WO2012144676A1 - 케모카인 발현 조절제 - Google Patents

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WO2012144676A1
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inhibitor
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arthritis
fas
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정두현
김혜성
김혜영
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • a method of controlling the expression of chemokine-like substances using Fas ligand is provided.
  • the chemokine-like material may be at least one selected from the group consisting of MIP-l, RANTES and IP-10. Since the chemokine-like substance is involved in the inflammatory reaction, a technique for controlling the inflammatory response using the Fas ligand is also provided.
  • Fas Ligand (FasL, CD95L, CD 178, Apo-1) is one of Type II membrane proteins, along with TNF, CD40L, 4-1BBL, and Tumor necrosis factor (TNF). It belongs to the lineage and is mainly expressed in immune privileged sites such as activated T cells, NK cells, tumor cells and eyes. Fas ligand has a homotrimer structure and is known to perform apoptosis of target cells through trimerization with its receptor Fas.
  • Fas ligand can be divided into membrane Fas ligand and soluble Fas (sFas) ligand. Because acetosis is induced by cell-cell contact, the membrane fas ligand is responsible for atoptosizing the cells by forming a death inducing signaling complex (DISC) along with Fas. Soluble Fas ligand is a truncated form of the membrane Fas ligand cut by serine matrix metalloproteinase -3 or -7 (serine matrix metalloproteinase, MMP-3 or MMP-7). Contrary to the membrane Fas ligand function, it is known to inhibit the aptosis of target cells or to act as a chemoattractant depending on the cell microenvironment.
  • sFas soluble Fas
  • Fas ligand in inflammatory diseases, particularly Rheumatoid arthritis (RA) have been shown to increase the amount of soluble Fas ligand in RA patients compared to patients with osteoarthritis. This is The only report is to reduce VEGF secreted from synovial fibroblasts and to inhibit angiogenesis.
  • apoptosis through Fas-Fas ligand in CIA (collagen induced arthritis) model suppresses the production of autoreactive cells in the early stages of RA, thereby relieving RA. It is reported that the key plays a role.
  • Fas ligand is an important regulator in the expression of chemokine-like substances.
  • one example of the present invention provides a method of controlling the expression of chemokine-like substances using Fas ligand.
  • Another example provides a method for inhibiting an inflammatory reaction by inhibiting Fas ligand and an anti-inflammatory reaction composition comprising a Fas ligand inhibitor as an active ingredient.
  • Another example provides methods for screening chemokine expression modulators by targeting Fas ligands.
  • a method of controlling the expression of chemokine-like substances using Fas ligand is provided.
  • the chemokine-like material may be at least one selected from the group consisting of MIP-1, RANTES and IP-10. Since the chemokine-like substance is involved in inflammatory reactions, a technique for controlling inflammatory reactions using Fas ligand is also provided.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that expression of chemokine-like substances, in particular Mip-la, RANTES, and / or IP-10 is increased when Fas ligand is cultured with Fas ligand.
  • chemokine-like substances in particular Mip-la, RANTES, and / or IP-10
  • gld mice were found to inhibit the development of rheumatoid arthritis. This finding is meaningful because it means that the Fas ligand is involved in the development of rheumatoid arthritis, apart from the apoptosis effect by the Fas ligand interaction with Fas.
  • the present inventors confirmed that there is no difference in the incidence of rheumatoid arthritis even when the Fas ligand, as previously known, is treated with a caspase inhibitor capable of inhibiting aptosis caused by the interaction with Fas.
  • a caspase inhibitor capable of inhibiting aptosis caused by the interaction with Fas.
  • the present invention reveals for the first time that the Fas ligand (sFas ligand) independently acts as a trigger for arthritis, particularly rheumatoid arthritis, irrespective of the aptosis caused by the Fas ligand interacting with Fas.
  • Fas ligand sFas ligand
  • the sFas ligand increases the expression of one or more chemokine-like substances selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10, thereby acting as an important factor in inflammatory reactions.
  • chemokine-like substances selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10, thereby acting as an important factor in inflammatory reactions.
  • it has been confirmed that it is one of the important causes of rheumatoid arthritis, it is useful as an effective target molecule not only for the prevention of inflammation, especially arthritis, but also for the therapeutic level.
  • one example of the present invention is a chemokine-like substance using sFas ligand, such as Mip-la (macrophage inflammatory protein-1 ⁇ , accession number: NP_035467, AAI_11444, CAI25136, ABY66390, EDL15715, etc.), Mip- lp (accession number: NP_038680, AAI 19258, AAI 19260, CAI 25137, EDL 15716), RANTES (Chemokine (CC motif) ligand 5, CCL5, accession number: CAJ18523, AAH33508, AAU43779, EDL 15710, etc.) and IP-10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10, CXCLIO, accession number: AAH 30067, EDL 05256, NP_067249, etc.) provides a method for controlling the expression of one or more chemokine-like substances selected from the group consisting of.
  • Mip-la macrophage
  • one or more chemokines selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10 by administering Fas ligand to the subject or enhancing Fas ligand activity (e.g., treating Fas ligand activity enhancer on the subject).
  • Fas ligand activity e.g., treating Fas ligand activity enhancer on the subject.
  • Methods of increasing the expression of a substance are provided.
  • a method of inhibiting Fas ligand eg, subjecting Fas ligand activity inhibitor to subject
  • chemokine-like substances selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10.
  • a chemokine-like substance regulator comprising an sFas ligand as an active ingredient. More specifically, there is provided an expression enhancer of at least one chemokine-like substance selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10 comprising an sFas ligand or an sFas ligand activity enhancer as an active ingredient. In addition, there is provided an expression inhibitor of at least one chemokine-like substance selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10 comprising an sFas ligand inhibitor as an active ingredient.
  • a use for the regulation of chemokine-like substances of sFas ligand More specifically, the use of the sFas ligand or the sFas ligand activator for Mip-la, RANTES, and IP-10 or at least one chemokine-like substance selected from the group is provided for use in the production of the expression promoting agent.
  • the sFas ligand inhibitor for use in the suppression of the expression or preparation of expression inhibitors of at least one chemokine-like substance selected from the group consisting of Mip-la, RANTES, and IP-10.
  • the sFas ligand or its activity enhancer may be administered to the subject, or the sFas ligand may be incubated together to increase chemokine expression, or the sFas ligand inhibitor may be administered to the subject to reduce chemokine expression. have.
  • the sFas ligand may itself act as a chemokine to directly act as an inflammatory cell influx and / or to induce inflammation (see Example 8).
  • chemokine-like substances are known to be involved in inflammatory reactions Therefore, in another aspect of the present invention there is provided a technique for inhibiting the sFas ligand to suppress inflammatory reaction.
  • techniques for preventing, treating, alleviating and / or alleviating inflammation associated with one or more chemokine-like substances selected from the group consisting of Mip- ⁇ , RANTES, and IP-10, such as arthritis, in particular rheumatoid arthritis can be provided.
  • one embodiment of the present invention provides a method for preventing and / or treating arthritis, comprising administering an sFas ligand inhibitor to a patient with arthritis, preferably rheumatoid arthritis.
  • the method of preventing and / or treating arthritis may further comprise identifying a patient with arthritis, preferably rheumatoid arthritis, prior to administering the sFas ligand inhibitor.
  • compositions for the prophylaxis and / or treatment of arthritis comprising an sFas ligand inhibitor
  • an sFas ligand inhibitor for use in the prevention and / or treatment of arthritis, preferably rheumatoid arthritis, or for the preparation of prophylactic and / or therapeutic agents.
  • sFas ligand itself serves as a chemokine
  • another example of the present invention provides an inflammation-inducing composition comprising a soluble Fas (sFas) ligand as an active ingredient.
  • soluble Fas (sFas) ligands as chemokines.
  • a method for inducing innovation comprising administering or contacting the soluble Fas ligand to a mammal or tissue or cell isolated from the mammal. When the mammal is used as a living body, the mammal may be interpreted as excluding humans.
  • the sFas ligand according to the present invention is characterized in that the chemokine expression control and inflammatory reaction regulatory activity such as arthritis occurs regardless of binding to Fas and apoptosis.
  • sFas ligands are related to NF-k such as pAKT (P31750, NP_033782, AAH 66018, AAI 15584), pSyk (AAA87462, NP_035648, AAH 65121), pERK (NP_033257, NP_001033752, NP_036079, AAH_58258, AAH_06708B) and the like. Increasing the expression of the protein was also confirmed.
  • 'Fas ligand means a soluble Fas (sFas) ligand.
  • sFas ligand in the present invention may be of mammalian origin, preferably of rodent or human origin, For example, it may be an accession number AAA 19778 (SEQ ID NO: 1), or AAC50071 (SEQ ID NO: 2).
  • sFas ligand activity enhancers are all substances that enhance the activity of sFas ligand by inducing the activation of cells expressing or secreting the sFas ligand.
  • GPI Glucose-6 contained in K / BxN serum used to induce arthritis -Phosphate Isomerase
  • anti-GPI antibody or GPI-anti GPI antibody complex, and the like, but are not limited thereto.
  • the Fas ligand inhibitor refers to any substance that reduces the expression of Fas ligand, decreases, eliminates, and / or blocks the action, such as Fas ligand blocking antibody, Fas ligand solubilization inhibitor, for example,
  • the subject may be a mammal, preferably a human or rodent, or a cell or tissue isolated therefrom.
  • the subject has a pathological condition caused by one or more expressions selected from the group consisting of chemokines such as Mip- ⁇ , RANTES, and IP-10, such as patients suffering from inflammation, or such pathological symptoms such as inflammation It may be isolated from a living body, such as induced cells, tissues, or body fluids.
  • the inflammation may be arthritis, the inflammation-induced cells are arthritis-inducing cells, more specifically immune cells and / or synovial cells infiltrated in the arthritis-induced joints, peripheral blood of a patient with arthritis Cells and the like.
  • the dose of the Fas ligand inhibitor may be appropriately adjusted according to the condition of the patient, the degree of inflammation, and the like, for example, 0.1 to 100 ug / kg (body weight), preferably 1 to 1, based on the active ingredient content. It may be 50 ug / kg (weight), but is not limited thereto.
  • inflammation according to the invention in particular
  • the prevention and / or treatment method of arthritis has the advantage that the effect of alleviating and treating the disease is excellent not only in the prevention of the onset and in the early stage of the onset, but also in the middle and late stages of the progression.
  • a method for screening a chemokine expression inhibitor targeting a Fas ligand is provided.
  • the candidate material may be characterized as being determined as a chemokine expression inhibitor.
  • the chemokine may be one or more selected from the group consisting of Mip- ⁇ , RANTES, and IP-10. Since the chemokine-like substance is known to be involved in inflammatory reaction, the chemokine expression inhibitor selected by the screening method can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for inflammation, especially arthritis such as rheumatoid arthritis. Thus, the screening method may be a method of screening for inflammation inhibitory and / or therapeutic agents for arthritis (eg, rheumatoid arthritis).
  • the sample may be a cell, tissue or organ obtained from an animal, preferably a mammal, and may preferably comprise an immune privileged site, more preferably, a T cell, an NK cell, a tumor. Cell or eye.
  • the Fas ligand activity can be measured by conventional methods, which can be easily understood by those of ordinary skill in the art. For example, when a soluble FasL is injected into an animal to induce arthritis, a change in the thickness of the joint is measured by about 1 to 20 days, preferably about 8 to 12 days, for example, 10 days, compared to an individual not injected. The degree of activation can be assessed. Or, for example, chemokines expressed or secreted in the group incubated with soluble sFasL after inducing arthritis-induced immune cells and incubated with soluble sFasL, were subjected to realtime PCR, Cytoflowmetry, fluorescence activated cell sorter (FACS), or ELISA.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the degree of activity can be evaluated. For example, if you do not process sFasL
  • the expression of chemokines in groups if the treated group had increased expression of chemokines than the untreated groups, it can be determined that the expression of chemokines increased according to the activity of the candidate compounds upon contact of the candidate compounds.
  • Realtime PCR compares the relative amounts between groups
  • ELISA confirms the absolute amount
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the candidate includes all synthetic or natural compounds, polypeptides, polynucleotides, and the like.
  • the screening chemokine expression control Ze has the advantage that inflammation, in particular, as well as prevention of the onset and early onset of arthritis treatment effects, illness that has progressed to some extent the middle and superior mitigation illness and treatment in the end.
  • the chemokine expression control technology using the Fas ligand, the prevention and / or treatment of arthritis such as inflammation, in particular rheumatoid arthritis using the Fas ligand presented in the present invention, and the search technology of novel chemokine expression inhibitors using the same, can effectively prevent the occurrence of arthritis In addition to being able to achieve excellent therapeutic effects even after some progress, it is a very useful technique for treating many patients suffering from arthritis.
  • La to lc shows the degree of expression of chemokine according to the Fas ligand concentration
  • la shows the expression level of ⁇ -1 ⁇
  • lb shows the expression level of RANTES
  • lc shows the expression level of IP-10.
  • Figure 2a shows the thickness and the clinical index of the joints in three kinds of mouse models induced arthritis by K / BxN serum transfer according to Example 2,
  • 2b is a picture of the joints of the three kinds of mice
  • 2c shows the expression level of IFNY, IL-4 and TGFp in the three kinds of mice.
  • FIG. 3 shows joint thickness and clinical index in z-VAD treated mice according to Example 3.
  • Figure 4a shows the joint thickness and clinical index measurement results of the mouse of Example 4,
  • 4c shows the expression level of IFN ⁇ IL-4 and TGF
  • Figure 5a shows the results of measurement of the joint thickness and clinical index of the early arthritis mice of Example 6,
  • 5d to 5f represent the early, middle and end mouse joints of Example 6, respectively.
  • Figure 6 shows the joint thickness and clinical index when the production of soluble Fas ligand in vivo is suppressed.
  • Figure 7a shows the number of inflammatory cells moved to the bottom chamber after 24 hours with inflammatory cells in the upper chamber and soluble Fas ligand in the bottom chamber
  • 7b shows the number of cells in the upper chamber and bottom chamber after 24 hours, respectively will be.
  • Example l Effect test for increasing chemokine expression of Fas ligand
  • KRN TCR transgenic mouse wave NOD mice obtained from Drs.D.Mathis and C.Benoist of Harvard medical school, Boston, MA, obtained from the normal mice. Arthritis was induced by injection. After 10 days of observation, infiltrated and synovial cells in the joint were isolated and in vitro with soluble Fas ligand (accession number AAA 19778 (SEQ ID NO: 1), lg, 5 ⁇ , 10 ⁇ g (R & D system), respectively). Incubated.
  • Culture medium was 10% Fetal bovine serum (Gibco), 1% penicillin streptomycin (Gibco), DMEM (Dulbeccos' s Modified Eagle's Medium) (WelGene) was used, the 12 well culture plate well / ml in the culture medium of 1 for producing from SPL science, was dispensed a well / 10 6 cells.
  • RNA extraction was carried out in the order provided using the RNasy mini prep kit produced by Qiagen. Of these, 3 g of RNA was again produced in promega.
  • the MMLV reverse transcription kit was used to synthesize cDNA.
  • the expression of chemokines Mip- ⁇ , RANTES, and IP-10 was measured using Realtime PCR ABI 7500 manufactured by Applied Biosystem on the obtained cDNA.
  • Chemokine primers were also prepared by Applied Biosystem, and the rate of chemokine expression was normalized to GAPDH, a type of house keeping gene that shows a high level of expression without any change in external conditions.
  • mice with overlapping Fas ligand and lpr mice lacking Fas, and control (normal) B6 with both Fas and Fas ligands RA was induced in mice.
  • blood in naturally induced arthritis-induced ⁇ / ⁇ mice crossed by KRN TCR transgenic and NOD mice from Drs.D.Mathis and C.Benoist from Harvard medical school, Boston, MA
  • Serum was collected.
  • B6 (orient bio), lpr (central laboratory animals) and gld mice (central laboratory animals) as described above were injected with 150 ⁇ 1 of K / BxN serum obtained above intraperitoneally (ip) on days 0 and 2. It was. Joint thickness was measured with a caliper (Manostat, Switzerland).
  • the Clinical index is referenced as follows:
  • FIG. 2A The thickness and clinical index of the joint measured as described above are shown in FIG. 2A.
  • FIG. 2a B6 mice and lpr mice were injected with serum and the joints began to swell from day 4, the highest index was observed at 8-9 days.
  • the joints did not swell almost 10 days after the serum injection, and the clinical index remained at 3-4 points.
  • the joint photograph of the test mouse is shown in Figure 2b. As can be seen in Figure 2b, in the gld mice it was observed that almost no swelling of the joints.
  • cytokine expression was measured using the Applied Biosystems 7500 sequence detection system (Perkin-Elmer Biosystems) and all results were compared with GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) expression. Averaged.
  • 3 cytokine expression was measured using the Applied Biosystems 7500 sequence detection system (Perkin-Elmer Biosystems) and all results were compared with GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) expression. Averaged.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • TGF- ⁇ 1 (forward): 5'-GC AAC ATGTGGAACTCTACC AGAA-3 ',
  • FIG. 2C The results obtained above are shown in FIG. 2C.
  • the expression of IL-4 and IFNY was increased in g6 mice in B6, and lpr mice, whereas the expression of TGF (3 was increased in gld mice.
  • Gand plays an important role in inducing joint inflammation in the K / BxN serum transfer model, and this role is independent of Fas.
  • Fas Lpr mice deficient and gld mice deficient in Fas ligand should show the same arthritis-induced behavior.
  • Fas-deficient lpr mice and Fas ligand-deficient gld mice showed different patterns in the induction of arthritis. This suggests that the Fas ligand does not contribute to the pathogenesis of arthritis by induction of apoptosis through binding with Fas, but may be related to another mechanism.
  • Example 3 Rheumatoid Arthritis Induction Test 2 in Animal Models
  • Fas ligand is involved in arthritis induction as a separate mechanism, rather than through apoptosis by binding to Fas, the following test was further performed.
  • B6 mice such as used in Example 2, were treated with a caspase inhibitor (caspase inhibitor, z-VAD, Calbiochem) that was able to inhibit apoptosis intraperitoneally with an amount of 50ug or lOOug the day before, followed by K / BxN serum was injected to induce arthritis.
  • caspase inhibitor caspase inhibitor, z-VAD, Calbiochem
  • K / BxN serum K / BxN serum
  • the test was performed by inducing arthritis by immunotransmitting splenocytes of B6, lpr, and gW mice to gld mice, respectively.
  • mice were euthanized and spleens were collected, homogenized with 1 ml of red blood cell (RBC) lysis buffer (Qiagen), and then RBC was removed : lymphocytes were obtained. After filtration with a sterile 40 ⁇ cell strainer (BD bioscience), 1 x 107 splenocytes per gld mouse the day before serum transfer were injected intravenously (iv) with sterile PBS at a total volume of 300 ⁇ .
  • RBC red blood cell
  • lysis buffer Qiagen
  • mice were injected with sFas ligand (soluble Fas ligand) and then transferred to K / BxN serum to test whether arthritis was induced.
  • sFas ligand soluble Fas ligand
  • mice 2 ⁇ g or 10 of the mouse sFas ligand (R & D) were injected into the gld mouse intraperitoneally on the day before the serum transfer, and then the joint thickness and clinical index were measured by the same method as in Example 2, and the results are shown in FIG. 4B.
  • the injection of 2 ⁇ ⁇ in sFasL showed no significant change in the joint thickness and clinical indices.
  • the injection of sFasL 10 increased the joint thickness and clinical indices to the same extent as wild-type B6 mice. .
  • Fas ligand is one of the important etiologies for inducing arthritis in the K / BxN serum transfer model.
  • the results indicate that the blocking of Fas ligand activation plays an effective role in the prevention and treatment of arthritis. To present. To confirm this hypothesis, the onset of arthritis was divided into early, mediated, and late phases to block the activation of Fas ligand and to observe the arthritis pathology. Fas ligand blocking antibody (BD bioscience) was mixed with PBS in an amount of ⁇ ⁇ ⁇ and injected into the blood vessel (iv) of ⁇ 6 mice at a total volume of 300 ⁇ .
  • Fas ligand blocking antibodies were treated from one day prior to serum transfer to 9 days after serum transfer to block the role of Fas ligand in the early stages of arthritis development. Joint thickness and clinical index of the animal model were measured in the same manner as in Example 2, and are shown in FIG. 5A. As can be seen in Figure 5a, it was confirmed that the onset of arthritis is significantly suppressed in mice treated with Fas ligand blocking antibody.
  • the Fas ligand blocking antibody was mixed with PBS in an amount of H ⁇ g or 20 from 5 days to 9 days after the serum transfer, which is considered to be an intermediate stage of joint inflammation, and injected intravascularly into ⁇ 6 mice at a total volume of 300 ⁇ , and the joint thickness.
  • clinical indices were measured and shown in FIG. 5B.
  • arthritis was suppressed even when the Fas ligand blocking antibody was treated during the onset of arthritis, and this inhibitory effect was more significant as the concentration of the Fas ligand blocking antibody was increased. It was shown.
  • cytokines IL-4, IFNy and TGFP
  • FIGS. 5D to 5F results are shown in FIGS. 5D to 5F, respectively.
  • FIGS. 5D to 5F expression of IL-4 and IFNY was decreased and expression of TGF (3) was increased in mice injected with Fas ligand blocking antibody in the early, middle and late stages of arthritis.
  • Example 7 Arthritis-induced Experiment When Inhibiting the Production of Soluble Fas Ligand
  • MMP-3 inhibitor matrix metalloproteinase-3 inhibitors
  • Example 8 Identification of direct chemokine role of solubleFas ligand Based on the above data, the generation of sFas ligand promotes chemokine expression, which induces arthritis. Next, we tested whether the sFas ligand could act as a chemokine that promotes the influx of inflammatory cells, rather than simply as a chemokine expression regulator. After inducing arthritis in wild-type B6 mice in the same manner as in Example 2, and obtaining the inflammatory cells introduced into the joint on the 8th day having the highest joint thickness and the highest clinical index, the upper chamber of the 80 ⁇ transwell plate (BD Falcon) was 300 ⁇ 1 culture solution.
  • Inflammatory cells were added to (RPMI 1640, 10% Fetal bovine serum, 1% antibiotics) and Ong, 50ng and 100ng of sFas ligand were added to 700 ⁇ 1 culture medium. After 24 hours, the ratio of the number of cells moved from the upper chamber to the bottom chamber according to the sFas ligand in the total upper chamber is shown in FIG. 7A. After 24 hours, the number of cells in the upper chamber and the bottom chamber, respectively, is shown in FIG. 7B.
  • the number of cells moved to the bottom chamber of the inflammatory cells in the upper chamber increased in proportion to the sFas ligand concentration.
  • the sFas ligand was able to confirm that sFasL itself acts as a chemokine as well as regulates chemokine expression.
  • the Fas ligand activity blockade suppresses chemokine expression and suppresses inflammatory reactions, and it is confirmed that the Fas ligand activity blockade is effective in suppressing arthritis symptoms as well as in the early stages of inflammation as well as after the onset of arthritis.

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Abstract

Fas 리간드를 이용하여 케모카인류 물질의 발현을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 케모카인류 물질은 MIP-1, RANTES 및 IP-10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 케모카인류 물질은 염증반응에 관여하므로, Fas 리간드를 이용하여 염증 반응을 조절하는 기술도 제공된다.

Description

【명세서】
【발명 의 명 칭】
케모카인 발현 조절제 【기술분야】
Fas 리 간드를 이용하여 케모카인류 물질의 발현을 조절하는 방법 이 제공된다. 상기 케모카인류 물질은 MIP-l, RANTES 및 IP-10으로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상의 것 일 수 있다. 상기 케모카인류 물질은 염증반웅에 관여하므로, Fas 리간드를 이용하여 염증 반응을 조절하는 기술이 또한 제공된다.
【배경 기술】
Fas 리 간드 (FasL, CD95L, CD 178, Apo-1)는 제 II형 막단백질 (Type II membrane protein)의 하나로서 , TNF, CD40L, 4-1BBL 등과 함께 종양괴사인자 (Tumor necrosis factor, TNF) 계통에 속하며 , 주로 활성화된 T 세포， NK 세포， 종양 세포 및 안구 등과 같은 면역 특전 부위 (immune privileged site)에서 발현된다. Fas 리 간드는 동종 삼합체 (homotrimer) 구조를 가지며 , 그 수용체인 Fas와의 trimerization을 통하여 표적 세포를 apoptosis시 키는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.
Fas 리 간드는 membrane Fas 리간드와 soluble Fas (sFas) 리 간드로 나눌 수 있다. 아픕토시스는 세포 -세포 접촉으로 유도되기 때문에， Fas와 함께 사멸 유도 신호 복합체 (Death inducing signaling complex, DISC) 이루어 세포를 아톱토시스시 키는 역할은 막 Fas 리간드가 담당한다. 가용성 Fas 리간드는 세 린 메트릭스 메탈로프로테 이 네 이즈 -3 또는 -7 (serine matrix metalloproteinase, MMP-3 또는 MMP-7)에 의해 잘려진 막 Fas 리간드의 절단형 태이다. 막 Fas 리 간드 기능과는 반대로 표적 세포의 아픕토시스를 억 제하거나 세포 미세환경에 따라서 화학 유인 물질 (chemoattractant)의 기능을 한다고 알려 져 있다.
염증질환, 특히 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis, RA)에서 의 Fas 리 간드의 역할에 대한 보고는 많지 않고, 골관절염 (Oasteoarthritis) 환자와 비교했을 때， RA 환자에서 가용성 Fas 리간드의 양이 증가되 어 있으며， 이는 활막 섬유모세포 (synovial fibroblast)에서 분비 하는 VEGF를 감소시 켜 혈관형성 (angiogenesis)을 억 제하는 역할을 한다는 보고가 유일하다. 또한, 막 Fas 리 간드와 관련해서는 CIA(collagen induced arthritis) 모델에서 Fas-Fas 리 간드를 통한 아품토시스는 RA 발병 초기 단계에서 자가반웅성 세포 (autoreactive cell)들의 생성을 억 제하여 RA를 완화시 키 는 역 할을 한다는 보고가 있다.
케모카인이 염증 반웅에 중요한 역할을 한다는 것을 고려할 때， Fas 리 간드의 케모카인 발현에 있어서 의 역할에 대한 연구의 중요성 이 커지고 있지 만 그 연구 성과는 미미 한 실정 이다.
【발명 의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 Fas 리 간드가 케모카인류 물질의 발현에 있어서 중요한 조절 인자임을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 일례는 Fas 리 간드를 이용하여 케모카인류 물질의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.
다른 예는 Fas 리 간드를 억 제하여 염증반응을 억 제하는 방법 및 Fas 리 간드 억 제제를 유효성분으로 포함하는 염증 반웅 억 제용 조성물을 제공한다.
또 다른 일예는 Fas 리 간드를 표적으로 하여 케모카인 발현 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
【기술적 해결방법】
Fas 리 간드를 이용하여 케모카인류 물질의 발현을 조절하는 방법 이 제공된다. 상기 케모카인류 물질은 MIP-1 , RANTES 및 IP-10으로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상의 것 일 수 있다. 상기 케모카인류 물질은 염증반웅에 관여 하므로, Fas 리간드를 이용하여 염증 반웅을 조절하는 기술 또한 제공된다.
본 발명자들은 Fas 리간드을 염증 세포를 Fas 리 간드와 함께 배양하면 케모카인류 물질, 특히 Mip-la, RANTES, 및 /또는 IP-10의 발현이 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명자들은 또한 K/BxN 세럼 트랜스퍼 모델을 이용하여 류마티스 관절염에서 가용성 Fas (sFas) 리간드의 역할을 시험하여, sFas가 결핍된 lpr 마우스에서는 B6 마우스와 마찬가지로 류마티스 관절염이 유도되지만, sFas 리간드가 결핍된 gld 마우스에서는 류마티스 관절염의 발생이 억제됨을 발견하였다. 이러한 발견은 기존에 알려진 바로는 Fas 리간드가 Fas와의 상호작용에 의한 아픕토시스 작용과는 별개로 Fas 리간드가 류마티스 관절염의 발병에 관여한다는 것을 의미하는 것이어서 의미있는 것이라 할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 기존에 알려진 바와 같은 Fas 리간드가 Fas와의 상호작용에 의하여 일어나는 아품토시스를 억제할 수 있는 카스파아제 억제제 (caspase inhibitor)를 처리하여도 류마티스 관절염의 발병 정도에는 차이가 없는 것을 확인하였으며, sFas 리간드가 결핍된 gld 마우스에 가용성 Fas 리간드를 주입하였을 때， 류마티스 관절염이 다시 유도되는 것을 관찰하였다. 또한 류마티스 관절염의 발병 단계를 나누어 발병 초기, 중기 및 말기의 각각의 단계에서 Fas 리간드의 활성화를 차단하였을 때, 발병 단계에 관계없이 Fas 리간드의 활성화 차단에 의하여 류마티스 관절염이 억제 및 완화되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 Fas와 Fas 리간드의 상호작용에 의한 아품토시스가 류마뒤스 관절염 발명 초기 단계에서 자가반웅성 세포 (autoreactive cell)들의 생성을 억제하여 류마티스 관절염을 완화시키는 역할을 한다는 기존의 보고와 상반되는 것으로, 본 발명은 Fas 리간드가 Fas와와 상호작용에 의한 아픕토시스와 무관하게， Fas 리간드 (sFas 리간드)가 독립적으로 관절염， 특히 류마티스 관절염의 유발 인자로서 작용함을 최초로 밝힌 것이다.
이를 종합해보면， sFas 리간드는 Mip-la, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현올 증가시키는 역할을 하며， 이에 의하여 염증 반웅에 중요한 인자로서 역할을 하며. 또한 류마티스 관절염의 중요한 발병 원인 중 하나임이 확인되었고, 이를 이용하여 염증， 특히 관절염의 예방뿐만 아니라 치료차원에도 효과적인 표적 분자로서 유용하다.
이러한 발견에 기초하여, 본 발명의 일례는 sFas 리간드를 이용하여 케모카인류 물질, 예컨대， Mip-la (macrophage inflammatory protein- 1 α， accession number: NP_035467, AAI_11444, CAI25136, ABY66390, EDL15715 등)， Mip-lp(accession number: NP_038680, AAI 19258, AAI 19260, CAI 25137, EDL 15716), RANTES(Chemokine (C-C motif) ligand 5, CCL5, accession number: CAJ18523, AAH33508, AAU43779, EDL 15710 등) 및 IP- 10 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 10, CXCLIO, accession number: AAH 30067, EDL 05256, NP_067249 등)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 구체적으로， Fas 리간드를 subject에 투여하거나， Fas 리간드 활성을 증진시켜 (예컨대, subject에 Fas 리간드 활성 증진제를 처리), Mip-la, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 또한， Fas 리간드를 억제하여 (예컨대, subject에 Fas 리간드 활성 억제제를 처리)， Mip-la, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현을 감소시키는 방법이 제공된다.
또 다른 면에서, sFas 리간드를 유효성분으로 포함하는 케모카인류 물질 조절제가 제공된다. 보다 구체적으로 sFas 리간드 또는 sFas 리간드 활성 증진제를 유효성분으로 포함하는 Mip-la, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현 증진제가 제공된다. 또 한， sFas 리간드 억제제를 유효성분으로 포함하는 Mip-la, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현 억제제가 제공된다.
또 다른 면에서, sFas 리간드의 케모카인류 물질 조절을 위한 용도가 제공된다. 보다 구체적으로 sFas 리간드 또는 sFas 리간드 활성화제의 Mip-la, RANTES, 및 IP- 10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현 촉진 또는 발현 촉진제 제조에 사용되기 위한 용도가 제공된다. 또한, sFas 리간드 억제제의 Mip-la, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질의 발현 억제 또는 발현 억제제 제조에 사용되기 위한 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 구체예에 있어서, sFas 리간드 또는 이의 활성 증진제를 subject에 투여하거나， sFas 리간드를 함께 배양하여 케모카인의 발현을 증가시키거나, sFas 리간드 억제제를 subject에 투여하여 케모카인의 발현을 감소시킬 수 있다.
또한, sFas 리간드는 그 자체가 케모카인으로서 역할을 하여 직접적으로 염증세포 유입 및 /또는 염증 유발 작용을 할 수 있다 (실시예 8 참조).
상기와 같은 케모카인류 물질은 염증 반웅에 관여하는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 또 다른 측면에서는 sFas 리간드를 억제하여 염증 반웅을 억제하는 기술이 제공된다. 특히， Mip-ΐα, RANTES, 및 IP-10로 이 루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인류 물질과 관련된 염증, 예컨대， 관절염， 특히 류마티스 관절염을 예방， 치료， 완화， 및 /또는 경감시키는 기술이 제공될 수 있다.
이에, 본 발명의 일례는 관절염， 바람직하게는 류마티스 관절염 환자에게 sFas 리간드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 관절염 예방 및 /또는 치료 방법은 sFas 리간드 억제제를 투여하는 단계 이전에 관절염， 바람직하게는 류마티스 관절염 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에 있어서, sFas 리간드 억제제를 포함하는 관절염， 바람직하게는 류마티스 관절염의 예방 및 /또는 치료용 조성물이 제공된다. 또 다른 예에 있어서, sFas 리간드 억제제의 관절염， 바람직하게는 류마티스 관절염의 예방 및 /또는 치료, 또는 예방 및 /또는 치료제 제조에 사용되기 위한 용도가 제공된다.
상기한 바와 같이， sFas 리간드는 그 자체가 케모카인으로서 역할을 하므로， 본 발명의 또 다른 예는 가용성 Fas (sFas) 리간드를 유효성분으로 포함하는 염증 유발용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 가용성 Fas (sFas) 리간드의 케모카인으로서의 용도를 제공한다. 또 다른 예는 포유류 또는 포유류에서 분리된 조직 또는 세포에 상기 가용성 Fas 리간드를 투여하거나 또는 접촉시키는 단계를 포함하는 혁증 유발 방법을 제공한다. 상기 포유류가 생체로 사용될 경우, 상기 포유류는 인간을 제외한 것으로 해석될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 sFas 리간드의 케모카인 발현 조절 및 관절염 등의 염증 반웅 조절 활성은 Fas와와 결합 및 apoptosis와 무관하게 일어나는 것을 특징으로 한다.
이 외에도, 본 발명자들은 sFas 리간드가 pAKT(P31750, NP_033782,AAH 66018, AAI 15584), pSyk (AAA87462, NP_035648, AAH 65121), pERK (NP_033257, NP_001033752, NP_036079, AAH_58258, AAH_06708) 등과 같은 NF-kB 관련 단백질의 발현을 증가시킴도 추가로 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 'Fas 리간드，는 특별한 언급이 없는 한 가용성 Fas (sFas) 리간드를 의미하는 것이다. 또한, 본 발명에서의 sFas 리간드는 포유류 유래의 것, 바람직하게는 설치류 또는 인간 유래의 것일 수 있으며， 예컨대， accession number AAA 19778 (SEQ ID NO: 1), 또는 AAC50071 (SEQ ID NO: 2)인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 'sFas 리간드의 활성 증진'은 sFas 리간드의 활성을 증진시키는 것은 물론， sFas 리간드의 발현을 증가시키는 모든 작용을 의미한다. sFas 리간드 활성 증진제는 sFas 리간드를 발현하거나 분비하는 세포의 활성화를 유도하여 sFas 리간드의 활성을 증진시키는 모든 물질로서， 예컨대, 관절염을 유도하는데 사용된 K/BxN serum에 포함되어있는 GPI (Glucose-6-Phosphate Isomerase) 단백질과, 항 GPI 항체, 또는 GPI-항 GPI 항체 복합체 등을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
또한， 본 명세서에서 사용되는 'sFas 리간드의 억제，는 Fas 리간드의 활성을 감소시키거나 제거하는 것은 물론， sFas 리간드의 발현억제, 제거 및 불활성화를 포함하여 sFas 리간드의 작용을 감소, 제거, 및 /또는 차단하는 모 든 작용을 의미한다. 상기 Fas 리간드 억제제는 Fas 리간드의 발현을 감소 시키거나, 작용을 감소, 제거, 및 /또는 차단하는 모든 물질을 의미하는 것으 로, 예컨대, Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제 (FAS ligand solubilization inhibitor, 예컨대,
Nl-hydroxyl-3-isobutyl-2-methyl-N4-(2-(methylamino)-2-oxo-l-phenylethyl)succinam ide), MMP(matrix metalloprotease)-3 inhibitor (Stromelysin-1 inhibitor; e.g.,
C27H46N10O9S, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 subject는 포유류, 바람직하게는 인간 또는 설치류, 또는 이로부터 분리된 세포.또는 조직일 수 있다. 바람직하게는, 상기 subject는 케모카인, 예컨대, Mip-ΐα, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현에 의한 병적 증상, 예컨대 염증을 앓고 있는 환자， 또는 이러한 병적 증상， 예컨대 염증이 유발된 세포, 조직, 또는 체액 등의 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 염증은 관절염일 수 있고, 상기 염증이 유발된 세포는 관절염 유발 세포, 보다 구체적으로 관절염이 유발된 관절 내에 침윤된 면역세포 및 /또는 활막세포, 관절염 환자의 말초 혈액 세포 등일 수 있다.
상기 Fas 리간드 억제제의 투여량은 환자의 상태， 염증 진행 정도 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대， 1일 투여량을 유효성분 함량 기준으로 0.1 내지 100 ug/kg (체중)， 바람직하게는 1 내지 50 ug/kg (체중)으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
후술하는 실시예에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 따른 염증， 특히 관절염의 예방 및 /또는 치료 방법은 발병 예방 효과 및 발병 초기에서의 치료 효과뿐 아니라, 병세가 진행된 중기 및 말기에도 병세 완화 및 치료 효과가 우수하다는 이점을 갖는다.
또 다른 일례에 있어서， Fas 리간드를 표적으로 하는 케모카인 발현 억제제의 스크리닝 방법이 제공된다. 상기 스크리닝 방법은
시료에 후보 물질을 반웅시키는 단계; 및
상기 시료의 Fas 리간드 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
상기 후보 물질을 처리한 시료에서의 Fas 리간드의 활성이 제거되거나， 후보 물질을 처리하지 않은 시료에서의 Fas 리간드 활성보다 감소된 경우 상기 후보 물질을 케모카인 발현 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 케모카인은 Mip-ΐα, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 케모카인류 물질은 염증 반웅에 관여하는 것으로 알려져 있으므로, 상기 스크리닝 방법에 의하여 선별된 케모카인 발현 억제제는 염증, 특히 류마티스 관절염 등의 관절염의 예방제 및 /또는 치료제로서 사용 가능하다. 따라서, 상기 스크리닝 방법은 염증 억제쎄, 및 /또는 관절염 (예컨대， 류마티스 관절염) 치료제의 스크리닝 방법일 수 있다.
상기 시료는 동물， 바람직하게는 포유류로부터 얻어진 세포， 조직 또는 기관일 수 있으며, 바람직하게는 면역 특전 부위 (immune privileged site)를 포함하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는， T 세포, NK 세포, 종양 세포 또는 안구 등일 수 있다.
상기 Fas 리간드 활성은 통상적 방법으로 측정 가능하며, 이는 이 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다. 예컨대， 동물에 가용성 FasL를 주입하여 관절염을 유발하였을 때 주입하지 않은 개체와 비교하여 약 1일 내지 20일간, 바람직하게는 약 8일 내지 12일간, 예컨대， 10일간 관절의 두께의 변화를 측정 함으로써 활성화의 정도를 평가할 수 있다. 또는， 예컨대, 관절염유도 후 관절에 침윤된 면역세포들을 얻어 가용성 sFasL와 함께 인큐베이션시킨 그룹과 그렇지 않은 그룹에서, 발현 또는 분비되는 케모카인류를 realtime PCR, Cytoflowmetry, FACS(fluorescence activated cell sorter), 또는 ELISA로 측정함으로써， 활성 정도를 평가할 수 있다. 예컨대, sFasL를 처리하지 않은 그룹과 처리한 그룹의 케모카인의 발현을 비교하여， 처리한 그룹이 처리하지 않은 그룹보다 케모카인의 발현이 증가 되어있다면, 후보 화합물의 접촉시 후보화합물의 활성정도에 따라 케모카인의 발현이 증가 되어있다고 판단할 수 있다.
Realtime PCR은 그룹간 상대 적인 양을 비교하고, ELISA는 절대량을 확인하고, FACS(fluorescence activated cell sorter)는 세포당 활성화 정도를 측정하는데 유리하다.
상기 후보 물질은 합성 또는 천연의 화합물, 폴리펩타이드， 폴리뉴클레오타이드 등을 모두 포함한다.
이와 같이 스크리닝된 케모카인 발현 억제'제는 염증, 특히 관절염의 발병 예방 및 발병 초기의 치료 효과뿐 아니라, 병세가 어느 정도 진행된 중기 및 말기에도 우수한 병세 완화 및 치료 효과를 갖는다는 이점이 있다. 본 발명에서 제시된 Fas 리간드를 이용한 케모카인 발현 조절 기술, 이를 이용한 염증， 특히 류마티스 관절염 등의 관절염의 예방 및 /또는 치료 기술, 및 이를 이용한 신규한 케모카인 발현 억제제의 탐색 기술은, 관절염의 발생을 효과적으로 예방할 수 있을 뿐 아니라， 병세가 어느 정도 진행된 후에도 우수한 치료 효과를 얻을 수 있게 하여， 관절염으로 고통 받는 많은 환자들을 치료하는데 매우 유용한 기술이다.
[도면의 간단한 설명]
도 la 내지 lc는 Fas 리간드 농도에 따른 케모카인의 발현 정도를 보여주는 것으로, la는 ΜΙΡ-1α의 발현 정도， lb는 RANTES의 발현 정도, lc는 IP-10의 발현 정도를 보여준다.
도 2a는 실시예 2에 따른 K/BxN 혈청 트랜스퍼에 의하여 관절염이 유발된 3 종류의 마우스 모델에서의 관절의 두께와 임상 지수를 나타낸 것이고,
2b는 상기 3 종류의 마우스의 관절 사진이고，
2c는 상기 3 종류의 마우스에서의 IFNY, IL-4 및 TGFp의 발현 정도를 보여주는 것이다.
도 3는 실시예 3에 따라서 z-VAD 처리된 마우스에서의 관절 두께 및 임상 지수를 나타낸 것이다.
도 4a는 실시예 4의 마우스의 관절 두께 및 임상 지수 측정 결과를 보여주는 것이고，
4b는 실시예 5의 마우스의 관절 두께 및 임상 지수 측정 결과를 보여주는 것이고，
4c는 실시예 5의 마우스 관절에서의 IFN^ IL-4 및 TGF|의 발현 정도를 보여주는 것이다.
도 5a는 실시예 6의 관절염 초기 마우스의 관절 두께 및 임상 지수 측정 결과를 보여주는 것이고,
5b는 실시예 6의 관절염 중기 마우스의 관절 두께 및 임상 지수 측정 ᅳ결과를 보여주는 것이고,
5c는 실시예 6의 관절염 말기 마우스의 관절 두께 및 임상 지수 측정 결과를 보여주는 것이고，
5d 내지 5f는 각각 실시예 6의 초기, 중기 및 말기 마우스 관절에서의
IFNy, IL-4 및 TGFp의 발현 정도를 보여주는 것이다.
도 6은 soluble Fas 리간드의 생체 내 생성을 억제한 경우의 관절 두께 및 임상 지수를 나타낸 것이다.
도 7a는 upper chamber에 염증 세포를 넣고 bottom chamber에 soluble Fas 리간드를 넣고 24시간 후 bottom chamber로 이동한 염증 세포의 수를 나타낸 것이고, 7b는 24시간 후 각각 upper chamber 와 bottom chamber의 세포수를 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 형태】 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. 실시예 l:Fas 리간드의 케모카인 발현 증가 효과 시험
정상 마우스인 B6 마우스 (오리엔트 바이오)에 K/BxN 마우스 (Harvard medical school, Boston, MA 의 Drs.D.Mathis와 C.Benoist에게서 KRN TCR 트랜스제닉 마우스파 NOD 마우스를 제공받아 교배하여 얻음)의 혈청을 주입하여 관절염을 유도하였다. 10일 관찰 후, 관절 내 침윤된 세포와 활막세포를 분리하여 in vitro 에서 가용성 Fas 리간드 (accession number AAA 19778 (SEQ ID NO: 1), 각각 l g, 5 μξ, 10 μg (R&D system)) 와 함께 배양하였다. 배양액은 10% Fetal bovine serum(Gibco), 1% penicillin streptomycin(Gibco), DMEM(Dulbeccos ' s Modified Eagle's Medium)(WelGene)을 이용하였으며 , SPL science 에서 제조하는 12 well culture plate 에 well/1 ml 의 배양액에 , well/106의 세포를 분주하였다.
24시 간동안 37°c, 5% C02 배양기에서 배양 후， 원심 분리 방법을 이용하여 세포와 배양액을 분리 한 후， 세포에서 RNA 를 추출하였다. RNA 의 추출은 Qiagen 에서 생산하는 RNasy mini prep kit를 이용하여 제공한 순서 에 따라 진행하였고, 이 중 3 g의 RNA를 다시 promega에서 생산하는
MMLV reverse transcription kit를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 얻어 진 cDNA 에서 Applied Biosystem 에서 제조하는 Realtime PCR ABI 7500를 이용하여 케모카인 Mip-ΐα, RANTES, 및 IP-10 의 발현을 측정하였다. 케모카인 primer 역시 Applied Biosystem에서 제조하였으며， 케모카인의 발현율은 성 격상 외부조건에 잘 변하지 않고 일정 정도의 높은 발현값을 보이는 house keeping gene 의 한 종류인 GAPDH로 표준화 하여 비교하였다.
이와 같이 얻은 결과를 도 la 내지 lc에 나타내었다. 도 la 및 lc에서 확인되는 바와 같이 , 가용성 Fas 리 간드를 처 리하지 않은 경우보다 처 리 한 경우에 3종류의 케모카인의 발현이 모두 증가하였으며 , 대체적으로 처 리 농도에 비 례하여 증가함을 알 수 있다. 실시 예 2: 동물 모델에서의 류마티스 관절염 유발 시험 1
항체 유발 관절염 (Antibody-induced arthritis) 모델에서 Fas 리 간드의 역할을 알아보기 위하여 , Fas 리간드가 겹핍 된 gld 마우스와 Fas가 결핍 된 lpr 마우스， 및 Fas와 Fas 리 간드를 모두 갖는 대조군 (정상) B6 마우스에 RA를 유도하였다. 우선， 관절염 이 자연스럽 게 유발된 Κ/ΒχΝ 마우스 (Harvard medical school, Boston, MA 의 Drs.D.Mathis와 C.Benoist에 게서 KRN TCR 트랜스제닉 마우스와 NOD 마우스를 제공받아 교배하여 얻음)에서 혈액을 얻어 혈청을 채취 하였다. 상기 한 바와 같은 B6 (오리 엔트 바이오)， lpr (중앙실험동물) 및 gld 마우스 (중앙실험동물) 에 게 상기에서 얻어 진 K/BxN 혈청 150μ1을 관찰 0일과 2일에 복강 내 (i.p)로 주입하였다. 관절의 두께는 칼리퍼 (Manostat, Switzerland)로 측정하였다.
임상지수 (Clinical index)는 다음올 참조하였다:
0: no joint swelling,
1： swelling of one finger joint,
2: mild swelling of wrist or ankle,
3: severe swelling of wrist or ankle. 상기와 같이 측정된 관절의 두께와 임상지수를 도 2a에 나타내 었다. 도 2a에서 확인되는 바와 같이 , B6 마우스와 lpr 마우스는 혈청을 주입하고 4일째부터 관절이 부어 오르기 시작하여 8~9일에 가장 높은 지수를 관찰할 수 있었다. 하지만 Fas 리 간드가 결핍 된 gld 마우스에서는 혈청을 주입 하고 10일 지나도 관절이 거 의 부어 오르지 않았고， 임상지수 역시 3~4 점에 머물러 있었다. 또한， 시험 마우스의 관절 사진을 도 2b에 나타내었다. 도 2b에서 확인되는 바와 같이 , gld 마우스에서 관절이 거 의 부어 오르지 않은 것을 관찰할 수 있었다.
K/BxN 혈청 트랜스퍼 모델에서 관절염증을 조절하는데 중요하게 관여하고 있는 사이토카인 (cytokine)의 발현을 관절 mRNA 에서 확인해 보았다. 혈청 트랜스퍼를 수행하고 10일 관찰 후 마우스를 안락사 시 켜 관절을 잘라내었다. RNeasy 키트 (Qiagen)를 이 용하여 관절 조직 에서 RNA를 분리하고， 모든 과정은 RNeasy 키트 (Qiagen)의 제조사에서 제공된 매뉴얼대로 시 행하였다. Reverse Transcription System (Promega Corporation, Madison, Wisconsin)을 이용하여 상기 분리 된 RNA 3 으로부터 cDNA를 합성하였다. 각 사이토카인 (IL-4, IFNy, 및 TGF|3)의 발현은 Applied Biosystems 7500 sequence detection system (Perkin-Elmer Biosystems)을 이용하여 측정하였으며 모든 결과는 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 발현과 비교하여 평균화하였다. 사용된 각각와 프라이머는 다음과 같으며 , Applied Biosystem (Foster City, CA) 에서 합성 하였다.
TGF-β 1 (forward): 5 '-GC AAC ATGTGGAACTCTACC AGAA-3 ' ,
TGF-βΙ (reverse): 5 '-GACGTCAAAAGACAGCC ACTCA-3 ' ,
TGF-βΙ specific probe:
FAM-ACCTTGGTAACCGGCTGCTGACCC-TAMRA
상기에서 얻어 진 결과를 도 2c에 나타내 었다. 도 2c에서 확인되는 바와 같이 , B6, 및 lpr 마우스에서 IL-4와 IFNY의 발현이 gld 마우스 보다 증가된 반면， TGF(3의 발현은 gld 마우스에서 증가되어 있었다. 상기 데 이 터들을 통해서 Fas 리 간드가 K/BxN 혈청 트랜스퍼 모델에서 관절 염증을 유도하는데 중요한 역할을 하고 있으며 , 이 러한 역할은 Fas와는 무관하게 독립 적 인 것 임을 확인할 수 있었다.
지금까지 알려 진 Fas 리간드의 대표적 인 기능은 그것의 수용체 인 Fas 와 결합하여 표적세포의 아픕토시스를 유도하는 것 이다. Fas 리간드가 Fas와의 상호작용에 의 한 아픕토시스를 통하여 관절 염증에 작용한다면， Fas 가 결핍된 lpr 마우스와 Fas 리간드가 결핍된 gld 마우스는 동일한 관절염 유발 양상을 보여야 할 것이다. 그렇지만, Fig la-lc에서 보이는 바와 같이, Fas가 결핍된 lpr마우스와 Fas 리간드가 결핍된 gld 마우스는 관절염의 유도에 있어서 서로다른 양상을 보이는 것으로 나타났다. 이는 Fas 리간드가 Fas와의 결합을 통한 아픕토시스의 유도로 관절염의 병인에 기여하는 것이 아니라, 또 다른 기작으로 관여할 가능성이 있음을 제시하는 것이라 할 수 있다. 실시예 3: 동물 모델에서의 류마티스 관절염 유발 시험 2
Fas 리간드가 Fas와의 결합에 의한 아픕토시스를 통하지 않고 별도의 독립된 기작으로 관절염 유발에 관여함을 보이기 위하여 다음과 같은 시험을 추가로 수행하였다.
상기 실시예 2에서 사용된 것과 같은 B6 마우스에 아폼토시스를 억제할 수 있는 카스파아제 억제제 (caspase inhibitor, z-VAD, Calbiochem)를 50ug, 또는 lOOug의 양으로 하루 전날 복강으로 처리한 후, K/BxN 혈청을 주입하여 관절염을 유도하였다. 상기 관절염이 유발된 마우스에 대하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 관절의 두께 및 임상 지수를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이， z-VAD를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우 모두에서 동일한 양상으로 관절염 점수 (관절 두께 및 임상 지수)가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 데이터를 통해서， 아품토시스는 K/BxN 혈청 트랜스퍼를 통한 관절염 유도에 전혀 관여하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 4: 동물 모델에서의 류마티스 관절염 유발 시험 3
Fas 리간드의 역할을 좀 더 확인해 보기 위하여, gld 마우스에 B6, lpr, 및 gW 마우스의 비장세포 (splenocyte)를 각각 면역 전달 (adoptive transfer)하여 관절염을 유도하여 시험을 수행하였다.
우선， B6, lpr, 및 gld 마우스를 안락사 하여 비장을 채취한 후에， 1ml 의 적혈구 (RBC) 용해 버퍼 (Qiagen)와 함께 균질화 시킨 후 RBC를 제거하고: 림프구를 얻었다. 멸균된 40μπι cell strainer (BD bioscience)로 여과한 후, 혈청 트랜스퍼 하루 전날 gld 마우스 한 마리 당 1 X 107 의 비장세포를 멸균된 PBS와 함께 전체 부피 300 μΐ를 맞추어 혈관 내 (i.v) 주입하였다. 이와 같이 비장세포가 트랜스퍼된 마우스 및 대조군으로서 비장세포가 트랜스퍼되지 않은 마우스에 대하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 관절 두께 및 임상 지수를 측정하여 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에서 확인되는 바와 같이, B6 와 lpr 마우스의 비장세포를 트랜스퍼해준 gld 마우스에서 트랜스퍼하지 않은 gld 마우스와 비교하여 관절 두께 및 임상 지수로 나타나는 관절염 점수가 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다. 반면에 gld 마우스의 비장세포를 트랜스퍼해 준 gld 마우스는 트랜스퍼하지 않은 gld 마우스와 유사하게 관절염이 거의 유도되지 않은 것으로 나타났다. 상기 데이터를 통해서 Fas가 결핍되었더라도 Fas 리간드가 존재하면 관절염이 유발될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 5: 동물 모델에서의 류마티스 관절염 유발 시험 4
다음으로， gld 마우스에 sFas 리간드 (soluble Fas ligand) 를 주입한 후 K/BxN 혈청을 트랜스퍼하여 관절염이 유발되는지 시험하였다.
마우스 sFas 리간드 (R&D) 2 μg 또는 10 을 혈청 트랜스퍼 전날에 gld 마우스 복강 내로 주입한 후 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 관절 두께 및 임상 지수를 측정하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 도 4b에서 확인되는 바와 같이, sFasL를 2μβ주입한 경우에는 관절 두께 및 임상 지수의 큰 변화가 없었지만, sFasL 10 을 주입한 경우에는, 야생형 B6 마우스와 비슷한 정도로 관절의 두께와 임상 지수가 증가하였다. 또한 sFasL 10 μβ 주입한 gld 마우스에서의 joint mR A 상의 IFNy, IL-4 및 TGFJ의 발현 정도를 측정하여 도 4c에 나타내었다. 도 4c에서 확인되는 바와 같이， sFasL 10 μβ 주입한 gld 마우스에서의 joint mRNA 상의 IFNy 와 IL-4 의 발현이 증가된 반면, TGF(의 발현은 감소하였다. 실시예 6: Fas 리간드 억제를 통한 관절염 치료 시험
이상의 결과들을 통하여 Fas 리간드는 K/BxN 혈청 트랜스퍼 모델에서 관절염을 유발시키는 중요한 병인 중 하나라는 것을 확인할 수 있었다ᅳ 이러한 결과는, 반대로 Fas 리간드 활성화의 차단은 관절염의 예방 및 치료에 효과적인 역할을 한다는 가능성을 제시한다. 이러한 가설을 확인하기 위해서, 관절염의 발병 단계를 초기 (early), 중기 (mediated), 및 말기 (late phase)로 나누어서 Fas 리간드의 활성화를 차단하고 관절염의 병세를 관찰하였다. Fas 리간드 블로킹 항체 (Fas ligand blocking antibody, BD bioscience)를 Ι μ^ 의 양으로 PBS와 흔합하여 전체 부피를 300 μΐ로 맞추어 Β6 마우스의 혈관 내 (i.v) 주입하였다. 혈청 트랜스퍼 하루 전날부터 혈청 트랜스퍼 9일 후까지 Fas 리간드 블로킹 항체를 처리하여, 관절염 발병 초기 단계에서의 Fas 리간드의 역할을 차단하였다. 상기 동물 모델에 대하여 실시예 2와 동일하게 관절 두께 및 임상 지수를 측정하여 도 5a에 나타내었다. 도 5a에서 볼 수 있듯이， Fas 리간드 블로킹 항체를 처리한 마우스에서 관절염의 발병이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 관절 염증의 중기라고 여겨지는 혈청 트랜스퍼 5일 후부터 9일까지 Fas 리간드 블로킹 항체를 H^g 또는 20 의 양으로 PBS와 흔합하여 전체 부피를 300 μΐ로 맞추어 Β6 마우스에 혈관내 주입하고, 관절 두께 및 임상 지수를 측정하여 도 5b에 나타내었다. 도 5b에서 확인되는 바와 같이， Fas 리간드 블로킹 항체를 관절염 발병 중기에 처리한 경우에도 관절염이 억제되는 현상을 관찰할 수 있었으며， 이러한 억제 효과는 Fas 리간드 블로킹 항체의 농도가 높아 질수록 더 유의미한 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
마지막으로 관절염 점수 (관절 두께 및 임상 지수)가 가장 높은 시기인 혈청 트랜스퍼 8일 후부터 관찰 11일까지 Fas 리간드 블로킹 항체를 20 μg 의 양으로 PBS와 흔합하여 전체 부피를 300 μΐ로 맞추어 Β6 마우스의 혈관 내 (Lv) 주입하였다. 상기 마우스에 대하여 실시예 2와 동일한 방법으로 관절 두께 및 임상 지수를 측정하여 그 결과를 도 5c에 나타내었다. 도 5c에서 확인되는 바와 같이, 관절염 발병 초기, 중기와 마찬가지로， 말기에서도 Fas 리간드 블로킹 항체 처리시 관절염이 빠른 속도로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 혈청 트랜스퍼된 B6 마우스 모델의 Joint mRNA 상에서 사이토카인 (IL-4, IFNy 및 TGFP)의 발현 정도를 관절염 발병 초기, 중기 및 말기로 각각 측정하여 그 결과를 도 5d 내지 5f에 각각 나타내었다. 도 5d 내지 5f에서 확인되는 바와 같이， 관절염 발병 초기， 중기 및 말기 모두에서 Fas 리간드 블로킹 항체를 주입한 마우스에서 IL-4 와 IFNY 의 발현이 감소하고, TGF(3의 발현은 증가한 것으로 나타났다. 실시예 7: soluble Fas 리간드의 생성을 억제 했을 때 관절염 유발 실험 실제로 관절염의 유발을 촉진하는 soluble Fas 리간드의 생체 내 생성을 억제하였을 때 관절염의 유발이 억제되는지 시험하였다. 야생형 B6 마우스와 Fas 결핍 lpr 마우스, 그리고 Fas 리간드 결핍 gld 마우스에 첫번째 혈청 트랜스퍼 전날과 그 다음날 메트릭스 메탈로프로테이네이즈 -3 억제제 (MMP-3 inhibitor, Calbiochem, Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2 ) \00μg 을 복강 내로 주입한 후 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 관절 두께 및 임상 지수를 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인되는 바와 같이 야생형 B6 마우스에 sFas 리간드의 생성을 억제하였을 경우 관절 두께 및 임상 지수가 감소하는 것을 관찰 하였고, lpr 마우스와 gld마우스에서는 이러한 효과를 관찰할 수 없었다. 상기 데이터를 통하여, MMP 억제제의 관절염 치료 효과는 sFas 리간드 생성 억제를 통하여 얻어지며， sFas 리간드의 생성은 관절염의 유발을 촉진하는 중요한 요인임을 확인할 수 있었다. 실시예 8:solubleFas 리간드의 직접적인 케모카인 역할의 확인 시험 위의 데이터 들을 통하여 sFas 리간드의 생성은 케모카인의 발현을 촉진하고, 이는 관절염의 유발하는 역할을 함을 알 수 있었다. 다음으로 sFas 리간드가 단순히 케모카인의 발현 조절제가 아닌 sFas 리간드 자체가 염증세포의 유입을 촉진하는 케모카인으로 작용할 수 있는지 시험해 보았다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 야생형 B6 마우스에 관절염을 유도한 후 가장 관절 두께 및 임상 지수가 높은 8일째 관절에 유입된 염증 세포를 얻은 후， 80μηι transwell plate(BD Falcon)의 upper chamber는 300μ1 배양액 (RPMI 1640, 10% Fetal bovine serum, 1% antibiotics) 에 염증 세포를 넣고， bottom chamber는 700μ1 배양액에 각각 Ong, 50ng 그리고 100ng의 sFas 리간드를 넣어주었다. 24시간 후， sFas 리간드에 따라 upper chamber에서 bottom chamber 로 이동한 세포의 수가 전체 upper chamber에 넣은 수의 얼마의 비율인지를 도 7a에 나타내었다. 또한 24시간 후 각각 upper chamber 와 bottom chamber의 세포수를 도 7b에 나타내었다.
도 7a 및 7b에서 알 수 있는 바와 같이, sFas 리간드 농도와 비례하여 upper chamber에 있던 염증 세포 중 bottom chamber 로 이동한 세포 수가 증가하였다. 상기 결과를 토대로 sFas 리간드는 케모카인의 발현을 조절할 뿐만 아니라 sFasL 자체가 케모카인으로 작용함을 확인할 수 있었다. 위의 결과들을 종합해 볼 때 Fas 리간드 활성 차단은 케모카인의 발현을 억제하여 염증 반웅을 억제하며， 염증， 특히 관절염의 발병 초기뿐만 아니라 발병 후에도 관절염 증세의 억제에 효과적이라는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 이러한 결과들은 관절염을 비롯한 염증의 예방 및 치료법 개발에 획기적인 정보를 제공할 수 있을 것이다. 더 나아가, sFasL 자체의 케모카인으로서의 새로운 용도를 제공한다.

Claims

【청구의 범위】
1. 가용성 Fas (sFas) 리간드 억제제를 유효성분으로 함유하는, Mip-ΐα, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인 발현 억제용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 가용성 Fas 리간드 억제제는 Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제, 및 MMP-3 억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인 조성물.
3. 가용성 Fas (sFas) 리간드를 유효성분으로 포함하는 염증 유발용 조성물.
4. 가용성 Fas (sFas) 리간드 억제제를 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 가용성 Fas 리간드 억제제는 Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제， 및 MMP-3 억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인 조성물.
6. 제 4항 또는 제 5.항에 있어서, 상기 염증은 관절염인 조성물.
7. 제 6항에 있어서， 상기 관절염은 류마티스 관절염인 조성물.
8. 가용성 Fas (sFas) 리간드 억제제의 Mip-ΐα, RANTES, 및
IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인 발현 억제를 위한 용도로 사용하기 위한 용도.
9. 제 8항에 있어서, 상기 가용성 Fas 리간드 억제제는 Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제, 및 MMP-3 억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인 용도.
10. 가용성 Fas(sFas) 리간드의 케모카인으로서의 용도.
11. 가용성 Fas (sFas) 리간드 억제제의 염증 예방 또는 치료를 위한 용도.
12. 제 11항에 있어서, 상기 가용성 Fas 리간드 억제제는 Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제, 및 MMP-3 억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인 용도.
13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 염증은 관절염인 용도.
14. 제 13항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 용도.
15. 케모카인 발현 감소를 필요로 하는 환자 또는 케모카인이 과다 발현된 세포에 가용성 Fas 리간드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는,
Mip-ΐα, RANTES, 및 IP-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인의 발현을 감소시키는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 가용성 Fas 리간드 억제제는 Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제, 및 MMP-3 inhibitor로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 케모카인의 발현을 감소시키는 방법.
17. 포유류 또는 포유류에서 분리된 조직 또는 세포에 상기 가용성 Fas 리간드를 투여하는 단계를 포함하는， 염증 유발 방법.
18. 염증 환자 또는 염증이 유발된 세포에 가용성 Fas 리간드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는，
염증의 예방 또는 치료 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 가용성 Fas 리간드 억제제 Fas 리간드 블로킹 항체, Fas 리간드 가용화 억제제， 및 MMP-3 inhibitor로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 염증의 예방 또는 치료 방법.
20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 염증은 관절염인, 염증의 예방 또는 치료 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 염증의 예방 또는 치료 방법.
22. 시료에 후보 물질을 반웅시키는 단계; 및
상기 시료의 Fas 리간드 활성을 측정하는 단계
를 포함하고，
상기 후보 물질을 처리한 시료에서의 Fas 리간드의 활성이 제거되거나, 후보 물질을 처리하지 않은 시료에서의 Fas 리간드 활성보다 감소된 경우 상기 후보 물질을 Mip-la,RANTES, 및 IP- 10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 케모카인 발현 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는, 케모카인 발현 억제제의 스크리닝 방법.
23. 시료에 후보 물질을 반웅시키는 단계; 및
상기 시료의 Fas 리간드 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
상기 후보 물질을 처리한 시료에서의 Fas 리간드의 활성이 제거되거나， 후보 물질을 처리하지 않은 시료에서의 Fas 리간드 활성보다 감소된 경우 상기 후보 물질을 염증 치료제로 결정하는 것을 특징으로 하는， 염증 치료제의 스크리닝 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 염증은 관절염인, 염증 치료제의 스크리닝 방법.
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