differentiation of a culture of endothelial precursor cells (EPCs) is determined in the presence of the serum of a patient of which it is desired to know if it responds positively to said treatment.
- EPCs endothelial precursor cells
- the present invention contemplates both pharmacological and dietary or physical treatments.
- Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world and are expected to remain due to the increase in their prevalence in countries with fewer resources and the aging population. WHO estimates that in 2030 about 23.6 million people will die from cardiovascular disease (CVD), especially from heart disease and stroke (AVC), and are expected to remain the leading cause of death. In the cardiovascular disorder the genetic susceptibility of the individual interacts with environmental factors (smoking, sedentary lifestyle and diet).
- CVD cardiovascular disease
- AVC heart disease and stroke
- EPCs endothelial precursor cells
- EPCs are progenitor cells with the ability to differentiate into functional endothelial cells and that constitute a very small population of circulating cells. EPCs are found in a concentration of about 2-5 cells per milliliter of human umbilical cord blood, and in a concentration of approximately 0.05 to 0.2 cells per milliliter in adult peripheral blood. Both the low frequency of circulating EPCs and the lack of a unique set of markers Distinctive cell phones have made the isolation of EPCs by flow cytometry or other immunological techniques very difficult.
- EPCs The quantification, analysis and obtaining of EPCs has become one of the main challenges of the biomedical community.
- the process for obtaining blood-derived EPCs is not simple.
- Most of the original studies identify circulating EPCs, such as cells expressing CD34, CD133 and VEGFR2.
- EPCs circulating EPCs, such as cells expressing CD34, CD133 and VEGFR2.
- CD34 circulating EPCs
- CD133 cell markers
- VEGFR2 the cell markers that can be mobilized in the circulation of the bone marrow to the sites of origin of neovascularization.
- adherent blood or bone marrow cells that express markers such as CD34, CD133 and VEGFR-2 as EPCs.
- EPCs obtained by this methodology are phenotypically indistinguishable from mature EC culture in terms of cobblestone morphology and the expression of adhesion molecules and receptors (Melero-Mart ⁇ n JM et al. Blood 2007; 109: 4761-4768).
- EPCs exhibit increased migratory and proliferative activity compared to endothelial cells derived from the existing vasculature (Khan ZA et al.
- the invention relates in the first aspect to a method for the identification of a suitable treatment for a cardiovascular pathology or for a pathology that entails an associated cardiovascular risk in a subject, comprising:
- the invention is related to a method for determining cardiovascular risk in a subject comprising:
- EPCs endothelial precursor cells
- the invention relates to a method for monitoring the response of a subject to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk, which comprises
- EPCs endothelial precursor cells
- the invention relates to a method for the identification of a suitable treatment for a cardiovascular pathology or for a pathology that entails an associated cardiovascular risk in a subject, comprising:
- step (i) contacting a population of mononuclear cells with the serum of a subject to which said treatment has been applied, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) and until a population of endothelial cells is obtained, (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where an increase in the The degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs brought into contact with a control serum, is indicative that such treatment is suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- EPCs endothelial precursor cells
- the invention relates to a method for determining cardiovascular risk in a subject comprising:
- step (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs contacted with a control serum, is indicative that said subject has a high cardiovascular risk.
- the invention relates to a method for monitoring the response of a subject to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk, comprising
- step (i) contacting a population of mononuclear cells with the serum of said subject, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population and until obtaining a population of endothelial cells, (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where an increase in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs contacted with the subject's serum before being treated is indicative that said subject responds to said treatment.
- EPCs endothelial precursor cells
- the invention relates to the use of a vascular therapeutic compound for the preparation of a medicament for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk wherein said compound is administered to a subject identified by a method that comprises
- the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of differentiation of the EPCs with respect to the degree of differentiation of a culture of said population contacted with a control serum.
- the invention relates to the use of a vascular therapeutic compound for the preparation of a medicament for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk wherein said compound is administered to a subject identified by a method that comprises
- step (i) contacting a population of mononuclear cells with the serum of said subject, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population and until obtaining a endothelial cell population, (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, wherein the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to the degree of proliferation of a culture of said population in contact with a control serum.
- EPCs endothelial precursor cells
- Figure 1 shows cell cultures obtained from a fraction of the mononuclear cells (MNC) isolated from a control population without a history of cardiovascular irrigation, cultured with serum samples from patients obtained prior to treatment and at the end of it, after 1-2 weeks of culture with said serum. It was observed that the number of colonies (known as early EPCs) of the culture corresponding to the post-treatment is greater than the number of colonies in the case of pre-treatment, although in any case it did not reach the number obtained in the healthy control.
- MNC mononuclear cells
- Figure 2 shows a graphical representation of samples of cell cultures obtained from a fraction of the MNCs isolated from a control population without a history of cardiovascular irrigation, cultured with serum samples from patients obtained prior to treatment and at the end of it. after 1-2 weeks of cultivation with said serum. It was observed that the number of colonies (known as early EPCs) of the culture corresponding to the post-treatment is greater than the number of colonies in the case of pretreatment, although in any case it did not reach the number obtained in the healthy control
- Figure 3 shows cell cultures obtained from MNCs isolated from a control population without a history of cardiovascular irrigation, cultured with serum samples from patients obtained prior to treatment and at the end of it, after 3-4 weeks of culture. with said serum. It was observed that the controls were covered by a monolayer of mature endothelial cells with a confluence of approximately 95%. In the case of pretreatment the cells did not form monolayer, while in the In the case of post-treatment there were monolayer areas but they did not reach the confluence of the control well.
- Figure 4 shows the representation of the flow cytometric analysis of the percentage of VEGFR2 expression of cells characterized as mature endothelial cells obtained from MNCs isolated from a control population without a history of cardiovascular irrigation, cultured with serum samples of patients obtained prior to treatment and at the end of it, after 3-4 weeks of culture with said serum. A higher percentage of cells with VEGFR2 expression was observed in cases where their post-treatment serum was used compared to pre-treatment. The values did not reach that of the control case.
- Figure 5 shows the representation of the flow cytometry analysis of the percentage of cell proliferation characterized as mature endothelial cells obtained from MNCs isolated from a control population without a history of cardiovascular irrigation, cultured with serum samples from patients obtained. before treatment and at the end of it, after 3-4 weeks of culture with said serum. A higher percentage of proliferating cells was observed when serum was used in post-treatment patients compared to pre-treatment, the difference being statistically significant.
- Figure 6 shows the quantification of the number of early EPC colonies obtained from a culture of MNC obtained from a control subject in the presence of serum from SAOS patients before treatment (Pre-CPAP) and after a 3-month treatment with the serum of patients after treatment with CPAP (Post-CPAP).
- Figure 7 shows the quantification of the degree of confluence of the monolayer of endothelial cells generated in culture from MNC of a control subject in the presence of serum from pre-treatment patients (Pre-CPAP) and serum from treated patients (Post - CPAP).
- the authors of the present invention have determined that the serum of patients undergoing different treatments may have an effect on the viability and functioning of endothelial precursor cells, so that it is possible to identify which treatments can decrease vascular damage in various populations of risk by contacting the serum of the patient treated with a culture with EPCs.
- the inventors have developed a methodology by which these cells are cultured with the serum of patients obtained after different treatments and their capacity for differentiation and proliferation is determined.
- the invention relates in the first place to a method (hereafter the first method of the invention) for the identification of a suitable treatment for a cardiovascular pathology or for a pathology that involves an associated cardiovascular risk in a subject, comprising:
- treatment means administration of a compound and / or application of a therapy to alleviate or eliminate the cardiovascular pathology or the pathology that carries an associated cardiovascular risk, or reducing or eliminating one or more symptoms associated with said pathology.
- treatment also encompasses alleviating or eliminating the physiological sequelae of the disease.
- the type of treatment suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that involves an associated cardiovascular risk in a subject is selected from the group consisting of pharmacological, dietary or physical.
- cardiac pathology refers to that pathology of the heart and the system of blood vessels (arteries, capillaries and veins) of the entire organism.
- Cardiovascular pathologies are classified into four general types: ischemic heart diseases, cerebrovascular diseases, peripheral vascular diseases and other diseases (Corella, D and Ordovás JM, 2007, Research and Science). The first two are responsible for more than 60% of total cardiovascular mortality.
- Ischemic heart disease is due to a progressive narrowing of the lumen of the coronary arteries, caused by the formation of atheroma plaque. There are fragile plates that break easily and others more resistant. Total blockage of the artery causes the interruption of blood circulation or ischemia, if this state is prolonged, the cardiac tissue is destroyed resulting in the area of necrosis or infarction. Cerebrovascular diseases are due to alterations of cerebral circulation. They are classified as ischemic or hemorrhagic. In the ischemic there is a decrease in blood flow that reaches some region of the brain, which produces tissue necrosis due to irreversible neuronal damage (cerebral infarction). In hemorrhagics there is an extravasation of blood due to the rupture of a vessel.
- Peripheral vascular diseases are disorders of the circulation of vessels (arteries or veins) that supply the legs or arms. They slow blood flow and cause narrowing of the vessels, swelling and pain. It can cause ischemia. When it affects the veins form blood clots, or thrombi, that cause occlusion and lead to venous thrombosis. If that thrombus breaks loose, it can be transported to the vessels of the lungs and cause death from pulmonary embolism.
- Cardiovascular pathologies include, without limitation, aneurysm, angina, atherosclerosis, stroke, coronary artery disease, heart attack, ischemic heart disease, heart failure, myocardipathy, valvulopathy, arrhythmia, congenital heart disease, sudden death, amyloidosis, Kawasaki disease, coarctation of aorta, patent foramen ovale, Brugada syndrome, Marfan syndrome, ductus arteriosus, transposition of large vessels, coronary heart disease, rheumatic heart disease, congenital heart disease, cerebrovascular disease, peripheral artery disease, deep venous thrombosis and pulmonary embolism.
- Cardiovascular risk is defined as the probability of having cardiovascular disease in a certain period of time. That probability depends on the cardiovascular risk factors. There are some modifiable risk factors and others that are not. The most important cardiovascular risk factors are: tobacco, high blood pressure, cholesterol and diabetes. In addition there are other risk factors that also influence cardiovascular risk such as: the age and sex of the patient, family history of cardiovascular diseases at an early age, obesity, lack of physical exercise and excessive alcohol consumption. The appearance in the same patient of several risk factors, even if they are of low intensity, increases the probability of suffering from cardiovascular disease with respect to only a single risk factor.
- Cardiovascular risk factors include, but are not limited to: smoking, drug dependence, cholesterol, hypertension, left ventricular hypertrophy, diet high in fat and cholesterol, thrombogenic factors, C-reactive protein, diabetes mellitus, sedentary lifestyle, obesity, menopause, psychosocial factors, depression, triglyceride level, homocysteine level, alcohol consumption, age, sex and family history.
- a "pathology that carries an associated cardiovascular risk" is that pathology that carries a high probability of developing a cardiovascular pathology in a certain period of time.
- Pathologies with associated cardiovascular risk include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, chronic kidney disease, sleep apnea.
- subject means any animal classified as a mammal and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, primates and humans, for example humans, nonhuman primates, cows, horses, pigs, sheep , goats, dogs, cats or rodents.
- the subject is a human being of female or male sex and of any race or age.
- the subject is a subject to whom adequate treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- the subject of the invention is a human being.
- the first method of the invention comprises contacting a population of mononuclear cells with the serum of a subject to which a treatment has been applied, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population.
- EPCs endothelial precursor cells
- MNCs refers to cells that are characterized by the presence of a single, round nucleus and include, among other cell types, lymphocytes, monocytes, macrophages, as well as precursor cells such as endothelial precursor cells or EPCs.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample. Mononuclear cells from blood Peripheral are called peripheral blood mononuclear cells or PBMNCs.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method.
- Methods for the purification of MNCs are widely known in the state of the art and include, without limitation, gradient centrifugation (for example, in Ficoll gradients as described in WO2008077094), by filtration as described in Hibino et al. . (Tissue Eng Part C Methods. 2011 17: 993-8), by sedimentation in the presence of agents of the hydroxyethyl starch type (Dinsmore RE. Et al, Br J Haematol. 1983; 54: 441-449), use of separators blood cells (Pierelli L, et al, Bone Marrow Transplant, 1991; 7: 355-361; Faradji A.
- serum refers to that part of the blood or lymph that remains liquid after coagulation has occurred. Methods of obtaining serum are widely collected in the state of the art. The examples indicate the method used to obtain the serum of the invention.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject to whom a treatment has been applied whose efficacy in for a cardiovascular pathology or for a pathology that entails cardiovascular risk. Associate wants to investigate.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum can be carried out with the serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the first method of the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- culture plate refers to a support, generally made of plastic, comprising a surface suitable for cell culture.
- the culture plate may be formed by a single surface or be divided into wells.
- polymer that promotes cell adhesion refers to a compound that facilitates the cells to adhere to the surface of the culture plate.
- Such polymers comprise, without limitation, collagen, fibronectin, laminin, poly-lysine and gelatin.
- the polymer that promotes cell adhesion with which the culture plates are coated is fibronectin.
- Fibronectin is a dimeric glycoprotein present in the extracellular matrix of most animal cell tissues, which is composed of two very long subunits linked by disulfide bridges located near the carboxyl end. Each subunit consists of a series of functionally distinct domains separated by flexible polypeptide regions. These domains are composed of smaller modules that, when repeated sequentially and being encoded by a different exon, suggest that the fibronectin exon originated from multiple exonic duplications.
- Fibronectin for cell culture is commercially available: human fibronectin (reference PHE0023 from Invitrogen; ref. 354008 from BD; ref. F2006 from Sigma-Aldrich), bovine plasma fibronectin (ref. 33010-018 from Invitrogen), etc.
- Fibronectin-coated culture plates have different applications, such as improve fixation, differentiation and proliferation of various cell types. Methods for upholstering culture plates with polymers that favor cell adhesion are known in the state of the art. Such plates are also commercially available (BDR BD BioCoat fibronectin cell culture plates, R&D Systems human fibronectin coated cell culture microplates, Millipore fibronectin coated cell culture plates, etc.).
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject to whom a treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries a risk. Cardiovascular associated in the presence of a serum suitable for cell culture.
- serum suitable for cell culture refers to any serum containing the components necessary to promote the differentiation and / or proliferation of cells in culture.
- the serum suitable for cell culture is a serum suitable for the culture of EPCs.
- sera include, without limitation, fetal bovine serum, human serum, calf serum, adult bovine serum, goat serum, chicken serum, pig serum, rabbit serum, sheep serum, horse serum, guinea pig serum, serum of mouse, rat serum as well as any of the above subjected to prior treatment such as, for example, sera inactivated with gamma radiation, by adsorption on activated carbon or by treatment at high temperatures, sera treated to totally or partially eliminate immunoglobulins, tarnished serum, iron-enriched serum.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum suitable for cell culture is carried out with said serum diluted in the culture medium.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v).
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the first method of the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- plasma refers to the liquid and acellular part of the blood.
- the contact of the population of MNCs with the serum of the patient to whom the treatment has been administered whose efficacy is to be tested is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population of MNC
- EPCs endothelial precursor cells
- endothelial precursor cell refers to progenitor cells capable of differentiating into functional endothelial cells. They can be obtained from peripheral blood, umbilical cord blood or bone marrow. They are characterized by their ability to form tubules and express characteristic markers of endothelial cells.
- markers of these cells are CD34, CD133, CD146 or the endothelial vascular growth factor 2 receptor (VEGFR2, CD309, KDR) (Urbich C & Dimmeler S Circ Res 2004; 95: 343-353, Churdchomjan W et al. Endocr Disord 2010; 10: 5).
- EPCs can be distinguished, identified as cells expressing CD34, CD133 and VEGFR2, and late EPCs, identified as cells that have lost CD133 expression and begin to express markers of endothelial lineage, including vWF (von Willebrand factor), eNOS (oxide) Endothelial nitric synthase, and Ve-cadherin (vascular endothelial)
- vWF von Willebrand factor
- eNOS oxygene
- Endothelial nitric synthase Endothelial nitric synthase
- Ve-cadherin vascular endothelial
- cell differentiation refers to the process by which each cell type expresses a characteristic gene profile, which marks the proliferative capacity of each cell type and its way of responding to each type of stimulus. said process the cells undergo cytological modifications that give rise to certain forms and functions during embryonic development or during the life of a multicellular organism, specializing in a cellular type.
- the cellular differentiation supposes a biological process of cellular specialization that allows cells with identical genetic information to give rise to different cells from each other, both structurally and functionally, according to the needs of the organism.
- suitable conditions for cell differentiation refers to the conditions that allow differentiation of the precursor cells to mature differentiated cells.
- Suitable conditions for EPC differentiation to take place include, without limitation, culture in the presence of growth factors and differentiation factors known in the art for their ability to promote precursor cell differentiation.
- Suitable growth factors include, without limitation stem cell growth factor (SCF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage granulocyte stimulating factor (GM-CSF), stromal cell derived factor 1, Endothelial vascular growth factor (VEGF), TGFP, platelet-derived growth factor (PDGF), angiopoietin (Ang), epidermal growth factor (EGF), bone morphogenic protein (BMP), fibroblast growth factor (FGF), Hepatocyte growth factor, insulin-like growth factor (IGF-I), interleukins (IL-3, IL-la, IL- ⁇ , IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 and IL- 13), colony stimulating factors, thrombopoietin, erythropoietin, FLT3 ligand and tumor necrosis factor (TNF).
- SCF stem cell growth factor
- G-CSF granulocyte colony stimulating factor
- GM-CSF macrophage granulocyte stimulating factor
- the first method of the invention comprises determining the effect of the serum of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that entails an associated cardiovascular risk. on the differentiation of EPCs, where an increase in the degree of differentiation of the EPCs with respect to a culture of EPCs contacted with a control serum, is indicative that said treatment is suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- an "increase in the degree of cell differentiation” means an increase of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cell differentiation of EPCs in contact with the serum of a subject to whom an appropriate treatment has been applied for a cardiovascular pathology or a pathology that carries a cardiovascular risk with respect to a culture of EPCs in contact with a control serum.
- the first method of the invention determines the degree of cellular differentiation of the EPCs by a method selected from the group: counting the number of colonies of early EPCs, and counting the number of endothelial cells.
- the term "cell colony” refers to a group of cells with similar characteristics that act together, with the exception that their function is not to form a larger structural unit.
- earsies in this reference refers to colonies formed after 1 or 2 weeks of mononuclear cell culture. These cells are characterized by presenting some characteristics of endothelial cells as well as monocyte characteristics. These cells express eNOS, CD45 and CD14 and are KDR + / low and CD144 + / low. They differ from the so-called late colonies in that they appear later (at 3 or 4 weeks of cultivation), have a pebble morphology and have a high proliferative capacity.
- Late EPCs are characterized by expressing vWF, eNOS, P1H12, thrombomodulin, flk-1, VE-cadherin, PECAM-I, CD34, CD36 and integrin alpha v and being KDR + and CD144 + and for being CD14 " .
- the appearance of early colonies of EPCs can be detected visually, it is possible to confirm that they are colonies of EPCs by determining the ability of cells to capture acetylated LDL (acLDL) or the ability to bind UEA-1 lectin.
- early PECs differ from late EPCs in the size of the colonies that give rise.
- early EPC colonies form colonies smaller than 20 ⁇ in diameter while late EPC colonies form colonies that typically have diameters of 20-50 ⁇ .
- early EPC differentiation has occurred when at least 99%, at least 98%, at least 97%, at least 96%, at least 95%, at least 94%, at least 93%, at least 92%
- At least 91%, at least 90%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50% of the colonies are early EPC colonies that have one or more of the characteristics mentioned above.
- endothelial cell refers to a type of flattened cell that lines the inside of the blood vessels and especially the capillaries, forming part of its wall (also lymphatic vessels, body cavities, etc). Endothelial cells constitute the endothelium, a type of monostratified flat epithelium. Vascular endothelium is called the epithelium that upholsters inside the blood vessels and that in the capillaries constitutes the wall of these vessels alone.
- Methods for cell counting are widely known to those skilled in the art and include, but are not limited to, hemocytometer count, Neubauer chamber count, Trypan Blue exclusion method, automatic counters (such as Invitrogen Countess Automated Cell Counter and Coulter Counter Beckman Coulter,), etc.
- control serum used in the first method of the invention refers to a serum obtained from a healthy subject or from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology.
- control serum of the first method of the invention is a serum obtained from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology.
- control serum is the serum extracted from the subject suffering from a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk before starting treatment for said cardiovascular pathology.
- the invention relates to a method (hereafter second method of the invention) for the identification of a suitable treatment for a cardiovascular pathology or for a pathology that entails an associated cardiovascular risk in a subject, comprising:
- step (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where an increase in the The degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs brought into contact with a control serum, is indicative that such treatment is suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- the terms “subject”, “treatment”, “cardiovascular pathology” and “cardiovascular risk” are used in the context of the second invention as defined above.
- the type of treatment is selected from the group consisting of a pharmacological treatment, a dietary treatment and a physical treatment, as described above.
- the subject of the invention is a human being.
- the subject is one to which a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- a population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that entails an associated cardiovascular risk, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) and until a population of endothelial cells is obtained.
- EPCs endothelial precursor cells
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been described above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the second method of the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject to whom a suitable treatment has been applied for a cardiovascular pathology or for a pathology that involves a associated cardiovascular risk in the presence of a serum suitable for cell culture.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and horse serum.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v).
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the population of endothelial cells obtained in the first stage of said method is contacted with the serum of the subject to which a suitable treatment for a cardiovascular pathology or for a pathology has been applied.
- a suitable treatment for a cardiovascular pathology or for a pathology which entails an associated cardiovascular risk
- said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where an increase in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs brought into contact with a control serum, it is indicative that such treatment is suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk.
- control serum used in the second method of the invention refers to a serum obtained from a healthy subject or from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology.
- control serum of the second method of the invention is a serum obtained from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology.
- control serum is the serum extracted from the subject suffering from a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk before starting treatment for said cardiovascular pathology.
- cell proliferation refers to the increase in the number of cells by cell division.
- suitable conditions for endothelial cell proliferation refers to the conditions (culture medium, temperature, pH, etc.) that allow an increase in the number of cells per cellular division.
- Suitable conditions for EPC proliferation to occur include, without limitation, incubation at 37 ° C and 5% C02, in culture medium containing EBM-2 (Endothelial cell Basal Medium-2) supplemented with decomplemented bovine fetal serum or with growth factors such as those that appear in the EGM-2 SingleQuots (Endothelial Growth Medium-2, all except hydrocortisone).
- EBM-2 Endothelial cell Basal Medium-2
- growth factors such as those that appear in the EGM-2 SingleQuots (Endothelial Growth Medium-2, all except hydrocortisone).
- Other methods for the cultivation and expansion of EPCs have been described by Jonathan
- Methods for determining suitable conditions for endothelial cell proliferation include, but are not limited to, counting the number of cells in culture, measure of the incorporation of a radioactively labeled nucleotide analog to the synthesis of De novo DNA, cell staining and analysis by flow cytometry, detection of proliferation-associated antigens such as Ki-67, incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU), propidium iodide staining, reduction of a tetrazolium salt, etc.
- the degree of proliferation of endothelial cells is determined by counting the number of endothelial cells. In a preferred embodiment, counting the number of endothelial cells is carried out by immunodetection using at least one antibody specific for an endothelial cell marker.
- the endothelial cell marker is selected from the group consisting of CD146 (melanoma cell adhesion molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (stop let endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1 ), CD144 (vascular endothelial cadheriri).
- an "increase in the degree of cell proliferation” means an increase of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65 %, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cell proliferation of a culture with EPCs brought into contact with the serum of a subject to whom an appropriate treatment for a cardiovascular pathology or a pathology that entails a cardiovascular risk with respect to a culture with EPCs in the presence of a control serum has been applied.
- Cardiovascular risk determination method (third and fourth method of the invention)
- third method of the invention relates to a method (hereinafter third method of the invention) for the determination of cardiovascular risk in a subject comprising:
- EPCs endothelial precursor cells
- cardiac risk is used in the context of the third method of the invention as previously defined.
- the term "subject" has been defined above.
- the subject is one whose cardiovascular risk is intended to be determined.
- the subject of the invention is a human being.
- the first stage of the third method of the invention comprises contacting a population of mononuclear cells with the serum of the subject whose cardiovascular risk is intended to be determined, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells ( EPCs) present in said population.
- EPCs endothelial precursor cells
- Suitable conditions for cell differentiation as well as methods for determining cell differentiation have been previously described.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been indicated above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the serum of a subject whose cardiovascular risk is to be determined is contacted with the population of mononuclear cells.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject whose cardiovascular risk is to be determined.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined in the presence of a serum suitable for cell culture.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and horse serum.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v). In a preferred embodiment, the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the second stage of the third method of the invention comprises determining the effect of the subject's serum whose cardiovascular risk is intended to be determined on the differentiation of the EPCs, wherein a decrease in the degree of differentiation of the EPCs with respect to a culture of EPCs placed in contact with a control serum is indicative that said subject has a high cardiovascular risk.
- a "decrease in the degree of cell differentiation” means a decrease of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at minus 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cell differentiation of a culture of EPCs brought into contact with the serum of a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined with respect to a culture of EPCs brought into contact with a control serum.
- the third method of the invention determines the degree of cellular differentiation of the EPCs by a method selected from the group: counting the number of colonies of early EPCs, and counting the number of endothelial cells. Methods of counting colonies of early EPCs and counting the number of endothelial cells have been described previously.
- control serum used in the third method of the invention refers to a serum obtained from a healthy subject or from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology or from a subject that lacks cardiovascular risk.
- the invention relates to a method (hereafter, fourth method of the invention) for the determination of cardiovascular risk in a subject comprising:
- step (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs contacted with a control serum, is indicative that said subject has a high cardiovascular risk.
- cardiovascular risk is used in the context of the fourth method of the invention as previously defined.
- subject has been defined above.
- the subject is one whose cardiovascular risk is intended to be determined.
- the subject of the invention is a human being.
- the first stage of the fourth method of the invention comprises contacting a population of mononuclear cells with the serum of the subject whose cardiovascular risk is intended to be determined, wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population and until obtaining a population of endothelial cells.
- EPCs endothelial precursor cells
- Suitable conditions for cell differentiation as well as methods for determining cell differentiation have been previously described.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been indicated above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the serum of a subject whose cardiovascular risk is to be determined is contacted with the population of cells.
- mononuclear The contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject whose cardiovascular risk is to be determined.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined in the presence of a serum suitable for cell culture.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and horse serum.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v). In a preferred embodiment, the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the second stage of the fourth method of the invention comprises contacting the population of endothelial cells obtained in the first stage of said method with the serum of the subject whose cardiovascular risk is intended to be determined, wherein said contacting is carried out under suitable conditions. for the proliferation of endothelial cells, where a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs brought into contact with a control serum, is indicative that said subject has a high cardiovascular risk.
- a "decrease in the degree of cell proliferation” means a decrease of at least 5%, at least 10%, at least 15%), at least 20%> , at least 25%>, at least 30%>, at least 35%>, at least 40%), at least 45%>, at least 50%>, at least 55%>, at least 60%>, at least 65% or, at least 70%>, at least 75%>, at least 80%>, at least 85%>, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cell proliferation of a culture of endothelial cells obtained in the first stage and brought into contact with the serum of a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined with respect to a culture of EPCs contacted with a control serum.
- the fourth method of the invention determines the degree of cell proliferation of endothelial cells by counting the number of endothelial cells.
- counting the number of endothelial cells is carried out by immunodetection using at least one antibody specific for an endothelial cell marker.
- the endothelial cell marker is selected from the group consisting of CD146 (melanoma cell adhesion molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (stop let endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1 ), CD144 (vascular endothelial cadheriri).
- control serum used in the third method of the invention refers to a serum obtained from a healthy subject or from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology or from a subject that lacks cardiovascular risk.
- the invention relates to a method for monitoring the response of a subject to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk, which comprises
- EPCs endothelial precursor cells
- the type of treatment is selected from the group consisting of a pharmacological treatment, a dietary treatment and a physical treatment.
- drug treatment includes, but is not limited to: drugs used in the treatment of hyperlipoproteinemias, such as HMG-CoA reductase inhibitors (itarvastatin, NK-104, pitavastatin, rosuvastatin, atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, pitavastatin, pravastatin, simvastatin), squalene synthase and squalene cyclase inhibitors, triglyceride transporter microsomal protein inhibitors (BMS-201030), co-reabsorption inhibitors (bile acid acids) Lipase protein activators (NO-1886), ACAT inhibitors (avasimibe, CS-505, F-12511, F-1394, TS-892), cholesterol absorption / reabsorption inhibitors (ezetimibe, phytosterols, phytostanols), Bile acid transport inhibitors in the ileum (S-8921
- DPP-4 dipeptidyl peptidated-4 sitagliptin inhibitor
- drugs used in the treatment of high blood pressure such as thiazide diuretics (chlorthalidone, hydrochlorothiazide, indapamide, xipamide), loop diuretics (furosemide, pyretanide, torasemide), distal diuretics
- beta blockers atenolol, bisoprolol, carteolol, celiprolol, metoprolol, nebivolol, oxprenolol, propanolol), alpha- beta blockers (carvedilol, labetalol), dihydropyridine calcium antagonists (amlodipine, barnidipine, felodipine, isradipine, lacidipine, lercanidipine, manidipine, nicardipine, nifedipine, nisoldipine, nitrendipine), calcium antagonists, non-dihydropyramine converters, dihydropyramine converters, dihydropyramine converters, dihydropyramine converters, dihydropyramine converters, dihydropyramine converters of angiotensin or ACEI (benazepril, captopril, cilazapril, enal
- vasopeptidase inhibitors omapatrilate, fasidotril, myxanpril, sampatrilate, CGS30440, MDL100,240, Z13752A, receptor antagonists endothelin (darusentan, sitsentan, A127722, BQ-123, EMD 1229646/94246, PD151242 / 182874 for ET A , A192621, BQ788, IRL2500 / 2659, Ro468443 for ET B , bosentan, enrasertan, tazosentan, BQ-610, 649, B7-610, 745142, PD145065 / 142983 for ET A / ET B ), TNFa antagonists (pentoxifylline, FR167653, candesartan, ⁇ -
- anticoagulants antithrombin III inhibitors such as heparins of low molecular weight ardeparin, certoparin, nadroparin, logiparin, parnaparin, reviparin and tedelparin, and the recombinant antithrombin III
- tissue factor (TF) -factor Vlla complex inhibitors such as TF mutants, anti-TF antibodies, overexpression of the TFrPI pathway inhibitor, NaPc2 and factor VII inhibitors
- thrombin inhibitors such as factor Xa antistatin inhibitors, TAP (tick anticoagulant peptide), DX9065, lefaxine, fondaparinux, terostatin, YM-75466 and ZK-807834, antibodies against factor IXa and Xa, pathway activators Protein C and selective thrombin inhibitors such as argatroban, bivaluridine, effegatrán, H376 / 95, hirugé
- drugs used in the treatment of arrhythmias such as selective blockers of (dofetilide, ibutilide, threcetilide), blockers of Iio- and ⁇ ⁇ (sotalol, ersentalide), selective blockers of IK UT and drugs with multiple actions ( Ambosilide, azimilide, BRL-32872, clofilium, ibutilide, dronedarone, tedisamilo, threcetilide).
- the dietary treatment includes, but is not limited to: consumption of red wine, green tea, astralagus, GojiBerry extract, Lactobacillus fermentum, ellagic acid, beta-1, 3-glucan, Vitamin D3 (Stem-Kine, RBC Life), acids omega 3, Mediterranean diet and diet supplemented with cocoa flavonoids.
- physical treatment includes, but is not limited to: physical exercise, CPAP (continuous positive airway pressure), coronary stenting, autologous EPCs transplantation, transcoronary EPCs transplantation, infusion intracoronary EPCs.
- CPAP continuous positive airway pressure
- coronary stenting a coronary stenting
- autologous EPCs transplantation a transcoronary EPCs transplantation
- infusion intracoronary EPCs infusion intracoronary EPCs.
- the term "monitor the response" refers to a follow-up of the evolution of a pathology, in particular of a cardiovascular pathology or of a pathology that carries a risk of cardiovascular pathology.
- subject means any animal classified as a mammal and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, primates and humans, for example humans, nonhuman primates, cows, horses, pigs, sheep , goats, dogs, cats or rodents.
- the subject is a human being of female or male sex and of any race or age.
- the subject is a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined.
- the subject of the invention is a human being.
- the first stage of the fifth method of the invention comprises contacting a population of mononuclear cells with the serum of the subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that entails a cardiovascular risk is intended to be monitored, wherein said putting in Contact is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population.
- EPCs endothelial precursor cells
- the terms "mononuclear cell”, “endothelial precursor cell”, “differentiation”, and “suitable conditions for differentiation” are used as defined above. Suitable conditions for cell differentiation, as well as methods for determining cell differentiation have been previously described.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been indicated above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk is intended to be monitored.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- contacting the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk is intended to be monitored is contacted with the population of mononuclear cells.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that entails a cardiovascular risk is intended to be monitored.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk is intended be monitored in the presence of a serum suitable for cell culture.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- Serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and serum. of horse.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v). In a preferred embodiment, the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the second stage of the fifth method of the invention comprises determining the effect of the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves cardiovascular risk is intended to be monitored on the differentiation of EPCs, where an increase in the degree of differentiation of the EPCs with respect to a culture of EPCs contacted with the subject's serum before being treated it is indicative that said subject responds to said treatment.
- an "increase in the degree of cell differentiation” means an increase of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65% , at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cell differentiation of a culture with EPCs put in contact with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk wants to be monitored with respect to a culture of EPCs put in contact with the serum of said subject before being treated .
- the fifth method of the invention determines the degree of cellular differentiation of the EPCs by a method selected from the group: counting the number of colonies of early EPCs, and counting the number of endothelial cells. Methods of counting colonies of early EPCs and counting the number of endothelial cells have been described previously.
- the invention in another aspect, relates to a method (hereafter sixth method of the invention) for monitoring the response of a subject to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk, which comprises
- step (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where an increase in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to a culture of EPCs contacted with the subject's serum before being treated is indicative that said subject responds to said treatment.
- treatment means treatment, “monitor the response”, “cardiovascular pathology”, “cardiovascular risk”, “differentiation” and “proliferation” are used as previously defined.
- subject means any animal classified as a mammal and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, primates and humans, for example humans, nonhuman primates, cows, horses, pigs, sheep , goats, dogs, cats or rodents.
- the subject is a human being of female or male sex and of any race or age.
- the subject is a subject whose cardiovascular risk is intended to be determined.
- the subject of the invention is a human being.
- the first stage of the sixth method of the invention comprises contacting a population of mononuclear cells with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that entails An associated cardiovascular risk is intended to be monitored, where said contacting is carried out under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population and until obtaining a population of endothelial cells.
- EPCs endothelial precursor cells
- Suitable conditions for cell differentiation as well as methods for determining cell differentiation have been previously described.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been indicated above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk is intended to be monitored.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the term "serum" is used as defined above.
- the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology involving a cardiovascular risk is intended to be monitored is contacted with the population of mononuclear cells.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that entails a cardiovascular risk is intended to be monitored.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk is intended be monitored in the presence of a serum suitable for cell culture.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with the serum diluted in culture medium.
- the serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and horse serum.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v). In a preferred embodiment, the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the second stage of the sixth method of the invention comprises contacting the population of endothelial cells obtained in the first stage of said method with the serum of the subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk It is intended to be monitored, where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, where an increase in the degree of proliferation of Endothelial cells with respect to a culture of EPCs brought into contact with the subject's serum before being treated is indicative that said subject responds to said treatment.
- an "increase in the degree of cell proliferation” means an increase of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65% , at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cell proliferation of endothelial cells in contact with the serum of a subject whose response to a treatment aimed at treating a cardiovascular pathology or a pathology that involves a cardiovascular risk wants to be monitored with respect to a culture of EPCs brought into contact with the subject's serum before being treated
- the sixth method of the invention determines the degree of cell differentiation by counting the number of endothelial cells.
- counting the number of endothelial cells is carried out by immunodetection using at least one antibody specific for an endothelial cell marker.
- the endothelial cell marker is selected from the group consisting of CD146 (melanoma cell adhesion molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1) , CD144 (vascular endothelial cadheriri).
- Custom therapy methods (seventh and eighth methods of the invention)
- the invention relates to the use of a vascular therapeutic compound for the preparation of a medicament for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk wherein said compound is administered to a subject identified by a method that comprises (i) contacting a population of mononuclear cells with the serum of said subject under conditions suitable for the differentiation of the EPCs present in said population and
- the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of differentiation of the EPCs with respect to the degree of differentiation of a culture of said population contacted with a control serum.
- the invention relates to a vascular therapeutic compound for use in the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk wherein said compound is administered to a subject identified by a method comprising
- the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of differentiation of the EPCs with respect to the degree of differentiation of a culture of said population contacted with a control serum.
- the invention relates to a method for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk wherein said treatment is applied to a subject identified by a method comprising
- the subject is that identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered.
- the subject of the invention is a human being.
- vascular therapeutic compound is defined as that compound that is used to alleviate or eliminate cardiovascular pathology or the pathology that entails an associated cardiovascular risk, or reduce or eliminate one or more symptoms associated with said pathology, or alleviate or eliminate the physiological sequelae of the disease.
- a population of mononuclear cells is contacted with the serum of the subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered, under conditions suitable for the differentiation of the EPCs present in said population.
- Modes of administration of a compound include, without limitation, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.
- the most appropriate route of administration in any given case depends on the duration of the subject's condition, the length of the desired treatment, the nature and severity of the condition. that is being treated, and the particular formulation that is being used.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells are derived from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the first stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been indicated above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered.
- the contact of the population of mononuclear cells with said subject serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the serum of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered is contacted with the population of mononuclear cells.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered in the presence of a serum suitable for cell culture.
- the contact of the population of mononuclear cells with said serum is carried out with diluted serum in culture medium.
- the serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and horse serum.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v). In a preferred embodiment, the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the effect of the serum of the subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered on the degree of cellular differentiation of said EPCs is determined, wherein the subject it is selected if the serum causes a decrease in the degree of cellular differentiation of the EPCs cells with respect to the degree of differentiation of a culture of said population contacted with a control serum.
- a "decrease in the degree of cell differentiation” means a decrease of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65% , at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or even more in the degree of cellular differentiation of the EPCs with respect to to the degree of differentiation resulting from the contact of said population with a control serum.
- the seventh method of the invention determines the degree of cellular differentiation of the EPCs by a method selected from the group: counting the number of colonies of early EPCs, and counting the number of endothelial cells. Methods of counting colonies of early EPCs and counting the number of endothelial cells have been described previously.
- control serum used in the seventh method of the invention refers to a serum obtained from a healthy subject or from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology.
- the type of treatment suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that involves an associated cardiovascular risk in a subject is selected from the group consisting of pharmacological, dietary or physical.
- the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that carries an associated cardiovascular risk for which a vascular therapeutic compound is used for the preparation of a medicament is of a pharmacological type.
- pharmacological treatment includes, but is not limited to: drugs used in the treatment of hyperlipoproteinemias,
- drugs used in the treatment of acute coronary syndromes drugs used in the treatment of the inflammatory process of atheroma plaque,
- drugs used in the treatment of arrhythmias such as those indicated above.
- the seventh method of the invention relates to a method for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that carries an associated cardiovascular risk, wherein said treatment may be of a dietary or physical type.
- the dietary treatment includes, but is not limited to: consumption of red wine, green tea, astralagus, GojiBerry extract, Lactobacillus fermentum, ellagic acid, beta-1, 3-glucan, Vitamin D3 (Stem-Kine, RBC Life), acids omega 3, Mediterranean diet and diet supplemented with cocoa flavonoids.
- physical treatment includes, but is not limited to: physical exercise, CPAP (continuous positive airway pressure), coronary stenting, autologous EPCs transplantation, transcoronary EPCs transplantation, infusion intracoronary EPCs.
- CPAP continuous positive airway pressure
- coronary stenting includes, but is not limited to: coronary stenting, autologous EPCs transplantation, transcoronary EPCs transplantation, infusion intracoronary EPCs.
- the invention relates in the last place to the use of a vascular therapeutic compound for the preparation of a medicament for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk wherein said compound is administered to a subject identified by a method that comprises
- step (iv) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, wherein the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to the degree of proliferation of a culture of said population in contact with a control serum.
- the invention relates to a vascular therapeutic compound for use in the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that entails an associated cardiovascular risk wherein said compound is administered to a subject identified by a method comprising
- step (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, wherein the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to the degree of proliferation of a culture of said population in contact with a control serum.
- the invention relates to a method for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that involves an associated cardiovascular risk wherein said treatment is applied to a subject identified by a method comprising
- step (ii) contacting the population of endothelial cells obtained in step (i) with the serum of said subject where said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, wherein the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of proliferation of endothelial cells with respect to the degree of proliferation of a culture of said population in contact with a control serum.
- treatment vascular therapeutic compound
- cardiac pathology cardiac pathology
- subject means any animal classified as a mammal and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, primates and humans, for example humans, nonhuman primates, cows, horses, pigs, sheep , goats, dogs, cats or rodents.
- the subject is a human being of female or male sex and of any race or age.
- the subject is a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered.
- the subject of the invention is a human being.
- a population of mononuclear cells is contacted with the serum of the subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered, under conditions suitable for the differentiation of endothelial precursor cells (EPCs) present in said population and until obtaining a population of endothelial cells.
- EPCs endothelial precursor cells
- the mononuclear cells are derived from a blood sample or an umbilical cord sample.
- the mononuclear cells are derived from a blood sample.
- the mononuclear cells come from an autologous blood sample or an autologous umbilical cord sample with respect to the serum used in the eighth stage of said method. Methods for purification of mononuclear cells have been indicated above.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered.
- the contact of the population of mononuclear cells with said subject serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out on a culture plate.
- the culture plate is coated with a polymer that promotes cell adhesion.
- the polymer that promotes cell adhesion is fibronectin.
- the serum of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered is contacted with the population of mononuclear cells.
- the contact of the population of mononuclear cells with the serum is carried out with said serum diluted in culture medium.
- the invention also contemplates that the population of mononuclear cells be contacted with the plasma of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered.
- the population of mononuclear cells is contacted with the serum of a subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered in the presence of a serum suitable for cell culture.
- a serum suitable for cell culture comprises, but is not limited to, fetal bovine serum and horse serum.
- the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8 or 1: 10 (v / v). In a preferred embodiment, the ratio of the subject's serum and the serum suitable for cell culture is at least 3: 1 (v / v).
- the population of endothelial cells obtained in the first stage of said method is contacted with the serum of the subject identified by the method of the invention and to which the vascular therapeutic compound is administered, in wherein said contacting is carried out under conditions suitable for the proliferation of endothelial cells, wherein the subject is selected if the serum causes a decrease in the degree of proliferation of the endothelial cells with respect to the degree of proliferation of a culture of said population in contact with a control serum.
- a "decrease in the degree of cell proliferation” means a decrease of at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%), at least 45%>, at least 50%>, at least 55%>, at least 60%>, at least 65%), at least 70%>, at least 75%>, at least 80%>, at least 85%>, at least 90%), at least 95%> or even more in the degree of cell proliferation of endothelial cells with respect to the degree of proliferation of a culture of said population in contact with a control serum.
- control serum used in the seventh method of the invention refers to a serum obtained from a healthy subject or from a subject that does not suffer from any cardiovascular pathology.
- the eighth method of the invention determines the degree of cell differentiation by counting the number of endothelial cells.
- counting the number of endothelial cells is carried out by immunodetection using at least one antibody specific for an endothelial cell marker.
- the endothelial cell marker is selected from the group consisting of CD146 (melanoma cell adhesion molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1) , CD144 (vascular endothelial cadheriri).
- the type of treatment suitable for a cardiovascular pathology or for a pathology that carries an associated cardiovascular risk in a subject is selected from the group consisting of pharmacological, dietary or physical.
- the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that carries an associated cardiovascular risk for which a vascular therapeutic compound is used for the preparation of a medicament is of a pharmacological type.
- pharmacological treatment includes, but is not limited to: drugs used in the treatment of hyperlipoproteinemias,
- drugs used in the treatment of acute coronary syndromes - drugs used in the treatment of the inflammatory process of atheroma plaque,
- the eighth method of the invention relates to a method for the treatment of a cardiovascular pathology or a pathology that carries an associated cardiovascular risk, wherein said treatment may be of a dietary or physical type.
- the dietary treatment includes, but is not limited to: consumption of red wine, green tea, astralagus, GojiBerry extract, Lactobacillus fermentum, ellagic acid, beta-1, 3-glucan, Vitamin D3 (Stem-Kine, RBC Life), acids omega 3, Mediterranean diet and diet supplemented with cocoa flavonoids.
- physical treatment includes, but is not limited to: physical exercise, CPAP (continuous positive airway pressure), coronary stenting, autologous EPCs transplantation, transcoronary EPCs transplantation, infusion intracoronary EPCs.
- CPAP continuous positive airway pressure
- coronary stenting includes, but is not limited to: coronary stenting, autologous EPCs transplantation, transcoronary EPCs transplantation, infusion intracoronary EPCs.
- peripheral blood or umbilical cord mononucleated cells of healthy subjects for the culture of endothelial precursor cells (EPCs).
- EPCs endothelial precursor cells
- Physiological serum or PBS IX 6% ACD solution (22.3 g of glucose, 22 g of sodium citrate and 8 g of citric acid for 1 1 solution), isolation buffer (50 ml of 6% ACD solution, 2, were used , 5 g BSA, 450 ml of PBS for 0.5 1 solution) and isolation medium or K medium (395 ml of EBM-2, 90 ml of decomplemented fetal bovine serum, 5 ml glutamine-penicillin-streptomycin lOOx and EGM- 2 SingleQuots (all except hydrocortisone) for 0.5 1 solution).
- Methodology used for the isolation of EPCs 6% ACD solution (22.3 g of glucose, 22 g of sodium citrate and 8 g of citric acid for 1 1 solution
- isolation buffer 50 ml of 6% ACD solution, 2, were used , 5 g BSA, 450 ml of PBS for 0.5 1 solution
- isolation medium or K medium 395 ml of EBM-2, 90
- EPC derived from umbilical cord blood and EPCs derived from adult peripheral blood were obtained from the mononuclear cell fraction (MNC).
- Peripheral blood mononucleated cells were obtained as indicated in WO2008077094. To do this, between 20-40 ml of whole blood, from either umbilical cord blood, was extracted by adding 1 ml of heparin in a syringe before extracting the umbilical cord blood, or adult peripheral blood, using tubes with heparin when drawing blood with needles with butterfly. In 10 ml tubes, 10 ml of isolation buffer was added for every 20 ml of blood used. 50 ml tubes were prepared with 15 ml of Ficoll, to which the mixture of blood and isolation buffer was added without breaking the gradient. It was centrifuged at 2700 rpm for 15 minutes and without brake.
- the autologous plasma was then collected, taking the supernatant (about 10-15 ml) being careful not to remove the cell layer, and it could be frozen at -20 ° C if not used immediately.
- the mononuclear cell layer (white layer) was then collected and transferred to 50 ml tubes, with 5 ml of isolation buffer being added for every 10 ml of collected cells. It was centrifuged at 2700 rpm for 5 minutes and then the supernatant was removed and the pellet was resuspended in 10 ml of isolation buffer to make a washing (centrifugation for 10 min at 1200 rpm and removal of the supernatant).
- isolation buffer 2 ml was added to resuspend the cells and 6 ml of ammonium chloride to lyse erythrocytes. After 5-10 min of incubation at 4 ° C, 5 ml of isolation buffer was added, homogenized and centrifuged at 1200 rpm for 5 min. 10 ml of isolation buffer was added again and centrifuged at 1200 rpm for 5 min. After removing the supernatant, the pellet was resuspended in 12 ml of K medium. 2 ml of this cell suspension were seeded in 6-well plates coated with fibronectin, with 300 ⁇ of the autologous plasma previously obtained being added in each well.
- the cells were incubated at 37 ° C and 5% C0 2 for 48 hours, after which the medium was removed and fresh K medium was added. This last step was repeated every 2 or 3 days. Between 7 and 14 days later, early EPCs were obtained. Between 20 and 25 days later the endothelial colonies were obtained.
- the cells were obtained from umbilical cord blood or adult peripheral blood samples as described above, with the difference that they were finally resuspended in 3.4 ml of isolation medium 2 or K-2 (395 ml of EBM-2, 15 ml of decomplemented bovine fetal serum, 5 ml of glutamine-penicillin-streptomycin lOOx and EGM-2 SingleQuots (all except hydrocortisone) for 0.5 1 of medium) instead of K medium as in the case previous.
- K-2 395 ml of EBM-2, 15 ml of decomplemented bovine fetal serum, 5 ml of glutamine-penicillin-streptomycin lOOx and EGM-2 SingleQuots (all except hydrocortisone) for 0.5 1 of medium) instead of K medium as in the case previous.
- K-2 395 ml of EBM-2, 15 ml of decomplemented bovine fetal serum, 5 ml of glutamine-penicillin-streptomycin lOO
- the cells were incubated at 37 ° C and 5% C02. After 48h in culture the medium was removed and fresh medium was added together with the corresponding serum as indicated above, and then repeated every 2-3 days. If the cells came from umbilical cord samples, early EPCs appeared in the first 7 days, and between 7-14 days later (at least in the control) endothelial colonies were observed. Optionally, the cells were frozen after obtaining them for storage and later use.
- EPC EPC-derived neurotrophic factor
- the cells were separated by cell scraping, and gentle mechanical dispersion by pipetting. The cells were washed with EBM-2 medium. A total of ⁇ ⁇ ⁇ 6 cells were incubated for 30 minutes in the dark at 4 ° C with the following monoclonal antibodies (mAb) with the concentrations recommended by the manufacturer: fluorescein-labeled anti-CD144 MAB (FITC), (Serotec, 22 of Bankside Focus of the station of Kidlington, United Kingdom), anti-CD34 MAB marked with PerCp (TC) (Caltag, Invitrogen, San Diego, CA), anti-VEGFR-2 MAB / KDR-PE (RD Systems, Minneapolis ).
- FITC fluorescein-labeled anti-CD144 MAB
- TC PerCp
- TC Caltag, Invitrogen, San Diego, CA
- anti-VEGFR-2 MAB / KDR-PE RD Systems, Minneapolis ).
- the corresponding isotype controls were used.
- the quantitative analysis was performed on a FACS Calibur flow cytometer where ⁇ ⁇ ⁇ 5 cells were acquired per sample. The data were analyzed using the CellQuest software (Becton Dickinson). The number of EPCs was defined as triple positive events for CD34, CD144, and KDR with low cytoplasmic granularity.
- the proliferation of EPCs was analyzed after three weeks of culture with the sera of the subjects.
- the effect of the sera on the proliferation of EPCs was evaluated using the PCNA kit (proliferating cell nuclear antigen) (BD Pharmingen, San Diego, CA) and the quantification was performed by flow cytometry (FACS Calibur Cytometer, Becton Dickinson, San Jose, CA).
- the results obtained in the PCNA marking were the following: 28.3% of cells proliferating in pre-treatment EPC samples were observed, compared to 63.1% of cells proliferating in post-treatment EPC samples.
- VEGFR2 endothelial vascular growth factor 2 receptor
- CD146 CD146
- EXAMPLE 1 Study of vascular evolution in a population with sleep apnea (OSAS) after CPAP treatment
- OSAS sleep apnea
- EXAMPLE 2 Study of vascular evolution in a hypertensive population undergoing chronic and acute dietary treatment The results obtained were similar to those previously described in the study of the SAOS population undergoing a CPAD treatment.
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Abstract
La presente invención se relaciona con metodologías para la identificación de tratamientos adecuados para patologías cardiovasculares, con métodos para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto, con métodos para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado mediante la determinación del grado de proliferación y/o diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) en presencia del suero de pacientes a los que se les ha administrado dicho tratamiento. Se contemplan tanto tratamientos farmacológicos como dietéticos o físicos indicados para patologías cardiovasculares.
Description
MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FÁRMACOS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con metodologías para la identificación de tratamientos adecuados para patologías cardiovasculares. Para ello, se determina el grado de proliferación y/o diferenciación de un cultivo de células precursoras endoteliales (EPCs) en presencia del suero de un paciente del que se desea saber si responde positivamente a dicho tratamiento. La presente invención contempla tanto tratamientos farmacológicos como dietéticos o físicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de mortalidad del mundo y se espera que lo sigan siendo debido al aumento de su prevalencia en los países con menos recursos y al envejecimiento de la población. La OMS estima que en 2030 morirán cerca de 23,6 millones de personas por enfermedad cardiovascular (ECV), sobre todo por cardiopatías y accidente vascular cerebral (AVC), y se prevé que sigan siendo la principal causa de muerte. En el trastorno cardiovascular interaccionan la susceptibilidad genética del individuo con los factores ambientales (tabaquismo, sedentarismo y dieta).
Los factores de riesgo cardiovascular tienen un efecto directo sobre la biología de las células precursoras del endotelio (EPCs) (Everaert et al. Journal of Cardiology 2010; 144(3):350-366).
Las EPCs son células progenitoras con capacidad de diferenciarse a células endoteliales funcionales y que constituyen una población muy pequeña de las células circulantes. Las EPCs se encuentran en una concentración de alrededor de 2-5 células por mililitro de sangre de cordón umbilical humano, y en una concentración de aproximadamente 0,05 a 0,2 células por mililitro en sangre periférica de adulto. Tanto la baja frecuencia de EPCs en circulación como la falta de un conjunto único de marcadores
celulares distintivos han hecho del aislamiento de EPCs por citometría de flujo o de otro tipo de técnicas inmunológicas muy difícil.
La cuantificación, análisis y obtención de las EPCs se ha convertido en uno de los principales retos de la comunidad biomédica. Sin embargo, el proceso para la obtención de EPCs derivadas de la sangre no es sencillo. La mayoría de los estudios originales identifican EPC circulantes, como las células que expresan CD34, CD133 y VEGFR2. Sin embargo, se sabe ahora que estos marcadores celulares son compartidos por las células hematopoyéticas que pueden ser movilizados en la circulación de la médula ósea a los sitios de origen de la neovascularización. Aunque los tipos de células hematopoyéticas y endoteliales son fundamentalmente diferentes, muchos estudios se han referido a las células adherentes de sangre o de hueso derivadas de la médula ósea que expresan marcadores como CD34, CD133 y VEGFR-2 como EPCs. Como resultado, la metodología de mayor éxito para aislar EPCs se basa en métodos similares a los descritos originalmente para la obtención de células endoteliales (EC) de sangre periférica (Lin Y et al. J Clin Invest 2000; 105:71-77). EPCs obtenidas por esta metodología son fenotípicamente indistinguibles de cultivo EC maduro en términos de la morfología de adoquines y la expresión de moléculas de adhesión y receptores (Melero- Martín JM et al. Blood 2007; 109:4761-4768). Sin embargo, en ensayos funcionales, las EPCs exhiben mayor actividad migratoria y proliferativa en comparación con células endoteliales derivadas de la vasculatura existente (Khan ZA et al. Blood 2006; 108:915- 921). Teniendo en cuenta el efecto que los factores de riesgo cardiovascular tienen sobre la biología de las EPCs, se han descrito distintas metodologías para la identificación de compuestos para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares basados en el estudio de EPCs. Así, Vasa M. et al han descrito que las EPCs pueden ser utilizadas como marcadores de disfunción endotelial durante el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (Vasa M. et al 2001 Circulation Research; 89:El-7). De igual modo, los documentos WO2004045517 y WO2009075566 describen métodos para el diagnóstico de una enfermedad cardiovascular basados en la detección de EPCs activadas en una muestra de
fluido circulante. US2004110241 y Deschaseaux et al. Journal of Pharmacology 2007; 562(1-2): 111-118 describen el efecto del tratamiento con fármacos tales como estatinas sobre el grado de activación de las EPCs obtenidas de dichos pacientes. Sin embargo, estos métodos requieren el aislamiento de las EPCs del sujeto objeto de estudio así como el uso de medios de cultivo comerciales de composición desconocida y de alto coste.
Sin embargo, y a pesar de los tratamientos disponibles hasta la fecha, la tasa de incidencia de las enfermedades cardiovasculares es aún elevada. Por lo tanto, debido a la alta prevalencia y a la gravedad de las enfermedades cardiovasculares, es necesario el desarrollo de terapias alternativas a las existentes que permitan reducir la tasa de incidencia y/o los efectos de las enfermedades cardiovasculares.
Por todo ello, a la vista del estado actual de la técnica, se hace necesario proporcionar metodologías que permitan predecir la eficacia de los potenciales tratamientos dirigidos a patologías cardiovasculares o a patologías con riesgo cardiovascular asociado en sujetos que presentan dichas patologías o que tienen un alto riesgo de desarrollarlas.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en primer aspecto con un método para la identificación de un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado dicho tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
En un segundo aspecto, la invención está relacionada con un método para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs, en donde una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs, en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado dicho tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
En un quinto aspecto, la invención se relaciona con un método para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
En un sexto aspecto, la invención se relaciona con un método para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento.
En un séptimo aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto en condiciones adecuadas para la diferenciación de las EPCs presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre el grado de diferenciación celular de dichas EPCs
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto al grado de diferenciación de un cultivo de dicha población puesto en contacto con un suero control.
En un último aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra cultivos de células obtenidos a partir de fracción de las células mononucleares (MNC) aisladas de una población control sin antecedentes de riego cardiovascular, cultivadas con muestras de suero de los pacientes obtenidas previo al tratamiento y al concluir el mismo, al cabo de 1-2 semanas de cultivo con dicho suero. Se observó que el número de colonias (conocidas como EPC tempranas) del cultivo correspondiente al post-tratamiento es mayor que el número de colonias en el caso del pre- tratamiento, aunque en todo caso no alcanzó el número obtenido en el control sano.
La Figura 2 muestra una representación gráfica de muestras de cultivos de células obtenidos a partir de fracción de las MNC aisladas de una población control sin antecedentes de riego cardiovascular, cultivadas con muestras de suero de los pacientes obtenidas previo al tratamiento y al concluir el mismo, al cabo de 1-2 semanas de cultivo con dicho suero. Se observó que el número de colonias (conocidas como EPC tempranas) del cultivo correspondiente al post-tratamiento es mayor que el número de colonias en el caso del pre- tratamiento, aunque en todo caso no alcanzó el número obtenido en el control sano
La Figura 3 muestra cultivos de células obtenidos a partir las MNC aisladas de una población control sin antecedentes de riego cardiovascular, cultivadas con muestras de suero de los pacientes obtenidas previo al tratamiento y al concluir el mismo, al cabo de 3-4 semanas de cultivo con dicho suero. Se observó que los controles se encontraban recubiertos por una monocapa de células endoteliales maduras con una confluencia de aproximadamente el 95%. En el caso del pretratamiento las células no formaron monocapa, mientras que en el
caso del post-tratamiento hubo zonas de monocapa pero no alcanzaron la confluencia del pocilio control.
La Figura 4 muestra la representación del análisis por citometría de flujo del porcentaje de expresión de VEGFR2 de células caracterizadas como endoteliales madura, de células obtenidos a partir de las MNC aisladas de una población control sin antecedentes de riego cardiovascular, cultivadas con muestras de suero de los pacientes obtenidas previo al tratamiento y al concluir el mismo, al cabo de 3-4 semanas de cultivo con dicho suero. Se observó un mayor porcentaje de células con expresión de VEGFR2 en los casos donde su utilizó suero post-tratamiento comparado con pre-tratamiento. Los valores no alcanzaron el del caso control.
La Figura 5 muestra la representación del análisis por citometría de flujo del porcentaje de proliferación celular caracterizadas como endoteliales madura, en células obtenidos a partir de las MNC aisladas de una población control sin antecedentes de riego cardiovascular, cultivadas con muestras de suero de los pacientes obtenidas previo al tratamiento y al concluir el mismo, al cabo de 3-4 semanas de cultivo con dicho suero. Se observó un mayor porcentaje de células proliferando cuando se utilizó el suero en pacientes post-tratamiento comparado con pre-tratamiento, siendo la diferencia estadísticamente significativa.
La Figura 6 muestra la cuantificación del número de colonias de EPC tempranas obtenidas a partir de un cultivo de MNC obtenidas de un sujeto control en presencia de suero de pacientes SAOS antes del tratamiento (Pre-CPAP) y tras un tratamiento de 3 meses con el suero de pacientes tras el tratamiento con CPAP (Post-CPAP).
La Figura 7 muestra la cuantificación del grado de confluencia de la monocapa de células endoteliales generadas en cultivo a partir de MNC de un sujeto control en presencia de suero de los pacientes pre-tratamiento (Pre-CPAP) y de suero de pacientes tratados (Post- CPAP).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han determinado que el suero de pacientes sometidos a diferentes tratamientos puede tener un efecto en la viabilidad y el funcionamiento de las células precursoras endoteliales, de modo que es posible identificar qué tratamientos pueden disminuir el daño vascular en diversas poblaciones de riesgo mediante la puesta en contacto del suero del paciente tratado con un cultivo con EPCs. Para ello, los inventores han desarrollado una metodología mediante la cual se cultivan estas células con el suero de pacientes obtenido tras diferentes tratamientos y se determina su capacidad de diferenciación y proliferación.
Métodos de identificación de tratamientos adecuados para patologías cardiovasculares (primer y segundo método de la invención) Primer método de la invención
La invención se relaciona en un primer lugar con un método (de ahora en adelante primer método de la invención) para la identificación de un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado dicho tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y (ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
El término "tratamiento", según se usa en el contexto de esta memoria, significa administración de un compuesto y/o aplicación de una terapia para aliviar o eliminar la
patología cardiovascular o la patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, o reducir o eliminar uno o más síntomas asociados a dicha patología. El término "tratamiento" también abarca aliviar o eliminar las secuelas fisiológicas de la enfermedad. En una realización particular del séptimo método de la invención, el tipo de tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto se selecciona del grupo formado por farmacológico, dietético o físico. La expresión "patología cardiovascular", según se usa en la presente invención, se refiere a aquella patología del corazón y del sistema de vasos sanguíneos (arterias, capilares y venas) de todo el organismo.
Las patologías cardiovasculares se clasifican en cuatro tipos generales: enfermedades isquémicas del corazón, enfermedades cerebrovasculares, enfermedades vasculares periféricas y otras enfermedades (Corella, D y Ordovás JM, 2007, Investigación y Ciencia). Las dos primeras, son responsables de más del 60% de la mortalidad cardiovascular total.
Las enfermedades isquémicas del corazón se deben a un estrechamiento progresivo de la luz de las arterias coronarias, causado por la formación de la placa de ateroma. Existen placas frágiles que se rompen con facilidad y otras más resistentes. La obstrucción total de la arteria provoca la interrupción de la circulación de la sangre o isquemia, si este estado se prolonga se destruye el tejido cardiaco dando lugar a la zona de necrosis o infarto. Las enfermedades cerebrovasculares se deben a alteraciones de la circulación cerebral. Se clasifican en isquémicas o hemorrágicas. En las isquémicas se produce una disminución del flujo sanguíneo que llega a alguna región del cerebro, lo que produce necrosis tisular por daño neuronal irreversible (infarto cerebral). En las hemorrágicas existe una extravasación de sangre por rotura de algún vaso.
Las enfermedades vasculares periféricas son trastornos de la circulación de los vasos (arterias o venas) que irrigan las piernas o brazos. Enlentecen el flujo sanguíneo y provocan estrechamiento de los vasos, hinchazón y dolor. Puede causar isquemia. Cuando afecta a las
venas se forman coágulos de sangre, o trombos, que provocan oclusión y dan lugar a trombosis venosa. Si ese trombo se desprende, puede transportarse a los vasos de los pulmones y causar defunción por embolia pulmonar. Las patologías cardiovasculares incluyen, sin limitarse, aneurisma, angina, ateroesclerosis, apoplejía, enfermedad de la arteria coronaria, infarto, cardiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, miocardipatía, valvulopatía, arritmia, cardiopatía congénita, muerte súbita, amiloidosis, enfermedad de Kawasaki, coartación de aorta, foramen oval permeable, síndrome de Brugada, síndrome de Marfan, ductus arterioso, transposición de grandes vasos, cardiopatía coronaria, cardiopatía reumática, cardiopatía congénita, enfermedad cerebrovascular, arteriopatía periférica, trombosis venosa profunda y embolia pulmonar.
Se define "riesgo cardiovascular" como la probabilidad de tener una enfermedad cardiovascular en un determinado periodo de tiempo. Esa probabilidad depende de los factores de riesgo cardiovascular. Existen unos factores de riesgo modificables y otros que no lo son. Los factores de riesgo cardiovasculares más importantes son: el tabaco, la hipertensión arterial, el colesterol y la diabetes. Además hay otros factores de riesgo que también influyen en el riesgo cardiovascular como son: la edad y sexo del paciente, los antecedentes familiares de enfermedades cardiovasculares a edades tempranas, la obesidad, la falta de ejercicio físico y el consumo excesivo de alcohol. La aparición en un mismo paciente de varios factores de riesgo, aunque sean de baja intensidad, aumenta la probabilidad de padecer enfermedad cardiovascular respecto a si sólo se presenta un único factor de riesgo. Los factores de riesgo cardiovascular incluyen, sin limitarse a: tabaquismo, drogodependencia, colesterol, hipertensión, hipertrofia ventricular izquierda, dieta rica en grasa y colesterol, factores trombogénicos, proteína C-reactiva, diabetes mellitus, sedentarismo, obesidad, menopausia, factores psicosociales, depresión, nivel de triglicéridos, nivel de homocisteína, consumo de alcohol, edad, sexo y antecedentes familiares.
En el contexto de la invención, una "patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado" es aquella patología que conlleva una alta probabilidad de desarrollar una patología cardiovascular en un determinado periodo de tiempo. Las patologías con riesgo cardiovascular asociado incluyen, sin limitarse a, artritis reumatoide, artritis psoriática, nefropatía crónica, apnea del sueño.
En la presente invención se entiende por "sujeto" cualquier animal clasificado como mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano de sexo femenino o masculino y de cualquier raza o edad. En el contexto del primer método de la presente invención, el sujeto es un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado. En una realización preferida de la invención, el sujeto de la invención es un ser humano.
En una primera etapa, el primer método de la invención comprende poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población.
El término "células mononucleares" o "MNCs" (mononuclear cells) hace referencia a células que se caracterizan por la presencia de un núcleo único y redondo e incluyen, entre otros tipos celulares, linfocitos, monocitos, macrófagos, así como células precursoras tales como las células precursoras endoteliales o EPCs.
En una realización particular del primer método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del primer método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. Las células mononucleares procedentes de sangre
periférica se denominan células mononucleares de sangre periférica o PBMNCs. En una realización aún más preferida del primer método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método.
Métodos para la purificación de MNCs son ampliamente conocidos en el estado de la técnica e incluyen, sin limitación, centrifugación en gradiente (por ejemplo, en gradientes de Ficoll tal y como se describe en WO2008077094), mediante filtración según se describe en Hibino et al. (Tissue Eng Part C Methods. 2011 17: 993-8), mediante sedimentación en presencia de agentes del tipo de hidroxietil almidón (Dinsmore RE. et al, Br J Haematol. 1983; 54: 441-449), uso de separadores de células sanguíneas (Pierelli L, et al, Bone Marrow Transplant, 1991; 7: 355-361; Faradji A. et al, Vox Sang., 1988; 55: 133-138; Gilmore MJ et al., Vox Sang. 1983; 45: 294-302 y Davis JM et al., J. Hematother., 1993; 2: 315-320) y tubos Leucosep, etc.
El término "suero" se refiere a aquella parte de la sangre o de la linfa que permanece líquida después de haberse producido la coagulación. Métodos de obtención de suero están ampliamente recogidos en el estado de la técnica. En los ejemplos se indica el método utilizado para la obtención del suero de la invención.
En la primera etapa del primer método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento cuya eficacia en para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado se desea investigar. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se puede llevar a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del primer método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del primer método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del primer método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
Alternativamente, el primer método de la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
El término "placa de cultivo" tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, hace referencia a un soporte, en general de plástico, que comprende una superficie apta para el cultivo celular. La placa de cultivo puede estar formada por una superficie única o bien estar dividida en pocilios.
El término "polímero que promueve la adhesión celular" hace referencia a un compuesto que facilita que las células de adhieran a la superficie de la placa de cultivo. Tales polímeros comprenden, sin limitarse a, colágeno, fibronectina, laminina, poli-lisina y gelatina.
En una realización preferida del primer método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular con el cual se encuentran recubiertas las placas de cultivo es fibronectina.
La fibronectina es una glicoproteina dimérica presente en la matriz extracelular de la mayoría de los tejidos celulares animales, que está compuesta por dos subunidades muy largas unidas por puentes disulfuro situados cerca del extremo carboxilo. Cada subunidad está formada por una serie de dominios funcionalmente distintos separados por regiones polipeptídicas flexibles. Estos dominios están compuestos por módulos más pequeños que, al repetirse secuencialmente y estar codificados por un exón diferente, sugieren que el exón de la fibronectina se originó por duplicaciones exónicas múltiples.
La fibronectina para cultivo celular se encuentra disponible comercialmente: fibronectina humana (referencia PHE0023 de Invitrogen; ref. 354008 de BD; ref. F2006 de Sigma-Aldrich), fibronectina de plasma bovino (ref. 33010-018 de Invitrogen), etc. Las placas de cultivo recubiertas con fibronectina tienen diferentes aplicaciones, tales como
mejorar la fijación, diferenciación y proliferación de diversos tipos celulares. Métodos para tapizar placas de cultivo con polímeros que favorecen la adhesión celular son conocidos en el estado de la técnica. Tales placas también se encuentran disponibles comercialmente (placas de cultivo celular BD BioCoat fibronectina de VWR, microplacas de cultivo celular cubiertas de fibronectina humana de R&D Systems, placas de cultivo celular cubiertas de fibronectina de Millipore, etc.).
En una realización particular de la primera etapa del primer método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular.
La expresión "suero adecuado para el cultivo celular" según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier suero que contenga los componentes necesarios para promover la diferenciación y/o proliferación de células en cultivo. En una forma preferida de realización, el suero adecuado para el cultivo celular es un suero adecuado para el cultivo de EPCs. Estos sueros incluyen, sin limitación, suero fetal bovino, suero humano, suero de ternero, suero bovino adulto, suero de cabra, suero de pollo, suero porcino, suero de conejo, suero de oveja, suero de caballo, suero de cobaya, suero de ratón, suero de rata así como cualquiera de los anteriores sometidos a tratamiento previo tales como, por ejemplo, sueros inactivados con radiación gamma, mediante adsorción en carbón activo o mediante tratamiento a altas temperaturas, sueros tratados para eliminar total o parcialmente las inmunoglobulinas, suero deslipidizado, suero enriquecido en hierro.
La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero adecuado para el cultivo celular se lleva a cabo con dicho suero diluido en el medio de cultivo. En una realización preferida, de la primera etapa del primer método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
Alternativamente, el primer método de la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado. El término "plasma" se refiere a la parte líquida y acelular de la sangre.
La puesta en contacto de la población de MNCs con el suero del paciente al que se le ha administrado el tratamiento cuya eficacia se desea comprobar se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de las células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población de MNC.
Los términos "célula precursora endotelial", "célula progenitora endotelial", "EPC", "célula precursora endotelial circulante" y "CEPC" se usan en la presente invención indistintamente para referirse a células progenitoras con capacidad de diferenciarse a células endoteliales funcionales. Pueden obtenerse a partir de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea. Están caracterizadas por su capacidad para formar túbulos y expresar marcadores característicos de células endoteliales. Entre los marcadores de estas células están CD34, CD133, CD146 o el receptor del factor de crecimiento vascular endotelial 2 (VEGFR2, CD309, KDR) (Urbich C & Dimmeler S Circ Res 2004; 95:343- 353, Churdchomjan W et al. Endocr Disord 2010; 10:5). Pueden diferenciarse EPCs tempranas, identificadas como células que expresan CD34, CD133 y VEGFR2, y EPCs tardías, identificadas como células que han perdido la expresión de CD133 y comienzan a expresar marcadores de linaje endotelial, incluyendo vWF (factor von Willebrand), eNOS (óxido nítrico sintasa endotelial, y Ve-cadherina (vascular endotelial). Las EPCs tempranas tienen una baja capacidad proliferativa y expresan CD14 y CD45, mientras que las EPCs tardías tienen una alta capacidad proliferativa (Napoli C et al. Atherosclerosis 2011; 215:9- 22). El término "diferenciación celular" de la presente invención se refiere al proceso por el que cada tipo celular expresa un perfil génico característico, que marca la capacidad proliferativa de cada tipo celular y su forma de responder a cada tipo de estímulo. Durante
dicho proceso las células sufren modificaciones citológicas que dan lugar a formas y funciones determinadas durante el desarrollo embrionario o durante la vida de un organismo pluricelular, especializándose en un tipo celular. La diferenciación celular supone un proceso biológico de especialización celular que permite que células con información genética idéntica den lugar a células diferentes entre sí, tanto estructural como funcionalmente, de acuerdo a las necesidades del organismo.
El término "condiciones adecuadas para la diferenciación celular", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a las condiciones que permiten que se produzca una diferenciación de las células precursoras a células diferenciadas maduras. Condiciones adecuadas para que tenga lugar la diferenciación de EPCs incluyen, sin limitación, el cultivo en presencia de factores de crecimiento y factores de diferenciación conocidos en la técnica por su capacidad para promover la diferenciación de células precursoras. Factores de crecimiento adecuados incluyen, sin limitación factor de crecimiento de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de granulocitos-macrófago (GM-CSF), factor derivado de células del estroma 1 , factor de crecimiento vascular endothelial (VEGF), TGFP, factor de creceimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoietinas (Ang), factor de crecimiento epidérmico (EGF), proteína morfogénica osean (BMP), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-I), interleuquinas (IL-3, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 e IL-13), factores estimuladores de colonias, trombopoyetina, eritropoyetina, FLT3 ligand y factor de necrosis tumoral (TNF). Otros ejemplos se describen en Dijke et al, "Growth Factors for Wound Healing", Bio/Technology, 7:793-798 (1989); Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF, eds. Clinicians' Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4th ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85; Ziegler T.R., Pierce, G.F., and Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlag. En una segunda etapa, el primer método de la invención comprende determinar el efecto del suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado
sobre la diferenciación de EPCs, en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
En el contexto del primer método de la invención, por un "aumento en el grado de diferenciación celular" se entiende un incremento de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de diferenciación celular de las EPCs en contacto con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular respecto a un cultivo de EPCs en contacto con un suero control.
En una realización particular, el primer método de la invención determina el grado de diferenciación celular de las EPCs mediante un método seleccionado del grupo: contaje del número de colonias de EPCs tempranas, y contaje del número de células endoteliales. El término "colonia celular" hace referencia a un grupo de células con similares características que actúan en conjunto, con la excepción de que su función no es formar una unidad estructural mayor.
El término "colonias tempranas" en la presente referencia hace referencia a las colonias formadas tras 1 o 2 semanas de cultivo de las células mononucleares. Estas células se caracterizan por presentar algunas características de células endoteliales así como características de monocitos. Estas células expresan eNOS, CD45 y CD14 y son KDR+/bajo y CD144+/bajo. Se diferencian de las denominadas colonias tardías en que estas aparecen más tarde (a las 3 o 4 semanas de cultivo), presentan una morfología de guijarros y tienen una alta capacidad proliferativa. Las EPC tardías se caracterizan por expresar vWF, eNOS, P1H12, trombomodulina, flk-1, VE-cadherin, PECAM-I, CD34, CD36 e integrina alphav y ser KDR+ y CD144+ y por ser CD14".
La aparición de colonias tempranas de EPCs puede ser detectado visualmente, es posible confirmar que se trata de colonias de EPCs mediante la determinación de la capacidad de las células de captar LDL acetilado (acLDL) o la capacidad de unir la lectina UEA-1.
Alternativamente, las PEC tempranas se diferencian de las EPC tardías en el tamaño de las colonias que dan lugar. Así, las colonias de EPC tempranas forman colonias menores de 20 μηι de diámetro mientras que las colonias de EPC tardías forman colonias que típicamente tienen diámetros de 20-50 μιη. Se entiende que se ha producido diferenciación a EPC tempranas cuando al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50% de las colonias son colonias de EPC tempranas que presentan una o varias de las características mencionadas anteriormente.
El término "célula endotelial" hace referencia a un tipo de célula aplanada que recubre el interior de los vasos sanguíneos y sobre todo los capilares, formando parte de su pared (también vasos linfáticos, cavidades corporales, etc). Las células endoteliales constituyen el endotelio, un tipo de epitelio plano monoestratificado. Se denomina endotelio vascular al epitelio que tapiza en interior de los vasos sanguíneos y que en los capilares constituye por sí solo la pared de dichos vasos.
Métodos para el contaje celular son ampliamente conocidos por el experto en la materia e incluyen, sin limitarse a, recuento en hemocitómetro, recuento en cámara Neubauer, método de exclusión Trypan Blue, contadores automáticos (tales como Countess Automated Cell Counter de Invitrogen y Coulter Counter de Beckman Coulter,), etc.
El término "suero control" empleado en el primer método de la invención se refiere a un suero obtenido de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna.
En una realización particular, el suero control del primer método de la invención es un suero obtenido a partir de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna. En una realización particular alternativa, el suero control es el suero extraído del sujeto que padece una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado antes de iniciar el tratamiento para dicha patología cardiovascular.
Segundo método de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método (de ahora en adelante segundo método de la invención) para la identificación de un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado dicho tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
Los términos "sujeto", "tratamiento", "patología cardiovascular" y "riesgo cardiovascular" se emplean en el contexto de la segunda invención tal y como han sido definidos anteriormente. En una realización preferida, el tipo de tratamiento se selecciona del grupo formado por un tratamiento farmacológico, un tratamiento dietético y un tratamiento físico, tal como han sido descritos anteriormente. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano.
En el contexto del segundo método de la presente invención, el suj eto es aquel al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado. En una primera etapa del segundo método de la invención, se pone en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) y hasta obtener una población de células endoteliales.
Los términos "célula mononuclear", "suero", "célula endotelial", "célula precursora endotelial" y "diferenciación" se emplean en el contexto de la primera etapa del segundo método de la invención tal y como se han descrito previamente.
En una realización particular del segundo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del segundo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del segundo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares han sido descritos anteriormente. En la primera etapa del segundo método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero de lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del primer método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del primer método de la
invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del primer método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina. Alternativamente, el segundo método de la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado. En una realización particular de la primera etapa del segundo método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero de lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del segundo método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5 : 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
En una segunda etapa del segundo método de la invención, se pone en contacto la población de células endoteliales obtenido en la primera etapa de dicho método con el suero del sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
El término "suero control" empleado en el segundo método de la invención se refiere a un suero obtenido de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna. En una realización particular, el suero control del segundo método de la invención es un suero obtenido a partir de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna. En una realización particular alternativa, el suero control es el suero extraído del sujeto que padece una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado antes de iniciar el tratamiento para dicha patología cardiovascular.
El término "proliferación celular" de la invención se refiere al incremento del número de células mediante división celular.
El término "condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales", según se usa en la presente invención, se refiere a las condiciones (medio de cultivo, temperatura, pH, etc.) que permiten que se produzca un incremento del número de células por división celular. Condiciones adecuadas para que tenga lugar la proliferación de EPCs incluyen, sin limitación, incubación a 37° C y 5% C02, en medio de cultivo que contiene EBM-2 (Endothelial cell Basal Medium-2) suplementado con suero fetal bovino descomplementado o con factores de crecimiento tales como los que aparecen en el EGM-2 SingleQuots (Endothelial Growth Medium-2, todos excepto hidrocortisona). Alternativamente, es posible el uso de suero humano, alogénico o autólogo o plasma suplementado con heparina en lugar de suero bovino fetal. Otros métodos para el cultivo y expansión de EPCs han sido descritos por Jonathan
M. et al., 2003, EJM, 348:593-600; Eggermann, 2003, Cardiovasc Res., 58: 478-86; Hristov, et al, 2003, Trends in Cardiovascular Medicine 13 : 201-6; Arnelia Casamassimi et.al, 2007, J. Biochemistry, 141 : 503-11; la patente en EEUU US5980887 y las solicitudes de patente en EEUU con número de publicación 20030194802, 20060035290, and 2006010385, que se incorporan a la presente solicitud por referencia.
Métodos para determinar condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales están ampliamente recogidos en el estado de la técnica e incluyen, sin limitarse a, contaje del número de células en cultivo, medida de la incorporación de un análogo de nucleótido marcado radiactivamente a la síntesis de DNA de novo, tinción celular y análisis mediante citometría de flujo, detección de antígenos asociados a proliferación como Ki-67, incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU), tinción con yoduro de propidio, reducción de una sal de tetrazolium, etc.
En una realización particular del segundo método de la invención, el grado de proliferación de las células endoteliales se determina mediante contaje del número de células endoteliales. En una realización preferida, el contaje del número de células endoteliales se lleva a cabo mediante inmunodetección usando al menos un anticuerpo específico para un marcador de células endoteliales. En una realización aún más preferida, el marcador de células endoteliales se selecciona del grupo formado por CD146 (melanoma cell adhesión molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (píate let endothelial cell adhesión molecule, PECAM-1), CD144 (vascular endothelial cadheriri).
En el contexto de la presente invención, por un "aumento en el grado de proliferación celular" se entiende un incremento de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de proliferación celular de un cultivo con EPCs puesto en contacto con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular respecto a un cultivo con EPCs en presencia de un suero control.
Método de determinación del riesgo cardiovascular (tercer y cuarto método de la invención)
Tercer método de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método (de ahora en adelante tercer método de la invención) para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs, en donde una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
El término "riesgo cardiovascular" se emplea en el contexto del tercer método de la invención tal como ha sido definido previamente.
El término "sujeto" se ha definido anteriormente. En el contexto del tercer método de la presente invención, el sujeto es aquel cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano. La primera etapa del tercer método de la invención comprende poner en contacto una población de células mononucleares con el suero del sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población.
Los términos "célula mononuclear", "célula precursora endotelial", "diferenciación", y "condiciones adecuadas para la diferenciación" se utilizan tal como han sido definidos anteriormente. Las condiciones adecuadas para la diferenciación celular, así como los métodos para determinar la diferenciación celular han sido descritos previamente.
En una realización particular del tercer método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En
una realización preferida del tercer método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del tercer método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares se han indicado anteriormente.
En la primera etapa del tercer método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del tercer método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del tercer método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del tercer método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
El término "suero" se emplea tal como ha sido definido anteriormente. En una realización particular del tercer método de la invención, el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular quiere determinarse se pone en contacto con la población de células mononucleares. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo. Alternativamente, la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular quiere determinarse.
En una realización particular de la primera etapa del tercer método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho
suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del tercer método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5 : 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
La segunda etapa del tercer método de la invención comprende determinar el efecto del suero del sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse sobre la diferenciación de las EPCs, en donde una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular. En el contexto del tercer método de la invención, por una "disminución del grado de diferenciación celular" se entiende un descenso de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de diferenciación celular de un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control. En una realización particular, el tercer método de la invención determina el grado de diferenciación celular de las EPCs mediante un método seleccionado del grupo: contaje del número de colonias de EPCs tempranas, y contaje del número de células endoteliales. Métodos de contaje de colonias de EPCs tempranas y de contaje del número de células endoteliales se han descrito con anterioridad.
El término "suero control" empleado en el tercer método de la invención se refiere a un suero obtenido de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna o de un sujeto que carece de riesgo cardiovascular. Cuarto método de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método (de ahora en adelante, cuarto método de la invención) para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
El término "riesgo cardiovascular" se emplea en el contexto del cuarto método de la invención tal como ha sido definido previamente. El término "sujeto" se ha definido anteriormente. En el contexto del cuarto método de la presente invención, el sujeto es aquel cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano.
La primera etapa del cuarto método de la invención comprende poner en contacto una población de células mononucleares con el suero del sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones
adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales.
Los términos "célula mononuclear", "célula precursora endotelial", "diferenciación", y "condiciones adecuadas para la diferenciación" se utilizan tal como han sido definidos anteriormente. Las condiciones adecuadas para la diferenciación celular, así como los métodos para determinar la diferenciación celular han sido descritos previamente.
En una realización particular del cuarto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del cuarto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del cuarto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares se han indicado anteriormente.
En la primera etapa del cuarto método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del cuarto método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del cuarto método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del cuarto método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
El término "suero" se emplea tal como ha sido definido anteriormente. En una realización particular del cuarto método de la invención, el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular quiere determinarse se pone en contacto con la población de células
mononucleares. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo.
Alternativamente, la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular quiere determinarse.
En una realización particular de la primera etapa del cuarto método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del cuarto método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v). La segunda etapa del cuarto método de la invención comprende poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la primera etapa de dicho método con el suero del sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
En el contexto del cuarto método de la invención, por una "disminución del grado de proliferación celular" se entiende un descenso de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%), al menos el 20%>, al menos el 25%>, al menos el 30%>, al menos el 35%>, al menos el 40%), al menos el 45%>, al menos el 50%>, al menos el 55%>, al menos el 60%>, al menos el 65%o, al menos el 70%>, al menos el 75%>, al menos el 80%>, al menos el 85%>, al menos el
90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de proliferación celular de un cultivo de células endoteliales obtenidas en la primera etapa y puesto en contacto con el suero de un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control.
En una realización particular, el cuarto método de la invención determina el grado de proliferación celular de las células endoteliales mediante contaje del número de células endoteliales. En una realización preferida, el contaje del número de células endoteliales se lleva a cabo mediante inmunodetección usando al menos un anticuerpo específico para un marcador de células endoteliales. En una realización aún más preferida, el marcador de células endoteliales se selecciona del grupo formado por CD146 (melanoma cell adhesión molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (píate let endothelial cell adhesión molecule, PECAM-1), CD144 (vascular endothelial cadheriri).
El término "suero control" empleado en el tercer método de la invención se refiere a un suero obtenido de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna o de un sujeto que carece de riesgo cardiovascular. Métodos de monitorización de la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado patologías cardiovasculares (quinto y sexto método de la invención)
Quinto método de la invención En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs,
en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento. Los términos "tratamiento", "patología cardiovascular", "riesgo cardiovascular", y
"diferenciación" se emplean tal como han sido definidos previamente.
En una realización preferida del quinto método de la invención, el tipo de tratamiento se selecciona del grupo formado por un tratamiento farmacológico, un tratamiento dietético y un tratami ento físico.
En una realización particular del quinto método de la invención, el tratamiento de tipo farmacológico incluye, sin limitarse a: - fármacos empleados en el tratamiento de las hiperlipoproteinemias, tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa (itarvastatina, NK-104, pitavastatina, rosuvastatina, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, simvastatina), inhibidores de escualeno sintasa y escualeno ciclasa, inhibidores de la proteína microsomal transportadora de triglicéridos (BMS- 201030), inhibidores de la reabsorción de ácidos biliares (colesevelam), activadores de la proteína lipasa (NO- 1886), inhibidores de ACAT (avasimiba, CS-505, F-12511, F-1394, TS-892), inhibidores de la absorción/reabsorción de colesterol (ezetimiba, fitosteroles, fitostanoles), inhibidores del transporte de ácidos biliares en el íleon (S-8921), aumentadores de la síntesis de HDL (CI- 1027), inhibidores de CEPT, agonistas de PPAR α y γ (tiazolidinedionas).
fármacos empleados en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 tales como el inhibidor de la dipeptidil peptidada-4 (DPP-4) sitagliptina,
fármacos empleados en el tratamiento de la hipertensión arterial tales como diuréticos tiazídicos (clortalidona, hidroclorotiazida, indapamida, xipamida), diuréticos de asa (furosemida, piretanida, torasemida), diuréticos distales
(amiloride, espironolactona, triamterene), betabloqueantes (atenolol, bisoprolol, carteolol, celiprolol, metoprolol, nebivolol, oxprenolol, propanolol), alfa-
betabloqueantes (carvedilol, labetalol), antagonistas del calcio dihidropiridínicos (amlodipino, barnidipino, felodipino, isradipino, lacidipino, lercanidipino, manidipino, nicardipino, nifedipino, nisoldipino, nitrendipino), antagonistas del calcio no dihidropiridínicos (diltiazem, verapamil), inhibidores del enzima convertidor de la angiotensina o IECA (benazepril, captopril, cilazapril, enalapril, espirapril, fosinopril, imidapril, perindopril, quinapril, ramipril, trandolapril, zofenopril), antagonistas de los receptores de la angiotensina II o ARA II (candesartán, eprosartán, irbesartán, losartán, olmesaltrán, telmisaltrán, valsartrán) y otros tales como alfabloqueantes (doxazosina, prazosina, terazosina, urapidil), fármacos de acción central (alfametildopa, clonidina, moxonidina) y vasodilatadores arteriales (hidralacina, minoxidil)
fármacos empleados en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca tales como péptidos natriuréticos auriculares (nesiritida, vasonatrida, anaritida, mini A P), inhibidores de vasopeptidasas (omapatrilato, fasidotrilo, mixanprilo, sampatrilato, CGS30440, MDL100,240, Z13752A, antagonistas de los receptores de la endotelina (darusentán, sitasentán, A127722, BQ-123, EMD 1229646/94246, PD151242/182874 para ETA, A192621, BQ788, IRL2500/2659, Ro468443 para ETB, bosentán, enrasertán, tazosentán, BQ-610, L749329/745142, PD145065/142983para ETA/ETB), antagonistas de TNFa (pentoxifilina, FR167653, candesartán, β-bloqueantes), antagonistas de los receptores de la vasopresina (conivaptán, tolvaptán (OPC-41061), OPC-31260, VPA-985, SR- 121463), antagonistas de la aldosterona (eplerenona), antagonistas de los receptores Al (BF9714), simpaticolíticos (nepicastat, nolomirona), fármacos que mejoran el metabolismo cardíaco (carnitina, etoxomir, hormona del crecimiento, ranolazina), antagonistas de los receptores ATI de la angiotensina II (candesartán, eprosartán, forasartán, irbesartán, olmesartán, ripisartán, tasosartán, telmisartán), nuevos inotrópicos positivos (levosimendán), inhibidores de metaloproteinasas (hidroxamatos como batimastat, ilomastat, marimastat y prinomastat, β-bloqueantes, glucocorticoides, tetraciclinas, CP-471,474, PD 166793), antagonistas de la plasmina.
fármacos empleados en el tratamiento de los síndromes coronarios agudos, tales como anticoagulantes (inhibidores de la antitrombina III como las heparinas de
bajo peso molecular ardeparina, certoparina, nadroparina, logiparina, parnaparina, reviparina y tedelparina, y la antitrombina III recombinante; inhibidores del complejo factor tisular (TF)-factor Vlla tales como mutantes del TF, anticuerpos anti-TF, sobreexpresión del inhibidor de la vía del TFrPI, NaPc2 e inhibidores del factor VII; inhibidores de la trombina tales como los inhibidores del factor Xa antistatina, TAP (tick anticoagulant peptide), DX9065, lefaxina, fondaparinux, terostatina, YM-75466 y ZK-807834, anticuerpos contra el factor IXa y Xa, activadores de la vía de la proteína C e inhibidores selectivos de la trombina como argatrobán, bivaluridina, efegatrán, H376/95, hirugén, inogatrán, melagatrán, napsagatrán, UK- 156406 y ximelagatrán), antiagregantes plaquetarios (XV459, roxifibán), fibrinolíticos y fármacos cardioprotectores. fármacos empleados en el tratamiento del proceso inflamatorio de la placa de ateroma tales como antagonistas de la interacción leucocito-endotelio, de selectina, integrinas y citoquinas; inhibidores de la expresión de moléculas de adhesión o la activación de F-KB.
fármacos empleados en el tratamiento de las arritmias tales como bloqueantes selectivos de la (dofetilida, ibutilida, trecetilida), bloqueantes de la Iio- y de los Ρνβ ΐ (sotalol, ersentalida), bloqueantes selectivos de la IKUT y fármacos con múltiples acciones (ambasilida, azimilida, BRL-32872, clofilium, ibutilida, dronedarona, tedisamilo, trecetilida).
En una realización particular del primer método de la invención, el tratamiento de tipo dietético incluye, sin limitarse a: consumo de vino tinto, té verde, astralagus, extracto de GojiBerry, Lactobacillus fermentum, ácido elágico, beta-l,3-glucano, vitamina D3 (Stem- Kine, RBC Life), ácidos grados omega 3, dieta mediterránea y dieta suplementada con flavonoides de cacao.
En una realización particular del primer método de la invención, el tratamiento de tipo físico incluye, sin limitarse a: ejercicio físico, CPAP (presión positiva continua en la vía aérea), stent coronario, transplante de EPCs autólogas, transplante de EPCs transcoronarias, infusión intracoronaria de EPCs.
En la presente invención, el término "monitorizar la respuesta" se refiere a un seguimiento de la evolución de una patología, en particular de una patología cardiovascular o de una patología que conlleva un riesgo de patología cardiovascular. En la presente invención se entiende por "sujeto" cualquier animal clasificado como mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano de sexo femenino o masculino y de cualquier raza o edad. En el contexto del tercer método de la presente invención, el sujeto es un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano.
La primera etapa del quinto método de la invención comprende poner en contacto una población de células mononucleares con el suero del sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población. Los términos "célula mononuclear", "célula precursora endotelial", "diferenciación", y "condiciones adecuadas para la diferenciación" se utilizan tal como han sido definidos anteriormente. Las condiciones adecuadas para la diferenciación celular, así como los métodos para determinar la diferenciación celular han sido descritos previamente. En una realización particular del quinto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del quinto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del quinto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares se han indicado anteriormente.
En la primera etapa del quinto método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del quinto método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del quinto método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del quinto método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
El término "suero" se emplea tal como ha sido definido anteriormente. En una realización particular del quinto método de la invención, el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse se pone en contacto con la población de células mononucleares. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo.
Alternativamente, la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse.
En una realización particular de la primera etapa del quinto método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero
de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del quinto método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
La segunda etapa del quinto método de la invención comprende determinar el efecto del suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse sobre la diferenciación de las EPCs, en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento. En el contexto de la presente invención, por un "aumento del grado de diferenciación celular" se entiende un aumento de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de diferenciación celular de un cultivo con EPCs puesto en contacto con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular quiere monitorizarse con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero de dicho sujeto antes de ser tratado.
En una realización particular, el quinto método de la invención determina el grado de diferenciación celular de las EPCs mediante un método seleccionado del grupo: contaje del número de colonias de EPCs tempranas, y contaje del número de células endoteliales. Métodos de contaje de colonias de EPCs tempranas y de contaje del número de células endoteliales se han descrito con anterioridad.
Sexto método de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método (de ahora en adelante sexto método de la invención) para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento.
Los términos "tratamiento", "monitorizar la respuesta", "patología cardiovascular", "riesgo cardiovascular", "diferenciación" y "proliferación" se emplean tal como han sido definidos previamente.
En la presente invención se entiende por "sujeto" cualquier animal clasificado como mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano de sexo femenino o masculino y de cualquier raza o edad. En el contexto del sexto método de la presente invención, el sujeto es un sujeto cuyo riesgo cardiovascular pretende determinarse. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano. La primera etapa del sexto método de la invención comprende poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva
un riesgo cardiovascular asociado pretende monitorizarse, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales.
Los términos "célula mononuclear", "célula precursora endotelial", "diferenciación", y "condiciones adecuadas para la diferenciación" se utilizan tal como han sido definidos anteriormente. Las condiciones adecuadas para la diferenciación celular, así como los métodos para determinar la diferenciación celular han sido descritos previamente.
En una realización particular del sexto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del sexto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del sexto método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares se han indicado anteriormente. En la primera etapa del sexto método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del sexto método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del sexto método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del sexto método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
El término "suero" se emplea tal como ha sido definido anteriormente. En una realización particular del sexto método de la invención, el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse se pone en contacto con la población de células mononucleares. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo.
Alternativamente, la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse.
En una realización particular de la primera etapa del sexto método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular pretende monitorizarse en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con el suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del quinto método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
La segunda etapa del sexto método de la invención comprende poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en primera etapa de dicho método con el suero del sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o a una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado pretende monitorizarse, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de
las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento.
En el contexto de la presente invención, por un "aumento del grado de proliferación celular" se entiende un aumento de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de proliferación celular de las células endoteliales en contacto con el suero de un sujeto cuya respuesta a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular quiere monitorizarse con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado En una realización particular, el sexto método de la invención determina el grado de diferenciación celular mediante contaje del número de células endoteliales. En una realización preferida, el contaje del número de células endoteliales se lleva a cabo mediante inmunodetección usando al menos un anticuerpo específico para un marcador de células endoteliales. En una realización aún más preferida, el marcador de células endoteliales se selecciona del grupo formado por CD146 (melanoma cell adhesión molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (platelet endothelial cell adhesión molecule, PECAM-1), CD144 (vascular endothelial cadheriri).
Métodos de terapia personalizada (séptimo y octavo métodos de la invención)
Séptimo método de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto en condiciones adecuadas para la diferenciación de las EPCs presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre el grado de diferenciación celular de dichas EPCs
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto al grado de diferenciación de un cultivo de dicha población puesto en contacto con un suero control. Alternativamente, la invención se relaciona con un compuesto terapéutico vascular para su uso en el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto en condiciones adecuadas para la diferenciación de las EPCs presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre el grado de diferenciación celular de dichas EPCs
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto al grado de diferenciación de un cultivo de dicha población puesto en contacto con un suero control.
Alternativamente, la invención se relaciona con un método para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho tratamiento se aplica a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto en condiciones adecuadas para la diferenciación de las EPCs presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre el grado de diferenciación celular de dichas EPCs
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto al grado de diferenciación de un cultivo de dicha población puesto en contacto con un suero control. Los términos "tratamiento", "patología cardiovascular" y "riesgo cardiovascular se emplean en el contexto del séptimo método de la invención tal como han sido definidos anteriormente.
En el contexto del séptimo método de la presente invención, el sujeto es aquel identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano.
El término "compuesto terapéutico vascular" se define como aquel compuesto que es utilizado para aliviar o eliminar la patología cardiovascular o la patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, o reducir o eliminar uno o más síntomas asociados a dicha patología, o aliviar o eliminar las secuelas fisiológicas de la enfermedad.
En la primera etapa del séptimo método de la invención, se pone en contacto una población de células mononucleares con el suero del sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular, en condiciones adecuadas para la diferenciación de las EPCs presentes en dicha población.
Los términos "célula mononuclear", "célula precursora endotelial", "diferenciación celular" y "condiciones adecuadas para la diferenciación celular" han sido definidos previamente. Condiciones adecuadas para la diferenciación celular, así como métodos para determinar la diferenciación celular han sido descritos anteriormente.
Los modos de administración de un compuesto incluyen, sin limitarse a, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. La vía de administración más adecuada en cualquier caso dado depende de la duración del estado del sujeto, la longitud del tratamiento deseado, la naturaleza y la gravedad del estado
que está tratándose, y la formulación particular que está usándose. Una revisión de diferentes métodos de administración de compuestos, principios activos, excipientes que van a usarse y procedimientos para producirlos pueden encontrarse en "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.
En una realización particular del séptimo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del séptimo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del séptimo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la primera etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares se han indicado anteriormente. En la primera etapa del séptimo método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero del sujeto se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del séptimo método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del séptimo método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del séptimo método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
El término "suero" se emplea tal como ha sido definido anteriormente. En una realización particular del séptimo método de la invención, el suero de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular se pone en contacto con la población de células mononucleares. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo.
Alternativamente, la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular.
En una realización particular de la primera etapa del séptimo método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con dio suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del séptimo método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
En la segunda etapa del séptimo método de la invención, se determina el efecto de del suero del sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular sobre el grado de diferenciación celular de dichas EPCs, en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de diferenciación celular de las células EPCs con respecto al grado de diferenciación de un cultivo de dicha población puesto en contacto con un suero control. En el contexto de la presente invención, por una "disminución del grado de diferenciación celular" se entiende un descenso de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso más en el grado de diferenciación celular de las EPCs con respecto al grado de diferenciación resultante de la puesta en contacto de dicha población con un suero control.
En una realización particular, el séptimo método de la invención determina el grado de diferenciación celular de las EPCs mediante un método seleccionado del grupo: contaje del número de colonias de EPCs tempranas, y contaje del número de células endoteliales. Métodos de contaje de colonias de EPCs tempranas y de contaje del número de células endoteliales se han descrito con anterioridad.
El término "suero control" empleado en el séptimo método de la invención se refiere a un suero obtenido a partir de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna.
En una realización particular del séptimo método de la invención, el tipo de tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto se selecciona del grupo formado por farmacológico, dietético o físico.
En una realización preferida, el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado para el que se usa un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento es de tipo farmacológico.
En una realización particular del séptimo método de la invención, el tratamiento de tipo farmacológico incluye, sin limitarse a: fármacos empleados en el tratamiento de las hiperlipoproteinemias,
- fármacos empleados en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2,
fármacos empleados en el tratamiento de la hipertensión arterial,
fármacos empleados en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca,
fármacos empleados en el tratamiento de los síndromes coronarios agudos, fármacos empleados en el tratamiento del proceso inflamatorio de la placa de ateroma,
fármacos empleados en el tratamiento de las arritmias,
tales como los indicados anteriormente.
Alternativamente, el séptimo método de la invención se relaciona con un método para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, en donde dicho tratamiento puede ser de tipo dietético o físico.
En una realización particular del séptimo método de la invención, el tratamiento de tipo dietético incluye, sin limitarse a: consumo de vino tinto, té verde, astralagus, extracto de GojiBerry, Lactobacillus fermentum, ácido elágico, beta-l,3-glucano, vitamina D3 (Stem- Kine, RBC Life), ácidos grados omega 3, dieta mediterránea y dieta suplementada con flavonoides de cacao.
En una realización particular del séptimo método de la invención, el tratamiento de tipo físico incluye, sin limitarse a: ejercicio físico, CPAP (presión positiva continua en la vía aérea), stent coronario, transplante de EPCs autólogas, transplante de EPCs transcoronarias, infusión intracoronaria de EPCs.
Octavo método de la invención
La invención se relaciona en un último lugar con el uso de un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(iii) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(iv) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales,
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control.
Alternativamente, la invención se relaciona con un compuesto terapéutico vascular para su uso en el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control.
Alternativamente, la invención se relaciona con un método para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho tratamiento se aplica a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales,
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control. Los términos "tratamiento", "compuesto terapéutico vascular", "patología cardiovascular" y "riesgo cardiovascular se emplean en el contexto del octavo método de la invención tal como han sido definidos anteriormente.
En la presente invención se entiende por "sujeto" cualquier animal clasificado como mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano de sexo femenino o masculino y de cualquier raza o edad. En el contexto del octavo método de la presente invención, el sujeto es un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular. En una realización preferida, el sujeto de la invención es un ser humano.
En la primera etapa del octavo método de la invención, se pone en contacto una población de células mononucleares con el suero del sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular, en condiciones adecuadas para la diferenciación de de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales.
Los términos "célula mononuclear", "célula precursora endotelial", "diferenciación celular" y "condiciones adecuadas para la diferenciación celular" han sido definidos previamente. Condiciones adecuadas para la diferenciación celular, así como métodos para determinar la diferenciación celular han sido descritos anteriormente.
En una realización particular del octavo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical. En una realización preferida del octavo método de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre. En una realización aún más preferida del octavo método
de la invención, las células mononucleares proceden de una muestra de sangre autóloga o de una muestra de cordón umbilical autóloga con respecto al suero que se usa en la octavoa etapa de dicho método. Métodos para la purificación de células mononucleares se han indicado anteriormente.
En la primera etapa del octavo método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con dicho suero del sujeto se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo. En una realización particular de la primera etapa del octavo método de la invención, la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo. En una realización preferida de la primera etapa del octavo método de la invención, la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular. En una realización aún más preferida de la primera etapa del octavo método de la invención, el polímero que promueve la adhesión celular es fibronectina.
El término "suero" se emplea tal como ha sido definido anteriormente. En una realización particular del séptimo método de la invención, el suero de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular se pone en contacto con la población de células mononucleares. La puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo con dicho suero diluido en medio de cultivo. Alternativamente, la invención también contempla que la población de células mononucleares se ponga en contacto con el plasma de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular.
En una realización particular de la primera etapa del octavo método de la invención, la población de células mononucleares se pone en contacto con el suero de un sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular en presencia de un suero adecuado para el cultivo celular. La puesta en
contacto de la población de células mononucleares con dicho suero se lleva a cabo con dio suero diluido en medio de cultivo. El suero adecuado para el cultivo celular comprende, sin limitarse a, suero fetal bovino y suero de caballo. En una realización preferida, de la primera etapa del octavo método de la invención, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 10: 1; 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 3 : 1, 2: 1, 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o 1 : 10 (v/v). En una forma preferida de realización, la relación del suero del sujeto y el suero adecuado para el cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
En la segunda etapa del octavo método de la invención, se pone en contacto la población de células endoteliales obtenidas en primera etapa de dicho método con el suero del sujeto identificado mediante el método de la invención y al que se administra el compuesto terapéutico vascular, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control.
En el contexto de la presente invención, por una "disminución del grado de proliferación celular" se entiende un descenso de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%), al menos el 45%>, al menos el 50%>, al menos el 55%>, al menos el 60%>, al menos el 65%), al menos el 70%>, al menos el 75%>, al menos el 80%>, al menos el 85%>, al menos el 90%), al menos el 95%> o incluso más en el grado de proliferación celular de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control.
El término "suero control" empleado en el séptimo método de la invención se refiere a un suero obtenido a partir de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna.
En una realización particular, el octavo método de la invención determina el grado de diferenciación celular mediante contaje del número de células endoteliales. En una
realización preferida, el contaje del número de células endoteliales se lleva a cabo mediante inmunodetección usando al menos un anticuerpo específico para un marcador de células endoteliales. En una realización aún más preferida, el marcador de células endoteliales se selecciona del grupo formado por CD146 (melanoma cell adhesión molecule, MCAM), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), CD31 (platelet endothelial cell adhesión molecule, PECAM-1), CD144 (vascular endothelial cadheriri).
En una realización particular del octavo método de la invención, el tipo de tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto se selecciona del grupo formado por farmacológico, dietético o físico.
El tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado para el que se usa un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento es de tipo farmacológico.
En una realización particular del octavo método de la invención, el tratamiento de tipo farmacológico incluye, sin limitarse a: - fármacos empleados en el tratamiento de las hiperlipoproteinemias,
fármacos empleados en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2,
fármacos empleados en el tratamiento de la hipertensión arterial,
fármacos empleados en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca,
fármacos empleados en el tratamiento de los síndromes coronarios agudos, - fármacos empleados en el tratamiento del proceso inflamatorio de la placa de ateroma,
fármacos empleados en el tratamiento de las arritmias,
tales como los indicados anteriormente. Alternativamente, el octavo método de la invención se relaciona con un método para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, en donde dicho tratamiento puede ser de tipo dietético o físico.
En una realización particular del octavo método de la invención, el tratamiento de tipo dietético incluye, sin limitarse a: consumo de vino tinto, té verde, astralagus, extracto de GojiBerry, Lactobacillus fermentum, ácido elágico, beta-l,3-glucano, vitamina D3 (Stem- Kine, RBC Life), ácidos grados omega 3, dieta mediterránea y dieta suplementada con flavonoides de cacao.
En una realización particular del octavo método de la invención, el tratamiento de tipo físico incluye, sin limitarse a: ejercicio físico, CPAP (presión positiva continua en la vía aérea), stent coronario, transplante de EPCs autólogas, transplante de EPCs transcoronarias, infusión intracoronaria de EPCs.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLOS
MATERIALES Y METODOS Células y sueros empleados en los ensayos
En la realización de los ensayos se emplean:
- células mononucleadas de sangre periférica o de cordón umbilical de sujetos sanos para el cultivo de las células precursoras del endotelio (EPCs). La diferencia entre utilizar células mononucleadas de sangre periférica o de cordón umbilical es que en el caso de cordón umbilical las EPCs se obtienen antes
- suero de sujetos sanos como control del experimento
- suero de pacientes con una patología relacionada con un aumento del estrés oxidativo o con un proceso inflamatorio crónico como pueden ser: insuficiencia renal crónica, apnea del sueño, artritis reumatoide, preclampsia, hipertensión, enfermedad cardiovascular, etc.
Medios empleados para el aislamiento de EPCs
Se emplearon suero fisiológico o PBS IX, disolución 6% ACD (22,3 g de glucosa, 22 g de citrato sódico y 8 g ácido cítrico para 1 1 de disolución), tampón de aislamiento (50 mi de disolución 6% ACD, 2,5 g BSA, 450 mi de PBS para 0,5 1 de disolución) y medio de aislamiento o medio K (395 mi de EBM-2, 90 mi suero fetal bovino descomplementado, 5 mi glutamina-penicilina-estreptomicina lOOx y EGM-2 SingleQuots (todos excepto hidrocortisona) para 0,5 1 de disolución). Metodología empleada para el aislamiento de EPCs
Las muestras de sangre periférica de adultos se obtuvieron de voluntarios donantes de acuerdo con un protocolo aprobado por el Hospital Universitario Virgen de Roció y se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y en virtud de un protocolo aprobado por el Comité de Investigación Clínica. Tanto las EPC derivadas de la sangre cordón umbilical como las EPCs derivados de la sangre periférica de adulto se obtuvieron a partir de las fracción de las células mononucleares (MNC).
Se obtuvieron células mononucleadas de sangre periférica tal como se indica en WO2008077094. Para ello, se extrajeron entre 20-40 mi de sangre total, procedente bien de sangre de cordón umbilical, añadiendo 1 mi de heparina en una jeringa antes de extraer la sangre de cordón umbilical, o bien de sangre periférica de adulto, utilizando tubos con heparina al extraer la sangre con agujas con mariposa. Se añadieron, en tubos de 50 mi, 10 mi de tampón de aislamiento por cada 20 mi de sangre empleada. Se prepararon tubos de 50 mi con 15 mi de Ficoll, a los que se añadieron la mezcla de sangre y tampón de aislamiento sin romper el gradiente. Se centrifugó a 2700 rpm durante 15 minutos y sin freno. A continuación se recogió el plasma autólogo, tomando el sobrenadante (unos 10-15 mi) con cuidado de no extraer la capa de células, pudiendo congelarse a -20°C en caso de no utilizarse de inmediato. Se recogió después la capa de células mononucleares (capa blanca) y se transfirió a tubos de 50 mi, añadiéndose 5 mi de tampón de aislamiento por cada 10 mi de células recogidas. Se centrifugó a 2700 rpm durante 5 minutos y a continuación se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 10 mi de tampón de aislamiento para hacer un
lavado (centrifugación durante 10 min a 1200 rpm y eliminación del sobrenadante). Se añadieron 2 mi de tampón de aislamiento para resuspender las células y 6 mi de cloruro de amonio para lisar los eritrocitos. Tras 5-10 min de incubación a 4°C se añadieron 5 mi de tampón de aislamiento, se homogeneizó y centrifugó a 1200 rpm durante 5 min. Se añadieron nuevamente 10 mi de tampón de aislamiento y se centrifugó a 1200 rpm durante 5 min. Tras eliminar el sobrenadante se resuspendió el pellet en 12 mi de medio K. Se sembraron 2 mi de esta suspensión celular en placas de 6 pocillas recubiertas con fibronectina, añadiéndose en cada pocilio 300 μΐ del plasma autólogo anteriormente obtenido. Las células fueron incubadas a 37°C y 5% C02 durante 48h, tras las cuales se retiró el medio y se añadió medio K fresco. Este último paso se repitió cada 2 o 3 días. Entre los 7 y 14 días después se obtuvieron las EPCs tempranas. Entre los 20 y los 25 días después se obtuvieron las colonias endoteliales.
Estudio de la viabilidad y capacidad de diferenciación de las EPCs como método diagnóstico de riesgo cardiovascular
Las células se obtuvieron a partir de muestras de sangre de cordón umbilical o de sangre periférica de adulto tal como se ha descrito anteriormente, con la diferencia de que fueron finalmente resuspendidas en 3,4 mi de medio de aislamiento 2 o K-2 (395 mi de EBM-2, 15 mi de suero fetal bovino descomplementado, 5 mi de glutamina-penicilina- estreptomicina lOOx y EGM-2 SingleQuots (todos excepto hidrocortisona) para 0,5 1 de medio) en lugar de medio K como en el caso anterior. Las células se sembraron en placas recubiertas con fibronectina, añadiéndose 1,7 mi de suspensión celular junto con 0,3 mi de suero fetal bovino en el caso del pocilio control o junto con 0,3 mi de suero del paciente en el caso del pocilio a evaluar. Las células fueron incubadas a 37°C y 5% C02. Tras 48h en cultivo se retiró el medio y se añadió medio fresco junto con el correspondiente suero como se ha indicado anteriormente, y a continuación se repitió cada 2-3 días. Si las células procedían de muestras de cordón umbilical, las EPCs tempranas aparecieron en los primeros 7 días, y entre 7-14 días después (al menos en el control) se observaron las colonias endoteliales.
Opcionalmente, las células se congelaron tras su obtención para su almacenamiento y posterior uso.
Identificación y recuento de las colonias de EPC tempranas.
En el día 7, el número de colonias de células adherentes se cuentan por dos observadores en un microscopio de fluorescencia invertido (Eclipse Ti-S, Nikon Instruments Europe BV, Badhoevedorp, Países Bajos). Caracterización del Fenotipo de las EPC
Entre las 3 y 4 semanas posteriores caracterizamos el fenotipo de las EPC. Las células fueron separadas mediante un raspado celular, y dispersión mecánica suave por pipeteo. Las células fueron lavadas con medio EBM-2. Un total de Ι χ ΙΟ6 células fueron incubadas durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C con los siguientes anticuerpos monoclonales (mAb) con las concentraciones recomendadas por el fabricante: anti-CD144 MAB marcado con fluoresceína (FITC), (Serotec, 22 de Bankside Enfoque de la estación de Kidlington, Reino Unido), anti-CD34 MAB marcado con PerCp (TC) (Caltag, Invitrogen, San Diego, CA), anti-VEGFR-2 MAB/KDR-PE (RD Systems, Minneapolis). Se utilizaron los controles de isotipo correspondiente. El análisis cuantitativo se realizó en un citómetro de flujo FACS Calibur donde se adquirieron Ι χ ΙΟ5 células por muestra. Los datos fueron analizados utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson). El número de EPC se definió como eventos triple positivo para CD34, CD144, y KDR con baja granularidad citoplásmica.
Determinación del grado de proliferación y/o diferenciación de las EPCs en cultivo
La proliferación de las EPC se analizó después de tres semanas de cultivo con los sueros de los sujetos. El efecto de los sueros sobre la proliferación de las EPC, se evaluó mediante el kit de PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación) (BD Pharmingen, San Diego, CA) y la cuantificación se realizó por citometría de flujo (Citómetro FACS Calibur, Becton Dickinson, San José, CA).
Los resultados obtenidos en el mareaje con PCNA fueron los siguientes: se observó un 28,3% de células proliferando en muestras de EPCs en pre-tratamiento, frente a un 63,1% de células proliferando en muestras de EPCs en post-tratamiento.
Para estudiar el grado de diferenciación se analizó la expresión de diferentes receptores característicos de las diferentes etapas de maduración/diferenciación de las células endoteliales, tales como VEGFR2 (receptor de factor de crecimiento vascular endotelial 2), que se expresa desde etapas muy tempranas, y CD146, que se expresa en etapas más tardías.
Entre la semana 2 y 3, se observó que un 26,3% de las células en pre-tratamiento expresaban VEGFR2, frente a un 72,4% de de las células en post-tratamiento, lo cual es indicativo de que el plasma de los pacientes antes del tratamiento dificulta la diferenciación de estas células.
RESULTADOS
Análisis de la capacidad de formación de colonias en presencia de suero de los pacientes
Al analizar el número de colonias formadas en presencia de una mezcla de sueros de pacientes con una patología antes y después de un tratamiento, se observó que tras el tratamiento hay un aumento significativo del número de colonias respecto a cuando los pacientes no reciben el tratamiento (Figura 1 y 2). Este aumento del número de colonias no llega a alcanzar el de los controles.
-Análisis del fenotipado de las EPCs
Se observó un mayor porcentaje de células con expresión de VEGFR2 en los casos donde se utilizó suero post-tratamiento comparado con pre-tratamiento (Figura 4). Los valores no alcanzaron el del caso control.
-Evaluación de la Proliferación celular
Se observó un mayor porcentaje de células proliferando cuando se utilizó el suero en pacientes post-tratamiento comparado con pre-tratamiento, siendo la diferencia estadísticamente significativa (Figura 5).
EJEMPLO 1.- Estudio de la evolución vascular en una población con apnea del sueño (SAOS) tras tratamiento con CPAP Entre la primera y segunda semana de cultivo de las MNC (obtenidas de un sujeto control, sin antecedentes de riesgo cardiovascular), se observó, que tras cultivar estas células con el suero de pacientes SAOS, pre-tratamiento, se generaba un menor número de colonias por pocilio (conocidas como EPC tempranas), frente al mismo cultivo de células, cultivadas con el suero de los mismos pacientes tras el tratamiento con CPAP de tres meses de duración (Figura 6).
Así mismo, se observo entre la 3 y 4 semana, en los pocilios cultivados con el suero de los pacientes tras el tratamiento con CPAP, la formación de unas monocapa constituidas por células endoteliales maduras de mayor confluencia que las formada en los pocilios cultivados con el suero de los pacientes pre-tratamiento, en los cuales en algunos pocilios ni siquiera se observo la formación de esta capa (Figura 7).
Entre los parámetros que pueden determinarse tras 4 semanas del cultivo de EPCs se tienen: expresión génica, expresión proteica, caracterización por citometría de flujo y pruebas de migración e inserción en matriz angiogénica. Con resultados similares a los descritos previamente en la población anterior.
EJEMPLO 2.- Estudio de la evolución vascular en una población hipertensa sometida a un tratamiento dietético crónico y agudo Los resultados obtenidos fueron similares a los descritos previamente en el estudio de la población SAOS sometida a un tratamiento con CPAD.
Claims
Un método para la identificación de un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado dicho tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
Un método según la reivindicación 1 en donde el tipo de tratamiento se selecciona del grupo formado por un tratamiento farmacológico, un tratamiento dietético y un tratamiento físico.
Un método según las reivindicaciones 1 o 2 en donde el suero control es el suero de dicho sujeto antes del tratamiento o el suero de un sujeto sano.
Un método para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs, en donde una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
5. Un método según la reivindicación 4 en donde el suero control es el suero de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna o de un sujeto que carece de riesgo cardiovascular.
6. Un método para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre la diferenciación de las EPCs, en donde un aumento en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento.
7. Un método según la reivindicación 6 en donde el tipo de tratamiento se selecciona del grupo formado por un tratamiento farmacológico, un tratamiento dietético y un tratamiento físico.
8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el grado de diferenciación de las EPCs se mide mediante un método seleccionado del grupo de (i) contaje del número de colonias de EPCs tempranas y (ii) contaje del número de células endoteliales.
9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo.
10. Un método según la reivindicación 9 en donde la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular.
11. Un método según la reivindicación 10 en donde dicho polímero es fibronectina.
Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde la etapa (i) lleva a cabo en presencia de un suero adecuado para cultivo celular.
13. Un método según la reivindicación 12 en donde la relación de suero del sujeto y suero adecuado para cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra del cordón umbilical.
15. Un método según la reivindicación 14 en donde la sangre o el cordón umbilical son autólogos con respecto al suero que se usa en la etapa (i).
16. Un método según las reivindicaciones 14 y 15 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre.
17. Un método para la identificación de un tratamiento adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en un sujeto, que comprende:
poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de un sujeto al que se le ha aplicado dicho tratamiento, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) y hasta obtener una población de células endoteliales,
poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de
que dicho tratamiento es adecuado para una patología cardiovascular o para una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado.
18. Un método según la reivindicación 17 en donde el tipo de tratamiento se selecciona del grupo formado por un tratamiento farmacológico, un tratamiento dietético y un tratamiento físico.
19. El método según la reivindicación 17 o 18 en donde el suero control es el suero de dicho sujeto antes del tratamiento o el suero de un sujeto sano.
20. Un método para la determinación del riesgo cardiovascular en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con un suero control, es indicativo de que dicho sujeto tiene un alto riesgo cardiovascular.
21. Un método según la reivindicación 20 en donde el suero control es el suero de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna o de un sujeto que carece de riesgo cardiovascular.
22. Un método para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento encaminado a tratar una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado, que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde un aumento en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto a un cultivo de EPCs puesto en contacto con el suero del sujeto antes de ser tratado es indicativo de que dicho sujeto responde a dicho tratamiento.
23. Un método según la reivindicación 22 en donde el tipo de tratamiento se selecciona del grupo formado por un tratamiento farmacológico, un tratamiento dietético y un tratami ento fí si co .
24. El método según las reivindicaciones 22 o 23 en donde el suero control es el suero de dicho sujeto antes del tratamiento o el suero de un sujeto sano.
25. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24 en donde la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo.
26. Un método según la reivindicación 25 en donde la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular.
27. Un método según la reivindicación 26 en donde dicho polímero es fibronectina.
28. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27 en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un suero adecuado para cultivo celular.
Un método según la reivindicación 28 en donde la relación de suero del sujeto y suero adecuado para cultivo celular es de al menos 3 : 1 (v/v).
Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 29 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra del cordón umbilical.
31. Un método según la reivindicación 30 en donde la sangre o el cordón umbilical son autólogos respecto al suero que se usa en la etapa (i).
32. Un método según las reivindicaciones 30 y 31 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre.
Un método según la reivindicación 32 en donde el grado de proliferación de las células endoteliales se mide mediante contaje del número de células endoteliales.
34. Un método según la reivindicación 33 en donde el contaje de células endoteliales se lleva a cabo usando mediante inmunodetección usando al menos un anticuerpo específico para un marcador de células endoteliales.
35. El método según la reivindicación 34 en donde dicho marcador se selecciona del grupo formado por CD146, VEGFR2, CD31 y CD144.
36. Uso de un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto en condiciones adecuadas para la diferenciación de las EPCs presentes en dicha población y
(ii) determinar el efecto de dicho suero sobre el grado de diferenciación celular de dichas EPCs
en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de diferenciación de las EPCs con respecto al grado de diferenciación de un cultivo de dicha población puesto en contacto con un suero control.
37. Uso según la reivindicación 36 en donde el suero control es el suero de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna.
38. Uso según la reivindicación 36 o 37 en donde el grado de diferenciación de las EPCs se mide mediante un método seleccionado del grupo de (i) contaje del número de colonias de EPCs tempranas y (ii) contaje del número de células endoteliales.
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38 en donde la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero se lleva a cabo en una placa de cultivo.
40. Uso según la reivindicación 39 en donde la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular.
41. Uso según la reivindicación 40 en donde dicho polímero es fibronectina.
42. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41 en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un suero adecuado para cultivo celular.
43. Uso según la reivindicación 42 en donde la relación de suero del sujeto y suero control es de al menos 3 : 1 (v/v).
44. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 43 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra del cordón umbilical.
45. Uso según la reivindicación 44 en donde la sangre o el cordón umbilical son autólogos con respecto al suero que se usa en la etapa (i).
46. Uso según las reivindicaciones 44 y 45 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre.
47. Uso de un compuesto terapéutico vascular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología cardiovascular o una patología que conlleva un riesgo cardiovascular asociado en donde dicho compuesto se administra a un sujeto identificado mediante un método que comprende
(i) poner en contacto una población de células mononucleares con el suero de dicho sujeto, en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la diferenciación de de células precursoras endoteliales (EPCs) presentes en dicha población y hasta obtener una población de células endoteliales,
(ii) poner en contacto la población de células endoteliales obtenidas en la etapa (i) con el suero de dicho sujeto en donde dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de células endoteliales, en donde el sujeto se selecciona si el suero provoca una disminución en el grado de proliferación de las células endoteliales con respecto al grado de proliferación de un cultivo de dicha población en contacto con un suero control.
48. Uso según la reivindicación 47 en donde el suero control es el suero de un sujeto sano o de un sujeto que no padece patología cardiovascular alguna.
49. Uso según las reivindicaciones 47 o48 en donde la puesta en contacto de la población de células mononucleares con el suero de se lleva a cabo en una placa de cultivo.
50. Uso según la reivindicación 49 en donde la placa de cultivo se encuentra recubierta de un polímero que promueve la adhesión celular.
51. Uso según la reivindicación 50 en donde dicho polímero es fibronectina.
52. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51 en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un suero adecuado para cultivo celular.
53. Uso según la reivindicación 52 en donde la relación de suero del sujeto y suero control es de al menos 3 : 1 (v/v).
54. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 53 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra del cordón umbilical.
55. Uso según la reivindicación 54 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre o de una muestra de cordón umbilical.
56. Uso según la reivindicación 55 en donde la sangre o el cordón umbilical son autólogos con respecto al suero que se usa en la etapa (i).
57. Uso según las reivindicaciones 55 o 56 en donde las células mononucleares proceden de una muestra de sangre.
58. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 57 en donde el grado de proliferación de las EPCs se mide mediante contaje del número de células endoteliales.
59. Uso según la reivindicación 58 en donde el contaje de células endoteliales se lleva a cabo usando mediante inmunodetección usando al menos un anticuerpo específico para un marcador de células endoteliales.
60. Uso según la reivindicación 59 en donde dicho marcador se selecciona del grupo de formado por CD146, VEGFR2, CD31 y CD144.
61. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 60 en donde el sujeto es un ser humano.
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US20070161552A1 (en) * | 2004-01-23 | 2007-07-12 | Bahlmann Ferdinand H | Use of low-dosage erythropoietin for stimulation of endothelial progenitor cells, for organ regeneration and for slowing the progression of end-organ damage |
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