WO2012175780A1 - Compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración y sus usos - Google Patents

Compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración y sus usos Download PDF

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Pablo PÉREZ MARTÍNEZ
Fernando LÓPEZ SEGURA
José LÓPEZ MIRANDA
Francisco PÉREZ JIMÉNEZ
Alberto RANGEL ZÚÑIGA ORIOL
María Dolores LUQUE DE CASTRO
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Universidad de Cordoba
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
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Definitions

  • the present invention is within the field of nutrition, medicine and pharmacology, and refers to the use of phenolic compounds of olive oil in a certain concentration, for the preparation of a drug or pharmaceutical or food composition, for prevention or the treatment of arteriosclerosis in humans.
  • One of the most common cooking methods for preparing food is frying. This process can significantly affect the quantity and quality of fat intake, affecting the health of the consumer. During the frying, the fat undergoes important changes in its composition. In deep frying, chemical reactions occur, such as hydrolysis and oxidation processes, which affect both the nutritional and sensory qualities of the food consumed and the consumer's safety. In addition, heating the oil reduces the natural content of antioxidants and generates toxic compounds such as polymers and polar compounds. In the generation of these toxic compounds, during the heating process, intrinsic characteristics of the oil influence, such as the degree of unsaturation of its fat content or its richness in antioxidant agents, and factors related to the heating technique, such as duration, temperature and number of heating.
  • Seed oils have lower antioxidant content than olive oil, especially virgin and extra virgin olive oil, making it more vulnerable to heating and generating an increase in the oxidation of lipoproteins after intake.
  • Some options for improving the stability of fried oils include the modified fatty acid composition, such as high sunflower and medium oleic or high oleic and low linolenic cane.
  • additives are a potential alternative. to prevent the oxidation of the frying oil, being able to improve its performance.
  • cytokines cellular signaling molecules
  • NF-kB factor cellular signaling molecules
  • the modulation of the inflammatory response by diet is one of the main fields of current research in nutrition and its relationship with the development of cardiovascular diseases.
  • the immune system suffers, throughout the day, numerous activation episodes, in relation to the different target intakes.
  • certain vascular internal reach potentially pathogenic components from the intestinal bacterial flora, and / or ingested food.
  • the lipopolysaccharide (LPS) stands out, a structure common to the cell wall of multiple bacteria that has the capacity to stimulate the immune system and arouse an inflammatory response. It has been shown that, in the presence of saturated fatty acids in the intake, the amount of LPS and subsequent activation of the inflammatory system is greater.
  • the authors of the present invention have carried out a study to know if postprandial NF-kB activation occurs in PBMCs of obese people, as an expression of inflammatory activity, after the acute intake of four different frying oils, with different composition and fat and different antioxidant content, after a standardized frying process.
  • the knowledge of the possible differences in activation of NF-KB has allowed them to define a certain concentration of phenolic compounds of virgin olive oil that can prevent the activation of the mechanisms involved in the development of arteriosclerosis in humans, and that can be administered in combination with other previously fried oils, so that their artificial addition in food can reproduce the biological effects present in the oil than those that it naturally possesses.
  • the use of the phenolic compounds of virgin olive oil in a concentration of at least 300 ppm, and preferably 400 ppm, as well as their pharmaceutical and food compositions, are useful for the prevention and treatment of arteriosclerosis in humans.
  • a first aspect of the invention relates to the use of the phenolic compounds of virgin olive oil in a concentration of at least 300 ppm, in the preparation of a composition for the prevention or treatment of atherosclerosis in humans, or alternatively, a composition comprising fe n o li com sdela ce i teoli will see a concentration of at least 300 ppm for the prevention or treatment of arteriosclerosis in humans.
  • the phenolic compounds of the virgin olive oil are in a concentration of at least 350 ppm, and more preferably, they are in a concentration of at least 400 ppm.
  • the phenolic compounds of virgin olive oil are obtained from the alperujo.
  • the human has a body mass index (BMI) greater than or equal to 24 kg / m 2
  • BMI body mass index
  • phenolic compounds refers to a set of phenols among which are found, but not limited to them, sunflower, apigenin, luteinoline vanillinic acid, p-cumaric acid, oleuropein and oleuropein aglycone.
  • the composition is a pharmaceutical composition or medicament. More preferably, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, and even more preferably, the pharmaceutical composition further comprises another active ingredient.
  • dication refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals. In the context of the present invention, the disease is arteriosclerosis.
  • active substance means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect on the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art. Thus, they can be, without limitation, in sterile aqueous solution or in biological fluids, such as serum. Aqueous solutions may be buffered or unbuffered and contain additional active or inactive components. Additional components include salts to modulate ionic strength, preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelants and the like, as well as nutrients including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • compositions can be prepared for administration in solid form.
  • the compositions may be combined with various inert vehicles or excipients, including but not limited to; binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients such as starch or lactose; dispersing agents such as alginic acid or corn starch; lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents such as sucrose or saccharin; or flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • compositions and / or their formulations may be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intracecal, intraventricular, oral. , enteral, parenteral, intranasal or dermal.
  • the route of administration is oral.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, age, weight, sex or tolerance, of the mammal.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of phenolic compounds in virgin olive oil that produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the virgin olive oil, as well as the rest of the components of the composition, and the therapeutic effect to be achieved.
  • the “adjuvants” and “pharmaceutically acceptable vehicles” that may be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • excipient refers to a substance that aids the absorption, distribution or action of any of the active ingredients of the present invention, stabilizes said active substance or aids in the preparation of the medicament in the sense of giving it consistency or providing flavors. Make it more enjoyable.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as, for example, starches, sugars or celluloses, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine, such as for example isolating it from the air and / or moisture, filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • ingredients such as, for example, starches, sugars or celluloses, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine, such as for example isolating it from the air and / or moisture, filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • the excipient must be pharmaceutically suitable, that is, an excipient that allows the activity of the active ingredient or of the active ingredients, that is, that it is compatible with the active ingredient, in this case, the active ingredient is any of the compounds of the present invention.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the vehicle like the excipient, is a substance that is used in the medicament to dilute any of the compounds of the present invention. up to a certain volume or weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to any of the cells of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
  • the composition is a food composition. More preferably, the food composition comprises a nutritional supplement. Even more preferably, the composition comprises a food matrix. In another preferred embodiment, the food matrix is selected from the list comprising: milk, yogurt, cheese, fermented milk, soy milk, pre-cooked cereals, milk jellies, bread, bowl, m antequ il la, m argari na, sausages, frying oils, vegetable oils, condiments, fruit juices, syrups, ice cream, frozen products, chewing gums and intermediate foods.
  • the food matrix is a vegetable oil or a mixture of vegetable oils. More preferably, the vegetable oil is sunflower oil.
  • the mixture of vegetable oils comprises: high oleic sunflower oil and rapeseed oil. In another more preferred embodiment the mixture of vegetable oils comprises: high oleic sunflower oil and rapeseed oil.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a composition of the invention (the food composition or the pharmaceutical composition), to prevent the generation of a pro-endogenous environment in the endothelium.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the food composition of the invention in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of atherosclerosis, preferably in humans.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIG 1 A Quantitative analysis of postprandial activation of NF- ⁇ , in peripheral blood mononuclear cells, of people who received four breakfast models, with pastry products made with different types of oils. It can be seen that only the oils with polyphenols VOO (virgin olive oil) and SOP (vegetable oil added with polyphenols) reduced the expression of NF- ⁇ , which led to the avoidance of the proinflammatory state induced by the other oils (SFO (Oil of sunflower) and SOD (Seed oil with Dimethylpolysiloxane)
  • Figure 1 B Quantitative analysis of postprandial activation of ⁇ - ⁇ , in peripheral blood mononuclear cells, of people who received four breakfast models, with processed pastry products with different types of oils.Its increase with the oils with polyphenols VOO (Virgin Olive Oil) and SOP (Vegetable oil added with polyphenols) is interpreted as a capacity of these oils to buffer the inflammatory response dependent on the activation of N F -KB.
  • BMI body mass index
  • CT total cholesterol plasma levels
  • TG plasma triglyceride levels
  • VEO Virgin olive oil
  • POLI polyunsaturated fatty acids
  • SAT saturated fatty acids
  • the concentration of phenols in the enriched oils was determined both globally (Folin-Ciocalteu method), and individually (chromatographic separation and detection by molecular absorption spectrometry - HPLC-DAD) after extraction of the selected analytes.
  • Samples of venous blood (40 ml) were obtained in EDTA tubes after 12 hours of fasting and at 4 hours after breakfast ingestion. The samples were diluted 1: 1 in PBS, and the cells were separated in 15 ml of Ficoll gradient (lymphocyte isolation solution, Rafer) by centrifugation 800 x g for 25 min.
  • Ficoll gradient lymphocyte isolation solution, Rafer
  • the PBMCs phase was extracted with Pasteur pipette, washed twice with cold PBS and suspended in lysis buffer [10 mM of 10 mM N-2 N-2 hydroxyethyl piperazine acid-N'-2-ethane (HEPES ), pH 7.5, 15 mM KCI, 0.1 mM EDTA, 2 MgCI2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
  • lysis buffer 10 mM of 10 mM N-2 N-2 hydroxyethyl piperazine acid-N'-2-ethane (HEPES ), pH 7.5, 15 mM KCI, 0.1 mM EDTA, 2 MgCI2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
  • Lipid parameters were measured with a Hitachi DDPPII modular autoanalyzer (Roche, Basel, Switzerland) using specific reagents (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany).
  • Triglycerides (TG) and total cholesterol (CT) were measured by enzymatic colorimetric methods and HDL (C-HDL) cholesterol by enzymatic methods.
  • LDL cholesterol (C-LDL) was calculated by Friedewald's formula based on the values of CT, TG, and C-HDL.
  • Plasma glucose concentrations were measured on a Hitachi 917 analyzer (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) by the glucose oxidase method (GOD-PAP).
  • the cells were resuspended in cell lysis buffer, thawed and lysed on ice for 10 minutes.
  • the tubes were shaken to break the cell membranes and centrifuged at 16,000 xg at 4 ° C for 5 min. They were then resuspended in cell lysis buffer solution (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM KCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% NonidetP-40 and 0.5 mM PMSF) and kept on ice for 10 minutes, being finally centrifuged at 16,000 xga at 4 0 C for 5 min. Supernatants were stored as cytoplasmic extracts.
  • cytoplasmic extracts 70 g were resuspended in a 12% polyacrylamide (SDS-PAGE) electrophoresis gel of sodium dodecyl sulfate and subsequently transferred to 25 mM Tris nitrocellulose membranes, 192 mM glycine, 20% methanol and They were subjected to 15 V for 1 hour using semi-dry transfer and following standard protocols. The amount of protein transferred was checked using the Ponceau-S stain solution in 1% acetic acid. Non-specific binding sites were blocked by membrane incubation in TTBS (25 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, 0.05% Tween-20, pH 7.6), with 5% milk powder.
  • TTBS 25 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, 0.05% Tween-20, pH 7.6
  • the membranes were incubated overnight at 4 ° C with primary polyclonal anti- ⁇ - ⁇ antibodies (Santa Cruz Biotechnology) (1: 200 in 5% skim milk powder in TTBS). The membrane was washed with TTBS and incubated with the secondary antibody [anti-rabbit IgG, conjugated with HRP (Santa Cruz Biotechnology) (1: 1000 in 5% milk powder in TTBS)] for 1 hour at room temperature. After a TTBS wash, the proteins were detected by the chemiluminescence kit of the Luminol Reagent detection system reagent (Santa Cruz Biotechnology). Protein levels were quantified with the SG-800 calibrated densitometer (Bio-Rad) and analyzed with the Quantity One 4.6.5 software. The results were calculated in terms of standardized integrated optical density (IOD) according to the Ponceau S red staining method and were expressed in arbitrary units (UA).
  • IOD integrated optical density
  • Endotoxins were measured by a Limulus amebocyte lysate test (QCL-1000; Lonza Ibérica, SA Barcelona, Spain), as recommended by the manufacturer. Serum was collected in non-pyrogenic tubes and frozen at -20 ° C until assay. All procedures were performed under non-pyrogenic conditions.
  • the serum was diluted 1: 5, mixed with Limulus amebocyte lysate (LAL) and incubated at 37 ° C for 10 minutes. A substrate solution was mixed with the LAL sample and incubated at 37 ° C for 6 minutes. The reaction was stopped with the stop reagent. When endotoxin is present in the serum, a yellow color develops. The absorbance of the colored solution was read at 405 nm.
  • the recovery of lipopolysaccharide was between 50 and 200%.
  • the sensitivity of the assay was 0.005 Ehrlich units / ml (0.5 pg / ml).
  • the intra- and intra-variation coefficients for the determination of LPS were between 5-10%.
  • the content of phenolic compounds was determined, before and after 20 heating cycles at 1 80 ° C, in the oils containing them, namely: VOO (naturally occurring) and SOP (with added phenolic compounds), In both cases the heating cycles reduced the amount of some of the phenols, but most of them (tyrosol, apigenin, luteolin, acid vanillinic, p-cumaric acid, oleuropein and oleuropein aglycone dialdehyde) were still present after heating.

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Abstract

Uso de compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica o alimentaria, para la prevención o el tratamiento de la arteriesclerosis en humanos.

Description

Compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada
concentración y sus usos
La presente invención se encuentra dentro del campo de la nutrición, la medicina y la farmacología, y se refiere al uso de compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica o alimentaria, para la prevención o el tratamiento de la arteriosclerosis en humanos. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Uno de los métodos de cocina más usuales para preparar comida es la fritura. Este proceso puede afectar significativamente la cantidad y calidad de la ingesta de grasas, afectando a la salud del consumidor. Durante la fritura, la grasa sufre importantes cambios en su composición. En la fritura profunda, se producen reacciones químicas, como son los procesos de hidrólisis y oxidación, que afectan tanto a las cualidades nutricionales y sensoriales del alimento consumido como a la segundad del consumidor. Además, el calentamiento del aceite reduce el contenido natural de los antioxidantes y genera compuestos tóxicos tales como polímeros y compuestos polares. En la generación de estos compuestos tóxicos, durante el proceso de calentamiento, influyen características intrínsecas del aceite, como el grado de insaturación de su contenido graso o su riqueza en agentes antioxidantes, y factores relacionados con la técnica del calentamiento, como la duración, temperatura y número de calentamientos. Los aceites de semillas tienen menor contenido de antioxidantes que el aceite de oliva, en especial que el aceite de oliva virgen y extravirgen, haciéndolo más vulnerables al calentamiento y generando tras su ingesta un incremento en la oxidación de lipoproteínas. Algunas opciones para mejorar la estabilidad de los aceites fritos incluyen la composición modificada en ácidos grasos, como el de girasol alto y medio oleico o el de cañóla alto oleico y bajo linolénico. Sin embargo, los aditivos son una alternativa potencial para prevenir la oxidación del aceite de fritura, siendo capaz de mejorar su rendimiento.
Pocos estudios se han centrado en las consecuencias biológicas del consumo de aceites de fritura. Los estudios en modelos animales han demostrado que su ingesta aumenta los niveles de lipoproteínas aterogénicas (LDL). En el ser humano, incrementa ciertos productos proaterogénicos, como la fracción oxidada de los quilomicrones y LDL. Además se ha demostrado que el contenido de compuestos polares (sustancias prooxidantes que se generan al someter al aceite a altas temperaturas) en aceites de fritura son predictivos de la hipertensión arterial. Por su parte, otros estudios han asociado el consumo de compuestos polares con la disfunción endotelial, la hipertensión, y la arteriesclerosis, y por tanto con el riesgo cardiovascular. Las consecuencias biológicas de la ingesta de aceites fritos son particularmente importantes en las personas obesas. En el medio interno de estas personas existe una inflamación sistémica crónica, de bajo grado, caracterizada por una producción anormal de citoquinas (moléculas de señalización celulares) que tienen propiedades inflamatorias y, además, se activan vías de señalización más complejas que favorecen el desarrollo de la arteriesclerosis. Esta inflamación de bajo grado se relaciona con la activación del factor NF-kB, que es el principal mediador de la respuesta inflamatoria. Su incremento refleja la activación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se asocia con la expresión de una variedad de citoquinas relacionadas con la inflamación y la respuesta inmune, fenómenos que contribuyen al desarrollo de la arteriesclerosis.
La modulación de la respuesta inflamatoria por la dieta es uno de los principales campos de investigación actuales en nutrición y su relación con el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. El sistema inmune sufre, a lo largo del día, numerosos episodios de activación, en relación con las distintas ingestas dianas. Tras una comida, llegan al medio interno vascular ciertos componentes potencialmente patógenos procedentes de la flora bacteriana intestinal, y/o de los alimentos ingeridos. Entre éstos destaca el lipopolisacárido (LPS), estructura común a la pared celular de múltiples bacterias y que tiene capacidad para estimular el sistema inmune y despertar una respuesta inflamatoria. Se ha demostrado que, en presencia elevada de ácidos grasos saturados en la ingesta, la cantidad de LPS y la activación subsecuente del sistema inflamatorio es mayor. Además, independientemente del tipo de grasa consumido, en las horas siguientes a una comida aumentan en sangre productos de glicación avanzada y se produce un incremento del estrés oxidativo. Todo esto puede resultar en una inflamación crónica de bajo nivel, debido a los continuos estímulos proinflamatorios derivados de la alimentación. Hallazgos recientes vinculan también la grasa de la dieta con la capacidad de absorción de los LPS procedentes de la flora bacteriana habitual del tubo digestivo (denominada microbiota), lo que, como hemos anteriormente, puede cond icionar d iferencias en el estado i nflam atorio, en un m ecan ism o dependiente de NF-kB, a través de unos mediadores denominados receptores tipo Toll-4 (TLR4).
En definitiva, y a pesar de que el periodo postprandial provoca una situación proinflamatoria, existen datos q ue dem uestran que hay determ i nados condicionantes, como el tipo de grasa consumida o la existencia de obesidad, que provocan un aumento de este estado inflamatorio. En el caso que nos ocupa, y resumiendo también las evidencias indicadas anteriormente, la ingesta de aceite previamente frito provoca un ambiente proaterogénico, ya que produce tanto un aumento de la inflamación postprandial, debido a la existencia en ese aceite de productos proinflamatorios y prooxidantes y, además, provoca la aparición de un perfil de lipoproteínas aterogénicas en plasma. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han realizado un estudio para conocer si se produce una activación de NF-kB postprandial en PBMCs de personas obesas, como expresión de actividad inflamatoria, tras la ingesta aguda de cuatro diferentes aceites de fritura, con distinta composición y grasa y diferente contenido de antioxidantes, después de un proceso estandarizado de fritura. El conocimiento de las posibles diferencias de activación de NF-kB les ha permitido definir una determinada concentración de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen que puede prevenir la activación de los mecanismos implicados en el desarrollo de arterieesclerosis en seres humanos, y que pueden administrarse en combinación con otros aceites previamente fritos, de forma que su adición artificial en los alimentos puede reproducir los efectos biológicos presentes en el aceite que los que posee de forma natural.
Por tanto, el uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm, y preferiblemente de 400 ppm, así como sus composiciones farmacéuticas y alimentarias, son útiles para la prevención y el tratamiento de arteriosclerosis en humanos.
Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm, en la elaboración de una composición para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis en humanos, o alternativamente, a una composición que comprende compuestos fe n ó l i co s d e l a ce i te d e o l i va v i rg e n e n u n a concentración de al menos 300 ppm para la prevención o el tratamiento de la arteriosclerosis en humanos.
En una realización preferida de la presente invención, los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se encuentran en una concentración de al menos 350 ppm, y más preferiblemente, se encuentran en una concentración de al menos 400 ppm. En otra realización preferida, los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se obtienen del alperujo. En otra realización preferida, el humano presenta un índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 24 kg/m2 El término "compuestos fenólicos" del aceite de oliva virgen, se refiere a un conjunto de fenoles entre los que se encuentran, pero sin lim itarse a ellos, tirasol, apigenina, luteolina ácido vainilinico, ácido p-cumárico, oleuropeína y oleuropeína aglicona. En otra realización preferida, la composición es una composición farmacéutica o medicamento. Más preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y aún más preferiblemente, la composición farmacéutica comprende, además, otro principio activo. El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es la arteriesclerosis. Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin lim itarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y contener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y similares, así como nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, desl izantes tales como d ióxido de si licio coloidal ; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico. Preferiblemente, la vía de administración es oral.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como, por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias del aceite de oliva virgen, así como del resto de los componentes de la composición, y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción, distribución o acción de cualquiera de los principios activos de la presente invención, estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como, por ejemplo, almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento, como, por ejemplo, para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término excipiente "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, un excipiente que perm ita la actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente invención.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.
El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las células de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.
En otra realización preferida la composición es una composición alimentaria. Más preferiblemente, la composición alimentaria comprende un suplemento nutricional. Aún más preferiblemente, la composición comprende una matriz alimentaria. En otra realización preferida, la matriz alimentaria se selecciona de la lista que comprende: leche, yogurt, queso, leche fermentada, leche de soja, cereales precoci nados, gal letas , pan , bol los, m antequ i l la, m argari na , salchichas, aceites de freír, aceites vegetales, condimentos, zumos de frutas, siropes, helados, productos congelado, gomas de mascar y alimentos intermedios.
En otra realización preferida la matriz alimentaria es un aceite vegetal o una mezcla de aceites vegetales. Más preferiblemente, el aceite vegetal es aceite de girasol. La mezcla de aceites vegetales comprende: aceite de girasol alto oleico y aceite de colza. En otra realización más preferida la mezcla de aceites vegetales comprende: aceite de girasol alto oleico y aceite de colza. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición de la invención (la composición alimentaria o la composición farmacéutica), para prevenir la generación de un ambiente proaterogénico en el endotelio.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición alimentaria de la invención en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la arterieesclerosis, preferentemente en humanos. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 A: Análisis cuantitativo de la activación postprandial de NF-κΒ, en células mononucleares de sangre periférica, de las personas que recibieron cuatro modelos de desayuno, con productos de bollería elaborados con distintos tipos de aceites. Puede verse que solo los aceites con polifenoles VOO (Aceite de oliva virgen) y SOP (Aceite vegetal añadido con polifenoles) redujeron la expresión del NF-κΒ , ref lej ando q ue evitaron e l estado proinflamatorio inducido por los otros aceites (SFO (Aceite de girasol) y SOD (Aceite de semilla con Dimetilpolisiloxano). Figura 1 B: Análisis cuantitativo de la activación postprandial de ΙκΒ-α, en células mononucleares de sangre periférica, de las personas que recibieron cuatro modelos de desayuno, con productos de bollería elaborados con distintos tipos de aceites. Su incremento con los aceites con polifenoles VOO (Aceite de ol iva virgen) y SOP (Aceite vegetal añadido con polifenoles) se interpreta como una capacidad de estos aceites para amortiguar la respuesta inflamatoria dependiente de la activación del N F-KB.
Figura 2: A las dos horas de la ingesta de los desayunos, con distinto contenido de aceites, se observó que con los aceites ricos en polifenoles (VOO y SOP) no se incrementan los niveles de Lipopolisacárido plasmático (LPS), señalando que no existe una absorción intestinal de dicho componente bacteriano. EJEMPLOS
Se realizó un ensayo clínico que se describe a continuación, y que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una determinada concentración en la prevención de la activación inflamatoria que favorece el desarrollo de la arterieesclerosis en humanos.
MATERIALES Y MÉTODOS Población de estudio
El estudio se realizó en veinte obesos sanos (edad media de 56 años, rango entre 40-70). Todos ellos firmaron su consentimiento informado y se les realizó una historia médica completa, examen físico y análisis de química clínica antes de la inscripción. Tenían un índice de masa corporal (IMC) promedio de 37,3 (29,4-44,9) kg/m2, perímetro de cintura de 1 13,7 cm (88-145), los niveles plasmáticos de colesterol total (CT) de 201 .1 ± 3.8 mg/dl, los niveles plasmáticos de triglicéridos (TG) 102.9 ± 3.6 mg/dl, los niveles de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDLc) de 130.2 ± 3.0 mg/dL y los niveles de colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDLc) de 50.8 ± 1 .2 mg/dl, niveles de glucosa plasmática de 100.9 ± 0.9 mg/dL y niveles de insulina de 10.7 ± 0.5 mU/L. Ninguno de los participantes mostraron indicios de enfermedades crónicas (hepática, renal, tiroides, corazón). Todos fueron no diabéticos, no fumadores, sin manifestación clínica de enfermedad cardiovascular y sin tratamiento. Ninguno tomaba medicamentos o vitaminas que se conozca que afectan a los lípidos plasmáticos. El protocolo del estudio fue aprobado por la Comisión de Investigación del Hospital Universitario Reina Sofía, de acuerdo con el marco institucional y las Directrices de Buenas Prácticas Clínicas. Diseño del estudio
Todos los voluntarios recibieron cuatro desayunos con magdalenas elaboradas con cuatro aceites diferentes. Cada desayuno contenía 0,45 mi de aceite y 40 equivalentes de retinol, por kilogramo de peso corporal, y una distribución de calorías de 56% de grasas, 9% de proteínas y 35% de hidratos de carbono. Los desayunos eran administrados con un diseño aleatorizado y cruzado, siguiendo un modelo de cuadrado latino, lo que aumentó el poder del estudio. Los voluntarios fueron divididos en cuatro grupos de forma aleatoria y estratificada por sexo para recibir cada desayuno con un periodo de lavado de dos semanas entre cada uno de ellos. Los aceites fueron sometidos previamente a un proceso de fritura estandarizado (20 ciclos de calentamiento a 180 °C durante 5 minutos por ciclo). Los aceites utilizados en el desayuno, así como su composición, son los siguientes:
1 . Aceite de oliva virgen (VOO) con 400 ppm de antioxidantes fenólicos naturales: 70,5% ácidos grasos monoinsaturados (MONO), 1 1 , 1 % de ácidos grasos poliinsaturados (POLI) y 18,4% de ácidos grasos saturados (SAT),
2. Aceite de girasol (SFO): 34,3% MONO, 58,3% de POLI y 7.3% de SAT. 3. Mezcla de aceites de semillas mixta (30% de girasol alto oleico y 70% de aceite de colza) enriquecido con 2 mg/kg de dimetilpolisiloxano antioxidante (SOD): 71 ,8% de MONO, 18,0% de POLI y 10,2% SAT. 4. Mezcla de aceites y semillas (30% de girasol alto oleico y 70% de aceite de colza) enriquecido con 400 ppm de compuestos fenoles extraídos del residuo de la producción de aceite de oliva-alperujo (SOP): 76,7% de
MONO, 17,6% de POLI y 5,8% de SAT.
Enriquecimiento de los aceites con fenoles extraídos de alperujo. Se realizó con el método de Girón et al. (2009. J Agrie Food Chem 57(7): p. 2797-802), basado en extracción sólido-líquido (S-L). Un volumen de extracto de alperujo se puso en contacto con 3 mi de aceite y se agitó vigorosamente durante 30 min. Transcurrido este tiempo, la fase etanol-agua se separó por centrifugación a 3000 rpm durante 10 min. El aceite enriquecido resultante se analizó para determinar la concentración de fenoles totales e individuales. Procedimiento de fritura. Dos litros de cada aceite se colocó en una freidora inoxidable y se sometió a 20 ciclos de calentamiento (a 180 0 C ± 5 0 C durante 5 minutos/ciclo).
Determinación de fenoles en los aceites
La concentración de fenoles en los aceites enriquecidos se determinó tanto de forma global (método de Folin-Ciocalteu), como individual (separación cromatográfica y detección mediante espectrometría de absorción molecular— HPLC-DAD) después de la extracción de los analitos seleccionados.
Extracción de los compuestos fenólicos del aceite. Alícuotas de aceite de 2 g se agitaron durante 30 min con 20 mi de metanol y 2 mi de hexano. La fase de metanol, que contiene los compuestos fenólicos, se separó por centrifugación, se evaporó hasta la preconcentración adecuada y se almacenó a -20 0 C hasta su posterior análisis.
Separación y cuantificación mediante HPLC-DAD. El método aplicado fue el propuesto por el Consejo Oleícola Internacional (COI) para la determinación individual de los compuestos fenólicos del aceite de oliva. La columna analítica empleada fue una Inertisil ODS-2 de fase reversa de 250 χ 4 mm i.d., 5 pm; el volumen de inyección de 10 μΙ y la fase móvil una mezcla de A (agua acidificada con 0,2% de ácido fosfórico) y B (acetonitrilo- metanol, 1 : 1 v / v) a 1 ml/min. Una elución lineal inicial en gradiente de 0 a 50% B en 40 minutos fue seguido por otros gradiente de elución lineal de 50 a 60% B en 5 minutos y un tercer gradiente de 60 a 100% B en 10 minutos. Por último, el instrumento fue mantenido en condiciones ¡socráticas (100% B) durante 2 min. Es necesaria una etapa de equilibración de 5 minutos para restablecer las condiciones iniciales y alcanzar la estabilización de la fase móvil. Los fenoles eluídos se midieron a 230, 280, 325 y 350 nm (tiempo de elución total inferior a 57 min).
Muestras de sangre y aislamiento de PMBCs
Se obtuvieron muestras de sangre venosa (40 mi) en tubos con EDTA tras 12 horas de ayuno y a las 4 horas después de la ingestión del desayuno. Las muestras se diluyeron 1 : 1 en PBS, y las células se separaron en 15 mi de gradiente de Ficoll (solución de aislamiento de linfocitos, Rafer) por centrifugación 800 x g durante 25 min. La fase de PBMCs se extrajo con pipeta Pasteur, se lavó dos veces con PBS frío y se suspendió en solución tampón de lisis [10 mM de N-2 10 mM de N-2 hidroxietil piperazina ácido-N'-2-etano (HEPES), pH 7,5, 15 mM KCI, 0.1 mM EDTA, 2 MgCI2, 1 mM ditiotreitol (TDT), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).
Análisis de lípidos y determinaciones bioquímicas
Los parámetros lipidíeos se midieron con un autoanalizador modular DDPPII Hitachi (Roche, Basel, Switzerland) utilizando reactivos específicos (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany). Los triglicéridos (TG) y el colesterol total (CT) se midió por métodos colorimétricos enzimáticos y el colesterol HDL (C-HDL) por métodos enzimáticos. El colesterol LDL (C-LDL) se calculó por la formula de Friedewald basada en los valores de CT, TG, y C- HDL. Las concentraciones de glucosa plasmática se midieron en un analizador Hitachi 917 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) por el método de la glucosa oxidasa (GOD-PAP).
Extracción de la proteína nuclear
Las células se resuspendieron en tampón de lisis celular, se descongelaron y se lisaron en hielo durante 10 minutos. Los tubos se agitaron para romper las membranas celulares y se centrifugaron a 16 000 x g a 4 ° C durante 5 min. Luego se resuspendieron en solución tampón de lisis celular (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM KCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NonidetP - 40 y 0,5 mM PMSF) y se mantuvieron en hielo durante 10 minutos, siendo finalmente centrifugadas a 16 000 x g a 4 0 C durante 5 min. Los sobrenadantes se almacenaron como extractos citoplasmáticos. Los pellets que contienen la fracción nuclear se resuspendieron en tampón de extracción nuclear [20 mM de HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF] y se incubaron en hielo durante 20 min. A continuación, la suspensión se centrifugó a 16 000 x g durante 15 min a 4 ° C y del sobrenadante se recogió el extracto nuclear. La concentración de proteínas fue estimada utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad).
Ensayos de movilidad electroforética Shift (EMSA) Los extractos nucleares fueron testados mediante su capacidad de unión con NF-kB, utilizando oligonucleótidos consenso SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, de Santa Cruz Biotechnology, utilizando el kit de Digoxigenina EMSA de Roche Diagnostics (Basilea, Suiza). Un total de 1 5 g de proteína nuclear fueron tratados de acuerdo con las instrucciones del kit. Los complejos se detectaron con el sustrato quimioluminiscente CSPD y fueron expuestos a Hyperfilm de Amersham Biosciences, en un soporte de película de 4 - 16 horas a temperatura ambiente.
Western Blotting
Los extractos citoplasmáticos (70 g) se resuspendieron en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de electroforesis al 12% de dodecil sulfato sódico y posteriormente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20% y se sometieron a 15 V durante 1 hora usando transferencia semi-seca y siguiendo los protocolos estándar. La cantidad de proteína transferida se comprobó utilizando la solución de mancha Ponceau-S en 1 % de ácido acético. Los sitios de unión inespecífica se bloquearon por incubación de la membrana en TTBS (25 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, 0.05% Tween-20, pH 7,6), con 5% de leche en polvo. Las membranas se incubaron durante una noche a 4 °C con anticuerpos primarios policlonales anti-ΙκΒ-α (Santa Cruz Biotechnology) (1 :200 en 5% de leche descremada en polvo en TTBS). La membrana se lavó con TTBS y se incubó con el anticuerpo secundario [IgG anti-conejo, conjugado con HRP (Biotecnología Santa Cruz) (1 : 1000 en 5% de leche en polvo en TTBS)] durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado con TTBS, las proteínas se detectaron mediante el kit de quimioluminiscencia del reactivo Luminol Reagent detection system (Santa Cruz Biotechnology). Los niveles de proteína se cuantificaron con el densitómetro calibrado SG-800 (Bio-Rad) y fueron analizados con el Quantity One 4.6.5 software. Los resultados fueron calculados en términos de densidad óptica integrada (IOD) normalizada según el método de tinción con rojo Ponceau S y se expresaron en unidades arbitrarias (UA).
Determinación de LPS
La endotoxinas (LPS) se midieron mediante una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (QCL-1000; Lonza Ibérica, SA Barcelona, España), según lo recomendado por el fabricante. Se recolectó el suero en tubos no pirogénicos y se congeló a -20 °C hasta el ensayo. Todos los procedimientos fueron realizados en condiciones no pirogénicas. El suero fue diluido al 1 :5, mezclados con lisado de amebocitos de Limulus (LAL) y fue incubado a 37 °C durante 10 minutos. Una solución de sustrato se mezcló con la muestra LAL y se incubó a 37 °C durante 6 minutos. La reacción se detuvo con el reactivo de parada. Cuando la endotoxina está presente en el suero, se desarrolla un color amarillo. La absorbancia de la solución coloreada se leyó a 405 nm. La recuperación de lipopolisacárido fue de entre 50 y 200%. La sensibilidad del ensayo fue de 0,005 unidades Ehrlich/ml (0,5 pg/ml). Los coeficientes intra- e ¡nter-ensayo de variación para la determinación de LPS fueron entre 5-10%. Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como valores medios y error típico. Se utilizó SSPS 15 para Windows (SPSS Inc. , Chicago) para el análisis estadístico. Los datos fueron analizados utilizando el análisis de varianza (ANOVA) para medidas repetidas. El estadístico de contraste utilizado en el supuesto de que la esfericidad no se cumpliera era de Greenhouse-Geisser. En este análisis se estudió:
1 . El efecto del tipo de aceite ingerido, independiente del tiempo.
2. El punto de tiempo postprandial.
3. La interacción de ambos factores.
Estos valores indican el grado de la respuesta postprandial en cada grupo de sujetos a cada aceite p<0,05 fue considerado significativo. RESULTADOS
Consumo de aceites fritos y lipemia postprandial
Los niveles de TGL postprandiales en plasma se incrementaron tras el consumo de los cuatro aceites (p <0,05), pero no se encontró ninguna diferencia entre los aceites (datos no mostrados).
Por otro lado, no se observaron cambios significativos en los niveles de CT, C- HDL y C-LDL.
Determinación de fenoles en los aceites
Se determinó el contenido de compuestos fenólicos, antes y después de 20 ciclos de calentam iento a 1 80 °C, en los aceites que los contenían, a saber: VOO (presente de forma natural) y SOP (con compuestos fenólicos añadidos), En ambos casos los ciclos de calentamiento redujeron la cantidad de algunos de los fenoles, pero la mayoría de ellos (tirosol, apigenina, luteolina, ácido vainilínico, ácido p-cumárico, oleuropeína y oleuropeína aglicona dialdehído) todavía estaban presentes tras el calentamiento.
Ingestión aguda de los diferentes aceites de fritura y expresión de NF-kB y de ΙκΒ-α
Con el fin de examinar si la ingestión aguda en forma de desayuno de cuatro aceites diferentes de fritura con distinto perfil lipídico y contenido de compuestos antioxidantes podría influir en la respuesta inflamatoria de las células mononucleares, los extractos nucleares de PBMCs recogidos a las 12 horas de ayuno y 4 horas después de ingerir el desayuno fueron analizados por EMSA. Los resultados mostraron que la ingesta del desayuno que contenía VOO (p = 0,029) y el desayuno con SOP (p = 0,009) disminuyó la activación de NF-kB posprandial (FIGURA 1A), aumentando la expresión de su inhibidor (FIGURA 1 B), frente al resultado encontrado con los aceites carentes en compuestos fenólicos.
Cambios en suero de los niveles de LPS en respuesta a la ingesta de los diferentes aceites fritos
Se ha estudiado si la ingesta de cuatro diferentes aceites fritos afecta la absorción de LPS endógena. Se observó una disminución significativa del nivel sérico postprandial de LPS, 2 h después de la ingesta de ambos VOO (p = 0,043) y SOP (p = 0,032) en comparación con el tiempo basal. Por el contrario, no hubo cambios significativos después del consumo de los desayunos basados en SFO y SOD (FIGURA 2).

Claims

REIVINDICACIONES
1 - El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm, en la elaboración de una composición para la prevención o el tratamiento de la arteriesclerosis en humanos.
2- El uso según la reivindicación anterior, donde los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se encuentran en una concentración de al menos 350 pp.
3- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se encuentran en una concentración de al menos 400 ppm.
4- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se obtienen del alperujo. 5- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el humano presenta un índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 24 kg/m2
6- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la composición es una composición farmacéutica o un medicamento.
7- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según la reivindicación 6, donde la composición farmacéutica además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. 8- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde la composición además comprende otro principio activo.
9- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la composición es una composición alimentaria.
10- EI uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según la reivindicación 9, donde la composición alimentaria incluye un suplemento nutricional.
1 1 - Una composición alimentaria según se descnbe en cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen y una matriz alimentaria.
12- Una composición alimentaria según la reivindicación anterior, donde la matriz alimentaria se selecciona de la lista que comprende: leche, yogurt, queso, leche fermentada, leche de soja, cereales precocinados, galletas, pan, bollos, mantequilla, margarina, salchichas, aceites de freír, aceites vegetales, condimentos, zumos de frutas, siropes, helados, productos congelado, gomas de mascar y alimentos intermedios.
13- Una composición alimentaria según la reivindicación 12, donde la matriz alimentaria es un aceite vegetal o una mezcla de aceites vegetales.
14- Una composición alimentaria según la reivindicación 13, donde el aceite vegetal es aceite de girasol.
15- Una composición alimentaria según la reivindicación 13, donde la mezcla de aceites vegetales comprende: aceite de girasol alto oleico y aceite de colza. -Uso de la composición alimentaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 1-15, para prevenir la generación de un ambiente proaterogénico en el endotelio.
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