WO2012175772A2 - Aceite de girasol con elevado contenido en fitoesteroles - Google Patents

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WO2012175772A2
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José María FERNÁNDEZ MARTÍNEZ
Begoña PÉREZ VICH
Álvaro FERNÁNDEZ DE LA CUESTA
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    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings or cooking oils
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor

Definitions

  • the object of the present invention is a sunflower oil with a high content of plant sterols or phytosterols, which is characterized by having between 7660 and 14980 mg of total phytosterols per kg of unrefined oil.
  • the fraction of phytosterols of this oil is composed of campesterol, which represents between 4.2% and 30.9% of the total phytosterols in the oil, stigmasterol, which represents between 4.3% and 29.8% of the total phytosterols in the oil, delta-7-campesterol, which represents between 0.2% and 15.7% of the total phytosterols in the oil, clerosterol, which represents between 0.2% and 8.6% of the total phytosterols in the oil, beta-sitosterol, which represents between 20.4% and 85.2% of the total phytosterols in the oil, delta-5- avenasterol, which represents between 0.3% and 20.9% of the total phytosterols in the oil, delta-5.24- stigmastadienol, which represents between 0.2% and 10.0% of the total phyto
  • Another object of the present invention is sunflower seeds that contain an oil with the aforementioned characteristics and sunflower plants that, when self-fertilized, produce seeds with the aforementioned characteristics.
  • the method of analysis of the phytosterols content from whole sunflower seeds, sunflower seed pieces or sunflower meal, as well as the method for obtaining sunflower seeds with a high phytosterols content consisting of the present invention are also an object of the present invention. in mutagenic treatment of sunflower seeds and identification of mutants by means of non-destructive analysis of sunflower seeds using the method of analysis above mentioned.
  • the invention is part of the agriculture sector, the food sector, and the nutraceutical and pharmaceutical sector.
  • the sunflower oil object of the present invention has a high content of phytosterols (also called vegetable sterols or simply sterols), much higher than other sunflower oils currently available.
  • the high phytosterols content gives it a high nutritional value due to the potential of phytosterols to reduce blood cholesterol levels.
  • the high content of phytosterols in the oil allows profitable extraction of them for use in the preparation of foods enriched in phytosterols or in nutraceutical or pharmaceutical formulations that include phytosterols in their composition.
  • Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. Among the risk factors for these diseases is an elevated level of blood cholesterol, particularly LDL cholesterol (World Health Organization, 2003. The World Health Report. Shaping the Future. WHO, Geneva, Switzerland).
  • Cholesterol belonging to the broad group of isoprenoid compounds, is the main sterol present in animals. Its plant equivalents are plant sterols or Phytosterols, which have a great chemical and functional similarity with cholesterol. In both cases, they are molecules derived from squalene and consist of a cyclopentaneperhydrophenanthrene tetracyclic ring and a C17 carbon side chain (Fig. 1). More than 250 different phytosterols have been identified.
  • delta-5-sterols Most of them, like cholesterol, have a double bond between the C5 and C6 carbons of the tetracyclic ring, and are called delta-5-sterols.
  • delta-5-sterols To this group belong the most common phytosterols, among which are sitosterol, campesterol, stigmasterol, and delta-5- avenasterol.
  • Another group of phytosterols have a double bond between the C7 and C8 carbons of the tetracyclic ring, and are called delta-7-sterols. This group includes delta-7-avenasterol, delta-7- stigmastenol and gramisterol, among others.
  • Some of the phytosterols of the delta-5 and delta-7 types may also have an additional double bond in the side chain, such as stigmasterol (delta-5, 22; Fig.
  • phytostanols saturated phytosterols, that is, without double bonds.
  • phytosterols in general will be discussed, including phytostanols in this term as well.
  • Fig. 1 Chemical structure of some of the phytosterols (sitosterol, campesterol, stigmasterol) and phytostanols (sitostanol, campestanol) more common compared to cholesterol.
  • Phytosterols are both free and conjugated with other compounds, mainly fatty acids and glycosides (Piironen et al., 2000. Plant sterols: biosynthesis, biological function and their importance to human nutrition Journal of the Science of Food and Agriculture 80: 939-966).
  • Phytosterols have been traditionally used in the cosmetic and pharmaceutical industry, although the main interest in these compounds is due to the appearance of applications in the field of food, initially as additives or natural food ingredients, and more recently as one of the main products of nutraceuticals, a new science that studies the therapeutic effects of food components (Kritchevsky and Chen, 2005. Phytosterols-health benefits and potential concerns: a review. Nutrition Research 25: 413-428). In the mid-1950s it discovered that phytosterols possessed the property of lowering cholesterol levels in animals (Peterson, 1951. Effect of soybean sterols in the diet on plasma and liver cholesterol in chicks. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 78: 143-147) and humans (Pollak, 1953.
  • the main natural source of phytosterols in the diet are vegetable oils and their derived products (margarines, etc.), followed by cereals and nuts.
  • Table 1 shows the average ester content of the main unrefined edible vegetable oils.
  • Table 1. Average content (mg kg -1 ) of the main phytosterols in unrefined edible vegetable oils (Padley et al., 1994. Occurrence and characteristics of oils and fats. In The Lipid Handbook, eds. FD Gunstone, JL Harwood and FB Padley, London: Chapman & Hall, pp. 47-223).
  • the total amount and profile of phytosterols within a given plant species is determined both by the genotype of the plant and by environmental factors (Amar et al. , 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploid populations of winter rapeseed. 48: 1000-1006).
  • environmental factors Amar et al. , 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploid populations of winter rapeseed. 48: 1000-1006.
  • studies on genetic and environmental variability for total content and profile of phytosterols in seeds have hardly been carried out to date.
  • Vlahakis and Hazebroek 2000. Phytosterol accumulation in ca ⁇ óla, sunflower, and soybean oils: effects of genetics, planting location, and temperature.
  • Helia 30 183-190 evaluated a large collection of varieties and pure sunflower lines in various environments and found a range of variation for phytosterols content between 1250 and 7650 mg kg -1 oil
  • the average profile of phytosterols in sunflower oil is composed of 8% campesterol, 8% stigmasterol, 60% beta-sitosterol, 4% delta-5-avenasterol, 15% delta-7- stigmastenol, 4% delta-7-avenasterol, and 1% of other minor phytosterols (Padley et al., 1994. Occurrence and characteristics of oils and fats. In The Lipid Handbook, eds. FD Gunstone, JL Harwood and FB Padley. London: Chapman & Hall, pp. 47-223 ).
  • ppm mg of sterols per kg of oil
  • Mutagenesis consists in the application of an agent with mutagenic properties to a part of the plant to induce modifications in its DNA.
  • the mutagenic agent When the mutagenic agent is applied to the seeds, these DNA alterations or mutations are transmitted to the offspring and, once those of interest have been identified and fixed, they give rise to new characters that can be introduced into commercial or cultivar varieties.
  • the mutagenic treatment generates random genetic alterations in certain points of the genome of the plant. However, when the treatment is applied to a large number of seeds, the probability of covering the entire genome of the plant and therefore of generating variation for the desired character is maximized.
  • Another interesting example is found in species of oleaginous brassicas, where it has been obtained Low-linolenic acid germplasm in a large number of independent mutagenesis studies using a wide range of chemical and physical mutagenic agents, highlighting Rakow's works (1973.
  • mutagenesis techniques allow to obtain the desired phenotypes that are not available in the germplasm of the species considered, and that these techniques are reproducible, that is, the same modified character can be obtained in different experiments performed independently, provided that the appropriate protocols are followed and a large number of plants are managed in successive generations of the mutagenesis program.
  • one of the key aspects for obtaining a certain phenotype through mutagenesis is the management of a large number of individuals.
  • the most general case is the application of the mutagenic treatment to the seeds.
  • the most general case is the application of the mutagenic treatment to the seeds.
  • the most general case is the application of the mutagenic treatment to the seeds.
  • the most general case is the application of the mutagenic treatment to the seeds.
  • the former are known as chemical mutants, and the latter as physical mutants.
  • EMS ethyl methyl sulphonate
  • NaN3 sodium azide
  • ENU ethylnitrosourea
  • NMU N-methylnitrosourea
  • DMS dimethyl sulfate
  • X-rays, gamma rays, and rapid neutrons stand out.
  • Different mutagenic agents differ in their mode of action but, as previously mentioned, the same modified character can be obtained with different mutagenic agents (Von Wettstein et al., 1959. Mutationsforschung und Züchtung. Lst Edition. Westdteutscher Verlag, Kóln, Germany, pp. 21-28).
  • mutagenic treatment Key aspects for the success of the mutagenic treatment is the use of the appropriate methodology (previous treatment of the seeds, use of the appropriate dose, time of application of the mutagenic agent, etc.) as well as the application of the same to a high number of seeds. The higher the number of seeds under treatment, the greater the probability of obtaining the desired phenotype. Seeds subjected to mutagenic treatment are received in the name of Mi seeds, and the plants derived from them Mi plants.
  • mutations are recessive, ie not expressed in terms of M 1 or plants M 1 seeds but seeds level M 2 (seeds produced by the Mi plants) or plants M 2 (plants derived from M 2 seeds), depending on the nature of the genetic control of the character.
  • gametophytic characters controlled by the genotype of the In developing embryo, recessive mutations can be detected at the level of individual M 2 seeds.
  • sporophytic characters controlled by the genotype of the mother plant, recessive mutations are detected at the level of M 2 plants by analyzing samples of M 3 seeds produced by M 2 plants.
  • Phytosterol content in seeds is a sporophytic character (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploide populations of winter rapeseed. Crop Science 48: 1000-1006).
  • the present invention relates to a sunflower oil extracted from sunflower seeds having a high phytosterols content, superior to the phytosterols content of any sunflower oil on the market or described in the literature.
  • This oil has between 7660 and 14980 mg of total phytosterols per kg of unrefined oil.
  • the phytosterols fraction of this oil is composed of campesterol, which represents between 4.2% and 30.9% of the total phytosterols in the oil, stigmasterol, which represents between 4.3% and 29.8% of the total phytosterols in the oil, delta-7- campesterol, which represents between 0.2% and 15.7% of the total phytosterols in the oil, clerosterol, which represents between 0.2% and 8.6% of the total phytosterols in the oil, beta-sitosterol, which represents between 20.4% and 85.2% of the total phytosterols in the oil, delta-5-avenasterol, which represents between 0.3% and 20.9% of the total phytosterols in the oil, delta-5, 24-stigmastadienol, which represents between 0.2% and 10.0% of the total phytosterols in the oil, delta-7-stigmastenol, which represents between 2.1% and 52.4% of the total phytosterols in the oil, and delta-7-avenasterol, which represents between 0.6% and 15.8% of the total phytosterol
  • the present invention also relates to sunflower seeds that contain an oil with the aforementioned characteristics, and sunflower plants that, when self-fertilized, produce seeds with the mentioned characteristics. At present there are no sunflower seeds that produce an oil with a high phytosterols content than the oil obtained from the seeds object of the present invention.
  • the method of analysis of the phytosterols content from whole sunflower seeds, sunflower seed pieces or sunflower meal, as well as the method for obtaining sunflower seeds with a high phytosterols content consisting of the present invention are also an object of the present invention.
  • Another object of the present invention is the use of oil and phytosterols extracted from it in human and animal feed and in the formulation of nutraceutical or pharmaceutical foods and products enriched in phytosterols.
  • the present invention relates to a sunflower oil characterized by having a high content of phytosterols, which is produced by sunflower plants (Helianthus annuus L.) that have been genetically modified by a mutagenesis program.
  • the phytosterols content of the oil is 7660 to 14980 mg of total phytosterols per kg of unrefined oil.
  • These high levels of phytosterols are not produced in nature by sunflower plants and have been obtained through a complex process consisting of artificial induction of mutations, development of a method of identification of mutants, identification of mutant plants by application of a new method. developed, and fixation of the new character identified.
  • the high content of phytosterols object of the present invention is inheritable and is always produced independently of the growing conditions.
  • the fraction of phytosterols of this oil is composed of campesterol, which represents between 4.2% and 30.9% of the total phytosterols in the oil, stigmasterol, which represents between 4.3% and 29.8% of the total Phytosterols in the oil, delta-7-campesterol, which represents between 0.2% and 15.7% of the total phytosterols in the oil, clerosterol, which represents between 0.2% and 8.6% of the total phytosterols in the oil, beta -sitosterol, which represents between 20.4% and 85.2% of the total phytosterols in the oil, delta-5- avenasterol, which represents between 0.3% and 20.9% of the total phytosterols in the oil, delta-5.24 - stigmastadienol, which represents between 0.2% and 10.0% of the total phytosterols in the oil,
  • a process of genetic modification of the seeds has been carried out by means of mutagenesis consisting of four stages: (1) Induction of artificial mutations in seeds of a variety of sunflower with standard content of phytosterols in their oil by chemical and physical mutagens; (2) Development of a non-destructive method of identifying mutants with altered levels of phytosterols adapted to the analysis of a large number of small samples; (3) Identification of individuals with altered levels of phytosterols; and (4) Fixation of the new character consisting of high levels of phytosterols in the seeds and in the oil extracted from them.
  • Chemical and physical mutagenic agents were used. Between the Chemical mutagenic agents include ethyl methyl sulphonate (EMS), sodium azide (NaN3), ethylnitrosourea (ENU), N-methylnitrosourea (NMU), and dimethylsulfate (DMS).
  • EMS ethyl methyl sulphonate
  • NaN3 sodium azide
  • ENU ethylnitrosourea
  • NMU N-methylnitrosourea
  • DMS dimethylsulfate
  • X-rays, gamma rays, and rapid neutrons stand out. Before proceeding with the mutagenic treatment, it was necessary to proceed to determine the optimal conditions of the treatment, including the pretreatment of the seeds, the dose of the mutagenic agent to be applied, and the time of application.
  • the treatment was carried out directly on intact seeds, without the need to pre-treat them.
  • the pretreatment consisted of submerging the seeds in water for a certain period of time to favor the softening of the outer cover of the seed and consequently a better penetration of the mutagenic agent.
  • the determination of the optimal dose of a certain mutagenic agent required prior tests using different types of seed pretreatment, dose of the mutagenic agent, and application time. Once the treatments were carried out, the seeds were sown and the percentage of germination and survival of plants was determined at 40 days after the treatment and, in comparison with the percentage of germination and survival presented by the untreated seeds, the dose was calculated Lethal 50% (LD 50), which is the treatment that inhibits the germination or development of 50% of the seeds compared to untreated seeds. This treatment is usually considered to be the optimum for the creation of new variation, since it combines good plant survival with high efficiency in induction of mutations (Brunner, 1995. Methods of induction of mutations. Plant Breeding Unit.
  • LD 50 Lethal 50%
  • the mutagenic treatments were applied to a high number of seeds, taking into account an approximate survival of 50% of seeds as mentioned above. Seeds under mutagenic treatment are called Mi seeds. Once the mutagenic treatment was applied with the optimal conditions of pretreatment of the seeds, dose of mutagenic agent and application time previously determined, the germination of the Mi seeds was carried out. For this, the seeds were put on filter paper moistened with tap water and kept for 48 hours in a growth chamber at 27 ° C and in dark conditions.
  • the seeds can be sown in pots containing vegetable substrate or directly in the field, although the percentage of germination is higher when germination is done on moistened filter paper.
  • the germinated seeds were transplanted into pots of approximately 7x7x7 cm in size containing plant substrate and kept in a growth chamber for 14 days at 25/18 ° C (day / night) with a 16 h photoperiod. After this time, the plants, called Mi plants, were transplanted to the field or to larger pots that were kept in a greenhouse or umbrella. Prior to the beginning of flowering, the inflorescences were bagged with paper bags to prevent the arrival of foreign pollen.
  • M 2 seeds seeds harvested on M 1 plants are called M 2 seeds. Since the phytosterol-containing character in seeds is a sporophytic character (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploide populations of winter rapeseed. Crop Science 48: 1000-1006), it was not It is necessary to analyze the M 2 seeds, but these were sown to generate a large population of M 2 plants. Planting of M 2 seeds were carried out directly in the field, using the "plant to row” (plant to row) procedure, that is, a groove of M 2 seeds is sown for each of the harvested Mi plants. The distance between rows was 1 m and the distance between plants within the groove was 20 cm.
  • the M 2 plants from the M 2 seeds were identified individually in order to follow their genealogy.
  • the inflorescences were bagged before flowering, as described above.
  • the collection was carried out at the level of individual plants.
  • the set of M 3 seeds collected on each of the M 2 plants constitutes the sample on which the phytosterols content was analyzed in order to identify possible mutants for this character.
  • plants of the pure sunflower cultivars and lines were grown, whose seeds were subjected to mutagenic treatments, and used as a control.
  • the oil content of the seeds and the phytosterols content in the seeds were non-destructively analyzed. With both analyzes, it was possible to determine the phytosterols content referred to the oil content of the seeds. Non-destructive analysis was necessary to maximize the probability of detecting mutants, because part of the M 2 plants produced a small number of seeds, due to the presence of unfavorable mutations resulting from mutagenic treatment.
  • the non-destructive analysis of oil content in the seeds was carried out by means of nuclear magnetic resonance imaging (NMR), which allows analyzing the oil content of samples consisting of 12 seeds (husked achenes) intact of sunflower.
  • NMR nuclear magnetic resonance imaging
  • the half-seed technique was applied to the seeds used for the oil content analysis.
  • the half seed technique It consists of cutting a small piece of the seed distally to the embryo so that the germination capacity of the seed is not affected.
  • This technique has been used for the analysis of the fatty acid profile in sunflower seeds (Conté et al., 1989. Half-seed analysis: rapid chromatographic determination of the main fatty acids of sunflower seed. Plant Breeding 102: 158-165) and for the analysis of the tocopherol profile in sunflower seeds (Velasco et al., 2004. Novel variation for tocopherol profile in a sunflower created by mutagenesis and recombination.
  • Plant Breeding 123: 490-492 but had not been used to date for the analysis of the phytosterols content in sunflower seeds.
  • the 12 cut seed pieces were used for the analysis of phytosterols in seed, while the 12 cut seeds, which contain the embryo, were stored in Eppendorf tubes identified with the corresponding plant code M 2 and kept in a cold chamber ( 4 ° C) until the time of planting.
  • the 12 seed pieces from each M 2 plant were divided into two groups of 6 pieces. It was analyzed in phytosterols content and profile in one of the two groups and the second was kept refrigerated to be analyzed as a confirmation sample in the event that the analysis of the first sample yielded an interesting result.
  • a new method of phytosterols analysis from sunflower seed pieces was developed based on the adaptation of methods developed for solid raw materials such as wheat flour (Toivo et al. , 2000. Factors affecting sample preparation in the gas chromatographic determination of plant sterols in whole wheat flour. Food Chemistry 68: 239-245) or whole rapeseed seeds (Amar et al., 2008.
  • the control line plants had a phytosterols content between 3542 and 6455 mg of phytosterols per kg of unrefined oil, while the M 2 plants showed a variation range between 2375 and 12698 mg of phytosterols per kg of unrefined oil.
  • the control line plants had a campesterol content between 4.1% and 11.7% of the total phytosterols in the oil, a stigmasterol content between 2.6% and 14.2% of the total phytosterols in oil, a delta-7-campesterol content between 0.5% and 4.2% of the total phytosterols in the oil, a clerosterol content between 0.2% and 2.9% of the total phytosterols in the oil, a content in beta-sitosterol between 54.6% and 75.8% of the total phytosterols in the oil, a delta-5- avenasterol content between 0.3% and 5.1% of the total phytosterols in the oil, a delta-5 content , 24- stigmastadienol between 0.1% and 2.2% of the total phytosterols in the oil, a delta-7- stigmastenol content between 5.8% and 17.3% of the total phytosterols in the oil, and a delta-7- avenasterol content between 2.0% and 5.1% of the total phytosterols in the oil
  • the M 2 plants had a campesterol content between 2.8% and 27.6% of the total phytosterols in the oil, a stigmasterol content between 3.3% and 26.9% of the total phytosterols in the oil, a delta content. 7- campesterol between 0.3% and 12.7% of the total phytosterols in the oil, a clerosterol content between 0.1% and 7.0% of the total phytosterols in the oil, a beta-sitosterol content between 36.4% and 84.2% of the total phytosterols in the oil, a delta-5-avenasterol content between 0.2% and 15.9% of the total phytosterols in the oil, a delta-5.24-stigmastadienol content between 0.1% and 8.0% of the total phytosterols in the oil, a delta-7- stigmastenol content between 1.2% and 46.7% of the total phytosterols in the oil, and a delta-7- avenasterol content between 0.2% and 13.6% of the total phytosterols in the oil.
  • the population of 8064 M 3 plants presented a campesterol content between 4.2% and 30.9% of the total phytosterols in the oil, a content of stigmasterol between 4.3% and 29.8% of the total phytosterols in the oil, a delta-7- campesterol content between 0.2% and 15.7% of the total phytosterols in the oil, a clerosterol content between 0.2% and 8.6% of the total phytosterols in the oil, a beta-sitosterol content between 20.4% and 85.2% of the total phytosterols in the oil, a delta-5-avenasterol content between 0.3% and 20.9% of the Total phytosterols in the oil, a delta-5, 24-stigmastadienol content between 0.2% and 10.0% of the total phytosterols in the oil, a delta-7-stigmastenol content between 2.1% and 52.4% of the total phytosterols in the oil, and a delta-7- avenasterol content between 0.6% and 15.8%
  • the variation detected for phytosterols profile within the population of M 3 plants with high total phytosterols content indicates that the increase in the total phytosterols content may be produced by the increase in the content in one or several individual phytosterols. Any mutation that favors the accumulation of a certain phytosterol affects both the total phytosterol content in the oil and the proportion of that phytosterol in the total total phytosterols in the oil.
  • particular embodiments of the invention include oils with a phytosterols content greater than 7660 mg per kg of unrefined oil, greater than 10,000 mg per kg of unrefined oil, and greater than 12500 mg per kg of unrefined oil.
  • the oil of the invention has a campesterol content greater than 21% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a content in stigmasterol greater than 19% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a delta-7- campesterol content exceeding 5% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a clerosterol content greater than 3% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a beta-sitosterol content of less than 42% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a delta-5- avenasterol content greater than 7% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a delta-5.24-stigmastadienol content exceeding 3% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a delta-7-stigmastenol content greater than 25% of the total phytosterols in the oil and greater than 35% of the total phytosterols in the oil.
  • the oil of the invention has a delta-7- avenasterol content greater than 10% of the total phytosterols in the oil.
  • this oil and the phytosterols extracted therefrom can be used ideally in human and / or animal feed.
  • the oil of the invention and the phytosterols extracted from it can be used in the formulation of food and products nutraceuticals or pharmaceuticals enriched in phytosterols.
  • the oil of the invention is obtainable from the extraction of sunflower seeds from the IASF-27 seed line, deposited on May 5, 2011 in the ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA, with deposit number PTA-11870.
  • oils containing the oil of the invention also constitute an object of the present invention, as well as the flour obtained as the residue of the oil extraction process from sunflower seeds.
  • Another object of the present invention is sunflower seeds that contain an oil with the characteristics of the oil of the invention. These are seeds that give rise to plants that, after germination, contain in their seeds, being self-fertilized, an oil with the characteristics of the oil of the invention, regardless of the growing conditions of the plants.
  • the seeds of the invention come from the IASF-27 sunflower line, deposited on May 5, 2011 at the ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, VA , USA, with deposit number PTA-11870.
  • the seeds object of the present invention can be used to obtain the oil of the invention.
  • sunflower plants which, being self-fertilized, produce seeds that contain the oil of the invention also constitute another object of the present invention.
  • Seeds of a particular entry of the Peredovik sunflower variety were used, selected for presenting a high total phytosterols content within the analysis of a large collection of sunflower germplasm.
  • the seeds, analyzed before the mutagenic treatment had a phytosterol content of 5719 mg per kg of oil.
  • the phytosterols profile, analyzed before the mutagenic treatment was composed of 6.4% campesterol, 11.1% stigmasterol, 2.4% delta-7-campesterol, 0.5% clerosterol, 59.6% beta-sitosterol, 1.5% delta-5- avenasterol, 1.2% delta-5, 24-stigmastadienol, 14.8% delta-7-stigmastenol, and 2.5% delta-7-avenasterol.
  • the seeds were transferred to a solution of the ethyl methylsulphonate mutagenic agent (EMS) with a concentration of 30 mM, 50 mM, 70 mM, 90 mM, or 110 mM in 0.1 M phosphate buffer at pH 7.0 for 2 hours , maintaining a constant stirring of 60 rpm. After this period, the seeds were washed for 16 hours with tap water and seeded in an inert medium (vermiculite) to determine the percentage of germination and survival. A control was also used to which no mutagenic agent was added.
  • EMS ethyl methylsulphonate mutagenic agent
  • the percentage of viable plants at 40 days of the treatment were: 97.3% in the control treatment, 79.9% in the treatment at a 30 mM dose of EMS, 72.3% in the treatment at a 50 mM dose of EMS, 63.8% in the treatment at a 70 mM dose of EMS, 52.7% in the treatment at a 90 mM dose of EMS, and 39.8% in the treatment at a 110 mM dose of EMS.
  • the optimal dose was 90 mM EMS, being the closest to the lethal dose 50.
  • the method had to meet four requirements: 1) it must be non-destructive, because many of the M 2 plants produced a small number of M 3 seeds that could not be destroyed in the analytical process; 2) you must use a small amount of sample and chemical reagents; 3) must be fast and allow the analysis of a large number of samples per day; and 4) the results obtained with the analysis method must show a good correlation with the results obtained through the official method.
  • the half-seed technique was applied to each of the seeds used in the oil content analysis, consisting of cutting a small piece of the seed distally to the embryo so that the germination capacity of the seed.
  • the 12 cut seed pieces were used for the analysis of phytosterols in seed, while the 12 cut seeds, containing the embryo, were stored in Eppendorf tubes identified with the corresponding plant code M 2 and kept in a cold chamber (4 ° C) until the time of planting.
  • the 12 seed pieces from each M 2 plant were divided into two groups of 6 pieces.
  • the content and profile of phytosterols in one of the two groups was analyzed and the second was kept refrigerated to be analyzed as a confirmation sample in the event that the analysis of the first sample yielded an interesting result.
  • a new method of phytosterols analysis based on sunflower seed pieces was described and described below.
  • the sunflower seed pieces were weighed on a precision scale and placed in 10 ml polypropylene tubes, adding 200 microliters of a colestrol solution (99% purity, reference C8667, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in hexane-ethanol (3: 2) at a concentration of 0.1% as internal standard.
  • An alkaline hydrolysis step was then carried out. For this, 2 milliliters of a 2% solution of potassium hydroxide in ethanol were added and the seeds were ground and homogenized using a Heidolph RC 500 homogenizer (Heidolph, Kelheim, Germany) equipped with a drill bit. 8 mm diameter stainless steel, at a speed of 5,000 rpm for 15 seconds. Seed residues in the drill bit were dragged into the polypropylene tube using 1 milliliter of the solution of potassium hydroxide in ethanol. The tubes were introduced in a water bath at 80 ° C for 15 minutes. After this period, the unsaponifiable fraction was extracted.
  • Heidolph RC 500 homogenizer Heidolph, Kelheim, Germany
  • the thermal regime of the oven was as follows: 240 ° C as the initial temperature, which was increasing at a rate of 5 ° C per minute to a final temperature of 265 ° C, which was maintained for 10 minutes.
  • the final analysis time was 15 minutes.
  • the areas of the different phytosterols present in sunflower seeds were identified by comparing retention times with patterns.
  • the quantification of the total phytosterols content was based on the area of the internal standard, whose concentration in the sample is known. Once the phytosterols content in the seeds and the oil content in the seeds were known, the phytosterols content was expressed as mg of phytosterols per kg of oil.
  • the phytosterol content of the M 3 plants was between 7660 and 11855 mg of phytosterols per kg of unrefined oil, while the phytosterols profile was different in different M 2 families, which indicated that the total phytosterols content can be increased by increasing the content in individual phytosterols.
  • Table 2 shows the ranges of total content variation and phytosterols profile in the 48 M 3 plants of each of the selected M 2 families.
  • IASF-27 D IASF-5894 IASF-9336 IASF-18589 Total 8042-11855 8268-11751 7942-10666 7660-9764
  • bIASF-27 line seeds have been deposited on May 5, 2011 at the ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, VA, USA, with PTA deposit number- 11870
  • Seeds from a selection of the IAS-13 pure line were used, developed in the sunflower genetic improvement program of the Institute of Sustainable Agriculture (CSIC) and selected for presenting high content in total phytosterols in the analysis of a large germplasm collection of sunflower.
  • the phytosterols profile analyzed before the mutagenic treatment, was composed of 6.8% campesterol, 7.9% stigmasterol, 1.3% delta-7-campesterol, 0.8% clerosterol, 65.8% beta-sitosterol, 1.3% delta-5-avenasterol, 0.8% delta-5.24- stigmastadienol, 12.7% delta-7-stigmastenol, and 2.5% delta-7-avenasterol. b) Calculation of the dose of mutagen
  • the percentage of viable plants 40 days after treatment were: 95.6% in the control treatment, 96.2% in the treatment at a dose of 100 Gy, 94.4% in the treatment at a dose of 200 Gy, 86.5% in the treatment at a dose of 300 Gy, 77.2% in the treatment at a dose of 400 Gy, 65.4% in the treatment at a dose of 500 Gy, and 60.6% in the treatment at a dose of 600 Gy.
  • An optimum dose of 600 Gy of gamma radiation was taken.
  • Three thousand sunflower seeds of the IAS-13 pure line underwent a mutagenic treatment with gamma rays emitted by a 60 Co source at a dose of 600 Gy. After the mutagenic treatment, the seeds (generation Mi) were sown in the field. At 40 days after planting a plant count was made in the field, resulting in a total of 1455 Mi plants. The inflorescences of the Mi plants were pocketed 3 days before the hint of flowering to obtain M 2 seed from self-fertilization. A total of 92 M 1 plants produced less than 24 seeds and were discarded.
  • Example 1 The method of analysis of the total content and profile of phytosterols in sunflower seeds described in Example 1 was used for the analysis of the population of 23182 M 2 plants at the level of individual plants. Following this evaluation, it was found that 3 M 2 plants had a phytosterols content greater than 9000 mg of phytosterols per kg of unrefined oil, which was arbitrarily set as the selection limit. M 3 seeds of each of the selected M 2 plants were sown in the field, pocketed to obtain M 4 seed from self-fertilization, and harvested at the level of individual plants. 48 M 3 plants were evaluated for each of the M 2 families.
  • the phytosterol content of the M 3 plants was between 8162 and 14980 mg of phytosterols per kg of unrefined oil, while the phytosterols profile was different in different M 2 families.
  • the ranges of variation are shown in Table 3 total content and phytosterols profile in the 48 M 3 plants of each of the selected M 2 families.
  • aTotal Total content in phytosterols
  • Camp Campesterol
  • Est Stigmasterol
  • 7-Camp Delta-7-Campesterol

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Abstract

Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles que se caracteriza por poseer entre 7660 y 4980 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado

Description

ACE I TE DE GIRASOL CON ELEVADO CONTENIDO EN FI TOESTEROLES
El objeto de la presente invención es un aceite de girasol con elevado contenido en esteróles vegetales o fitoesteroles , que se caracteriza por poseer entre 7660 y 14980 mg de fitoesteroles totales por kg de aceite no refinado. La fracción de fitoesteroles de este aceite está compuesta por campesterol, que representa entre el 4.2% y el 30.9% del total de fitoesteroles en el aceite, estigmasterol , que representa entre el 4.3% y el 29.8% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7-campesterol , que representa entre el 0.2% y el 15.7% del total de fitoesteroles en el aceite, clerosterol, que representa entre el 0.2% y el 8.6% del total de fitoesteroles en el aceite, beta-sitosterol , que representa entre el 20.4% y el 85.2% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5- avenasterol, que representa entre el 0.3% y el 20.9% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5,24- estigmastadienol , que representa entre el 0.2% y el 10.0% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7- estigmastenol , que representa entre el 2.1% y el 52.4% del total de fitoesteroles en el aceite, y delta-7-avenasterol , que representa entre el 0.6% y el 15.8% del total de fitoesteroles en el aceite. Constituye otro objeto de la presente invención las semillas de girasol que contienen un aceite con las mencionadas características y las plantas de girasol que al ser autofecundadas producen semillas con las características mencionadas. Constituyen también objeto de la presente invención el método de análisis del contenido en fitoesteroles a partir de semillas enteras de girasol, trozos de semillas de girasol o harina de girasol, así como el método para la obtención de semillas de girasol con contenido elevado en fitoesteroles consistente en tratamiento mutagénico de semillas de girasol e identificación de mutantes mediante análisis no destructivo de semillas de girasol empleando el método de análisis arriba mencionado. La extracción de los fitoesteroles contenidos en este aceite asi como la utilización del aceite y de los fitoesteroles extraídos a partir de él en alimentación humana y animal y en la formulación de alimentos y productos nutracéuticos o farmacéuticos enriquecidos en fitoesteroles son asimismo objeto de la presente invención.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención se enmarca en el sector de la agricultura, en el sector alimentario, y en el sector nutracéutico y farmacéutico. El aceite de girasol objeto de la presente invención presenta un elevado contenido en fitoesteroles (también denominados esteróles vegetales o simplemente esteróles), muy superior a la de otros aceites de girasol existentes en la actualidad. El elevado contenido en fitoesteroles le confiere un elevado valor nutricional debido al potencial de los fitoesteroles para reducir los niveles de colesterol en sangre. Asimismo, el elevado contenido en fitoesteroles en el aceite permite rentabilizar la extracción de los mismos para su empleo en la preparación de alimentos enriquecidos en fitoesteroles o en formulados nutracéuticos o farmacéuticos que incluyan fitoesteroles en su composición.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo. Entre los factores de riesgo para estas enfermedades se encuentra un nivel elevado de colesterol en sangre, particularmente de colesterol-LDL (World Health Organization, 2003. The World Health Report. Shaping the Future. WHO, Geneva, Switzerland) . El colesterol, perteneciente al amplio grupo de compuestos isoprenoides , es el principal esterol presente en animales. Sus equivalentes en plantas son los esteróles vegetales o fitoesteroles , que presentan una gran similitud química y funcional con el colesterol. En ambos casos, se trata de moléculas derivadas del escualeno y constan de un anillo tetracíclico ciclopentanoperhidrofenantreno y una cadena lateral en el carbono C17 (Fig. 1) . Se han identificado más de 250 fitoesteroles diferentes. La mayoría de ellos, al igual que el colesterol, presentan un doble enlace entre los carbonos C5 y C6 del anillo tetracíclico, y se denominan delta-5-esteroles . A este grupo pertenecen los fitoesteroles más comunes, entre los que se encuentran sitosterol, campesterol, estigmasterol , y delta-5- avenasterol. Otro grupo de fitoesteroles presentan un doble enlace entre los carbonos C7 y C8 del anillo tetracíclico, y se denominan delta-7-esteroles . En este grupo se encuentan entre otros delta-7-avenasterol , delta-7- estigmastenol y gramisterol. Algunos de los fitoesteroles de los tipos delta-5 y delta-7 pueden presentar asimismo un doble enlace adicional en la cadena lateral, como por ejemplo estigmasterol (delta-5, 22 ; Fig. 1) . Por último, existen también fitoesteroles saturados, es decir, sin dobles enlaces, denominados fitoestanoles . A efectos de simplificación, en esta descripción del estado de la técnica se hablará de fitoesteroles en general, incluyendo en este término también a los fitoestanoles .
Sitostanol Campestanol
Fig. 1. Estructura química de algunos de los fitoesteroles (sitosterol, campesterol, stigmasterol ) y fitoestanoles (sitostanol, campestanol) más comunes en comparación con el colesterol.
Los fitoesteroles se encuentran tanto de forma libre como de forma conjugada con otros compuestos, principalmente ácidos grasos y glucósidos (Piironen et al., 2000. Plant sterols: biosynthesis , biological function and their importance to human nutrition Journal of the Science of Food and Agriculture 80:939-966) .
Los fitoesteroles han sido empleados tradicionalmente en la industria cosmética y farmacéutica, si bien el principal interés sobre estos compuestos se debe a la aparición de aplicaciones en el campo de la alimentación, inicialmente como aditivos o ingredientes alimentarios naturales, y más recientemente como unos de los principales productos de la nutracéutica, una nueva ciencia que estudia los efectos terapéuticos de los componentes de los alimentos (Kritchevsky y Chen, 2005. Phytosterols- health benefits and potential concerns : a review. Nutrition Research 25:413-428) . A mediados de la década de 1950 se descubrió que los fitoesteroles poseían la propiedad de reducir los niveles de colesterol en animales (Peterson, 1951. Effect of soybean sterols in the diet on plasma and liver cholesterol in chicks. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 78:143-147) y humanos (Pollak, 1953. Reduction of blood cholesterol in man. Circulation 7: 702-706) . Desde entonces, se han sucedido numerosos estudios que han confirmado el efecto de los fitoesteroles en la dieta en la reducción de los niveles de colesterol LDL y la mortalidad causada por enfermedades coronarias (Andersson et al., 2004. Intake of dietary plant sterols is inversely related to serum cholesterol concentration in men and women in the EPIC Norfolk population: a cross-sectional study. European Journal of Clinical Nutrition 58: 1378-1385) . A raíz de estos estudios, los fitoesteroles empezaron a ser considerados como compuestos con un excepcional interés farmacológico y nutricional, si bien, debido a su baja solubilidad, su administración debe realizarse previa transformación en sus correspondientes ésteres, que presentan asimismo gran valor fisiológico en la reducción de los niveles de colesterol (Vanhanen et al., 1994. Serum levéis, absorption efficiency, faecal elimination and synthesis of cholesterol during increasing doses of dietary sitostanol esters in hypercholesterolaemic subjects. Clinical Science 87: 61- 67) . Su utilización comercial en alimentos enriquecidos comenzó en 1995 en Finlandia, donde se lanzó al mercado por primera vez una margarina enriquecida con fitoestanoles (Benecol®, Raisio Pie, Raisio, Finlandia) . En la actualidad, se puede encontrar en el mercado un amplio espectro de productos enriquecidos con fitoesteroles y fitoestanoles , que incluye margarinas, quesos, bebidas lácteas, o incluso pasta (Salo et al., 2005. Plant estanol ester as cholesterol-lowering ingredient of Benecol® foods . In: Healthful Lipids. C.A. Akoh, O.M. Lai, eds . AOCS Press, Champaign, IL, EE.UU, pp . 699-730) .
La principal fuente natural de fitoesteroles en la dieta son los aceites vegetales y sus productos derivados (margarinas, etc.), seguidos de los cereales y frutos secos. En la Tabla 1 se muestra el contenido medio en esteróles de los principales aceites vegetales comestibles sin refinar. Tabla 1. Contenido medio (mg kg-1) de los principales fitoesteroles en aceites vegetales comestibles no refinados (Padley et al., 1994. Occurrence and characteristics of oils and fats. In The Lipid Handbook, eds. F.D. Gunstone, J.L. Harwood and F.B. Padley. London: Chapman & Hall, pp . 47-223) .
Figure imgf000007_0001
Al igual que ocurre con otros compuestos presentes en las semillas, por ejemplo ácidos grasos o tocoferoles, la cantidad total y perfil de fitoesteroles dentro de una determinada especie vegetal está determinada tanto por el genotipo de la planta como por factores ambientales (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploid populations of winter rapeseed. Crop Science 48:1000-1006) . En el caso del girasol, no obstante, apenas se han realizado hasta la fecha estudios sobre variabilidad genética y ambiental para contenido total y perfil de fitoesteroles en semillas. Vlahakis y Hazebroek (2000. Phytosterol accumulation in cañóla, sunflower, and soybean oils: effects of genetics, planting location, and temperature. Journal of the American Oil Chemists' Society 77:49-53) encontraron un rango de variación entre 2100 y 4540 mg kg-1 aceite en 12 variedades de girasol cultivadas en varios ambientes, concluyendo que la variación era consecuencia tanto de diferencias genéticas entre las variedades como de efectos ambientales. Gotor et al. (2007. Quantification of sunflower minor components by near infrared spectrometry NIR. Helia 30:183-190) evaluaron una amplia colección de variedades y lineas puras de girasol en varios ambientes y encontraron un rango de variación para contenido en fitoesteroles entre 1250 y 7650 mg kg-1 aceite. El perfil medio de fitoesteroles en aceite de girasol está compuesto por 8% campesterol, 8% estigmasterol , 60% beta- sitosterol, 4% delta-5-avenasterol , 15% delta-7- estigmastenol , 4% delta-7-avenasterol , y 1% de otros fitoesteroles menores (Padley et al., 1994. Occurrence and characteristics of oils and fats. In The Lipid Handbook, eds . F.D. Gunstone, J.L. Harwood and F.B. Padley. London: Chapman & Hall, pp . 47-223) . Algunos autores han estudiado los rangos de variación para perfil de fitoesteroles en aceite de girasol. Vlahakis y Hazebroek (2000. Phytosterol accumulation in cañóla, sunflower, and soybean oils: effects of genetics, planting location, and temperature. Journal of the American Oil Chemists' Society 77:49-53)) encontraron niveles máximos de 20% campesterol, 18% estigmasterol, y 82% beta-sitoesterol . Verleyen et al. (2002. Analysis of free and sterified sterols in vegetable oils. Journal of the American Oil Chemists' Society 79:117- 122) describieron niveles máximos de 16% campesterol, 9% estigmasterol , 69% beta-sitosterol , y 15% delta-5- avenasterol. El Real Decreto 308/1983 de 25 de enero por el que se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria de Aceites Vegetales Comestibles (BOE Núm. 44 de 21 de febrero de 1983, páginas 4853-4858) no establece limites para contenido total o perfil de esteróles en el aceite de girasol. Por el contrario, el Real Decreto 478/2007 de 13 de abril por el que se modifica el Real Decreto 308/1983 (BOE Núm. 99 de 25 de abril de 2007, páginas 18069-18070) especifica que el aceite de girasol debe contener un total de esteróles totales comprendidos entre 1700 y 5200 ppm (ppm = mg de esteróles por kg de aceite) , con una composición que debe cumplir los siguientes limites: menor o igual a 0.5% de colesterol, menor o igual a 0.2% de brasicasterol , de 5.0 a 13.0% de campesterol, de 4.5 a 13.0% de estigmasterol, de 42.0 a 70.0% de beta-sitosterol, de 1.5 a 6.9% de delta-5-avenasterol , de 6.5 a 24.0% de delta-7-estigmasterol , de 3.0 a 9.0% de delta-7- avenasterol, y menor o igual a 9.5% de otros esteróles. Debe señalarse que en el mencionado Real Decreto 478/2007 de 13 de abril se confunde delta-7-estigmastenol por delta- 7-estigmasterol , lo que ya aparece corregido en el Real Decreto 1716/2010 de 17 de diciembre por el que se modifica el real decreto 308/1983 (BOE Núm. 317 de 30 de diciembre de 2010, páginas 108823-108825) , en el que se establecen los mismos limites de contenido total y perfil de esteróles a los establecidos en el Real Decreto 478/2007, pero referidos específicamente a los aceites de girasol procedentes de semillas con alto esteárico-alto oleico.
Roche et al. (2006. Management of environmental crop conditions to produce useful sunflower oil components. European Journal of Lipid Science and Technology 108:287- 297) estudiaron los efectos ambientales sobre la acumulación de fitoesteroles en semillas de girasol, concluyendo que tanto la temperatura como la disponibilidad de agua durante la fase de formación de las semillas ejercían gran influencia sobre la acumulación de fitoesteroles en semillas de girasol.
El desarrollo de germoplasma de girasol con mayor contenido en fitoesteroles en semillas al descrito en la literatura permitiría el desarrollo de nuevos productos con alto contenido natural en fitoesteroles y permitiría reducir costes de producción en el aislamiento de fitoesteroles naturales a partir de aceite de girasol. No obstante, no existen en la literatura trabajos dirigidos al desarrollo de germoplasma de girasol con niveles elevados de fitoesteroles .
Entre las técnicas existentes para crear nueva variación genética no existente en el germoplasma de un cultivo determinado, destacan las técnicas de inducción de mutaciones o mutagénesis. La mutagénesis consiste en la aplicación de un agente con propiedades mutagénicas a una parte de la planta para inducir modificaciones en su ADN. Cuando el agente mutagénico se aplica a las semillas, estas alteraciones del ADN o mutaciones se transmiten a la descendencia y, una vez identificadas aquellas de interés y fijadas, dan lugar a nuevos caracteres que pueden introducirse en variedades comerciales o cultivares. El tratamiento mutagénico genera alteraciones genéticas aleatorias en puntos determinados del genoma de la planta. No obstante, cuando el tratamiento se aplica a un número elevado de semillas, se maximiza la probabilidad de cubrir todo el genoma de la planta y por tanto de generar variación para el carácter deseado. Von Wettstein et al. (1959. Mutationsforschung und Züchtung. lst Edition. Westdteutscher Verlag, Kóln, Germany, pp . 21-28) citan varios ejemplos sobre la reproducibilidad de los tratamientos mutagénicos, es decir, la obtención de forma consistente de un tipo determinado de mutante siempre que el tratamiento y la evaluación de mutantes se realicen sobre un número suficiente de individuos. Otros ejemplos los encontramos en los trabajos de Jenkins (1959) sobre Drosophila (Mutagenesis at a complex locus in Drosophila with the monofunctional alkylating agent, ethyl methanesulphonate . Genetics 57:783-793), y Svetleva (2004) sobre la obtención de mutante cloróticos en judia (Induction of chlorophyll mutants in conraion bean under the action of chemical mutagens ENU and EMS. Journal of Central European Agriculture 5:85-90) . En relación con caracteres bioquímicos de las semillas, deben mencionarse varios ejemplos sobre la obtención del mismo carácter modificado a través de varios experimentos independientes de mutagénesis. Así, se han obtenido mediante mutagénesis semillas de soja con niveles elevados en ácido palmítico de forma independiente por Erickson et al. (1988. Inheritance of altered palmitic acid percentage in two soybean mutants. Journal of Heredity 79:465-468), Bubeck et al. (1989, Inheritance of palmitic and stearic acid mutants of soybean. Crop Science 29:652-656), Fehr et al. (1991. Inheritance of elevated palmitic acid content in soybean seed oil. Crop Science 31: 1522-1524), y Takagi et al. (1995. Reduced and elevated palmitic acid mutants in soybean developed by X- ray irradiation. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 59:1778-1779) . También en soja, varios experimentos independientes de mutagénesis dieron como resultado la detección y fijación de mutantes con alto contenido en ácido esteárico, destacando los trabajos de Hammond y Fehr (1983. Registration of A6 germplasm line of soybean. Crop Science 23: 192-193), Graef et al. (1985. Inheritance of three stearic acid mutants of soybean. Crop Science 25:1076-1079), Bubeck et al. (1989. Inheritance of palmitic and stearic acid mutants of soybean. Crop Science 29:652-656), y Rahman et al. (1995. High stearic acid soybean mutant induced by X-ray irradiation. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 922-923) . Otro ejemplo interesante lo encontramos en especies de brassicas oleaginosas, donde se ha obtenido germoplasma con bajo contenido en ácido linolénico en una gran número de trabajos independientes de mutagénesis empleando una amplia gama de agentes mutágenos químicos y físicos, destacando los trabajos de Rakow (1973. Selektion auf Linol- und Linolensauregehalt in Rapssamen nach mutagener Behandlung. Zeitschrift für Pflanzenzüchtg 69:62- 82), Róbbelen y Nitsch (1975. Genetical and physiological investigations on mutants for polyenoic fatty acids in rapeseed, Brassica napus L. I. Selection and description of new mutants. Zeitschrift für Pflanzenzüchtg 75:93-105), Auld et al. (1992. Rapeseed mutants with reduced levéis of polyunsaturated fatty acids and increased levéis of oleic acid. Crop Science 32:657-662), Velasco et al. (1997. Induced variability for C18 unsaturated fatty acids in Ethiopian mustard. Canadian Journal of Plant Science 77:91- 95), y Spasibionek (2006. New mutants of winter rapeseed - Brassica napus L. - with changed fatty acid composition. Plant Breeding 125:259-267) . Por último, Fernández-Martínez et al. ((2009. Mutation breeding for oil quality improvement in sunflower. En: Q.Y. Shu, editor, Induced Plant Mutations in the Genomics Era. Food and Agriculture Organization iof the United Nations, Rome, pp . 197-202) describieron varios ejemplos sobre mutantes con niveles modificados de ácido palmítico y ácido esteárico en semillas de girasol empleando diversos procedimientos de mutagénesis química y física Todos estos ejemplos ponen de manifiesto que las técnicas de mutagénesis permiten obtener los fenotipos deseados que no se encuentran disponibles en el germoplasma de la especie considerada, y que estas técnicas son reproducibles , es decir, el mismo carácter modificado puede obtenerse en diferentes experimentos realizados de forma independiente, siempre que se sigan los protocolos adecuados y se maneje un elevado número de plantas en las sucesivas generaciones del programa de mutagénesis. Como se acaba de mencionar, uno de los aspectos clave para la obtención de un determinado fenotipo mediante mutagénesis es el manejo de un elevado número de individuos. El caso más general es la aplicación del tratamiento mutagénico a las semillas. Existe una amplia gama de productos químicos y tipos de radiaciones que producen alteraciones genéticas. A los primeros se les conoce momo mutantes químicos, y a los segundos como mutantes físicos. Entre los mutante químicos destacan como más utilizados en tratamientos de semillas el metil sulfonato de etilo (EMS), azida sódica (NaN3), etilnitrosourea (ENU) , N-metilnitrosourea (NMU) , y dimetilsulfato (DMS) . Entre los mutantes físicos destacan los rayos X, rayos gamma, y neutrones rápidos. Los diferentes agentes mutagénicos difieren en su modo de acción pero, como se comentó anteriormente, un mismo carácter modificado puede obtenerse con distintos agentes mutagénicos (Von Wettstein et al., 1959. Mutationsforschung und Züchtung. lst Edition. Westdteutscher Verlag, Kóln, Germany, pp . 21-28) . Aspectos clave para el éxito del tratamiento mutagénico es el empleo de la metodología adecuada (tratamiento previo de las semillas, uso de la dosis adecuada, tiempo de aplicación del agente mutágeno, etc.) así como la aplicación de la misma a un elevado número de semillas. Cuanto mayor sea el número de semillas sometidas a tratamiento, mayor será la probabilidad de obtener el fenotipo deseado. Las semillas sometidas a tratamiento mutagénico reciben en nombre de semillas Mi , y las plantas derivadas de ellas plantas Mi .
En general las mutaciones son recesivas, es decir, no se expresan a nivel de semillas M1 o plantas M1 sino a nivel semillas M2 (semillas producidas por las plantas Mi ) o plantas M2 (plantas derivadas de semillas M2 ) , dependiendo de la naturaleza del control genético del carácter. En los caracteres gametofíticos , controlados por el genotipo del embrión en desarrollo, las mutaciones recesivas pueden detectarse a nivel de semillas M2 individuales. Por el contrario, en los caracteres esporofiticos , controlados por el genotipo de la planta madre, las mutaciones recesivas se detectan a nivel de plantas M2 mediante el análisis de muestras de semillas M3 producidas por las plantas M2. El contenido en fitoesteroles en semillas es un carácter esporofitico (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploide populations of winter rapeseed. Crop Science 48:1000-1006) .
Debido a su naturaleza esporofitica, la detección de mutaciones que afectan al contenido en fitoesteroles requiere el análisis de un gran número de plantas M2 derivadas del tratamiento de semillas Mi con agentes mutagénicos químicos o físicos. La identificación de mutantes con niveles elevados de fitoesteroles sólo es posible si se dispone de una técnica analítica que permita analizar el contenido en fitoesteroles de forma no destructiva, rápida y precisa. Sin embargo, los métodos tradicionales para el análisis de fitoesteroles en semillas vegetales requieren la extracción previa del aceite de las semillas (Dutta and Normen, 1998. Capillary column gas- liquid chromatographic separation of 5-unsaturated and saturated phytosterols . Journal of Chromatography A 816:177-184) . La necesidad de extraer el aceite ralentiza el proceso de análisis y no permite manejar grandes tamaños de poblaciones. Alternativamente, y tomando como base métodos para analizar el contenido en colesterol en alimentos (Klatt et al., 1995. Cholesterol analysis in foods by direct saponification-gas chromatographic method: collaborative study. Journal of AOAC International 78:75- 79) , se han desarrollado métodos que permiten analizar el contenido en fitoesteroles en materias primas sólidas tales como harina de trigo (Toivo et al., 2000. Factors affecting sample preparation in the gas chromatographic determination of plant sterols in whole wheat flour. Food Chemistry 68:239-245) o semillas de colza (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploide populations of winter rapeseed. Crop Science 48:1000-1006) . Estas técnicas, sin embargo, son destructivas (las semillas analizadas son destruidas durante el proceso de análisis y por consiguiente no pueden sembrarse para dar lugar a la siguiente generación) y no han sido adaptadas a los requerimientos de los programas de selección a partir de mutagénesis, basados principalmente en el análisis no destructivo de un gran número de muestras consistentes en un pequeño número de semillas. La combinación de técnicas de mutagénesis con técnicas eficientes de detección de mutantes de forma no destructiva ha permitido el desarrollo de un elevado número de mutantes de girasol con propiedades modificadas de la calidad de su aceite, principalmente con niveles modificados de ácidos grasos y tocoferoles (revisado por Fernández-Martínez et al., 2008. Sunflower. En: Oil Crop Breeding. J. Vollmann, I. Rajcan (eds), Springer, pp . 155-232) . Sin embargo, no se han identificado hasta la fecha mutantes de girasol con niveles elevados de fitoesteroles en sus semillas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Descripción Breve
La presente invención se refiere a un aceite de girasol extraído a partir de semillas de girasol que presenta un elevado contenido en fitoesteroles , superior al contenido en fitoesteroles de cualquier aceite de girasol existente en el mercado o descrito en la literatura. Este aceite posee entre 7660 y 14980 mg de fitoesteroles totales por kg de aceite no refinado. La fracción de fitoesteroles de este aceite está compuesta por campesterol, que representa entre el 4.2% y el 30.9% del total de fitoesteroles en el aceite, estigmasterol , que representa entre el 4.3% y el 29.8% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7-campesterol , que representa entre el 0.2% y el 15.7% del total de fitoesteroles en el aceite, clerosterol, que representa entre el 0.2% y el 8.6% del total de fitoesteroles en el aceite, beta-sitosterol , que representa entre el 20.4% y el 85.2% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5-avenasterol , que representa entre el 0.3% y el 20.9% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5, 24-estigmastadienol, que representa entre el 0.2% y el 10.0% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7-estigmastenol , que representa entre el 2.1% y el 52.4% del total de fitoesteroles en el aceite, y delta-7-avenasterol , que representa entre el 0.6% y el 15.8% del total de fitoesteroles en el aceite.
La presente invención se refiere también a las semillas de girasol que contienen un aceite con las mencionadas características, y las plantas de girasol que al ser autofecundadas producen semillas con las características mencionadas. No existen en la actualidad semillas de girasol que produzcan un aceite con el elevado contenido en fitoesteroles que el que presenta el aceite obtenido de las semillas objeto de la presente invención.
Constituyen también objeto de la presente invención el método de análisis del contenido en fitoesteroles a partir de semillas enteras de girasol, trozos de semillas de girasol o harina de girasol, así como el método para la obtención de semillas de girasol con contenido elevado en fitoesteroles consistente en tratamiento mutagénico de semillas de girasol e identificación de mutantes mediante análisis no destructivo de semillas de girasol empleando el método de análisis arriba mencionado. Asimismo constituye otro objeto de la presente invención la utilización del aceite y de los fitoesteroles extraídos a partir de él en alimentación humana y animal y en la formulación de alimentos y productos nutracéuticos o farmacéuticos enriquecidos en fitoesteroles .
Descripción Detallada La presente invención se refiere a un aceite de girasol caracterizado por poseer un elevado contenido de fitoesteroles , que es producido por plantas de girasol (Helianthus annuus L.) que han sido modificadas genéticamente mediante un programa de mutagénesis. El contenido en fitoesteroles del aceite es de 7660 a 14980 mg de fitoesteroles totales por kg de aceite no refinado. Estos elevados niveles de fitoesteroles no son producidos en la naturaleza por plantas de girasol y han sido obtenidos mediante un proceso complejo consistente en inducción artificial de mutaciones, puesta a punto de un método de identificación de mutantes, identificación de plantas mutantes mediante aplicación de nuevo método desarrollado, y fijación del nuevo carácter identificado. El elevado contenido en fitoesteroles objeto de la presente invención es heredable y se produce siempre con independencia de las condiciones de cultivo.
El manejo de grandes poblaciones en el proceso de mutagénesis junto con la puesta a punto de un método eficiente de identificación de mutantes han permitido obtener elevados niveles de fitoesteroles totales con diferentes perfiles de fitoesteroles individuales. Así, la fracción de fitoesteroles de este aceite está compuesta por campesterol, que representa entre el 4.2% y el 30.9% del total de fitoesteroles en el aceite, estigmasterol , que representa entre el 4.3% y el 29.8% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7-campesterol , que representa entre el 0.2% y el 15.7% del total de fitoesteroles en el aceite, clerosterol, que representa entre el 0.2% y el 8.6% del total de fitoesteroles en el aceite, beta-sitosterol , que representa entre el 20.4% y el 85.2% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5- avenasterol, que representa entre el 0.3% y el 20.9% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5,24- estigmastadienol , que representa entre el 0.2% y el 10.0% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7- estigmastenol , que representa entre el 2.1% y el 52.4% del total de fitoesteroles en el aceite, y delta-7-avenasterol , que representa entre el 0.6% y el 15.8% del total de fitoesteroles en el aceite. La obtención de elevado contenido total en fitoesteroles junto con diferentes perfiles de los mismos indicó que el incremento del contenido total fue debido en algunas de las lineas obtenidas a una acumulación diferencial de uno o varios fitoesteroles individuales.
Para la obtención de las plantas modificadas genéticamente cuyas semillas dan lugar a un aceite con elevado contenido en fitoesteroles , se ha llevado a cabo un proceso de modificación genética de las semillas mediante mutagénesis consistente en cuatro etapas: (1) Inducción de mutaciones artificiales en semillas de una variedad de girasol con contenido estándar en fitoesteroles en su aceite mediante mutágenos químicos y físicos; (2) Puesta a punto de un método no destructivo de identificación de mutantes con niveles alterados de fitoesteroles adaptado al análisis de un elevado número de muestras de pequeño tamaño; (3) Identificación de individuos con niveles alterados de fitoesteroles ; y (4) Fijación del nuevo carácter consistente en niveles elevados de fitoesteroles en las semillas y en el aceite extraído de las mismas.
Para la inducción de mutaciones en semillas se emplearon agentes mutagénicos químicos y físicos. Entre los agentes mutagénicos químicos destacan metil sulfonato de etilo (EMS) , azida sódica (NaN3) , etilnitrosourea (ENU) , N- metilnitrosourea (NMU) , y dimetilsulfato (DMS) . Entre los mutantes físicos destacan los rayos X, rayos gamma, y neutrones rápidos. Antes de proceder al tratamiento mutagénico, fue necesario proceder a determinar las condiciones óptimas del tratamiento, incluyendo el pretratamiento de las semillas, dosis del agente mutagénico a aplicar, y tiempo de aplicación. En los tratamientos con agentes mutagénicos físicos, el tratamiento se realizó directamente sobre semillas intactas, sin necesidad de pretratamiento de las mismas. En el caso de tratamiento con un agente mutagénico químico, el pretratamiento consistió en sumergir las semillas en agua durante un período de tiempo determinado para favorecer el ablandamiento de la cubierta externa de la semilla y consiguientemente una mejor penetración del agente mutagénico.
La determinación de la dosis óptima de un determinado agente mutagénico requirió la realización de pruebas previas empleando diferentes tipos de pretratamiento de las semillas, dosis del agente mutagénico, y tiempo de aplicación. Una vez realizados los tratamientos, se sembraron las semillas y se determinó el porcentaje de germinación y supervivencia de plantas a los 40 días después del tratamiento y, en comparación con el porcentaje de germinación y supervivencia que presentaron las semillas sin tratar, se calculó la dosis letal 50% (LD 50), que es el tratamiento que inhibe la germinación o desarrollo del 50% de las semillas en comparación con las semillas no tratadas. Este tratamiento suele considerarse como el óptimo para la creación de nueva variación, ya que combina una buena supervivencia de plantas con una gran eficiencia en la inducción de mutaciones (Brunner, 1995. Methods of induction of mutations. Plant Breeding Unit. Joint FAO/IAEA Programme, IAEA Laboratories, Siebersdorf, Austria, 62 pp) . Los tratamientos mutagénicos se aplicaron a un elevado número de semillas, teniendo en cuenta una supervivencia aproximada del 50% de semillas como se ha mencionado anteriormente. Las semillas sometidas a tratamiento mutagénico reciben en nombre de semillas Mi . Una vez aplicado el tratamiento mutagénico con las condiciones óptimas de pretratamiento de las semillas, dosis de agente mutagénico y tiempo de aplicación determinados previamente, se procedió a la germinación de las semillas Mi . Para ello, las semillas se pusieron en papel de filtro humedecido con agua de grifo y se mantuvieron durante 48 h en cámara de crecimiento a 27°C y en condiciones de oscuridad. Alternativamente las semillas pueden sembrarse en macetitas conteniendo sustrato vegetal o directamente en campo, si bien el porcentaje de germinación es mayor cuando la germinación se realiza en papel de filtro humedecido. Las semillas germinadas se trasplantaron a macetitas de tamaño aproximado 7x7x7 cm conteniendo sustrato vegetal y se mantuvieron en cámara de crecimiento durante 14 días a 25/18°C (dia/noche) con un fotoperiodo de 16 h. Transcurrido este tiempo las plantas, denominadas plantas Mi , se trasplantaron a campo o a macetas de mayor tamaño que se mantuvieron en invernadero o umbráculo. Con anterioridad al inicio de la floración, las inflorescencias se embolsaron con bolsas de papel para evitar la llegada de polen ajeno. Terminada la floración y maduración de las semillas, éstas se cosecharon a nivel de planta M1 individual, se limpiaron y clasificaron. Las semillas cosechadas sobre plantas M1 se denominan semillas M2. Como el carácter contenido en fitoesteroles en semillas es un carácter esporofitico (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploide populations of winter rapeseed. Crop Science 48:1000-1006), no fue necesario analizar las semillas M2 , sino que éstas se sembraron para generar una gran población de plantas M2. La siembra de semillas M2 se realizó directamente en campo, mediante el procedimiento de "planta a surco" (plant to row) , es decir, se siembra un surco de semillas M2 por cada una de las plantas Mi cosechadas. La distancia entre surcos fue de 1 m y la distancia entre plantas dentro del surco fue de 20 cm.
Las plantas M2 procedentes de las semillas M2 se identificaron de forma individual para poder seguir su genealogía. Las inflorescencias se embolsaron antes de la floración, como se ha descrito anteriormente. La recolección se realizó a nivel de plantas individuales. El conjunto de semillas M3 recolectadas sobre cada una de las plantas M2 constituye la muestra sobre la que se analizó el contenido en fitoesteroles con el objetivo de identificar posibles mutantes para este carácter. Junto a las plantas M2 se cultivaron plantas de las líneas puras y cultivares de girasol cuyas semillas se sometieron a los tratamientos mutagénicos, y que se emplearon como control.
Para la identificación de posibles mutantes para contenido en fitoesteroles en el aceite, se procedió a analizar de forma no destructiva el contenido en aceite de las semillas y el contenido en fitoesteroles en las semillas. Con ambos análisis, fue posible determinar el contenido en fitoesteroles referido al contenido en aceite de las semillas. El análisis no destructivo fue necesario para maximizar la probabilidad de detectar mutantes, debido a que parte de las plantas M2 produjeron un reducido número de semillas, debido a la presencia de mutaciones desfavorables consecuencia del tratamiento mutagénico. El análisis no destructivo de contenido en aceite en las semillas se realizó mediante resonancia magnética nuclear (RMN) , que permite analizar el contenido en aceite de muestras consistentes en 12 semillas (aquenios descascarillados) intactas de girasol. Una vez analizado el contenido en aceite, se aplicó la técnica de la media semilla a las semillas empleadas para el análisis de contenido en aceite. La técnica de la media semilla consiste en cortar un pequeño trozo de la semilla en su parte distal al embrión de forma que no se afecta la capacidad de germinación de la semilla. Esta técnica se ha empleado para el análisis del perfil de ácidos grasos en semillas de girasol (Conté et al., 1989. Half-seed analysis: rapid chromatographic determination of the main fatty acids of sunflower seed. Plant Breeding 102:158-165) y para el análisis del perfil de tocoferoles en semillas de girasol (Velasco et al., 2004. Novel variation for tocopherol profile in a sunflower created by mutagenesis and recombination . Plant Breeding 123:490-492) pero no había sido empleada hasta la fecha para el análisis del contenido en fitoesteroles en semillas de girasol. Los 12 trozos de semilla cortados se emplearon para el análisis de fitoesteroles en semilla, mientras que las 12 semillas cortadas, que contienen el embrión, se guardaron en tubos Eppendorf identificados con el código de la planta M2 correspondiente y se conservaron en cámara fría (4 °C) hasta el momento de la siembra.
Los 12 trozos de semilla procedentes de cada planta M2 se dividieron en dos grupos de 6 trozos. Se analizó en contenido y perfil de fitoesteroles en uno de los dos grupos y el segundo se conservó refrigerado para ser analizado como muestra de confirmación en el caso que el análisis de la primera muestra arrojara un resultado interesante. Para el análisis del contenido total y perfil de fitoesteroles se puso a punto un nuevo método de análisis de fitoesteroles a partir de trozos de semillas de girasol basado en la adaptación de métodos desarrollados para materias primas sólidas tales como harina de trigo (Toivo et al., 2000. Factors affecting sample preparation in the gas chromatographic determination of plant sterols in whole wheat flour. Food Chemistry 68:239-245) o semillas enteras de colza (Amar et al., 2008. Genetic variation and genotype x environment interactions of phytosterol content in three doubled haploid populations of winter rapeseed. Crop Science 48:1000-1006) . El método no destructivo desarrollado específicamente para el análisis de medias semillas de girasol y detección de mutantes con contenido elevado de fitoesteroles se describe en detalle en el E emplo 1 de esta memoria.
En este trabajo se emplearon varios agentes mutagénicos (véanse dos ejemplos en la próxima sección) sobre un total de 18000 semillas procedentes de varias líneas puras y cultivares de girasol, que dieron lugar a 7605 plantas Mi que alcanzaron la madurez y produjeron semillas M2. Se sembraron a partir de ellas 6693 familias M2 en campo, con una media de 11.96 plantas M2 por cada familia Mi , resultando en un total de 80048 plantas M2 , de las cuales 12007 plantas produjeron menos de 24 semillas y fueron descartadas, mientras que 68041 plantas produjeron semillas M3 que fueron analizadas para contenido en aceite y contenido en fitoesteroles en semilla mediante el método descrito anteriormente. Las plantas de las líneas control presentaron un contenido en fitoesteroles entre 3542 y 6455 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado, mientras que las plantas M2 presentaron un rango de variación entre 2375 y 12698 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado. A nivel de perfil de fitoesteroles , las plantas de las líneas control presentaron un contenido en campesterol entre el 4.1% y el 11.7% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en estigmasterol entre el 2.6% y el 14.2% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-7-campesterol entre el 0.5% y el 4.2% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en clerosterol entre el 0.2% y el 2.9% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en beta- sitoesterol entre el 54.6% y el 75.8% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-5- avenasterol entre el 0.3% y el 5.1% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-5,24- estigmastadienol entre el 0.1% y el 2.2% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-7- estigmastenol entre el 5.8% y el 17.3% del total de fitoesteroles en el aceite, y un contenido en delta-7- avenasterol entre el 2.0% y el 5.1% del total de fitoesteroles en el aceite. Las plantas M2 presentaron un contenido en campesterol entre el 2.8% y el 27.6% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en estigmasterol entre el 3.3% y el 26.9% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-7- campesterol entre el 0.3% y el 12.7% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en clerosterol entre el 0.1% y el 7.0% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en beta-sitosterol entre el 36.4% y el 84.2% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-5-avenasterol entre el 0.2% y el 15.9% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-5,24- estigmastadienol entre el 0.1% y el 8.0% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-7- estigmastenol entre el 1.2% y el 46.7% del total de fitoesteroles en el aceite, y un contenido en delta-7- avenasterol entre el 0.2% y el 13.6% del total de fitoesteroles en el aceite.
A partir de la evaluación de plantas M2, se seleccionaron 27 plantas M2 con más de 9000 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado y se evaluaron 48 plantas M3 por cada una de las plantas M2 seleccionadas. El análisis de las plantas M3 se hizo de forma no destructiva sobre 16 semillas M4 producidas por cada planta M3, como se ha descrito anteriormente para el análisis de las plantas M2. Esta población de 8064 plantas M3 presentó un rango de variación entre 7660 y 14980 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado. Para perfil de fitoesteroles , la población de 8064 plantas M3 presentó un contenido en campesterol entre el 4.2% y el 30.9% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en estigmasterol entre el 4.3% y el 29.8% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-7- campesterol entre el 0.2% y el 15.7% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en clerosterol entre el 0.2% y el 8.6% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en beta-sitoesterol entre el 20.4% y el 85.2% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-5-avenasterol entre el 0.3% y el 20.9% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta-5, 24-estigmastadienol entre el 0.2% y el 10.0% del total de fitoesteroles en el aceite, un contenido en delta- 7-estigmastenol entre el 2.1% y el 52.4% del total de fitoesteroles en el aceite, y un contenido en delta-7- avenasterol entre el 0.6% y el 15.8% del total de fitoesteroles en el aceite. La variación detectada para perfil de fitoesteroles dentro de la población de plantas M3 con elevado contenido total en fitoesteroles indica que el incremento en el contenido total en fitoesteroles puede producirse por el incremento en el contenido en uno o varios fitoesteroles individuales. Cualquier mutación que favorezca la acumulación de un determinado fitoesterol repercute tanto sobre el contenido total en fitoesteroles en el aceite como en la proporción de ese fitoesterol en el conjunto de fitoesteroles totales del aceite.
Teniendo en cuenta el rango en el contenido total en fitoesteroles de las lineas de girasol obtenidas en el programa de mutagénesis, las realizaciones particulares de la invención incluyen aceites con un contenido en fitoesteroles superior a 7660 mg por kg de aceite no refinado, superior a 10000 mg por kg de aceite no refinado, y superior a 12500 mg por kg de aceite no refinado.
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en campesterol superior al 21% del total de fitoesteroles en el aceite.
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en estigmasterol superior al 19% del total de fitoesteroles en el aceite.
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en delta-7- campesterol superior al 5% del total de fitoesteroles en el aceite .
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en clerosterol superior al 3% del total de fitoesteroles en el aceite.
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en beta- sitosterol inferior al 42% del total de fitoesteroles en el aceite .
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en delta-5- avenasterol superior al 7% del total de fitoesteroles en el aceite .
En otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en delta-5,24- estigmastadienol superior al 3% del total de fitoesteroles en el aceite.
En otras dos realizaciones particulares de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en delta-7-estigmastenol superior al 25% del total de fitoesteroles en el aceite y superior al 35% del total de fitoesteroles en el aceite.
Y en otra realización particular de la invención el aceite de la invención presenta un contenido en delta-7- avenasterol superior al 10% del total de fitoesteroles en el aceite.
Dado el elevado contenido en fitoesteroles del aceite de la invención, este aceite y los fitoesteroles extraídos a partir del mismo puede ser utilizado de forma idónea en alimentación humana y/o animal. Igualmente el aceite de la invención y los fitoesteroles extraídos a partir de él pueden emplearse en la formulación de alimentos y productos nutracéuticos o farmacéuticos enriquecidos en fitoesteroles .
En una realización particular de la invención, el aceite de la invención es obtenible a partir de la extracción de semillas de girasol de la linea de semillas IASF-27, depositada el 5 de mayo de 2011 en el ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, con número de depósito PTA-11870.
Las mezclas de aceites que contienen el aceite de la invención también constituyen un objeto de la presente invención, asi como la harina obtenida como el residuo del proceso de extracción del aceite a partir de las semillas de girasol.
Constituyen otro objeto de la presente invención las semillas de girasol que contienen un aceite con las características del aceite de la invención. Se trata de semillas que dan lugar a plantas que tras su germinación contienen en sus semillas, al ser autofecundadas , un aceite con las características del aceite de la invención, con independencia de las condiciones de cultivo de las plantas. En una realización particular las semillas de la invención proceden de la línea de girasol IASF-27, depositada el 5 de mayo de 2011 en el ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, VA, EEUU, con número de depósito PTA- 11870. Las semillas objeto de la presente invención pueden ser utilizadas para la obtención del aceite de la invención .
Asimismo las plantas de girasol (Helianthus annuus L.) que al ser autofecundadas producen semillas que contienen el aceite de la invención también constituyen otro objeto de la presente invención. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1: Mutagénesis química
a) Material vegetal empleado
Se emplearon semillas de una entrada particular de la variedad Peredovik de girasol, seleccionada por presentar un elevado contenido total en fitoesteroles dentro del análisis de una amplia colección de germoplasma de girasol. Las semillas, analizadas antes del tratamiento mutagénico, presentaron un contenido en fitoesteroles de 5719 mg por kg de aceite. El perfil de fitoesteroles , analizado antes del tratamiento mutagénico, estuvo compuesto por 6.4% campesterol, 11.1% estigmasterol , 2.4% delta-7-campesterol , 0.5% clerosterol, 59.6% beta-sitosterol , 1.5% delta-5- avenasterol, 1.2% delta-5, 24-estigmastadienol, 14.8% delta- 7-estigmastenol , y 2.5% delta-7-avenasterol . b) Cálculo de la dosis de mutágeno
Se tomaron lotes de 400 semillas de la variedad Peredovik y cada lote se sometió a una dosis de tratamiento mutagénico con el agente mutagénico metilsulfonato de etilo (EMS) con el objetivo de determinar la dosis óptima de tratamiento, próxima a la dosis letal 50 (LD50) . Las dosis ensayadas fueron 30 mM, 50 mM, 70 mM, 90 mM, y 110 mM. Para la realización del tratamiento mutagénico, las semillas se embebieron durante 16 horas en agua. Pasado este tiempo, las semillas se transfirieron a una solución del agente mutagénico metilsulfonato de etilo (EMS) con una concentración de 30 mM, 50 mM, 70 mM, 90 mM, o 110 mM en tampón fosfato 0.1 M a pH 7.0 durante 2 horas, manteniendo una agitación constante de 60 rpm. Tras este periodo, las semillas se lavaron durante 16 horas con agua de grifo y se sembraron en un medio inerte (vermiculita) para determinar el porcentaje de germinación y supervivencia. Se empleó asimismo un testigo al que no se le añadió agente mutagénico. El porcentaje de plantas viables a los 40 días del tratamiento fueron: 97.3% en el tratamiento testigo, 79.9% en el tratamiento a una dosis 30 mM de EMS, 72.3% en el tratamiento a una dosis 50 mM de EMS, 63.8% en el tratamiento a una dosis 70 mM de EMS, 52.7% en el tratamiento a una dosis 90 mM de EMS, y 39.8% en el tratamiento a una dosis 110 mM de EMS. Se tomó como dosis óptima 90 mM de EMS, al ser la más próxima a la dosis letal 50. c) Tratamiento mutagénico
Cuatro mil quinientas semillas de girasol de la variedad Peredovik se sometieron a un tratamiento mutagénico con metilsulfonato de etilo (EMS) a una concentración 90 mM siguiendo el protocolo descrito en el apartado anterior. Tras el tratamiento mutagénico, las semillas (generación Mi ) se lavaron durante 16 horas con agua corriente y posteriormente se sembraron en el campo. A los 40 días de la siembra se hizo un conteo de plantas en el campo, resultando en un total de 1856 plantas Mi . Las inflorescencias de las plantas Mi se embolsaron 3 días antes del indicio de la floración para la obtención de semilla M2 procedente de autofecundación. Un total de 418 plantas M1 produjeron menos de 24 semillas y fueron descartadas. Veinticuatro semillas M2 de las restantes 1438 plantas M1 se sembraron en campo en un surco individual por cada familia Mx, obteniéndose un total de 27380 plantas M2. Cada planta fue embolsada antes de la floración para la obtención de la semilla M3 procedente de autofecundación, como se ha descrito anteriormente. d) Puesta a punto de un método de identificación de mutantes
El análisis del contenido total y perfil de fitoesteroles en 27380 muestras de semillas M3 procedentes de plantas M2 individuales es inviable empleando el método oficial de análisis de fitoesteroles (Norma UNE-EN ISO 12228:2000. BOE núm. 202 de 23 de agosto de 2000, páginas 30109-30113) que se basa en la extracción previa del aceite de las semillas. Por este motivo, se procedió al desarrollo de un método alternativo de análisis de muestras de semillas de girasol. El método tenia que cumplir cuatro requisitos: 1) debe ser no destructivo, debido a que muchas de las plantas M2 produjeron un pequeño número de semillas M3 que no podían ser destruidas en el proceso analítico; 2) debe emplear una cantidad pequeña de muestra y de reactivos químicos; 3) debe ser rápido y permitir el análisis de un elevado número de muestras por día; y 4) los resultados obtenidos con el método de análisis deben mostrar una buena correlación con los resultados obtenidos mediante el método oficial.
Para poder expresar los resultados obtenidos en el análisis del contenido en fitoesteroles en semillas de girasol como contenido en fitoesteroles en aceite, es necesario en primer lugar medir de forma no destructiva el contenido en aceite en las semillas (aquenios descascarillados) . Para realizar este análisis, se descascarillaron 12 aquenios M3 de cada planta M2 y las 12 semillas se secaron en estufa a 45°C durante 72 horas. A continuación se analizó el contenido en aceite en las semillas mediante resonancia magnética nuclear (RMN) en un equipo Oxford 400 analyzer (Oxford Analytical Instruments Ltd., Abingdon, OX, Reino Unido), empleando aceite crudo de girasol para la calibración del equipo. A cada una de las semillas empleadas en el análisis de contenido en aceite se les aplicó la técnica de la media semilla, consistente en cortar un pequeño trozo de la semilla en la parte distal al embrión de forma que no se afecta la capacidad de germinación de la semilla. Los 12 trozos de semilla cortados se emplearon para el análisis de fitoesteroles en semilla, mientras que las 12 semillas cortadas, que contienen el embrión, se guardaron en tubos Eppendorf identificados con el código de la planta M2 correspondiente y se conservaron en cámara fría (4 °C) hasta el momento de la siembra.
Los 12 trozos de semilla procedentes de cada planta M2 se dividieron en dos grupos de 6 trozos. Se analizó el contenido y perfil de fitoesteroles en uno de los dos grupos y el segundo se conservó refrigerado para ser analizado como muestra de confirmación en el caso que el análisis de la primera muestra arrojara un resultado interesante. Para el análisis del contenido total y perfil de fitoesteroles se puso a punto un nuevo método de análisis de fitoesteroles a partir de trozos de semillas de girasol que se describe a continuación. Los trozos de semilla de girasol se pesaron en una balanza de precisión y se dispusieron en tubos de polipropileno de 10 mi, añadiéndose 200 microlitros de una solución de colestrol (99% pureza, referencia C8667, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) en hexano-etanol (3:2) a una concentración 0.1% como patrón interno. A continuación se procedió a realizar una etapa de hidrólisis alcalina. Para ello, se añadieron 2 mililitros de una solución al 2% de hidróxido potásico en etanol y se procedió a la molienda y homogenización de las semillas en la solución empleando un homogenizador Heidolph RC 500 (Heidolph, Kelheim, Alemania) equipado con una broca de acero inoxidable de 8 mm de diámetro, a una velocidad de 5,000 rpm durante 15 segundos. Los restos de semilla en la broca se arrastraron al tubo de polipropileno empleando 1 mililitro de la solución de hidróxido potásico en etanol. Los tubos se introdujeron en un baño de agua a 80°C durante 15 minutos. Tras este periodo, se procedió a la extracción de la fracción insaponificable . Para ello, se añadieron 1 mililitro de hexano y 1.5 mililitros de agua y se agitaron los tubos en vortex. Tras este proceso, se formaron dos capas, con los fitoesteroles disueltos en hexano en la capa superior. Ésta se transfirió a un vial de vidrio de 2 mililitros que se mantuvo en horno a 37.5 °C durante 16 horas. Posteriormente se procedió a una etapa de derivatización de los fitoesteroles . Para ello, se añadieron a los viales 50 microlitros de hexano y 50 microlitros de una solución sililante compuesta de piridina : hexametildisilazano : trimetilclorosilano en una proporción volumétrica 9:3:1 (Silan-Sterol-1, referencia 355650.0922, Panreac Química, Barcelona, España) y los viales se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Transcurrido este tiempo, la solución se transfirió a un vial de vidrio conteniendo un microinserto de 200 microlitros y se centrifugaron a 4,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos (Unicen 21, Ortoalresa, Madrid, España) . Tras la centrifugación, los viales se taparon y se mantuvieron en congelador a -20°C hasta su análisis mediante cromatografía de gases. La cromatografía de gases se realizó en un cromatógrafo Perkin Elmer Clarus 600 GC equipado con columna capilar ZB-5 (diámetro interno = 0.25 rom, longitud = 30 m, grosor de relleno = 0.10 μπι; Phenomenex, Torrance, CA, EEUU) . Se empleó hidrógeno como gas portador a una presión de 125 KPa. El inyector y el detector de ionización de llama se mantuvieron a 320°C. El régimen térmico del horno fue el siguiente: 240°C como temperatura inicial, que fue aumentando a razón de 5°C por minuto hasta una temperatura final de 265°C, que se mantuvo durante 10 minutos. El tiempo final de análisis fue de 15 minutos. Las áreas de los diferentes fitoesteroles presentes en las semillas de girasol se identificaron mediante comparación de los tiempos de retención con patrones. La cuantificación del contenido total en fitoesteroles se realizó en base al área del patrón interno, cuya concentración en la muestra es conocida. Una vez conocidos el contenido en fitoesteroles en las semillas y el contenido en aceite en las semillas, se expresó el contenido en fitoesteroles como mg de fitoesteroles por kg de aceite. El método se validó con el método oficial de análisis de fitoesteroles , resultando en una correlación de r=0.85 entre los resultados de ambos métodos. e) Identificación y caracterización de mutantes
El método de análisis del contenido total y perfil de fitoesteroles en semillas de girasol desarrollado para este trabajo, descrito en el apartado anterior, permitió el análisis de alrededor de 100 muestras por operario y día, lo que posibilitó el análisis de la población de 27380 plantas M2 a nivel de plantas individuales. Tras esta evaluación, se encontró que 4 plantas M2 presentaban un contenido en fitoesteroles superior a 9000 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado, que se fijó de forma arbitraria como limite de selección. Semillas M3 de cada una de las plantas M2 seleccionadas se sembraron en campo, se embolsaron para la obtención de semilla M4 procedente de autofecundación, y se cosecharon a nivel de plantas individuales. Se evaluaron 48 plantas M3 por cada una de las familias M2. El contenido en fitoesteroles de las plantas M3 estuvo entre 7660 y 11855 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado, mientras que el perfil de fitoesteroles fue diferente en distintas familias M2, lo que indicó que se puede incrementar el contenido total en fitoesteroles mediante el incremento del contenido en fitoesteroles individuales. En la Tabla 2 se muestran los rangos de variación contenido total y perfil de fitoesteroles en las 48 plantas M3 de cada una de las familias M2 seleccionadas.
Tabla 2. Rangos de variación para contenido total en fitoesteroles (mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado) y perfil de fitoesteroles (% del total de fitoesteroles ) en 4 familias M2 procedentes e tratamiento mutagénico con EMS. Se analizaron 48 plantas M3 por cada una de las familias M2.
Carácter3 Familia M2
IASF-27D IASF-5894 IASF-9336 IASF-18589 Total 8042-11855 8268-11751 7942-10666 7660-9764
Camp 5.0-9.3 21.4-29.6 4.6-7.9 5.2-9.1
Est 5.1-7.2 19.1-26.3 4.6-7.1 9.5-13.6
7 -Camp 0.8-1.5 8.6-11.9 0.4-1.1 0.2-0.6
Clero 0.6-1.2 0.5-0.9 0.6-1.1 0.3-0.8
Sito 60.8-73.4 27.6-36.8 22.3-48.3 71.4-80.9
5-Aven 0.7-1.6 0.4-1.1 0.8-1.2 0.5-1.0
5, 24-Est 0.8-1.4 0.5-1.0 1.1-2.6 0.5-1.0
7-Est 11.2-15.9 6.3-11.1 35.5-52.4 2.1-4.5
7 -Aven 1.9-4.7 2.0-4.9 3.6-7.4 0.6-1.3 aTotal=Contenido total en fitoesteroles ; Camp=Campesterol ; Est=Estigmasterol ; 7-Camp=Delta-7-Campesterol ;
Clero=Clerosterol ; Sito=Beta-sitosterol ; 5-Aven=Delta-5- Avenasterol ; 5, 24-Est=Delta-5, 24-estigmastadienol ; 7- Est=Delta-7-estigmastenol ; 7-Aven=Delta-7-avenasterol .
bLas semillas de la linea IASF-27 han sido depositadas el 5 de mayo de 2011 en el ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, VA, EEUU, con número de depósito PTA-11870.
Tras los análisis de plantas M3 individuales, se mezclaron partes iguales de semillas M4 de cada planta M3 para cada familia M2, se extrajo el aceite de la mezcla de semillas y se analizó el contenido en fitoesteroles y el perfil de fitoesteroles en el aceite mediante el método oficial de análisis (Norma UNE-EN ISO 12228:2000; BOE núm. 202 de 23 de agosto de 2000, páginas 30109-30113) . En las cuatro familias M2, el contenido en fitoesteroles y perfil de fitoesteroles en el aceite determinados mediante el método oficial estuvo dentro de los rangos de variación mostrados para cada familia M2 en la Tabla 2.
Ejemplo 2. Mutagénesis física a) Material vegetal empleado
Se emplearon semillas de una selección de la linea pura IAS-13, desarrollada en el programa de mejora genética de girasol de Instituto de Agricultura Sostenible (CSIC) y seleccionada por presentar alto contenido en fitoesteroles totales en el análisis de una amplia colección de germoplasma de girasol. Las semillas, analizadas antes del tratamiento mutagénico, presentaron un contenido en fitoesteroles de 5346 mg por kg de aceite. El perfil de fitoesteroles , analizado antes del tratamiento mutagénico, estuvo compuesto por 6.8% campesterol, 7.9% estigmasterol , 1.3% delta-7-campesterol , 0.8% clerosterol, 65.8% beta- sitosterol, 1.3% delta-5-avenasterol , 0.8% delta-5,24- estigmastadienol , 12.7% delta-7-estigmastenol , y 2.5% delta-7-avenasterol . b) Cálculo de la dosis de mutágeno
Se tomaron lotes de 250 semillas de la linea pura IAS-13 y cada lote se sometió a una dosis de tratamiento mutagénico con rayos gamma emitidos por una fuente de 60Co con el objetivo de determinar la dosis óptima de tratamiento, próxima a la dosis letal 50 (LD50) . Las dosis ensayadas fueron 100 Gy, 200 Gy, 300 Gy, 400 Gy, 500 Gy, y 600 Gy. Tras el tratamiento, las semillas se mantuvieron durante 48 h en desecador y posteriormente se sembraron en un medio inerte (vermiculita) para determinar el porcentaje de germinación y supervivencia. Se empleó asimismo un testigo no tratado. El porcentaje de plantas viables a los 40 días del tratamiento fueron: 95.6% en el tratamiento testigo, 96.2% en el tratamiento a una dosis de 100 Gy, 94.4% en el tratamiento a una dosis de 200 Gy, 86.5% en el tratamiento a una dosis de 300 Gy, 77.2% en el tratamiento a una dosis de 400 Gy, 65.4% en el tratamiento a una dosis de 500 Gy, y 60.6% en el tratamiento a una dosis de 600 Gy. Se tomó como dosis óptima 600 Gy de radiación gamma. c) Tratamiento mutagénico
Tres mil semillas de girasol de la linea pura IAS-13 se sometieron a un tratamiento mutagénico con rayos gamma emitidos por una fuente de 60Co a una dosis de 600 Gy. Tras el tratamiento mutagénico, las semillas (generación Mi) se sembraron en el campo. A los 40 días de la siembra se hizo un conteo de plantas en el campo, resultando en un total de 1455 plantas Mi. Las inflorescencias de las plantas Mi se embolsaron 3 días antes del indicio de la floración para la obtención de semilla M2 procedente de autofecundación. Un total de 92 plantas M1 produjeron menos de 24 semillas y fueron descartadas. Veinticuatro semillas M2 de las restantes 1363 plantas M1 se sembraron en campo en un surco individual por cada familia Mx, obteniéndose un total de 23182 plantas M2. Cada planta fue embolsada antes de la floración para la obtención de la semilla M3 procedente de autofecundación, como se ha descrito anteriormente. d) Identificación y caracterización de mutantes
Se empleó el método de análisis del contenido total y perfil de fitoesteroles en semillas de girasol descrito en el Ejemplo 1 para el análisis de la población de 23182 plantas M2 a nivel de plantas individuales. Tras esta evaluación, se encontró que 3 plantas M2 presentaban un contenido en fitoesteroles superior a 9000 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado, que se fijó de forma arbitraria como limite de selección. Semillas M3 de cada una de las plantas M2 seleccionadas se sembraron en campo, se embolsaron para la obtención de semilla M4 procedente de autofecundación, y se cosecharon a nivel de plantas individuales. Se evaluaron 48 plantas M3 por cada una de las familias M2. El contenido en fitoesteroles de las plantas M3 estuvo entre 8162 y 14980 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado, mientras que el perfil de fitoesteroles fue diferente en distintas familias M2. En la Tabla 3 se muestran los rangos de variación contenido total y perfil de fitoesteroles en las 48 plantas M3 de cada una de las familias M2 seleccionadas.
Tabla 3. Rangos de variación para contenido total en fitoesteroles (mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado) y perfil de fitoesteroles (% del total de fitoesteroles ) en 3 familias M2 procedentes de tratamiento mutagénico con rayos gamma. Se analizaron 48 plantas M3 por cada una de las familias M2.
Figure imgf000037_0001
aTotal=Contenido total en fitoesteroles ; Camp=Campesterol ; Est=Estigmasterol ; 7-Camp=Delta-7-Campesterol ;
Clero=Clerosterol ; Sito=Beta-sitosterol ; 5-Aven=Delta-5- Avenasterol ; 5, 24-Est=Delta-5, 24-estigmastadienol ; 7-
Est=Delta-7-estigmastenol ; 7-Aven=Delta-7-avenasterol .
Tras los análisis de plantas M3 individuales, se mezclaron partes iguales de semillas M4 de cada planta M3 para cada familia M2, se extrajo el aceite de la mezcla de semillas y se analizó el contenido en fitoesteroles y el perfil de fitoesteroles en el aceite mediante el método oficial de análisis (Norma UNE-EN ISO 12228:2000. BOE núm. 202 de 23 de agosto de 2000, páginas 30109-30113) . En las cuatro familias M2, el contenido en fitoesteroles y perfil de fitoesteroles en el aceite determinados mediante el método oficial estuvo dentro de los rangos de variación mostrados para cada familia M2 en la Tabla 2.

Claims

RE IVI DICACIONES
1. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles que se caracteriza por poseer entre 7660 y 14980 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado .
2. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque la fracción de fitoesteroles de este aceite está compuesta por campesterol, que representa entre el 4.2% y el 30.9% del total de fitoesteroles en el aceite, estigmasterol , que representa entre el 4.3% y el 29.8% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7-campesterol , que representa entre el 0.2% y el 15.7% del total de fitoesteroles en el aceite, clerosterol, que representa entre el 0.2% y el 8.6% del total de fitoesteroles en el aceite, beta-sitosterol , que representa entre el 20.4% y el 85.2% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5- avenasterol, que representa entre el 0.3% y el 20.9% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-5,24- estigmastadienol , que representa entre el 0.2% y el 10.0% del total de fitoesteroles en el aceite, delta-7- estigmastenol , que representa entre el 2.1% y el 52.4% del total de fitoesteroles en el aceite, y delta-7-avenasterol , que representa entre el 0.6% y el 15.8% del total de fitoesteroles en el aceite.
3. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza por poseer un contenido total en fitoesteroles superior a 10000 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado, y preferentemente superior a 12500 mg de fitoesteroles por kg de aceite no refinado.
4. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en campesterol es superior al 21% del total de fitoesteroles presentes en el aceite.
5. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en estigmasterol es superior al 19% del total de fitoesteroles presentes en el aceite.
6. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en delta-7-campesterol es superior al 5% del total de fitoesteroles presentes en el aceite .
7. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en clerosterol es superior al 3% del total de fitoesteroles presentes en el aceite.
8. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en beta-sitosterol es inferior al 42% del total de fitoesteroles presentes en el aceite .
9. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en delta-5-avenasterol es superior al 7% del total de fitoesteroles presentes en el aceite .
10.- Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en delta-5,24- estigmastadienol es superior al 3% del total de fitoesteroles presentes en el aceite.
11.- Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en delta-7- estigmastenol es superior al 25% del total de fitoesteroles presentes en el aceite, y preferentemente superior al 35% del total de fitoesteroles presentes en el aceite.
12. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, que se caracteriza porque el contenido en delta-7- avenasterol es superior al 10% del total de fitoesteroles presentes en el aceite.
13. - Aceite de semilla de girasol con elevado contenido total en fitoesteroles según la reivindicación 1, caracterizado porque es obtenible a partir de la extracción de semillas de girasol de la linea de semillas IASF-27, depositada el 5 de mayo de 2011 en el ATCC (American Type Culture Collection) Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, VA, EEUU, con número de depósito PTA-11870.
14. Mezclas de aceites que contienen un aceite de semilla de girasol según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Harina obtenida como el residuo del proceso de extracción de un aceite de semilla de girasol según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16.- Método para la obtención de semillas de girasol con contenido elevado en fitoesteroles según las reivindicaciones 1 a 13, consistente en: a) Tratamiento de semillas de girasol con un agente mutagénico a una concentración suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para inducir mutaciones en genes implicados en la biosintesis de fitoesteroles , de forma que las mutaciones inducidas resulten en un contenido elevado de fitoesteroles en semillas; b) Siembra de semillas mutagenizadas o semillas Mi , cultivo y autofecundación de plantas Mi y obtención de semillas M2 ; c) Siembra de semillas M2 , cultivo y autofecundación de plantas M2 y obtención de semillas M3 ; d) Corte de un pequeño trozo de semilla de la parte distal al embrión en un grupo de semillas M3 de la misma planta M2 , y análisis del contenido en fitoesteroles de los trozos cortados de las semillas según un método de análisis que consiste en: d.l) hidrólisis alcalina de los trozos de semillas; d.2) extracción de la fracción insaponificable; d.3) derivatización de los fitoesteroles ; y d.4) separación y cuantificación de los fitoesteroles individuales mediante cromatografía de gases y uso de patrón interno; de forma que las semillas originales M3 mantienen su capacidad germinativa y pueden ser sembradas en el caso de identificación de elevado contenido en fitoesteroles en los trozos analizados de las semillas.
17. Utilización de aceite de girasol según las reivindicaciones 1 a 13 para la alimentación humana y animal .
18. Utilización de aceite de girasol según las reivindicaciones 1 a 13 para la elaboración de productos enriquecidos con fitoesteroles .
19. Utilización de aceite de girasol según las reivindicaciones 1 a 13 para la extracción de fitoesteroles contenidos en el mismo.
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