WO2013017788A1 - Use of lithium and the derivatives thereof for assaying alkaloids - Google Patents

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WO2013017788A1
WO2013017788A1 PCT/FR2012/051788 FR2012051788W WO2013017788A1 WO 2013017788 A1 WO2013017788 A1 WO 2013017788A1 FR 2012051788 W FR2012051788 W FR 2012051788W WO 2013017788 A1 WO2013017788 A1 WO 2013017788A1
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lithium
morphine
alkaloid
derivative
alkaloids
Prior art date
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PCT/FR2012/051788
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French (fr)
Inventor
Yannick Goumon
Alexis LAUX-BIEHLMANN
Denise STUBER
Francis Schneider
Ingeborg Welters
Nadja GRÄFE
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Université De Strasbourg
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9486—Analgesics, e.g. opiates, aspirine
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to the use of lithium or a derivative thereof for measuring the level of endogenous or exogenous alkaloids, in particular morphine, in animal or human body tissues and fluids.
  • the present invention finds particular application in the diagnostic field to improve the evaluation of levels of endogenous or exogenous alkaloids in an animal or human patient may represent a pathological marker.
  • references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
  • Lithium known as a compound of major therapeutic importance, appears to act on the activity of the central nervous system, but to date no specific mode of action has been described. Lithium seems to pass through the membranes by passive diffusion or by active membrane transport of the sodium, potassium and calcium ions on which it appears to act [Pasquali et al., Behav. Pharmacol., 21 (5-6): 473-492, 2010; Phiel et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 41: 789-813, 2001] [1, 2]. On the other hand, by way of example, it appears that lithium affects both certain intracellular enzyme activities and second messengers (inositol-phosphate and adenylate-cyclase systems).
  • neuromediators acts on neuromediators, either by action on the transport of neurotransmitter precursors (reduction of choline passage, elevation of the intracerebral tryptophan level), or by direct interaction with the neuromediator system such as serotonin (potentiating effect on neuromediators). serotoninergic function), norepinephrine (decreased turnover), gamma-amino-butyric acid (GABA) which facilitates the activity and acetylcholine (stabilizing effect).
  • neurotransmitter precursors reduction of choline passage, elevation of the intracerebral tryptophan level
  • neuromediator system such as serotonin (potentiating effect on neuromediators).
  • serotoninergic function serotoninergic function
  • norepinephrine decreased turnover
  • GABA gamma-amino-butyric acid
  • Alkaloids are basic nitrogenous heterocyclic organic molecules of natural origin, which may have pharmacological activity. Although many alkaloids are toxic (such as strychnine or aconitine), some are used in medicine for, for example, their analgesic properties (such as morphine, codeine), as part of sedation protocols (anesthesia). ) often accompanied by hypnotics, or as an antimalarial agent (quinine, chloroquinine) or anticancer agent (taxol, vinblastine, vincristine).
  • Opiates are chemical molecules that act by binding to opioid receptors Mu Kappa Delta or which are expressed in the central and peripheral nervous system and the gastro intestinal ⁇ . These receptors mediate both the beneficial and the side effects of opiates (alkaloids) and opioids (peptides). Opiates are among the oldest known drugs.
  • the analgesic (anti-pain) effects of opioids are due to decreased pain perception, decreased pain response, and increased tolerance to pain.
  • the main side effects of opioids are sedation, respiratory depression, and constipation. Opiates can cause the suppression of cough, which can be both an indication for the administration of opiates or an unexpected side effect. Psychic and physical dependence may develop with continued opioid administration, leading to withdrawal withdrawal syndrome.
  • Opiates are well known for their ability to produce a feeling of euphoria, thus motivating some to use them for recreational purposes.
  • the following elements could be considered as natural opiates: the leaves of Mitragyna speciosa (also called Kratom) contain some natural opiates, active via the Mu and Delta receptors.
  • Salvinorin A found naturally in the plant Salvia divinorum, is a kappa opioid receptor agonist;
  • B semi-synthetic opiates created from natural opiates such as hydromorphone, hydrocodone, oxycodone,
  • Morphine is a natural opiate alkaloid used as a pain medication (analgesic).
  • the main alkaloid derived from the opium poppy (Papaver somniferum), morphine is considered the reference to which all other analgesics are compared in terms of efficacy. It is most often used in the form of a salt, sulfate or hydrochloride, identical efficiencies.
  • morphine is the most effective analgesic drug and is most commonly used to relieve various types of physical pain.
  • his job poses many problems due to the dependence it can induce. Therefore, it is listed as amazing at the international level (Cil).
  • Endogenous morphine structurally identical to opium poppy morphine, and several of its derivatives have been characterized in different mammalian tissues and cells (chromaffin cells and polymorphonuclear neutrophils) [Herbert et al., Nat. Prod. Rep. 17: 317-322, 2000; Stefano et al., Trends Neurosci. 23: 436-442, 2000; Zhu et al., J.
  • PPP phosphatidylethanolamine binding protein
  • Creatine kinase (CK, EC 2.7.3.2), also known as phosphocreatine kinase or creatine phosphokinase (CPK), is an enzyme expressed by various tissues including the brain and muscles where it is present in a cytoplasmic and mitochondrial form. There are several isoenzymes (present in the form of non-covalent dimers): CK-MM present in muscles, CK-MB found in myocardial cells, and CK-BB found in the brain. There is also mitochondrial CK (mtCK). This enzyme catalyzes the reversible conversion of creatine to phosphocreatine via the use of adenosine triphosphate (ATP, FIG. 1).
  • ATP adenosine triphosphate
  • This enzyme is essential for the production of ATP from phosphocreatine stocks.
  • Phosphocreatine, through ATP, is a rapidly available reservoir of energy for muscles and other organs including the brain.
  • CK MM and MB isoforms, dimers
  • the determination of isoenzymes in the blood makes it possible to distinguish the origin of the cell destruction.
  • the increase in blood CK-MB was used in blood tests to diagnose myocardial infarction. It is further known in the art that several pathologies are associated with increased levels of creatine kinase or other alkaloid-binding proteins relative to normal.
  • the inventors were the first to have observed that (i) creatine kinase and alkaloids formed complexes of very strong affinity, and more broadly protein-alkaloid complexes, in tissues and tissues. animal or human body fluids, and that (ii) lithium and its derivatives were capable of inhibiting and / or dissociating said complexes under mild conditions. Based on this observation, they hypothesized that lithium and its derivatives could a priori make it possible to improve the detection efficiency of morphine whose circulating or tissue levels are low, and by extension of any endogenous alkaloid and exogenously once extracted in free form.
  • lithium and its derivatives in particular lithium heparin, made it possible to quantify endogenous and exogenous morphine with a better efficiency in the blood, and did not interfere with (ie, did not overvalue or undervalue) the detection of morphine in the samples.
  • the present invention therefore relates to the use of lithium or a derivative thereof for the determination of the alkaloid level in the tissues and body fluids of an animal or a human.
  • lithium derivative is understood to mean, for example, lithium halides (eg lithium chloride, lithium bromide, lithium fluoride, etc.), organic lithium salts (eg lithium citrate) , lithium gluconate, lithium carbonate, lithium acetate, lithium trifluoromethanesulfonate, lithium formate, lithium trifluoroacetate, lithium heparin, etc.), the LiR (where R represents for example methyl, ethyl, phenyl, etc.) ..), and other lithium salts (bis (trifluoromethane) sulfonimide lithium, lithium hexafluorophosphate, lithium iodate, lithium metaborate, lithium nitrate, lithium phosphate, lithium sulphate, etc.), etc.
  • it is lithium heparinate, lithium lithium chloride and lithium carbonate.
  • tissues and body fluids is intended to mean, for example, organs or parts of an organ (biopsy) or tissues (conjunctive, cutaneous, epithelial, etc.), as well as fluids such as the saliva, urine, blood (serum, plasma, whole blood), cerebrospinal fluid, seminal fluid, vaginal fluid, etc.
  • the present invention further relates to a method for analyzing an alkaloid in a biological sample comprising:
  • step b) measuring the alkaloid content obtained in step a).
  • biological sample means any body fluid or tissue derived from an animal or from a human.
  • body fluid includes blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid, and for example, tissue includes brain, lung, muscle, or liver tissue.
  • the lithium or a derivative thereof is added to the test sample in an amount sufficient to dissociate all the protein-alkaloid complexes.
  • lithium or a derivative thereof is added at a concentration of 0.001 to 1000 IU / ml sample, preferably at a concentration of 17 IU / ml sample.
  • said analysis method may further comprise a step c) in which the detection results obtained in step b) are compared with respect to a negative and / or positive control.
  • control and negative control within the meaning of the present invention is meant a control sample respectively comprising or not comprising at least one alkaloid. This indicator makes it possible to compare the measurement result obtained in step b) of the method of the invention and to detect a false positive or false negative, if appropriate.
  • said analysis method may further comprise a step c b is) in which the detection results obtained in step b) are compared with a measurement standard; which allows a qualitative and / or quantitative analysis of opiates.
  • the term "measuring standard” means one or more analyzes carried out on solutions manufactured for the purposes of the analysis according to the invention comprising a known content of alkaloid (s). . From the results of analysis obtained on these manufactured solutions, it is possible to determine the presence of alkaloid (s) in the sample and even its (their) concentration by comparison, for example by means of a standard curve made from the measurement standards.
  • steps c) and c b i S can be implemented both before or during after steps a) and b) of the process of the invention.
  • steps c) and c b i S ) can be implemented simultaneously or successively, including in steps a) and b), for example on a multiwell plate making it possible to carry out simultaneously or successively several analyzes, including including standard measures.
  • the alkaloid analysis methods according to the present invention are used to analyze, for example, endogenous or exogenous natural alkaloids, for example morphine, as well as its derivatives, for example using ELISA, EIA or RIA using antibodies specific for the alkaloid to be detected or a protein / peptide for binding to said alkaloid to be detected, but also using mass spectrometric analyzes.
  • the present invention also relates to an alkaloid analysis kit comprising lithium or a derivative thereof and the means for measuring circulating alkaloid levels.
  • the measuring means that are well known to those skilled in the art are, for example, the constituents that are necessary and sufficient to carry out the aforementioned tests (primary antibody specific for the alkaloid to be detected / labeled secondary antibody, and / or protein / binding peptide). alkaloid audit to be detected, with associated reagents for quantification of the measurement result, etc.).
  • Figure 1 shows the enzymatic reaction catalyzed by creatine kinase.
  • Figure 2 shows the putative synthetic pathway of endogenous morphine in mammals according to [23].
  • Figure 3 depicts serum morphine concentrations as a function of morphine plasma concentrations in critically ill patients (points) and morphine-treated patients (cross).
  • the upper left inset shows an enlargement of the results for the lowest concentrations. All patients under the diagonal dotted line have a higher concentration of morphine in the plasma than in the serum.
  • BD vacutainer ® LH PST II ref: 367378, 17UI / ml
  • Morphine levels of plasma and serum were measured using a commercial ELISA kit specific for morphine (ELISA kit ref: 213-0480, Immunalysis Corporation). Plasma and serum samples (40 ⁇ 1) were tested in duplicate, and the Coefficient of Variation (CV) values were below the 8% limit. Samples with higher CVs were re-tested to obtain CVs below 8%.
  • standard morphine (0-25 ng / ml) was diluted in 1% PBS-BSA (w / v) for serum samples and 1% PBS-BSA (w / v) containing lithium heparin (17 IU / ml) for plasma samples.
  • the limit of detection calculated in this study for the ELISA kit lot was 0.1ng / ml of morphine.
  • known concentrations of morphine diluted in PBS or PBS-lithium heparin buffers were first tested using the ELISA assay. No differences were observed, showing that lithium heparin did not affect the detection of morphine.

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Abstract

The present invention relates to the improved assay of the amount of endogenous or exogenous alkaloids, in particular morphine, in the body tissue or fluid of an animal or human, using lithium or a derivative thereof.

Description

UTILISATION DU LITHIUM ET DE SES DÉRIVÉS POUR LE DOSAGEUSE OF LITHIUM AND ITS DERIVATIVES FOR ASSAY
DES ALCALOÏDES ALKALOIDS
DESCRIPTION DESCRIPTION
Domaine technique Technical area
La présente invention se rapporte à l'utilisation du lithium ou d'un dérivé de celui-ci pour mesurer le taux d'alcaloïdes endogènes ou exogènes, en particulier la morphine, dans les tissus et fluides corporels animal ou humain .  The present invention relates to the use of lithium or a derivative thereof for measuring the level of endogenous or exogenous alkaloids, in particular morphine, in animal or human body tissues and fluids.
La présente invention trouve notamment une application dans le domaine diagnostic, pour améliorer l'évaluation des niveaux en alcaloïdes endogènes ou exogènes chez un patient animal ou humain susceptibles de représenter un marqueur pathologique.  The present invention finds particular application in the diagnostic field to improve the evaluation of levels of endogenous or exogenous alkaloids in an animal or human patient may represent a pathological marker.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ( [ ] ) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.  In the description below, references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
Etat de la technique State of the art
Le lithium, connu comme un composé ayant une importance thérapeutique majeure, semble agir sur l'activité du système nerveux central, mais à ce jour aucun mode d'action spécifique n'a été décrit. Le lithium semble traverser les membranes par diffusion passive ou par des transports membranaires actifs des ions sodium, potassium et calcium sur lesquels il semble agir [Pasquali et al., Behav. Pharmacol., 21(5- 6) : 473-492, 2010 ; Phiel et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 41 : 789-813, 2001] [1, 2]. D'autre part, à titre d'exemple, il semble que le lithium affecte à la fois certaines activités enzymatiques intracellulaires et seconds messagers (systèmes inositol-phosphate et adénylate-cyclase ) . Il agit également sur des neuromédiateurs, soit par action sur le transport des précurseurs des neuromédiateurs (diminution du passage de la choline, élévation du taux intracérébral du tryptophane) , soit par interaction directe avec le système des neuromédiateurs tels que la sérotonine (effet potentialisateur sur la fonction sérotoninergique) , la noradrénaline (diminution du turn over) , l'acide gamma-amino-butyrique (GABA) dont il facilite l'activité et 1 ' acétylcholine (effet stabilisateur) . Différentes pathologies psychiatriques, e.g. la schizophrénie [Ebmeier et al., Practitioner, 254(1729) : 19-22, 2010 ; Buckley, CNS Spectr., 13 : 1- 10, 2008 ; Ratanajamit et al., J. Med. Assoc. Thai . , 89(11) : 1954-1960, 2006 ; Frye et Salloum, Bipolar Disord., 8 : 677-685, 2006] [3-6], la dépression [Frye et Salloum, 2006, précité ; Kovacsics et al., Annu . Rev. Pharmacol. Toxicol., 49 : 175-198, 2009] [6, 7], l'alcoolisme [Rosenberg et Salzman, CNS Spectr., 12 : 831-841, 2007 ; Salzman, Harv. Rev. Psychiatry, 11 : 230-244, 2003] [8, 9] et autres troubles du comportement ; pathologies douloureuses, e.g. algie vasculaire de la face [Bussone et al., Headache, 30 : 411-417, 1990 ; Leroux et Ducros, Orphanet. J. Rare Dis., 3 : 20, 2008] [10, 11], herpès douloureux [Gaby, Altern. Med. Rev., 11 : 93-101, 2006] [12], la fibromyalgie [Fontrier, Anesth. Analg., 98 : 1505, 2004 ; Teasell, CMAJ, 144 : 122-123, 1991 ; Tyber, CMAJ, 143 : 902-904, 1990] [13-15] ; pathologies immunitaires, e.g. leucopénies [Focosi et al., J. Leukoc. Biol., 85 : 20-28, 2009] [16] ; pathologies hormonales, e.g. hyperthyroïdie, hyponatrémie [Zietse et al., NDT Plus, 2 : iiil2-iiil9, 2009 ; Akin et al., Med. Princ. Pract . , 17 : 167-170, 2008] [17, 18] ; sont déjà traitées par le lithium. Lithium, known as a compound of major therapeutic importance, appears to act on the activity of the central nervous system, but to date no specific mode of action has been described. Lithium seems to pass through the membranes by passive diffusion or by active membrane transport of the sodium, potassium and calcium ions on which it appears to act [Pasquali et al., Behav. Pharmacol., 21 (5-6): 473-492, 2010; Phiel et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 41: 789-813, 2001] [1, 2]. On the other hand, by way of example, it appears that lithium affects both certain intracellular enzyme activities and second messengers (inositol-phosphate and adenylate-cyclase systems). It also acts on neuromediators, either by action on the transport of neurotransmitter precursors (reduction of choline passage, elevation of the intracerebral tryptophan level), or by direct interaction with the neuromediator system such as serotonin (potentiating effect on neuromediators). serotoninergic function), norepinephrine (decreased turnover), gamma-amino-butyric acid (GABA) which facilitates the activity and acetylcholine (stabilizing effect). Different psychiatric pathologies, eg schizophrenia [Ebmeier et al., Practitioner, 254 (1729): 19-22, 2010; Buckley, CNS Spectr., 13: 1-10, 2008; Ratanajamit et al., J. Med. Assoc. Thai. , 89 (11): 1954-1960, 2006; Frye and Salloum, Bipolar Disord., 8: 677-685, 2006] [3-6], depression [Frye and Salloum, 2006, supra; Kovacsics et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 49: 175-198, 2009] [6, 7], alcoholism [Rosenberg and Salzman, CNS Spectr., 12: 831-841, 2007; Salzman, Harv. Rev. Psychiatry, 11: 230-244, 2003] [8, 9] and other behavioral disorders; painful conditions, eg cluster headache [Bussone et al., Headache, 30: 411-417, 1990; Leroux and Ducros, Orphanet. J. Rare Dis., 3: 20, 2008] [10, 11], painful herpes [Gaby, Altern. Med. Rev., 11: 93-101, 2006] [12], fibromyalgia [Fontrier, Anesth. Analg., 98: 1505, 2004; Teasell, CMAJ, 144: 122-123, 1991; Tyber, CMAJ 143: 902-904, 1990] [13-15]; immune pathologies, eg leukopenia [Focosi et al., J. Leukoc. Biol., 85: 20-28, 2009] [16]; hormonal pathologies, eg hyperthyroidism, hyponatremia [Zietse et al., NDT Plus, 2: iiil2-iiil9, 2009; Akin et al., Med. Princ. Pract. , 17: 167-170, 2008] [17, 18]; are already treated with lithium.
Les alcaloïdes sont des molécules organiques hétérocycliques azotées basiques d'origine naturelle, pouvant avoir une activité pharmacologique . Bien que beaucoup d'alcaloïdes soient toxiques (comme la strychnine ou 1 ' aconitine) , certains sont employés dans la médecine pour, par exemple, leurs propriétés analgésiques (comme la morphine, la codéine) , dans le cadre de protocoles de sédation (anesthésie) souvent accompagnés d'hypnotiques, ou comme agent antipaludéen (quinine, chloroquinine) ou agent anticancéreux (taxol, vinblastine, vincristine) .  Alkaloids are basic nitrogenous heterocyclic organic molecules of natural origin, which may have pharmacological activity. Although many alkaloids are toxic (such as strychnine or aconitine), some are used in medicine for, for example, their analgesic properties (such as morphine, codeine), as part of sedation protocols (anesthesia). ) often accompanied by hypnotics, or as an antimalarial agent (quinine, chloroquinine) or anticancer agent (taxol, vinblastine, vincristine).
Les opiacés sont des molécules chimiques qui agissent en se liant aux récepteurs opioïdes Mu, Delta ou Kappa, qui sont exprimés dans le système nerveux central et périphérique et le tractus gastro¬ intestinal. Ces récepteurs médient à la fois les effets bénéfiques et les effets secondaires des opiacés (alcaloïdes) et opioïdes (peptides) . Les opiacés sont parmi les plus anciennes drogues connues. Les effets analgésiques (antidouleurs) des opiacés sont dus à une perception diminuée de la douleur, une réaction diminuée à la douleur ainsi qu'une tolérance augmentée à la douleur. Les principaux effets secondaires des opiacés sont la sédation, la dépression respiratoire, et la constipation. Les opiacés peuvent provoquer la suppression de la toux, qui peut être à la fois une indication pour l'administration d'opiacés ou d'un effet secondaire imprévu. Une dépendance psychique et physique peut se développer avec l'administration continue d'opiacés, ce qui conduit à un syndrome de sevrage à l'arrêt brusque. Les opiacés sont bien connus pour leur capacité à produire un sentiment d'euphorie, motivant ainsi certains à les utiliser à des fins récréatives. Il existe cinq grandes classes d'opiacés: (A) les opiacés naturels sont des alcaloïdes contenus dans la résine du pavot à opium (Papaver somniferum) mais également chez d'autres organismes vivants (mammifères et invertébrés) , à savoir principalement la morphine et des dérivés morphiniques par exemple la codéine et la thébaïne, mais pas la papavérine et la noscapine qui ont un mécanisme d'action différent. Les éléments suivants pourraient être considérés comme les opiacés naturels: les feuilles de Mitragyna speciosa (également appelé Kratom) contiennent quelques opiacés naturels, actifs via les récepteurs Mu et Delta. La Salvinorine A, trouvée naturellement dans la plante Salvia divinorum, est un agoniste des récepteurs opioïdes kappa ; (B) les opiacés semi-synthétiques créés à partir des opiacés naturels tels que 1 ' hydromorphone, 1 ' hydrocodone, l'oxycodone,Opiates are chemical molecules that act by binding to opioid receptors Mu Kappa Delta or which are expressed in the central and peripheral nervous system and the gastro intestinal ¬. These receptors mediate both the beneficial and the side effects of opiates (alkaloids) and opioids (peptides). Opiates are among the oldest known drugs. The analgesic (anti-pain) effects of opioids are due to decreased pain perception, decreased pain response, and increased tolerance to pain. The main side effects of opioids are sedation, respiratory depression, and constipation. Opiates can cause the suppression of cough, which can be both an indication for the administration of opiates or an unexpected side effect. Psychic and physical dependence may develop with continued opioid administration, leading to withdrawal withdrawal syndrome. Opiates are well known for their ability to produce a feeling of euphoria, thus motivating some to use them for recreational purposes. There are five main classes of opiates: (A) the natural opiates are alkaloids contained in the opium poppy resin (Papaver somniferum) but also in other living organisms (mammals and invertebrates), namely mainly morphine and morphine derivatives eg codeine and thebaine, but not papaverine and noscapine which have a different mechanism of action. The following elements could be considered as natural opiates: the leaves of Mitragyna speciosa (also called Kratom) contain some natural opiates, active via the Mu and Delta receptors. Salvinorin A, found naturally in the plant Salvia divinorum, is a kappa opioid receptor agonist; (B) semi-synthetic opiates created from natural opiates such as hydromorphone, hydrocodone, oxycodone,
1' oxymorphone, la désomorphine, la nicomorphine, la dipropanoylmorphine, la benzylmorphine, 1 ' éthylmorphine et la buprénorphine ; (C) les opiacés entièrement de synthèse tels que le fentanyl, la péthidine, la méthadone, le tramadol et le dextropropoxyphène ; (D) les opioïdes endogènes peptidiques produits naturellement dans le corps (comme les endorphines, les enképhalines , les dynorphines, et les endomorphines ) ; et (E) leurs dérivés synthétiques ou semi-synthétiques (DDPE, etc..) . Oxymorphone, deomorphine, nicomorphine, dipropanoylmorphine, benzylmorphine, ethylmorphine and buprenorphine; (C) fully synthetic opiates such as fentanyl, pethidine, methadone, tramadol and dextropropoxyphene; (D) endogenous peptide opioids naturally produced in the body (such as endorphins, enkephalins, dynorphins, and endomorphins); and (E) their synthetic or semi-synthetic derivatives (DDPE, etc.).
La morphine est un alcaloïde opiacé naturel utilisé comme médicament contre la douleur (analgésique) . Principal alcaloïde issu du pavot à opium (Papaver somniferum) , la morphine est considérée comme la référence à laquelle sont comparés tous les autres analgésiques en termes d'efficacité. Elle est le plus souvent utilisée sous la forme d'un sel, de sulfate ou de chlorhydrate, d'efficacités identiques. À ce jour, la morphine est le médicament analgésique le plus efficace et le plus couramment utilisé pour soulager divers types de douleur physique. Toutefois son emploi pose de nombreux problèmes dus à la dépendance qu'elle peut induire. Aussi est-elle listée comme stupéfiant au niveau international (Cil). La morphine endogène (ME), structuralement identique à la morphine du pavot à opium, ainsi que plusieurs de ses dérivés ont été caractérisés dans différents tissus et cellules de mammifères (cellules chromaffines et neutrophiles polymorphonucléaires ) [Herbert et al., Nat. Prod. Rep . , 17 : 317-322, 2000 ; Stefano et al., Trends Neurosci . , 23 : 436-442, 2000 ; Zhu et al., J. Immunol., 175(11) : 7357-7362, 2005 ; Glattard et al., PLoS One, 5(1) : e8791, 2010] [19-22], et sont présents, par exemple, dans des vésicules de sécrétion de certains neurones [Bianchi et al., Brain Res., 627 : 210-215, 1993 ; Bianchi et al., Adv. Neuroimmunol . , 4 : 83-92, 1994 ; Guarna et al., J. Neurochem., 70 : 147-152, 1998 ; Muller et al., PLoS One, 3 : Epub www.plosone.org/doi/pone.0001641, 2008] [23-26]. On retrouve également de la ME dans différents fluides biologiques incluant le liquide céphalorachidien, le sang et l'urine. Tout comme chez les plantes, la voie de synthèse de la morphine chez les mammifères dérive de celle de la dopamine (figure 2) [Boettcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 : 8495-8500, 2005 ; Goumon et al., An. R. Acad. Nac. Farm., 75 : 389-418, 2009 ; Neri et al., J. Neurochem., 106(6) : 2337-2344, 2008 ; Stefano et al., Trends Neurosci., 23(9) : 436- 442, 2000] [27-30] . Le catabolisme de la morphine (endogène et exogène) par la superfamille des UDP- glucuronosyltransférases (UGT) aboutit à la formation de la morphine-3-glucuronide (M3G, dénuée d'activité analgésique) et de la morphine- 6-glucuronide (M6G qui possède une activité analgésique supérieure à celle de la morphine, 1 à 600 fois) [Lotsch et Geisslinger, Clin. Pharmacokinet . , 40 : 485-499, 2001] [31]. Cependant, d'autres dérivés endogènes sont également retrouvés : la normorphine, nocodéine-3- 6- diglucuronide, l' hydrocodone, l' hydromorphone, etc.. Il a été mis en évidence une corrélation entre le taux de morphine sérique et le sepsis (infection systémique grave) qui indique que la morphine endogène représente un biomarqueur sérique des infections [Demande de Brevet en Europe No. 07301692.5] [32]. D'autre part, de récents résultats indiquent qu'une immunoréactivité apparentée à la morphine est distribuée dans tout le cerveau de la souris et avec une densité de marquage plus forte localisée dans les régions cérébrales impliquées dans la motricité et la mémoire [Laux et al., J. Comp. Neurol., 519(12) : 2390-2416, 2011 ; Charron et al., Brain, PMID : 21742735, 2011] [33, 34]. Un nombre croissant d'études suggère que la ME est un important modulateur dans les états physiologiques et pathophysiologiques. Par exemple, des patients ayant un sepsis ont des taux circulants de ME significativement plus élevés par rapport à des patients ayant un syndrome de réponse inflammatoire systémique ou des donneurs sains [Glattard et al., 2010, précité] [22]. Les traitements au lipopolysaccharide (LPS) sont également associés avec une augmentation des taux de ME chez les rats [Goumon et al., Neurosci. Lett., 293(2) : 135-138, 2000 ; Meijerink et al., Shock, 12(3) : 165- 173, 1999] [35, 36] . Des taux élevés de ME dans le sang de patients ont également été associés à d'autres états pathologiques incluant le pontage cardiovasculaire [Brix-Christensen et al., Acta Anaesthesiol . Scand., 44(10) : 1204-1208, 2000 ; Brix-Christensen et al., Int. J. cardiol., 62(3) : 191-197, 1997] [37, 38], la chirurgie invasive [Madbouly et al., Br. J. Surg., 97(5) : 759-764, 2010 ; Yoshida et al., Surg. Endosc, 14(2) : 137-140, 2000] [39, 40], et le traitement de la maladie de Parkinson avec de la L-DOPA [Arun et al., Indian J. Med. Res., 107 : 231-238, 1998 ; Matsubara et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 260(3) : 974-978, 1992] [41, 42] . Morphine is a natural opiate alkaloid used as a pain medication (analgesic). The main alkaloid derived from the opium poppy (Papaver somniferum), morphine is considered the reference to which all other analgesics are compared in terms of efficacy. It is most often used in the form of a salt, sulfate or hydrochloride, identical efficiencies. To date, morphine is the most effective analgesic drug and is most commonly used to relieve various types of physical pain. However, his job poses many problems due to the dependence it can induce. Therefore, it is listed as amazing at the international level (Cil). Endogenous morphine (ME), structurally identical to opium poppy morphine, and several of its derivatives have been characterized in different mammalian tissues and cells (chromaffin cells and polymorphonuclear neutrophils) [Herbert et al., Nat. Prod. Rep. 17: 317-322, 2000; Stefano et al., Trends Neurosci. 23: 436-442, 2000; Zhu et al., J. Immunol., 175 (11): 7357-7362, 2005; Glattard et al., PLoS One, 5 (1): e8791, 2010] [19-22], and are present, for example, in secretory vesicles of certain neurons [Bianchi et al., Brain Res., 627: 210-215, 1993; Bianchi et al., Adv. Neuroimmunol. , 4: 83-92, 1994; Guarna et al., J. Neurochem., 70: 147-152, 1998; Muller et al., PLoS One, 3: Epub www.plosone.org/doi/pone.0001641, 2008] [23-26]. We also found ME in different biological fluids including cerebrospinal fluid, blood and urine. As in plants, the route of synthesis of morphine in mammals derives from that of dopamine (Figure 2) [Boettcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 8495-8500, 2005; Goumon et al., An. R. Acad. Nac. Farm., 75: 389-418, 2009; Neri et al., J. Neurochem., 106 (6): 2337-2344, 2008; Stefano et al., Trends Neurosci., 23 (9): 436-442, 2000] [27-30]. The catabolism of morphine (endogenous and exogenous) by the superfamily of UDP-glucuronosyltransferases (UGT) results in the formation of morphine-3-glucuronide (M3G, devoid of analgesic activity) and morphine-6-glucuronide (M6G which has an analgesic activity superior to that of morphine, 1 to 600 times) [Lotsch and Geisslinger, Clin. Pharmacokinet. , 40: 485-499, 2001] [31]. However, other endogenous derivatives are also found: normorphine, nocodein-3-diglucuronide, hydrocodone, hydromorphone, etc. It has been demonstrated a correlation between the level of serum morphine and sepsis (severe systemic infection) which indicates that endogenous morphine is a serum biomarker of infections [European Patent Application No. 07301692.5] [32]. On the other hand, recent findings indicate that morphine-related immunoreactivity is distributed throughout the mouse brain and with a higher localized labeling density in the brain regions involved in motor and memory [Laux et al. J. Comp. Neurol., 519 (12): 2390-2416, 2011; Charron et al., Brain, PMID: 21742735, 2011] [33, 34]. An increasing number of studies suggest that EM is an important modulator in physiological and pathophysiological states. For example, patients with sepsis have significantly higher circulating MOE levels compared with patients with systemic inflammatory response syndrome or healthy donors [Glattard et al., 2010, cited above] [22]. Lipopolysaccharide (LPS) treatments are also associated with increased levels of ME in rats [Goumon et al., Neurosci. Lett., 293 (2): 135-138, 2000; Meijerink et al., Shock, 12 (3): 165-173, 1999] [35, 36]. Elevated EM levels in the blood of patients have also been associated with other disease states including cardiovascular bypass [Brix-Christensen et al., Acta Anesthesiol. Scand., 44 (10): 1204-1208, 2000; Brix-Christensen et al., Int. J. cardiol., 62 (3): 191-197, 1997] [37, 38], invasive surgery [Madbouly et al., Br. J. Surg., 97 (5): 759-764, 2010; Yoshida et al., Surg. Endosc, 14 (2): 137-140, 2000] [39, 40], and treatment of Parkinson's disease with L-DOPA [Arun et al., Indian J. Med. Res., 107: 231-238, 1998; Matsubara et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 260 (3): 974-978, 1992] [41, 42].
La liaison de la morphine ou de ses dérivés à des protéines a déjà été décrite [Misra et al., Nature, 232 : 48-50, 1971 ; Mullis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 208 : 228-231, 1979 ; Nagamatsu et al., Drug Metab. Dispos., 11 : 190-194, 1983 ; Olsen et al., Clin. Pharmacol. Ther., 17(6) : 677-684, 1975] [43-46]. En effet la morphine a été caractérisée pour se lier faiblement à la sérum albumine, ainsi qu'à l'alpha 1- acid glycoprotein [Leow et al., Ther. Drug Monit., 15 : 440-447, 1993] [47], et il a récemment été décrit que la protéine de liaison de la phosphatidyléthanolamine (la phosphatidyléthanolamine-binding protein, PEBP) était capable de lier uniquement la M6G et la M3G à faible affinité, mais ne possédait aucune affinité pour la morphine [Atmanene et al., Med. Sci. Monit., 15 : BR178-187, 2009 ; Goumon et al., J. Biol. Chem., 281(12) : 8082-9, 2006] [48, 51]. D'autres études ont indiqué qu'une protéine de 50-53kDa pouvait spontanément lier la morphine radioactive de manière covalente (protéine non caractérisée, sans mise en évidence biochimique) [Nagamatsu et Hasegawa, Biochem. Pharmacol., 43 : 2631-2635, 1992] [49]. Il a également été décrit que cette liaison morphine-protéine était diminuée en présence de sélénium [Nagatmasu et Hasegawa, Drug Chem. Toxicol., 16 : 241-253, 1993] [50] . The binding of morphine or its derivatives to proteins has already been described [Misra et al., Nature, 232: 48-50, 1971; Mullis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 208: 228-231, 1979; Nagamatsu et al., Drug Metab. 11: 190-194, 1983; Olsen et al., Clin. Pharmacol. Ther., 17 (6): 677-684, 1975] [43-46]. Indeed morphine has been characterized to bind weakly to serum albumin, as well as to alpha 1- acid glycoprotein [Leow et al., Ther. Drug Monit., 15: 440-447, 1993] [47], and it has recently been described that phosphatidylethanolamine binding protein (PEPP) is capable of binding only low affinity, but had no affinity for morphine [Atmanene et al., Med. Sci. Monit., 15: BR178-187, 2009; Goumon et al., J. Biol. Chem., 281 (12): 8082-9, 2006] [48, 51]. Other studies have indicated that a 50-53kDa protein can spontaneously bind radioactive morphine covalently (uncharacterized protein, without biochemical evidence) [Nagamatsu and Hasegawa, Biochem. Pharmacol., 43: 2631-2635, 1992] [49]. It has also been reported that this morphine-protein binding is decreased in the presence of selenium [Nagatmasu and Hasegawa, Drug Chem. Toxicol., 16: 241-253, 1993] [50].
Récemment, les Inventeurs ont mis en évidence la formation de complexes entre la créatine kinase et les alcaloïdes apparentés à la morphine endogènes ou exogènes, et plus largement de complexes protéine- alcaloïde .  Recently, the inventors have demonstrated the formation of complexes between creatine kinase and endogenous or exogenous morphine-related alkaloids, and more broadly protein-alkaloid complexes.
La créatine kinase (CK, EC 2.7.3.2), également appelée phosphocréatine kinase ou créatine phosphokinase (CPK) , est une enzyme exprimée par différents tissus incluant le cerveau et les muscles où elle est présente sous une forme cytoplasmique et mitochondriale . Il existe plusieurs isoenzymes (présents sous forme de dimères non covalents) : la CK- MM présente dans les muscles, la CK-MB trouvée dans les cellules myocardiaques , et la CK-BB qui se trouve dans le cerveau. On trouve également de la CK mitochondriale (mtCK) . Cette enzyme catalyse la conversion réversible de la créatine en phosphocréatine via l'utilisation de l'adénosine triphosphate (ATP, figure 1). Cette enzyme est primordiale pour la production d'ATP à partir des stocks de phosphocréatine. La phosphocréatine, par l'intermédiaire de l'ATP, constitue ainsi un réservoir d'énergie rapidement utilisable pour les muscles et autres organes incluant le cerveau. La CK (isoformes MM et MB ; dimères) est libérée dans le sang lors de lésions tissulaires provoquant une lyse cellulaire (par exemple atteinte musculaire telle que la rhabdomyolysis , efforts musculaires, etc..) . Le dosage des isoenzymes dans le sang permet de distinguer l'origine de la destruction cellulaire. L'augmentation de CK-MB sanguine a été utilisée en dosage sanguin pour diagnostiquer l'infarctus du myocarde. Il est en outre connu de l'art que plusieurs pathologies sont associées à une augmentation des taux en créatine kinase ou en d'autres protéines liant les alcaloïdes par rapport à la normale. Il s'agit par exemple de la rhabdomyolyse [Cervellin et al., Clin. Chem. Lab. Med., 48(6) : 749- 756, 2010] [40], de l'infarctus du myocarde [Navin et Hager, Curr. Probl . Cardiol., 3 : 1-32, 1979] [41], de lésions musculaires, d'un accident vasculaire cérébral, etc... Creatine kinase (CK, EC 2.7.3.2), also known as phosphocreatine kinase or creatine phosphokinase (CPK), is an enzyme expressed by various tissues including the brain and muscles where it is present in a cytoplasmic and mitochondrial form. There are several isoenzymes (present in the form of non-covalent dimers): CK-MM present in muscles, CK-MB found in myocardial cells, and CK-BB found in the brain. There is also mitochondrial CK (mtCK). This enzyme catalyzes the reversible conversion of creatine to phosphocreatine via the use of adenosine triphosphate (ATP, FIG. 1). This enzyme is essential for the production of ATP from phosphocreatine stocks. Phosphocreatine, through ATP, is a rapidly available reservoir of energy for muscles and other organs including the brain. CK (MM and MB isoforms, dimers) is released into the bloodstream when tissue damage causes cell lysis (eg muscle damage such as rhabdomyolysis, muscle strain, etc.). The determination of isoenzymes in the blood makes it possible to distinguish the origin of the cell destruction. The increase in blood CK-MB was used in blood tests to diagnose myocardial infarction. It is further known in the art that several pathologies are associated with increased levels of creatine kinase or other alkaloid-binding proteins relative to normal. This is for example rhabdomyolysis [Cervellin et al., Clin. Chem. Lab. Med., 48 (6): 749-756, 2010] [40], myocardial infarction [Navin and Hager, Curr. Problem . Cardiol., 3: 1-32, 1979] [41], muscle injury, stroke, etc.
Il a été montré que cette liaison créatine kinase- alcaloïde est forte mais labile (non covalente) , et que la dissociation de ces complexes nécessite des conditions extrêmes [présence d'urée associée à un traitement thermique (100°C, 10 minutes)]. Plus récemment, les inventeurs ont montré toutefois que le lithium et ses dérivés (e.g. lithium héparine, chlorure de lithium et carbonate de lithium) étaient capables d'inhiber et/ou de dissocier les complexes créatine kinase-alcaloïde, et plus largement des complexes protéine-alcaloïde, dans des conditions douces. It has been shown that this creatine kinase-alkaloid binding is strong but labile (non-covalent), and that the dissociation of these complexes requires extreme conditions [presence of urea associated with heat treatment (100 ° C, 10 minutes)] . More recently, the inventors have shown, however, that the lithium and its derivatives (eg lithium heparin, lithium chloride and lithium carbonate) were able to inhibit and / or dissociate the creatine kinase-alkaloid complexes, and more broadly protein-alkaloid complexes, under mild conditions.
Du fait de cette complexion, les taux circulants ou tissulaires d'alcaloïdes endogènes ou exogènes libres seraient minorés d'où une diminution de leurs effets (analgésique, anti-inflammatoire, etc..) .  Because of this complexion, the circulating or tissue levels of free endogenous or exogenous alkaloids would be reduced, hence a decrease in their effects (analgesic, anti-inflammatory, etc.).
Du fait également des faibles taux circulants ou tissulaires de ME (0-25ng/ml) , un protocole précis pour quantifier la ME serait nécessaire. Encore actuellement, il n'existe aucun consensus concernant la préparation d'échantillon pour mesurer les taux d'alcaloïdes endogènes et exogènes dans le sang. Par exemple, les meilleurs rendements actuellement décrits ne dépassent pas les 50% pour des quantités faibles de morphine exogène (pg-ng) .  Also due to low circulating or tissue levels of ME (0-25 ng / ml), a precise protocol for quantifying EM would be required. Even today, there is no consensus regarding sample preparation for measuring endogenous and exogenous alkaloid levels in the blood. For example, the best yields currently described do not exceed 50% for low amounts of exogenous morphine (pg-ng).
Il existe donc un réel besoin d'identifier des protocoles et/ou molécules susceptibles d'améliorer le rendement de détection, à moindre coût, des taux d' alcaloïdes endogènes et exogènes circulants dans les tissus et fluides corporels d'un animal ou d'un humain, notamment des taux de morphine, ainsi que d'alcaloïdes qui en dérivent (codéine, morphine-6-gucuronide, morphine-3-gucuronide, etc..) .  There is therefore a real need to identify protocols and / or molecules that can improve the detection efficiency, at a lower cost, of circulating endogenous and exogenous alkaloid levels in the tissues and body fluids of an animal or animal. a human, including morphine levels, as well as alkaloids derived therefrom (codeine, morphine-6-gucuronide, morphine-3-gucuronide, etc.).
Description de l'invention Description of the invention
Les Inventeurs ont été les premiers à avoir observé que (i) la créatine kinase et les alcaloïdes formaient des complexes de très forte affinité, et plus largement des complexes protéine-alcaloïde, dans les tissus et les fluides corporels animal ou humain, et que (ii) le lithium et ses dérivés étaient capables d'inhiber et/ou de dissocier lesdits complexes en conditions douces. Ils ont, à partir de cette observation, émis l'hypothèse que le lithium et ses dérivés pourraient a priori permettre d'améliorer le rendement de détection de la morphine dont les taux circulants ou tissulaires sont faibles, et par extension de tout alcaloïde endogène et exogène une fois ainsi extrait sous forme libre. The inventors were the first to have observed that (i) creatine kinase and alkaloids formed complexes of very strong affinity, and more broadly protein-alkaloid complexes, in tissues and tissues. animal or human body fluids, and that (ii) lithium and its derivatives were capable of inhibiting and / or dissociating said complexes under mild conditions. Based on this observation, they hypothesized that lithium and its derivatives could a priori make it possible to improve the detection efficiency of morphine whose circulating or tissue levels are low, and by extension of any endogenous alkaloid and exogenously once extracted in free form.
Les Inventeurs ont alors mis en évidence de manière tout à fait inattendue que le lithium et ses dérivés, en particulier l'héparinate de lithium, permettait de quantifier la morphine endogène et exogène avec une meilleure efficacité dans le sang, et n'interféraient pas avec (i.e., ne surévaluaient ou ne sous-évaluaient pas) la détection de la morphine dans les échantillons.  The inventors then demonstrated, quite unexpectedly, that lithium and its derivatives, in particular lithium heparin, made it possible to quantify endogenous and exogenous morphine with a better efficiency in the blood, and did not interfere with (ie, did not overvalue or undervalue) the detection of morphine in the samples.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation du lithium ou d'un dérivé de celui-ci pour le dosage du taux d'alcaloïde dans les tissus et fluides corporels d'un animal ou d'un humain.  The present invention therefore relates to the use of lithium or a derivative thereof for the determination of the alkaloid level in the tissues and body fluids of an animal or a human.
Par « dérivé du lithium » au sens de la présente invention, on entend par exemple les halogénures de lithium (e.g. chlorure de lithium, bromure de lithium, fluorure de lithium, etc..) , les sels organiques de lithium (e.g. citrate de lithium, gluconate de lithium, carbonate de lithium, acétate de lithium, trifluorométhanesulfonate de lithium, formate de lithium, trifluoroacétate de lithium, héparinate de lithium, etc..) , les organolithiens LiR (où R représente par exemple méthyle, éthyle, phényle, etc..) , et autres sels de lithium (bis ( trifluorométhane) sulfonimide de lithium, hexafluorophosphate de lithium, iodate de lithium, métaborate de lithium, nitrate de lithium, phosphate de lithium, sulfate de lithium, etc.), etc.... En particulier, il s'agit de l'héparinate de lithium, du chlorure de lithium et du carbonate de lithium. For the purposes of the present invention, the term "lithium derivative" is understood to mean, for example, lithium halides (eg lithium chloride, lithium bromide, lithium fluoride, etc.), organic lithium salts (eg lithium citrate) , lithium gluconate, lithium carbonate, lithium acetate, lithium trifluoromethanesulfonate, lithium formate, lithium trifluoroacetate, lithium heparin, etc.), the LiR (where R represents for example methyl, ethyl, phenyl, etc.) ..), and other lithium salts (bis (trifluoromethane) sulfonimide lithium, lithium hexafluorophosphate, lithium iodate, lithium metaborate, lithium nitrate, lithium phosphate, lithium sulphate, etc.), etc. In particular, it is lithium heparinate, lithium lithium chloride and lithium carbonate.
Par « tissus et fluides corporels » au sens de la présente invention, on entend par exemple les organes ou parties d'organe (biopsie) ou de tissus (conjonctif, cutané, épithélial, etc..) , ainsi que les fluides tels que la salive, l'urine, le sang (sérum, plasma, sang entier) , le liquide céphalorachidien, le liquide séminal, le liquide vaginal, etc....  For the purposes of the present invention, the term "tissues and body fluids" is intended to mean, for example, organs or parts of an organ (biopsy) or tissues (conjunctive, cutaneous, epithelial, etc.), as well as fluids such as the saliva, urine, blood (serum, plasma, whole blood), cerebrospinal fluid, seminal fluid, vaginal fluid, etc.
La présente invention a encore pour objet un procédé d'analyse d'un alcaloïde dans un échantillon biologique comprenant :  The present invention further relates to a method for analyzing an alkaloid in a biological sample comprising:
a) la mise en contact dudit échantillon avec le lithium ou un dérivé de celui-ci ;  a) contacting said sample with lithium or a derivative thereof;
b) la mesure du taux d'alcaloïde obtenu à l'étape a) .  b) measuring the alkaloid content obtained in step a).
Par « échantillon biologique » au sens de la présente invention, on entend tout fluide corporel ou tissu provenant d'un animal ou d'un humain. Par exemple, le fluide corporel comprend le sang, l'urine, la salive, le liquide céphalorachidien, et par exemple, le tissu comprend le tissu cérébral, pulmonaire, musculaire ou hépatique.  For the purposes of the present invention, the term "biological sample" means any body fluid or tissue derived from an animal or from a human. For example, body fluid includes blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid, and for example, tissue includes brain, lung, muscle, or liver tissue.
Selon un mode particulier de mise en œuvre du procédé de l'invention, le lithium ou un dérivé de celui-ci est ajouté à l'échantillon à tester dans une quantité suffisante pour dissocier tous les complexes protéine-alcaloïde. Par exemple, le lithium ou un dérivé de celui-ci est ajouté à une concentration de 0.001 à 1000 Ul/ml d'échantillon, de préférence à une concentration de 17 Ul/ml d'échantillon. According to a particular mode of implementation of the method of the invention, the lithium or a derivative thereof is added to the test sample in an amount sufficient to dissociate all the protein-alkaloid complexes. For example, lithium or a derivative thereof is added at a concentration of 0.001 to 1000 IU / ml sample, preferably at a concentration of 17 IU / ml sample.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé d'analyse peut comprendre en outre une étape c) dans laquelle les résultats de détection obtenus à l'étape b) sont comparés par rapport à un contrôle négatif et/ou positif.  According to a particular embodiment, said analysis method may further comprise a step c) in which the detection results obtained in step b) are compared with respect to a negative and / or positive control.
Par « contrôle positif » et « contrôle négatif » au sens de la présente invention, on entend un échantillon témoin respectivement comprenant ou ne comprenant pas au moins un alcaloïde. Ce témoin permet de comparer le résultat de mesure obtenu à l'étape b) du procédé de l'invention et de déceler un faux positif ou faux négatif, le cas échéant.  By "positive control" and "negative control" within the meaning of the present invention is meant a control sample respectively comprising or not comprising at least one alkaloid. This indicator makes it possible to compare the measurement result obtained in step b) of the method of the invention and to detect a false positive or false negative, if appropriate.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé d' analyse peut comprendre en outre une étape cbis ) dans laquelle les résultats de détection obtenus à l'étape b) sont comparés à un étalon de mesure ; ce qui permet une analyse qualitative et/ou quantitative des opiacés. According to a particular embodiment, said analysis method may further comprise a step c b is) in which the detection results obtained in step b) are compared with a measurement standard; which allows a qualitative and / or quantitative analysis of opiates.
Par « étalon de mesure » au sens de la présente invention, on entend une ou plusieurs analyse (s) réalisée (s) sur des solutions fabriquées pour les besoins de l'analyse selon l'invention comprenant une teneur connue en alcaloïde (s) . A partir des résultats d'analyse obtenus sur ces solutions fabriquées, il est possible de déterminer la présence d' alcaloïde ( s ) dans l'échantillon et même sa (leur) concentration par comparaison, par exemple au moyen d'une courbe étalon réalisée à partir des étalons de mesure.  For the purposes of the present invention, the term "measuring standard" means one or more analyzes carried out on solutions manufactured for the purposes of the analysis according to the invention comprising a known content of alkaloid (s). . From the results of analysis obtained on these manufactured solutions, it is possible to determine the presence of alkaloid (s) in the sample and even its (their) concentration by comparison, for example by means of a standard curve made from the measurement standards.
Selon l'invention, les étapes c) et cbiS ) peuvent être mises en œuvre toutes les deux, avant pendant ou après les étapes a) et b) du procédé de l'invention. Selon l'invention, les étapes c) et cbiS ) peuvent être mises en œuvre simultanément ou successivement, y compris aux étapes a) et b) , par exemple sur une plaque multipuits permettant de réaliser simultanément ou successivement plusieurs analyses, y compris des mesures étalons. According to the invention, steps c) and c b i S ) can be implemented both before or during after steps a) and b) of the process of the invention. According to the invention, steps c) and c b i S ) can be implemented simultaneously or successively, including in steps a) and b), for example on a multiwell plate making it possible to carry out simultaneously or successively several analyzes, including including standard measures.
Les procédés d' analyse d' alcaloïdes selon la présente invention, servent à analyser par exemple les alcaloïdes naturels endogènes ou exogènes, par exemple la morphine, ainsi que ses dérivés, par exemple à l'aide de test ELISA, EIA ou RIA utilisant des anticorps spécifiques de l'alcaloïde à détecter ou une protéine/peptide de liaison audit alcaloïde à détecter, mais également à l'aide d'analyses par spectrométrie de masse .  The alkaloid analysis methods according to the present invention are used to analyze, for example, endogenous or exogenous natural alkaloids, for example morphine, as well as its derivatives, for example using ELISA, EIA or RIA using antibodies specific for the alkaloid to be detected or a protein / peptide for binding to said alkaloid to be detected, but also using mass spectrometric analyzes.
La présente invention a encore pour objet un kit d'analyse d'un alcaloïde comprenant le lithium ou un dérivé de celui-ci et les moyens de mesure des taux d'alcaloïde circulants. Les moyens de mesure bien connus de l'Homme du métier sont par exemple les constituants nécessaires et suffisants pour mettre en œuvre les tests précités (anticorps primaire spécifique de l'alcaloïde à détecter / anticorps secondaire marqué, et/ou protéine/peptide de liaison audit alcaloïde à détecter, avec les réactifs y associés pour la quantification du résultat de mesure, etc..) .  The present invention also relates to an alkaloid analysis kit comprising lithium or a derivative thereof and the means for measuring circulating alkaloid levels. The measuring means that are well known to those skilled in the art are, for example, the constituents that are necessary and sufficient to carry out the aforementioned tests (primary antibody specific for the alkaloid to be detected / labeled secondary antibody, and / or protein / binding peptide). alkaloid audit to be detected, with associated reagents for quantification of the measurement result, etc.).
D' autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des résultats expérimentaux obtenus à partir des protocoles décrits dans les exemples ci-dessous mis en œuvre par les inventeurs, et illustrés de manière non limitative par les figures annexées. Other advantages may still be apparent to those skilled in the art on reading the experimental results obtained from the protocols described in the examples below implemented by the inventors, and illustrated in a nonlimiting manner by the appended figures.
Brève description des figures Brief description of the figures
La figure 1 représente la réaction enzymatique catalysée par la créatine kinase.  Figure 1 shows the enzymatic reaction catalyzed by creatine kinase.
La figure 2 représente la voie de synthèse putative de la morphine endogène chez les mammifères d'après [23] .  Figure 2 shows the putative synthetic pathway of endogenous morphine in mammals according to [23].
La figure 3 représente les concentrations sériques en morphine en fonction des concentrations plasmatiques en morphine chez des patients gravement malades (points) et des patients traités à la morphine (croix) . L'encart en haut à gauche montre un agrandissement des résultats pour les plus faibles concentrations. Tous les patients sous la ligne diagonale pointillée présentent une concentration en morphine plus élevée dans le plasma que dans le sérum. EXEMPLES  Figure 3 depicts serum morphine concentrations as a function of morphine plasma concentrations in critically ill patients (points) and morphine-treated patients (cross). The upper left inset shows an enlargement of the results for the lowest concentrations. All patients under the diagonal dotted line have a higher concentration of morphine in the plasma than in the serum. EXAMPLES
Cette étude a été approuvée par le conseil d'examen institutionnel pour l'expérimentation humaine des hôpitaux universitaires de Strasbourg. This study was approved by the Institutional Review Board for Human Experimentation of Strasbourg University Hospitals.
EXEMPLE 1 : EXAMPLE 1
Les échantillons ont été prélevés à partir de patients ayant besoin d' analyses de laboratoire et qui ont donné par écrit leur consentement éclairé.  The samples were taken from patients who needed laboratory tests and gave their written consent in writing.
Le sang de 80 patients a été collecté, en même temps, dans deux types de tubes de prélèvement : (i) pour l'analyse du sérum, le sang a été collecté dans des tubes secs (BD vacutainer" SST II advance, réf. : 367957), et le sérum a été obtenu après centrifugation (4°C, 4000rpm, 10min), (il) pour l'analyse du plasma, le sang a été collecté dans des tubes d'héparinate de lithium (BD Vacutainer® LH PST II, réf : 367378, 17UI/ml) , et le plasma a été obtenu après centrifugation (4°C, 4000rpm, 10min). Blood from 80 patients was collected, at the same time, in two types of collection tubes: (i) for serum analysis, blood was collected in dried tubes (BD vacutainer "SST II advance, ref .: 367957), and the serum was obtained after centrifugation (4 ° C, 4000rpm, 10min), (II) for plasma analysis, the blood was collected in lithium heparin tubes (BD Vacutainer ® LH PST II, ref: 367378, 17UI / ml), and plasma was obtained after centrifugation (4 ° C, 4000rpm, 10min).
Les taux en morphine du plasma et du sérum ont été mesurés en utilisant un kit ELISA commercial spécifique de la morphine (kit ELISA réf : 213-0480, Immunalysis Corporation) . Les échantillons du plasma et du sérum (40μ1) ont été testés en double, et les valeurs du coefficient de variation (CV) étaient sous la limite des 8%. Les échantillons avec des CV plus élevés ont été re-testés afin d'obtenir des CV en dessous de 8%. Pour tous les tests, une morphine standard (0-25ng/ml) a été diluée dans 1% de PBS-BSA (w/v) pour les échantillons du sérum et dans 1% de PBS-BSA (w/v) contenant de l'héparinate de lithium (17UI/ml) pour les échantillons du plasma. La limite de détection calculée dans cette étude pour le lot de kit ELISA a été de 0,lng/ml de morphine. Comme expérience de contrôle, des concentrations connues de morphine diluée dans des tampons PBS ou PBS-héparinate de lithium ont été d'abord testés à l'aide du test ELISA. Aucune différence n'a été observée, montrant que l'héparinate de lithium n'affecte pas la détection de la morphine.  Morphine levels of plasma and serum were measured using a commercial ELISA kit specific for morphine (ELISA kit ref: 213-0480, Immunalysis Corporation). Plasma and serum samples (40μ1) were tested in duplicate, and the Coefficient of Variation (CV) values were below the 8% limit. Samples with higher CVs were re-tested to obtain CVs below 8%. For all tests, standard morphine (0-25 ng / ml) was diluted in 1% PBS-BSA (w / v) for serum samples and 1% PBS-BSA (w / v) containing lithium heparin (17 IU / ml) for plasma samples. The limit of detection calculated in this study for the ELISA kit lot was 0.1ng / ml of morphine. As a control experiment, known concentrations of morphine diluted in PBS or PBS-lithium heparin buffers were first tested using the ELISA assay. No differences were observed, showing that lithium heparin did not affect the detection of morphine.
Dans une seconde étape, des concentrations connues de morphine ont été ajoutées à du sérum et des tubes d'héparinate de lithium avant de collecter le sang frais (donneurs sains, n=4) . Dans les échantillons de plasma, 86% de la concentration de morphine initiale a été récupéré, alors que seulement 42% a été récupéré dans les échantillons de sérum. In a second step, known concentrations of morphine were added to serum and lithium heparin tubes before collecting fresh blood (healthy donors, n = 4). In the plasma samples, 86% of the initial morphine concentration was recovered, while only 42% was recovered in the serum samples.
Enfin, 80 patients ont été inclus dans trois groupes : (i) les donneurs sains (n=16), (ii) les patients traités à la morphine (patch transdermique de morphine, 12-48h avant la prise de sang, 20mg/jour, n=8), et (iii) les patients gravement malades (non traités à la morphine et de pathologies diverses, n=56) .  Finally, 80 patients were included in three groups: (i) healthy donors (n = 16), (ii) patients treated with morphine (morphine transdermal patch, 12-48h before blood draw, 20mg / day , n = 8), and (iii) critically ill patients (untreated with morphine and various pathologies, n = 56).
Les résultats sont présentés dans la figure 3.  The results are shown in Figure 3.
Chez les donneurs sains, la ME n'est pas détectable dans le sérum et dans les échantillons de plasma. Chez les patients traités à la morphine (figure 3, croix) , les concentrations moyennes de morphine dans les échantillons de sérum ont varié de 3,2ng/ml à 31ng/ml, alors que celles du plasma ont été trouvées entre 25,7ng/ml et 114, 8ng/ml . Par rapport à la concentration plasmatique, les concentrations en morphine dans le sérum ont été significativement plus faibles (-78115% en moyenne) . Chez les patients gravement malades (figure 3, points) , les taux de ME ont varié entre Ong/rnl (non détectable) et 23, 6ng/ml dans les échantillons de sérum et entre 0,15ng/ml et 76,3ng/ml dans les échantillons de plasma. Par rapport aux échantillons de plasma, les concentrations en ME dans le sérum ont été significativement plus faibles (de 13% à -98%, en moyenne -65132%) .  In healthy donors, EM is not detectable in serum and plasma samples. In patients treated with morphine (Figure 3, cross), mean morphine concentrations in serum samples ranged from 3.2 ng / ml to 31 ng / ml, whereas those from plasma were found to be between 25.7 ng / ml. ml and 114.8ng / ml. With respect to plasma concentration, serum morphine concentrations were significantly lower (-78115% on average). In critically ill patients (Figure 3, points), MOEs ranged from ng / rnl (undetectable) to 23.6 ng / ml in serum samples and from 0.15 ng / ml to 76.3 ng / ml. in the plasma samples. Compared to the plasma samples, serum ME concentrations were significantly lower (from 13% to -98%, averaging -65132%).
Comme le montre la figure 3, la concentration en ME ou en morphine exogène a été systématiquement plus élevé dans le plasma par rapport aux échantillons de sérum pour 61 sur 64 patients testés. Ensemble, ces résultats ont montré que les tubes d'héparinate de lithium ont été les plus appropriés pour quantifier efficacement la morphine endogène (ME) et exogène. Ainsi, lors de l'ajout de quantités connues de morphine, avant le prélèvement de sang, 86% de morphine initialement ajoutée a été détectée dans les échantilons « héparinate de lithium » tandis que seulement 42% de celle-ci a été détecté dans les échantillons « sérum ». Une explication de l'échec de la quantification de la morphine libre dans le sérum pourrait impliquer la liaison de la morphine à des protéines du sang. En effet, différentes liaisons de la morphine à des protéines ont d'ores et déjà été identifiées et comprennent l'albumine sérique et 1' alpha-l-glycoprotéines acide [47]. Fait intéressant, la détection de la morphine exogène dans le sang a montré qu'elle était très dépendante de l'urémie, une hypoalbuminémie, suggérant un lien important entre les protéines liant la morphine et la biodisponibilité de la morphine [47] . Autre fait intéressant, le lithium est considéré comme un agent chaotropique/dénaturant et peut donc augmenter la quantité de morphine libre et ainsi permettre la réalisation de dosage avec un meilleur rendement que les techniques de l'art. As shown in Figure 3, the concentration of exogenous ME or morphine was consistently higher in plasma compared to serum samples for 61 out of 64 patients tested. Together, these results showed that lithium heparin tubes were most appropriate for efficiently quantifying endogenous (ME) and exogenous morphine. Thus, when adding known amounts of morphine, prior to blood collection, 86% of morphine initially added was detected in the "lithium heparin" samples while only 42% of it was detected in the samples. "serum" samples. An explanation of the failure of quantification of free morphine in serum may involve the binding of morphine to blood proteins. Indeed, different links of morphine to proteins have already been identified and include serum albumin and alpha-1-acid glycoproteins [47]. Interestingly, the detection of exogenous morphine in the blood has been shown to be highly dependent on uremia, a hypoalbuminemia, suggesting an important link between morphine-binding proteins and morphine bioavailability [47]. Another interesting fact, lithium is considered as a chaotropic / denaturing agent and can therefore increase the amount of free morphine and thus allow the performance of dosage with a better yield than the techniques of the art.
In vivo, la libération de ME dans le sang est susceptible de survenir au cours de stress ou de situations pathologiques. Du fait du rôle majeur joué par la ME dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques , ainsi que du fait des résultats des inventeurs qui ont montré la perte conséquente de morphine endogène et exogène dans les sérums, la concentration en morphine endogène et exogène dans le sang doit être analysée sur du plasma collecté en tube héparinate de lithium plutôt que dans le sérum. In vivo, the release of ME in the blood is likely to occur during stress or pathological situations. Because of the major role played by EM in many physiological and physiopathological processes, as well as the results of the inventors who showed the consequent loss of endogenous and exogenous morphine in sera, the concentration of endogenous and exogenous morphine in the Blood should be analyzed on plasma collected in lithium heparin tube rather than in serum.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d'analyse d'un alcaloïde dans un échantillon biologique comprenant : A method of analyzing an alkaloid in a biological sample comprising:
a) la mise en contact dudit échantillon avec le lithium ou un dérivé de celui-ci ;  a) contacting said sample with lithium or a derivative thereof;
b) la mesure du taux d'alcaloïde obtenu à l'étape a) . 2) Procédé d'analyse selon la revendication 1, ledit procédé comprenant en outre une étape c) dans laquelle les résultats de mesure obtenus à l'étape b) sont comparés par rapport à un contrôle négatif et/ou positif .  b) measuring the alkaloid content obtained in step a). 2) An analysis method according to claim 1, said method further comprising a step c) wherein the measurement results obtained in step b) are compared with respect to a negative and / or positive control.
3) Procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative d'un alcaloïde dans un échantillon biologique comprenant : 3) Process for the qualitative and / or quantitative analysis of an alkaloid in a biological sample comprising:
a) la mise en contact dudit échantillon avec une le lithium ou un dérivé de celui-ci ;  a) contacting said sample with lithium or a derivative thereof;
b) la mesure du taux d'alcaloïde obtenu à l'étape a) ;  b) measuring the alkaloid level obtained in step a);
c) la comparaison des résultats de mesure obtenus à l'étape b) par rapport à une courbe étalon.  c) comparing the measurement results obtained in step b) with respect to a standard curve.
4) Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où le taux d'alcaloïde mesuré est choisi parmi les alcaloïdes naturels exogènes ou endogènes, de préférence la morphine et ses dérivés. 4) A method of analysis according to any one of claims 1 to 3, wherein the measured alkaloid level is selected from exogenous or endogenous natural alkaloids, preferably morphine and its derivatives.
5) Kit d'analyse d'un alcaloïde comprenant du lithium ou un dérivé de celui-ci, et les moyens de mesure de taux d'alcaloïde circulant dans les tissus et fluides corporels. 5) Kit for analyzing an alkaloid comprising lithium or a derivative thereof, and the means for measurement of circulating alkaloid level in tissues and body fluids.
6) Utilisation du lithium ou d'un dérivé de celui- ci pour le dosage du taux d'alcaloïde dans les tissus et fluides corporels d'un animal ou d'un humain. 6) Use of lithium or a derivative thereof for the determination of the alkaloid level in the tissues and body fluids of an animal or a human.
7) Utilisation du lithium ou d'un dérivé de celui- ci selon la revendication 6, où le fluide corporel est choisi parmi l'urine, le sang, la salive et le liquide céphalorachidien . 7) Use of lithium or a derivative thereof according to claim 6, wherein the body fluid is selected from urine, blood, saliva and cerebrospinal fluid.
8) Utilisation du lithium ou d'un dérivé de celui- ci selon la revendication 6, où le tissu est choisi parmi le tissu cérébral, pulmonaire, hépatique, ou musculaire . 8) Use of lithium or a derivative thereof according to claim 6, wherein the tissue is selected from brain, lung, liver, or muscle tissue.
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