WO2012168585A1 - Composition pour supplementer des milieux de culture cellulaire - Google Patents

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Elhadji Diouf
Marie-Claire DESPIAU
Christine Pivot
Fabrice Pirot
Mamadou Lamine Tall
Odile Damour
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Universite Claude Bernard Lyon 1
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Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/395—Thyroid hormones

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of cell culture media, and in particular epithelial cell culture media.
  • Triiodo-L-thyronine (T3) sodium corresponds to the IUPAC name: sodium salt of (2-amino-3- [4- (4-hydroxy-3-iodo-phenoxy) 3,5-diiodophenyl ] Propanoic and CAS number: 55-06-1 T3 is used in various pharmaceutical specialties: T3-containing tablets are marketed for the emergency or short-term treatment of hypothyroidism or as adjunctive therapy.
  • Other disorders of thyroidism Goldshieid sells Dextran 110 sodium t3 lyophilisate and sodium hydroxide which must be reconstituted in PPI water just before parenteral administration.
  • T3 has also been advocated for its interest in culture media such as the Green medium for culturing epithelial cells in series.
  • culture media such as the Green medium for culturing epithelial cells in series.
  • Thyroid hormone action on skin diverging effects of topical versus intraperitoneal administration: Thyroid, 2003 Feb; 13 (2): 159-65).
  • the present invention proposes to provide an aqueous solution of T3 in the form of a sodium salt, which is ready for use to supplement a given culture medium.
  • a solution must be stable, under temperature conditions, in particular belonging to the range 2-8 ° C, or even at room temperature (25 ° C), to facilitate its storage and use.
  • composition proposed in the context of the invention must also be prepared easily and at a cost not prohibitive cost.
  • the purpose of the composition according to the invention being to supplement simpler culture media, already known or to be developed in the future, its components other than sodium T3 must be compatible with a cell culture medium, and in particular a epithelial cell culture medium.
  • the present invention relates to a composition for supplementing a culture medium of epithelial cells, comprising Triiodo-L-thyronine (T3) sodium, an alkali metal hydroxide, an alcohol in Ci-C 3 and water.
  • T3 Triiodo-L-thyronine
  • alkali hydroxide As an example of alkali hydroxide, mention may be made of hydroxides of lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium or francium.
  • the function of the alkaline hydroxide is to aid the solubilization of sodium T3 in an aqueous solution.
  • the alkaline hydroxide is sodium hydroxide.
  • the ratio (m / m) sodium T3 / sodium hydroxide in the composition is in the range of 0.17 / 100 to 3.40 / 100, and is preferably 0.34 / 100.
  • C 1 -C 3 alcohol examples include methanol, ethanol, 7-propanol or propanol.
  • the function of the alcohol is to stabilize the solution obtained, in combination with the alkaline hydroxide.
  • the alcohol is methanol.
  • the ratio (m / v) sodium T3 / methanol is in the range of 0.068 / 100 to 5.440 / 100, and is preferably equal to 0.272 / 100.
  • the composition according to the invention is in the form of an aqueous solution.
  • the ratio (m / v) sodium T3 / water belongs to the range of 0.068 / 100 to 5.440 / 100, and is preferably equal to 0.272 / 100.
  • the composition according to the invention is sterile and pyrogen-free.
  • all the components used can be sterile and / or a closed system sterilizing filtration step can be implemented.
  • the invention relates to the use of a composition as defined above to supplement an epithelial cell culture medium.
  • the subject of the invention is also a process for culturing epithelial cells, in which a composition as previously defined is added to an initial culture medium, and then epithelial cells are cultured in the modified modified culture medium.
  • the composition according to the invention is, for example, added in such an amount as to have in the modified modified culture medium, a concentration of sodium T3 belonging to the range from 0.68 ⁇ g / L to 27.2 ⁇ g / sec, of preferably, to have a concentration equal to 1.36 pg / L
  • the initial culture medium may be any culture medium used for the culture of epithelial cells.
  • a medium which, after having been supplemented with the composition according to the invention, corresponds substantially to the Green medium.
  • Such media include, in general:
  • At least one oligo or polysaccharide for example chosen from glucose, fructose, galactose, mannose
  • At least one mineral salt for example chosen from sodium, potassium, calcium, magnesium, iron, zinc, cobalt and copper salts;
  • At least one vitamin and / or an antioxidant for example chosen from biotin, calcium pantothenate, choline chloride, folic acid, inositol, nicotinamide, pyridoxine, riboflavin, thiamine and vitamin B12,
  • At least one growth factor for example chosen from EGF (Epidermal Growth Factor) and adenine
  • antibiotics optionally one or more antibiotics, antifungals or bacterial agents.
  • the composition according to the invention may be used to supplement epithelial cell culture media.
  • This composition is suitable for mass culturing of keratinocytes, such as epidermal cells human, keratinocytes teratomas.
  • the serial culture of epithelial cells may in particular be carried out to produce colonies and possibly stratified squamous epithelium.
  • the process according to the invention makes it possible, in particular, to produce epidermal cells which can be used in the treatment of burns or else to test the effects on the skin of pharmaceutical, dermatological or cosmetic active ingredients.
  • glassware is protected from light.
  • a glass beaker containing 68 mg of sodium T3, 7.5 ml of 0.02M NaOH solution are added.
  • the sodium T3 powder is dissolved by sonication and then transferred to a 0.5-liter volumetric flask.
  • the beaker is rinsed several times with water for injection (ppi) and then the rinse water is transferred to the completed vial. to the line of the gauge with water ppi.
  • UV detection wavelength 226 nm
  • the calibration range is carried out in the methanolic solution of sodium hydroxide R: concentrations ranging from 0 mg / L to 5 mg / L. Each vial of the concentrated solution is used for two assays (at + 4 ° C. in PBS and in the methanolic solution of NaOH then at -25 ° C. in PBS and in the methanolic solution of NaOH):
  • the expected concentration is 1.36 mg / L.
  • FIG. 1 shows the study of the variation of the concentration of concentrated aqueous solutions of T3 (initial concentration: 136 mg.l -1 ) during storage time.
  • the solutions were stored either (i) at 4 ° C and then diluted at the time of the dosage to l / 100th in a methanolic solution of sodium hydroxide ( ⁇ ) or in a solution of PBS (O), or (ii) at -25 ° C then diluted to l / 100th during measurement in a methanolic solution of sodium hydroxide ( ⁇ ) or in a solution of PBS ( ⁇ ).
  • FIG. 2 shows the study of the change in the concentration of dilute T3 solutions (initial concentration: 1.36 mg.l- 1 ) over the storage time, and the T3 solutions were either stored at (i) 4 ° C ( ⁇ : solvent methanol / sodium hydroxide) and (O: solvent: PBS), either (ii) at -25 ° C ( ⁇ : solvent methanol / sodium hydroxide) and ( ⁇ : solvent: PBS).
  • ECCM modified epithelial cell culture medium

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Abstract

La présente invention concerne une composition destinée à supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales comprenant de la Triiodo-L-thyronine (T3) sodique, un hydroxyde alcalin, un alcool en C1-C3 et de l'eau, ainsi que l'utilisation d'une telle composition pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales.

Description

COMPOSITION POUR SUPPLEMENTER DES MILIEUX DE CULTURE CELLULAIRE
La présente invention concerne le domaine technique des milieux de culture cellulaire, et en particulier des milieux de culture de cellules épithéliales.
La Triiodo-L-thyronine (T3) sodique correspond au nom IUPAC : sel de sodium de l'acide (25 2-amino-3- [4-(4-hydroxy-3-iodo-phénoxy 3,5- diiodo-phényl]propanoique et au numéro CAS : 55-06-1. La T3 est utilisée dans différentes spécialités pharmaceutiques : des comprimés contenant de la T3 sont notamment commercialisés pour le traitement d'urgence ou de courte durée de ITiypothyroïdie ou dans le traitement d'appoint d'autres affections de la thyroïdie. La société Goldshieid commercialise un lyophilisât de T3 sodique de Dextran 110 et d'hydroxyde de sodium qui doit être reconstitué dans de l'eau PPI, juste avant administration par voie parentérale.
La T3 a également été préconisée pour son intérêt dans des milieux de culture comme le milieu de Green permettant de cultiver en série des cellules épithéliales. De telles applications sont notamment décrites dans :
> Safer JD, Crawford TM, Fraser LM, Hoa M, Ray S, Chen TC, Persons K, Holick MF. Thyroid hormone action on skin: diverging effects of topical versus intraperitoneal administration : Thyroid, 2003 Feb; 13 (2) : 159-65).
Simon M, Green H. Enzymatic cross-linking of involucrin and other proteins by keratinocyte particulates in vitro. Cell. 1985 Mar;40(3):677-83.
> Formanek M et al In J Oral Maxillofac. In vitro approaches for determining mechanisms of toxicity and carcinogenicity by asbestos in the gastrointestinal and respiratory tracts. Urg. 1996, Apr 25 (2) : 157-160
> Mossman BT. Environ Health Perspect. 1983 Nov;53: 155-61. Review.
La composition du milieu Green est donnée dans la TABLEAU 1 ci- après : TABLEAU 1
Figure imgf000003_0001
Dans le cadre d'études internes, la demanderesse a tout d'abord développée une solution prête à l'emploi de T3 sodique dans une solution saline tamponnée avec des phosphates (PBS de l'anglais « phosphate buffered saline »). Une telle solution ne s'est pas montrée satisfaisante, en termes de stabilité.
Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir une solution aqueuse de T3 sous la forme d'un sel de sodium, qui soit prête à l'emploi pour supplémenter un milieu de culture donné. Une telle solution se doit d'être stable, dans des conditions de température, notamment appartenant à la gamme 2-8°C, voire même à température ambiante (25°C), afin de faciliter son stockage et son utilisation.
La composition proposée dans le cadre de l'invention se doit également de pouvoir être préparée facilement et à un coût de revient non prohibitif. Le but de la composition selon l'invention étant de supplémenter des milieux de culture plus simples, déjà connus ou qui seront développés dans le futur, ses composants autres que la T3 sodique doivent être compatibles avec un milieu de culture cellulaire, et en particulier un milieu de culture de cellules épithéliales.
La présente invention a pour objet une composition pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales, comprenant de la Triiodo-L- thyronine (T3) sodique, un hydroxyde alcalin, un alcool en Ci-C3 et de l'eau.
A titre d'exemple d'hydroxyde alcalin, on peut citer les hydroxydes de lithium, sodium, potassium, rubidium, césium ou francium. L'hydroxyde alcalin a pour fonction d'aider à la solubilisation de la T3 sodique dans une solution aqueuse. Selon un mode de réalisation particulier, l'hydroxyde alcalin est de l'hydroxyde de sodium. De façon avantageuse, le rapport (m/m) T3 sodique/hydroxyde de sodium dans la composition appartient à la gamme allant de 0,17/100 à 3,40/100, et est de préférence égal à 0,34/100.
A titre d'exemples d'alcool en Ci-C3 (c'est-à-dire comprenant de 1 à 3 atomes de carbone), on peut citer le méthanol, l'éthanol, le /7-propanol ou /so-propanol. La fonction de l'alcool est de stabiliser la solution obtenue, en combinaison avec l'hydroxyde alcalin. Selon un mode de réalisation particulier pouvant être combiné aux précédents, l'alcool est le méthanol. De façon avantageuse, le rapport (m/v) T3 sodique/méthanol appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est de préférence égal à 0,272/100.
La composition selon l'invention se présente sous la forme d'une solution aqueuse. De façon avantageuse, le rapport (m/v) T3 sodique/eau appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est de préférence égal à 0,272/100.
Compte tenu de son application, la composition selon l'invention est stérile et apyrogène. Pour obtenir une composition stérile, l'ensemble des composants utilisés peuvent être stériles et/ou une étape de filtration stérilisante en système clos pourra être mise en uvre. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que précédemment définie pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales.
L'invention a également pour objet un procédé de culture de cellules épithéliales, dans lequel on ajoute, à un milieu de culture initial, une composition telle que précédemment définie, puis on cultive des cellules épithéliales, dans le milieu de culture modifié obtenu. La composition selon l'invention est, par exemple, ajoutée en quantité telle pour avoir dans le milieu de culture modifié obtenu, une concentration en T3 sodique appartenant à la gamme allant de 0,68 pg/L à 27,2 \sgfl, de préférence, pour avoir une concentration égale à 1,36 pg/L
Le milieu de culture initial peut être tout milieu de culture utilisé pour la culture de cellules épithéliales. A titre d'exemple, on peut citer un milieu qui après avoir été supplémenté avec la composition selon l'invention correspond sensiblement au milieu Green. De tels milieux comprennent, en général :
- au moins un oligo ou polysaccharide, par exemple choisi parmi glucose, fructose, galactose, mannose
- au moins un sel minéral, par exemple choisi parmi sels de sodium, potassium, calcium, magnésium, fer, zinc, cobalt, cuivre
- au moins un acide aminé naturel,
- au moins une vitamine et/ou un agent antioxydant, par exemple choisi parmi la biotine, le pantothénate de calcium, le chlorure de choline, l'acide folique, l'inositol, la nicotinamide, la pyridoxine, la riboflavine, la thiamine et la vitamine B12,
- éventuellement au moins un facteur de croissance, par exemple choisi parmi l'EGF (facteur de croissance épidermique de l'anglais « Epidermal Growth Factor ») et l'adénine
- éventuellement un ou plusieurs antibiotiques, antifongiques ou agents a nti bactériens.
La composition selon l'invention pourra être utilisée pour supplémenter des milieux de culture de cellules épithéliales. Cette composition est adaptée à la culture en série des kératinocytes, comme des cellules épidermiques humaines, des keratinocytes de tératomes. La culture en série de cellules épithéliales pourra notamment être réalisée pour produire des colonies et éventuellement un épithélium squameux stratifié. Le procédé selon l'invention permet, notamment, de produire des cellules épidermiques qui peuvent être utilisées dans le traitement des brûlures ou encore pour tester les effets sur la peau d'actifs pharmaceutiques, dermatologiques ou cosmétiques.
Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. Les Figures 1 et 2 étudient la stabilité de différentes compositions au cours du temps.
Deux solutions diluées de T3 sodique prêtes à l'emploi ont été préparées et testées pour évaluer la stabilité de la T3 sodique comme suit :
1. Fabrication d'une solution concentrée de T3 sodique dans un flacon verre brun, à l'abri de la lumière :
Composition qualitative et quantitative
T3 sodique 68 mg
NaOH 0,02M 7,5 ml
Eau ppi quantité suffisante pour 500 ml
C = 200 μΜ soit 136 mg/L
Lors de la fabrication, la verrerie est protégée de la lumière. Dans un bêcher en verre contenant 68 mg de T3 sodique, 7,5 ml d'une solution de NaOH 0,02M sont ajoutés. La poudre de T3 sodique est dissoute par sonication puis transférée dans une fiole jaugée de 0,5 L. Le bêcher est rincé plusieurs fois à l'eau pour préparation injectable (ppi) puis l'eau de rinçage est transférée dans la fiole complétée jusqu'au trait de la jauge avec de l'eau ppi.
2. A partir de la solution concentrée aqueuse précédente (0,2 m ), on réalise une solution diluée (solution finale) dans le PBS (Phosphate Buffered Saline) et dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (préparée avec 800 mg de NaOH dans 1000 ml d'eau ppi et 1000 ml de méthanol ),: La formule de fabrication de la solution diluée de T3 dans le PBS est donnée ci-dessous.
Formule de fabrication de la solution diluée de T3 sodiaue dans le PBS: 10 mL de la solution concentrée (concentration T3 sodique :136 mg/L)
+ 990 mL PBS
C = 2 μΜ soit 1,36 mg/L
La formule de fabrication de la solution diluée de T3 dans la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium est donnée ci-dessous.
Formule de fabrication de la solution diluée de T3 sodiaue dans la solution méthanolique de NaQH:
10 mL de la solution concentrée aqueuse (concentration T3 sodique :136 mg/L)
+ 495 mL Solution NaOH 0,2 mM:
+ 495 mL méthanol
C = 2.10"6 mol/L = 1,36 mg/L
3. Etude de stabilité des solutions diluées
• 10 flacons de chaque dilution ont été conservés à +4°C pour dosage à Jour 0, Jour 7, Jour 14, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois; 6 mois; 9 mois; 12 mois
• 9 flacons de chaque dilution ont été conservés à -25°C pour dosage à Jour 7, Jour 14, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois; 6 mois; 9 mois; 12 mois.
4. Dosage de la T3 (High-performance liquid chromatography-UV)
Paramètres utilisés pour l'HPLC :
• Colonne : Atlantis dcl8 (3 μιτι, 2,1x150 mm)
• Température du four : 40°C
· Volume injecté : 20 μί • Eluant : tampon phosphate 100 mM et acétonitrile (70/30 ; v/v) pH=5,6.
• Diluant : utilisé pour la gamme et les dilutions des échantillons : Solution méthanolique d'hydroxyde de sodium
800 mg de NaOH R
1000 ml d'eau R
1000 ml de méthanol R
• Débit : 1,5 ou 2 mL/min
Longueur d'onde de détection UV : 226 nm
Gamme d'étalonnage :
La gamme d'étalonnage est réalisée dans la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium R : les concentrations allant de 0 mg/L à 5 mg/L. Chaque flacon de la solution concentrée est utilisé pour deux dosages (à +4°C dans le PBS et dans la solution méthanolique de NaOH ensuite à -25°C dans le PBS et dans la solution méthanolique de NaOH):
Jour 0: 2 dosages
Jour 7: 4 dosages
Jour 14: 4 dosages
1 mois: 4 dosages
2 mois: 4 dosages
3 mois: 4 dosages
4 mois: 4 dosages
6 mois: 4 dosages
9 mois: 4 dosages
12 mois: 4 dosages
Pour doser la T3 dans la solution concentrée aqueuse, des dilutions au l/100ème dans la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium puis dans le PBS sont effectuées au moment du dosage pour chaque solution, la gamme d'étalonnage allant de 0 mg/L à 5 mg/L On obtient ainsi une solution méthanolique aqueuse à 1,36 mg/L et une solution avec le PBS à 1,36 mg/L. • Chaque flacon de la solution diluée est utilisé pour un dosage :
Jour 0: 2 dosages
Jour 7: 4 dosages
Jour 14: 4 dosages
1 mois: 4 dosages
2 mois: 4 dosages
3 mois: 4 dosages
4 mois: 4 dosages
6 mois: 4 dosages
9 mois: 4 dosages
12 mois: 4 dosages
Aucune dilution n'est nécessaire pour la solution diluée : la concentration attendue est de 1,36 mg/L.
Les résultats sont présentés sur les Figures 1 et 2. La Figure 1 présente l'étude de la variation de la concentration de solutions aqueuses concentrées de T3 (concentration initiale :136 mg.l 1) au cours du temps de stockage. Les solutions ont été conservées soit (i) à 4°C puis diluées au moment du dosage au l/100eme dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (·) ou dans une solution de PBS (O), soit (ii) à -25°C puis diluées au l/100eme au moment du dosage dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (■) ou dans une solution de PBS (□).
La Figure 2 présente l'étude de la variation de la concentration de solutions diluées de T3 (concentration initiale :1,36 mg.l"1) au cours du temps de stockage. Les solutions de T3 ont été conservées soit (i) à 4°C (· : solvant méthanol/hydroxyde de sodium) et (O : solvant : PBS), soit (ii) à - 25°C (■ : solvant méthanol/hydroxyde de sodium) et (□ : solvant : PBS).
L'étude de stabilité réalisée pendant un an (ou deux ans dans le cas des solutions diluées à + 4°C) de la solution méthanolique de NaOH conforme à l'invention, versus le PBS, a montré que la solution selon l'invention est plus stable. 5. Supplémentation d'un milieu de culture
Composition du milieu de culture modifié de cellules épithéliales (ECCM)
Figure imgf000010_0001
La culture de cellules épithéliales a été réalisée avec succès dans ce milieu et aucun signe de toxicité de la composition selon l'invention in vitro n'a été mis en évidence.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Composition pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales comprenant de la Triiodo-L-thyronine(T3) sodique, un hydroxyde alcalin, un alcool en C1-C3 et de l'eau.
2 - Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'hydroxyde alcalin est de l'hydroxyde de sodium.
3 - Composition selon la revendication 2 précédentes caractérisée en ce que le rapport (m/m) T3 sodique/hydroxyde de sodium appartient à la gamme allant de 0,17/100 à 3,40/100, et est, de préférence, égal à 0,34/100.
4 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'alcool en C1-C3 est le méthanol.
5 - Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que le rapport (m/v) T3 sodique/méthanol appartient à la gamme allant de 0,068/100 à
5,440/100, et est, de préférence, égal à 0,272/100.
6 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le rapport (m/v) T3 sodique /eau appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est, de préférence, égal à 0,272/100.
7 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est stérile et apyrogène.
8 - Utilisation d'une composition selon l'une des revendications précédentes pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales.
9 - Procédé de culture de cellules épithéliales dans lequel on ajoute, à un milieu de culture initial, une composition selon l'une des revendications 1 à 7, puis on cultive des cellules épithéliales dans le milieu de culture modifié obtenu.
10 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la composition selon l'une des revendications 1 à 7 est ajoutée en quantité telle pour avoir dans le milieu de culture modifié obtenu, une concentration en T3 sodique appartenant à la gamme allant de 0,68 pg/L à 27,20 pg/L, et de préférence une concentration égale à 1,36 pg/L. 11 - Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que le milieu de culture initiai comprend au moins un sucre, au moins un sel inorganique, au moins un acide aminé naturel et au moins une vitamine et/ou un agent anti-oxydant.
12 - Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce que le milieu de culture initial comprend au moins un facteur de croissance.
13 - Procédé selon l'une des revendications 9 à 12 caractérisé en ce que le milieu de culture initial comprend au moins un agent choisi parmi les agents antibiotiques, antifongiques et antibactériens.
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