WO2012150373A1 - Materiales funcionalizados - Google Patents

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Pablo Alfonso DEL PINO GONZÁLEZ DE LA HIGUERA
Maria Valeria GRAZÚ BONAVÍA
Jesús MARTÍNEZ DE LA FUENTE
Christian SÁNCHEZ ESPINEL
Ruben SANTOS MARTÍNEZ DE LAGUNA
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Universidad De Zaragoza
Fundación Agencia Aragonesa Para La Investigación Y El Desarrollo
Nanoimmunotech, Srl
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Definitions

  • Non-limiting examples of peptides are cell internalization peptides ie those that have less than 30 amino acids and are amphiphilic or with a positive net charge.
  • Non-limiting examples of blocking agents would be polyethylene glycols and sugars such as mono and polysaccharides.
  • the pH of the solution should preferably be included between 5 and 9 and the salt concentration (NaCI, MgCI2, N ⁇ CI2, NaBr, ZnCI2, MnCI2, BrCI, CaCI2, KCI, AgCI, LiBr, KBr, AgBr, or others) should preferably be in the range between 1 mM and 1 M.
  • the base material is of the microparticulate type.
  • the base material is of the nanostructured type.
  • the nanoparticulate base material has an average diameter size between 2 and 100 nm.
  • the organic shell is a polymer
  • this is the poly (maleic anhydride-alt-1-octadecene).
  • mini-antibodies if the micro or nanostructured material to be functionalized is going to be used in therapy or diagnosis in vivo, the fact of using Antibodies for its functionalization may limit its applications due to inherent immunogeneity problems or diffusion problems through biological barriers or into the neoplastic mass of tumors. In these cases, the use of smaller biomolecules, such as mini-antibodies, is a possible solution.
  • the mini-antibodies are fragments derived from antibodies constructed by recombinant DNA technology, and which, despite their smaller size, retain the antigen binding capacity since they maintain at least one variable immunoglobulin domain.
  • Aptamers are molecules that, due to their small size and low immunogeneity, can substitute antibodies in certain applications.
  • Aptamers are single chain nucleic acids that have well-defined three-dimensional shapes which allows them to bind to the target molecule in a similar way as antibodies.
  • Aptamers combine the optimal characteristics of small molecules (low immunogenicity, high diffusion, etc.) and antibodies (high specificity and affinity and chemical stability).
  • Another advantage over monoclonal antibodies is that they are chemically synthesized instead of being Biologically expressed, which offers a significant advantage in terms of cost and allows functional groups that allow the binding of the PNA or DNA molecule to be introduced at the far end into the biological recognition zone.
  • Toxin While non-toxic or inactive toxins are used as vectorizing biomolecules, the toxins can be used as drugs ⁇ Spooner and Watson, Curr. Opin. Drug Discov. Dev 2010, 13 (1), 86-95). Due to its high non-selective toxicity its use is prohibited if it is not through its selective vectorization.
  • the tracers are selected from fluorescent markers, magnetic resonance contrast agents and radioisotopes.
  • the cell internalization peptides are selected from those that have less than 30 amino acids and are either amphiphilic or with a positive net charge, for example and without limitation, TAT, penetrin ...
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the use of the functionalized material for use as industrial catalysts in sustainable chemistry processes: fine and pharmaceutical chemistry, biofuels, food chemistry, analytical chemistry, etc.
  • the term "pharmaceutical or veterinary composition” refers to a set of components that is at least formed by the extract of the invention, which has at least one application in improving the physical or physiological or psychological well-being of a subject. , which implies an improvement of the general state of your health, for example a cosmetic application, although it may not imply a physiological effect on the organism but an improvement in the well-being of the subject related to his psychology. Therefore, said pharmaceutical composition may be a personal hygiene product, a cosmetic product or a product that may constitute the basis for the preparation of the above products or the basis for the preparation of a medicament.
  • the "personal hygiene product” is defined as the substances or preparations that, without having the legal consideration of medicines, medical devices, cosmetics or biocides, are intended to be applied to the skin, teeth or mucous membranes of the human body for the purpose of hygiene or aesthetic, or to neutralize or eliminate ectoparasites.
  • medicament has a more limited meaning than the meaning of "pharmaceutical composition”, as defined in the present invention, since the medicament necessarily implies a therapeutic effect, that is, a physiological effect on the subject's metabolism.
  • composition of the invention may further comprise a pharmacologically acceptable carrier.
  • vehicle must be pharmaceutically acceptable.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the vehicle can be an inert substance or action analogous to any of the sequences of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the extract of the invention as well as other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • the pharmacologically acceptable carrier could be, but not limited to, a nanoparticle, a liposome, a micelle or a microemulsion.
  • the IgM monoclonal antibody called BH1 has been functionalized with the PNA-B sequence, while, on the other hand, the TexasRed fluorescent marker, has been functionalized with the DNA-A sequence.
  • anti HLA-DR This new antibody has the ability to recognize DR + leukemic cells and produce their death with high efficacy in the presence of complement.
  • human Hmy-2 tumor cells HLA-DR class II positive B cell line
  • HLA-DR class II positive B cell line have been used, which have been properly labeled with another fluorescent marker and detected by the flow cytometry technique.

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Abstract

Procedimiento de obtención de materiales multifuncionalizados La presente invención describe un procedimiento de obtención de materiales multifuncionales que comprende las etapas de: a) activación química de grupos funcionales presentes en un material base micro o nanoparticulado; b) reacción de sustitución nucleófila entre al menos un grupo amino, carboxilo o tiol terminal de una cadena de PNA o ADN tipo A y al menos un grupo funcional activado del material base obtenido en la etapa (a); c) conjugación a una biomolécula mediante activación química de grupos funcionales de una cadena de PNA/ADN tipo B, complementaria a la cadena PNA/ADN tipo A; y d) hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A, que están unidas al material base según la etapa b) y las cadenas de PNA/ADN tipo B que tienen unidas biomoléculas, según la etapa c) mediante reconocimiento molecular PNA-PNA o PNA-ADN.

Description

Materiales funcionalizados
La presente invención describe materiales funcionalizados y multifuncionalizados a los que se han anclado hebras de PNA o ADN sobre las que se hibridan mediante reconocimiento molecular, PNA-PNA, PNA-ADN o ADN-ADN, hebras complementarias de PNA o ADN que a su vez están conjugadas con moléculas activas o bioactivas. La presente invención también se refiere al procedimiento de obtención de estos materiales funcionales y funcionales asi como a sus posibles aplicaciones biotecnológicas y biomédicas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Un área de investigación que puede revolucionar el ámbito de los materiales sintéticos, es el campo de los materiales funcionales y multifuncionales. Hoy en día, se requiere de este tipo de materiales con unas funciones adaptables y un diseño a la carta; es decir lo que se desea principalmente, es un diseño inteligente de estos materiales. Una de las áreas donde este tipo de materiales tienen un gran potencial, no sólo por el impacto económico que supone, si no además por su impacto social, es el campo de la aplicación de estos materiales en biotecnología y medicina.
El desarrollo de nuevos sistemas funcionales y multifuncionales micro y nanoestructurados está alcanzando un gran interés para su utilización en aplicaciones biotecnológicas (bioprocesos enzimáticos, biorremediación, etc) y biomédicas (diagnóstico, imagen, terapia molecular, etc). Se prevé que todos estos dispositivos tengan una gran utilidad en procesos de identificación temprana de enfermedades, en la ablación de tumores mediante hipertermia, en el transporte y liberación de fármacos o en la regeneración celular dentro de un organismo.
Si bien han sido publicadas varias aproximaciones R. Ojeda, J.L de Paz, A. G. Barrientos, M. Martin-Lomas, S. Penades, Carb. Res. 342 (2007) 448-459 para la obtención de materiales multifuncionales, ninguno de estos protocolos puede ser aplicado de forma universal a todo tipo de material. La principal limitación para el desarrollo de una estrategia universal de funcionalización o multifuncionalización radica en las grandes diferencias existentes entre la gran variedad actual de materiales micro y nanoestructurados en cuanto a: tamaño, área superficial, densidad de grupos reactivos, forma, estabilidad coloidal, etc. Por ejemplo, en el caso particular de los materiales nanoestructurados, su multi-funcionalización es una tarea para nada trivial, dado que por lo general involucra varias etapas, durante las cuales es indispensable que los mismos se mantengan estables en suspensión. Debido a su tamaño nanométrico, la estabilidad coloidal de estos materiales depende de un delicado balance entre fuerzas de atracción (van der Waals y/o magnéticas) y de repulsión (electrostáticas y/o esféricas). Es así que pequeños cambios en el pH o la fuerza iónica del medio puede llevar a su rápida agregación, lo cual imposibilita la funcionalización de los mismos de forma escalable y reproducible. Dado que este balance de fuerzas es muy distinto para cada tipo de nanopartícula (magnéticas, metálicas, quantum dots, poliméricas, de sílica, de materiales biomiméticos, etc) o material nanoestructurado (nanotubos de carbono, silicio, etc), no existe hasta el momento un protocolo universal de funcionalización o multifuncionalización. Hoy en día, es por lo tanto necesario optimizar distintas estrategias para cada caso en particular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe nuevos materiales multifuncionalizados a los que se han anclado hebras de PNA o ADN sobre las que se hibridan mediante reconocimiento molecular, PNA-PNA, PNA-ADN o ADN-ADN, hebras complementarias de PNA o ADN que a su vez están conjugadas con moléculas activas o bioactivas. Las características estructurales de estos materiales permiten su fabricación a través de un procedimiento universal de multifuncionalización. Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un material multifuncionalizado (de aquí en adelante material multifuncionalizado de la presente invención) que comprende:
a. Un material base que comprende al menos un tipo de cadenas de PNA tipo A y/o ADN tipo A (PNA/ADN-A) unidas a dicho material base; y b. al menos un tipo de cadenas de PNA tipo B y/o ADN tipo B (PNA/ADN-B), complementarias o parcialmente complementarias a las cadenas de PNA/ADN-A, unidas a una biomolécula;
donde las cadenas de PNA/ADN-A se encuentran hibridadas con las cadenas de PNA/ADN-B mediante el reconocimiento molecular PNA-PNA, PNA-ADN o ADN-ADN y donde el material base presenta en su superficie más de una biomolécula diferente unida a, al menos, un tipo de PNA/ADN-B.
En el contexto de la presente invención, la definición de cadenas del tipo PNA/ADN-A o PNA/ADN-B engloba cualquier tipo de cadena de PNA o de ADN sin limitación alguna, siempre y cuando la cadena de PNA/ADN tipo A sea totalmente o parcialmente complementaria a la cadena PNA/ADN tipo B y viceversa.
En el contexto de la presente invención, material funcionalizado se define como aquel material que haya sido modificado en su superficie con moléculas confiriéndole nuevas propiedades y/o funcionalidades.
En el contexto de la presente invención, material multifuncionalizado se define como aquel material que haya sido modificado en su superficie con mas de una molécula diferente (por ejemplo: anticuerpo + enzima; ADN+ antibiótico + marcador fluorescentes, etc).
En el contexto de la presente invención el material base es una biomolécula o un material micro o nanoestructurado, donde el material base microestructurado o microparticulado se define como un material que presenta un diámetro medio mayor de 0, 1 y menor o igual a 1000 pm, preferiblemente entre 0, 1 y 700 pm, más preferiblemente entre 0, 1 y 100 pm y aún más preferiblemente entre 1 y 1000 m. El material base nanoestructurado se define como un material que presenta un diámetro medio entre 0, 1 y 100 nm, preferiblemente entre 1 y 100 nm, más preferiblemente entre 2 y 100 nm.
Ejemplos no limitativos de material base de tipo microparticulado son polímeros orgánicos naturales tales como polisacáridos y proteínas fibrosas, polímeros orgánicos sintéticos tales como poliolefinas y polímeros acrílicos, soportes inorgánicos naturales y sintéticos y palancas de silicio.
Ejemplos no limitativos de material base de tipo nanoestructurado son: nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de carbono, nanopartículas de oro-citrato, nanopartículas de óxidos de metales, nanopartículas superparamagnéticas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de sílica, nanopartículas de silicio, nanopartículas poliméricas, nanotubos de carbono, nanohilos de silicio y polisacáridos, nanopartículas de paladio, dendrímeros, nanopartículas de platino, nanocristales semiconductores, liposomas, o cualquiera de sus combinaciones.
De acuerdo a una realización preferida de la presente invención el material base de tipo nanoestructurado puede estar recubierto por una cubierta orgánica seleccionada entre las siguientes: citrato, aminoácidos naturales y no naturales, polietilenglicoles con grupos terminales amino, tiol hidroxilo o azida, polímeros o polisacáridos y sílica. En una realización especialmente preferida de la presente invención el material base de tipo nanoestructurado es el polímero poli(anhídrido maleico-alt-1 -octadeceno).
El material base de tipo nanoestructurado puede presentar diferentes formas (ej: esféricas, cúbicas, prismas, bastones, tubos, etc) y/o tamaños (0, 1 nm- 100nm) asi como estar compuesto de uno y/o varios materiales (metales nobles o non-nobles, óxidos, magnéticas, carbono, polímeros, semiconductores, látex, sílica, polipéptidos, dendrímeros, etc) dispuestos formando estructuras tipo núcleo-corteza o aleaciones. En el contexto de la presente invención, el término biomolécula se define como moléculas que han podido ser sintetizadas o no por seres vivos y que tienen una estructura basada en átomos de carbono. Además de éste, suelen estar constituidas por átomos de hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y/o azufre, tales como moléculas de reconocimiento biológico, agentes terapéuticos, profármacos, trazadores, péptidos de internalización celular y agentes bloqueantes.
Ejemplos no limitativos de moléculas de reconocimiento biológico son vitaminas, hormonas o péptidos con actividad biológica, dominios extracelulares de receptores de membrana o moléculas de adhesión celular, toxinas, lectinas, enzimas (tales como proteasas, nucleasas o óxido- reductasas}, anticuerpos, minianticuerpos y aptámeros.
Ejemplos no limitativos de biomoleculas son anticuerpos monoclonales y/o policlonales del tipo IgG, IgM, Anti DR, Anti OX-26, Anti TNF-α, pAb anti IgG 22.8, Anti PTX, Anti ratón, Anti cabra, Anti humano o biomoleculas del tipo CD33, CD8, CD4, CD5, CD3, CD14, CD95, CD1 1 , CD56, CD79, IL1 , IL2, IL10, IL4, IL6, TNF alpha, TNF beta, Interferon gamma, VEGF, ICAMM, PSA o hCG
Ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos son fármacos hidrofóbicos, fármacos hidrofílicos, toxinas y radioisótopos. De acuerdo a una realización preferida de la presente invención agentes terapéuticos son antibióticos tales como el cloranfenicol.
Ejemplos no limitativos de trazadores son marcadores fluorescentes (FITC, cadaverina, fluoresceina... }, agentes de contraste de resonancia magnética y radioisótopos.
Ejemplos no limitativos de péptidos son péptidos de internalización celular es decir aquellos que presentan menos de 30 aminoácidos y son anfifílicos o con carga neta positiva. Ejemplos no limitativos de agentes bloqueantes serían polietilenglicoles y azúcares tales como mono y polisacaridos.
Otros ejemplos de biomoleculas son macadores tumorales tales como CEA, PSA, AFP o ácido fólico, lípidos como el colesterol, fagos, ácidos nucleicos, lectinas e hidratos de carbono tales como glucosa o ciclodextrina.
La multifuncionalización de los materiales de la invención comprende la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o ácido desoxirribonucleico (ADN) de tipo A, unidos previamente mediante enlace covalente a la superficie de un material base, con otras secuencias complementanas de PNA o ADN de tipo B Las cadenas complementarias están unidas a las biomoleculas de interés. La complementahedad de ambas cadenas (PNA_A o ADN_A con PNA_B o ADN_B) a través del reconocimiento molecular PNA-PNA, ADN-ADN o PNA-ADN, origina la conjugación de las moléculas bioactivas a la superficie del material base, en un proceso al que se ha denominado NIT-zipper (Figura 1 ).
La ventaja que presentan los nuevos materiales multifuncionalizados de la presente invención es que sus características conformacionales permite su fabricación a través de un procedimiento especialmente ventajoso por las siguientes razones:
1 - Este procedimiento permite generar partículas multifuncionales independizándose de las grandes diferencias existentes entre la gran variedad actual de materiales micro y nanoestructurados en cuanto a tamaño, área superficial, densidad de grupos reactivos, forma, estabilidad coloidal, etc.
2- Además de permitir independizarse de la heterogeneidad en cuanto al material a funcionalizar también permite independizarse de buscar la estrategia más adecuada para unir de forma activa cada una de las biomoléculas de interés. Independientemente del tipo de biomolécula la presente invención asegura la unión de vahas biomoléculas de forma activa y en un único paso. 3- Si bien la estrategia propuesta puede llevarse acabo utilizando cadenas complementarias de ADN, el hecho de utilizar cadenas de PNA presenta varias ventajas:
- Dada la estructura de su esqueleto peptidomimético artificial, el PNA no es sensible a la acción de enzimas biodegradadoras naturales como DNasas, RNasas o proteasas, por lo que su estabilidad biológica es mucho mayor que la del ADN.
- El esqueleto de la molécula de PNA no contiene grupos fosfato y por lo tanto la unión entre hebras PNA/PNA y PNA/ADN es mucho más fuerte que entre hebras ADN/ADN dado que no existe repulsión electrostática. Esto tiene como consecuencia que para una misma secuencia nucleotídica la Tm sea mucho mayor en el caso de una doble hélice PNA/PNA o PNA/ADN que ADN/ADN. Por lo que secuencias más cortas de PNA permiten tener doble hebras más resistentes a la deshibridación con la temperatura. Finalmente, la insensibilidad del PNA a las variaciones de pH o de fuerza iónica hacen que posea también mucha mayor estabilidad química y permite que la estrategia propuesta pueda ser utilizada para funcionalizar nanopartículas que van a ser usadas en medios con composición compleja (sangre, suero, orina, saliva, lisados celulares, medios con alta salinidad o pHs extremos, etc).
- Por último la eficiencia de hibridación es mucho mayor cuando se utilizan hebras de PNA que de ADN (F Xu, A M. Pellino, W Knoll, Thin Solid Films 516 (2008) 8634-8639). La eficiencia y la cinética de hibridación de dos hebras de ADN en solución no sólo depende de la complementariedad de las secuencias sino también de la fuerza iónica del tampón, la temperatura, el pH, el largo de la secuencia, la relación entre el número de G-C (guaninas-citosina) y A-T (adeninas-timinas), etc. En el caso de que una de las secuencias esté inmovilizada se suman a los factores mencionados efectos superficiales como son: el impedimento estérico, la repulsión electrostática, tasas de difusión de la solución a la inferíase solución-superficie del soporte, restricciones por orientación, etc. Al eliminar el efecto de repulsión, la hibridación de cadenas complementarias de PNA es sensiblemente mejor que en el caso de cadenas de ADN.
Por lo tanto un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de materiales funcionalizados o preferiblemente multifuncionalizados (de aquí en adelante procedimiento de la invención) que comprende las siguientes etapas: a) activación química de grupos funcionales presentes en un material base; b) la reacción entre al menos un grupo amino o carboxilo terminal de una cadena de PNA tipo A o un grupo amino o tiol de una cadena de ADN tipo A y al menos un grupo funcional activado del material base obtenido en la etapa
(a); c) la conjugación de una cadena de PNA/ADN tipo B, complementana a la cadena PNA/ADN tipo A, a una biomolecula mediante activación química de grupos funcionales; y d) la hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A, que están unidas al material base según la etapa b) y las cadenas de PNA/ADN tipo B que tienen unidas biomoléculas según la etapa c) mediante reconocimiento molecular PNA-PNA, ADN -ADN o PNA-ADN.
Esta novedosa estrategia de funcionalización y multifuncionalización de materiales permite independizarse de tener que seleccionar el método de unión más adecuado dependiendo de cada biomolecula a unir.
Una de las etapas claves de este procedimiento universal de funcionalización o multifuncionalización es la etapa d). Para llevar a cabo dicha etapa se pueden utilizar tampones de hibridación que incluyen pero no están limitados a, fosfato, citrato, Tris, Hepes (ácido 4-(2-hidrox¡et¡l)-1 -p¡peraz¡naetanosulfónico), TAPS (ácido N-Tris(h¡drox¡met¡l)met¡l-3-am¡nopropanosulfón¡co), MOPS (ácido 3-(N- morfolin)propanosulfónico), PIPES (ácido Piperazino-1 ,4-bis(2-etanosulfónico), MES (ácido 2-(N-morfolino)ethanosulfónico) tampones, hipersolutos (por ejemplo, manosilglicerato) o cualquier otra solución tamponante conteniendo o no, agentes desnaturalizantes, sales, polímeros inertes, surfactantes entre otros. El pH de la solución deberá estar preferiblemente comprendido entre 5 y 9 y la concentración de sal (NaCI, MgCI2, NÍCI2, NaBr, ZnCI2, MnCI2, BrCI, CaCI2, KCI, AgCI, LiBr, KBr, AgBr, u otras) deberá estar preferiblemente en el rango comprendido entre 1 mM y 1 M.
Adicionalmente, en la etapa d), es preferible que la reacción de hibridación se realice a temperaturas preferentemente inferiores a la temperatura de fusión (Tm) más aun para la fabricación de un material multifuncional (Figura 1 ). De manera preferida la Tm está dentro del intervalo de 25 a 80°C ambos valores inclusive.
Adicionalmente para llevar a cabo el proceso de la presente invención es preferible el uso de secuencias específicas de PNA/ADN para evitar la formación de hibridaciones dentro de la propia secuencia de PNA/ADN o interacciones secundarias con otras moléculas de PNA/ADN como por ejemplo, secuencias complementarias presentes en sistemas celulares. Para ello, el diseño de las secuencias debe evitar hibridaciones intra e inter moleculares (tales como tallo-bucle e hibridaciones entre PNA/ADN para una misma secuencia, respectivamente) y evitar preferiblemente secuencias que forman parte de secuencias genómicas conocidas (tales como genoma humano, que serviría para evitar problemas en los casos en los que se use los conjugados resultantes para terapia o diagnóstico en humanos.) La longitud de las secuencias de reconocimiento deberían ser, preferiblemente, entre 10 y 25 nucleótidos y con un contenido de %GC (guanina y citosina) superior al 50%. Con el objeto de realizar la multifuncionalización de un material base teniendo un control estequiométrico de las moléculas a conjugar, es preferible utilizar una o más cadenas de PNA/ADN diferentes (secuencia, longitud, espaciadores, etc). Por otro lado, el uso de diferentes cadenas podría permitir la liberación selectiva de una o varias biomoléculas, por ejemplo, usando linkers que están entre las biomoléculas/material base y las cadenas de PNA/ADN y que sean lábiles frente a distintos agentes físico-químicos (luz, pH, temperatura, enzimas, agentes reductores, etc).
Adicionalmente, la densidad de las moléculas de PNA/ADN tipo A con las que se funcionalizan los materiales base se haya preferiblemente entre un 40% y un 60% de la superficie total de recubrimiento.
Para poder contar con la máxima libertad de elección a la hora de seleccionar la combinación de biomoléculas más adecuada, es necesario preparar una batería muy amplia de conjugados PNA/ADN_B-biomolécula. A la hora de sintetizar estos conjugados, es clave que al modificar la biomolécula con la molécula de PNA/ADN_B, su sitio activo quede libre para que pueda realizar su función biológica una vez modificada.
Con respecto a los grupos funcionales a activar, presentes en el material base, se seleccionan entre grupos hidroxilos, carboxilos, carbonilos, armiños, tioles, azidas o alquinos.
Dicha activación de los grupos funcionales se puede llevar a cabo y sin sentido limitativo mediante un reactivo seleccionado entre carbodiimida, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, bromuro de cianógeno, epóxidos, N- hidroxisuccinimida, sulfo-N- hidroxisuccinimida. De manera más preferida, el reactivo se selecciona entre 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), N- hidroxisuccinimida (NHS), Sulfo-NHS, EDC, 2-(1 H-7-Azabenzotr¡azol-1 -¡l)- 1 , 1 ,3,3-tetrametil uronio hexafluorofosfato metanominio (HATU), 1 , 1 - carbonildiimidazol (CDI) o cualquiera de sus combinaciones. De manera aún más preferida el reactivo que se utiliza es una combinación de NHS y EDC o Sulfo-NHS y EDC.
En una realización preferida, el material base es de tipo microparticulado.
Según otra realización preferida, los materiales base de tipo microparticulado se seleccionan entre: polímeros orgánicos naturales, polímeros orgánicos sintéticos, soportes inorgánicos y palancas de silicio (cantilevers de silicio).
Según una realización preferida, los polímeros orgánicos naturales se seleccionan del grupo formado por polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, quitosano, etc) y proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc).
Según otra realización preferida, los polímeros orgánicos sintéticos se seleccionan del grupo formado por poliolefinas (como el poliestireno), polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.), polímeros polivinílicos (alcohol polivinílico, etc.), poliamidas, etc.
Según otra realización preferida, los soportes inorgánicos se seleccionan del grupo formado soportes inorgánicos naturales (arcillas, sílice, etc) o sintéticos (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc).
Según una realización preferida, el material base microparticulado tiene un tamaño de diámetro medio mayor de 0, 1 y menor o igual a 1000 pm, aun mas preferiblemente entre 1 y 100 pm.
Según otra realización preferida, el material base es de tipo nanoestructurado.
Según otra realización preferida, los materiales base nanoestructurados se seleccionan entre: nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de carbono, nanopartículas de oro-citrato, nanopartículas de óxidos de metales, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de sílica, nanopartículas de silicio, nanopartículas poliméricas (dextrano, polilisina, etc ), nanotubos de carbono, nanohilos de silicio, nanopartículas de paladio, dendrímeros, nanopartículas de platino, nanocristales semiconductores, liposomas o cualquiera de sus combinaciones.
Según una realización preferida, el material base nanoparticulado tiene un tamaño de diámetro medio de entre 2 y 100 nm.
Según otra realización preferida, cuando el material base nanoestructurado, está recubierto por una cubierta orgánica, seleccionada entre citrato, aminoácidos naturales y no naturales, polietilenglicoles con distintos grupos terminales (amino, tiol hidroxilo, azida, ... ), polímeros, polisacáridos o silica.
Según otra realización preferida, si la cubierta orgánica es un polímero, este es el poli(anhídrido maleico-alt-1 -octadeceno).
Según otra realización preferida, el material base es de tipo biomoléculas.
Según otra realización preferida, las biomoléculas que se conjugan con las cadenas PNA/ADN tipo A o B, se seleccionan entre moléculas de reconocimiento biológico, agentes terapéuticos, pro-fármacos, trazadores, péptidos de internalización celular, agentes bloqueantes.
Según otra realización preferida, las moléculas de reconocimiento biológico se seleccionan entre vitaminas, hormonas o péptidos con actividad biológica, dominios extracelulares de receptores de membrana o moléculas de adhesión celular, toxinas, lectinas, enzimas, anticuerpos, minianticuerpos y aptámeros.
En el caso de las vitaminas, hormonas o péptidos con actividad biológica, dado que la expresión de muchos receptores de estas moléculas con actividad biológica se encuentra alterada en ciertos tipos de enfermedades, la funcionalización del material con una vitamina, péptido u hormona específica puede ser de gran utilidad para la detección o terapia de esa enfermedad en particular (cáncer, esquizofrenia, arteriosclerosis, etc) (J Sudimack, RJ. Lee, Advanced Drug Delivery Reviews 2000, 4, 147-162; A Zvara, G Szekeres, Z Janka, JZ Kelemen, C Cimmer, M Sántha, LG Puskás Dis Markers (2005) 21: 61-9.Burtea C, Laurent S, Lancelot E, Ballet S, Murariu O, Rousseaux O, Port M, Elst LV, Corot C, Muller RN, Mol. Pharm. 2009, 6 (6): 1903-1919 Petros RA, DeSimone JM, Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9 (8), 615-627; RB Huang, S Mocherla, MJ Heslinga, P Charopenphol, O Eniola-Adefeso, Molecular Membrane Biology 2010, 27(7), 312-327; Johansson EMV, Dubois J , Darbre, Reymond JL, Bioorg. Med. Chem. 2010, 18 (17), 6589-6597). Dependiendo de la estructura de la hormona, vitamina o péptido de interés, se utiliza un grupo químico lo más alejado posible de la zona de actividad biológica (amino, tiol, carboxilo, hidroxilo, imidazol, etc) para hacerlo reaccionar covalentemente con el grupo amino o carboxilo terminal de la molécula de PNA/ADN, mediante química de activación con carbodiimida.
Por ejemplo en el caso particular del ácido fólico, la unión covalente se hace entre el grupo γ-carboxílico del glutamato presente en su estructura y el grupo amino terminal de la cadena de PNA o ADN-B, mediante su activación previa con N-hidroxisuccinimida (NHS), sulfo-NHS o carbodimida. Se elige este grupo en particular porque ya ha sido demostrado que su modificación no provoca una pérdida significativa en la afinidad por su receptor (S Wang, RJ Lee, CJ Mathias, MA Green, PS, Imaging Bioconjugate Chem. 1996, 7, 56-62; P Caliceti, S Salmaso, A Semenzato, T Carofiglio, R Fornasier, M Fermeglia, Marco Ferrone, Sabrina Pricl, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 899-908; Salmaso S, Bersani S, Semenzato A, Caliceti P J. Drug Target. 2007, 15 (6), 379-390 F Canal, MJ. Vicent, G Pasut, O Schiavon, conjugates Journal of Controlled Reléase 146 (2010) 388-399; BK Biswal, NB Debata, RS Verma, Polymers 2010, 2, 86-101 ).
En el caso de dominios extracelulares de receptores de membrana o moléculas de adhesión celular, la funcionalización de materiales con dominios extracelulares de receptores de membrana es de sumo interés para el desarrollo de biosensores (TL Hoffman, G Canziani, L Jia, J Rucker, RW Doms, PNAS 2000, 97 (21), 11215-11220; Vidic J, Pla-Roca M, Grosclaude J, Persuy MA, Monnerie R, Caballero D, Errachid A, Hou Y, Jaffrezic-Renault N, Salesse R, Pajot-Augy E, Samitier J., Anal Chem. 2007 May 1;79(9):3280-90 ; Lee SH, Park TH, Biotechnol. Bioprocess Eng. 2010, 15 (1): 22-29). En el caso de moléculas de adhesión celular, es sabido que su expresión cambia en ciertos tipos de enfermedades (cáncer, enfermedades neurodegenerativas, etc) por lo que su uso en la funcionalización tanto de materiales micro como nanoestructurados puede ser de gran utilidad para la detección o terapia (H Peinado, F Portillo, A Cano, Int. J. Dev. Biol. 2004, 48, 365-375; Arikkath, J, Reichardt, LF, Trends in Neurosciences, 31(9):487-94; Jeanes et al, Oncogene 2008, 27, 6920-6929; JM. Benjamín, WJ Nelson, Seminars in Cáncer Biology 2008, 18, 53-64; Bryan RT, Tselepis C, J. Urol. 2010, 184 (2): 423-431). Dado que los dominios extracelulares tanto en el caso de los receptores de membrana como en las moléculas de adhesión celular se obtienen por técnicas de biología molecular, cuentan con una cola de polihistidina como etiqueta en su extremo amino o carboxilo terminal. Por lo tanto, la unión de la cadena de PNA o ADN a través de esta etiqueta asegura la correcta orientación de la biomolécula sobre el material. Esta unión se realiza entre un grupo imidazol de uno de los residuos de histidina con el grupo carboxilo o amino terminal de la molécula de PNA o con el grupo amino o tiol en el caso de las moléculas de ADN, por medio de la química de activación con carbodiimida.
En el caso de toxinas, el uso de fragmentos de toxinas, toxinas mutantes o recombinantes no tóxicas en la funcionalización de materiales puede ser de utilidad para una vectorización selectiva en terapia. En literatura se pueden encontrar ejemplos de su uso como biomoléculas vectorizadoras en terapias dirigidas a neuronas del sistema nervioso central, a células infectadas con el virus del VIH, etc (Goldstein H, Pettoello-Mantovani M, Bera TK, Pastan IH, Berger EA, J Infect Dis. 2000 Mar; 181(3):921-6; Pieter J. Gaillarda, Arjen Brinka, Albertus G. de Boerb . International Congress Series Volume 1277, April 2005, Pages 185-198; SA Townsend GD Evrony, FX. Gu, MP Schulze, RH Brown Jr, RS Langer, Biomaterials 2007 , 28(34), 5176-5184; Peng Zhang, Radharaman Ray, Bal Ram Singh, Dan Li, Michael Adler, Prabhati Ray Pharmacoiogy 2009, 9: 12), en terapias de tumores (A Bouter, B Delord, E Dransart, C Poirier, L Johannes, D van Eff enterre, Biol. Cell 2008, 100, 717- 725; Viel T, Dransart E, Nemati F, Henry E, Theze B, Decaudin D, Lewandowski D, Boisgard R, Johannes L, Tavitian B, Mol. Imaging 2008, 7 (6): 239-247; Johannes L, Romer W, Nat. Rev. Microbiol. 2010 8 (2): 105-116). Dependiendo de la estructura del fragmento de toxina o la toxina muíante se utiliza un grupo químico lo más alejado posible de la zona de actividad biológica (amino, tiol, carboxilo, hidroxilo, imidazol, etc) para hacerlo reaccionar covalentemente con el grupo amino o carboxilo terminal en el caso de la molécula de PNA y amino o tiol en el caso de la molécula de ADN, mediante la química más adecuada (activación con carbodimida, epoxidación, bromuro de cianógeno, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc). En el caso de tratarse de una toxina recombinante, si cuenta con una cola de polihistidina como etiqueta en su extremo amino o carboxilo terminal, esta unión se realiza a través de uno de los residuos de histidina con el grupo carboxilo o amino terminal de la molécula de PNA y amino o tiol en el caso de la molécula de ADN por medio de la química activación con carbodiimida.
En el caso de las lectinas éstas son un grupo de proteínas que se unen de manera selectiva y reversible a distintos sacáridos. Tienen muchas aplicaciones en el ámbito de biosensores desde la detección de analitos glicosilados hasta la detección de alteraciones en la expresión de moléculas glicosiladas presentes en la superficie celular (La Belle et al, Trends Neurosci. 2008 31(9): 487-494; Sakuma et al, Journal of Controlled Reléase 2009, 134, 2-10; Xiea et al, Biosensors and Bioelectronics 2009, 24, 1311-1317). Dado que presentan al menos dos sitios de unión a carbohidratos, cualquier protocolo de unión permite obtener materiales funcionalizados con actividad biológica. Como no es necesario un protocolo de unión orientada, la unión de la cadena de PNA o ADN se realiza a través de grupos amino presentes en la superficie de la lectinas de interés. El motivo de esta elección se basa en que al ser un grupo polar se encuentra usualmente expuesto en la superficie proteica y es uno de los grupos más abundantes en la superficie de las proteínas {Guisan JM, Enzyme Microb. Technol. 10, 375-382). Cuando éstos no se encuentran protonados son muy reactivos como agentes nucleofílicos, por lo que es posible su unión covalente con el grupo carboxilo o amino terminal previamente activado con química adecuada carbodiimida.
En el caso de las enzimas, la funcionalización de materiales con estas moléculas es de sumo interés tanto para su uso en detección como en procesos biotecnológicos (producción de compuestos químicos, biotransformación de alimentos, etc). Dependiendo del tamaño del sustrato a transformar por la enzima es más o menos crítico que zonas cercanas a su sitio activo se vean involucradas en su unión a un soporte. Por lo que dependiendo de la enzima de interés, se tiene que elegir el grupo químico de su superficie más adecuado (tiol, amino, hidroxilo, carboxilo, imidazol, carbohidrato, etc) para introducir la cadena de PNA o ADN
En el caso de anticuerpos (Ab). Son muy selectivos y específicos, y actualmente es posible obtener anticuerpos monoclonales de prácticamente cualquier molécula con independencia de su tamaño. Esto hace que sean muy utilizados para introducir al material la especificidad necesaria para su uso en detección o en terapia. La preparación del conjugado Ab-PNA o ADN se realiza por medio de la oxidación con periodato de las cadenas de carbohidratos del anticuerpo para así poder proceder a la incorporación de la cadena de PNA/ADN a través de su extremo amino terminal (S Puertas, M Moros, R Pacheco Fernández, MR ¡barra, V Grazú, JM de la Fuente, Journal of Physiscs-D (Applied Physics) 2010, 43(47) Art No 474012; M. Fuentes, C. Mateo, J. M. Guisan, R. Fernandez-Lafuente, Biosens. Bioelectron. 2005, 20(7), 1380-1387). Esto asegura la correcta orientación del Ab una vez unido al material ya que las cadenas de azúcares se encuentran localizadas en la zona Fe del anticuerpo, lejos de la zona de reconocimiento del antígeno.
En el caso de minianticuerpos, si el material micro o nanoestructurado a funcionalizar se va a utilizar en terapia o diagnóstico in vivo, el hecho de usar anticuerpos para su funcionalización puede llegar a limitar sus aplicaciones por problemas de inmunogenecidad inherente o problemas de difusión a través de las barreras biológicas o hacia el interior de la masa neoplásica de tumores. En estos casos el uso de biomoléculas de menor tamaño, como son los minianticuerpos, es una posible solución. Los minianticuerpos son fragmentos derivados de anticuerpos construidos por tecnología de ADN recombinante, y que, pese a su menor tamaño, conservan la capacidad de unión al antígeno ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina. Al obtenerse por técnicas de biología molecular, cuentan con una cola de polihistidina como etiqueta en su extremo amino o carboxilo terminal la cual puede usarse para unir la cadena de PNA o en su extremo amino o tiol en el caso de la ADN y así asegurar una unión orientada del mismo.
Los aptámeros son moléculas que por su tamaño pequeño y su baja inmunogenecidad pueden sustituir a los anticuerpos en ciertas aplicaciones. Los aptámeros son ácidos nucleicos de una sola cadena que tienen formas tridimensionales bien definidas lo cual les permite unirse a la molécula objetivo en una forma similar que los anticuerpos. Los aptámeros combinan las características óptimas de las moléculas pequeñas (inmunogenicidad baja, difusión alta, etc) y de los anticuerpos (alta especificidad y afinidad y estabilidad química) Otra ventaja con respecto a los anticuerpos monoclonales, es que son sintetizados químicamente en lugar de ser expresados biológicamente, lo cual ofrece una ventaja significativa en cuanto a costo y permite introducir en el extremo alejado a la zona de reconocimiento biológico grupos funcionales que permitan la unión de la molécula de PNA o ADN. La molécula de PNA o ADN se une covalentemente por medio de la química más adecuada (activación con carbodimida, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc), dependiendo del grupo químico terminal introducido en el aptámero (fosfato, carboxilo, amino, tiol, etc).
Según otra realización preferida, los agentes terapéuticos se seleccionan entre fármacos hidrofóbicos, fármacos hidrofílicos, toxinas y radioisótopos. Fármaco hidrofóbico. En el caso de unir una droga hidrofobica, se conjugará a ciclodextrinas para evitar así modificaciones químicas del fármaco que reduzcan su actividad terapéutica, y mejorar su estabilidad. Las ciclodextrinas se anclan a su vez al material a través de una cadena de PNA o ADN.
El conjugado ciclodextrina-PNA o ADN se obtiene por medio de la activación de uno de los hidroxilos en posición 6 de la ciclodextrina siguiendo química clásica de ciclodextrinas (Stephen Hanessian, Aziza Benalil, Craig Laferriere J. Org. Chem., 1995, 60, 4786; Furusaki E.; Ueno Y.; Sakairi N. 1; Nishi N.; Tokura S Carbohydr. Polymers, 1996, 29,29; Ning Zhong, Hoe-Sup Byun and Robert Bittman Tetrahedron Lett., 1998, 39, 2919; M. Prabaharan, J.F. Mano Carbohydr. Polymers, 2006, 63, 153), para proceder a la posterior incorporación del PNA o ADN por su extremo amino terminal. Dependiendo del tamaño del fármaco a unir se utiliza la ciclodextrina que forme mejores complejos de inclusión con el fármaco: α-, β- o γ-ciclodextrina. Si fuese necesario es posible mejorar las constantes de unión alcanzada entre el fármaco y los distintos conjugados ciclodextrina-PNA o ADN, mediante la modificación hidrofobica de los OH primarios a la vez que se introduce el PNA o ADN (Yamanoi T, Yoshida N, Oda Y, Akaike E, Tsutsumida M, Kobayashi N, Osumi K, Yamamoto K, Fujita K, Takahashi K, Hattori K Bioorg. Med. Chem. Lett, 2005, 15, 1009).
Fármaco hidrofílico. Si el fármaco es demasiado hidrofílico como para no poder ser conjugado en una ciclodextrina, se ancla directamente a la cadena de PNA o ADN. Dependiendo de la estructura del fármaco se utiliza o se introduce por modificación química el grupo más adecuado (carboxilo, amino, tiol, imidazol, hidroxilo, etc) para poder realizar la unión a través de la química convencional más apropiada (activación con carbodimida, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc).
Si fuese necesaria la liberación del fármaco una vez alcanzada la célula diana, se introduce un espaciador con un enlace sensible al pH ácido de los endosomas o lisosomas del citoplasma celular (hidrazina, etc), o con grupos sensibles a enzimas (grupo disulfuro, éster, secuencia peptídica, etc) (Reum et al, 2010 Polymers 2010, 2, 86-101).
Toxina. Si bien las toxinas no tóxicas o inactivas son utilizadas como biomoléculas vectorizadoras, las toxinas pueden ser utilizadas como fármacos {Spooner and Watson, Curr. Opin. Drug. Discov. Dev 2010, 13(1), 86-95). Debido a su alta toxicidad no selectiva su uso está prohibido si no es a través de su vectorización selectiva. Es así que en la literatura se pueden encontrar varios ejemplos de vectorización selectiva de toxinas para el tratamiento de cáncer {Debinski, Drug Develop Res 2008 69(7), 407-414; S Pótala, SK Sahoo, RS yerma, Drug Discovery Today 2008, 13(17/18), 807-815; S Oh, BJ Stish, SM Vickers, DJ Buchsbaum, AK Saluja, DA V Altera, Páncreas 2010, 39(6), 913-922), inhibición de infecciones virales (A Fabbri, S Travaglione, L Falzano, C Fiorentini, Curr. Med. Chem.2008, 15 (11), 1116-1125), tratamiento de infecciones inflamatorias (PS Low, WA Henne, DD Doorneweerd, Accounts Chem. Res. 2008, 41 (1): 120-129), etc. Una técnica muy extendida para dirigir las toxinas de forma específica a la célula enferma es a través de la obtención de inmunotoxinas: moléculas híbridas formadas por la unión de una toxina y un anticuerpo (Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 2010, 12 (2), 176-183; Mathew and \/erma, Cáncer Sci 2009 100 (8), 1359-1365). Si bien esta es una técnica bastante extendida, tiene el inconveniente de poder generar inmunogenicidad en el paciente. Es así que el uso de nanopartículas como plataformas multifuncionales para lograr la vectorización selectiva de toxinas se presenta como una alternativa muy prometedora (Zhou ZX, Shen YQ, Tang JB, Fan MH, Van Kirk EA, Murdoch WJ, Radosz, M, Adv. Funct. Mater. 2009, 19 (22), 3580- 3589).
Para obtener nanopartículas funcionalizadas con toxina según la estrategia propuesta es necesario anclar la toxina a la cadena de PNA o ADN. La química a utilizar depende de la estructura del fragmento de toxina. Se utiliza un grupo químico lo más alejado posible de la zona de actividad biológica (amino, tiol, carboxilo, hidroxilo, imidazol, etc) para hacerlo reaccionar covalentemente con el grupo amino o carboxilo terminal de la molécula de PNA y amino o tiol en el caso de la molécula de ADN, mediante la química más adecuada (activación con carbodimida, epoxidación, bromuro de cianógeno, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc).
Radiosisótopos. Actualmente pacientes con ciertos tumores están siendo tratados con bajas dosis de radioisótopos (iodo-125, paladio-103, oro-198, 99mTc, Ga-68, Cu-64, etc). Es sabido que esta estrategia causa síntomas posttratamiento que van desde efectos secundarios molestos hasta complicaciones clínicas severas. El uso de nanopartículas para liberación sitio específica de estos radioisótopos permitiría poder evitar estos efectos secundarios (Chanda et al, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2010, 6, 201- 209).
En la literatura existen varios ejemplos de moléculas orgánicas con capacidad de quelar radioisótopos: EDTA (ácido etliendiaminotetraacético), DOTA (1 ,4,7, 10-tetraazaciclo dodecan-1 ,4,7, 10-ácido tetraacetico), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), NOTA (1 ,4,7-triazaciclononano-1 ,4,7-ácido triacético), etc (Chong et al Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17 (22), 6107-61 10; Tripathi et al, Journal of Cáncer Research and Therapeutics 2009, 5(3), 148- 153; Ferreira et al, Bioconjugate Chem. 201 0, 21 , 531 -536). Por lo tanto la conjugación de derivados armiñados de estos agentes quelantes al carboxilo o amino terminal de la cadena de PNA o al grupo amino o tiol en el caso de la molécula de ADN permite funcionalizar las nanopartículas con estos radioisótopos empleando química convencional (activación con carbodimida, epoxidación, bromuro de cianógeno, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc).
Según otra realización preferida, los trazadores se seleccionan entre marcadores fluorescentes, agentes de contraste de resonancia magnética y radioisótopos.
Las nanopartículas también han irrumpido en el ámbito del diagnóstico para ser utilizadas en el desarrollo de sistemas de análisis y de imagen para la detección de enfermedades en los estadios más tempranos posibles de las mismas, tanto in vivo {Pysz et al, Clin. Radiol. 2010, 65 (7), 500-516). Existen muchos ejemplos en literatura de su uso para el diagnóstico precoz de cáncer, arteriosclerosis, enfermedades neurodegenerativas, etc (van Schooneveld et al, Mol. Imaging 2010, 5 (4), 231-236; Kim et al, ACS NANO, 2010, 4 (7), 3689- 3696; Chou et al, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132 (38), 13270-13278). En el caso de nanopartículas magnéticas sus propiedades superparamagnéticas permiten su uso como agentes de contraste para el mareaje y diagnóstico mediante Resonancia Magnética de Imagen (RMI). Sin embargo, en el caso de nanopartículas que no sean superparamagnéticas es necesario funcionalizarlas con algún trazador (marcador fluorescente, radioisótopos, etc) para usarlas en diagnóstico.
La estrategia planteada permite funcionalizar nanopartículas con un único trazador o múltiples trazadores en una única etapa. Esto permite diseñar agentes de contraste llamados todo-en-uno, que sirven a la vez para varias técnicas médicas: resonancia magnética de imagen (RMI), tomografía fluorescente, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía de emisión de fotón único (SPECT), tomografía axial computarizada (TAC), etc.
Marcador fluorescente. La molécula de PNA o ADN se une covalentemente al marcador flurorescente por medio de la química más adecuada (activación con carbodiimida, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc), dependiendo del grupo químico presente en el fluoróforo (carboxilo, amino, tiol, hidroxilo, etc).
Agente de contraste de resonancia magnética y radioisótopos. Varios radioisótopos y agentes de contraste de resonancia magnética son quelados por una gran variedad de moléculas orgánicas (EDTA, DOTA, DTPA, NOTA, etc). Por lo tanto la conjugación de derivados armiñados de estos agentes quelantes al carboxilo o amino terminal de la cadena de PNA o al grupo amino o tiol en el caso de la molécula de ADN permite funcionalizar las NPs con estos radioisótopos o agentes de contraste. La obtención del conjugado PNA o ADN- quelante se lleva a cabo mediante el uso de química convencional (activación con carbodimida, epoxidación, bromuro de cianógeno, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc).
Según otra realización preferida los péptidos de internalización celular se seleccionan entre aquellos que tienen menos de 30 aminoácidos y bien son anfifílicos o con carga neta positiva, por ejemplo y sin sentido limitativo, TAT, penetrina...
En muchas ocasiones es necesario que las nanopartículas una vez alcanzada la célula diana puedan llegar a su citoplasma o núcleo. Para esto es necesario evitar su endocitosis, lo cual puede lograse mediante la funcionalización de los llamados péptidos de internalización celular (de la Fuente et al, Bioconjugate Chemistry 16, 5, 1 176-1 180). Hoy en día existen numerosos ejemplos de este tipo de péptidos, los cuales por lo general son péptidos de menos de 30 aminoácidos y bien son amfifílicos o tienen una carga neta positiva. Algunos ejemplos conocidos son: TAT, penetratina, etc.
Dependiendo de la estructura del péptido se utiliza un grupo químico lo más alejado posible de la zona de actividad biológica (amino, tiol, carboxilo, hidroxilo, imidazol, etc) para hacerlo reaccionar covalentemente con el grupo amino o carboxilo terminal de la molécula de PNA o con el grupo amino o tiol en el caso de la molécula de ADN mediante química convencional (activación con carbodimida, epoxidación, bromuro de cianógeno, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc).
Según otra realización preferida, los agentes bloqueantes se seleccionan entre polietilenglicoles y azúcares.
Los grupos funcionales de la superficie de las nanopartículas no usados para anclar biomoléculas deben ser enmascarados (inertización de la superficie) para evitar así la adsorción inespecífica de proteínas. Una inertización no adecuada puede afectar a los límites de sensibilidad alcanzados en nanodiagnosis. A su vez, si las nanopartículas van a ser inyectadas de forma intravenosa, la adsorción inespecífica de proteínas plasmáticas haría que las mismas sean reconocidas por células del sistema fagocítico mononuclear y por lo tanto eliminadas del torrente sanguíneo antes que cumplan la función terapéutica para la cual fueron diseñadas.
Los agentes bloqueantes tienen que ser neutros e hidrofílicos, es así que entre los más utilizados se encuentran: polietilenglicoles y azúcares de distinto tamaño (Moros et al, Nanoscale 2010, 2(9), 1746-1755; Liu et al, Curr. Nanosci. 2010, 6 (4), 347-354 Petros and DeSimone, Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9 (8), 615-627; Romberg et al, Pharm. Res.2008, 25(1), 55-71)
Derivados armiñados de polietilenglicoles, monosacáridos, disacáridos etc se conjugan covalentemente al grupo amino o carboxilo terminal de la molécula de PNA, o con el grupo amino o tiol en el caso de la molécula de ADN mediante química convencional (activación con carbodimida, epoxidación, bromuro de cianógeno, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, etc).
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al material funcionalizado obtenible por el procedimiento de la invención.
Aún otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del material funcionalizado para la detección de biomoléculas in vitro como por ejemplo un biochip, un biosensor de formato en soluble o anclado a una superficie, sistemas de separación basados en partículas magnéticas, sistemas de separación basados en partículas de metales nobles, columnas de purificación, microarrays, agentes de contraste basados en nanopartículas magnéticas o radioisótopos. Según una realización preferida las biomoléculas son proteínas, péptidos, vitaminas o ácidos nucleicos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del material funcionalizado para la elaboración de un medicamento donde el medicamento es para la liberación dirigida de fármacos. De manera preferida, el fármaco es un radiosótopo, seleccionado entre iodo-125, paladio-103, oro-198, Te, Ga- 68 ó Cu-64 o un citotóxico, preferiblemente la doxorrubicina.
Una realización preferida de la presente invención se refiere al uso del material funcionalizado para su uso como catalizadores industriales en procesos de química sostenible: química fina y farmacéutica, biocombustibles, química de alimentos, química analítica, etc.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o veterinaria que comprende el material funcionalizado.
En la presente invención el término "composición farmacéutica o veterinaria" se refiere a un conjunto de componentes que está formada al menos por el extracto de la invención, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud, por ejemplo una aplicación cosmética, aunque puede no implicar un efecto fisiológico en el organismo sino una mejora en el bienestar del sujeto relacionada con su psicología. Por tanto, dicha composición farmacéutica puede ser un producto de higiene personal, un producto cosmético o un producto que puede constituir la base para la elaboración de los productos anteriores o la base para la elaboración de un medicamento.
El "producto de higiene personal" se define como las sustancias o preparados que, sin tener la consideración legal de medicamentos, productos sanitarios, cosméticos o biocidas, están destinados a ser aplicados sobre la piel, dientes o mucosas del cuerpo humano con finalidad de higiene o de estética, o para neutralizar o eliminar ectoparásitos.
El "producto cosmético" se define como toda sustancia o preparado destinado a ser puesto en contacto con las diversas partes superficiales del cuerpo humano (epidermis, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos) o con los dientes y las mucosas bucales, con el fin exclusivo o principal de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto, y/o corregir los olores corporales, y/o protegerlos o mantenerlos en buen estado.
El término "medicamento" tiene un significado más limitado que el significado de "composición farmacéutica", tal como se define en la presente invención, ya que el medicamento implica necesariamente un efecto terapéutico es decir, un efecto fisiológico en el metabolismo del sujeto.
El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades en seres humanos o que puedan usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas y/o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del extracto de la invención, estabiliza dicho extracto o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
La composición de la invención puede comprender además un vehículo farmacológicamente aceptable. Además, el vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las secuencias de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del extracto de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El vehículo farmacológicamente aceptable podría ser, pero sin limitarse, una nanopartícula, un liposoma, una micela o una microemulsion.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Muestra un esquema de la estrategia NIT-zipper para el desarrollo de micro y nanopartículas multifuncionales.
EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad del procedimiento de la presente invención y de los productos obtenidos por dicho procedimiento.
Síntesis de nanopartículas superparamagnéticas
Nanopartículas monodispersas de Fe304 de 8 nm de diámetro medio fueron sintetizadas siguiendo el procedimiento de semilla-crecimiento descrito por Sun et al, (J. Am. Chem. Soc, 2004, 126, 273-279). Para ello, semillas de 6nm de Fe304 fueron sintetizadas mezclando Fe(acac)3 (2 mmol), 1 ,2-hexadecanodiol (10 mmol), ácido oléico (6 mmol), oleilamina (6 mmol), y bencil éter (20 ml_) bajo un flujo de nitrógeno. La mezcla se calentó a 200 °C durante 2 horas y después se mantuvo a reflujo (300 °C) durante 1 hora. La disolución se enfrió a temperatura ambiente y después se lavó con metanol para eliminar el disolvente y finalmente redispersarlas en hexano. El recrecimiento de las nanopartículas de 6 nm para obtener nanopartículas de 8 nm se realizó como se indicó anteriormente y adicionando 84 mg de nanopartículas de 6 nm dispersas en hexano.
Transferencia de las nanopartículas superparamagnéticas a agua
Para que estas nanopartículas puedan ser usadas en aplicaciones biomédicas, es necesario que sean estables en fase acuosa, y esto se puede realizar gracias a la utilización de una cubierta polimérica. Las nanopartículas de 8 nm de Fe304 se funcionalizaron con el poli(anhidr¡do maleico-alt-1 -octadeceno) (PMAO) tal y como está descrito en Moros et al (Nanoscale 2010, 2(9), 1746- 1755). Para ello, 280 mg de PMAO son adicionados a un matraz con 200 mL de cloroformo. Una vez que el polímero esté disuelto, 20 mg de nanopartículas son añadidas a la mezcla agitando fuertemente durante 1 h a 25 °C. Después se elimina el disolvente bajo vacío y las nanopartículas se resuspenden en unos pocos mililitros de cloroformo. 20 mL de NaOH 0.05M son adicionados a esta disolución. Después se elimina de nuevo el disolvente bajo vacío. En este punto la disolución se clarifica ya que las nanopartículas han sido completamente transferidas al agua. El exceso de polímero se elimina por centrifugación a 25000 rpm durante 2 h. Las nanopartículas de menor tamaño, así como el exceso de polímero sin unir se quedan en el sobrenadante; las nanopartículas precipitadas se recuperan y redispersan en agua. Este método de funcionalización permite la introducción del polímero deseado, sin modificar la morfología de las nanopartículas.
Funcionalización con PNA _A
Para obtener nanopartículas PMAO-NPs funcionalizadas con PNA (PNA- PMAO-NPs), 0.4 mg de PMAO-NPs fueron incubados toda la noche con EDC y NHS, ambas con una concentración final de 20 m, SDS 0.01 % y 93 pmol de PNA-NH2 en buffer fosfato 10 mM (pH 7), 0.1 M NaCI. Las NPs fueron purificadas del exceso de ligando y reactivos mediante lavados con buffer usando sistemas de filtración por centrifugación.
Para demostrar que el procedimiento de funcionalización ha tenido lugar, un ensayo de hibridación se llevó a cabo. Para ello 46.5 pmol de PNA complementario o no complementario se dejó interaccionar con 0.2 mg de PNA-PMAO-NPs en buffer fosfato (pH7), 0.1 M NaCI. Después de 2 h a temperatura ambiente, las muestras se introdujeron en un gel de agarosa donde el PNA no hibridado se separó de PNA-PMAO-NPs. Mediante la intercalación de GeIRed en el PNA recogido, es posible cuantificar la cantidad de PNA hibridado mediante medidas de fluorescencia.
Complejo Ácido Fólico-ADN_B.
El grupo carboxilo del ácido fólico ha sido activado con NHS y DCC tal y como describió Yoo et al [Journal of Controlled Reléase 100 (2004) 247-256]. Para ello, 0.23 mmol de ácido fólico disueltos en 1 mL de DMSO y 250 uL de trietilamina se pusieron a reaccional con DCC y NHS, con una relación molar fólico/NHS/DCC 1 :2:2 a temperatura ambiente durante 12 h. Después de esto una breve centrifugación permitió eliminar los subproductos no solubles. El ácido fólico activado fue después purificado por gel-filtración en una columna PD-10. El filtrado fue entonces liofilizado y resuspendido en DMSO. Para preparar el complejo fólico-ADN 1 .1 nmol de NHS-fólico se dejó reaccionar toda la noche bajo agitación. Con 1 1 nmol de 3' amino modificado ADN en 0.2M de buffer fosfato (pH 7.5) 0.1 M NaCI. El complejo fólico-ADN fue después purificado mediante centrifugación con sistemas de filtración por centrifugación con un corte de membrana de 30 kDa.
Síntesis de nanopartículas de oro-citrato
Las nanopartículas de oro citrato se sintetizaron mediante la reducción del ácido tetracloroaúrico (HAuCU) con citrato sódico, tal y como ha sido descrito anteriormente (Lee and Meisel, J Phys Chem 86: 3391-3398). En este método una mezcla de una sal de oro y citrato sódico son calentados bajo reflujo. La disolución coloreada amarillo pálido pasó a tener un color rojizo característico de las nanopartículas de oro. La suspensión de las nanopartículas fue observada con un microscopio electrónico de transmisión (TEM), observándose tamaños de 14 nm para estas nanopartículas.
Síntesis de nanopartículas de oro PEGiladas
Para poder llevar a cabo posteriores reacciones de funcionalización sobre las nanopartículas de oro, se han empleado espaciadores bifuncionales de polietilenglicol (PEG), con un extremo terminado en un grupo tiol para su unión covalentemente sobre las nanoaprtículas de oro y otro grupo funcional en el otro extremo que permite la incorporación de diversos compuestos. Hemos usado cadenas de polietilenglicol con un un grupo tiol en un extremo y un grupo carboxilo en el otro para su posterior funcionalización empleando química clásica de carbodiimida. El espaciador empleado es el SH-EG(7)-CH2-COOH. Se han preparado nanopartículas saturadas con un 25% de estas cadenas de PEG en orden a permitir la incorporación de otros compuestos tiolados tales como SH-PNA. Para ello, una mezcla de 0.5 mg/mL de nanopartículas de oro- citrato, 0.028% SDS y 0.03 mg/mL SH-EG(7)-CH2-COOH (Iris-Biotech) se dejó reaccionar durante 16h a tempereatura ambiente con una disolución 25 mM de NaOH. El exceso de PEG se eliminó por centrifugación a 14000 rpm durante 30 minutos a 4°C.
Nanopartículas de oro funcionalizadas con PNA Se disolvió PNA tiolado en 1 mL de 0.1 M DTT. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, las moléculas de PNA reducidas fueron purificadas empleando una columna NAP-10 (GE Helthcare). 0.035 nmol de este PNA fue incubado con una disolución de Au-PEG (0.45 mg/ml_) durante 16 h a 4°C. Después las nanopartículas fueron purificadas por centrifugación a 13000 rpm durante 20 minutos a 4°C y resuspendidas en agua. Este proceso se repitió 3 veces.
Multifuncionalización de las NPs
Para la multifuncionalización de las NPs (superparamagnéticas y de oro), se llevó a cabo un ensayo de hibridización donde se adicionó la misma cantidad de complejo-ADN que la cantidad de PNA situada sobre las nanopartículas PNA-NPs, a una disolución de estas NPs en buffer fosfato (pH 7) 0.1 M NaCI. Después de 2 h la muestra se introdujo en un del de agarosa para separar el PNA no hibridado. Se han empleado dos tipos de complejos-ADN, por un lado el complejo fólico-ADN cuya síntesis ha sido descrita anteriormente, y por otro lado el complejo comercial fluoróforo-ADN.
Ejemplos de aplicaciones del proceso y materiales de la invención
Marcación in vivo de células humanas tumorales por fluorescencia.
El anticuerpo monoclonal IgM, llamado BH1 ha sido funcionalizado con la secuencia PNA-B, mientras que, por otro lado, el marcador fluorescente TexasRed, ha sido funcionalizado con la secuencia DNA-A. Mediante la tecnología de la presente invención, ambas moléculas han podido ser conjugadas para dar lugar a un anticuerpo fluorescente: anti HLA-DR. Este nuevo anticuerpo tiene la capacidad de reconocer células leucémicas DR+ y producir su muerte con alta eficacia en presencia del complemento. Para este ensayo se han utilizado células humanas tumorales Hmy-2 (HLA-DR class II positive B cell line), las cuales han sido debidamente marcadas con otro marcador fluorescente y detectadas por la técnica de citometría de flujo.
Terapia por hipertermia magnética. El anticuerpo anteriormente descrito, BH1 funcionalizado con la secuencia PNA-B, ha sido conjugado a nanopartículas de oxido de hierro, previamente funcionalizadas con la secuencia PNA-A, mediante la técnica de hibridación de cadenas complementarias. Para este ensayo se han utilizado células humanas tumorales Hmy-2 (HLA-DR class II positive B cell line) y se ha observado que los conjugados finales, nanopartícula-BH1 , han sido capaces de detectar, de una manera específica, las células diana y, además y debido a las propiedades magnéticas de las nanopartículas, se ha podido inducir la muerte de las células por hipertermia.
Captura magnética y marcación fluorescente de larvas de mejillón.
El anticuerpo monoclonal IgG m22.8, capaz de reconocer larvas de mejillón M. galloprovincialis, ha sido funcionalizado con la secuencia PNA-B y conjugado con nanopartículas magnéticas de 100 nm previamente funcionalizadas con la secuencia PNA-A, a través de la hibridación de las secuencias complementarias PNA-A y PNA-B. Así, tras la incubación de este conjugado con una muestra que contenía las citadas larvas, la solución ha sido sometida a un campo magnético externo que ha permitido una separación selectiva.
Por otro lado y debido a la posibilidad de obtener una multifucionalización haciendo uso de la tecnología presentada, se han podido unir moléculas de marcadores fluorescentes funcionalizadas con la secuencia ADN-B a las nanoestructuras por hibridación, de igual manera que se ha hecho con el m22.8 a las nanopartículas. De esta manera, se han podido visualizar las larvas capturadas por las nanopartículas magnéticas funcionalidas con el m22.8, por medio de microscopía confocal.
Reconocimento, internatilización, marcación y liberación de fármacos.
El anticuerpo anteriormente descrito, BH1 funcionalizado con la secuencia PNA-B, ha sido conjugado a nanopartículas de oro de 13 nm, previamente funcionalizadas con la secuencia PNA-A, mediante la técnica de hibridación de cadenas complementarias. Para este ensayo se han utilizado células humanas tumorales Hmy-2 (HLA-DR class II positive B cell line) y se ha observado que los conjugados finales, nanopartícula-BH1 , han sido capaces de detectar, de una manera específica, las células diana.
Por otro lado y debido a la posibilidad de obtener una multifucionalización haciendo uso de la tecnología presentada, se han podido unir, además, moléculas de un péptido de infernal ización celular con la secuencia ADN-B a las nanoestructuras por hibridación, de igual manera que se ha hecho con el BH1 a las nanopartículas.
Además y siguiendo con la posibilidad de obtener una multifucionalización haciendo uso de la tecnología presentada, se han podido unir moléculas de marcadores fluorescentes funcionalizadas con la secuencia ADN-B a las nanoestructuras anteriores por hibridación, de igual manera que se ha hecho con el BH1 a las nanopartículas. De esta manera, se ha podido visualizar la internalización de la nanoestructura en la célula, por medio de microscopía confocal así como a través de citometría de flujo, la selectividad de los conjugados por las células humanas tumorales Hmy-2 (HLA-DR class II positive B cell line) las cuales han sido debidamente marcadas con otro marcador fluorescente y detectadas por la técnica de citometría de flujo.
Para finalizar y continuando con la multifuncionalización que permite la tecnología presentada, se han podido unir moléculas de ciclodextrina funcionalizadas con la secuencia ADN-B a las nanoestructuras anteriores por hibridación, de igual manera que se ha hecho con el BH1 , fluoróforo y péptido de internalización a las nanopartículas, utilizando una relación molar 1 : 1 : 1 : 1 respectivamente. Esta nueva molécula ha permitido transportar al interior celular una droga anticancerígena (β-Lapachone), que ha inducido, selectivamente, la muerte celular.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Material multifuncional izado que comprende:
a. Un material base que comprende al menos un tipo de cadenas de PNA tipo A y/o ADN tipo A (PNA/ADN-A) unidas a dicho material base; y b. a! menos un tipo de cadenas de PNA tipo B y/o ADN tipo B (PNA/ADN-B), complementarias o parcialmente complementarias a las cadenas de PNA/ADN-A, unidas a una biomolécula;
donde las cadenas de PNA/ADN-A se encuentran hibridadas con las cadenas de PNA/ADN-B mediante el reconocimiento molecular PNA-PNA, PNA-ADN o ADN-ADN y donde el material base presenta en su superficie más de una biomolécula diferente.
2. Material multifuncionalizado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde las cadenas PNA/ADN-A y/o PNA/ADN-3 son de PNA.
3. Material de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las cadenas de PNA/ADN presentan un ccntenido de Guaninas y citosinas (GC) superior al 50% y una longitud entre 10 y 25 nucleótidos
4. Material de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las moléculas de PNA/ADN tipo A con las que se multifuncional izan los materiales base se hayan cubriendo entre un 40% y un 60% de la superficie total de recubrimiento de dicho material
5. Material de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el material base es una biomolécula o un material micro o nanoestructurado.
6. Material de acuerdo con la reivindicación 5, donde el material base es de tipo microparticulado.
7. Material de acuerdo con la reivindicación 6, donde el material base de tipo microparticulado se selecciona entre la lista que consiste en: polímeros orgánicos naturales, polímeros orgánicos sintéticos, soportes inorgánicos y palancas de silicio.
8. Material de acuerdo con la reivindicación 7, donde los polímeros orgánicos naturales se seleccionan entre el grupo que consiste en poiisacáridos y proteínas fibrosas.
9. Material de acuerdo con la reivindicación 7, donde los polímeros orgáricos sintéticos se seleccionan del grupo que consiste en poliolefinas y polímeros acrílicos.
10. Material de acuerdo con la reivindicación 7, donde los soportes inorgánicos se seleccionan del grupo que consiste en soportes inorgánicos naturales y sintéticos.
11. Material de acuerdo con la reivindicación 5. donde el material base es de tipo nanoestructurado.
12. Material de acuerdo con la reivindicación 11 , donde el material base nanoestructurado se selecciona entre ¡a lista que consiste en: nanoparticulas de oro, nanoparticulas de plata, nanopartícuias de carbono, nanoparticulas de oro-citrato, nanoparticulas de óxidos de metales, nanoparticulas superparamagnéticas, nanoparticulas magnéticas, nanoparticulas de sílica, nanoparticulas de silicio, nanoparticulas poliméncas, nanotubos de carbono, nanohilos de silicio y poiisacáridos, nanoparticulas de paladio, dendrímeros, nanoparticulas de platino, nanocristales semiconductores, liposomas o cualquiera de sus combinaciones.
13. Material de acuerdo con cualquiera de tas reivindicaciones 1 1 o 12, donde el material base nanoestructurado está recubierto per una cubierta orgánica seleccionada entre la lista que consiste en: citrato, aminoácidos naturales y no naturales, polietilengiicoles con grupos terminales amino, tiol hídroxilo o azida, polímeros o poiisacáridos y sílica.
14. Material ele acuerdo con la reivindicación 13, donde la cubierta orgánica es un polímero.
1 5. Material de acuerdo con a reivindicación 14, donde el polímero es el poli(anhídrido maleico-alt-1 -octadeceno).
16. Material de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde las biomoléculas que se conjugan con las cadenas PNA o ADN tipo A o B, se seleccionan entre moléculas de reconocimiento biológico, agentes terapéuticos, profármacos, trazadores, péptidos de ínternalizacíón celular y agentes bloqueantes.
17. Material de acuerdo con la reivindicación 16, donde las moléculas de reconocimiento biológico se seleccionan entre vitaminas, hormonas o péptidos con actividad biológica, dominios extracelulares de receptores de membrana o moléculas de adhesión celular, toxinas, íectinas, enzimas, anticuerpos, minianticuerpos y aptámeros.
18. Material de acuerdo con la reivindicación 16, donde los agentes terapéuticos se seleccionan entre fármacos hidrofóbicos, fármacos hidrofílicos, toxinas y radioisótopos.
19. Material de acuerdo con la reivindicación 16, donde los trazadores se seleccionan entre marcadores fluorescentes, agentes de contraste de resonancia magnética y radioisótopos,
20. Material de acuerdo con la reivindicación 16, donde los péptidos de interralización celular se seleccionan entre aquellos que tienen menos de 30 aminoácidos y son anfifílicos o con carga neta positiva.
21 . Material de acuerdo con la reivindicación 16, donde los agentes bloqueantes se seleccionan entre polietilenglicoles y azúcares.
22. Procedimiento de obtención de materiales funcionales o multifuncionales que comprende las siguientes etapas:
a activación química de grupos funcionales presentes en el material base, b. reacción entre al menos un grupo amino o carboxilo terminal de al menos un tipo de cadena de PNA tipo A o un grupo amino o tiol de al menos un tipo de cadena de ADN tipo A y al menos un grupo funcional activado del material base activado según la etapa (a);
o conjugación de af menos un tipo de cadena de PNA/ADN tipo B, complementaria o parcialmente complementaria la cadena PNA/ADN tipo A, a una biomolécula medíante activación química de grupos funcionales; y d. hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A, unidas al material base según ¡a etapa b) y ias cadenas de PNA/ADN tipo B que tienen unidas b omoléculas. según ia etapa c) mediante el reconocimiento molecular PNA- PNA, PNA-ADN o ADN-ADN.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, donde los grupos funcionales a activar, presentes en el material base micro o nanoparticulado se seleccionan entre grupos -OH, -COOH, - CHO, -NH2, -SH, azidas o alquinos.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23, donde la activación de los grupos funcionales se lieva a cabo mediante un reactivo seleccionado entre carbodiimída, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, bromuro de cianógeno, epóxidos, N-hidroxisuccinimida, sulfo-N- hidroxisuccinimida.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, donde el reactivo se selecciona entre EDC, DCC, DIC, NHS. Sulfo NHS, HATU, CDI o cualquiera de sus combinaciones.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25, donde el reactivo es una combinación de NHS y EDC, preferiblemente Suifo-NHS o NHS y EDC.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, donde en la etapa d), la hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A y Jas cadenas de PNA/ADN tipo B se lleva a cabo a temperaturas inferiores a la temperatura de fusión (Tm) de dichas cadenas.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, donde las temperaturas de fusión están dentro del intervalo de 25 a 80°C.
29. Material funciónalizado obtenible de acuerdo al procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28.
30. Uso del material funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o 29, para la detección de biomoléculas in vitro.
31 . Uso del material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o 29, como catalizador industrial en procesos de química fina y farmacéutica, biocombustibles, química de alimentos o química analítica.
32. Material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o 29, para su uso en terapia.
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