WO2012160798A1 - グルタチオンアルキルエステル同位体置換体および反応性代謝物の検出方法 - Google Patents

グルタチオンアルキルエステル同位体置換体および反応性代謝物の検出方法 Download PDF

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Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
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    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a novel isotope-labeled compound and a method for detecting a reactive metabolite using the isotope-labeled compound as a trapping reagent. .
  • IDT idiosyncratic drug toxicity
  • a trapping test using a trapping reagent is known as a method for simply examining whether a drug candidate compound generates a reactive metabolite by metabolism. Reactive metabolites are not very easy to detect because they are very unstable.
  • a drug candidate compound is incubated in the presence of a metabolic enzyme, and a trapping reagent is allowed to coexist with the drug candidate compound when testing whether a reactive metabolite is generated.
  • the trapping reagent binds to a reactive metabolite generated by the action of a drug candidate compound by a metabolic enzyme to form an adduct.
  • This trapping reagent-reactive metabolite adduct is relatively stable and can be detected using a mass spectrometer or the like.
  • Patent Document 1 describes glutathione as a trapping reagent.
  • Non-patent Document 2 Another example reported as a compound that can be used as a trapping reagent is glutathione ethyl ester. It has been reported that when glutathione ethyl ester is used as a trapping reagent, a trapping reagent-reactive metabolite adduct can be detected with higher sensitivity in analysis using a mass spectrometer than when glutathione is used as a trapping reagent. (Non-patent document 2).
  • the trapping reagent-reaction is detected when the trapping reagent-reactive metabolite adduct is detected by a liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS) or the like.
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometer
  • an isotope-labeled compound that can be used as a trapping reagent includes glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N (Patent Document 2, Non-Patent Documents 3 and 4).
  • Glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N is an isotope ( 13 C) in which two carbon atoms ( 12 C) of a glycine moiety of glutathione and an isotope ( 15 N) in one nitrogen atom ( 14 N) It is a labeled isotope-labeled compound.
  • Glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N has a mass number 3 higher than that of normal glutathione.
  • Glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N is mixed with normal glutathione at a constant ratio (such as 1: 1) and used as a trapping reagent to give glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N-reactive metabolite adduct And glutathione-reactive metabolite adducts are formed at a certain ratio. When this is detected by LC-MS or the like, an isotope double line having a mass number different by 3 appears. This facilitates discrimination of the target peak, thereby reducing the possibility of being determined as false positive.
  • the present invention uses a novel isotope-labeled compound that can be used as a trapping reagent for clarifying a compound that generates a reactive metabolite among drug candidate compounds, and uses the isotope-labeled compound as a trapping reagent
  • An object is to provide a method for detecting a reactive metabolite.
  • an isotope substituent of a glutathione alkyl ester represented by the general formula (1) (hereinafter simply represented by the general formula (1)). (Also referred to as a substituted product).
  • the substitution product represented by the general formula (1) can be easily prepared from inexpensive glutathione.
  • R 1 represents a linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms in which at least one of contained carbon atom, oxygen atom and hydrogen atom is isotope-labeled, or contained And a cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms in which at least one of carbon atoms, oxygen atoms, and hydrogen atoms is isotopically labeled.
  • the substituent represented by the general formula (1) has an isotope in the structure.
  • LC-MS analysis is performed upon detection of reactive metabolites.
  • the present inventor adopts a trapping reagent-reactive metabolite adduct by adopting a measurement method capable of detecting a wide range of continuous ions such as a full scan method or a neutral loss scan method in the LC-MS analysis. It has also been found that ion peaks derived from can be detected more easily. Thereby, detection with few false negatives is possible. That is, the present invention includes the following inventions.
  • a glutathione alkyl ester isotope-substituted product represented by the general formula (1).
  • R 1 represents a linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms in which at least one of contained carbon atom, oxygen atom and hydrogen atom is isotope-labeled, or contained And a cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms in which at least one of carbon atoms, oxygen atoms, and hydrogen atoms is isotopically labeled.
  • the glutathione alkyl ester isotope according to [1], in which at least one of a carbon atom, an oxygen atom, and a hydrogen atom represented by the general formula (2) and provided with an asterisk * is isotopically labeled. Body replacement.
  • D represents deuterium ( 2 H).
  • a glutathione alkyl ester isotope substitute-reactive metabolite adduct and a detection auxiliary compound-reactive metabolite by incubating a reaction sample containing a detection auxiliary compound and a drug candidate compound in the presence of a drug metabolizing enzyme Give rise to adducts, Detection of mass peaks of the resulting glutathione alkyl ester isotope substitute-reactive metabolite adduct and detection auxiliary
  • the substitution product represented by the general formula (1) can be prepared at a very low cost compared to the isotope-labeled compound used as a conventional trapping reagent. Therefore, it is possible to realize screening of a huge amount of drug candidate compounds, which has been difficult in the past.
  • the first spectrum contains the peak of adduct C. It is the 1st spectrum in retention time 3.92 minutes when ticlopidine is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct D. It is the 1st spectrum in retention time 4.02 minutes at the time of using ticlopidine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct E. It is the 1st spectrum in retention time 5.56 minutes at the time of using diclofenac as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct F. It is the 1st spectrum in retention time 5.78 minutes at the time of using diclofenac as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct G. It is a final chromatogram when the target compound is not used. (Control) It is a final chromatogram when acetaminophen is used as a target compound. It is a final chromatogram when omeprazole is used as a target compound. It is a final chromatogram when imipramine is used as a target compound. It is a final chromatogram when thienyl acid is used as a target compound. It is a final chromatogram when quercetin is used as a target compound. It is the 1st spectrum in retention time 2.33 minutes when acetaminophen is used as an object compound. The first spectrum contains the adduct H peak.
  • the first spectrum contains the peak of adduct I. It is a 1st spectrum in the retention time of 3.99 minutes at the time of using omeprazole as a target compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct J. It is the 1st spectrum in retention time 4.27 minutes at the time of using imipramine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct K. It is the 1st spectrum in retention time 4.33 minutes at the time of using imipramine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct L.
  • the first spectrum contains the peak of adduct M. It is the 1st spectrum in retention time 3.76 minutes when quercetin is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct N. It is the 1st spectrum in retention time 4.01 minutes when quercetin is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct O. It is the 1st spectrum in retention time 4.52 minutes when quercetin is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct P. In a comparative example, it is a final chromatogram when not using a target compound.
  • a comparative example it is a final chromatogram when omeprazole is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when clozapine is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when diclofenac is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when imipramine is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when thienyl acid is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when acetaminophen is used as a target compound.
  • a comparative example it is a final chromatogram when quercetin is used as a target compound.
  • it is the 1st spectrum in retention time 3.59 minutes when omeprazole is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct Q.
  • it is the 1st spectrum in retention time 4.22 minutes at the time of using clozapine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct R.
  • it is the 1st spectrum in retention time 4.33 minutes at the time of using clozapine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct S.
  • the first spectrum in a comparative example, it is the 1st spectrum in retention time 5.49 minutes when diclofenac is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct T.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct U.
  • the first spectrum contains the peak of adduct V.
  • it is the 1st spectrum in retention time 3.87 minutes when quercetin is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct W.
  • a comparative example it is the 1st spectrum in retention time 4.35 minutes at the time of using quercetin as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct X.
  • a comparative example it is a final chromatogram when omeprazole is used as a target compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct Q2.
  • it is a final chromatogram when not using a target compound. (Control)
  • a comparative example it is a final chromatogram when omeprazole is used as a target compound.
  • a final chromatogram when clozapine is used as a target compound In a comparative example, it is a final chromatogram when imipramine is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when thienyl acid is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when acetaminophen is used as a target compound. In a comparative example, it is a final chromatogram when quercetin is used as a target compound. In a comparative example, it is the 1st spectrum in retention time 2.74 minutes when omeprazole is used as an object compound. The first spectrum contains the peak of adduct Y.
  • a comparative example it is the 1st spectrum in retention time 2.88 minutes at the time of using omeprazole as an object compound.
  • the first spectrum contains the adduct Z peak.
  • it is the 1st spectrum in retention time 3.22 minutes at the time of using clozapine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct AA.
  • it is the 1st spectrum in retention time 3.37 minutes at the time of using clozapine as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct AB.
  • it is the 1st spectrum in retention time 3.50 minutes when clozapine is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct AC. In a comparative example, it is the 1st spectrum in retention time 3.65 minutes when imipramine is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct AD. In a comparative example, it is the 1st spectrum in retention time 4.85 minutes at the time of using thienyl acid as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct AE. In a comparative example, it is the 1st spectrum in retention time 2.82 minutes when quercetin is used as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of adduct AF. In a comparative example, it is the 1st spectrum in retention time 3.16 minutes at the time of using quercetin as an object compound.
  • the first spectrum contains the peak of the adduct AG.
  • a reactive metabolite is detected using a substituent represented by the general formula (1) which is an isotope-labeled compound.
  • R 1 represents a linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms in which at least one of contained carbon atom, oxygen atom and hydrogen atom is isotope-labeled, or contained And a cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms in which at least one of carbon atoms, oxygen atoms, and hydrogen atoms is isotopically labeled.
  • the definition of the functional group of the general formula may be omitted with reference to the definition already described.
  • “isotopically labeled compound” refers to a compound in which at least one of the contained atoms is substituted with an isotope.
  • the isotopes described in this specification refer to atoms having the same atomic number but having a mass number different from the mass number (number of neutrons) which is predominant in nature.
  • the “pharmaceutical drug candidate compound” described in the present specification is a compound that is subjected to various tests for the purpose of drug development, and is not limited to a compound that forms a reactive metabolite.
  • the “reactive metabolite” described in the present specification refers to an electrophilic or radical compound produced by changing the chemical structure of a substrate compound by being metabolized by a drug metabolizing enzyme described later. means.
  • electrophilic compounds have electrophilic functional groups such as epoxide groups, quinone groups, unsaturated carbonyl groups, and imine groups in their molecules.
  • reactive metabolites radical compounds have highly reactive free radicals in their molecules.
  • drug-metabolizing enzyme refers to any enzyme derived from human or animal tissue that can metabolize a drug candidate compound.
  • the drug metabolizing enzyme used for detecting reactive metabolites is preferably derived from human or rat tissue, more preferably derived from human tissue. Of these, it is preferably derived from liver tissue.
  • examples of drug-metabolizing enzymes include cytochrome P450 enzyme, peroxidase, cyclooxygenase, and myeloperoxidase.
  • the drug metabolizing enzyme may be used in an isolated form, or may be used in a form contained in a cell or a cell fraction, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • a drug metabolizing enzyme in which a drug metabolizing enzyme is contained in a cell or cell fraction refers to a cell or cell fraction derived from human or animal tissue containing the above-mentioned “drug metabolizing enzyme”.
  • examples of cells or cell fractions containing drug-metabolizing enzymes include cells, S9 fractions, microsomal fractions and soluble fractions, and preferably cells, S9 fractions or microsomal fractions are used. Particularly preferably, hepatocytes, liver S9 or liver microsomes are used.
  • Drug metabolizing enzymes may be used for reactive metabolite detection in combination with coenzymes.
  • the coenzymes include oxidized coenzymes such as oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP +), reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), reduced There are reduced coenzymes such as type nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH).
  • NADPH type nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NADPH or NADP + is used in combination with a drug metabolizing enzyme.
  • hepatocytes, liver S9 or liver microsomes are used for reactive metabolite detection in combination with a coenzyme NADPH or NADP +.
  • a combination of liver microsomes and NADPH is more preferred.
  • the “liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS)” described in the present specification is a system in which liquid chromatography and a mass spectrometer are connected.
  • LC liquid chromatography
  • MS mass spectrometer
  • the ions are detected. Since the compound-derived ion (parent ion) contained in the LC solution is generated, the presence or absence of the compound can be confirmed by detecting the mass-to-charge ratio (m / z) of the ion. At this time, an appropriate scanning method can be selected.
  • the mass-to-charge ratio (m / z) is a value obtained by mass spectrometry, which is a value obtained by ionizing molecules in a measurement sample and dividing the mass (m) of the obtained ions by the number of charges (z). is there. From the value of the mass-to-charge ratio (m / z) of ions and the value of the number of charges (z), the mass of the molecule can be determined.
  • the “MS / MS measurement” described in the present specification means that a parent ion arbitrarily selected from the parent ions obtained by the MS measurement is further collisionally activated with an inert gas, and the generated ions ( This is a method for detecting (child ions).
  • the mass-to-charge ratio (m / z) of the child ions can be measured by an appropriate scanning method.
  • the inert gas include helium and argon.
  • Examples of the liquid chromatography (LC) include high performance liquid chromatography (HPLC), Ultra Performance LC (UPLC), and Ultra Fast LC (UFLC), among which UPLC is preferable.
  • MS mass spectrometer
  • FT-ICR Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer
  • Examples of ionization methods that can be used in a mass spectrometer include electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure ionization (APCI), and among these, ESI is preferred.
  • Examples of the scan method used in the mass spectrometer (MS) include a full scan method, a neutral loss scan method, an SRM method, and a product ion scan method. Of these, it is preferable to use the neutral loss scan method or the full scan method because the number of cases in which false negative is determined can be reduced.
  • the full scan method is a method in which a parent ion is continuously detected in a range of an arbitrarily selectable mass to charge ratio (m / z). Since the present method measures the entire mass range (a mass range having a certain width that can be arbitrarily selected), the trapping reagent-reactive metabolite adduct produced can be detected without exception.
  • the neutral loss scan method is a method in which a parent ion is continuously detected in a range of an arbitrarily selectable mass-to-charge ratio (m / z). Among them, a neutral molecule having a specific mass number is desorbed. This is a method for detecting parent ions.
  • the SRM method detects both ions (parent ion and child ion) that generate a child ion having a specific mass-to-charge ratio (m / z) from a parent ion having a specific mass-to-charge ratio (m / z). Is the method.
  • This method is a measurement method that predicts the structure of a trapping reagent-reactive metabolite adduct generated from a drug candidate compound and a trapping reagent, and narrows the measurement range based on its mass. Since it is a method for detecting a specific range, the influence of impurities is small, and highly sensitive measurement is possible.
  • the product ion scan method detects child ions continuously from a parent ion having a specific mass-to-charge ratio (m / z) within an arbitrarily selectable mass-to-charge ratio (m / z) range. It is a method to do. When an unpredictable reactive metabolite is generated, detection failure may occur when using the SRM method, but exhaustive detection is possible by using the full scan method. In the development of pharmaceuticals, it is useful to be able to capture unpredictable reactive metabolites, which is important information that leads to the design of the next drug candidate compound.
  • the “chromatogram” described in the present specification represents the MS measurement result of the LC eluate with the retention time on the horizontal axis and the relative abundance on the vertical axis.
  • the “mass spectrum” described in the present specification is an MS measurement result at an arbitrary time, with the mass-to-charge ratio (m / z) on the horizontal axis and the relative abundance on the vertical axis. .
  • “at least one of a carbon atom, an oxygen atom, and a hydrogen atom is isotopically labeled” means that at least one of a carbon atom, an oxygen atom, and a hydrogen atom is bonded to each atom. It is substituted with an isotope.
  • Examples of carbon atom isotopes include 13 C and 14 C. 18 O is mentioned as an isotope of an oxygen atom.
  • Examples of the isotope of a hydrogen atom include 2 H (also expressed as D) or 3 H.
  • linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms examples include, for example, methoxy group, ethoxy group, 1-methylethoxy group, 1,1-dimethylethoxy group, 1-propoxy group, 2-propoxy group Group, 2-methyl-2-propoxy group, 1-ethylpropoxy group, 2-ethylpropoxy group, 1-butoxy group, 2,3-dimethyl-2-butane-2-oxy group, 2,3-dimethylbutane- Examples include 2-oxy group, 1-pentoxy group, 1-hexyloxy group, 1-heptyloxy group, and 1-octyloxy group. *
  • Examples of the “cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms” include a cyclopropoxy group, a cyclopropylmethoxy group, a cyclobutoxy group, a cyclopentoxy group, a cyclohexyloxy group, a cycloheptyloxy group, and a cyclooctyloxy group. Can be mentioned.
  • the “detection auxiliary compound” described in the present specification is a compound used by mixing with a reaction sample in detection of a reactive metabolite.
  • the detection auxiliary compound is a compound in which at least one of the atoms of the glutathione alkyl ester isotope substituent of the present embodiment used as a trapping reagent is replaced with an atom having a different mass number (number of neutrons). Therefore, the detection auxiliary compound has the same skeleton as the glutathione alkyl ester isotope substituent of the present embodiment used as a trapping reagent, and the same functional group (atom) is bonded to the same position in the same configuration. Yes.
  • the glutathione alkyl ester isotope substitute of this embodiment used as a trapping reagent and the detection auxiliary compound differ in at least one mass number (the number of neutrons) of the atoms, and as a result, the two compounds have the same mass number. The only difference is that the molecular weights differ between the two.
  • the molecular weight of the detection auxiliary compound can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the particular ease in mass spectrometry and the like.
  • the detection auxiliary compound binds to a reactive metabolite, so it can be said to be one of the trapping reagents in the detection of the reactive metabolite.
  • a substitutional unlabeled compound represented by the general formula (1) mixed in the reaction sample can be used.
  • the term “unlabeled compound” means a compound in which all atoms that are isotopes of glutathione alkyl ester isotope substituents are substituted with atoms that are non-isotopes. That is, when the glutathione alkyl ester isotope substituent has the carbon atom isotope 13 C, the unlabeled compound refers to a compound in which the 13 C is substituted with 12 C.
  • the unlabeled compound refers to a compound in which the 18 O is substituted with 16 O.
  • the glutathione alkyl ester isotope substitute has the hydrogen atom isotope 2 H
  • the unlabeled compound means a compound having a structure in which the 2 H is substituted with 1 H.
  • a “trapping reagent” is used for the detection of reactive metabolites and is a covalent complex that is covalently bound to a reactive metabolite and is more stable than the reactive metabolite (trapping reagent).
  • Reagents referred to as reactive metabolite adducts.
  • detection auxiliary compound-reactive metabolite means a covalent complex of a detection auxiliary compound and a reactive metabolite.
  • glutathione alkyl ester isotope substitute-reactive metabolite adduct refers to the glutathione alkyl ester isotope substitute, which is the isotope-labeled compound of the present embodiment, and reactive metabolism. It means a covalent complex with a product.
  • a double line that appears when a non-labeled compound of a glutathione alkyl ester isotope substitute is used as a detection auxiliary compound is referred to as an “isotope double line”.
  • “False positive” described in the present specification means that the reactive metabolite is not produced in the incubation of the drug candidate compound and the drug metabolizing enzyme, although the reactive metabolite is not actually generated. It means to show the result (positive) that it was generated. False positives are undesirable because they lead to the removal of safe compounds that do not produce reactive metabolites from drug candidates.
  • “False negative” described in this specification means that a reactive metabolite is produced in the incubation of a drug candidate compound and a drug metabolizing enzyme, even though a reactive metabolite is actually produced. This means that the result is negative (negative). False negatives are not preferred because compounds that produce reactive metabolites will be mistaken for safe compounds.
  • Step 1 In vitro incubation and sample preparation
  • the substitute represented by the general formula (1), the detection auxiliary compound, and the drug candidate compound are mixed to obtain a reaction sample.
  • the ratio of the substitution product represented by the general formula (1) and the detection auxiliary compound is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art. However, the molar ratio is preferably 2: 1 to 1: 2. 1 is more preferable.
  • the reaction sample is incubated in the presence of a drug metabolizing enzyme. Incubation conditions are not particularly limited.
  • the concentration of the drug metabolizing enzyme, the concentration of the drug candidate compound, and the like can be appropriately set according to the sensitivity required by those skilled in the art in the LC-MS analysis of step 2 described later.
  • the drug-metabolizing enzyme may be contained in the microsome fraction or the like and mixed in the reaction sample. Therefore, the concentration of the drug-metabolizing enzyme can be adjusted based on the protein concentration in the reaction sample.
  • the reaction time and reaction temperature can also be set as appropriate according to the sensitivity required in the LC-MS analysis, and can be set at 37 ° C. for 60 minutes, for example.
  • the drug metabolizing enzyme may be present in the reaction sample in a form contained in cells or cell fractions.
  • a coenzyme such as NADPH may be added to this reaction sample. After incubation, analysis is performed using LC-MS.
  • the substitution product represented by the general formula (1) of the present embodiment may generate a disulfide bond at the thiol group portion to generate a dimer.
  • DTT dithiothreitol
  • This can suppress the appearance of a large dimer peak in the chromatogram of the LC-MS analysis, so that the peak of the trapping reagent-reactive metabolite adduct can be easily identified.
  • reducing agents such as 2-mercaptoethanol and tris (2-carboxyethyl) phosphine can be used.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an example of LC-MS analysis.
  • the four types of instrument data charts shown in FIG. 1 are referred to as a first chromatogram, a first spectrum, a second spectrum, and a final chromatogram in order from the top.
  • the first chromatogram is a chart showing the results of mass spectrometry by sequentially introducing the LC eluate from which the compounds have been separated by liquid chromatography (LC) into a mass spectrometer (MS).
  • the horizontal axis represents the retention time (hereinafter simply referred to as retention time) of the compound corresponding to each peak in the liquid chromatography column, and the vertical axis represents the ion corresponding to each peak.
  • the first spectrum is a chart showing a mass analysis result at a specific time point on the first chromatogram.
  • the horizontal axis represents the mass-to-charge ratio (m / z)
  • the vertical axis represents the relative abundance of ions corresponding to each peak.
  • the second spectrum is a chart showing the results of MS / MS measurement.
  • the horizontal axis represents the mass-to-charge ratio (m / z), and the vertical axis represents the relative abundance of ions corresponding to each peak.
  • the final chromatogram is a chart that displays, as a chromatogram, only the peak in which the neutral loss of the mass designated in the MS / MS measurement is detected among the peaks represented in the first chromatogram.
  • the horizontal axis represents the retention time
  • the vertical axis represents the relative abundance of ions corresponding to each peak.
  • the sample prepared in Step 1 (product obtained by incubation) was separated by liquid chromatography (LC), and the obtained LC eluate was separated into a mass spectrometer (MS). Introduce. After ionization in MS, mass spectrometry is performed to obtain a first chromatogram and a first spectrum (Act101 and Act102).
  • the measurement range of mass spectrometry is good enough to detect the mass-to-charge ratio (m / z) of the adduct generated from the target compound and the trapping reagent.
  • the mass-to-charge ratio (m / z) range is selected as 350-1200. Full scan measurement under the above conditions is preferred.
  • MS / MS measurement may be performed (Act103).
  • MS / MS measurement is performed to confirm the MS / MS fragment, whereby the possibility of being determined as false positive can be further reduced.
  • a preferred energy setting range is a range of Normalized Collision Energy 5-50.
  • the MS / MS measurement performed after collision activation it is a peak identified as a detection auxiliary doublet, and is a mixture ratio of the substitution product represented by the general formula (1) and the detection auxiliary compound (preferably By measuring only ions corresponding to peaks having an intensity ratio of 2: 1 to 1: 2, more preferably 1: 1), detection with fewer false positives can be performed more efficiently. Therefore, it is preferable to use the isotopic data dependent scan mode.
  • the “isotopic data dependent scan mode” is a mode in which MS / MS measurement is performed only when ions having a mass difference and intensity ratio specified in advance are detected during full scan measurement.
  • a 129 Da neutral loss filter may be applied to the obtained data set (Act104).
  • the “neutral loss filter” is a data analysis method in which only data having a specified mass of neutral loss is displayed as a chromatogram with respect to acquired data. By using a neutral loss filter, a final chromatogram is obtained (see FIG. 1). By obtaining the final chromatogram, the unique peak of the generated trapping reagent-reactive metabolite adduct can be more easily identified.
  • R 1 is a linear or branched alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms in which at least one of a carbon atom, an oxygen atom and a hydrogen atom is labeled, or a carbon atom or an oxygen atom And a cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms in which at least one of hydrogen atoms is isotopically labeled.
  • the glutathione alkyl ester isotope substitute represented by the general formula (1) can be produced, for example, by deriving from the glutathione represented by the general formula (4). For example, it can be produced by reacting glutathione represented by the formula (4) with an alcohol represented by the general formula (5) containing an isotope in the presence of a catalyst.
  • R 1 is as described above, and a hydrogen atom marked with two stars ** may be substituted with an isotope.
  • glutathione represented by formula (4) is reacted with isotope-labeled ethanol represented by general formula (6) in the presence of a catalyst. Thereby, the glutathione alkyl ester isotope substituted body represented by the general formula (2) can be obtained.
  • Examples of the alcohol represented by the general formula (5) containing an isotope include methanol-d3, methanol-d4, ethanol-1,1-d2, ethanol-2,2,2-d3, ethanol-d5, ethanol- d6, propanol-1,1-d2, propanol-2,2-d2, propanol-3,3,3-d3, propanol-d7, propanol-d8, isopropanol-1,1,1,3,3,3- and d6, isopropanol-d8, butanol-d10, 1-pentanol-d11, cyclohexanol-d12, and octanol-d18.
  • Ethanol-1,1-d2, ethanol-2,2,2-d3, ethanol-d5 or ethanol-d6 is preferred, and ethanol-d6 is more preferred.
  • the catalyst is used in an amount of 0.5 to 10 equivalents relative to glutathione, preferably 1 to 2 equivalents, more preferably 1.6 equivalents.
  • the reaction temperature may range from 0 ° C. to the boiling point of the alcohol containing the isotope, preferably 20 ° C. to 40 ° C., more preferably 25 ° C. to 35 ° C.
  • the substituted product represented by the general formula (1) can use inexpensive glutathione as a synthetic raw material.
  • glutathione by making commercially available glutathione react with alcohol containing isotopes such as commercially available heavy ethanol (alcohol represented by the general formula (5)), it can be easily prepared in a single step with a high yield. Is possible.
  • alcohol represented by the general formula (5) alcohol represented by the general formula (5)
  • glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N which is the prior art, is commercially available, it is a very expensive reagent and is difficult to obtain in large quantities.
  • a very expensive glycine isotope substitute is used as a raw material, and five steps are required to obtain glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N. Therefore, it is extremely difficult to obtain glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N at low cost (Non-patent Document 4) (Scheme 2).
  • R 1 is as described above, and a hydrogen atom marked with two asterisks ** may be substituted with an isotope.
  • the trapping reagent reacts with the reactive metabolite in the incubation of the reaction sample containing the trapping reagent (substituent represented by the general formula (1), auxiliary detection compound) and drug candidate compound.
  • an ion peak derived from a trapping reagent-reactive metabolite adduct appears as a multiple line that is, for example, a detection auxiliary double line.
  • a multiple line such as a detection auxiliary double line is easier to identify than a single peak. Therefore, it is possible to detect fewer false positives in the detection of reactive metabolites.
  • the characteristic peak of the glutathione alkyl ester isotope substituent-reactive metabolite adduct according to the present embodiment has a wide range of continuous peaks in LC-MS analysis, such as full scan method or neutral loss scan method. By applying a measurement method capable of detecting ions, it becomes easier to detect. Therefore, it is possible to detect with fewer cases judged as false negatives.
  • D represents deuterium ( 2 H).
  • Glutathione reduced form 503.8 mg, 1.64 mmol was suspended in ethanol-d6 (99.5 ATOM% D) (5 mL), and concentrated sulfuric acid (0.137 mL, 2.56 mmol) was added to the reaction solution. It was. The reaction solution was stirred at room temperature for 30 minutes and then allowed to stand at room temperature for 21 hours. Triethylamine (0.714 mL) was added to the reaction solution for neutralization, and ethanol (10 mL) and diisopropyl ether (10 mL) were added to crystallize the product. After standing at 4 ° C. for 16 hours, the crystals were collected by filtration. By drying under reduced pressure at 35 ° C.
  • Steps common to Examples 2 to 9 Steps 1 and 2
  • Step 1 In vitro incubation and sample preparation for analysis
  • a substrate compound that produces a reactive metabolite in a detection test of a reactive metabolite is referred to as a target compound.
  • Target compound (10 ⁇ mol / L, 10 nmol), a mixture (1 mmol / L, 1 ⁇ mol) of glutathione ethyl ester (GSHEE) and glutathione ethyl ester-d5 (GSHEEE-d5) mixed at a molar ratio of 1: 1, rat liver
  • GHEE glutathione ethyl ester
  • GSHEEE-d5 glutathione ethyl ester-d5
  • An incubation mixture (reaction sample) containing microsomes (1 mg / mL, 1 mg), potassium phosphate buffer (pH 7.4) (100 mmol / L, 100 ⁇ mol), magnesium chloride (5 mmol / L, 5 ⁇ mol), and purified water was added. Pre-incubation at 37 ° C for 5 minutes.
  • NADPH 20 mmol / L, 20 ⁇ mol
  • the final incubation volume was 1 mL.
  • a sample containing no target compound was used as a control.
  • a 50 mmol / L dithiothreitol aqueous solution 100 ⁇ L, 5 ⁇ mol was added to the incubation mixture and centrifuged at 10,000 g for 5 minutes.
  • the centrifugal supernatant was subjected to a solid phase extraction column (OASIS HLB 1 cc, 30 mg) previously washed with 1 mL of methanol and activated with 1 mL of purified water. After washing with 1 mL of water and 1 mL of 5% methanol water, the reaction product was eluted with 1 mL of methanol. The solvent was distilled off under a nitrogen stream, and the residue was dissolved in 150 ⁇ L of acetonitrile: water (2: 8) to obtain a sample for analysis.
  • LC-MS analysis (Step 2-1) Liquid chromatography AQCUITY UPLC system (WATERS) was used for separation by chromatography.
  • a portion (10 ⁇ L) of the prepared analytical sample was injected onto an AQCUITY UPLC BEH C18 column (2.1 ⁇ 100 mm, 1.7 ⁇ m). This chromatographic separation was performed at a mobile phase flow rate of 0.5 mL / min under the gradient conditions shown in the table below.
  • Step 2-2 Mass Spectrometry
  • the LC column eluate obtained in Step 2-1 was introduced into an LTQ XL ion trap mass spectrometer. Ionization was performed in the positive mode of ESI (mode for detecting positively charged ions). The measurement conditions used are shown below (measurement conditions A).
  • Measurement condition A ISplay Voltage: 5.0kV Capillary Temp: 350 °C Sheath Gas Flow Rate: 41 Aux Gas Flow Rate: 18 Sweep Gas Flow Rate: 6.5
  • a full scan measurement with a mass-to-charge ratio (m / z) range of 400-800 was performed to obtain a first chromatogram and a first spectrum shown in FIGS. 6 to 12 and FIGS.
  • an isotope double line (double line having an intensity ratio of 1: 1 with a difference of 5 amu) appears in the mass analysis of Step 2-2, and the second mass analysis (MS / MS measurement) Represents a peak where a neutral loss of 129 Da was detected.
  • the peaks appearing in the final chromatogram the peaks excluding the peaks appearing in the control (FIG. 2 or FIG. 13) are considered to be peaks of the trapping reagent-reactive metabolite adduct.
  • the above measurement was performed using clozapine, ticlopidine, diclofenac, acetaminophen, omeprazole, imipramine, thienylic acid and quercetin as the target compounds. These eight compounds are known to generate reactive metabolites, and glutathione ethyl ester-d5, which is one of the isotope-labeled compounds according to this embodiment, detects reactive metabolites. Selected to prove whether it can be used.
  • FIG. 3 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 4.81 minutes, 4.89 minutes and 5.02 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 2).
  • An adduct corresponding to a retention time of 4.81 minutes is referred to as an adduct A
  • an adduct corresponding to a retention time of 4.89 minutes is referred to as an adduct B
  • an adduct corresponding to a retention time of 5.02 minutes is referred to as an adduct C.
  • FIG. 4 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 3.92 minutes and 4.03 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 2).
  • the adduct corresponding to the retention time of 3.92 minutes is referred to as adduct D
  • the adduct corresponding to the retention time of 4.03 minutes is referred to as adduct E.
  • adduct D characteristic isotope double lines having mass to charge ratios (m / z) of 631 and 636 Da were confirmed.
  • FIG. 9 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • FIG. 5 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 5.54 and 5.78 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 2).
  • An adduct corresponding to a retention time of 5.54 minutes is referred to as an adduct F
  • an adduct corresponding to a retention time of 5.78 minutes is referred to as an adduct G.
  • characteristic isotope double lines having a mass-to-charge ratio (m / z) of 611 and 616 Da were confirmed.
  • m / z mass-to-charge ratio
  • FIG. 14 shows the final chromatogram obtained for the target compound. Several components show positive responses, but a sample-specific peak is observed at a retention time of 2.33 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 13). An adduct corresponding to a retention time of 2.33 minutes is referred to as adduct H. As shown in FIG. 19, for the adduct H, characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 485 and 490 Da were confirmed. From the above results, acetaminophen was determined to be positive even when glutathione ethyl ester-d5 was used as a trapping reagent, and it was confirmed that one kind of reactive metabolite was produced.
  • m / z mass-to-charge ratios
  • FIG. 15 shows the final chromatogram obtained for the object compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 3.92 minutes and 3.99 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 13).
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.92 minutes is referred to as adduct I
  • adduct J an adduct corresponding to a retention time of 3.99 minutes.
  • FIG. 16 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 4.27 and 4.33 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 13).
  • the adduct corresponding to the retention time of 4.27 minutes is referred to as adduct K
  • the adduct corresponding to the retention time of 4.33 minutes is referred to as adduct L.
  • characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 602 and 607 Da were confirmed.
  • FIG. 1 mass-to-charge ratios
  • FIG. 17 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but a sample-specific peak is observed at a retention time of 5.74 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 13).
  • An adduct corresponding to a retention time of 5.74 minutes is referred to as adduct M.
  • characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 664 and 669 Da were confirmed. From the above results, it was confirmed that thienyl acid was positive even when glutathione ethyl ester-d5 was used as a trapping reagent, and it was confirmed that one kind of reactive metabolite was produced.
  • FIG. 18 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 3.76 minutes, 4.01 minutes, and 4.52 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 13).
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.76 minutes is referred to as an adduct N
  • an adduct corresponding to a retention time of 4.01 minutes is referred to as an adduct O
  • an adduct corresponding to a retention time of 4.52 minutes is referred to as an adduct P.
  • Examples 2 to 9 by using glutathione ethyl ester-d5 isomer represented by the formula (3) as a trapping reagent, positive results were correctly obtained for all eight compounds (no false negatives).
  • the peaks of glutathione alkyl ester isotope substituent-reactive metabolite adduct and detection auxiliary compound-reactive metabolite adduct appear as characteristic isotope double lines. Yes. Therefore, the peaks of glutathione alkyl ester isotope substituent-reactive metabolite adduct and detection auxiliary compound-reactive metabolite adduct can be easily distinguished from other peaks. Therefore, the possibility of being determined as a false positive can be reduced. .
  • the above measurement was performed using 7 compounds of clozapine, diclofenac, acetaminophen, omeprazole, imipramine, thienylic acid and quercetin as the target compounds. These seven compounds are known to generate reactive metabolites, and are compared with the case where the isotope-labeled compound of this embodiment is used as a trapping reagent in the detection of reactive metabolites. Selected. The final spectrum obtained for the control is shown in FIG.
  • FIG. 29 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but a sample-specific peak is observed at a retention time of 3.59 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 28).
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.59 minutes is referred to as adduct Q.
  • adduct Q As shown in FIG. 36, for adduct Q, a peak was confirmed at a mass-to-charge ratio (m / z) of 679 Da.
  • FIG. 30 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 4.22 and 4.33 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 28).
  • An adduct corresponding to a retention time of 4.22 minutes is referred to as an adduct R
  • an adduct corresponding to a retention time of 4.33 minutes is referred to as an adduct S.
  • a peak was confirmed at a mass-to-charge ratio (m / z) of 646 Da.
  • a peak was confirmed for the adduct S at a mass to charge ratio (m / z) of 660 Da.
  • FIG. 31 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but a sample-specific peak is observed at a retention time of 5.49 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 28).
  • An adduct corresponding to a retention time of 5.49 minutes is referred to as adduct T.
  • a peak was confirmed at a mass-to-charge ratio (m / z) of 645 Da.
  • FIG. 32 shows the final chromatogram obtained for the target compound, but no sample-specific peak was observed.
  • FIG. 33 shows the final chromatogram obtained for the target compound, but no sample-specific peak was observed.
  • FIG. 34 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but a sample-specific peak is observed at a retention time of 2.18 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 28).
  • An adduct corresponding to a retention time of 2.18 minutes is referred to as an adduct U.
  • a peak was confirmed at a mass-to-charge ratio (m / z) of 485 Da.
  • FIG. 35 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 3.63 minutes, 3.87 minutes and 4.35 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 28).
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.63 minutes is referred to as an adduct V
  • an adduct corresponding to a retention time of 3.87 minutes is referred to as an adduct W
  • an adduct corresponding to a retention time of 4.35 minutes is referred to as an adduct X.
  • Table 2 shows the results of Examples and Comparative Examples 1 to 7.
  • the case where the isotope-labeled compound of the present embodiment is used as a trapping reagent is compared with the case where only glutathione ethyl ester is used as a trapping reagent.
  • About 5 compounds among 7 compounds it turns out that the number of the reactive metabolite which was able to be confirmed in an Example is larger than a comparative example (omeprazole, a clozapine, a diclofenac, an imipramine, a thienyl acid).
  • a comparative example omeprazole, a clozapine, a diclofenac, an imipramine, a thienyl acid.
  • imipramine and thienylic acid no reactive metabolite was detected in the comparative example, and a negative result was obtained.
  • both imipramine and thienylic acid are known to be compounds that generate reactive metabolites, and the result is “false negative”.
  • the isotope-labeled compound of the present embodiment is less likely to be false negative than a compound conventionally used as a trapping reagent and is superior in use as a trapping reagent. .
  • Target compound Omeprazole Omeprazole was used as the target compound. Except for performing MS / MS measurement in data dependent scan mode (Dynamic Exclusion ON mode) in which MS / MS measurement is performed in descending order of ion intensity in the MS / MS measurement corresponding to (Step 2-3). Measurements were performed in the same manner as in Comparative Example 1. In the data dependent scan mode (Dynamic Exclusion ON mode), the most intense ion of the peaks in the first spectrum is measured three times by MS / MS, then the ion is excluded, and then the strongest ion is removed. While performing 3 times of MS / MS measurement, the process is repeated in order of intensity. The measurement conditions used are as follows (measurement condition D). (Measurement condition D) Repeat Count: 3 Repeat Duration: 6.00 Exclusion List Size: 100 Exclusion Duration: 6.00
  • FIG. 44 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but a sample-specific peak is observed at a retention time of 3.61 minutes compared to the control chromatogram (FIG. 28).
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.61 minutes is referred to as adduct Q2.
  • adduct Q2 As shown in FIG. 45, for adduct Q2, a strong peak was confirmed at a mass-to-charge ratio (m / z) of 679 Da.
  • Example 6 among the peaks of the first spectrum, only the isotope double line can be activated by collision, MS / MS measurement can be performed, and detection can be performed with high sensitivity.
  • Comparative Example 8 the intensity is high. Activation is performed sequentially from ions. From this, it is considered that when the peak intensity of the trapping reagent-reactive metabolite adduct is low in the peak of the first spectrum, the number of collision activations is reduced and the sensitivity is lowered.
  • the isotope-labeled compound of this embodiment is less likely to be false negative and is more excellent in use as a trapping reagent.
  • Step 1 In vitro incubation and sample preparation for analysis Mixture of target compound (10 ⁇ mol / L, 10 nmol), glutathione (GSH) and glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N in a molar ratio of 1: 0.7 (1 mmol / L, 1 ⁇ mol), rat liver microsomes (1 mg / mL, 1 mg), potassium phosphate buffer (pH 7.4) (100 mmol / L, 100 ⁇ mol), magnesium chloride (5 mmol / L, 5 ⁇ mol), and purified water
  • the incubation mixture (reaction sample) containing was preincubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • NADPH 20 mmol / L, 20 ⁇ mol
  • Step 2 LC-MS analysis (Step 2-1) Liquid chromatography AQCUITY UPLC system (WATERS) was used for separation by chromatography. A portion (10 ⁇ L) of the prepared analytical sample was injected onto an AQCUITY UPLC BEH C18 column (2.1 ⁇ 100 mm, 1.7 ⁇ m). This chromatographic separation was performed under the gradient conditions shown in Table 3 at a mobile phase flow rate of 0.5 mL / min.
  • WATERS Liquid chromatography AQCUITY UPLC system
  • Step 2-2 Mass Spectrometry
  • the LC column eluate obtained in Step 2-1 was introduced into an LTQ XL ion trap mass spectrometer. Ionization was performed in the positive mode of ESI (mode for detecting positively charged ions). The measurement conditions used are shown below (measurement conditions A).
  • Measurement condition A ISplay Voltage: 5.0kV Capillary Temp: 350 °C Sheath Gas Flow Rate: 41 Aux Gas Flow Rate: 18 Sweep Gas Flow Rate: 6.5
  • FIGS. 53 to 61 A full scan measurement with a mass-to-charge ratio (m / z) range of 450-900 was performed to obtain a first chromatogram and a first spectrum shown in FIGS. 53 to 61 (omeprazole: FIGS. 53 to 54, clozapine: FIG. 55-57, imipramine: FIG. 58, thienylic acid: FIG. 59, quercetin: FIGS. 60-61).
  • Step 2-3 MS / MS Measurement Isotopic Data Dependency that MS / MS measurement is performed by collision activation of only “ion having an intensity ratio of 1: 0.7 with a difference of 3 amu” giving an isotope doublet A second spectrum was obtained by measurement in the dent scan mode.
  • the measurement conditions used are shown below (measurement condition E).
  • Measurement condition E Normalized Collision Energy: 35 Mass Difference: 3.00 Expected ratio: 0.7 Match tolerance: 0.15
  • Step 2-4 Neutral loss filter
  • the final chromatogram shown in FIGS. 46 to 52 was obtained by applying a 129 Da neutral loss filter to the data set obtained by the MS / MS measurement in step 2-3 (control).
  • an isotope double line (double line having an intensity ratio of 1: 0.7 with a difference of 3 amu) appears in the mass analysis of step 2-2, and the second mass analysis (MS / MS (Measurement) represents the peak at which a neutral loss of 129 Da was detected.
  • MS / MS Measurement
  • the peaks appearing in the final chromatogram the peaks excluding the peak appearing in FIG. 46 (control) are considered to be peaks of the trapping reagent-reactive metabolite adduct.
  • FIG. 47 shows the final chromatogram obtained for the object compound.
  • Several components show positive responses, but retention times 1.13 minutes, 1.23 minutes, 1.95 minutes, 2.21 minutes and 2.1 compared to the control chromatogram (FIG. 46).
  • Sample specific peaks are observed at 74 minutes, 2.88 minutes and 3.61 minutes. Among these, the peaks at 1.13 minutes, 1.23 minutes, 1.95 minutes, 2.21 minutes and 3.61 minutes are false positive peaks, and the peaks at 2.74 minutes and 2.88 minutes are trapped.
  • An adduct corresponding to a retention time of 2.74 minutes is referred to as adduct Y.
  • adduct Z An adduct corresponding to a retention time of 2.88 minutes is referred to as adduct Z.
  • adduct Z characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 621 and 624 Da were confirmed.
  • adduct Z characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 651 and 654 Da were confirmed.
  • FIG. 48 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 3.22, 3.37, and 3.50 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 46).
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.22 minutes is referred to as an adduct AA
  • an adduct corresponding to a retention time of 3.36 minutes is referred to as an adduct AB
  • an adduct corresponding to a retention time of 3.50 minutes is referred to as an adduct AC.
  • characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 650 and 653 Da were confirmed for adduct AA.
  • characteristic isotope double lines having a mass-to-charge ratio (m / z) of 618 and 621 Da were confirmed.
  • a characteristic isotope doublet having mass-to-charge ratios (m / z) of 632 and 635 Da was confirmed for the adduct AC.
  • FIG. 49 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses but are sample specific at retention times 3.65 min, 4.61 min, 4.78 min and 4.93 min compared to the control chromatogram ( Figure 46).
  • the peak is observed.
  • the peaks at 4.61 minutes, 4.78 minutes and 4.93 minutes are false positive peaks
  • the peak at 3.65 minutes is the peak of the trapping reagent-reactive metabolite adduct.
  • An adduct corresponding to a retention time of 3.65 minutes is referred to as adduct AD.
  • a characteristic isotope double line having mass-to-charge ratios (m / z) of 574 and 577 Da was confirmed for adduct AD.
  • FIG. 50 shows the final chromatogram obtained for the target compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times of 4.85 and 8.71 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 46).
  • the peak at 8.71 minutes is a false positive peak
  • the peak at 4.85 minutes is a peak of a trapping reagent-reactive metabolite adduct.
  • An adduct corresponding to a retention time of 4.85 minutes is referred to as an adduct AE.
  • characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 636 and 639 Da were confirmed for adduct AE.
  • FIG. 51 shows the final chromatogram obtained for the target compound, but no peak of the trapping reagent-reactive metabolite adduct was observed.
  • FIG. 52 shows the final chromatogram obtained for the object compound.
  • Several components show positive responses, but sample-specific peaks are observed at retention times 2.82 minutes and 3.16 minutes compared to the control chromatogram ( Figure 46).
  • An adduct corresponding to a retention time of 2.82 minutes is referred to as an adduct AF
  • an adduct corresponding to a retention time of 3.16 minutes is referred to as an adduct AG.
  • FIG. 60 for the adduct AF, characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 608 and 611 Da were confirmed.
  • FIG. 61 for the adduct AG, characteristic isotope double lines having mass-to-charge ratios (m / z) of 608 and 611 Da were confirmed.
  • Table 4 shows the results of Examples and Comparative Examples.
  • the case where the isotope-labeled compound of this embodiment is used as a trapping reagent and the case where glutathione glycine- 13 C 2 , 15 N is used are compared.
  • About 3 compounds among 6 compounds it turns out that the number of the reactive metabolites which were able to be confirmed in an Example is larger than a comparative example (imipramine, acetaminophen, quercetin).
  • acetaminophen no reactive metabolite was detected in the comparative example, and a negative result was obtained.
  • acetaminophen is also known to be a compound that generates a reactive metabolite, and the result is “false negative”.
  • the isotope-labeled compound of this embodiment was used. In some cases, false positive peaks that were not confirmed were observed. From the above, the isotope-labeled compound of the present embodiment is less likely to be judged as false negative and false positive than the compound conventionally used as a trapping reagent, and is more excellent in use as a trapping reagent. I understand that.
  • isotope-labeled compound that can be used as a trapping reagent, useful for selecting drug candidate compounds that produce reactive metabolites.
  • a detection method and a detection reagent capable of detecting a reactive metabolite more accurately with fewer false negatives as well as false positives.

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Abstract

　【課題】 反応性代謝物を生ずる医薬品候補化合物を選定するために有用な、トラッピング試薬として使用できる新規の同位体標識化合物を提供する。　【解決手段】 一般式（１）で表されるグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。 式（１）中、Ｒ１は炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８である直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、または炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８であるシクロアルコキシ基を示す。　

Description

グルタチオンアルキルエステル同位体置換体および反応性代謝物の検出方法
　本発明は、新規の同位体標識化合物および、当該同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた反応性代謝物の検出方法に関するものである。　　　　
　医薬品の承認が得られるまでには、通常、動物実験や臨床試験においてその有効性、安全性が十分に確認されている。しかし、時として上市後、それまでは見られなかった重篤な肝毒性やアレルギー反応などの、死亡例を伴う薬物毒性を発現することがある。この薬物毒性は、特異体質性薬物毒性（ＩＤＴ）と総称される。現在、ＩＤＴの発現は予測が困難であるが、その発現には、薬物の代謝により生成する「反応性代謝物」が関与していると考えられている（非特許文献１）。従って、医薬品開発においては、反応性代謝物を生じない医薬品候補化合物の合成計画を立案することが重要である。
　医薬品候補化合物が、代謝により反応性代謝物を生ずるのかどうか、簡便に調べる方法として、トラッピング試薬を用いたトラッピング試験が知られている。反応性代謝物は、非常に不安定であるため検出が容易ではない。トラッピング試験においては、医薬品候補化合物を代謝酵素の存在下においてインキュベートし、反応性代謝物が生じるか否かを検定する際に、トラッピング試薬を医薬品候補化合物と共存させる。トラッピング試薬は、医薬品候補化合物の代謝酵素による作用により生じた反応性代謝物と結合し、付加体を形成する。このトラッピング試薬－反応性代謝物付加体は比較的安定であり、質量分析機器等を用いて、検出が可能である。特許文献１にはトラッピング試薬としてグルタチオンが記載されている。
　トラッピング試薬として使用可能な化合物として報告されているその他の例として、グルタチオンエチルエステルがあげられる（非特許文献２）。グルタチオンエチルエステルをトラッピング試薬として用いた場合は、グルタチオンをトラッピング試薬として用いた場合に比べ、質量分析機器を用いた分析において感度よくトラッピング試薬－反応性代謝物付加体を検出できることが報告されている（非特許文献２）。
　一方、上記のグルタチオンまたはグルタチオンエチルエステルをトラッピング試薬として用いた場合、トラッピング試薬－反応性代謝物付加体を液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）等で検出する際に、トラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークの特定が難しいという事情が存在する。そのため、トラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークではないピークをトラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークであると見誤り、その結果、誤って反応性代謝物が生成されたと判定することもある（偽陽性）。
　偽陽性を防ぐための手段の一つとして、同位体標識化合物をトラッピング試薬として使用することが提案されている。例えば、トラッピング試薬として使用可能である同位体標識化合物として、グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎが挙げられる（特許文献２、非特許文献３，４）。グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎは、グルタチオンの有するグリシン部分の２つの炭素原子（１２Ｃ）が同位体（１３Ｃ）で、１つの窒素原子（１4Ｎ）が同位体（１５Ｎ）で標識された同位体標識化合物である。グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎは、通常のグルタチオンに比べ、質量数が３だけ大きい。グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎを通常のグルタチオンと一定の比率（１：１など）で混合し、トラッピング試薬として用いることにより、グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ－反応性代謝物付加体と、グルタチオン－反応性代謝物付加体がそれぞれ一定の比率で生成する。これをＬＣ－ＭＳ等で検出すると、質量数が３だけ異なる同位体二重線が現れる。これにより、目的のピークの判別が容易となるので、偽陽性と判定される可能性を小さくできる。
特開２００２－２３８５９７号公報 国際公開第２００６／０１２１５４号パンフレット
Ｆｏｌｉａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．２００６, １２７，４７３～４８０. Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，２００４，３６，１０５－１１６． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，７６（２３），６８３５－６８４７． Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００５，１９（２３），３４８２－３４９２．
　しかしながら、これまでに報告されているトラッピング試薬として使用可能な同位体標識化合物は極めて高価であり、膨大な数の医薬品候補化合物のスクリーニングには適さない。
　本発明は、医薬品候補化合物のうち反応性代謝物が生成される化合物を明らかにするためのトラッピング試薬として使用可能である新規の同位体標識化合物、および当該同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた反応性代謝物の検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、一般式（１）で表される、グルタチオンアルキルエステルの同位体置換体（以下、単に一般式（１）で表される置換体とも称す）を見出した。一般式（１）で表される置換体は、安価なグルタチオンから容易に調製することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
　式（１）中、Ｒ１は、含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８である直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、または含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が３～８であるシクロアルコキシ基を示す。
　一般式（１）で表される置換体は、同位体を構造中に有している。よって、一般式（１）で表される置換体をトラッピング試薬として反応性代謝物の検出に用いた場合には、従来の同位体トラッピング試薬（グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎなど）と同様の原理で、ＬＣ－ＭＳ分析等においてトラッピング試薬－反応性代謝物付加体に由来するイオンピークの特定が容易となる。従って、偽陽性の少ない検出が可能となる。
　反応性代謝物の検出の際に、例えばＬＣ－ＭＳ分析を行う。本発明者は、当該ＬＣ－ＭＳ分析においてフルスキャン法またはニュートラルロススキャン法などの、広い範囲の連続的なイオンが検出可能な測定方法を採用することにより、トラッピング試薬－反応性代謝物付加体に由来するイオンピークをより検出しやすくなることも見出した。これにより、偽陰性の少ない検出が可能である。
　すなわち、本発明は、以下の発明を含有する。
〔１〕一般式（１）で表されるグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
　式（１）中、Ｒ１は、含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８である直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、または含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が３～８であるシクロアルコキシ基を示す。
〔２〕一般式（２）で表され、星印*の付与されている炭素原子、酸素原子、および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている〔１〕に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
 
〔３〕一般式（３）で表される〔１〕に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
式（３）中、Ｄは重水素（２Ｈ）を表す。
〔４〕〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置体を用いて、反応性代謝物を検出する方法。
〔５〕〔４〕に記載の方法において、
　〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体、当該グルタチオンアルキルエステル同位体置換体が有する原子のうち少なくとも１つが質量数が異なる原子に置き換えられている化合物である検出補助化合物、および医薬品候補化合物を含む反応試料を薬物代謝酵素の存在下においてインキュベートすることにより、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体および検出補助化合物－反応性代謝物付加体を生じさせ、
  液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いた分析において、生じたグルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体および検出補助化合物－反応性代謝物付加体の質量ピークを検出することを含む、反応性代謝物を検出する方法。〔６〕〔５〕に記載の方法において、
　前記反応試料中における〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の前記グルタチオンアルキルエステル同位体置換体と前記検出補助化合物のモル比率が２：１から１：２である、反応性代謝物を検出する方法。
〔７〕〔５〕または〔６〕に記載の方法において、
　インキュベートすることにより得られた生成物にジチオスレイトール、２－メルカプトエタノール、またはトリス（２－カルボキシエチル）フォスフィンを添加した後、前記液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いた分析を行うことをさらに含む、反応性代謝物を検出する方法。
〔８〕〔５〕から〔７〕のうちいずれか１つに記載の方法において、
　前記液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いた分析において、ニュートラルロススキャン法またはフルスキャン法を行う、反応性代謝物を検出する方法。
〔９〕〔５〕から〔８〕のうちいずれか１つに記載の方法において、
　前記検出補助化合物が、前記反応試料中に含まれる〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体の非標識化合物である、反応性代謝物を検出する方法。
〔１０〕グルタチオンに、重水素化アルコールを反応させることにより、〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の前記グルタチオンアルキルエステル同位体置換体を製造する方法。
〔１１〕〔１０〕に記載の方法において、
　前記重水素化アルコールがエタノール-ｄ６であるグルタチオンアルキルエステル置換体を製造する方法。
　新規のトラッピング試薬として使用できる同位体標識化合物として、一般式（１）で表される置換体を見出した。一般式（１）で表される置換体は、従来のトラッピング試薬として用いられていた同位体標識化合物と比べ、非常に安価に調製が可能である。よって、従来困難であった、膨大な量の医薬品候補化合物のスクリーニングが実現可能となる。
反応性代謝物のＬＣ－ＭＳ分析の処理フローの一例を示す図である。 対象化合物を使用しなかった場合の、最終クロマトグラムである。（コントロール） 対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、チクロピジンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、ジクロフェナクを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間４．８１分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ａのピークを含有する。 対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間４．８９分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｂのピークを含有する。 対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間５．０２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｃのピークを含有する。 対象化合物として、チクロピジンを使用した場合の、保持時間３．９２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｄのピークを含有する。 対象化合物として、チクロピジンを使用した場合の、保持時間４．０２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｅのピークを含有する。 対象化合物として、ジクロフェナクを使用した場合の、保持時間５．５６分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｆのピークを含有する。 対象化合物として、ジクロフェナクを使用した場合の、保持時間５．７８分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｇのピークを含有する。 対象化合物を使用しなかった場合の、最終クロマトグラムである。（コントロール） 対象化合物として、アセトアミノフェンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、イミプラミンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、チエニル酸を使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 対象化合物として、アセトアミノフェンを使用した場合の、保持時間２．３３分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｈのピークを含有する。 対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、保持時間３．９２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｉのピークを含有する。 対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、保持時間３．９９分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｊのピークを含有する。 対象化合物として、イミプラミンを使用した場合の、保持時間４．２７分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｋのピークを含有する。 対象化合物として、イミプラミンを使用した場合の、保持時間４．３３分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｌのピークを含有する。 対象化合物として、チエニル酸を使用した場合の、保持時間５．７４分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｍのピークを含有する。 対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間３．７６分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｎのピークを含有する。 対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間４．０１分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｏのピークを含有する。 対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間４．５２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｐのピークを含有する。 比較例において、対象化合物を使用しなかった場合の、最終クロマトグラムである。（コントロール） 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、ジクロフェナクを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、イミプラミンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、チエニル酸を使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、アセトアミノフェンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、保持時間３．５９分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｑのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間４．２２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｒのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間４．３３分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｓのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、ジクロフェナクを使用した場合の、保持時間５．４９分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｔのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、アセトアミノフェンを使用した場合の、保持時間２．１８分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｕのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間３．６３分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｖのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間３．８７分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｗのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間４．３５分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｘのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、保持時間３．６１分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｑ２のピークを含有する。 比較例において、対象化合物を使用しなかった場合の、最終クロマトグラムである。（コントロール） 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、イミプラミンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、チエニル酸を使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、アセトアミノフェンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、最終クロマトグラムである。 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、保持時間２．７４分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｙのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、オメプラゾールを使用した場合の、保持時間２．８８分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体Ｚのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間３．２２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＡのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間３．３７分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＢのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、クロザピンを使用した場合の、保持時間３．５０分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＣのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、イミプラミンを使用した場合の、保持時間３．６５分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＤのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、チエニル酸を使用した場合の、保持時間４．８５分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＥのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間２．８２分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＦのピークを含有する。 比較例において、対象化合物として、ケルセチンを使用した場合の、保持時間３．１６分における、第１スペクトルである。当該第１スペクトルは、付加体ＡＧのピークを含有する。
　以下、本発明の１つの実施形態について、詳細に説明する。
　本実施形態においては、同位体標識化合物である一般式（１）で表される置換体を用いて反応性代謝物の検出を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
　式（１）中、Ｒ１は、含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８である直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、または含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が３～８であるシクロアルコキシ基を示す。
　なお、以下において、一般式が有する官能基の定義については、すでに記載した定義を引用してその説明を省略することがある。
　本明細書に記載されている「同位体標識化合物」とは、含まれる原子のうち少なくとも１つが、同位体によって置換されている化合物をいう。また、本明細書に記載されている同位体とは、同じ原子番号を有するが、天然において優勢である質量数（中性子の数）とは異なる質量数を有する原子をいう。
　本明細書中に記載されている「医薬品候補化合物」とは、医薬品の開発を目的として各種の試験に供される化合物であり、反応性代謝物を形成するものに限られない。
　本明細書に記載されている「反応性代謝物」とは、後述する薬物代謝酵素により代謝を受けることにより基質化合物の化学構造が変化して生成される、求電子性またはラジカル性の化合物を意味する。反応性代謝物のうち求電子性化合物は、その分子内に、エポキシド基、キノン基、不飽和カルボニル基、イミン基などの求電子的な官能基を有する。反応性代謝物のうちラジカル性の化合物は、その分子内に反応性の高いフリーラジカルを有する。
　本明細書中に記載されている「薬物代謝酵素」とは、医薬品候補化合物を代謝することができるヒトまたは動物組織由来のすべての酵素をいう。反応性代謝物検出のために使用される薬物代謝酵素は、ヒトまたはラット組織由来であることが好ましく、ヒト組織由来であることがより好ましい。そのうち、肝臓組織由来であることが好ましい。例えば、薬物代謝酵素として、チトクロームＰ４５０酵素、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどが挙げられる。
　薬物代謝酵素は単離された態様で使用されてもよいほか、細胞もしくは細胞画分に含有されている態様で使用されてもよく、当業者が適宜設定できる。
　また、本明細書に記載されている、薬物代謝酵素が細胞もしくは細胞画分に含有されている態様とは、前記の「薬物代謝酵素」を含むヒトまたは動物組織由来の細胞もしくは細胞画分を意味する。薬物代謝酵素を含む細胞もしくは細胞画分の例として、細胞、Ｓ９画分、ミクロソーム画分、可溶性画分が挙げられ、好ましくは細胞、Ｓ９画分またはミクロソーム画分が使用される。特に好ましくは、肝細胞、肝Ｓ９または肝ミクロソームが使用される。
　薬物代謝酵素は、補酵素と組み合わせて反応性代謝物検出のために使用してもよい。補酵素には、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）などの酸化型補酵素と、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）などの還元型補酵素がある。好ましくは、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰ＋が薬物代謝酵素と組み合わされて使用される。
　好ましい態様としては、肝細胞、肝Ｓ９または肝ミクロソームが、補酵素であるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰ＋と組み合わせて反応性代謝物検出のために使用される。このうち、肝ミクロソームとＮＡＤＰＨの組み合わせがより好ましい。
　本明細書中に記載されている「液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）」とは、液体クロマトグラフィーと質量分析装置を連結したシステムである。本システムは、まず、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いて、測定対象試料に含有される複数の化合物の分離を行う。次に、得られたＬＣ溶出液を質量分析装置（ＭＳ）に順次導入し、イオン化させたのち、そのイオンを検出する。ＬＣ溶液中に含まれていた、化合物由来のイオン（親イオン）が生成するので、当該イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出することで、化合物の存在の有無が確認できる。この際、適切なスキャン法を選択することができる。
　質量電荷比（ｍ／ｚ）とは、質量分析により得られる値であり、測定試料中の分子をイオン化させ、得られてくるイオンの質量（ｍ）を電荷数（ｚ）で除した値である。イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）の値と電荷数（ｚ）の値より、分子の質量を求めることができる。
　本明細書中に記載されている「ＭＳ／ＭＳ測定」とは、ＭＳ測定により得られた親イオンのうち、任意に選択した親イオンをさらに不活性ガスにより衝突活性化させ、生じたイオン（子イオン）を検出する方法である。適切なスキャン法により当該子イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定することができる。不活性ガスとしてはヘリウムやアルゴンがあげられる。
　液体クロマトグラフィー（ＬＣ）には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、Ｕｌｔｒａ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ＬＣ（ＵＰＬＣ）、Ｕｌｔｒａ　Ｆａｓｔ　ＬＣ（ＵＦＬＣ）を挙げることができ、中でもＵＰＬＣが好ましい。
　質量分析装置（ＭＳ）としては、四重極質量分析計、イオントラップ質量分析装置、飛行時間型質量分析器、磁場型質量分析器、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器（ＦＴ－ＩＣＲ）があげられる。
　質量分析装置（ＭＳ）において、使用可能なイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）および大気圧イオン化法（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＡＰＣＩ）を挙げることができ、中でも、ＥＳＩが好ましい。
　質量分析装置（ＭＳ）において使用されるスキャン方法としては、フルスキャン法、ニュートラルロススキャン法、ＳＲＭ法またはプロダクトイオンスキャン法があげられる。このうち、偽陰性と判定される場合をより少なくできるので、ニュートラルロススキャン法またはフルスキャン法を用いることが好ましい。　
　フルスキャン法とは任意に選択可能な質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲において親イオンを連続的に検出する方法である。本方法は、全質量範囲（任意に選択可能である一定の幅を持つ質量範囲）を測定するため、生成するトラッピング試薬－反応性代謝物付加体をもれなく、検出することができる。
　ニュートラルロススキャン法とは、任意に選択可能な質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲において親イオンを連続的に検出する方法であるが、そのうち、特定の質量数の中性分子を脱離する親イオンを検出する方法である。
　ＳＲＭ法とは特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する親イオンから、特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する子イオンを生じさせる、両イオン（親イオン、子イオン）を検出する方法である。本方法は、医薬品候補化合物とトラッピング試薬から生成してくるトラッピング試薬－反応性代謝物付加体の構造を予測し、その質量を拠り所として、測定範囲を絞る測定方法である。特定範囲を検出する方法であるため、夾雑物の影響が少なく、高感度の測定が可能である。
　プロダクトイオンスキャン法とは特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する親イオンから生じる子イオンのうち、任意に選択可能な質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲において子イオンを連続的に検出する方法である。
　予測不可能な反応性代謝物が生成する場合、ＳＲＭ法を使用すると、検出もれが生じる可能性があるが、フルスキャン法を使用することにより、網羅的な検出が可能となる。医薬品の開発においては、予想できない反応性代謝物を補足できることは有用であり、次の医薬品候補化合物の設計に繋がる重要な情報となる。
　本明細書中に記載されている「クロマトグラム」とは、ＬＣ溶出液のＭＳ測定結果を、保持時間を横軸に、相対存在量を縦軸に表したものである。
　本明細書中に記載されている「マススペクトル」とは、任意の時間におけるＭＳ測定結果を、質量電荷比（ｍ／ｚ）を横軸に、相対存在量を縦軸に表したものである。
　本明細書中に記載されている「炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている」とは、炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが、各原子の同位体に置換されていることを意味する。
　炭素原子の同位体としては、１３Ｃまたは１４Ｃが挙げられる。酸素原子の同位体としては、１８Ｏが挙げられる。水素原子の同位体としては、２Ｈ（Ｄとも表される）または３Ｈが挙げられる。
　「炭素数が１～８である直鎖または分岐のアルコキシ基」としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、１－メチルエトキシ基、１，１－ジメチルエトキシ基、１－プロポキシ基、２－プロポキシ基、２－メチル－２－プロポキシ基、１－エチルプロポキシ基、２－エチルプロポキシ基、１－ブトキシ基、２，３－ジメチル－２－ブタン－２－オキシ基、２，３－ジメチルブタン－２－オキシ基、１－ペントキシ基、１－ヘキシルオキシ基、１－ヘプチロキシ基、１－オクチロキシ基を挙げることができる。　
　「炭素数が３～８であるシクロアルコキシ基」としては、例えば、シクロプロポキシ基、シクロプロピルメトキシ基、シクロブトキシ基、シクロペントキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘプチロキシ基、シクロオクチロキシ基を挙げることができる。
　本明細書中に記載されている「検出補助化合物」とは、反応性代謝物の検出において反応試料に混合されて使用される化合物である。検出補助化合物は、トラッピング試薬として使用される本実施形態のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体が有する原子のうち少なくとも１つが質量数（中性子の数）が異なる原子に置き換えられている化合物である。したがって、検出補助化合物は、トラッピング試薬として使用される本実施形態のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体と同一の骨格を有するとともに、同じ位置に同じ立体配置で同一の官能基（原子）が結合している。そして、トラッピング試薬として使用される本実施形態のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体と検出補助化合物とは、原子のうち少なくとも１つの質量数（中性子の数）が異なり、その結果、当該２つの化合物の間で分子量が異なるという点のみ相違する。　
　検出補助化合物の分子量は、質量分析等における特定の容易さなどを考慮して当業者が適宜設定することができる。
　検出補助化合物は、本実施形態のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体と同様、反応性代謝物と結合するため、反応性代謝物の検出におけるトラッピング試薬の１つということもできる。
　検出補助化合物として、例えば、反応試料に混合される一般式（１）で表される置換体の非標識化合物を用いることができる。なお、非標識化合物とは、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体が有する同位体である原子全てが非同位体である原子に置換されている化合物を意味する。
　すなわち、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体が炭素原子の同位体１３Ｃを有する場合は、その非標識化合物とは、当該１３Ｃが１２Ｃに置換されている化合物をいう。同様に、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体が酸素原子の同位体１８Ｏを有する場合は、その非標識化合物とは、当該１８Ｏが１６Ｏに置換されている化合物をいう。そして、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体が水素原子の同位体２Ｈを有する場合は、その非標識化合物とは、当該２Ｈが１Ｈに置換された構造を有する化合物を意味する。
　本明細書に記載されている「トラッピング試薬」とは、反応性代謝物の検出のために使用され、反応性代謝物と共有結合して反応性代謝物よりも安定な共有結合複合体（トラッピング試薬－反応性代謝物付加体と称す）を与える化合物をいう。
　本明細書中に記載されている「検出補助化合物－反応性代謝物」とは、検出補助化合物と、反応性代謝物との共有結合複合体を意味する。
　本明細書中に記載されている「グルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体」とは、本実施形態の同位体標識化合物であるグルタチオンアルキルエステル同位体置換体と、反応性代謝物との共有結合複合体を意味する。
　検出補助化合物－反応性代謝物付加体とグルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体の混合物についてＬＣ－ＭＳを用いた分析を行うと、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体と検出補助化合物の質量差分に応じた異なる質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する質量ピーク（例えば２本の質量ピーク、二重線）が検出される。本明細書において、当該二重線を、検出補助二重線と称する。また、検出補助二重線のうち、検出補助化合物としてグルタチオンアルキルエステル同位体置換体の非標識化合物を用いた場合に現れる二重線を、「同位体二重線」と称する。
　本明細書中に記載されている「偽陽性」とは、医薬品候補化合物と薬物代謝酵素とのインキュベートにおいて、実際には反応性代謝物が生成されていないにも係らず、反応性代謝物が生成されたとの結果（陽性）を示すことを意味する。偽陽性は、反応性代謝物を生成しない安全な化合物を医薬品の候補からはずすことに繋がるため、好ましくない。
　本明細書中に記載されている「偽陰性」とは、医薬品候補化合物と薬物代謝酵素とのインキュベートにおいて、実際には反応性代謝物が生成されたにも係らず、反応性代謝物が生成されていないとの結果（陰性）を示すことを意味する。偽陰性は、反応性代謝物を生成する化合物を安全な化合物と見誤ることになるので、好ましくない。
（反応性代謝物の検出の一例）
　反応性代謝物の検出の一例について説明する。
（工程１）インビトロ・インキュベーション及びサンプル調製
　一般式（１）で表される置換体、検出補助化合物、および医薬品候補化合物を混合し、反応試料とする。一般式（１）で表される置換体と検出補助化合物との割合は特に限定されず、当業者が適宜設定できるが、モル比率で２：１から１：２であることが好ましく、１：１であることがより好ましい。当該反応試料を、薬物代謝酵素の存在下、インキュベートする。インキュベーションの条件は特に限定されない。例えば、薬物代謝酵素の濃度および医薬品候補化合物の濃度などは、当業者が後述する工程２のＬＣ－ＭＳ分析において求める感度に応じて適宜設定できる。薬物代謝酵素は、上述のとおりミクロソーム画分などに含まれて反応試料中に混合されていてもよい。よって、薬物代謝酵素の濃度は、反応試料中のタンパク質濃度に基づき調整することもできる。また、反応時間および反応温度についてもＬＣ－ＭＳ分析において求める感度に応じて適宜設定でき、例えば３７℃で６０分とすることができる。
　薬物代謝酵素は、反応試料中、細胞や細胞画分に含有される態様で存在していてもよい。また、この反応試料には、ＮＡＤＰＨなどの補酵素を添加してもよい。インキュベーション後、ＬＣ―ＭＳを用いて分析を行う。
　本実施形態の一般式（１）で表される置換体は、チオール基部分で、ジスルフィド結合を生成し、二量化体を生成することがある。その場合は、ＬＣ－ＭＳ分析の前に、インキュベーションにより得られた生成物にジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加えることにより、ジスルフィド結合を還元することが可能である。これにより、ＬＣ－ＭＳ分析のクロマトグラムにおいて二量化体のピークが大きく現れるのを抑制することができるので、トラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークの特定を容易とすることができる。ジチオスレイトールの代わりに、２－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）フォスフィンなどの還元剤も使用できる。
（工程２）ＬＣ―ＭＳ分析
　ＬＣ―ＭＳ分析の一例の概略図を図１に示す。図１中に記載されている４種類の機器データチャートをそれぞれ上から順番に、第１クロマトグラム、第１スペクトル、第２スペクトル、および最終クロマトグラムと称呼する。
　第１クロマトグラムは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により化合物が分離されたＬＣ溶出液を、質量分析装置（ＭＳ）に順次導入し、質量分析を行った結果を示すチャートである。第１クロマトグラムにおいて、横軸は、各ピークに対応する化合物の液体クロマトグラフィーのカラムにおける保持時間（以下、単に保持時間と称す）を示し、また、縦軸は、各ピークに対応するイオンの相対存在量を示している。
　第１スペクトルは、第１クロマトグラム上の特定の時点における質量分析結果を示すチャートである。第１スペクトルにおいて、横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は、各ピークに対応するイオンの相対存在量を示している。
　第２スペクトルは、ＭＳ／ＭＳ測定の結果を示すチャートである。第２スペクトルにおいて、横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は、各ピークに対応するイオンの相対存在量を示す。
　最終クロマトグラムは、第１クロマトグラムに表されたピークのうち、ＭＳ／ＭＳ測定において指定した質量のニュートラルロスが検出されたピークのみを、クロマトグラムとして表示させるチャートである。最終クロマトグラムにおいて、横軸は保持時間を示し、縦軸は各ピークに対応するイオンの相対存在量を示す。
　図１に示した通り、工程１で調製されたサンプル（インキュベーションにより得られた生成物）を、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により分離し、得られたＬＣ溶出液を、質量分析装置（ＭＳ）に導入する。ＭＳにおいてイオン化後、質量分析を行い、第１クロマトグラムおよび第１スペクトルを得る（Act101およびAct102）。
　質量分析の測定範囲は、対象化合物とトラッピング試薬から生成する付加体の質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出できる範囲が良く、例えば質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲を３５０－１２００に選択した条件でのフルスキャン測定が好ましい。
　ここで得られた第１スペクトルの中から、検出補助二重線の存否を確認する。確認は、第１スペクトルのデータを目視により解析してもよいし、または、ＭＳパターン認識（一般式（１）の置換体と検出補助化合物との質量差と強度を定義し、その条件に一致するイオンを機械的に検出する方法）を使用してもよい。
　第１スペクトルにおいて検出補助二重線が観測された場合は、ＭＳ／ＭＳ測定を行うようにしてもよい(Act103)。検出補助二重線が観測された場合にＭＳ／ＭＳ測定を行って、ＭＳ／ＭＳフラグメントを確認することにより、偽陽性と判定される可能性をより小さくすることができる。
　グルタチオンアルキルエステル構造を有する化合物からは、衝突活性化により、質量数１２９Ｄａのピログルタミン酸分子が脱離することが知られている。よって、ＭＳ／ＭＳ測定は、この１２９Ｄａのニュートラルロスが検出できるエネルギー設定で衝突活性化を行うことが好ましい。
　このＭＳ／ＭＳ測定の結果、第２スペクトルが得られる。好ましいエネルギー設定範囲は、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｅｎｅｒｇｙ　５～５０の範囲である。　
　衝突活性化後に実行されるＭＳ／ＭＳ測定の際には、検出補助二重線として特定されたピークであって、一般式（１）で表される置換体と検出補助化合物の混合比率（好ましくは２：１から１：２、より好ましくは１：１）の強度比をもつピークに対応するイオンのみを測定することにより、より効率的に偽陽性の少ない検出が可能となる。よって、アイソトピックデータディペンデントスキャンモードを使用することが好ましい。
　「アイソトピックデータディペンデントスキャンモード」とは、フルスキャン測定時に、あらかじめ指定した質量差および強度比のイオンが検出された場合のみ、ＭＳ／ＭＳ測定を実施するモードである。
　ＭＳ／ＭＳ測定後、得られたデータセットに１２９Ｄａのニュートラルロスフィルターを適用してもよい（Act104）。
　ここで、「ニュートラルロスフィルター」とは、取得済みのデータに対し、指定した質量のニュートラルロスがあるもののみを、クロマトグラムとして表示させるデータ解析法である。ニュートラルロスフィルターを使用することにより、最終クロマトグラムが得られる（図１参照）。最終クロマトグラムを得ることで、生成されたトラッピング試薬－反応性代謝物付加体の特有のピークをより容易に特定することができる。
（製造方法の一例）
　一般式（１）で表される置換体の製造方法の一例をＳｃｈｅｍｅ１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
　式（１）中、Ｒ１は炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８である直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、または炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が３～８であるシクロアルコキシ基を示す。
　一般式（１）で表されるグルタチオンアルキルエステル同位体置換体は、例えば、一般式（４）で表されるグルタチオンから誘導することにより製造することができる。
　例えば、式（４）で表されるグルタチオンを、触媒存在下、同位体を含有する一般式（５）で表されるアルコールと反応させることにより、製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
　一般式（５）中、Ｒ1は前述のとおりであり、また、２つの星印＊＊が付されている水素原子についても同位体に置換されていてもよい。
　より具体的には、式（４）で表されるグルタチオンを、触媒存在下、一般式（６）で表される同位体標識されたエタノールと反応させる。これにより、一般式（２）で表されるグルタチオンアルキルエステル同位体置換体を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
　一般式（６）中、星印*の付与されている炭素原子、酸素原子、および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている。また、一般式（６）中、２つの星印＊＊が付されている水素原子についても同位体に置換されていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
　一般式（２）中、星印*の付与されている炭素原子、酸素原子、および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている。
　同位体を含有する一般式（５）で表されるアルコールとしては、メタノール－ｄ３、メタノール－ｄ４、エタノール－１，１－ｄ２、エタノール－２，２，２－ｄ３、エタノール－ｄ５、エタノール－ｄ６、プロパノール－１，１－ｄ２、プロパノール－２，２－ｄ２、プロパノール－３，３，３－ｄ３、プロパノール－ｄ７、プロパノール－ｄ８、イソプロパノール－１，１，１，３，３，３－ｄ６、イソプロパノール－ｄ８、ブタノール－ｄ１０、1－ペンタノール－ｄ１１、シクロヘキサノール－ｄ１２、オクタノール－ｄ１８があげられる。好ましくはエタノール－１，１－ｄ２、エタノール－２，２，２－ｄ３、エタノール－ｄ５またはエタノール－ｄ６であり、より好ましくはエタノール－ｄ６である。
　触媒は、グルタチオンに対し、０．５～１０当量が用いられるが、好ましくは１～２当量であり、さらに好ましくは１．６当量である。
　反応温度は０℃～同位体を含有するアルコールの沸点の範囲が挙げられるが、好ましくは２０℃～４０℃であり、さらに好ましくは２５℃～３５℃である。
（従来技術との比較）
　トラッピング試薬として使用されていた従来の同位体標識化合物では、同位体をグルタチオンの構成アミノ酸である、グリシン残基中に有していた（特許文献２、非特許文献３、４）。本発明者らは、グルタチオンの構成アミノ酸部分ではないＲ１に含まれる元素を同位体標識することで、トラッピング試薬として使用できる、安価な同位体標識化合物の提供を可能とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
　式（７）中、星印＊の付与されている原子は１３Ｃまたは１５Ｎである。式（１）中、Ｒ１は、前述のとおりである。
　一般式（１）で表される置換体は、安価なグルタチオンを合成原料として使用できる。例えば、市販のグルタチオンに、市販の重エタノールなど、同位体を含有するアルコール（一般式（５）で表されるアルコール）を反応させることで、一段階で、収率よく簡便に調製することが可能である。
　一方、従来技術であるグルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎに関しては、市販されているものの、非常に高価な試薬であり、大量に入手することが困難である。また、別途合成する場合も、非常に高価なグリシン同位体置換体を原料としているほか、グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎを得るまでには、５段階を必要とする。よって、グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎを安価に入手することは極めて困難である（非特許文献４）（Ｓｃｈｅｍｅ２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
　Ｓｃｈｅｍｅ２中、Ｒ１は前述のとおりであり、また、２つの星印＊＊が付されている水素原子についても同位体に置換されていてもよい。
　以上、本実施形態によれば、トラッピング試薬として使用できる、より安価な同位体標識化合物を提供することができるので、より膨大な数の医薬品候補化合物のスクリーニングが実現可能となる。研究開発の初期段階で簡便に毒性が評価できることは、医薬品開発のスピードアップにも繋がり、意義が大きい。
　また、本実施形態においては、トラッピング試薬（一般式（１）で表される置換体、補助検出化合物）、および医薬品候補化合物を含む反応試料のインキュベーションにおいて、トラッピング試薬と反応性代謝物とを反応させてトラッピング試薬－反応性代謝物付加体を生じさせる。よって、ＬＣ－ＭＳ分析等においてトラッピング試薬－反応性代謝物付加体に由来するイオンピークが、例えば検出補助二重線である多重線として出現する。検出補助二重線のような多重線は、単独のピークよりも特定が容易である。したがって、反応性代謝物の検出において、偽陽性のより少ない検出が可能となる。
　さらに、本実施形態に係るグルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体の特徴的なピークは、ＬＣ－ＭＳ分析においてフルスキャン法またはニュートラルロススキャン法などの、広い範囲の連続的なイオンが検出可能な測定方法を適用することで、より検出しやすくなる。よって、偽陰性と判定されるケースをより少なくした検出も可能である。
　加えて、本実施形態の一般式（１）の置換体をトラッピング試薬として用いた場合、従来の同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた場合に反応性代謝物を検出できなかった化合物についても、反応性代謝物を検出することができる。よって、本実施形態によれば、偽陰性と判定されるケースをより少なくすることができる。
（実施例１）
グルタチオンエチルエステル－ｄ５体（式（３））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
　式（３）中、Ｄは重水素（２Ｈ）を表す。
　グルタチオン還元型（５０３．８ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）をエタノール－ｄ６（９９．５ＡＴＯＭ％Ｄ）（５ｍＬ）に懸濁させたのち、濃硫酸（０．１３７ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）を添加し、反応液とした。反応液を室温で３０分間撹拌したのち、室温で２１時間静置した。この反応液にトリエチルアミン（０．７１４ｍＬ）を加えて中和し、エタノール（１０ｍＬ）、ジイソプロピルエーテル（１０ｍＬ）を加え、生成物を晶析させた。４℃で１６時間静置したのち、結晶をろ取した。３５℃で３時間減圧乾燥することで、４７２ｍｇ（収率８５％）の白色固体を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ　３３６　［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）　δ：１．９８－２．０４（２Ｈ，ｍ），２．３５－２．４２（２Ｈ，ｍ），２．７９－２．８１（２Ｈ，ｍ），３．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０８Ｈｚ），３．８７－３．８８（１Ｈ，ｍ），４．４１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１２Ｈｚ）
（実施例２～９で共通する工程：工程１～２）
（工程１）インビトロ・インキュベーション及び分析用サンプル調製
　以下の実施例２～９においては、反応性代謝物の検出試験において反応性代謝物を生じさせる基質化合物を対象化合物と称す。
　対象化合物（１０μｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ）、グルタチオンエチルエステル（ＧＳＨＥＥ）とグルタチオンエチルエステル－ｄ５体（ＧＳＨＥＥ―ｄ５）をモル比１：１の割合で混合した混合物（１ｍｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ）、ラット肝ミクロソーム（１ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ）、リン酸カリウム・バッファー（ｐＨ７．４）（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ）、塩化マグネシウム（５ｍｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ）、および精製水を含有するインキュベーション混合物（反応試料）を３７℃で５分間プレインキュベートした。プレインキュベートしたインキュベーション混合物に、ＮＡＤＰＨ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ）を添加し、反応（インキュベーション）を開始した。最終インキュベーション容量は１ｍＬであった。また、対象化合物を含まないサンプルを、コントロールとして使用した。
　３７℃で６０分間のインキュベーション後、５０ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール水溶液（１００μＬ、５μｍｏｌ）をインキュベーション混合物に添加し、５分間１０，０００ｇで遠心分離に供した。あらかじめ１ｍＬのメタノールで洗浄後、１ｍＬの精製水で活性化した固相抽出カラム（ＯＡＳＩＳ　ＨＬＢ　１ｃｃ，３０ｍｇ）に、前記遠心上清を、供した。１ｍＬの水、１ｍＬの５％メタノール水により洗浄を行った後、さらに１ｍＬのメタノールにより反応生成物を溶出させた。窒素気流下で溶媒を留去し、残渣を１５０μＬのアセトニトリル：水（２：８）に溶解させ、分析用サンプルとした。
（工程２）ＬＣ―ＭＳ分析
（工程２－１）液体クロマトグラフィー
　クロマトグラフィーによる分離は、ＡＱＣＵＩＴＹ　ＵＰＬＣシステム（ＷＡＴＥＲＳ）を使用した。調製された分析用サンプルの一部（１０μＬ）を、ＡＱＣＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）上にインジェクトした。このクロマトグラフィーによる分離を、０．５ｍＬ／分の移動相流速で下表に示すグラジエント条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
（工程２－２）質量分析
　工程２－１で得られたＬＣカラム溶出液を、ＬＴＱ　ＸＬ　イオントラップ型質量分析計に導入した。イオン化は、ＥＳＩのポジティブモード（正に荷電したイオンを検出するモード）で行った。使用した測定条件を以下に示す（測定条件Ａ）。
（測定条件Ａ）
ISplay Voltage: 5.0kV
Capillary Temp: 350℃
Sheath Gas Flow Rate: 41
Aux Gas Flow Rate: 18
Sweep Gas Flow Rate: 6.5
　質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲が４００－８００にわたるフルスキャン測定を行い、第１クロマトグラムおよび図６～図１２、図１９～図２７に示す第１スペクトルを得た（クロザピン：図６～８、チクロピジン：図９～１０、ジクロフェナク：図１１～１２、アセトアミノフェン：図１９、オメプラゾール：図２０～２１、イミプラン：図２２～２３、チエニル酸：図２４、ケルセチン：図２５～２７）。
（工程２－３）ＭＳ／ＭＳ測定
　同位体二重線を与える“５ａｍｕの差で１：１の強度比をもつイオン”のみを衝突活性化してＭＳ／ＭＳ測定するアイソトピックデータディペンデントスキャンモードで測定し、第２スペクトルが得られた。使用した測定条件を以下に示す（測定条件Ｂ）。
（測定条件Ｂ）
Normalized Collision Energy：35
Mass Difference：5.00
Expected ratio: 1.00
Match tolerance：0.15
（工程２－４）ニュートラルロスフィルター
　工程２－３のＭＳ／ＭＳ測定により得られたデータセットに１２９Ｄａのニュートラルロスフィルターを適用することにより、図２～５、１３～１８に示す最終クロマトグラムを取得した（コントロール：図２および図１３、クロザピン：図３、チクロピジン：図４、ジクロフェナク：図５、アセトアミノフェン：図１４、オメプラゾール：図１５、イミプラン：図１６、チエニル酸：図１７、ケルセチン：図１８）。
　なお、反応試料に混合されるラット肝ミクロソームのロットが異なることや質量分析計におけるイオン化状態や感度の違いなどに応じて、前述のクロマトグラムのピークの出現状態および後述する質量分析におけるスペクトルのピークの出現状態が異なることがある。そのため、より正確な分析を行うために、実施例１～４のコントロール（図２）とは別に、実施例５～９については新たにコントロールの調製および測定を行っている（図１３）。
　最終クロマトグラムは、工程２－２の質量分析で同位体二重線（５ａｍｕの差で１：１の強度比を持つ二重線）が現れ、且つ第二の質量分析（ＭＳ／ＭＳ測定）で、１２９Ｄａのニュートラルロスが検出されたピークを表す。最終クロマトグラムに表れるピークのうち、コントロール（図２または図１３）でも表れたピークを除いたピークが、トラッピング試薬―反応性代謝物付加体のピークと考えられる。
　対象化合物として、クロザピン、チクロピジン、ジクロフェナク、アセトアミノフェン、オメプラゾール、イミプラミン、チエニル酸及びケルセチンを用いて、上記の測定を行った。なお、これら８つの化合物は、反応性代謝物を生成することが知られており、本実施形態に係わる同位体標識化合物の１つであるグルタチオンエチルエステル－ｄ５体が、反応性代謝物の検出に使用できるのかどうか立証するため、選択された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
（実施例２）
対象化合物：クロザピン
　図３は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２）と比較し、保持時間４．８１分、４．８９分および５．０２分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間４．８１分に対応する付加体を付加体Ａ、保持時間４．８９分に対応する付加体を付加体Ｂ、保持時間５．０２分に対応する付加体を付加体Ｃとする。図６に示されるように、付加体Ａについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６７８および６８３Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図７に示されるように、付加体Ｂについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６４６および６５１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図８に示されるように、付加体Ｃについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６６０および６６５Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、クロザピンはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、３種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例３）
対象化合物：チクロピジン
　図４は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２）と比較し、保持時間３．９２分および４．０３分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．９２分に対応する付加体を付加体Ｄ、保持時間４．０３分に対応する付加体を付加体Ｅとする。図９に示されるように、付加体Ｄについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３１および６３６Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図１０に示されるように、付加体Ｅについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３１および６３６Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、チクロピジンはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、２種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例４）
対象化合物：ジクロフェナク
　図５は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２）と比較し、保持時間５．５４分および５．７８分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間５．５４分に対応する付加体を付加体Ｆ、保持時間５．７８分に対応する付加体を付加体Ｇとする。図１１に示されるように、付加体Ｆについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６１１および６１６Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図１２に示されるように、付加体Ｇについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６４５および６５０Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、ジクロフェナクはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、２種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例５）
対象化合物：アセトアミノフェン
　図１４は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図１３）と比較し、保持時間２．３３分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間２．３３分に対応する付加体を付加体Ｈとする。図１９に示されるように、付加体Ｈについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４８５および４９０Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、アセトアミノフェンはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、１種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例６）
対象化合物：オメプラゾール
　図１５は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図１３）と比較し、保持時間３．９２分および３．９９分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．９２分に対応する付加体を付加体Ｉ、保持時間３．９９分に対応する付加体を付加体Ｊとする。図２０に示されるように、付加体Ｉについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６４９および６５４Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図２１に示されるように、付加体Ｊについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６７９および６８４Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、オメプラゾールはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、２種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例７）
対象化合物：イミプラミン
　図１６は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図１３）と比較し、保持時間４．２７分および４．３３分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間４．２７分に対応する付加体を付加体Ｋ、保持時間４．３３分に対応する付加体を付加体Ｌとする。図２２に示されるように、付加体Ｋについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６０２および６０７Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図２３に示されるように、付加体Ｌについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６４８および６５３Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、イミプラミンはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、２種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例８）
対象化合物：チエニル酸
　図１７は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図１３）と比較し、保持時間５．７４分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間５．７４分に対応する付加体を付加体Ｍとする。図２４に示されるように、付加体Ｍについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６６４および６６９Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、チエニル酸はグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、１種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
（実施例９）
対象化合物：ケルセチン
　図１８は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図１３）と比較し、保持時間３．７６分、４．０１分および４．５２分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．７６分に対応する付加体を付加体Ｎ、保持時間４．０１分に対応する付加体を付加体Ｏ、保持時間４．５２分に対応する付加体を付加体Ｐとする。図２５に示されるように、付加体Ｎについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６および６４１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図２６に示されるように、付加体Ｏについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６および６４１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図２７に示されるように、付加体Ｐについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６および６４１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　以上の結果より、ケルセチンはグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いた場合でも陽性と判定され、３種類の反応性代謝物を生成していることが確認できた。
　実施例２～９において、式（３）で表されるグルタチオンエチルエステル－ｄ５体をトラッピング試薬として用いることにより、８つの化合物とも正しく陽性の結果が得られた
（偽陰性なし）。
　また、実施例２～９において、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体、および検出補助化合物－反応性代謝物付加体のピークが、特徴的な同位体二重線として現れている。そのため、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体および検出補助化合物－反応性代謝物付加体のピークとそれ以外のピークとが容易に判別できる。よって、偽陽性と判定される可能性を小さくできる。。
（比較例１～７共通）
　トラッピング試薬として、グルタチオンエチルエステル（ＧＳＨＥＥ）とグルタチオンエチルエステル－ｄ５体（ＧＳＨＥＥ―ｄ５）の混合物に代えて、グルタチオンエチルエステル（１ｍｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ）を用い、前記（工程１）～（工程２）と同様の方法で反応および測定を行った。
　なお、（工程２－２）に対応する質量分析では、質量電荷比（ｍ／ｚ）４５０－９００にわたりフルスキャン測定を行った。（工程２－３）に対応するＭＳ／ＭＳ測定においては、第一スペクトル内の最も強度の強いイオンを衝突活性化してＭＳ／ＭＳ測定するデータディペンデントスキャンモードで測定し、第２スペクトルを得た。使用した測定条件は以下の通りである（測定条件Ｃ）。
（測定条件Ｃ）
Activation Type：CID
Normalized Collision Energy：35
　対象化合物としてクロザピン、ジクロフェナク、アセトアミノフェン、オメプラゾール、イミプラミン、チエニル酸およびケルセチンの７化合物を用いて、上記の測定を行った。なお、これら７化合物は、反応性代謝物を生成することが知られており、反応性代謝物の検出における、本実施形態の同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた場合との比較を行うために、選択された。
　また、コントロールについて得られた最終スペクトルを図２８に示す。
（比較例１）
対象化合物：オメプラゾール
　図２９は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２８）と比較し、保持時間３．５９分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．５９分に対応する付加体を付加体Ｑとする。図３６に示されるように、付加体Ｑについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６７９Ｄａにピークが確認された。
　図３０は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２８）と比較し、保持時間４．２２分および４．３３分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間４．２２分に対応する付加体を付加体Ｒ、保持時間４．３３分に対応する付加体を付加体Ｓとする。図３７に示されるように、付加体Ｒについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６４６Ｄａにピークが確認された。図３８に示されるように、付加体Ｓについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６６０Ｄａにピークが確認された。
　図３１は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２８）と比較し、保持時間５．４９分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間５．４９分に対応する付加体を付加体Ｔとする。図３９に示されるように、付加体Ｔについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６４５Ｄａにピークが確認された。
　図３２は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示しているが、サンプル特有のピークは認められなかった。
　図３３は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示しているが、サンプル特有のピークは認められなかった。
　図３４は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２８）と比較し、保持時間２．１８分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間２．１８分に対応する付加体を付加体Ｕとする。図４０に示されるように、付加体Ｕについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４８５Ｄａにピークが確認された。
（比較例７）
対象化合物：ケルセチン
　図３５は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２８）と比較し、保持時間３．６３分、３．８７分および４．３５分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．６３分に対応する付加体を付加体Ｖ、保持時間３．８７分に対応する付加体を付加体Ｗ、持時間４．３５分に対応する付加体を付加体Ｘとする。図４１に示されるように、付加体Ｖについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６Ｄａにピークが確認された。図４２に示されるように、付加体Ｗについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６Ｄａにピークが確認された。図４３に示されるように、付加体Ｘについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６Ｄａにピークが確認された。
　実施例と比較例１～７の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　本実施形態の同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた場合と、グルタチオンエチルエステルのみをトラッピング試薬として使用した場合とを比較する。７化合物中５化合物について、実施例の方が比較例よりも、確認できた反応性代謝物の数が多いことが分かる（オメプラゾール、クロザピン、ジクロフェナク、イミプラミン、チエニル酸）。
　特に、イミプラミンやチエニル酸においては、比較例では１つも反応性代謝物が検出できておらず、陰性結果が出ている。前述した通り、イミプラミン、チエニル酸のいずれも反応性代謝物を生成する化合物であることが知られており、当該結果は、「偽陰性」である。
　本実施形態の同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた実施例においては、第一スペクトルの同位体二重線のみを衝突活性化してＭＳ／ＭＳ測定を行っている。
　一方、比較例１～７ではグルタチオンエチルエステルを用いているため、同位体二重線は観測されない。比較例１～７では最も強度の強いイオンを衝突活性化しているが、トラッピング試薬－反応代謝物付加体のピーク強度が低い場合、当該ピークは衝突活性化を受けず、その結果、確認できる反応性代謝物の数が減ったと考えられる。
　以上の結果から、本実施形態の同位体標識化合物は、従来においてトラッピング試薬として使用されていた化合物と比べ偽陰性と判定されるケースが少なく、トラッピング試薬としての使用においてより優れていることが分かる。
　比較例１～７において、実施例と比べ、確認できた反応性代謝物の数が少なかった原因として、（工程２－３）のＭＳ／ＭＳ測定において、「第一スペクトル内の最も強度の強いイオンを衝突活性化」していることが考えられた。そこで、トラッピング試薬－反応代謝物付加体のピーク強度が、最も強くない場合でも、衝突活性化を受ける条件下で再度検討を行った。
（比較例８）
対象化合物：オメプラゾール
　対象化合物としてオメプラゾールを用いた。（工程２－３）に対応するＭＳ／ＭＳ測定においてイオンの強度の高い順にＭＳ／ＭＳ測定を実行するデータディペンデントスキャンモード（Dynamic Exclusion ONモード）でＭＳ／ＭＳ測定を行った以外は、比較例１と同様に測定を行った。データディペンデントスキャンモード（Dynamic Exclusion ONモード）は、第一スペクトル内のピークのうち最も強度の強いイオンを３回MS／MS測定した後、当該イオンを除外し、次に強度の強いイオンを３回ＭＳ／ＭＳ測定するとともに、当該処理を強度の順に繰り返し行う。使用した測定条件は以下の通りである（測定条件D）。
（測定条件D）
Repeat Count：3
Repeat Duration：6.00
Exclusion List Size：100
Exclusion Duration：6.00
　図４４は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図２８）と比較し、保持時間３．６１分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．６１分に対応する付加体を付加体Ｑ２とする。図４５に示されるように、付加体Ｑ２について、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６７９Ｄａに強度の強いピークが確認された。
　以上の結果より、（工程２－３）のＭＳ／ＭＳ測定の条件を変更した場合でも、比較例１と同様に、１種類の反応性代謝物しか確認できなかった。
  実施例６では、第一スペクトルのピークのうち、同位体二重線のみを衝突活性化してMS／MS測定を行うことができ、感度よく検出が可能なのに対し、比較例８では、強度の高いイオンから順次活性化を行っている。このことから、第一スペクトルのピーク中で、トラッピング試薬－反応代謝物付加体のピーク強度が低い場合、衝突活性化回数が少なくなり、感度が低下してしまうため、と考えられる。
　以上のことからも、本実施形態の同位体標識化合物は、偽陰性と判定されるケースが少なく、トラッピング試薬としての使用においてより優れていることが分かる。
（比較例９～１５共通）
（工程１）インビトロ・インキュベーション及び分析用サンプル調製
　対象化合物（１０μｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ）、グルタチオン（ＧＳＨ）とグルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎをモル比１：０．７の割合で混合した混合物（１ｍｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ）、ラット肝ミクロソーム（１ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ）、リン酸カリウム・バッファー（ｐＨ７．４）（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ）、塩化マグネシウム（５ｍｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ）、および精製水を含有するインキュベーション混合物（反応試料）を３７℃で５分間プレインキュベートした。プレインキュベートしたインキュベーション混合物に、ＮＡＤＰＨ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ）を添加し、反応（インキュベーション）を開始した。最終インキュベーション容量は１ｍＬであった。また、対象化合物を含まないサンプルを、コントロールとして使用した。
　３７℃で６０分間のインキュベーション後、５分間１０，０００ｇで遠心分離に供した。あらかじめ１ｍＬのメタノールで洗浄後、１ｍＬの精製水で活性化した固相抽出カラム（ＯＡＳＩＳ　ＨＬＢ　１ｃｃ，３０ｍｇ）に、前記遠心上清を供した。１ｍＬの水、１ｍＬの５％メタノール水により洗浄を行った後、さらに１ｍＬのメタノールにより反応生成物を溶出させた。窒素気流下で溶媒を留去し、残渣を１５０μＬのアセトニトリル：水（２：８）に溶解させ、分析用サンプルとした。
（工程２）ＬＣ―ＭＳ分析
（工程２－１）液体クロマトグラフィー
　クロマトグラフィーによる分離は、ＡＱＣＵＩＴＹ　ＵＰＬＣシステム（ＷＡＴＥＲＳ）を使用した。調製された分析用サンプルの一部（１０μＬ）を、ＡＱＣＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）上にインジェクトした。このクロマトグラフィーによる分離を、０．５ｍＬ／分の移動相流速で表３に示すグラジエント条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
（工程２－２）質量分析
　工程２－１で得られたＬＣカラム溶出液を、ＬＴＱ　ＸＬ　イオントラップ型質量分析計に導入した。イオン化は、ＥＳＩのポジティブモード（正に荷電したイオンを検出するモード）で行った。使用した測定条件を以下に示す（測定条件Ａ）。
（測定条件Ａ）
ISplay Voltage: 5.0kV
Capillary Temp: 350℃
Sheath Gas Flow Rate: 41
Aux Gas Flow Rate: 18
Sweep Gas Flow Rate: 6.5
　質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲が４５０－９００にわたるフルスキャン測定を行い、第１クロマトグラムおよび図５３～図６１に示す第１スペクトルを得た（オメプラゾール：図５３～５４、クロザピン：図５５～５７、イミプラミン：図５８、チエニル酸：図５９、ケルセチン：図６０～６１）。
（工程２－３）ＭＳ／ＭＳ測定
同位体二重線を与える“３ａｍｕの差で１：０．７の強度比をもつイオン”のみを衝突活性化してＭＳ／ＭＳ測定するアイソトピックデータディペンデントスキャンモードで測定し、第２スペクトルが得られた。使用した測定条件を以下に示す（測定条件E）。
（測定条件E）
Normalized Collision Energy：35
Mass Difference：3.00
Expected ratio: 0.7
Match tolerance：0.15
（工程２－４）ニュートラルロスフィルター
工程２－３のＭＳ／ＭＳ測定により得られたデータセットに１２９Ｄａのニュートラルロスフィルターを適用することにより、図４６～５２に示す最終クロマトグラムを取得した（コントロール：図４６、オメプラゾール：図４７、クロザピン：図４８、イミプラミン：図４９、チエニル酸：図５０、アセトアミノフェン：図５１、ケルセチン：図５２）。
最終クロマトグラムは、工程２－２の質量分析で、同位体二重線（３ａｍｕの差で１：０．７の強度比を持つ二重線）が現れ、第二の質量分析（ＭＳ／ＭＳ測定）で、１２９Ｄａのニュートラルロスを検出したピークを表したものである。最終クロマトグラムに表れるピークのうち、図４６（コントロール）で表れたピークを除いたピークが、トラッピング試薬―反応性代謝物付加体のピークと考えられる。
（比較例９）
対象化合物：オメプラゾール
　図４７は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図４６）と比較し、保持時間１．１３分、１．２３分、１．９５分、２．２１分、２．７４分、２．８８分および３．６１分においてサンプル特有のピークが認められる。このうち、１．１３分、１．２３分、１．９５分、２．２１分および３．６１分のピークは、偽陽性ピークであり、２．７４分および２．８８分のピークがトラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークである。保持時間２．７４分に対応する付加体を付加体Ｙとする。保持時間２．８８分に対応する付加体を付加体Ｚとする。図５３に示されるように、付加体Ｙについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６２１および６２４Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図５４に示されるように、付加体Ｚについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６５１および６５４Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　図４８は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図４６）と比較し、保持時間３．２２分、３．３７分および３．５０分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間３．２２分に対応する付加体を付加体ＡＡ、保持時間３．３６分に対応する付加体を付加体ＡＢ、保持時間３．５０分に対応する付加体を付加体ＡＣとする。図５５に示されるように、付加体ＡＡについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６５０および６５３Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図５６に示されるように、付加体ＡＢについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６１８および６２１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図５７に示されるように、付加体ＡＣについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３２および６３５Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　図４９は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図４６）と比較し、保持時間３．６５分、４．６１分、４．７８分および４．９３分においてサンプル特有のピークが認められる。このうち、４．６１分、４．７８分および４．９３分のピークは、偽陽性ピークであり、３．６５分のピークがトラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークである。保持時間３．６５分に対応する付加体を付加体ＡＤとする。図５８に示されるように、付加体ＡＤについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が５７４および５７７Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　図５０は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図４６）と比較し、保持時間４．８５分および８．７１分においてサンプル特有のピークが認められる。このうち、８．７１分のピークは偽陽性ピークであり、４．８５分のピークがトラッピング試薬－反応性代謝物付加体のピークである。保持時間４．８５分に対応する付加体を付加体ＡＥとする。図５９に示されるように、付加体ＡＥについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６３６および６３９Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
　図５１は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示しているが、トラッピング試薬－反応代謝物付加体のピークは認められなかった。
（比較例１４）
対象化合物：ケルセチン
　図５２は、対象化合物について得られた最終クロマトグラムを示している。数種の成分が正の応答を示しているが、コントロールのクロマトグラム（図４６）と比較し、保持時間２．８２分および３．１６分においてサンプル特有のピークが認められる。保持時間２．８２分に対応する付加体を付加体ＡＦ、保持時間３．１６分に対応する付加体を付加体ＡＧとする。図６０に示されるように、付加体ＡＦについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６０８および６１１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。図６１に示されるように、付加体ＡＧについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）が６０８および６１１Ｄａである特徴的な同位体二重線が確認された。
実施例と比較例の結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　本実施形態の同位体標識化合物をトラッピング試薬として用いた場合と、グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎを使用した場合を比較する。６化合物中３化合物について、実施例の方が比較例よりも、確認できた反応性代謝物の数が多いことが分かる（イミプラミン、アセトアミノフェン、ケルセチン）。特に、アセトアミノフェンにおいては、比較例では１つも反応性代謝物が検出できておらず、陰性結果が出ている。前述した通り、アセトアミノフェンも、反応性代謝物を生成する化合物であることが知られており、当該結果は、「偽陰性」である。
　また、オメプラゾール（比較例９）、イミプラミン（比較例１１）、チエニル酸（比較例１２）において、グルタチオングリシン－１３Ｃ２，１５Ｎを使用した場合、本実施形態の同位体標識化合物を用いた場合には確認されなかった偽陽性ピークが認められた。
　以上のことから、本実施形態の同位体標識化合物は、従来においてトラッピング試薬として使用されていた化合物と比べ偽陰性および偽陽性と判定されるケースが少なく、トラッピング試薬としての使用においてより優れていることが分かる。
　反応性代謝物を生ずる医薬品候補化合物を選定するために有用な、トラッピング試薬として使用できる新規の同位体標識化合物を提供する。偽陽性のみならず、偽陰性が少なく、より正確に反応性代謝物の検出が可能である検出方法、検出試薬を提供する。

Claims (11)

  1. 　一般式（１）で表されるグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
      
    式（１）中、Ｒ１は、含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が１～８である直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、または含有される炭素原子、酸素原子および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている炭素数が３～８であるシクロアルコキシ基を示す。
  2. 　一般式（２）で表され、星印*の付与されている炭素原子、酸素原子、および水素原子のうち少なくとも１つが同位体標識されている請求項１に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
      
  3. 　一般式（３）で表される請求項１に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
      
    式（３）中、Ｄは重水素（２Ｈ）を表す。
  4. 　請求項１から３のいずれか一項に記載のグルタチオンアルキルエステル同位体置換体を用いて、反応性代謝物を検出する方法。
  5. 　請求項４に記載の方法において、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載の前記グルタチオンアルキルエステル同位体置換体、当該グルタチオンアルキルエステル同位体置換体が有する原子のうち少なくとも１つが質量数が異なる原子に置き換えられている化合物である検出補助化合物、および医薬品候補化合物を含む反応試料を、薬物代謝酵素の存在下においてインキュベートすることにより、グルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体および検出補助化合物－反応性代謝物付加体を生じさせ、
    　液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いた分析において、生じたグルタチオンアルキルエステル同位体置換体－反応性代謝物付加体および検出補助化合物－反応性代謝物付加体の質量ピークを検出することを含む、反応性代謝物を検出する方法。
  6. 　請求項５に記載の方法において、
    　前記反応試料中における請求項１から３のいずれか一項に記載の前記グルタチオンアルキルエステル同位体置換体と前記検出補助化合物のモル比率が２：１から１：２である、請求項５に記載の反応性代謝物を検出する方法。
  7. 　請求項５または６に記載の方法において、
    　インキュベートすることにより得られた生成物にジチオスレイトール、２－メルカプトエタノール、またはトリス（２－カルボキシエチル）フォスフィンを添加した後、前記液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いた分析を行うことをさらに含む、反応性代謝物を検出する方法。
  8. 　請求項５から７のいずれか１項に記載の方法において、
    　前記液体クロマトグラフィー－質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いた分析においてニュートラルロススキャン法またはフルスキャン法を行う、反応性代謝物を検出する方法。
  9. 　請求項５から８のいずれか１項に記載の方法において、
    　前記検出補助化合物が、前記反応試料中に含まれる請求項１から３のいずれか一項に記載の前記グルタチオンアルキルエステル同位体置換体の非標識化合物である、反応性代謝物を検出する方法。
  10. 　グルタチオンに、重水素化アルコールを反応させることにより、請求項１から３のいずれか一項に記載の前記グルタチオンアルキルエステル同位体置換体を製造する方法。
  11. 　請求項１０に記載の方法において、
    　前記重水素化アルコールがエタノール－ｄ６である前記グルタチオンアルキルエステル置換体を製造する方法。
     
     
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