WO2013005403A1 - 熱中症に対する発症感受性や発症耐性の判定方法 - Google Patents

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WO2013005403A1
WO2013005403A1 PCT/JP2012/004209 JP2012004209W WO2013005403A1 WO 2013005403 A1 WO2013005403 A1 WO 2013005403A1 JP 2012004209 W JP2012004209 W JP 2012004209W WO 2013005403 A1 WO2013005403 A1 WO 2013005403A1
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heat stroke
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博 木戸
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応用酵素医学研究所株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a test for genetic polymorphism as a predisposition to heat stroke. Furthermore, the present invention relates to a method for examining whether or not the ATP level in a patient's blood is a constitution that is likely to cause heat stroke or how serious it is. Furthermore, the present invention relates to a drug related to the treatment of heat stroke against the background of genetic polymorphism testing. That is, the present invention relates to a method for determining onset susceptibility or onset resistance to heat stroke, an onset susceptibility or onset resistance detection kit for heat stroke, and a therapeutic / preventive drug for heat stroke.
  • Heat stroke is a general term for symptoms caused by the heat of the outside air. It is a systemic disease caused by dehydration due to sweat and peripheral blood vessel dysfunction caused by peripheral blood vessel dilatation in a high temperature and high humidity environment. In some cases, multiple organ failure results in death. It is a very dangerous pathology that causes damage to the body's ability to regulate body temperature, which is usually kept constant, and can lead to increased body temperature and sometimes death. Especially due to recent climate tropicalization and urban heat island phenomenon, there are increasing cases of heat stroke not only during sports and outdoor activities, but also in daily life indoors, which has become a social problem, and countermeasures have been taken. I'm in a hurry.
  • the treatment of heat stroke is mainly symptomatic treatment such as oral administration of infusion solution, saline solution and sports drink for eliminating dehydration, and cold therapy for lowering body temperature.
  • a sports drink that replenishes water and prevents dehydration such as heat stroke (Patent Document 1)
  • a cooling composition that is effective in suppressing or preventing body temperature increase or body temperature increase after exercise Patent Document 2
  • a deep body temperature lowering agent Patent Document 3
  • a basal metabolism inhibitor Patent Document 4 for suppressing basal metabolism or lowering the body temperature are disclosed.
  • it is symptomatic and there is no causal treatment.
  • the heat stroke prevention method pays attention to the temperature, humidity, and body temperature of the outside air, and tries to take in water and salt.
  • the heat stroke is clearly affected by the physical strength, constitution, and physical condition of the individual.
  • Carnitine-palmitoyl-transferase-II is one of the enzymes that work in the carnitine cycle, and separates the acylcarnitine contained in the matrix in mitochondria into carnitine and acyl-CoA. Acyl-CoA is then converted to acetyl-CoA by ⁇ -oxidation, combined with oxaloacetate and taken into the TCA circuit (citric acid circuit) to generate ATP.
  • the present inventors have various transporters involved in energy metabolism in mitochondria, including CPTII, carnitine circuit, long chain ⁇ oxidation circuit, medium chain / short chain ⁇ oxidation circuit, electron transfer, ketone body synthesis and ATP production.
  • Patent Document 5 A method of diagnosing the high possibility of developing a central nervous system symptom with residual sequelae or a disease such as multi-organ failure is disclosed (Patent Document 5).
  • the disease include influenza encephalitis / encephalopathy, Reye syndrome, RS virus infection, adenovirus infection, rhinovirus infection, rubella, Japanese encephalitis, malaria infection, sudden infant death syndrome, and Kawasaki disease. The association with the disease is not clear.
  • Bezafibrate 2-za (4- ⁇ 2- [(4-Chlorobenzoyl) amino] ethyl ⁇ phenoxy) -2- methylpropanoic acid), is a fibrate-based high fat that has a serum triglyceride lowering effect and a serum cholesterol improving action. It is a therapeutic agent for septicemia. Further, bezafibrate is an agonist of PPAR (pan-peroxisome proliferator activated receptor), and is further known to increase CPTII mRNA level and enhance CPTII expression (Non-patent Documents 1 and 2).
  • PPAR pan-peroxisome proliferator activated receptor
  • An object of the present invention is to provide a method for determining onset susceptibility and / or onset resistance to heat stroke, an onset sensitivity and / or onset resistance detection kit for heat stroke, and a therapeutic / preventive drug for heat stroke.
  • Heat stroke is a systemic disease that occurs as a result of blood circulation insufficiency caused by dehydration by sweating and peripheral vasodilation in a high-temperature and high-humidity environment.
  • Heat stroke is a systemic disease that occurs as a result of blood circulation insufficiency caused by dehydration by sweating and peripheral vasodilation in a high-temperature and high-humidity environment.
  • there has been a tendency for many patients to die from heat stroke and many research requests have been sent to the institution of the inventor who has been analyzing the relationship between enzymes and diseases for many years. ing.
  • As a result of genetic polymorphism analysis on heat stroke conducted by the present inventor it was found that about half of the patients with heat stroke have a high concentration of the gene polymorphism of mitochondrial long-chain fatty acid metabolizing enzyme Carnitinemipalmitoyltransferase II (CPTII). It was discovered and found to be one of the causative genes for heat stroke
  • CPTII is the most important enzyme that regulates ATP production derived from mitochondrial long-chain fatty acid metabolism together with CPTI, and gene mutation of CPTII is the most frequent gene mutation (Ref. 1, 2, 3).
  • thermolabile gene polymorphism In the case of a thermolabile gene polymorphism, CPTII is heat-inactivated with an increase in body temperature, resulting in an acquired gene-deficient state, and suddenly the amount of ATP production decreases, resulting in malfunction of organs and cells throughout the body. It was thought to be the cause. Among them, organs and cells that consume a high amount of ATP are brain, heart, and vascular endothelial cells, and it is expected that these organs and cells are prone to malfunction. In particular, in vascular endothelial cell ⁇ (Ref. 4) ⁇ , which depends on fat for about 70% of the cell's energy source, it is speculated that the CPTII heat-labile gene polymorphism has a significant effect on the onset. It is presumed that the vascular endothelial cells of the brain are strongly affected by cells with high mitochondrial content and high ATP production (Ref. 5).
  • thermolabile CPTII gene polymorphism The amino acid mutations of the thermolabile CPTII gene polymorphism that have been clarified so far by the inventors are shown below. 1) c.1055T> G (p.Phe352Cys) (Ref. 6,7,8) 2) c.1102G> A (p.Val368Ile) (Ref. 6,7,8) 3) c.1511C> T (p.Pro504Leu) (Ref. 7) 4) c.1813G> C (p.Val605Leu) (Ref. 7) 5) c.647A> G (p.Glu216Arg) (Ref.9) Ref. 1: McGarry JD, Foster DW. 1980. Systemic carnitine deficiency.
  • Ref. 5 WH Oldendorf, MECornford, WJ Brown. 1977.
  • the large apparent work capability of the blood-brain barrier a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.Ann. Neurol. 1 : 409-417.
  • Ref. 6 Y. Chen, H. Mizuguchi, D. Yao, M. Ide, Y. Kuroda, Y. Shigematsu, S. Yamaguchi, M. Yamaguchi, M. Kinoshita, H. Kido. 2005.
  • the present inventors have found that a single nucleotide polymorphism in CPTII is involved in onset susceptibility or onset resistance to heat stroke, a method for determining onset susceptibility or onset resistance to heat stroke, onset susceptibility to heat stroke, or The present invention has been completed by providing an onset resistance detection kit and a therapeutic and / or prophylactic agent for heat stroke.
  • the present invention provides [1] (a) a step of detecting the presence or absence of one or more single nucleotide polymorphisms in a subject's Carnitine palmitoyltransferase II (CPTII) gene; (b) one in step (a) Steps (a) and (b) characterized in that if there is a nucleotide polymorphism, the onset susceptibility to heat stroke is high or the onset tolerance is low; Onset tolerance determination method, [2] single nucleotide polymorphism is: i) base number 1102 in the CPTII gene is G / A or A / A; ii) base number 1055 in the CPTII gene is T / G or G / G; iii) Base number 1511 in CPTII gene is C / T or T / T; iv) Base number 1813 in CPTII gene is G / C or C / C; v) Base number 1 in CPTI
  • Detection of the presence or absence of a single nucleotide polymorphism is performed by a method using sequencing using PCR, and the onset susceptibility to or resistance to onset of heat stroke according to any one of the above [1] to [3] It relates to a determination method.
  • the present invention also provides a kit for detecting onset susceptibility or onset resistance to heat stroke, comprising a primer or probe for detecting a single nucleotide polymorphism in [5] CPTII gene, and [6] one in CPTII gene.
  • the primer for detecting a nucleotide polymorphism is selected from SEQ ID NOs: 3 to 24, and the onset susceptibility to onset of heat stroke or onset resistance detection kit described in [5], or [7] a fibrate drug as an active ingredient It relates to a therapeutic / preventive agent for heat stroke characterized by the above, and a therapeutic / preventive agent for heat stroke described in [7] above, which is used in combination with [8] carnitin.
  • the present invention it is possible to determine onset susceptibility and onset resistance to heat stroke, and to provide a therapeutic / preventive drug for heat stroke.
  • CPTII enzyme activity, FAO level, and ATP level are shown when heat (41 ° C.), bezafibrate or carnitine is given to fibroblasts of wild type, FI-FI, CI-FI CPTII genotype.
  • the heat stroke in the present invention refers to a symptom caused by an environment such as high temperature and high humidity, which is also called heat stroke, sunstroke, or high temperature injury. It is a continuous pathological condition from the state of regulation of thermoregulatory function to the dysfunction of organs throughout the body, including symptoms such as heat stroke, heat fatigue, heat convulsions, heat syncope, heat damage and multiple organ failure. Specifically, dizziness, tiredness, collapse, head weight, vomiting, loss of consciousness, dehydration, hyperventilation, shock, increased body temperature, sweating, changes in skin temperature and dryness, disturbance of consciousness, involuntary Painful convulsions and stiffness, brain damage, death due to multiple organ failure, etc. can be mentioned.
  • onset susceptibility or onset resistance to heat stroke refers to onset susceptibility and / or onset resistance to heat stroke, and is susceptible to heat stroke and / or recovery when suffering from heat stroke.
  • Resistant to heat stroke means that it is difficult to develop heat stroke even if it is placed in an environment with high temperature and humidity, or even when heat stroke has occurred. It is easy to do. Therefore, it can be said that individuals who are determined to have low onset susceptibility or resistance to heatstroke need to be prepared for heatstroke, especially in high-temperature and high-humidity environments. It can be said that it is necessary to watch over the progress with particular attention to whether it becomes serious.
  • the method for determining the onset susceptibility or onset resistance to heat stroke of the present invention can be suitably used before and after suffering from heat stroke, or when there is a risk of suffering.
  • infants who cannot successfully communicate physical condition changes to others, elderly persons who have become less sensitive to physical condition changes, and those who have a basic disease and are predicted to have low basic physical fitness the onset of heat stroke of the present invention It is particularly useful to examine sensitivity or onset resistance.
  • a person with low onset susceptibility or resistance to heat stroke is suffering from heat stroke, it is possible to observe the progress with special care and to take measures such as preparing for sequelae or seriousness. it can.
  • the method for determining the onset susceptibility or onset resistance to heat stroke of the present invention comprises the steps of: (a) detecting the presence or absence of one or more single nucleotide polymorphisms in a subject's Carnitine palmitoyl transferase II (CPTII) gene.
  • CPTII Carnitine palmitoyl transferase II
  • the step of determining that the onset susceptibility to heat stroke is high or the onset resistance is low may be a determination method, and as one embodiment, a method of collecting data for determining onset susceptibility or onset resistance to heat stroke comprising the steps (a) and (b), and the above step (a ) And (b) can also be exemplified as a method of collecting data for heat stroke treatment policy determination.
  • a method of collecting data for determining onset susceptibility or onset resistance to heat stroke comprising the steps (a) and (b), and the above step (a ) And (b) can also be exemplified as a method of collecting data for heat stroke treatment policy determination.
  • it can be used as a method for determining onset susceptibility or onset resistance to heat stroke, or it can be used as data for determining onset susceptibility or onset resistance to heat stroke. it can.
  • a sample of a subject eg, blood, hair, nails, oral mucosa, etc.
  • the base sequence and amino acid sequence information of the CPTII gene are NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/hgmd0.html), etc. It can be appropriately obtained using a database.
  • CPTII nucleotide sequence of accession number NM_000098, version NM_000098.2, GI: 169790951, and CPTII amino acid sequence of accession number NP_000089, version NP_000089.1, GI: 4503023 be able to.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the coding region of the CPTII gene based on the above data
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the CPTII protein.
  • Single nucleotide mutations that occur at a frequency of 1% or more in a population are called single nucleotide polymorphisms (SNPs) and refer to diversity in which one nucleotide in a genomic nucleotide sequence is mutated.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the CPTII single nucleotide polymorphism (SNP) is not particularly limited as long as it is a single nucleotide substitution mutation in the CPTII gene, and may be an insertion, substitution, or deletion.
  • the single nucleotide polymorphism in the CPTII gene coding region is a missense mutation in which the amino acid sequence of the protein changes, and is preferably a single nucleotide polymorphism that impairs the stability of the protein.
  • the single nucleotide polymorphism is preferably a single nucleotide polymorphism that reduces the expression of the CPTII gene.
  • One type of single nucleotide polymorphism to be detected in the step (a) may be used, but an example of detecting a plurality of single nucleotide polymorphisms is preferable.
  • Base number 1102 in the CPTII gene is G / A or A / A ii)
  • the base number 1055 in the CPTII gene is T / G or G / G iii) C / T or T / T is the base number 1511 in the CPTII gene iv)
  • Base number 1813 in the CPTII gene is G / C or C / C v)
  • the base number 1939th position in the CPTII gene is A / G or G / G It is preferable to detect one or more single nucleotide polymorphisms selected from i) to v).
  • the single nucleotide polymorphism causes amino acid mutations in the proteins i) F352C, ii) V358I, iii) F504L, iv) V605L, and v) M647V.
  • A, T, C, and G in the base sequence are one-letter codes of bases, respectively, and represent adenine, thymine, cytosine, and glycine.
  • F, C, V, I, L, and M in the protein amino acid sequence are amino acid It is a single letter code and represents phenylalanine, cysteine, valine, isoleucine, leucine, methionine.
  • 1055T / G as a genotype of single base substitution indicates that the base T of the 1055th base number in the CPTII gene on the genomic DNA is G, and may be expressed as 1055T> G.
  • the notation “1055th is T / G or G / G” means that the base T is G, and even if the heterotype is mutated on one side, both are mutated. However, it means that it develops, that is, a dominant negative.
  • F352C represents that the amino acid at amino acid number 352 was changed from F to C by this mutation.
  • the 352nd amino acid F may also be represented as 352F.
  • i) F352C and / or ii) V368I can be preferably exemplified.
  • the method for determining the onset susceptibility or onset resistance to heat stroke of the present invention can further comprise (c) a step of measuring blood ATP concentration.
  • the method for measuring ATP (adenosine triphosphate) in blood is not particularly limited, and it can be measured using various blood component analyzers or any known ATP measurement method.
  • ATP can be efficiently extracted from a sample and analyzed for the amount of ATP by using the method using phenol in International Publication No. WO2009 / 096429.
  • the origin of the sample blood is not particularly limited, and examples thereof include humans, cows, horses, sheep, goats, pigs, birds, dogs, cats, rats, mice, hamsters, and preferably humans.
  • the site and type of blood to be collected are not limited, and any of peripheral blood, blood collected from tissues, umbilical cord blood, venous blood, and arterial blood may be used.
  • Peripheral blood is preferred because of its availability.
  • Such blood samples may contain additives such as antiseptics, fungicides, anticoagulants such as EDTA and heparin, and remove some of the blood components as long as they do not interfere with genomic DNA analysis or ATP measurement. Or only a part of the components may be taken out and used.
  • the method for detecting the presence or absence of a single nucleotide polymorphism in the present invention is not particularly limited, and a certain genomic DNA can be amplified by a PCR reaction, and the nucleotide sequence can be examined by the Sanger method to identify a single nucleotide polymorphism.
  • Single base substitution can also be detected using probes that detect specific single base substitutions, direct sequencing method, single base primer extension method, PCR-single chain conformation polymorphism (SCPS) analysis, PCR-restriction Enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis, invader methods, and mass spectrometry can be used.
  • Such a single nucleotide polymorphism detection template is not limited to DNA but can be used for gene polymorphism analysis using RNA as a material, and gene expression quantification by quantitative real-time PCR detection can also be performed.
  • gene polymorphisms involving amino acid substitution radioimmunoantibody assay, enzyme immunoassay (ELISA), and the like are also possible.
  • a method of immobilizing on a solid support such as a bead, a chip, or a membrane and measuring a polymorphism can be mentioned.
  • the onset susceptibility or onset resistance detection kit for heat stroke of the present invention is not particularly limited as long as it contains a primer or probe for detecting a single nucleotide polymorphism in the CPTII gene.
  • the primer is SEQ ID NO: 3 to There can be mentioned 24 primers.
  • these primers may be appropriately labeled, and examples of the labeling substance include fluorescently labeled proteins, radioisotopes, peptides, enzymes, proteins, steroids and the like.
  • the therapeutic / preventive agent for heat stroke may be any agent that contains a fibrate drug as an active ingredient, and is a normal pharmaceutically acceptable carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent.
  • Various formulation ingredients such as a pH buffer, a disintegrant, a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent can be added.
  • the therapeutic / prophylactic agent of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • it can be administered orally in a dosage form such as powder, granule, tablet, capsule, syrup, suspension and the like.
  • Alternatively, for example, in the form of a solution, emulsion, suspension or the like it can be administered parenterally in the form of injection, or it can be administered intranasally in the form of spray.
  • fibrates examples include bezafibrate, beclobrate, vinylfibrate, ciprofibrate, clinofibrate, clofibrate, clofibrate aluminum, clofibric acid, etofibrate, fenofibrate, gemfibrozil, nicofibrate, pilifibrate, lonifibrate, sim
  • fibrate theofibrate, AHL-157, and bezafibrate is preferred.
  • Bezafibrate is a general name of 2- (4- ⁇ 2-[(4-Chlorobenzoyl) amino] ethyl ⁇ phenoxy) -2-methylpropanoic acid, and can be synthesized by, for example, the method disclosed in JP-A-10-204047. It can also be purchased and obtained.
  • tablets include excipients such as lactose and starch, talc, and magnesium stearate.
  • Lubricants such as hydroxypropylcellulose and polyvinylpyrrolidone, disintegrants such as carboxymethylcellulose, etc. can be blended.
  • Solvents such as physiological saline alcohol, polyethylene glycol, propylene Solubilizers such as glycol, suspending agents such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, lecithin, isotonic agents such as glycerin and D-mannitol, buffering agents such as phosphate, acetate and citrate Etc. can be blended. If necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be blended.
  • water-soluble solvents such as distilled water and physiological saline
  • solubilizing agents such as sodium salicylate
  • isotonic agents such as sodium chloride, glycerin and D-mannitol, human serum albumin, etc.
  • Stabilizers, preservatives such as methylparaben, and narcotics such as benzyl alcohol can be blended.
  • the dose of the therapeutic / preventive agent for heat stroke of the present invention can be appropriately selected depending on the type of disease, the weight and age of the patient, the dosage form, symptoms, etc.
  • the active ingredient when administered to an adult, the active ingredient
  • the dose of the therapeutic / preventive agent for heat stroke of the present invention containing bezafibrate as 1 to 10,000 mg per day, preferably 10 to 2,000 mg, more preferably 100 to 1,000 mg. It is desirable to administer 1 to 3 times a day.
  • parenteral administration of the therapeutic / prophylactic agent for heat stroke of the present invention include intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intramedullary administration, and transmucosal administration. Internal administration and subcutaneous administration are preferred.
  • the therapeutic / preventive agent for heat stroke of the present invention can be used in combination with carnitine and may be L-carnitine, D-carnitine, or DL-carnitine, preferably L-carnitine.
  • the therapeutic / preventive agent for heat stroke of the present invention may contain carnitine as one component, or the therapeutic / preventive agent for heat stroke of the present invention may be used.
  • Carnitine may be administered by the same administration method or another administration method before, during, or during administration.
  • the amplified product was analyzed for the base sequence of the CPTII gene using the DyeDeoxi TM Terminator Cycle Sequencing Kit and ABI-PRISM TM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). No. 352) and the presence or absence of single nucleotide polymorphisms at base number 1055 (amino acid number 368) were identified. The results are shown in Table 2.
  • the mutation CPTII [F352C] of the single nucleotide polymorphism [1055T> G / F352C] decreases in enzyme activity with high temperature, and when it exceeds 40 ° C., it becomes about 25-30% of the activity of wild type CPTII.
  • the mutant CPTII [V368I] of another single nucleotide polymorphism [1102G> A / V368I] has almost the same enzyme activity as that of the wild type after [V368I] alone is exposed to heat at 41 ° C.
  • [V368I] plus [F352C] polymorphism has been shown to be about 25-30% of the activity of wild-type CPTII after exposure to 41 ° C heat (WO 2006/054722). reference).
  • Wild type fibroblasts (FV-FVallels) of the genotype [F352F + V368V] were purchased from RIKEN cell bank. Fibroblasts were cultured and maintained in MEM (Invitrogen) containing 10% FCS (Roche) at 5% CO 2 and 37 ° C. When bezafibrate treatment or L-carnitine treatment was performed, pre-incubation was performed for 6 hours in MEM without serum, and bezafibrate (DMSO solution) was performed at a concentration of 100 to 800 ⁇ M, and carnitine (DMSO solution) was performed at a concentration of 50 ⁇ M.
  • DMSO solution bezafibrate
  • carnitine DMSO solution
  • CPTII protein expression level The protein expression level of CPTII in the wild type and FI-FI and CI-FI single nucleotide polymorphism fibroblasts was examined. The lysate of fibroblasts was subjected to SDS-PAGE using 10-20% gradient gel, transferred to a PVDF membrane, and 0.4 ⁇ g / ml anti-CPTII antibody (H-300, sc-20671, manufactured by Santa Cruz) The sample was subjected to Western blotting using. It was confirmed that CPTII expression was low in the fibroblasts of the single nucleotide polymorphism of FI-FI and CI-FI (FIG. 2).
  • First-strand cDNA template was synthesized with Super Script (registered trademark) III First-Strand kit (manufactured by Invitrogen), CPTII, using the following primers and real-time PCR using SYBR Green PCR kit (manufactured by Qiagen) PPAR- ⁇ and CPTIA mRNA expression levels were examined.
  • the PCR cycle was 30, 35, and 40 cycles of CPTII, PPAR- ⁇ , and CPTIA, respectively, with a denaturation step of 95 ° C for 30 seconds, an annealing step of 59 ° C for 30 seconds, and an extension step of 72 ° C for 50 seconds.
  • ⁇ -actin was used as an internal standard to normalize the results.
  • the primers used are as follows (SEQ ID NOs: 25 to 32).
  • the amount of ATP in the fibroblasts of the wild type and FI-FI, CI-FI single nucleotide polymorphism was examined, the amount of ATP in the fibroblasts of FI-FI, CI-FI single nucleotide polymorphism was Fewer than fibroblasts. That is, the amount of CPTII is increased by exposure to heat in wild-type cells, and it can be applied to the load on the body. However, in the case of heat stroke-related single nucleotide polymorphism cells, CPTII protein is low, so when exposed to heat. It can be thought of as one of the causes of the lack of energy, causing systemic symptoms of heat stroke, worsening, and delaying recovery.
  • bezafibrate for increasing the expression level of CPTII and L-carnitine which is a product of CPTII in energy production, were added to examine the amount of ATP in the cells.
  • FI-FI and CI-FI were analyzed with bezafibrate and L-carnitine. It was found that the amount of intracellular ATP in the nucleotide polymorphic fibroblasts increased (FIG. 4). That is, it is considered that heat stroke can be prevented by supplementing the energy shortage caused by heat stroke with bezafibrate or L-carnitine, or by supplementing the energy shortage with bezafibrate or L-carnitine.
  • heat stroke is not an extrinsic disease caused by physical stimulation, but heat stroke is considered to be an illness related to the energy crisis. It can be a risk factor for crisis.
  • heat stroke can be prevented by taking the heat stroke preventive / therapeutic agent of the present invention in advance when heat stroke is expected. If a person with such a risk factor suffers from heat stroke, measures such as careful follow-up can be taken. It can be said that administration of a drug supplementing CPTII function, bezafibrate and carnitine is effective in treating heat stroke.
  • the present invention can be suitably used in the field of determination methods for heat stroke and preventive / therapeutic drugs for heat stroke.

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Abstract

　本発明は、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法や、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キットや、熱中症の治療・予防薬を提供することを課題とした。解決手段として、（ａ）被検者のCarnitine palmitoyl transferase II遺伝子における１種又は２種以上の一塩基多型の有無を検出する工程；（ｂ）工程（ａ）において一塩基多型があった場合、熱中症に対する発症感受性が高い、又は発症耐性が低いと判定する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法を行うことである。

Description

熱中症に対する発症感受性や発症耐性の判定方法
　本発明は、熱中症の起こりやすい体質としての遺伝子多型の検査に関する。さらには、患者血液中のＡＴＰ量を測定することで、熱中症が起きやすい体質であるか、どの程度の重篤状態であるかを検査する方法に関する。さらには、遺伝子多型の検査を背景とした熱中症の治療に関する薬剤に関する。すなわち、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法や、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キットや、熱中症の治療・予防薬に関する。
　熱中症は、外気の熱さによって引き起こされる症状の総称であり、高温高湿下の環境で発汗による脱水と末梢血管拡張によって体内血液の循環不全が生じた結果起きる全身性の疾患で、重篤な場合は多臓器不全となって死亡する。通常一定に保たれる体温の調節機能に障害が引き起こされ、体温が上昇し時には死に至ることもある極めて危険な病態である。特に近年の気候の熱帯化、都市部のヒートアイランド現象などにより、スポーツ中や屋外活動中だけでなく室内の日常生活中においても熱中症となる例が増加しており社会問題ともなっており、対策が急がれている。熱中症の治療は主に、脱水を解消するための輸液や食塩水、スポーツドリンクなどの経口投与、体温を下げるための冷温療法などの対症療法である。例えば、水分を補給し、熱中症等の脱水症状を予防するスポーツ飲料（特許文献１）や、体温上昇又は運動後の体温上昇抑制、又は予防に効果を有する清涼用組成物（特許文献２）や、深部体温を低下させるための深部体温低下剤（特許文献３）や、基礎代謝の抑制又は体温の低下のための基礎代謝抑制剤（特許文献４）などが開示されているが、いずれも対症療法であり、原因療法はないのが現状である。また、熱中症の予防法は外気の温度や湿度、体温に注意を払い、水分と塩分の摂取を心がけるなどであるが、熱中症の罹患は個人の体力、体質、体調によるところも多いため明確な基準も設定されにくいという問題もある。したがって、体質的な熱中症へのかかりやすさや、熱中症になった場合の回復の容易さ、すなわち熱中症への耐性を調べることができれば、効果的に熱中症の予防及び治療を行うことができる。
　Carnitine palmitoyl transferase II（ＣＰＴII）はカルニチン回路で働く酵素の一つであり、ミトコンドリア内のマトリックスに入ったアシルカルニチンをカルニチンとアシル－ＣｏＡに分離する。ついでアシル－ＣｏＡはβ－酸化によりアセチル－ＣｏＡに変換され、オキサロ酢酸と結合してＴＣＡ回路（クエン酸回路）に取り込まれ、ＡＴＰが生成される。本発明者らは、ＣＰＴIIを含む、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関与する各種トランスポーター、カルニチン回路、長鎖β酸化回路、中鎖・短鎖β酸化回路、電子伝達、ケトン体合成およびＡＴＰ産生のいずれかに関与する少なくとも１種、好ましくは複数の酵素の酵素活性が３７℃を１００％としたとき、３９℃以上では健常者よりも有意に低下するか否かを調べ、高熱時に致死的又は後遺症の残る中枢神経症状、あるいは多臓器不全などの疾患を発症する可能性の高さを診断する方法を開示している（特許文献５）。前記疾患としては、インフルエンザ脳炎・脳症、ライ症候群、ＲＳウイルス感染症、アデノウイルス感染症、ライノウイルス感染症、風疹、日本脳炎、マラリア感染症、乳幼児突然死症候群、川崎病が挙げられるが、熱中症との関連明らかではない。
　一般名ベザフィブラート（Bezafibrate、2- (4- {2- [ (4 - Chlorobenzoyl) amino] ethyl} phenoxy) -2- methylpropanoic acid）は、血清トリグリセリド低下作用とともに血清コレステロール改善作用を有するフィブラート系の高脂血症治療剤である。また、ベザフィブラートはＰＰＡＲ（pan-peroxisome proliferator activated receptor）のアゴニストであり、さらにＣＰＴIIのｍＲＮＡレベルを上昇させ、ＣＰＴIIの発現を亢進することが知られている（非特許文献１及び２）。
特開２００３－１６９６４２号公報 特開２０１１－３２２３９号公報 特開２００９－２３５０５０号公報 特開２００５－２４７７４３号公報 再表２００６－０５４７２２号公報
Zolkipli Z. et al., PLoS One. 1; 6 (4): e17534 1-10 (2011) Djouadi F. et al., J Clin Endocrinol Metab. Mar; 90 (3): 1791-1797 (2005)
　本発明の課題は、熱中症に対する発症感受性及び／又は発症耐性の判定方法や、熱中症に対する発症感受性及び／又は発症耐性検出キットや、熱中症の治療・予防薬を提供することにある。
　熱中症は、高温高湿下の環境で発汗による脱水と末梢血管拡張によって体内血液の循環不全が生じた結果起きる全身性の疾患で、重篤な場合は多臓器不全となって死亡する。近年熱中症で死亡する患者が多発する傾向にあり、酵素と疾患との関係を長年解析している本発明者の研究機関に、疾患発症の背景としての体質に関する遺伝子解析の依頼が多く寄せられている。本発明者が行った熱中症に関する遺伝子多型解析の結果、熱中症患者の約半数にミトコンドリアの長鎖脂肪酸代謝酵素Carnitine palmitoyltransferase II（ＣＰＴII）の遺伝子多型が高頻度に集中していることを見いだし、熱中症の原因遺伝子の一つであることが解明された。
　見いだされたＣＰＴIIの遺伝子多型は、新規の遺伝子多型を含めていずれもＣＰＴIIの先天性酵素欠損症として報告されている遺伝子変異ではなく、これまで疾患との関係が明らかでなかった遺伝子多型であり、本発明者がこれまでに明らかにしてきた熱不安定性遺伝子多型のうちの一つであった。ＣＰＴIIは、ＣＰＴＩと共にミトコンドリアの長鎖脂肪酸代謝に由来するＡＴＰ産生を調節している最も重要な酵素で、遺伝子変異としてはＣＰＴIIの遺伝子欠損が最も頻度が高い（Ref. 1, 2, 3）。熱不安定性遺伝子多型の場合、体温上昇に伴ってＣＰＴIIが熱失活して後天性遺伝子欠損状態になってしまうため、突如としてＡＴＰ産生量が低下して全身の臓器、細胞の機能不全が生じることが原因と考えられた。中でもＡＴＰの消費量の高い臓器、細胞は脳、心臓、血管内皮細胞で、これらの臓器と細胞が機能不全に陥り易いことが予想される。特に、細胞のエネルギー源の約７０％を脂肪に依存している血管内皮細胞 (Ref. 4) では、ＣＰＴIIの熱不安定性遺伝子多型は発症に大きな影響を与えることが推測される。脳の血管内皮細胞はミトコンドリア含量が高くＡＴＰ産生の高い細胞 (Ref. 5) で、強く影響を受けることが推定される。
　以下にこれまでに発明者等が明らかにした熱不安定性ＣＰＴII遺伝子多型のアミノ酸変異を示す。
1) c.1055T>G (p.Phe352Cys) (Ref. 6,7,8)
2) c.1102G>A (p.Val368Ile) (Ref. 6,7,8)
3) c.1511C>T (p.Pro504Leu) (Ref. 7)
4) c.1813G>C (p.Val605Leu) (Ref. 7)
5) c.647A>G (p.Glu216Arg) (Ref.9)
Ref. 1: McGarry JD, Foster DW. 1980. Systemic carnitine deficiency. N Engl J Med 303:1413-1415.
Ref. 2: Bieber LL. 1988. Carnitine. Annu Rev Biochem 57: 261-283.
Ref. 3: Bonnefont JP, Djouadi F, Prip-Buus C, Gobin S, Munnich A, Bastin J. 2004. Carnitine palmitoyltransferase 1 and 2: biochemical, molecular and medical aspects. Mol Aspects Med 25: 495-520.　
Ref. 4: Z. Dagher, N. Ruderman, K. Tornheim, Y. Ido. 2001. Acute regulation of fatty acid oxidation and AMP-activated protein kinase in human umbilical vein endothelial cells. Circ. Res. 88:1276-1282.
Ref. 5: W.H. Oldendorf, M.E.Cornford, W.J. Brown. 1977. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann. Neurol. 1 :409-417.
Ref. 6: Y. Chen, H. Mizuguchi, D. Yao, M. Ide, Y. Kuroda, Y. Shigematsu, S. Yamaguchi, M. Yamaguchi, M. Kinoshita, H. Kido. 2005. Thermolabile phenotype of carnitine palmitoyltransferase II variations as a predisposing factor for influenza-associated encephalopathy. FEBS Lett. 579:2040-2044.
Ref. 7: D. Yao, H. Mizuguchi, M. Yamaguchi, H. Yamada, J. Chida, K. Shikata, H. Kido. 2008. Thermal instability of compound variants of carnitine palmitoyltransferase II and impaired mitochondrial fuel utilization in influenza-associated encephalopathy. Hum. Mutat. 29:718-727.
Ref. 8: M. Kubota, J. Chida, H. Hoshino, H. Ozawa, A. Koide, H. Kashii, A. Koyama, Y. Mizuno, A. Hoshino, M. Yamaguchi, D. Yao, M. Yao, H. Kido. 2011. Thermolabile CPT II variants and low blood ATP levels are closely related to severity of acute encephalopathy in Japanese children. Brain Dev. PMID: 21277129
Ref.9: D. Yao, M. Yao, M. Yamaguchi, J. Chida, H. Kido. 2011. Characterization of compound missense mutation and deletion of carnitine palmitoyltransferase II in a patient with adenovirus-associated encephalopathy. J. Med. Invest. In press.
　以上の通り、熱不安定性遺伝子多型を持つ患者は日常生活では何も症状を持たないで生活できているが、インフルエンザ脳症への罹患など体温上昇と共に発症していることから、発明者の見いだした熱不安定性遺伝子多型は潜在的に高熱を伴う疾患との関連を示唆するものの、外因的な、主に高温及び湿度に起因するとされてきた熱中症との関連はまったく明らかではなかった。さらに、熱中症とＡＴＰなどのエネルギー枯渇との関連も明らかではなく、熱不安定性遺伝子多型の中でもＣＰＴII、特にＣＰＴII単独の一塩基多型が熱中症の発症や病態と関連することは、まったく予想できないものであった。
　本発明者らは、ＣＰＴIIにおける一塩基多型が熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性に関与することを見出し、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法や、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キットや、熱中症の治療及び／又は予防薬を提供することにより本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は［１］（ａ）被検者のCarnitine palmitoyltransferase II (ＣＰＴII) 遺伝子における１種又は２種以上の一塩基多型の有無を検出する工程；（ｂ）工程（ａ）において一塩基多型があった場合、熱中症に対する発症感受性が高い、又は発症耐性が低いと判定する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法や、［２］一塩基多型が、ｉ）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１１０２番目がＧ／Ａ又はＡ／Ａ；ii）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１０５５番目がＴ／Ｇ又はＧ／Ｇ；iii）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１５１１番目がＣ／Ｔ又はＴ／Ｔ；iv）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１８１３番目がＧ／Ｃ又はＣ／Ｃ；ｖ）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１９３９番目がＡ／Ｇ又はＧ／Ｇ；のｉ）～ｖ）から選ばれる１種又は２種以上の一塩基多型である前記［１］記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法や、［３］さらに（ｃ）血中ＡＴＰ濃度を測定する工程；を備えたことを特徴とする、前記［１］又は［２］記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法や、［４］一塩基多型の有無の検出が、ＰＣＲ法を用いたシークエンシングによる方法で行われる前記［１］～［３］のいずれか記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法に関する。
　また、本発明は［５］ＣＰＴII遺伝子における一塩基多型を検出するためのプライマー又はプローブを含むことを特徴とする熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キットや、［６］ＣＰＴII遺伝子における一塩基多型を検出するためのプライマーが、配列番号３～２４から選ばれる前記［５］記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キットや、［７］フィブラート系薬物を有効成分とすることを特徴とする熱中症の治療・予防薬や、［８］カルニチン（carnitin）と合わせて使用することを特徴とする、前記［７］記載の熱中症の治療・予防薬に関する。
　本発明によれば、熱中症に対する発症感受性や発症耐性の判定することができ、また熱中症の治療・予防薬を提供することができる。
ＣＰＴII一塩基多型の解析結果を示す図である。 野生型、ＦＩ－ＦＩ（Ｆ３５２Ｆ及びＶ３６８Ｉ）、ＣＩ－ＦＩ（Ｆ３５２Ｃ及びＶ３６８Ｉ／Ｆ３５２Ｆ及びＶ３６８Ｉ）のＣＰＴII遺伝子型の繊維芽細胞におけるＣＰＴIIタンパク質発現量を示す。 野生型、ＦＩ－ＦＩ、ＣＩ－ＦＩのＣＰＴII遺伝子型の繊維芽細胞に、熱（４１℃）及びベザフィブラートを与えた場合の、ＣＰＴII、ＰＰＡＲδ、及びＣＰＴIAのｍＲＮＡ発現量、並びにＣＰＴIIタンパク質発現量を示す。 野生型、ＦＩ－ＦＩ、ＣＩ－ＦＩのＣＰＴII遺伝子型の繊維芽細胞に、熱（４１℃）、ベザフィブラート又はカルニチンを与えた場合のＣＰＴII酵素活性、ＦＡＯレベル、ＡＴＰレベルを示す。
　本発明における熱中症は、熱射病、日射病、高温障害とも呼ばれる、高温や多湿などの環境が原因となって起こるとされる症状を指す。体温調節機能の失調状態から、全身の臓器の機能不全に至るまでの連続的な病態であり、熱射病、熱疲労、熱痙攣、熱失神、熱障害による多臓器不全などの症状も含み、具体的にはめまい、疲労感、虚脱感、頭重、嘔吐、意識の消失、脱水症状、過呼吸、ショック症状、体温の上昇、発汗の増減、皮膚の温度変化や乾燥、意識障害、不随意性有痛性痙攣と硬直、脳障害、多臓器不全等による死亡を挙げることができる。
　本発明における「熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性」としては、熱中症に対する発症感受性及び／又は発症耐性であり、熱中症へのかかりやすさ、及び／又は、熱中症にかかった場合の回復の容易さを指す。「熱中症に耐性がある」とは、温度や湿度が高い条件の環境の中に置かれても熱中症を発症しにくいことをいい、又は熱中症を発症してしまった場合にも、回復しやすいことをいう。したがって、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性が小さいと判定される個体は、特に高温や多湿の環境において熱中症への備えが必要であるといえるし、熱中症にかかった場合も、熱中症が重篤化しないか、特に注意して経過を見守る必要があるといえる。したがって、本発明の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法は、熱中症罹患前後、罹患の恐れがある場合などにも好適に利用することができる。特に、体調変化をうまく他者に伝えられない乳幼児や、体調変化の感知が鈍くなった高齢者や、基礎疾患を有し基礎体力が少ないと予測される者が、本発明の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性を調べておくことは特に有用である。また、かかる熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性が弱い者が熱中症にかかっている場合には、特に注意して経過を観察したり、後遺症、重篤化に備えるなどの方策を講じることができる。
　本発明の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法は、（ａ）被検者のCarnitine palmitoyl transferase II (ＣＰＴII) 遺伝子における１種又は２種以上の一塩基多型の有無を検出する工程；及び（ｂ）工程（ａ）において一塩基多型があった場合、熱中症に対する発症感受性が高い、又は発症耐性が低いと判定する工程；を備えた熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法であればよく、実施の一形態として、上記工程（ａ）及び（ｂ）を備えた熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定のためのデータを収集する方法や、上記工程（ａ）及び（ｂ）を備えた熱中症の治療方針決定のためのデータを収集する方法を例示することもできる。他に公知の血液検査等の検査結果のデータも合わせて、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法とすることも、熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定のデータとすることもできる。一塩基多型の有無の検出においては、ＤＮＡを含む被検者の試料（例えば血液、毛髪、爪、口腔粘膜等）を試料として用いることができる。
　ＣＰＴII遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、ＨＧＭＤ（http://www.hgmd.cf.ac.uk/hgmd0.html）などのデータベースを用いて適宜入手することができ、例えばアクセッション番号NM_000098、バージョンNM_000098.2、GI:169790951のＣＰＴII塩基配列や、アクセッション番号NP_000089、バージョンNP_000089.1、GI:4503023のＣＰＴIIアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号１に前記データに基づくＣＰＴII遺伝子のコード領域の塩基配列を、配列番号２にＣＰＴIIタンパク質のアミノ酸配列を示す。
　集団内で１％以上の頻度で見られる、一塩基変異は一塩基多型（ＳＮＰ：Single Nucleotide Polymorphism）と呼ばれ、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異した多様性をいう。本発明においてＣＰＴIIの一塩基多型（ＳＮＰ）としては、ＣＰＴII遺伝子における一塩基置換変異であれば特に制限されず、挿入、置換、欠失であってもよい。ＣＰＴII遺伝子コード領域における一塩基多型は、タンパク質のアミノ酸配列が変化するミスセンス変異であり、タンパク質の安定性が損なわれる一塩基多型が好ましく、ＣＰＴII遺伝子の５’上流や３’下流の領域における一塩基多型としては、ＣＰＴII遺伝子の発現が減少する一塩基多型が好ましい。工程（ａ）において検出するかかる一塩基多型は、１種類でもよいが、好ましくは複数の一塩基多型を検出する例を挙げることができる。本発明の熱中症に対する発症感受性又は発症耐性の判定方法においては、
ｉ）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１１０２番目がＧ／Ａ又はＡ／Ａ
ii）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１０５５番目がＴ／Ｇ又はＧ／Ｇ
iii）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１５１１番目がＣ／Ｔ又はＴ／Ｔ
iv）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１８１３番目がＧ／Ｃ又はＣ／Ｃ
ｖ）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１９３９番目がＡ／Ｇ又はＧ／Ｇ
のｉ）～ｖ）から選ばれる１種又は２種以上の一塩基多型を検出することが好ましい。上記一塩基多型により、ｉ）Ｆ３５２Ｃ、ii）Ｖ３５８Ｉ、iii）Ｆ５０４Ｌ、iv）Ｖ６０５Ｌ、ｖ）Ｍ６４７Ｖのタンパク質のアミノ酸変異が起こる。ここで、塩基配列におけるＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇはそれぞれ塩基の１文字表記でありアデニン、チミン、シトシン、グリシンを表し、タンパク質アミノ酸配列におけるＦ，Ｃ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍはアミノ酸の一文字表記でありフェニルアラニン、システイン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンを表す。また一塩基置換のジェノタイプとして例えば１０５５Ｔ／Ｇは、ゲノムＤＮＡ上のＣＰＴII遺伝子における塩基番号１０５５番目の塩基ＴがＧであることを表し、１０５５Ｔ＞Ｇとして表すこともある。なお、一塩基多型の記載において、例えば「１０５５番目がＴ／Ｇ又はＧ／Ｇ」の表記は、塩基ＴがＧであることにおいて、片方が変異したヘテロ型でも、両方が変異したホモ型でも発症する、つまりドミナントネガティブであることを意味する。また、この変異によりアミノ酸番号３５２番目のアミノ酸がＦからＣに変異したことをＦ３５２Ｃとして表す。また３５２番目のアミノ酸Ｆを、３５２Ｆと表すこともある。上記変異の中でも、ｉ）Ｆ３５２Ｃ及び／又はii）Ｖ３６８Ｉを検出することを好適に例示することができる。
　本発明の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法は、さらに（ｃ）血中ＡＴＰ濃度を測定する工程を備えることもできる。かかる血中ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の測定方法は特に制限されず、各種血液成分分析機器を用いて測定することも、公知のいかなるＡＴＰ測定方法を用いることもできる。例えば国際公開公報ＷＯ２００９／０９６４２９のフェノールを用いた方法を使用することにより効率よくＡＴＰを試料から抽出しＡＴＰ量を解析することができる。試料血液の由来は特に制限されず、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、トリ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスターなどを挙げることができ、好ましくはヒトである。また血液の採取部位や種類は制限されず、末梢血、組織から採取した血液、臍帯血、静脈血、動脈血いずれでもよいが、入手の容易さから末梢血が好ましい。かかる血液試料は、ゲノムＤＮＡの解析やＡＴＰの測定を阻害しない限りは防腐剤や防カビ剤、ＥＤＴＡやヘパリンなど抗血液凝固剤などの添加物を含んでもよく、また血液成分の一部を除去したり、成分の一部のみを取り出して使用してもよい。
　本発明における一塩基多型の有無の検出方法は特に制限されず、ある一定のゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅し、サンガー法により塩基配列を調べて一塩基多型を同定することもできるが、特定の一塩基置換を検出するプローブを用いて一塩基置換を検出することもでき、ダイレクトシーケンシング法、一塩基プライマー伸長法、ＰＣＲ－単鎖高次構造多型（ＳＣＰＳ）分析、ＰＣＲ－制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、インベーダー法、および質量分析計を用いて実施することができる。かかる一塩基多型の検出のテンプレートは、ＤＮＡに限らず、ＲＮＡを材料にした遺伝子多型解析も可能であり、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法による遺伝子発現定量法も実施することができる。また、アミノ酸置換を伴う遺伝子多型に関しては、ラジオイムノ抗体アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）なども可能である。以上の方法は、効率的に実施するうえでは、ビーズ、チップ、膜等の固相支持体に固定化し、多型を測定する方法を挙げることができる。
　本発明の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キットとしては、ＣＰＴII遺伝子における一塩基多型を検出するためのプライマー又はプローブを含んでいれば特に制限されず、例えばプライマーとしては配列番号３～２４のプライマーを挙げることができる。さらに、これらのプライマーは適宜標識されていてもよく、標識物質としては蛍光標識タンパク質、放射性同位体、ペプチド、酵素、タンパク質、ステロイドなどを挙げることができる。
　本発明の熱中症の治療・予防薬としては、フィブラート系薬物を有効成分とするものであればよく、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。本発明の治療・予防薬は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
　フィブラート系薬物としては、例えば、ベザフィブラート、ベクロブラート、ビニフィブラート、シプロフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブラート、クロフィブラートアルミニウム、クロフィブリン酸、エトフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ニコフィブラート、ピリフィブラート、ロニフィブラート、シムフィブラート、テオフィブラート、ＡＨＬ－１５７等が挙げられ、ベザフィブラートが好ましい。ベザフィブラートは2-(4-{2-[(4-Chlorobenzoyl)amino]ethyl}phenoxy)-2-methylpropanoic acidの一般名であり、例えば特開平１０－２０４０４７の方法で合成することも、市販品を購入して入手することもできる。
　経口的に投与する製剤の場合、薬理学的に許容される担体としては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、デンプン等の賦形剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、懸濁液製剤には生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ－マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。
　また、本発明の熱中症の治療・予防薬の投与量は、疾病の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができるが、例えば成人に投与する場合、有効成分としてベザフィブラートを含む本発明の熱中症の治療・予防薬の投与量は、一日あたり１～１０，０００ｍｇ、好ましくは１０～２，０００ｍｇ、さらに好ましくは１００～１，０００ｍｇであり、この量を１日１回～３回投与するのが望ましい。本発明の熱中症の治療・予防薬を非経口的に投与するには、たとえば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができるが、静脈内投与や皮下投与が好ましい。
　さらに本発明の熱中症の治療・予防薬は、カルニチン（carnitine）と合わせて使用することもでき、Ｌ－カルニチン及びＤ－カルニチン、ＤＬ－カルニチンでもよいが、好ましくはＬ－カルニチンであり、本発明の熱中症の治療・予防薬と合わせて使用する方法としては、本発明の熱中症の治療・予防薬が一成分としてカルニチンを含んでもよく、また本発明の熱中症の治療・予防薬を投与する前後、又は投与している間に同じ投与方法又は別の投与方法でカルニチンを投与してもよい。
（材料及び方法）
　東京医科大学施設に直送され熱中症の診断で入院となった、連続した１１症例を対象とした。熱中症は体温４０℃以上で意識障害又はけいれんを認める症例とした。被検者又は最も近い家族から書面で同意を得て、遺伝子解析を行った。なお研究に先立ち、遺伝子解析を扱う研究として倫理委員会による審査が行われ、承認を得た（東京医科大学医学研究倫理審査７９９号）。被検者から採取した全血よりゲノムＤＮＡを抽出し（Genomics Volume 68, Issue 2, 1 September 2000, Pages 144-151に記載の方法）、以下の表１を含む配列番号３～２４のプライマーを用いてエクソン１～５をＰＣＲ反応により増幅した。かかる増幅産物をDyeDeoxi（商標）Terminator Cycle Sequencing Kit及びABI-PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いてＣＰＴII遺伝子の塩基配列を解析し、各患者において塩基番号１１０２番目（アミノ酸番号３５２番目）及び塩基番号１０５５番目（アミノ酸番号３６８番目）における一塩基多型の有無を同定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（結果）
　１１症例中、５例（４５．５％）でＣＰＴII遺伝子における塩基番号１０５５番目のチミン（Ｔ）がグリシン（Ｇ）に置換され［１０５５Ｔ＞Ｇ］、アミノ酸番号３５２番目のフェニルアラニン（Ｆ）がシステイン（Ｃ）に置換された［Ｆ３５２Ｃ］の一塩基多型が認められた。また、この５例のうち１例は、集中治療にかかわらず、多臓器不全で死の転帰をとった（表２）。Ｆ３５２Ｃの対立遺伝子頻度（allelic frequency）は０．３２であり、これは日本人で確認されている０．１９８（NCBI:Single nucleotide polymorphism (Accessed Apr 7, 2011, at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=1376)）の１．６２倍に相当した。
　一塩基多型［１０５５Ｔ＞Ｇ／Ｆ３５２Ｃ］の変異ＣＰＴII［Ｆ３５２Ｃ］は、高温に伴い酵素活性が低下し、４０℃を超えると野生型ＣＰＴIIの２５－３０％程度の活性となる。また、別の一塩基多型［１１０２Ｇ＞Ａ／Ｖ３６８Ｉ］の変異ＣＰＴII［Ｖ３６８Ｉ］は、［Ｖ３６８Ｉ］単独では４１℃の熱にさらされた後の酵素活性は野生型とほぼ同じであるが、［Ｖ３６８Ｉ］に加えて［Ｆ３５２Ｃ］の多型を伴った場合、４１℃の熱にさらされた後野生型ＣＰＴIIの２５－３０％程度の活性となることが判っている（ＷＯ２００６／０５４７２２号公報参照）。
　以上の結果から、熱により機能が阻害されるＣＰＴIIの一塩基多型を持つ場合は熱中症になりやすいことが確認された。すなわち、熱により機能が阻害されるＣＰＴIIの一塩基多型を調べることにより、熱中症のなりやすさを予測することができる。また、熱中症患者に、熱により機能が阻害されるＣＰＴIIの一塩基多型を持つ場合が多いということは、すなわち熱中症ではエネルギー要求値が高まっており、血管内皮細胞や心筋など、特に脂肪酸をエネルギー基質として使用している組織において‘エネルギー危機’を生じた結果、多臓器不全、症状の重篤化が進行している可能性が考えられる。したがって、ＣＰＴIIの一塩基多型によるＣＰＴII機能低下を補えば、熱中症を効果的に治療することができることが示唆される。
　ＣＰＴIIの一塩基多型によるＣＰＴII機能低下を補う方法を調べるために、以下の実験を行った。
（細胞）
　ホモ一塩基多型［１１０２Ｇ＞Ａ／Ｖ３６８Ｉ］（患者１：ＦＩ－ＦＩ allels：相同染色体共に３５２Ｆ、３６８Ｉである）及び、ヘテロ一塩基多型［１０５５Ｔ＞Ｇ／Ｆ３５２Ｃ］かつホモ一塩基多型［１１０２Ｇ＞Ａ／Ｖ３６８Ｉ］（患者２：ＣＩ－ＦＩ allels：３５２Ｃ及びＶ３６８Ｉ、３５２Ｆ及びＶ３６８Ｉの相同染色体の組み合わせである）の遺伝子型の繊維芽細胞は大阪大学医学部小児より提供を受けた。これらの繊維芽細胞のＣＰＴII遺伝子型は前記と同じ方法にて調べた結果を図１に示す。遺伝型［Ｆ３５２Ｆ＋Ｖ３６８Ｖ］の野生型繊維芽細胞（ＦＶ－ＦＶallels）は、ＲＩＫＥＮ　cell bankより購入した。繊維芽細胞は１０％ＦＣＳ（ロシュ社製）を含むＭＥＭ（インビトロジェン社製）中で、５％ＣＯ２、３７℃で培養、維持した。ベザフィブラート処理又はＬ－カルニチン処理を行う場合は、血清を含まないＭＥＭで６時間プレインキュベーションし、ベザフィブラート（ＤＭＳＯ溶解液）は１００～８００μＭ、カルニチン（ＤＭＳＯ溶解液）は５０μＭの濃度で行った。
（ＣＰＴIIのタンパク質発現レベル）
　前記野生型並びに、ＦＩ－ＦＩ及びＣＩ－ＦＩ一塩基多型の繊維芽細胞のＣＰＴIIのタンパク質発現レベルを調べた。繊維芽細胞のlysateを１０－２０％gradient gelを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、０．４μｇ／ｍｌの抗ＣＰＴII抗体（H-300, sc-20671, Santa Cruz社製）を用いたウェスタンブロッティングに供した。ＦＩ－ＦＩ及びＣＩ－ＦＩの一塩基多型の繊維芽細胞ではＣＰＴII発現が低いことが確認された（図２）。
（熱とベザフィブラートによるＣＰＴII発現の亢進）
　３７℃又は４１℃で６時間培養した後、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。第一鎖ｃＤＮＡテンプレートをSuper Script（登録商標） III First-Strand kit（インビトロジェン社製）で合成し、以下のプライマーとreal-time PCR using SYBR Green PCR kit（キアゲン社製）を用いて、ＣＰＴII、ＰＰＡＲ－δ、ＣＰＴIAのｍＲＮＡ発現量を調べた。ＰＣＲサイクルは９５℃の変性ステップ３０秒、５９℃のアニーリングステップ３０秒、７２℃の延長ステップ５０秒を、ＣＰＴII、ＰＰＡＲ－δ、ＣＰＴIAでそれぞれ３０，３５，４０サイクル行った。β－アクチンを内部標準として用い、結果を標準化した。使用したプライマーは以下の通りである（配列番号２５～３２）。
＜real-time PCR primers＞
ＣＰＴII－Ｆ；5'-acttgaaccctgcaaaaagtgacac-3'
ＣＰＴII－Ｒ；5'-catcagtcagctcgaagttgagttt-3'
ＰＰＡＲ－δ－Ｆ；5'-atgtcacaacgctatccgttttg-3'
ＰＰＡＲ－δ－Ｒ；5'-agcagcccgtccttgttgacgatag-3'
ＣＰＴIA－Ｆ；5'-tgcgctactccctgaaagtgctgct-3'
ＣＰＴIA－Ｒ；5'-tgatttcctcccggtccagtttgcg-3'
β-actin－Ｆ；5'-tcaccattggcaatgagcggttccg-3'
β-actin－Ｒ；5'-cgccgatccacacggagtacttgcg-3'
　その結果、熱によりＣＰＴII、ＰＰＡＲ、ＣＰＴIAのｍＲＮＡ発現が誘導されることが確認された。さらに、ＣＰＴIIタンパク質も熱により量が増加することが示された。しかしながら、上記２一塩基多型の変異を有するＦＩ－ＦＩ、ＣＩ－ＦＩ繊維芽細胞においては、いずれも野生型繊維芽細胞に比べてＣＰＴIIタンパク質量が少ないことが確認された。また、ベザフィブラートの添加によりＣＰＴIIのｍＲＮＡ及びタンパク質発現量が増加することが確認された（図３）。さらに、野生型及びＦＩ－ＦＩ、ＣＩ－ＦＩ一塩基多型の繊維芽細胞におけるＡＴＰ量を調べたところ、ＦＩ－ＦＩ、ＣＩ－ＦＩ一塩基多型の繊維芽細胞におけるＡＴＰ量は、野生型繊維芽細胞よりも少なかった。すなわち、通常野生型細胞では熱にさらされることによりＣＰＴII量が増加し、体にかかる負荷にそなえるが、熱中症関連一塩基多型細胞においてはＣＰＴIIタンパク質が低いため、熱にさらされた場合にエネルギー不足に陥り、それが熱中症の全身的な症状を引き起こしたり、悪化させたり、回復を遅らせる原因のひとつと考えることができる。そこで、ＣＰＴII発現量を増加させるベザフィブラートや、エネルギー産生におけるＣＰＴIIの産生物であるＬ－カルニチンを添加して細胞内ＡＴＰ量を調べたところ、ベザフィブラートやＬ－カルニチンによりＦＩ－ＦＩ、ＣＩ－ＦＩ一塩基多型の繊維芽細胞における細胞内ＡＴＰ量が増加することがわかった（図４）。すなわち、熱中症により引き起こされるエネルギー不足を、ベザフィブラートやＬ－カルニチンにより補う、又はベザフィブラートやＬ－カルニチンによりエネルギー不足を補うことにより熱中症を予防することができると考えられる。
　以上の結果より、熱中症の病態を物理的な刺激による外因性疾患としてのみ捉えるのではなく、熱中症をエネルギー危機が関与する疾病であると考え、さらにＣＰＴII遺伝子多型は高温をきっかけとしてエネルギー危機が生じるリスク因子とすることができる。本知見に基づき、予防及び治療戦略を考え直すことができる。すなわち、従来の熱中症対策の脱水症状治療及び体温を下げる事後的な治療だけでなく、熱中症が予想される場合に事前に本発明の熱中症予防・治療薬を服用することにより熱中症を防ぐ、又はかかるリスク因子を有する者が熱中症に罹患した場合は慎重に経過観察を行うなどの対応をとることができる。そして、ＣＰＴII機能を補う薬剤、ベザフィブラート及びカルニチン投与は、熱中症を治療に有効であるといえる。
　本発明は、熱中症に対する判定方法や、熱中症の予防・治療薬の分野で好適に利用することができる。

Claims (8)

  1. 　以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法。
    （ａ）被検者のCarnitine palmitoyltransferase II (ＣＰＴII) 遺伝子における１種又は２種以上の一塩基多型の有無を検出する工程；
    （ｂ）工程（ａ）において一塩基多型があった場合、熱中症に対する発症感受性が高い、又は発症耐性が低いと判定する工程；
  2. 　一塩基多型が、以下のｉ）～ｖ）から選ばれる１種又は２種以上の一塩基多型である請求項１記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法。
    ｉ）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１１０２番目がＧ／Ａ又はＡ／Ａ
    ii）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１０５５番目がＴ／Ｇ又はＧ／Ｇ
    iii）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１５１１番目がＣ／Ｔ又はＴ／Ｔ
    iv）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１８１３番目がＧ／Ｃ又はＣ／Ｃ
    ｖ）ＣＰＴII遺伝子における塩基番号１９３９番目がＡ／Ｇ又はＧ／Ｇ
  3. 　さらに（ｃ）血中ＡＴＰ濃度を測定する工程；を備えたことを特徴とする、請求項１又は２記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法。
  4. 　一塩基多型の有無の検出が、ＰＣＲ法を用いたシークエンシングによる方法で行われる請求項１～３のいずれか記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性の判定方法。
  5. 　ＣＰＴII遺伝子における一塩基多型を検出するためのプライマー又はプローブを含むことを特徴とする熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キット。
  6. 　ＣＰＴII遺伝子における一塩基多型を検出するためのプライマーが、配列番号３～２４から選ばれる請求項５記載の熱中症に対する発症感受性、又は発症耐性検出キット。
  7. 　フィブラート系薬物を有効成分とすることを特徴とする熱中症の治療・予防薬。
  8. 　カルニチン（carnitin）と合わせて使用することを特徴とする、請求項７記載の熱中症の治療・予防薬。
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