WO2012143577A1 - Partículas codificadas - Google Patents

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WO2012143577A1
WO2012143577A1 PCT/ES2011/000130 ES2011000130W WO2012143577A1 WO 2012143577 A1 WO2012143577 A1 WO 2012143577A1 ES 2011000130 W ES2011000130 W ES 2011000130W WO 2012143577 A1 WO2012143577 A1 WO 2012143577A1
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metal core
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microsphere
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Luis Manuel LIZ MARZÁN
Ramón Ángel ÁLVAREZ PUEBLA
Francisco Javier Garcia De Abajo
Eduardo GARCÍA-RICO FERNÁNDEZ
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidade de Vigo
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidade de Vigo
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to an encoded particle.
  • the present invention relates to a method for the preparation of an encoded particle.
  • the present invention relates to a method for the preparation of a microsphere and to the microsphere obtained by the method.
  • the present invention relates to a method of detecting biological materials.
  • the present invention relates to the use of an encoded particle.
  • Ideal strategies for drug discovery as well as for the analysis of any biological material should allow users to simultaneously investigate the presence of a large number of biological markers in each sample (e.g. high sampling
  • reaction For example, if only one reaction of interest occurs in a group of thousands of molecules that are sampled against a certain target analyte, it should be possible
  • US 2011/0046009 Al describes a method for detecting the methylation status of a genomic target locus.
  • the encoded signal is based solely on fluorescence detection through sets of encoded particles.
  • the present invention aims, among other objectives, to provide a coded particle that
  • Another objective of the present invention is to provide a particular coded that allows the binding of biological material, and thus provide the marking of the biological material with the coded particle.
  • the metal core in the encoded particle comprises at least one metal core, which can be a metal core, two metal cores, three metal cores, four cores Metallic or more.
  • the particular encoded of the present invention can therefore contain at least two metal cores.
  • the term "core" is understood as the internal part of the coded particle.
  • the at least one metal core in the particular encoded of the present invention may be made of a metal, or a combination of metals, from the periodic table.
  • Preferred metals can be iron, cobalt, nickel, palladium, platinum, copper, silver, gold.
  • they are made of silver or gold.
  • the at least one metal core is made of an alloy of silver and / or gold.
  • the at least one metal core can present on the surface of the core, surfactant molecules that
  • the surfactant can be any aromatic or aliphatic complex of ammonium, carboxylic acid or
  • surfactants are cetyl trimethyl ammonium bromide, citrate, oleic acid, poly (vinyl pyrrolidone), acid
  • the marking agent can also be designated as a molecule comprising a code, or molecular code, or bar code.
  • the marking agent binds, or retains, to the surface of said metal core. It should be understood that the marking agent is located around the core
  • the marking agent in the context of the present invention is provided by the retention of a molecule comprising a conjugate system, such as at least one aromatic group.
  • suitable marking agents include a phenyl or naphthalene ring.
  • a phenyl ring, commonly referred to as phenyl group comprises 6 carbon atoms sp2.
  • a naphthalene ring comprises 10 sp 2 carbon atoms.
  • the aromatic group may be substituted with any organic group.
  • the aromatic ring is substituted with a functional group chosen from: -SH, -SeH, TeH, amines (primary, secondary, tertiary), cyanides, -S-, -Se-, - Te-, or any other group that allows fixing on a metal core, by self-assembly and / or electrostatic interactions.
  • marking agents include colorants, aromatic thiols, selenides
  • aromatics aromatic tellurides, aromatic amines, aromatic cyanides or any other conjugated molecule that contains at least one group that has high affinity for silver and / or gold surfaces.
  • the marking agent is attached to the surface of said metal core, providing a core
  • the metal core on whose surface the marking agent is attached is also designated as a marked metal core.
  • the marked metal core is in turn encapsulated by the outer layer of inert material.
  • the material is an inert material, and the term “inert” should be understood as not interacting with the marking agent.
  • the outer layer is therefore located on the
  • the outer layer that encapsulates the marked metal core can be regular or irregular in thickness.
  • the particular coding of the present invention is composed of an internal part made of at least one metal core, around which a marking agent, also designated as fixed, or
  • the marking agent can be attached around the metal core by covalent bonds, or by electrostatic and / or van der aals forces.
  • the outer layer of inert material can also be designed as a protective layer and can contain
  • Inorganic oxides are any suitable inorganic oxides. Examples of inorganic oxides are silica (Si0 2 ) or titania (Ti0 2 ). Polymers can be
  • Any suitable polymer examples are polyethylene glycol copolymers or polyethylene glycol homopolymers, or block copolymers with suitable biocompatibility and reactive functional groups, or proteins.
  • the outer layer may be made of at least one molecular layer of a siloxane or a titanoxane that binds the dyeing agent with a suitable functional group.
  • the siloxane or titanoxane provides an outer layer of silica or titania on the surface of the particle
  • the surface of the outer layer is provided with a functional group.
  • the siloxane can have the general formula XR ⁇ Si (OR 2 ) (OR 3 ) (OR 4 ), where X is the functional group, R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are a hydrogen or an alkyl group of
  • the titanoxano may have the general formula XR 1 - Ti (OR 2) (OR 3) (OR 4) where X is the functional group, R 1, R 2, R 3 and R 4 are hydrogen or an alkyl group Any length, they can be the same or different. Any of the groups R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be absent. Siloxanes and
  • Titanoxanes used as the outer layer herein
  • invention may also contain some siloxane or
  • Siloxanes and titanoxanes containing at least one alkyl group can also be designated as
  • the functional group, X, of the siloxan or the titanoxane can be any organic functional group.
  • At least one functional group should be understood as at least one type of functional group.
  • the surface of the outer layer can have one type, two types or three types of groups
  • the coded particle according to the present invention comprises at least one biomolecule directly or
  • the at least one biomolecule can be linked to the outer layer, or attached
  • Biomolecules can be amino acids, proteins, nucleic acids, peptides, saccharides, hormones, lipids or other macromolecules suitable for interactions.
  • the at least one biomolecule can be linked through a link point.
  • the point of attachment may be the same or different than the siloxane or titanoxane described above. Therefore, in the outer layer of inert material, a bonding point may be additionally present.
  • the link point is functionalized by at least one functional group, as they can be thiols (-SH), selenoles (-SeH), tellurols (TeH), amines (primary, secondary, tertiary), cyanides (-CN), thiocyanides (-SCN), sulfides (-S-), selenides (-Se -), tellurides (-Te-), carboxyl groups (-COOH), esters (-COO-). These functional groups may allow binding with other molecules, such as biomolecules.
  • the metal core of the coded particle is spherical, or ellipsoidal or conical, or cylindrical, or cubic, or cuboid, or pyramidal of square base, or pyramidal of triangular base, or triangular prismatic, or octagonal prismatic.
  • a spherical shape must be understood as a perfectly round geometric object in space
  • spherical should be understood as perfectly spherical or substantially spherical. In the context of the present invention, the aforementioned shapes may be perfect shapes or may present some geometric imperfections, giving substantially inaccurate geometries.
  • An ellipsoidal shape must be understood as an upper dimensional analog of an ellipse.
  • a conical shape should be understood as a geometric shape that sharpens smoothly from a flat, normally circular base to a point called a vertex. More precisely, it is the solid figure surrounded by a flat base and the surface (called lateral surface) formed by the locus of all straight linear segments that join the vertex with the perimeter of the base.
  • a cylindrical shape should be understood as a curvilinear geometric shape, whose surface is formed by points at a fixed distance from a given segment, the axis of the cylinder.
  • a cubic form must be understood as a three-dimensional solid surrounded by six faces, facets or square sides, so that three meet at each vertex.
  • the cubic form can also be called regular hexahedron. It is a special form of square prism, rectangular parallelepiped and trigonal trapezohedron.
  • a cubic form must be understood as a form with six sides, which form a convex polyhedron.
  • cuboid may be used to refer to such a form in which each of the faces is a rectangle (and therefore each pair of adjacent faces are at a right angle);
  • This more restrictive type of cuboid is also known as straight cuboid, rectangular box, rectangular hexahedron, straight rectangular prism, or rectangular parallelepiped.
  • Pyramid of triangular base should be understood as a square pyramid or a triangular pyramid
  • the shape of the metal core can be triangular prismatic.
  • a triangular prism prism is a three-sided prism; It is a polyhedron made of a triangular base, a translated copy, and 3 faces that join corresponding sides. Equivalently, it is a pentahedron of which two faces are parallel, while those normal to the Surface of the other three are in the same plane (which is not necessarily parallel to the base planes). These three faces are parallelograms. All cuts parallel to the base faces are the same triangle.
  • An octagonal prismatic shape is the sixth in an infinite set of prisms, consisting of square sides and two caps that are regular octagons. If the faces are all regular, it is a semi-regular polyhedron. In the context of the present invention, if the shape of the at least one metal core is prismatic
  • octagonal it can also be designated as a rod.
  • the at least one metal core of the coded particle has a surface provided with at least one tip.
  • At least one point should be understood as one point, two points, three points, four points, five points, six points, seven points, eight points, nine points, ten points, without limitation as to the maximum number of points. Therefore, the surface can be provided with multiple points.
  • the metal core may have any of the shapes recited above and also be provided with at least one tip.
  • a star-shaped nucleus can also be designated as a star-shaped particle (PFE).
  • the at least one metal core is a star-shaped core.
  • the star shape can be regulated geometrically (at least two points of
  • the at least one metal core is a star-shaped particle (PFE) is that the presence of tips improves the properties of the metal core.
  • PFE star-shaped particle
  • the present invention surprisingly shows that when the metal cores are star-shaped, the properties of the metal core improve.
  • a star-shaped core allows better detection of the mareaje agent.
  • the detection of the marking agent can be carried out by Raman enhanced surface dispersion spectroscopy (SERS), which has the advantage that the detection can be carried out under a conventional optical microscope attached to a Raman spectrometer. Therefore, simple equipment can allow the detection of the encoded particles.
  • SERS Raman enhanced surface dispersion spectroscopy
  • Coded particles can be fixed on a surface either by layer-by-layer electrostatic assembly with the appropriate polymers or by direct self-assembly on the surface, previously functionalized with thiols
  • particles encoded with a star-shaped core provide better detection and an increased signal.
  • Biomolecule bound to the outer layer is chosen from the group of amino acids, peptides, proteins, carbohydrates, hormones, lipids.
  • Amino acids are molecules that comprise an amino group, a carboxylic acid group and a side chain that It varies between different amino acids.
  • the key elements of an amino acid are carbon, hydrogen, oxygen, and nitrogen. They are particularly important in biochemistry, where the term usually refers to alpha-amino acids.
  • An alpha-amino acid has the generic formula H 2 NCHYCOOH, where Y is an organic substituent, the amino group is attached to the carbon atom immediately adjacent to the carboxylate group (carbon a).
  • amino acid when the amino group is attached to a different carbon atom; for example, in gamma-amino acids (such as gamma-amino acid-butyric) the carbon atom to which the amino group is attached is separated from the carboxylate group by two other carbon atoms.
  • gamma-amino acids such as gamma-amino acid-butyric
  • the various alpha-amino acids differ in which side chain (or group Y) is attached to their alpha carbon, and can vary in size from just one hydrogen atom in the glycine to a large heterocyclic group in the
  • Peptides are short polymers of amino acids linked by peptide bonds. They have the same peptide bonds as those of proteins, but are usually shorter in length. The shortest peptides are dipeptides, which consist of two amino acids linked by a single peptide bond. There may also be tripeptides, tetrapeptides, pentapeptides, etc. The peptides have an extreme amino and an extreme carboxyl, unless they are cyclic peptides.
  • a polypeptide is a simple linear chain of amino acids linked together by peptide bonds. Protein molecules consist of one or more polypeptides typically put together in a biologically functional manner and sometimes carry non-peptide groups, which may be called prosthetic groups or cofactors.
  • Proteins are biochemical compounds that consist of one or more polypeptides typically folded in one form. globular or fibrous in a biologically functional way.
  • a polypeptide is a single linear polymer chain of
  • amino acids linked by peptide bonds between the carboxyl and amino groups of adjacent amino acid residues are defined by the sequence of a gene, which is encoded in the genetic code.
  • the genetic code specifies 20 standard amino acids; however, in certain organisms the genetic code may include selenocysteine - and in certain archaea - pyrrolysine. Shortly after or even during the synthesis, the residues of a protein are usually
  • Proteins have attached non-peptide groups, which can be called prosthetic groups or cofactors. Proteins can also work together to achieve a particular function, and usually associate to form complexes.
  • Carbohydrates are organic compounds with the empirical formula C m (H 2 0) n ; that is, they only contain carbon, hydrogen and oxygen, with a hydrogen: oxygen ratio of 2: 1 (as in water). Carbohydrates can be seen as carbohydrates, hence their name. Structurally, however, it is more accurate to see them as polyhydroxyaldehydes and ketones.
  • Carbohydrates can also be designed as saccharides.
  • Carbohydrates saccharides
  • Carbohydrates saccharides
  • Carbohydrates saccharides
  • sugars monosaccharides and disaccharides, which are more carbohydrates small (lower molecular weight), they are usually known as sugars.
  • Hormones are chemically released by a cell or gland in a part of the body that sends messages that affect cells in other parts of the body. Only a small amount of hormone is needed to alter cellular metabolism. In essence, it is a chemical messenger that carries a signal from one cell to another. All multicellular organisms produce hormones; Plant hormones are also called phytohormones. Hormones in animals are usually transported in the blood. Cells respond to a hormone when they express a receptor
  • the hormone binds to the receptor protein, resulting in the activation of a
  • Lipids are a broad group of compounds that include fats, waxes, sterols, fat-soluble vitamins (such as vitamins A, D, E and K), monoglycerides, diglycerides, phospholipids, and others. You begin them
  • Biological functions of lipids include the
  • Lipids can be defined in general as hydrophobic or amphiphilic small molecules; The amphiphilic nature of some lipids allows them to form structures such as vesicles, liposomes, or membranes in an aqueous environment.
  • Biological lipids originate entirely or in part from two different types of biochemical subunits or "building blocks”: ketoacyl and isoprene groups. Using this approach, lipids can be divided into eight
  • fatty acyls glycerolipids, glycerophospholipids, sphingolipids, saccharolipids and
  • Lipids also include molecules such as fatty acids and their derivatives (which include tri-, di-, and monoglycerides and phospholipids), as well as other metabolites that contain sterol such as cholesterol.
  • Biomolecule is directly attached to the outer layer of the inert material.
  • directly linked it should be understood as linked by any interaction suitable for the binding of the at least one biomolecule.
  • the at least one biomolecule can advantageously be attached to the outer layer of inert material by means of covalent, electrostatic, or van der Waals interactions.
  • the biomolecule is linked by a linker comprising at least one functional group chosen from the group -OH, -SH, -SeH, -TeH, -COOH, a primary amine, a secondary amine, a tertiary amine.
  • the linker is advantageously a siloxane or a titanoxane, but it can also be a functionalized alkane that does not interfere with the marking agent.
  • Biomolecule indirectly bound to the outer layer is covalently bound to the outer layer, by (or through) a layer of inert material comprising the particle marked therein. Therefore, in this embodiment of the present invention, the marked metal core is embedded in a layer (which can also be designated as the first layer) of inert material and then encapsulated by the outer layer of inert material.
  • the mentioned (first) layer may or may not be of the same inert material as the layer external and therefore can be of any inorganic oxide or polymer defined in the context of the present invention.
  • the inert material is an inorganic oxide or an organic polymer comprising at least one group chosen from -OH, -SH, -SeH, -TeH, -COOH, a primary amine, a secondary amine, a tertiary amine , boronic acid, halides.
  • the at least one group is located on the surface of the outer layer.
  • the group -OH is designated as hydroxy group, -SH as thiol, -SeH as
  • boronic acid is -B (OH) 2 and in the context of the present invention, the halides are F-, Cl- or Br-.
  • the particular coded advantageously comprises an outer layer made of an inert material chosen from the siloxane, titanoxane, polyethenyl glycol polymers, polyvinyl alcohol polymers.
  • Siloxanes and titanoxanes are polymers, which alternate silicon atoms, or titanium respectively, and oxygen, where silicon is optionally substituted with a hydrogen atom or an alkyl chain.
  • a siloxane is
  • Siloxanes can have skeletons
  • polysiloxanes Representative examples are [SiO (CH 3) 2] n (polydimethylsiloxane) and [SiO (C 6 H 5) 2] n (polydiphenylsiloxane).
  • the organic side chains give them hydrophobic properties while the skeleton -Si-O-Si-O- is purely inorganic.
  • the definitions for siloxanes or polysiloxanes are also applicable for titanoxanes or polititanoxanes, where the Si atom is replaced by a Ti atom.
  • the outer layer may be made of a first layer of Si0 2 or Ti0 2 and a next layer of a siloxane or different titanoxano.
  • Polyethylene glycol (PEG) polymers are polyether compounds with many applications from industrial manufacturing to medicine, with the general formula
  • Polyvinyl alcohol (PVOH, PVA, or PVAl) is a water-soluble synthetic polymer with the general formula (C 2 H0) n .
  • Polyethylene glycol polymers can be homopolymers or any ethylene glycol co-polymers.
  • Biomolecule attached to the outer layer comprises a directed signal.
  • the directed signal can also be designed as a selective molecular recognition signal.
  • the biomolecule comprises a part or site or region in the biomolecule that can selectively recognize, or detect, a corresponding site or region, of a biological material.
  • An example of a directed signal is an epitope or a paratope.
  • An epitope also known as a determinant
  • epitopes are normally believed to be derived from non-self proteins, the sequences derived from the receptor that can be recognized are also classified as epitopes. Protein antigen epitopes fall into two categories, epitopes
  • a conformational epitope is composed of discontinuous sections of the amino acid sequence of the antigen. These epitopes interact with the paratope by the 3-D surface characteristics and the tertiary form or structure of the antigen. Most epitopes are
  • conformational A paratope is the part of an antibody that recognizes an antigen, the antigen binding site of an antibody.
  • linear epitopes interact with the paratope based on their primary structure.
  • the amino acids that make up a linear epitope are a
  • the directed signal can also be a paratope.
  • a paratope is the part of an antibody that recognizes an antigen, the antigen binding site of an antibody.
  • the biomolecule can mimic an epitope or a paratope.
  • Inert material is made of an inorganic oxide or an organic polymer.
  • the inert material of the outer layer must be inert in relation to the marking agent. This means that according to the present invention, the layer should not inhibit the mareaje agent when it detects it. Therefore, the inert material can be chosen from an inorganic oxide, such as a titanium oxide (Ti), zirconium (Zr), vanadium (V), chromium (Cr), silicon (Si).
  • Organic polymers such as substituted or unsubstituted polyethylene glycol (PEG) polymers (homopolymers or any copolymer), or substituted or unsubstituted polyvinyl alcohol polymers (homopolymers or any copolymer) are also inert materials suitable for the outer layer of the particles coded according to the present invention.
  • PEG polyethylene glycol
  • polyvinyl alcohol polymers homopolymers or any copolymer
  • the outer layer may be formed by at least one layer of inert material, such as one layer, two layers, three layers, four layers.
  • the interactions between the layers can be covalent or electrostatic.
  • the layers of inert material can be formed by self-assembly, physical adsorption or by polymerization initiated in the
  • Biomolecule attached to the outer layer binds to biological material.
  • the biological material can be material
  • biomolecule can be chosen to selectively bind to a particular type of bological material.
  • the at least one biomolecule is attached to the outer layer.
  • the biological material can be attached to the outer layer by a covelente bond, or by electrostatic and / or van der Waals forces (also designated as electrostatic and / or van der Waals bonds).
  • a covalent bond should be understood as a chemical bond between the biomolecule and the biological material.
  • the covalent bond includes many types of interactions, including ⁇ -linkage, ⁇ -bond, metal-to-metal bond, agotic interactions, and two-electron bonds between three centers,
  • electrostatic forces or electrostatic bonding
  • forces that exert electrical charges on each other are described by Coulomb's law.
  • van der Waals forces may allow the link between the biomolecule and the biological material through a permanent dipole and a corresponding induced dipole (or Debye force) interactions or forces between two induced dipoles
  • biomolecules containing a charged hydrophilic part (e.g. anionic) and a hydrophobic part can be attached to the biological matter through electrostatic forces and van der Waals.
  • the biological material is chosen from immune cells, cell membranes, viruses.
  • the biological material can be or come from any cell membrane.
  • a cellular membrane is a biological membrane that separates the inside of all cells from the outside environment. The cellular membrane is permeable
  • glycocalyx cellular, ionic conductivity and cellular signaling and serve as an anchor surface for the glycocalyx
  • T cells can be of any type. T cells are also designated as T lymphocytes and belong to a group of white blood cells known as lymphocytes, and play a central role in cell-mediated immunity. They can be distinguished from other types of lymphocytes, such as B cells and killer cells (NK cells) by the presence of a special receptor in their
  • T cell receptors TCR
  • T cell T cell receptors
  • thymus since this is the main organ responsible for the maturation of T cells.
  • B cells are lymphocytes that play an important role in the
  • B cells The main functions of B cells are to produce antibodies against antigens, carrying out the function of antigen presenting cells (APC) and, finally, they become B memory cells after activation by interaction with the antigen.
  • APC antigen presenting cells
  • B cells are an essential component of the adaptive immune system.
  • a virus is an infectious agent that can be replicated only within living cells of organisms. Viruses infect all kinds of organisms, from animals and plants to bacteria and archaea. Viruses consist of two or three parts: the genetic material composed of DNA or RNA, macromolecules that carry genetic information, a protein layer that protects these genes, and in some cases a lipid envelope that surrounds the protein layer when they are outside of a cell.
  • the forms of viruses range from simple helical and icosahedral forms to more complex structures.
  • An average virus is about one hundredth the size of an average bacteria.
  • the coded particle comprises at least two cores, for example, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten cores.
  • Metal cores can be added.
  • at least one of these metal cores is a star-shaped metal core.
  • the metal core is formed of metal core
  • the metal core may be made of silver (Ag), or gold (Au), or a silver and gold alloy (AgAu), or a silver alloy, such as AgM, or a gold alloy (Au), or an alloy of silver and gold, and at least one other metal
  • transition elements of the chemical elements table You can choose metals from the group: Co, Ni, Pd, Pt, Cu.
  • the coded particle of the present invention can have any total size or shape, as well as any size between 30 nanometers (nm) and 20 micrometers ( ⁇ ).
  • the size of the metal core is in the range of 10 nm to 2000 nm, such as any size above 10 nm, or greater than 20 nm, as well as any size less than 2000 nm, or by below 1000, or below 500 nm.
  • the metal core size can be adjusted. You can get good
  • the metal core has a shape comprising peaks, designated as star-shaped, especially good results can be obtained.
  • the marking agent comprises an aromatic group.
  • An aromatic group can be any conjugated cyclic hydrocarbon.
  • the marking agent, or marking molecule is any molecule capable of providing a code or signal detectable by ultraviolet light absorption,
  • Detection in the context of the present invention can be carried out in a microfluidic cell or a flow cytometry cell.
  • the marking agent may be given by the marking molecules, such as aromatic thiols,
  • the marking agent can be chosen from the group of acridines, anthraquinones, aryl methanes, azo dyes, diazonium dyes, nitro or nitrous dyes, phthalocyanines, quinone-imines, indamines, tlazoles, xanthenes, fluorenes, pironins, rhodamines or perylenes, and its derivatives .
  • the method for preparing an encoded particle comprises:
  • step i) is carried out in water, preferably deionized, or an alcoholic aqueous medium.
  • Step i) is carried out through the reduction of a metal salt with the appropriate reducing agent.
  • This water or aqueous medium is also suitable for the next step of the process according to the present invention.
  • metal salts are AgN0 3 , AgCl0 4 , HAuCl 4 .
  • reducing agents are NaBH4, sodium citrate, ascorbic acid, hydrazine. Shape and size
  • Step ii) is advantageously carried out by
  • Step iii) is advantageously carried out by means of sol-gel chemistry.
  • Sol-gel chemistry consists of
  • alkoxysilanes hydrolysis and condensation of alkoxysilanes in a mixture of water, ethanol and ammonia.
  • alkoxysilanes are tetraethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane or
  • Step iv) is advantageously carried out by self-assembly (previously functionalized with a
  • the encoded according to the present invention may comprise a stage III2) between stage iii) and stage iv), which includes the fixation of a chemical connector between the outer layer and the biomolecule.
  • the chemical connector is a alkyl chain comprising one to six functionalized carbon atoms at each end of the chain by a functional group as defined in the context of the present invention.
  • the chemical linker can also be a functionalized siloxane or titanoxane as defined in the context of the present invention.
  • the method according to the present invention prepares the coded particle according to the present invention.
  • Preferences defined by the encoded particle of the present invention are applicable to the method according to the invention for the preparation of the encoded particle.
  • the method for the preparation of an encoded particle comprises the preparation of a batch of particles.
  • metal core suspensions where the metal core consists of spikes, providing star shape to the metal core can be prepared by the method of the invention.
  • step iv) is followed by a step v) comprising the covalent attachment of at least one of the biomolecules of interest to the outer layer.
  • step v) comprising the covalent attachment of at least one of the biomolecules of interest to the outer layer.
  • biofunctionalization of the encoded particles The particles encoded according to the present invention in the context of the present invention can be designated as biofunctionalized encoded particles.
  • the present invention relates to a method for preparing a coded microsphere comprising at least two coded particles according to the present invention comprising:
  • the silica microsphere can have any diameter.
  • the diameter is of the order of 500 nm and 10,000 nm.
  • a microsphere can also be designated as a microbead, or microparticle in the context of the present invention. Encapsulate, in the context of this
  • the method for preparing a coded microsphere according to the present invention obtains the microsphere
  • the present invention relates to a method for the detection of material
  • the biological material binds to the encoded particles, or to the encoded microspheres, and is
  • the method for detection according to the present invention provides the advantages that it is a flexible method suitable for different detection techniques and provides a strong detection signal. Consequently, the method for the detection of biological material comprising the steps of:
  • coded microsphere according to the invention or obtained according to the method of the invention, or on a surface;
  • coded microsphere with a medium containing a biological material; 4) locate the coded particle or the
  • the method for the detection of biological material detects the biological material through the presence of a coded particle, or a
  • the detection method comprises a step 1) in which the coded particles, or of the coded microspheres, according to the present invention, are immobilized on a surface, such as a glass surface or a surface of silicon.
  • a surface such as a glass surface or a surface of silicon.
  • the fixing of the particles or microspheres to the surface is carried out by self-assembly or assembly directed by electrostatic interactions.
  • the surface may be of any material, such as glass, a silicon surface, metallic surfaces, or of a polymeric material, flat or shaped through any lithographic or non-lithographic method
  • Step 2 implies that the coded particles, or coded microspheres, are located, therefore they are detectable and therefore identifiable by any detection technique, such as ultraviolet light absorption, visible light absorption, infrared light absorption, Enhanced surface infrared absorption-reflectance, fluorescent light emission, phosphorescent light emission, Raman dispersion, Raman dispersion increased by surface, Raman dispersion of resonance increased by surface, Rayleigh dispersion.
  • any detection technique such as ultraviolet light absorption, visible light absorption, infrared light absorption, Enhanced surface infrared absorption-reflectance, fluorescent light emission, phosphorescent light emission, Raman dispersion, Raman dispersion increased by surface, Raman dispersion of resonance increased by surface, Rayleigh dispersion.
  • Step 3) is carried out by contacting the surface on which the encoded particle or the encoded microsphere has been attached, with a medium containing the biological material.
  • the medium is an aqueous medium in which the biological material can be in suspension.
  • the biological material is then attached to the coded particle, through covalent bonds, or electrostatic interactions and / or van der aals forces.
  • the biological material can be any biological material.
  • the biological material can originate from human biological material, animal biological material, biological material of plant origin.
  • the biological material can originate from microorganisms, bacteria, viruses.
  • step 4 the location of the particle
  • encoded together with the biological material which allows the detection of biological material through the presence of the encoded particle, or the encoded microsphere, fixed on the surface, is carried out by any detection technique in order to detect the encoded particle , or the encoded microsphere, and the substrate.
  • the metal core generates the electromagnetic field necessary to increase the Raman signal of the marking agent, or labeled molecule, once excited with the appropriate light.
  • Silver and / or gold metal cores and their alloys have plasmon resonances
  • the low toxicity, stability and a High optical efficiency of the metal cores according to the present invention allows the improvement in the detection of the marker agent around at least one metal core. Consequently, when the outer layer joins a
  • SERS detection can identify the marker agent alone, or a combination of the marker agent and the biomolecule.
  • the detection method involves locating according to steps 2) and / or 5) and requires detection by at least one detection technique of the group consisting of: absorption spectroscopy and / or absorption spectroscopy- Surface enhanced infrared reflectance and / or fluorescent light emission and / or Raman dispersion and / or Raman scattering spectroscopy, and / or surface enhanced Raman scattering spectroscopy, and / or surface enhanced Raman resonant scattering spectroscopy, and / or Rayleigh dispersion spectroscopy.
  • two or three detection techniques can be used at the same time or at least substantially at the same time. If the two or three detection techniques are carried out substantially at the same time, it should be understood that they are carried out one after another, but in the same sample within the same region of a sample.
  • Raman scattering spectroscopy increased by surface or Raman scattering spectroscopy augmented by surface.
  • spectroscopic techniques that measure the absorption of radiation, depending on the frequency or wavelength, due to its interaction with the sample.
  • the sample absorbs energy, that is, photons, from the field of radiation.
  • the intensity of the absorption varies depending on the frequency, and this variation is the absorption spectrum.
  • Absorption spectroscopy is performed through the electromagnetic spectrum. Absorption spectroscopy is used to determine the presence of a substance in a sample and, in many cases, to quantify the amount of substance present. Infrared spectroscopy and
  • Ultraviolet-visible are particularly common in analytical applications. There is a wide range of
  • SEIRA Surface-enhanced infrared absorption-reflectance spectroscopy
  • Zone selection is based on a series of physical properties and other material characteristics of the sample surface. Once the sample area has been selected, the molecular information of the surface
  • Selected can be stored spectroscopically in the infrared spectral region.
  • Emission fluorescence spectroscopy also called fluorescence spectroscopy, or fluorometry or spectrofluorometry, is a type of spectroscopy
  • a beam of light is used, usually ultraviolet light, which excites electrons in the molecules of certain compounds and causes them to emit light of lower energy, usually, but not necessarily, visible light.
  • a complementary technique is absorption spectroscopy.
  • Phosphorescence emission spectroscopy is a similar technique for measuring phosphorescence, that is, a specific type of fluorescence-related photoluminescence. Unlike fluorescence, a phosphorescent material does not immediately re-emit the radiation it absorbs. The lower re-emission time scales are associated with transitions between energy states
  • the absorbed radiation can be re-emitted with less intensity until several hours after the initial excitation.
  • Rayleigh dispersion spectroscopy measures the elastic dispersion of light or electromagnetic radiation by particles smaller than the wavelength of light, which can be individual atoms or molecules. It can occur when light travels through clear solids and liquids, but is more frequently observed in gases. Rayleigh dispersion depends on the electrical polarizability of the particles. The dispersion caused by particles similar or greater than the wavelength of light can be explained by the theory of Wed, or the approximation of discrete dipoles.
  • Raman dispersion spectroscopy is a spectroscopic technique used for vibrational study
  • Infrared spectroscopy produces similar but complementary information.
  • the sample is illuminated with a laser beam.
  • the illuminated spot light is collected with a lens and sent through a monochromator. Wavelengths close to the laser line must be filtered, due to the elastic dispersion of Rayleigh, while the rest of the collected light is dispersed on a detector, by notches or by the edge of the filter for the laser and the spectrographs (either axial transmissible (A), Czerny-Turner monochromator (TC)) or FT (based on
  • Raman dispersion increased in surface, resonant Raman dispersion increased in surface, Raman dispersion increased in points, polarized Raman dispersion,
  • Raman scattered surface spectroscopy SERS
  • SERRS Raman scattered surface scattered spectroscopy
  • the detection is carried out in a microfluidic cell or in a cell of
  • a microfluidic cell is a cell or a container suitable for microfluidics, or other applications where precise control and fluid handling are
  • a flow cytometry cell is a cell, or a suitable container for carrying out flow cytometry.
  • Flow cytometry is a technique used to count and examine microscopic particles, such as cells and chromosomes, by suspending them in a fluid stream and passing them through an electronic detection device. This allows simultaneous multi-parameter analysis of the physical and chemical characteristics of up to thousands of
  • Flow cytometry is routinely used in the diagnosis of health disorders, especially blood cancer, but it has many other applications in research and in clinical practice.
  • the particle in another aspect of the invention, the particle
  • microorganisms preferably bacteria or viruses.
  • the particle in another aspect of the invention, the particle
  • Encoded is used in the spectroscopic or microscopic detection of pathogens or immunogenic cells, or antibodies.
  • Coded is used in the spectroscopic and microscopic detection of hormones, or lipids, or liposarides or saccharides.
  • the encoded particle is used in the spectroscopic or microscopic detection of chemical reactions in a directed genomic locus.
  • microorganisms preferably bacteria or viruses.
  • toluidine (TB) and a layer of silica.
  • B Different coded nuclei, each with a single antibody, are contacted with the biological fluid of interest. After washing the particles, the detection antibodies are added with fluorescent dyeing, and the sample is washed again. An aliquot is deposited on a glass slide and scanning is carried out with two laser lines. The 488 nm laser line causes the fluorescence of the particles that have reacted. The antibodies that have reacted are identified by the SERS barcode of the particle (785 nm).
  • C Manufacture of a microarray for ELISA. The sample of particles is deposited on a micro-profiled silicon chip with a
  • the matrix is contacted, first with the biological fluid of interest, washed and then contacted with the detection antibodies with fluorescent dyeing.
  • the microarray is then swept with two laser lines: the 488 nm excitation laser line causes fluorescence in the particles that have reacted, while the antibody that has reacted is identified by the SERS barcode of the particle (785 nm).
  • SAP streptavidin-alkaline phosphatase
  • FAI fluorescent probe
  • FIG. 5 TEM images showing the cellular uptake of (A, C) Au-nanosphere-TB @ Si0 2 , and (B, D) SSP-TB @ Si0 2 ( Figure 1).
  • the scale bar represents 1 miera.
  • SERS map baseline intensity at 1419 errf 1 , 70 x 70 ⁇ 2 , step size of ⁇
  • Star-shaped nanoparticles, or nanostars are prepared by adding gold seeds with
  • any morphology and / or size coated with PVP is dispersed in ethanol or other solvent in a mixture of HAuCl 4 and PVP in DMF with rapid stirring at room temperature.
  • the color of the solution changes indicating the formation of star-shaped nanoparticles. It is possible to obtain any particle shape and size depending on the size and shape of the seed used.
  • Example 2 Marking and coating with silica of the metal core
  • the star-shaped nanoparticles, prepared according to Example 1 of the present invention are protected by adding a thiolated polyethylene glycol, mPEGSH, (calculated to provide 4 molecules / nm 2 ) to the star-shaped nanoparticles.
  • mPEGSH thiolated polyethylene glycol
  • the sample is stirred, centrifuged and redispersed in ethanol.
  • the molecular code is added dropwise with gentle agitation to the
  • Star-shaped nanoparticles stabilized with PEG Immediately after the addition of the molecular code, the silica coating is carried out through a sol-gel process by mixing the star-shaped nanoparticles stabilized with PEG with an ethanol / ammonia solution and the subsequent addition of
  • the reaction mixture is allowed to react for 24 h, then the particles are centrifuged and washed with ethanol. When the reaction time is over, the particles are centrifuged and washed with ethanol.
  • Example 3 Deposition, marking and protection of colloids on microspheres of S1O 2
  • Star-shaped nanoparticles are adsorbed onto microspheres (previously functionalized with a silane mercapto) by self-assembly and or by layer-on-layer protocols. Adsorption isotherms determine the conditions necessary to maximize the density of nanoparticles.
  • the materials thus prepared have applications in solid phase synthesis and applications in drug discovery. For key-lock type sensors, spectroscopic markers
  • the thickness of Si0 2 is precisely controlled to obtain final homogeneous microspheres that, in addition, can act as fluorescence enhancers.
  • Example 4 Solid phase synthesis and discovery of drugs with nanoparticles built on microspheres or coded particles for high scan
  • the star-shaped submicron particles marked and protected by an external silica coating obtained according to Example 2 and / or the compound microspheres obtained according to Example 3 are functionalized with a short chain aliphatic mercapto acid or an amine, providing a suitable functional group (-C00H, -NH 2 , - OH, Cl, or others) for phase peptide synthesis
  • SPPS solid
  • binds to amino acids binds to amino acids.
  • Fixing First amino acid is performed as follows.
  • DIPCDI dimethylformamide
  • DMF dimethylformamide
  • the amino acids are then coupled under standard SPSS conditions, using HBTU / DIEA (AA / HBTU / DIEA-4/3, 8/8) in DMF.
  • HBTU / DIEA AA / HBTU / DIEA-4/3, 8/8
  • the binding of the peptides to the compound microspheres is confirmed by liquid chromatography coupled to an LC / MS mass spectrometer (m / z) and NMR nuclear magnetic resonance, after obtaining a small peptide sample by cleavage of the solid support with 95% TFA.
  • Detection is performed by placing a mixture of particles (each with a different peptide), on a glass slide and mapping each particle with a Raman microscope with a red or near infrared laser to avoid damage to the sample.
  • a Raman microscope with a red or near infrared laser
  • Peptide nature is carried out by conventional vibration analysis.
  • Proper functionalization of the particles is achieved by silanization of the Si0 2 surface of the particles, with amino or acid functions, following standard bioconjugation procedures in aqueous suspension (i.e. carbodiimide chemistry, with l-ethyl-3 (3- dimethylaminopropyl carbodiimide, EDC, and N-hydroxybenzotriazole, HoBt, as coupling agents) of a capture (diagnostic) antigen or antibodies (biodetection) (Fig. 3A)
  • the encoded microparticles are used as a whole.
  • each coded particle carries a specific marker of a certain pathogen, tumor or disease.
  • the microparticles are contacted directly with the biological fluid of interest, or incorporated into a micro-profiled matrix. After a thorough wash, the
  • particles or matrices are immersed in a solution containing a fluorescent marker (antibody or antigen), washed again and then mapped with a Raman microspectrometer with two different laser lines: a blue laser
  • Example 6 Cell culture and nanoparticle capture
  • Cellular organisms, tissues or organs are contacted with the functionalized or not encoded particles.
  • the cultures are incubated with nanoparticles dispersed in the cell culture medium provided at a concentration of 6 nM (in cell culture dishes of 3 cm) for 2 hours at 37 'C in a humidified atmosphere of 5% C0 2.
  • Example 7 Use of coded particles for coding and traceability of money, documents and consumables
  • coding comprises printing, coating by

Landscapes

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Abstract

La presente invención se refiere a una partícula codificada. Específicamente, la partícula codificada según la presente invención, comprende: a) al menos un núcleo metálico; b) un agente de mareaje unido a la superficie de dicho núcleo metálico, proporcionando un núcleo metálico marcado; c) una capa externa de un material inerte que encapsula a dicho núcleo metálico marcado; y d) al menos una biomolécula directamente o indirectamente unida a dicha capa externa. Además, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una partícula codificada. Además, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una microesfera y a la microesfera obtenida por el método. Además, la presente invención se refiere a un método para detectar materiales biológicos. Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de una partícula codificada.

Description

PARTÍCULAS CODIFICADAS
La presente invención se refiere a una partícula codificada. Además, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una partícula codificada.
Además, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una microesfera y a la microesfera obtenida por el método. Además, la presente invención se refiere a un método para detectar materiales biológicos. Adicionalmente , la presente invención se refiere al uso de una partícula codificada .
Las estrategias ideales para el descubrimiento de fármacos así como para el análisis de cualquier material biológico deberían permitir a los usuarios investigar simultáneamente la presencia de un gran número de marcadores biológicos en cada muestra (p.e. muestreo de alto
rendimiento) y extraer una conclusión rápida y precisa sobre la actividad de un grupo de sustancias. En este momento, muchas de estas estrategias incluyen típicamente el barrido de librerías químicas para compuestos de interés y la identificación de moléculas diana específicas, tales como antígenos, anticuerpos, nucleótidos y péptidos. Herramientas prometedoras para este propósito son las 'tecnologías multiplex' , las cuales permiten llevar a cabo múltiples ensayos discretos simultáneamente en la misma muestra.
Quizás uno de los retos más importantes para el desarrollo de ensayos multiplex es la necesidad de seguir cada
reacción. Por ejemplo, si solo sucede una reacción de interés en un grupo de miles de moléculas que se muestrean frente a un cierto analito-diana, debe ser posible
determinar cuál molécula era responsable de esa reacción particular. US 2011/0046009 Al describe un método para detectar el estado de metilación de un locus genómico diana. En el método de US 2011/0046009 Al, la señal codificada se basa solamente en detección por fluorescencia a través de conjuntos de partículas codificadas.
Por lo tanto, hay una necesidad continua en el anterior estado del arte de proporcionar una particular codificada que sea detectablemediante un amplio rango de técnicas de detección, y/o cuya presencia pueda ser detectada fácilmente y/o localizada, y/o cuya composición pueda ser fácilmente analizada. Además, hay una continua necesidad en el anterior estado del arte de proporcionar un método para preparar una partícula codificada. Además, hay una continua necesidad de proporcionar un método de detección mejorado para un
material biológico determinado.
La presente invención tiene como objetivo, entre otros objetivos, proporcionar una partícula codificada que
presenta las ventajas arriba indicadas. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una particular codificada que permita la unión de material biológico, y de esta forma proporcionar el mareaje del material biológico con la partícula codificada. Esto se consigue por la presente invención por la partícula codificada que comprende:
a) al menos un núcleo metálico;
b) un agente de mareaje unido a la superficie de dicho núcleo metálico, proporcionando un núcleo metálico marcado;
c) una capa externa de un material inerte que encapsula dicho núcleo metálico marcado; y d) al menos una biomolécula directamente o
indirectamente unida a dicha capa externa.
En el contexto de la presente invención, el núcleo metálico en la partícula codificada comprende al menos un núcleo metálico, que puede ser un núcleo metálico, dos núcleos metálicos, tres núcleos metálicos, cuatro núcleos metálicos o más. La particular codificada de la presente invención puede contener por tanto al menos dos núcleos metálicos. El término "núcleo" se entiende como la parte interna de la partícula codificada.
El al menos un núcleo metálico en la particular codificada de la presente invención puede estar hecho de un metal, o una combinación de metales, de la tabla periódica. Los metales preferidos pueden ser hierro, cobalto, níquel, paladio, platino, cobre, plata, oro. Ventajosamente, están hechos de plata u oro. Ventajosamente, el al menos un núcleo metálico está hecho de una aleación de plata y/u oro.
El al menos un núcleo metálico puede presentar en la superficie del núcleo, moléculas de surfactante que
estabilizan el núcleo metálico. Algún surfactante o polímero puede estar sustancialmente presente en la superficie del núcleo metálico. El surfactante puede ser cualquier complejo aromático o alifático de amonio, ácido carboxílico o
polimérico que estabiliza el núcleo metálico. Ejemplos de surfactantes son el bromuro de cetil trimetil amonio, citrato, ácido oleico, poli (vinilpirrolidona) , ácido
poliacrílico .
El agente de mareaje también se puede designar como molécula que comprende un código, o código molecular, o código de barras. El agente de mareaje se une, or retiene, a la superficie de dicho núcleo metálico. Se debe entender que el agente de mareaje está situado en torno al núcleo
metálico. El agente de mareaje, en el contexto de la presente invención está proporcionado por la retención de una molécula que comprende un sistema conjugado, como al menos un grupo aromático. Ejemplos de agentes de mareaje adecuados incluyen un anillo fenilo o naftaleno. Un anillo fenilo, comúnmente designado como grupo fenilo comprende 6 átomos de carbono sp2. Un anillo naftaleno comprende 10 átomos de carbono sp2. El grupo aromático puede estar sustituido con cualquier grupo orgánico. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, el anillo aromático está sustituido con un grupo funcional escogido entre: -SH, -SeH, TeH, aminas (primarias, secundarias, terciarias) , cianuros, -S-, -Se-, -Te-, o cualquier otro grupo que permita la fijación sobre un núcleo metálico, por auto- ensamblaje y/o interacciones electrostáticas. Ejemplos de agentes de mareaje, en el context de la presente invención, incluyen colorantes, tioles aromáticos, selenuros
aromáticos, telururos aromáticos, aminas aromáticas, cianuros aromáticos o cualquier otra molécula conjugada que contenga al menos un grupo que presente alta afinidad por superficies de plata y/u oro.
El agente de mareaje está unido a la superficie del mencionado núcleo metálico, proporcionando un núcleo
metálico marcado. El núcleo metálico sobre cuya superficie se une el agente de mareaje, se designa también como núcleo metálico marcado.
El núcleo metálico marcado se encapsula a su vez por la capa externa de material inerte. El material es un material inerte, y el término "inerte" se debe entender como que no interacciona con el agente de mareaje.
La capa externa se localiza por tanto sobre la
superficie de la partícula marcada, en torno al agente de mareaje. La capa externa que encapsula el núcleo metálico marcado puede ser regular o irregular en grosor.
Por lo tanto, la particular codificada de la presente invención está compuesta de una parte interna hecha de al menos un núcleo metálico, alrededor del cual se une un agente de mareaje, también designado como fijado, o
retenido, o adsorbido, y subsiguientemente, sigue la capa externa encapsulante . El agente de mareaje puede estar unido alrededor del núcleo metálico por enlaces covalentes, o por fuerzas electrostáticas y/o de van der aals.
La capa externa de material inerte también se puede designer como capa protectora y puede contener
recubrimientos producidos por óxidos inorgánicos o
polímeros. Los óxidos inorgánicos son cualesquiera óxidos inorgánicos adecuados. Ejemplos de óxidos inorgánicos son sílice (Si02) o titania (Ti02) . Polímeros pueden ser
cualquier polímero adecuado. Ejemplos son copolímeros de polietilén glicol u homopolímeros de polietilén glicol, o copolímeros de bloques con biocompatibilidad adecuada y grupos funcionales reactivos, o proteínas.
Ventajosamente, la capa externa puede estar hecha de al menos una capa molecular de un siloxano o un titanoxano que se une al agente de mareaje con un grupo funcional adecuado. El siloxano o titanoxano proporciona una capa externa de sílice o titania sobre la superficie de la partícula
codificada. La superficie de la capa externa está dotada de un grupo funcional . El siloxano puede tener la formula general X-R^Si (OR2) (OR3) (OR4) , donde X es el grupo funcional, R1, R2, R3 y R4 son un hidrógeno o un grupo alquilo de
cualquier longitud, pueden ser los mismos o diferentes.
Cualquiera de los grupos R1, R2, R3 y R4 pueden estar
ausentes. El titanoxano puede tener la formula general X-R1- Ti(OR2) (OR3) (OR4) , donde X es el grupo funcional, R1, R2, R3 y R4 son un hidrógeno o un grupo alquilo de cualquier longitud, pueden ser los mismos o diferentes. Cualquiera de los grupos R1, R2, R3 y R4 pueden estar ausentes. Los siloxanos y
titanoxanos usados como capa externa en la presente
invención también pueden contener algún siloxano o
titanoxano que contenga cadenas ramificadas o no ramificadas de átomos de silicio y oxígeno alternados -Si-O-Si-O- o -Ti- O-Ti-0, con grupos alquilo unidos a los átomos de silicio o titanio. Los siloxanos y titanoxanos que contengan al menos un grupo alquilo también se pueden designar como
alkoxisilanos o alkoxititanos .
El grupo funcional, X, del siloxan o el titanoxano puede ser cualquier grupo funcional orgánico.
Ventajosamente, se han obtenido Buenos resultados con grupos funcionales escogidos del grupo: -SH, -SeH, TeH, aminas (primarias, secundarias, terciarias) , cianuro, tiocianuro, - S-, -Se-, -Te-, -COOH, -COO-, F-, Cl-, Br- .
En el contexto de la presente invención, "al menos un grupo funcional" se debe entender como al menos un tipo de grupo funcional. La superficie de la capa externa puede poseer un tipo, dos tipos o tres tipos de grupos
funcionales .
La partícula codificada según la presente invención comprende al menos una biomolécula directamente o
indirectamente unida a la superficie de la capa externa. Si la biomolécula está unida directamente a la capa externa de material inerte, la al menos una biomolécula puede estar unida covelentemente a la capa externa, o unida
electrostáticamente y/o por fuerzas de van der Waals. Las biomoléculas pueden ser aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, sacáridos, hormonas, lípidos u otras macromoléculas adecuadas para interacciones .
Si la al menos una biomolécula está unida
covalentemente (o enlazada covalentemente) a la capa
externa, la al menos una biomolécula puede estar unida a través de un punto de enlace. El punto de enlace puede ser la misma o diferente que el siloxano o titanoxano descrito más arriba. Por lo tanto, en la capa externa de material inerte, puede estar adicionalmente presente un punto de enlace. El punto de enlace, o punto de enlace químico, está funcionalizado por al menos un grupo funcional, como pueden ser tioles (-SH) , selenoles (-SeH), teluroles (TeH) , aminas (primarias, secundarias, terciarias) , cianuros (-CN) , tiocianuros (-SCN) , sulfuros (-S-) , seleniuros (-Se-) , telururos (-Te-) , grupos carboxilo (-COOH) , ésteres ( -COO- ) . Estos grupos funcionales pueden permitir la unión con otras moléculas, como biomoléculas .
Según la presente invención, el núcleo metálico de la partícula codificada es esférico, o elipsoidal o cónico, o cilindrico, o cúbico, o cuboide, o piramidal de base cuadrada, o piramidal de base triangular, o triangular prismático, u octagonal prismático.
Una forma esférica se debe entender como un objeto geométrico perfectamente redondo en el espacio
tridimensional, o sustancialmente imperfecto. Aquí
"esférico" se debe entender como perfectamente esférico o sustancialmente esférico. En el contexto de la presente invención, las formas citadas pueden ser formas perfectas o pueden presentar algunas imperfecciones geométricas, dando geometrías sustancialmente imprecisas. Una forma elipsoidal se debe entender como un análogo de dimensional superior de una elipse. Una forma cónica se debe entender como una forma geométrica que se afila suavemente desde una base plana, normalmente circular hasta un punto llamado vértice. De forma más precisa, es la figura sólida rodeada por una base plana y la superficie (llamada superficie lateral) formada por el locus de todos los segmentos lineales rectos que unen el vértice con el perímetro de la base. Una forma cilindrica se debe entender como una forma geométrica curvilínea, cuya superficie está formada por los puntos a una distancia fija de un segmento dado, el eje del cilindro. El sólido
encerrado por esta superficie y por dos planos
perpendiculares al eje también se llama cilindro. Una forma cúbica se debe entender como un sólido tridimensional rodeado por seis caras, facetas o lados cuadrados, de forma que tres se encuentran en cada vértice. La forma cúbica también se puede llamar hexaedro regular. Es una forma especial de prisma cuadrado, de paralelepípedo rectangular y de trapezoedro trigonal. Una forma cuboica se debe entender como una forma con seis lados, que forman un poliedro convexo. Existen dos definiciones de un cuboide que compiten (pero son incompatibles) en la bibliografía matemática. En la definición más general de un cuboide, el único requisite adicional es que cada una de estas seis caras sea un
cuadrilátero, y que el grádico no dirigido formado por los vértices y los lados del poliedro debe ser isomórfico con el gráfico de un cubo. Alternativamente, la palabra "cuboide" se puede usar para referirse a una forma de este tipo en la cual cada una de las caras es un rectángulo (y por tanto cada par de caras adyacentes se encuentran en un ángulo recto) ; este tipo más restrictivo de cuboide también se conoce como cuboide recto, caja rectangular, hexaedro rectangular, prisma rectangular recto, o paralelepípedo rectangular. Una forma piramidal de base cuadrada o
piramidal de base triangular se deben entender como una pirámide cuadrada o una pirámide triangular,
respectivamente. En una pirámide que tiene una base
cuadrada, si el vértice está perpendicularmente encima del centro del cuadrado, tendrá la simetría C4v- En una pirámide que tenga una base triangular, si el vértice está
perpendicularmente encima del centro del triángulo, tendrá la simetría C3v. La forma del núcleo metálico puede ser prismática triangular. Un prisma triangular prisma es un prisma de tres lados; es un poliedro hecho de una base triangular, una copia trasladada, y 3 caras que unen lados correspondientes. Equivalentemente, es un pentaedro del cual dos caras son paralelas, mientras que las normales a la superficie de las otras tres están en el mismo plano (que no es necesariamente paralelo a los planos base) . Estas tres caras son paralelogramos . Todos los cortes paralelos a las caras base son el mismo triángulo. Una forma prismática octagonal es la sexta en un conjunto infinito de prismas, formada por lados cuadrados y dos tapas que son octágonos regulares. Si las caras son todas regulares, es un poliedro semiregular. En el context de la presente invención, si la forma del al menos un núcleo metálico es prismática
octagonal, también se puede designar como varilla.
Según la presente invención, el al menos un núcleo metálico de la partícula codificada tiene una superficie dotada de al menos una punta. Al menos una punta se debe entender como una punta, dos puntas, tres puntas, cuatro puntas, cinco puntas, seis puntas, siete puntas, ocho puntas, nueve puntas, diez puntas, sin limitación en cuanto al número máximo de puntas. Por lo tanto, la superficie puede estar dotada de múltiples puntas. El núcleo metálico puede tener cualquiera de las formas recitadas arriba y además estar dotado de al menos una punta. El núcleo
metálico con una superficie dotada de al menos una punta, cuando comprende al menos tres puntas, también se puede designar como una estrella, o núcleo con forma de estrella. Un núcleo con forma de estrella también se puede designar como una partícula con forma de estrella (PFE) .
Ventajosamente, el al menos un núcleo metálico es un núcleo con forma de estrella. La forma de estrella puede ser regular geométricamente (al menos dos puntas de
aproximadamente el mismo tamaño y grosor) o irregular (al menos dos puntas de tamaños y grosores diferentes) . La ventaja de que el al menos un núcleo metálico sea una partícula en forma de estrella (PFE) es que la presencia de puntas mejora las propiedades del núcleo metálico. La presente invención sorprendentemente muestra que cuando los núcleos metálicos tienen forma de estrella mejora las propiedades del núcleo metálico. Además, un núcleo con forma de estrella permite una mejor detección del agente de mareaje. Por ejemplo, la detección del agente de mareaje puede llevarse a cabo por espectroscopia de dispersión Raman aumentada en superficies (SERS) , que presenta la ventaja de que la detección se puede llevar a cabo bajo un microscopio óptico convencional unido a un espectrómetro Raman. Por lo tanto, equipos sencillos pueden permitir la detección de las partículas codificadas. Para detección por SERS, las
partículas codificadas se pueden fijar sobre una superficie bien por ensamblaje electrostático capa-por-capa con los polímeros apropiados o por auto-ensamblaje directo sobre la superficie, previamente funcionalizada con tioles
aromáticos, seleniuros, telururos, aminas, cianuros u otros grupos que muestren alta afinidad por superficies de plata y/u oro.
Para algunas aplicaciones, la posibilidad de observar y resolver partículas individuales puede ser necesario. Dado que los sistemas micro-Raman convencionales unidos a
microscopios confocales poseen una resolución espacial de unos 500 nm, estas aplicaciones requieren partículas
codificadas de mayor tamaño, normalmente en las escalas submicrométrica, o incluso micrométrica . Según la presente invención, partículas codificadas con un núcleo con forma de estrella proporcionan mejor detección y una señal aumentada.
Según la presente invención, la al menos una
biomolécula unida a la capa externa se escoge de entre el grupo aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos, hormonas, lípidos.
Los aminoácidos son moléculas que comprenden un grupo amino, un grupo ácido carboxílico y una cadena lateral que varía entre diferentes aminoácidos. Los elementos clave de un aminoácido son carbono, hidrógeno, oxígeno, y nitrógeno. Son particularmente importantes en bioquímica, donde el término normalmente se refiere a alfa-aminoácidos . Un alfa- aminoácido tiene la formula genérica H2NCHYCOOH, donde Y es un sustituyente orgánico, el grupo amino está unido al átomo de carbono inmediatamente adyacente al grupo carboxilato (el carbono a) . Otros tipos de aminoácido existen cuando el grupo amino está unido a un átomo de carbón diferente; por ejemplo, en gamma-aminoácidos (como el gamma-aminoácido - butírico) el átomo de carbono al que se une el grupo amino está separado del grupo carboxilato por otros dos átomos de carbono. Los diversos alfa-aminoácidos difieren en cuál cadena lateral (o grupo Y) está unido a su carbono alfa, y puede variar en tamaño desde solo un átomo de hidrógeno en la glicina hasta un grupo heterocíclico grande en el
triptófano .
Los péptidos son polímeros cortos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Poseen los mismos enlaces peptídicos que los de las proteínas, pero suelen ser más cortos en longitud. Los péptidos más cortos son los dipéptidos, que consisten en dos aminoácidos unidos por un único enlace peptídico. También puede haber tripéptidos, tetrapéptidos , pentapéptidos , etc. Los páptidos tienen un extreme amino y un extreme carboxilo, a no ser que sean péptidos cíclicos. Un polypéptido es una cadena lineal sencilla de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Las moléculas de proteínas consisten en uno o más polipéptidos puestos juntos típicamente de una forma biológicamente functional y a veces lleva unidos grupos no-peptídicos , que se pueden llamar grupos prostéticos o cofactores.
Las proteínas son compuestos bioquímicos que consisten en uno o más polipéptidos típicamente doblados en una forma globular o fibrosa de una forma biológicamente funcional. Un polipéptido es una única cadena polimérica lineal de
aminoácidos unidos por enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos aminoácidos adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está definida por la secuencia de un gen, que está codificado en el código genético. En general, el código genético especifica 20 aminoácidos estándar; sin embargo, en ciertos organismos el código genético puede includir selenocisteína — y en ciertos archaea—pirrolisina . Poco después o incluso durante la síntesis, los residuos de una proteína suelen estar
modificados químicamente por modificación post- translacional , la cual altera las propiedades físicas y químicas, plegado, estabilidad, actividad, y en última instancia, la función de las proteínas. A veces las
proteínas tienen grupos no-peptídicos unidos, que se pueden llamar grupos prostéticos o cofactores . Las proteínas también pueden trabajar juntas para conseguir una función particular, y suelen asociarse para formar complejos
estables .
Los carbohidratos son compuestos orgánicos con la formula empírica Cm(H20)n; es decir, solo contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, con una relación hidrógeno : oxígeno de 2:1 (como en el agua) . Los carbohidratos se pueden ver como hidratos de carbono, de ahí su nombre. Estructuralmente sin embargo, es más preciso verlos como polihidroxialdehidos y cetonas .
Los carbohidratos también se pueden designer como sacáridos. Los carbohidratos (sacáridos) se dividen en cuatro grupos químicos: monosacáridos, disacáridos,
oligosacáridos , y polisacáridos . En general, los
monosacáridos y disacáridos, que son carbohidratos más pequeños (peso molecular más bajo) , suelen conocerse como azúcares .
Las hormonas son liberadas químicamente por una célula o una glándula en una parte del cuerpo que envía mensajes que afectan a células en otras partes del organismo. Solo se necesita una pequeña cantidad de hormona para alterar el metabolismo celular. En esencia, es un mensajero químico que transporta una señal de una célula a otra. Todos los organismos multicelulares producen hormonas; las hormonas de las plantas también se denominan fitohormonas . Las hormonas en animales suelen transportarse en la sangre. Las células responden a una hormona cuando expresan un receptor
específico para esa hormona. La hormona se une a la proteína receptora, dando como resultado la activación de un
mecanismo de transducción de señal que en última instancia conduce a respuestas específicas del tipo de célula.
Los lípidos son un grupo amplio de compuestos que incluye las grasas, ceras, esteróles, vitaminas solubles en grasa (como las vitaminas A, D, E y K) , monoglicéridos , diglicéridos , fosfolípidos , y otros. Las principáis
funciones biológicas de los lípidos incluyen el
almacenamiento de energía, como componentes estructurales de membranas celulares, y como importantes moléculas
señaladoras .
Los lípidos se pueden definer en general como moléculas pequeñas hidrofóbicas o anfifílicas ; la naturaleza anfífila de algunos lípidos les permite formar estructuras como vesículas, liposomas, o membranas en un entorno acuoso. Los lípidos biológicos se originan por completo o en parte de dos tipos distintos de subunidades bioquímicas o "bloques constructores ": grupos cetoacilo e isopreno. Usando esta aproximación, los lípidos se pueden dividir en ocho
categorías: acilos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos , sacarolípidos y
policétidos (derivados de la condensación de subunidades cetoacilo) ; y lípidos esterol y prenol (derivados de la condensación de subunidades isopreno) . Los lípidos también incluyen moléculas como ácidos grasos y sus derivados (que incluyen tri-, di-, y monoglicéridos y fosfolípidos) , así como otros metabolitos que contienen esterol como el colesterol .
Según la presente invención, la al menos una
biomolécula está directamente unida a la capa externa del material inerte. Por directamente unido, se debe entender unido por cualquier interacción adecuada para la unión de la al menos una biomolécula. La al menos una biomolécula puede unirse ventajosamente a la capa externa de material inerte por medio de interacciones covalentes, electrostáticas, o de van der Waals.
Según la presente invención, la al menos una
biomolécula se une por un enlazador que comprende al menos un grupo funcional escogido del grupo -OH, -SH, -SeH, -TeH, -COOH, una amina primaria, una amina secondaria, una amina terciaria. El enlazador es ventajosamente un siloxano o un titanoxano, pero también puede ser un alcano funcionalizado que no interfiere con el agente de mareaje.
Según la presente invención, la al menos una
biomolécula unida indirectamente a la capa externa está unida covalentemente a la capa externa, por (o a través) de una capa de material inerte que comprende la partícula marcada en su interior. Por lo tanto, en esta realización de la presente invención, el núcleo metálico marcado está incrustado en una capa (que también se puede designar como primera capa) de material inerte y luego encapsulado por la capa externa de material inerte. La mencionada (primera) capa puede o no ser del mismo material inerte que la capa externa y por tanto puede ser de cualquier óxido inorgánico o polímero definido en el contexto de la presente invención. Según la presente invención, el material inerte es un óxido inorgánico o un polímero orgánico que comprende al menos un grupo escogido de -OH, -SH, -SeH, -TeH, -COOH, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, ácido borónico, haluros. Ventajosamente, el al menos un grupo está situado en la superficie de la capa externa. El grupo -OH se designa como grupo hidroxi, -SH como tiol, -SeH como
selenol, -TeH como telurol, -COOH como carboxílico, amina primaria es -NH2, amina secundaria es -NH- y tiene dos restos alquilo, una amina terciaria es una amina con tres restos alquilo. El ácido borónico es -B (OH) 2 y en el contexto de la presente invención, los haluros son F-, Cl- o Br- .
En la presente invención, la particular codificada comprende ventajosamente una capa externa hecha de un material inerte escogido del grupo siloxano, titanoxano, polímeros de polietilén-glicol , polímeros de polivinil- alcohol .
Siloxanos y titanoxanos son polímeros, que alternan átomos de silicio, o titanio respectivamente, y oxígeno, donde el silicio está opcionalmente sustituido con un átomo de hidrógeno o una cadena alquílica. Un siloxano es
cualquier compuesto químico compuesto de unidades de la forma R2SiO, conde R es un átomo de hidrógeno o un grupo hidrocarburo. Los siloxanos pueden tener esqueletos
ramificados (sustituidos) o no-ramificados (no-sustituidos) formados por átomos alternados de silicio y oxígeno -Si-O- Si-O-, con cadenas laterales R unidas a los átomos de silicio. También se conocen estructuras más complicadas, por ejemplo ocho átomos de silicio en las esquinas de un cubo, conectados por 12 átomos de oxígeno como los lados del cubo. Los siloxanos polimerizados con cadenas laterales orgánicas (R ≠ H) suelen conocerse como siliconas o como
polisiloxanos. Ejemplos representativos son [SiO (CH3) 2] n (polidimetilsiloxano) y [SiO (C6H5) 2] n (polidifenilsiloxano) . Las cadenas orgánicas laterals les confieren propiedades hidrofóbicas mientras que el esqueleto -Si-O-Si-O- es puramente inorgánico. Las definiciones para siloxanos o polisiloxanos también son aplicables para los titanoxanos o polititanoxanos , donde el átomo de Si se sustituye por un átomo de Ti. Ventajosamente, la capa externa puede estar hecha de una primera capa de Si02 o Ti02 y una capa siguiente de un siloxano o titanoxano diferente.
Los polímeros de polietilén glicol (PEG) son compuestos de poliéter con muchas aplicaciones desde la fabricación industrial hasta la medicina, con la fórmula general
C2n+2H4n+6On+2. También se los conoce como óxido de polyetileno (PEO) o polioxietileno (POE) , en función de su peso
moleclar. El polivinil alcohol (PVOH, PVA, o PVAl) es un polímero sintético soluble en agua con la fórmula general (C2H0)n. Los polímeros de polietilén glicol pueden ser homopolímeros o cualesquiera co-polímeros de etilén glicol.
Según la presente invención, la al menos una
biomolécula unida a la capa externa comprende una señal dirigida. La señal dirigida también se puede designer como una señal de reconocimiento molecular selectivo. En otras palabras la biomolécula comprende una parte o sitio o región en la biomolécula que puede reconocer selectivamente, o detectar, un sitio o región correspondiente, de un material biológico. Un ejemplo de señal dirigida es un epítopo o un paratopo .
Un epítopo, también conocido como determinante
antigénico, es la parte de un antígeno que es reconocida por el sistema inmune, específicamente por anticuerpos, células B, o células T. La parte de un anticuerpo que reconoce el epítopo se llama paratopo. Aunque normalmente se cree que los epítopos derivan de proteínas no-propias, las secuencias derivadas del receptor que se pueden reconocer también se clasifican como epítopos. Los epítopos de antígenos de proteína se dividen en dos categorías, epítopos
conformacionales y epítopos lineales, sobre la base de su estructura y su interacción con el paratopo. Un epítopo conformacional está compuesto de secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Estos epítopos interaccionan con el paratopo por las características superficiales 3-D y la forma o estructura terciaria del antígeno. La mayor parte de los epítopos son
conformacionales . Un paratopo es la parte de un anticuerpo que reconoce un antígeno, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo.
En contraste, los épitopes lineales interaccionan con el paratopo basándose en su estructura primaria. Los aminoácidos que component un epítopo lineal son una
secuencia continua de aminoácidos del antígeno.
La señal dirigida también puede ser un paratopo. Un paratopo es la parte de un anticuerpo que reconoce un antígeno, el sitio de unión a un antígeno de un anticuerpo.
En el contexto de la presente invención, la biomolécula puede imitar un epítopo o un paratopo.
Según la presente invención, la capa externa de
material inerte está hecha de un óxido inorgánico o un polímero orgánico. El material inerte de la capa externa debe ser inerte en relación al agente de mareaje. Esto significa que según la presente invención, la capa no debería inhibir al agente de mareaje cuando lo detecta. Por lo tanto, el material inerte se puede escoger de un óxido inorgánico, como un óxido de titanio (Ti) , zirconio (Zr) , vanadio (V) , cromio (Cr) , silicio (Si) . Polímeros orgánicos, como los polímeros de polietilén glycol (PEG) sustituidos o no sustituidos (homopolímeros o cualquier copolímero) , o polímeros de polivinil alcohol sustituidos o no sustituidos (homopolímeros o cualquier copolímero) también son materiales inertes adecuados para la capa externa de las partículas codificadas según la presente invención. En el contexto de la presente invención, el término "polímeros" se debe entender como cualquier
homopolímero o cualquier copolímero.
La capa externa puede estar formada por al menos una capa de material inerte, tal como una capa, dos capas, tres capas, cuatro capas. Las interacciones entre las capas pueden ser covalentes o electrostáticas. Las capas de material inerte pueden formarse por auto-ensamblaje, adsorción física o por polimerización iniciada en la
superficie .
Según la presente invención, la al menos una
biomolécula unida a la capa externa se une a material biológico. El material biológico puede ser material
biológico humano, material biológico animal o material biológico vegetal. Ventajosamente, la biomolécula se puede escoger para que se una selectivamente a un tipo particular de material bológico.
En el contexto de la presente invención, la al menos una biomolécula se une a la capa externa. El material biológico puede unirse a la capa externa por un enlace covelente, o por fuerzas electrostáticas y/o de van der Waals (también designadas como enlaces electrostáticos y/o de van der Waals) .
En el contexto de la presente invención, una unión covalente se debe entender como un enlace químico entre la biomolécula y el material biológico. El enlace covalente incluye muchos timpos de interacciones, incluyendo enlace-σ, enlace-π, enlace metal a metal, interacciones agósticas, y enlaces de dos electrones entre tres centros,
particularmente, entre átomos de electronegatividades similares .
En el contexto de la presente invención, fuerzas electrostáticas, o unión electrostática, se deben entender como fuerzas que ejercen cargas eléctricas entre sí. Dichas fuerzas se describen por la ley de Coulomb.
En el contexto de la presente invención, las fuerzas de van der Waals pueden permitir el enlace entre la biomolécula y el material biológico a través de un dipolo permanente y un correspondiente dipolo inducido (o fuerza de Debye) interacciones o fuerzas entre dos dipolos inducidos
instantáneos (fuerzas de dispersión de London) .
En el contexto de la presente invención, biomoléculas que contienen una parte hidrófila cargada (p.e. aniónica) y una parte hidrófoba pueden unirse al materia biológico a través de fuerzas electrostáticas y de van der Waals.
Según la presente invención, el material biológico se escoge de células inmunes, membranas celulares, virus.
El material biológico puede ser o proceder de cualquier membrana celular. Una membrane cellular es una membrana biológica que separa el interior de todas las células del entorno exterior. La membrane cellular es permeable
selectivamene a iones y moléculas orgánicas y controla el movimiento de sustancias hacia dentro y hacia fuera de las células. Consiste en una bicapa fosfolipídica con proteínas incrustadas. Las membranas celulares están implicadas en una gran variedad de procesos celulares como la adhesión
celular, la conductividad iónica y el señalado cellular y sirven como superficie de anclaje para el glicocáliz
extracelular y la pared celular y el citoesqueleto
intracelular . Las células inmunes pueden ser de cualquier tipo. Las células T también se designan como linfocitos T y pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos, y juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Pueden distinguirse de otros tipos de linfocitos, como las células B y células asesinas (células NK) por la presencia de un receptor especial en su
superficie celular llamado receptores celulares T (TCR) . La abreviatura T, en célula T, quiere decir timo, ya que este es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto diferentes subconj untos de células T, cada uno con una función distinta. Las células B son linfocitos que juegan un importante papel en la
respuesta inmune humoral (a diferencia de la respuesta inmune mediada por células, que se rige por las células T) . Las principales funciones de las células B son producir anticuerpos contra los antígenos, llevando a cabo la función de células presentadoras de antígeno (APC) y, finalmente, se convierten en células de memoria B después de la activación por interacción con el antígeno. Las células B son un componente esencial del sistema inmune adaptativo.
Un virus es un agente infeccioso que se puede replicar sólo dentro de las células vivas de organismos. Los virus infectan todo tipo de organismos, desde animales y plantas a bacterias y arqueas. Los virus consisten en dos o tres partes: el material genético compuesto de ADN o ARN, macromoléculas que portan información genética, una capa de proteína que protege estos genes, y en algunos casos una envoltura de lipidos que rodea la capa de proteínas cuando están fuera de una célula. Las formas de los virus van desde simples formas helicoidales e icosaédrica a estructuras más complejas. Un virus promedio es alrededor de una centésima el tamaño de una bacteria promedio. Según la presente invención, la partícula codificada comprende por lo menos por dos núcleos, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez núcleos. Los núcleos metálicos pueden ser agregados. Ventajosamente, por lo menos uno de estos núcleos metálicos es un núcleo metálico con forma de estrella.
Según la presente invención, el núcleo metálico
comprende plata y oro /, o sus aleaciones.
El núcleo metálico puede estar hecho de plata (Ag) , o oro (Au) , o de una aleación de plata y oro (AgAu) , o de una aleación de plata, como AgM, o de una aleación de oro (Au ) , o una aleación de plata y oro, y al menos otro metal
(AgAuM) , donde M es al menos un metal elegido de los
elementos de transición de la tabla de elementos químicos. Se pueden elegir metales del grupo: Co, Ni, Pd, Pt, Cu.
Según la presente invención, la partícula codificada de la presente invención puede tener cualquier tamaño total o forma, así como cualquier tamaño entre 30 nanómetros (nm) y 20 micrómetros (μτη) .
Según la presente invención, el tamaño del núcleo metálico se encuentra en el rango de 10 nm a 2000 nm, como el de cualquier tamaño por encima de 10 nm, o superior a 20 nm, así como cualquier tamaño inferior a 2000 nm, o por debajo de 1000, o por debajo 500 nm. El tamaño del núcleo metálico se puede ajustar. Se pueden obtener buenos
resultados con las partículas de cualquier tamaño o forma. Si el núcleo metálico tiene una forma que comprende picos, designada como en forma de estrella, se pueden obtener resultados especialmente buenos.
Según la presente invención, el agente de mareaje comprende un grupo aromático. Un grupo aromático puede ser cualquier hidrocarburo cíclico conjugado. El agente de mareaje, o molécula de mareaje, es cualquier molécula capaz de proporcionar un código o un señal detectable por absorción de luz ultravioleta,
absorción de luz visible, absorción de luz infrarroja, absorción-reflectancia infrarroja aumentada por superficie (SEIRA) , emisión de luz fluorescente, emisión de luz
fosforescente, dispersión Raman, dispersión Raman aumentada por superficie mayor (SERS) , resonancia de dispersión Raman aumentada por superficie (SERRS) , dispersión de Rayleigh.
La detección en el contexto de la presente invención puede llevarse a cabo en una celda de microfluidos o una celda de la citometría de flujo.
El agente de mareaje puede venir dado por las moléculas de mareaje, tales como tioles aromáticos,
seleniuro, telururos, cianuros, aminas, ácidos carboxílicos y otros, incluyendo sistemas moleculares no-resonantes (con la luz de excitación) y colorantes orgánicos y
organometálicos. El agente de mareaje se puede elegir de entre el grupo de las acridinas, antraquinonas, arilmetanos, colorantes azo, colorantes diazonio, colorantes nitro o nitroso, ftalocianinas , quinona-iminas, indaminas, tlazoles, xantenos, fluorenos, pironinas, rodaminas o perilenos, y sus derivados .
Según otro aspecto de la invención, el método para la preparación de una partícula codificada comprende:
i) preparar un núcleo metálico con un tamaño y forma definidos;
ii) unir un agente de mareaje a dicho núcleo metálico proporcionando un núcleo metálico marcado;
iii) encapsular dicho núcleo metálico marcado con una capa externa de material inerte; iv) unir directamente o indirectamente al menos una biomolécula en la superficie de dicha capa externa .
Ventajosamente, el paso i) se lleva a cabo en agua, preferiblemente desionizada, o un medio acuoso alcohólico. El paso i) se lleva a cabo a través de la reducción de una sal metálica con el agente reductor apropiado. Este medio de agua o acuoso también es adecuado para el siguiente paso del procedimiento según la presente invención.
Ejemplos de sales metálicas son AgN03, AgCl04, HAuCl4. Ejemplos de agentes reductores son NaBH4 , citrato sódico, ácido ascórbico, la hidracina. La forma y el tamaño
definidos, o predefinidos, están determinados por las condiciones de reacción de la preparación del núcleo
metálico (se entendide que aquí se prepara más de un núcleo simultáneamente, en i) ) .
El paso ii) se lleva ventajosamente a cabo por
chemisorción a través de enlace químico o de complej ación con el metal en medio acuoso.
El paso iii) se realiza ventajosamente por medio de química sol-gel. La química sol-gel consiste en la
hidrólisis y la condensación de alcoxisilanos en una mezcla de agua, etanol y amoníaco. Ejemplos de alcoxisilanos son tetraetoxisilano, aminopropiltrietoxisilano o
mercaptopropiltrietoxisilano .
El paso iv) es ventajosamente llevado a cabo por autoensamblaj e (previamente funcionalizado con un
mercaptosilano) o por protocolos de capa sobre capa.
El método para la preparación de la partícula
codificada según la presente invención puede comprender una etapa III2) entre la etapa iii) y la etapa iv) , que incluye la fijación de un conector químico entre la capa externa y la biomolécula. Ventajosamente, el conector químico es una cadena alquilo que comprende de uno a seis átomos de carbono funcionalizada a cada extremo de la cadena por un grupo funcional tal como se define en el contexto de la presente invención. El conector químico también puede ser un siloxano funcionalizado o titanoxano tal como se define en el contexto de la presente invención.
El método según la presente invención prepara la partícula codificada según la presente invención. En
consecuencia, todas las ventajas, especificaciones y
preferencias definidas por la partícula codificada de la presente invención son aplicables al método según la invención para la preparación de la partícula codificada.
Las condiciones del método para la preparación de la partícula codificada y las características de la partícula codificada (tales como el tamaño y forma del núcleo
metálico, la selección del agente de mareaje, la selección de la capa externa, una posible funcionalización de la capa externa o su biocompatibilidad) pueden depender de cada aplicación específica. Según la presente invención, el método para la preparación de una partícula codificada comprende la preparación de un lote de partículas
codificadas .
Ventajosamente, suspensiones de núcleos metálicos donde el núcleo metálico consta de picos, proporcionando forma de estrella al núcleo metálico, se puede preparar por el método de la invención.
Según la presente invención, la etapa iv) es seguida por una etapa v) que comprende la unión covalente de al menos una de las biomoléculas de interés a la capa externa. La unión covalente de biomoléculas como se definió
anteriormente, también se puede designar como
biofuncionalización de las partículas codificadas. Las partículas codificadas según la presente invención en el contexto de la presente invención pueden ser designadas como partículas codificadas biofuncionalizadas .
Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una microesfera codificada que comprende al menos dos partículas codificadas según la presente invención que comprende:
i) preparar al menos dos núcleos metálicos con un tamaño y forma definidos;
ii) unir un agente de mareaje a cada uno de los al menos dos núcleos metálicos
proporcionando al menos dos núcleos
metálicos marcados;
iii) incrustar al menos dos núcleos metálicos marcados en una capa de material inerte; iv) unir al menos dos núcleos metálicos
marcados encapsulados obtenidos en iii) sobre una microesfera de sílice (Si02) ;
v) encapsular al menos dos núcleos metálicos marcados unidos a la microesfera de sílice con una capa externa de material inerte; vi) unir al menos una biomolécula en la
superficie de la capa externa prevista en v) .
En la etapa iv) , la microesfera de sílice puede tener cualquier diámetro. Ventajosamente, el diámetro es del orden de 500 nm y 10000 nm.
Otro aspecto de la invención está relacionado con microesferas codificadas obtenibles por el método para la preparación de microesferas codificadas según la presente invención. Una microesfera también puede ser designada como microbead, o micropartícula en el contexto de la presente invención. Encapsular, en el contexto de la presente
invención y en cualquier aspecto de la presente invención, se debe entender como recubrir con una capa de material inerte o con una capa externa de material inerte.
El método para preparar una microesfera codificada según la presente invención obtiene la microesfera
codificada usando las partículas codificadas según la invención o que puedan obtenerse por el método de la
invención. En consecuencia, todas las ventajas,
especificaciones y preferencias definidas por la partícula codificada de la invención o el método para la obtención de la partícula codificada, son aplicables al método según la invención para la preparación de la partícula codificada.
Según otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la detección de material
biológico. El material biológico se une a las partículas codificadas, o a las microesferas codificadas, y es
detectado por la presencia de las partículas codificadas, o a las microesferas codificadas. El método para la detección según la presente invención proporciona las ventajas de que es un método flexible adecuado para diferentes técnicas de detección y proporciona una fuerte señal de detección. En consecuencia, el método para la detección de material biológico que comprende las etapas de:
1) inmovilizar una partícula codificada o una
microesfera codificada, según la invención u obtenida según el método de la invención, o sobre una superficie;
2) localizar dicha partícula codificada o
microesfera codificada;
3) poner en contacto la superficie sobre la que se inmoviliza la partícula codificada o la
microesfera codificada, con un medio que contiene un material biológico; 4) localizar la partícula codificada o la
microesfera codificada unida al material biológico .
El método para la detección de material biológico según la presente invención detecta el material biológico a través de la presencia de una partícula codificada, o una
microesfera codificada, según la presente invención. En consecuencia, todas las ventajas, especificaciones y
preferencias definidas por la partícula codificada, o la microesfera codificada, de la presente invención son
aplicables al método descrito en la invención para detectar material biológico.
En el método de la presente invención, el método de detección comprende un paso 1) en el que las partículas codificadas, o de las microesferas codificadas, según la presente invención, son inmovilizadas sobre una superficie, como una superficie de vidrio o una superficie de silicio. La fijación de las partículas o microesferas a la superficie se lleva a cabo por auto-ensamblaje o ensamblaje dirigido por interacciones electrostáticas. La superficie puede ser de cualquier material, como vidrio, una superficie de silicio, superficies metálicas, o de un material polimérico, plano o conformado a través de cualquier método litográfico o no litográfico
El paso 2) implica que las partículas codificadas, o microesferas codificadas, están localizadas, por tanto son detectables y por consiguiente identificables por cualquier técnica de detección, como la absorción de luz ultravioleta, la absorción de luz visible, de absorción de luz infrarroja, de absorción-reflectancia de infrarrojos aumentada por superficie, la emisión de luz fluorescente, la emisión de luz fosforescente , la dispersión Raman, dispersión Raman aumentada por superficie, dispersión Raman de resonancia aumentada por superficie, la dispersión Rayleigh.
El paso 3) se lleva a cabo poniendo en contacto la superficie sobre la que se ha unido la partícula codificada o la microesfera codificada, con un medio que contiene el material biológico. Ventajosamente, el medio es un medio acuoso en el que el material biológico puede encontrarse en suspensión. El material biológico se une entonces a la partícula codificada, a través de enlaces covalentes, o de interacciones electrostáticas y/o fuerzas de van der aals.
El material biológico puede ser cualquier material biológico. El material biológico puede originarse a partir de material biológico humano, material biológico animal, material biológico de origen vegetal. El material biológico se puede originarse a partir de microorganismos, bacterias, virus .
En el paso 4) , la localización de la partícula
codificada unida al material biológico, que permite la detección de material biológico a través de la presencia de la partícula codificada, o la microesfera codificada, fijada sobre la superficie, se lleva a cabo por cualquier técnica de detección con el fin de detectar la partícula codificada, o la microesfera codificada, y el sustrato.
Una de las técnicas de detección para la detección de las partículas codificadas, o de las microesferas
codificadas, es la espectroscopia de dispersión Raman aumentada por superficie (SERS) . El núcleo metálico genera el campo electromagnético necesario para aumentar la señal Raman del agente de mareaje, o molécula etiquetada, una vez excitada con la luz adecuada. Núcleos metálicos de plata y/u oro y sus aleaciones poseen resonancias de plasmon
superficial localizadas radiativas, en el espectro visible o infrarrojo. Además, la baja toxicidad, estabilidad y una alta eficiencia óptica de los núcleos metálicos según la presente invención, permite la mejora en la detección del agente marcador alrededor de al menos un núcleo metálico. En consecuencia, cuando la capa externa se une a una
biomolécula, la detección SERS puede identificar el agente marcador solo, o una combinación del agente marcador y la biomolécula .
Según la presente invención, el método de detección implica la localización de acuerdo a los pasos 2) y/o 5) y requiere la detección mediante al menos una técnica de detección del grupo formado por: espectroscopia de absorción y/o espectroscopia de absorción-Reflectancia infrarroja aumentada por superficie y/o espectroscopia de emisión de luz fluorescente y/o emisión de luz fosforescente y/o dispersión Raman, y/o espectroscopia de dispersión Raman aumentada por superficie, y/o espectroscopia de dispersión Raman resonante aumentada por superficie, y/o espectroscopia de dispersión Rayleigh.
Ventajosamente, se pueden utilizar dos o tres técnicas de detección al mismo tiempo o por lo menos sustancialmente al mismo tiempo. Si las dos o tres técnicas de detección se llevan a cabo sustancialmente al mismo tiempo, se debe entender que se llevan a cabo una tras otra, pero en una misma muestra dentro de la misma región de una muestra.
Ventajosamente, una de estas técnicas es la
espectroscopia de dispersión Raman aumentada por superficie o la espectroscopia de dispersión Raman resonante aumentada por superficie.
La espectroscopia de absorción se refiere a las
técnicas espectroscópicas que miden la absorción de la radiación, en función de la frecuencia o la longitud de onda, debido a su interacción con la muestra. La muestra absorbe energía, es decir, los fotones, del campo de la radiación. La intensidad de la absorción varía en función de la frecuencia, y esta variación es el espectro de absorción. La espectroscopia de absorción se realiza a través del espectro electromagnético. La espectroscopia de absorción se emplea para determinar la presencia de una sustancia en una muestra y, en muchos casos, para cuantificar la cantidad de sustancia presente. Las espectroscopias infrarroja y
ultravioleta-visible son particularmente comunes en las aplicaciones analíticas. Existe una amplia gama de
aproximaciones experimentales para medir los espectros de absorción. El diseño más común consiste en dirigir un haz de radiación sobre una muestra y detectar la intensidad de la radiación que pasa a través de ella. La energía transmitida se puede utilizar para calcular la absorción. La fuente, la disposición de la muestra y la técnica de detección varían considerablemente en función del rango de frecuencia y el propósito del experimento.
La espectroscopia de absorción-reflectancia infrarroja aumentada por superficie (SEIRA) utiliza la luz visible y una óptica reflectante para visualizar una imagen ampliada de una muestra y para seleccionar una superficie
microscópica de la muestra para el análisis por
espectroscopia de reflexión-absorción infrarroja. La
selección de la zona se basa en una serie de propiedades físicas y otras características materiales de la superficie de la muestra. Una vez que se ha seleccionado el área de la muestra, la información molecular de la superficie
seleccionada se puede almacenar espectroscópicamente en la región espectral infrarroja.
La espectroscopia de fluorescencia de emisión, también denominada espectroscopia de fluorescencia, o fluorometría o espectrofluorometría, es un tipo de espectroscopia
electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se utiliza un haz de luz, por lo general la luz ultravioleta, que excita los electrones en las moléculas de ciertos compuestos y los hace emitir luz de una energía más baja, por lo general, pero no necesariamente, la luz visible. Una técnica complementaria es la espectroscopia de absorción. La espectroscopia de emisión de fosforescencia es una técnica similar para medir la fosforescencia, es decir, un tipo específico de fotoluminiscencia relacionada con la fluorescencia. A diferencia de fluorescencia, un material fosforescente no reemite inmediatamente la radiación que absorbe. Las escalas de tiempo más bajas de la re-emisión se asocian con transiciones entre estados energéticos
"prohibidas" en mecánica cuántica. Dado que estas
transiciones se producen con relativa lentitud en ciertos materiales, la radiación absorbida puede ser reemitida con menor intensidad hasta varias horas después de la excitación inicial .
La espectroscopia de dispersión Rayleigh mide la dispersión elástica de la luz o radiación electromagnética por partículas más pequeñas que la longitud de onda de la luz, que pueden ser átomos individuales o moléculas. Puede ocurrir cuando la luz viaja a través de sólidos y líquidos transparentes, pero es más frecuentemente observado en gases. La dispersión Rayleigh depende de la polarizabilidad eléctrica de las partículas. La dispersión originada por partículas similares o mayores que la longitud de onda de la luz se puede explicar mediante la teoría de Mié, o la aproximación de dipolos discretos.
La espectroscopia de dispersión Raman es una técnica espectroscópica usada para el estudio vibracional,
rotacional y de otros modos de baja frecuencia en un
sistema. Esto depende de la dispersión inelástica, o la dispersión Raman, de luz monocromática, normalmente desde un láser en el intervalo del visible, infrarrojo cercano o ultravioleta cercano. La luz del láser interacciona con un sistema molecular perdiendo energía en forma de vibraciones, fotones u otras excitaciones en el sistema, dando como resultado un desplazamiento, hacia arriba o hacia abajo de la energía de los fotones del láser. El desplazamiento en energía proporciona información sobre el sistema. La
espectroscopia de infrarrojo produce información similar pero complementaria. Por lo general, la muestra es iluminada con un rayo láser. La luz del punto iluminado se recoge con una lente y es enviada a través de un monocromador . Las longitudes de onda cercanas a la línea del láser se han de filtrar, debido a la dispersión elástica de Rayleigh, mientras que el resto de la luz recogida se dispersa sobre un detector, por muescas o por el borde del filtro para el láser y los espectrógrafos (ya sea transmisible axial (A) , monocromador Czerny- Turner (TC) ) o FT (basada en la
espectroscopia por transformada de Fourier) , y recogidos en los detectores de fotones (incluidos los tubos
fotomultiplicadores, matrices de diodos, CCD u otros) . Tipos avanzados de espectroscopia de Raman, incluyen la
espectroscopia de dispersión Raman resonante, la de
dispersión Raman aumentada en superficie , la de dispersión Raman resonante aumentada en superficie, la dispersión Raman aumentada por puntas , dispersión Raman polarizada,
dispersión Raman estimulada (similar a la emisión
estimulada) , la transmisión Raman, Raman con desplazamiento espacial, Raman coherente anti-Stokes e hiper-Raman.
En el contexto de la presente invención, la
espectroscopia de dispersión Raman aumentada por superficie (SERS) y la espectroscopia de dispersión Raman resonante aumentada por superficie (SERRS) ofrecen ventajas únicas, como la detección ultrasensible, un número ilimitado de códigos ya que los espectros SERS / SERRS son esencialmente las huellas dactilares de vibración, únicas para cada molécula, que se pueden acoplar a otras técnicas de
análisis, como las técnicas inmunológicas (ELISA, RIA o la FIA) .
Según la presente invención, la detección se lleva a cabo en una celda de microfluidos o en una celda de
citometría de flujo.
Una celda de microfluidos es una celda o un recipiente adecuado para la microfluídica, u otras aplicaciones donde el control preciso y la manipulación de fluidos son
geométricamente restringidos a una pequeña escala, por lo general inferior al milímetro.
Una celda de citometría de flujo es una celda, o un recipiente adecuado para llevar a cabo la citometría de flujo. La citometría de flujo es una técnica utilizada para contar y examinar partículas microscópicas, como células y cromosomas, mediante la suspensión en una corriente de fluido y pasándolas por un aparato electrónico de detección. Esto permite el análisis simultáneo multiparamétrico de las características físicas y químicas de hasta miles de
partículas por segundo. La citometría de flujo se utiliza de forma rutinaria en el diagnóstico de trastornos de la salud, especialmente cáncer en la sangre, pero tiene muchas otras aplicaciones en investigación y en la práctica clínica.
En otro aspecto de la invención, la partícula
codificada se utiliza en la detección espectroscópica o microscópica in vitro, de la presencia de microorganismos, preferiblemente bacterias o virus.
En otro aspecto de la invención, la partícula
codificada se utiliza en la detección espectroscópica o microscópica de agentes patógenos o células inmunogénicas , o anticuerpos . En otro aspecto de la invención, la partícula
codificada se utiliza en la detección espectroscopica y microscópica de hormonas, o lípidos, o liposáridos o sacáridos .
En otro aspecto de la presente invención, la partícula codificada se utiliza en la detección espectroscopica o microscópica de reacciones químicas en un locus genómico dirigido .
En otro aspecto de la presente invención, la
microesfera codificada se utiliza en la detección
espectroscopica o microscópica in vitro, de la presencia de microorganismos, preferiblemente bacterias o virus.
En otro aspecto de la presente invención, la
microesfera codificada se utiliza en la detección
espectroscopica o microscópica de agentes patógenos o células inmunogénicas , o anticuerpos.
En otro aspecto de la presente invención, la
microesfera codificada se utiliza en la detección
espectroscopica y microscópica de hormonas, o lípidos, o liposáridos o sacáridos.
En otro aspecto de la presente invención, la
microesfera codificada se utiliza en la detección
espectroscopica o microscópica de reacciones químicas en un locus genómico dirigido.
Los usos mencionados no son limitativos de ninguna manera. Además, la partícula codificada y/o la microesfera según la presente invención, pueden ser utilizadas para otros fines. En consecuencia, en el contexto de la presente invención, todas las ventajas, características y
preferencias definidas para la partícula codificada y/o para la microesfera codificada, de la presente invención son aplicables a todos los métodos y usos según la invención, en relación con la partícula codificada y/o la microesfera codificada .
La presente invención está ilustrada, sin estar
limitada, por los siguientes Ejemplos y figuras.
Figuras
Figura 1 Imágenes de TEM de nanopartículas de oro
(A) esféricas, y (B) en forma de estrella codificadas con azul de toluidina y cubiertas con una capa de sílice. (C) espectros de resonancia de plasmón superficial localizada de nanoesferas y nanoestrellas , recién preparados (línea punteada) y después de la codificación y deposición de la capa de sílice (línea continua) . La flecha roja punteada indica la longitud de onda de la línea láser de excitación. (D) Espectros SERS de las esferas y las estrellas codificadas, una vez excitadas con una línea de láser de IR cercano, 830 nm.
Figura 2 Imagen de TEM, espectro de resonancia de plasmón superficial localizada y
respuesta SERS de un núcleo
submicrométrico en forma de estrella siempre con el mareaje de azul de
toluidina (TB) y una capa de sílice.
Figura 3 Esquema de detección de sustratos de
interés, es decir, marcadores patológicos, con experimentos en
suspensión o en una micromatriz.
(A) Protección- funcionalización y bioconjugación de Si02@SSP o SPP
sumicrométricas . (B) Diferentes núcleos codificados, cada uno con un solo anticuerpo, se ponen en contacto con el fluido biológico de interés. Después de lavar las partículas, se añaden los anticuerpos de detección con mareaje fluorescente, y la muestra se lava de nuevo. Una alícuota se deposita en un portaobjetos de vidrio y se lleva a cabo el barrido con dos líneas láser. La línea láser de 488 nm provoca la fluorescencia de las partículas que han reaccionado. Los anticuerpos que han reaccionado se identifican por el código de barras SERS de la partícula (785 nm) . (C) Fabricación de una micromatriz para ELISA. La muestra de partículas se deposita sobre un chip de silicio microperfilado con una
espátula de punta de goma bajo un
microscopio óptico. La matriz se pone en contacto, primero con el fluido biológico de interés, se lava y luego se pone en contacto con los anticuerpos de detección con mareaje fluorescente. La micromatriz se barre entonces con dos líneas de láser: la línea de láser de excitación de 488 nm provoca fluorescencia en las partículas que han reaccionado, mientras que el anticuerpo que ha reaccionado es identificado por el código de barras SERS de la partícula (785 nm) .
Figura 4 Partículas codificadas para identificar fármacos activos en bibliotecas
combinatorias complejas.
(A) Partícula codificada en síntesis peptídica de fase sólida estándar con 9- fluorenil-metoxicarbonil (FMOC-SPPS)
(B) Identificación por SERS y
clasificación de la biblioteca peptídica:
(Bl) espectros SERS de Pl, P2 y Pn, asignación de bandas (composición) y elucidación estructural (estructura primaria, es decir, secuencia) , (B2) fotografía óptica de una mezcla de partículas codificadas cada una con un solo péptido; y (B3) clasificación SERS de las partículas codificadas
(C) Prueba de concepto de la adecuación de este método para el descubrimiento de fármacos. En resumen, el sustrato
biológico, en este caso estreptavidina- fosfatasa alcalina (SAP) , marcada con una sonda fluorescente (FAI) se pone en contacto con un grupo de granos que portan péptidos diferentes. La SAP se une de forma selectiva al péptido de interés. Esta unión se detecta por fluorescencia
(excitando la muestra con la línea láser de 488 nm) . Cada péptido activo se identifica a través de su espectro SERS excitando la muestra con la línea láser de 633 nm. Esta línea está muy lejos de las bandas de absorción del marcador, por lo que no se espera emisión electrónica.
Figura 5 Imágenes de TEM que muestran la captación celular de (A, C) Au-nanoesfera-TB@Si02 , y (B, D) SSP-TB@Si02 (Figura 1) . La barra de escala representa 1 miera. Imágenes ópticas y mapas SERS de cortes ultrafinos de una película que contiene las células HeLa teñidas de (E) Au-nanoesferas - TB@Si02, y (F) SSP-TB@Si02. Mapa SERS (intensidad de la línea base a 1419 errf1, 70 x 70 μιτι2, tamaño de paso de Ιμπ
adquirido utilizando una línea de
excitación láser de 830 nm.
Figura 6 Ejemplo de traceo de consumibles.
Imágenes ópticas de tejidos codificados con SSP@Si02 portando diferentes
moléculas codificadoras. Análogamente, la codificación se puede realizar en papel, plástico o cualquier otra superficie sólida. Azul: espectros SERS de la SSP codificada recién preparada; Negro:
espectros SERS de la SSP codificada sobre el tejido.
Ej emplos
Ejemplo 1 - Preparación del núcleo metálico
Las nanopartículas en forma de estrella, o nanoestrellas se preparan mediante la adición de semillas de oro con
cualquier morfología y/o tamaño recubiertas con PVP, se dispersan en etanol u otro disolvente en una mezcla de HAuCl4 y PVP en DMF con agitación rápida a temperatura ambiente. En el tiempo comprendido entre 20 min a 10 h, el color de la disolución cambia indicando la formación de las nanopartículas en forma de estrella. Es posible obtener cualquier forma y tamaño de partícula en función del tamaño y la forma de la semilla utilizada. Las partículas finales y la forma final, así como las propiedades ópticas,
dependen del tamaño y la forma inicial de las semillas utilizadas .
Ejemplo 2 - Mareaje y recubrimiento con sílice del núcleo metálico
Las nanopart ículas en forma de estrella, preparadas según el Ejemplo 1 de la presente invención se protegen añadiendo un polietilenglicol tiolado, mPEGSH, (calculado para proporcionar 4 moléculas/nm2) a las nanopartículas en forma de estrella. La muestra se agita, se centrifuga y se redispersa en etanol. A continuación, se añade el código molecular gota a gota con agitación suave a las
nanopartículas en forma de estrella estabilizadas con PEG. Inmediatamente después de la adición del código molecular, el recubrimiento con sílice se lleva a cabo a través de un proceso sol-gel mediante la mezcla de las nanopartículas en forma de estrella estabilizadas con PEG con una disolución de etanol/amoníaco y la adición posterior de
tetraetoxisilano . La mezcla de reacción se deja reaccionar durante 24 h, a continuación las partículas se centrifugan y se lavan con etanol. Cuando el tiempo de la reacción ha terminado, las partículas se centrifugan y se lavan con etanol .
Ejemplo 3 - Deposición, mareaje y protección de los coloides sobre microesferas de S1O2
Las nanopartículas en forma de estrella se adsorben sobre microesferas (previamente funcionalizadas con un mercapto silano) mediante autoensambla e o mediante protocolos capa-sobre-capa. Las isotermas de adsorción determinan las condiciones necesarias para maximizar la densidad de nanopartículas. Los materiales así preparados tienen aplicaciones en la síntesis en fase sólida y aplicaciones en el descubrimiento de fármacos. Para los sensores de tipo llave-cerradura, los marcadores espectroscópicos
(colorantes o tioles aromáticos) son entonces
quimiadsorbidos sobre las microesferas compuestas siguiendo el protocolo de isoterma de adsorción. El sistema activo resultante se protege finalmente con una capa delgada de Si02 para evitar la lixiviación de los marcadores, mejorar la estabilidad en medio acuoso, y facilitar la
funcionaliación para otras aplicaciones. En este caso, el espesor de Si02 se controla con precisión para obtener microesferas homogéneas finales que, además, puedan actuar como potenciadores de la fluorescencia.
Ejemplo 4 - Síntesis en fase sólida y descubrimiento de fármacos con nanopartículas construidas sobre microesferas o partículas codificadas para el barrido de alto
rendimiento y sensores de tipo llave-cerradura
Las partículas submicrométricas en forma de estrella marcadas y protegidas por un recubrimiento de sílice externo obtenidas según el Ejemplo 2 y/o las microesferas compuestas obtenidas según el Ejemplo 3 se funcionalizan con un mercaptoácido alifático de cadena corta o una amina, proporcionando un grupo funcional adecuado (-C00H,-NH2, - OH, Cl, u otros) para la síntesis peptídica en fase
sólida (SPPS) y se une a los aminoácidos. La fijación del primer aminoácido se realiza de la siguiente manera. El correspondiente aminoácido modificado con ácido
fluorenilmetiloxicarbonil (aminoácido-Fmoc) ,
hidroxibenzotiazol (HOBT) y diisopropilcarbodiimida
(DIPCDI) se disuelven en dimetilformamida (DMF) y se dejan en reposo durante 10 minutos. A continuación, la mezcla se añade a las partículas (suspendidas en DMF) y se deja reaccionar durante varias horas. A continuación se acoplan los aminoácidos en condiciones estándar de SPSS, utilizando HBTU / DIEA (AA/HBTU/DIEA-4/3 , 8/8) en DMF. La fijación de los péptidos a las microesferas compuestas se confirma por cromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas LC/MS (m/z) y resonancia magnética nuclear RMN, tras obtener una pequeña muestra peptídica por escisión del soporte sólido con TFA 95%.
La detección se realiza colocando una mezcla de partículas (cada una con un péptido diferente) , en un portaobjetos de vidrio y mapeando cada partícula con un microespectrometro Raman con láser rojo o infrarrojo cercano para evitar daños en la muestra. La clasificación y elucidación de la
naturaleza peptídica se lleva a cabo mediante análisis de vibración convencionales.
Ejemplo 5 - Sistemas inmunológicos para la detección de patógenos
La funcionalización adecuada de las partículas se consigue mediante silanización de la superficie de Si02 de las partículas, con funciones amino o ácido, seguiendo los procedimientos de bioconj ugación estándar en suspensión acuosa (es decir, química de carbodiimida , con l-etil-3(3- dimetilaminopropil-carbodiimida, EDC, y N- hidroxibenzotriazol , HoBt , como agentes de acoplamiento) de un antígeno de captura (diagnóstico) o anticuerpos (biodetección) (Fig. 3A)
Las micropartículas codificadas se utilizan como
plataformas para los sensores tipo sándwich llave-cerradura con aplicaciones en diagnóstico y detección. En pocas palabras, cada partícula codificada porta un marcador específico de un determinado patógeno, tumor o enfermedad. Las micropartículas se ponen en contacto directamente con el fluido biológico de interés, o incorporado en una matriz microperfilada . Después de un lavado cuidadoso, las
partículas o matrices se sumergen en una disolución que contiene un marcador fluorescente (anticuerpo o antígeno) , se lava otra vez y luego se mapea con un microespectrómetro Raman con dos líneas de láser diferentes: un láser azul
(488 nm) , para detectar la fluorescencia de las partículas que han reaccionado, y una roja (633 nm) o láser infrarrojo
(785 nm) para identificar los agentes o los marcadores de la enfermedadconcreta . Esta aproximación presenta numerosas ventajas respecto a las técnicas convencionales. La
intensidad de los espectros SERS/SERRS es muy alta, lo cual permite tiempos de detección muy cortos, del orden de milisegundos . Por otra parte, aprovechando la presencia de las nanopartículas , se debería obtener también la
fluorescencia aumentada por superficie del colorante de detección. Se han descrito mejoras en torno a 100 veces (en comparación con la espectroscopia de fluorescencia láser normal, de alrededor 20 veces la de los microscopios de fluorescencia normal, dando lugar a un factor de mejora final de cerca de 2000 veces) , a la distancia óptica optimizada entre la sonda (nanopartícula) y la molécula. Esta última permite una dramática disminución en la
sensibilidad (la cantidad de agente/marcador de enfermedad presente detectado) con límites de detección por debajo de concentraciones picomolar o femtomolar (Fig. 4) .
Ejemplo 6 - Cultivo celular y captura de nanopartículas
Se ponen en contacto organismos celulares, tejidos u órganos con las partículas codificadas funcionalizadas o no. Los cultivos se incuban con nanopartículas dispersas en un medio de cultivo celular siempre a una concentración de 6 nM (en placas de cultivo celular de 3 cm) durante 2 horas a 37 'C en una atmósfera humidificada de 5%C02.
Ejemplo 7 - Uso de las partículas codificadas para la codificación y la trazabilidad de dinero, documentos y consumibles
Las partículas codificadas previamente descritas se
dispersan en la concentración adecuada con polímeros
transparentes con las propiedades adecuadas para ser
adsorbidos en la superficie deseada. El proceso de
codificación comprende impresión, recubrimiento por
rotación, recubrimiento por inmersión de una película sobre una superficie deseada (figura 5 y 6) .

Claims

REIVINDICACIONES
1. Partícula codificada que comprende:
a) al menos un núcleo metálico;
b) un agente de mareaje unido a la superficie de dicho núcleo metálico, proporcionando un núcleo metálico marcado;
c) una capa externa de un material inerte que encapsula a dicho núcleo metálico marcado; y d) al menos una biomolécula directamente o
indirectamente unida a dicha capa externa.
2. Partícula codificada según la reivindicación 1, donde la forma del núcleo metálico es esférica, o
elipsoidal, o cónica, o cilindrica, o cúbica, o cuboide, o piramidal de base cuadrada, o piramidal de base triangular, o prismática triangular, o prismática octagonal.
3. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el núcleo metálico posee una superficie dotada de al menos una punta.
. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde al menos una biomolécula unida a la capa externa se escoge del grupo aminoácidos,
proteínas, péptidos, carbohidratos, hormonas, lípidos.
5. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la al menos una biomolécula directamente unida está unida covalentemente a la capa externa .
6. Partícula codificada según la reivindicación 5, donde la al menos una biomolécula está unida a la capa externa por un enlazador que comprende al menos un grupo funcional escogido del grupo -OH, -SH, -SeH, -TeH, -COOH, una amina primaria, una amina secundaria, una amina
terciaria .
7. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la al menos una biomolécula está indirectamente unida a la capa externa a través de una capa de material inerte que contiene la partícula marcada codificada incrustada en su interior.
8. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la al menos una biomolécula unida a la capa externa comprenda una señal dirigida.
9. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el material inerte es un óxido inorgánico o un polímero orgánico.
10. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la al menos una biomolécula unida a la capa externa está unida al material biológico.
11. Partícula codificada según la reivindicación 12, donde el material biológico se escoge de células inmunes, membranas celulares, virus.
12. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo al menos dos núcleos metálicos .
13. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el núcleo metálico comprende plata y/u oro o sus aleaciones.
14. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el tamaño del núcleo metálico está en el intervalo 10 nm a 2000 nm.
15. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el agente de mareaje
comprende un grupo aromático.
16. Partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el material inerte de la capa externa se escoge del grupo siloxano, titanoxano, polímeros de polietilén-glicol , polímeros de polivinil -alcohol .
17. Método para preparar una particular codificada por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que comprende:
i) preparar un núcleo metálico con una forma y tamaño definidos;
ii) unir un agente de mareaje a dicho núcleo metálico proporcionando un núcleo metálico marcado;
iii) encapsular el mencionado núcleo metálico marcado con una capa externa de material inerte ;
iv) unir directamente o indirectamente al menos una biomolécula en la superficie de dicha capa externa.
18. Método para preparar una microesfera codificada que comprende al menos dos partículas codificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende:
i) preparar al menos dos núcleos metálicos con forma y tamaño definidos;
ii) unir un agente de mareaje a cada uno de los al menos dos núcleos metálicos
proporcionando al menos dos núcleos
metálicos marcados;
iii) incrustar cada uno de los dichos al menos dos núcleos metálicos marcados en una capa de material inerte;
iv) unir los al menos dos núcleos metálicos
marcados encapsulados obtenidos en iii) sobre una microesfera de sílice; v) encapsular los al menos dos núcleos
metálicos marcados unidos a la microesfera de sílice con una capa externa de material inerte ;
vi) unir al menos una biomolécula en la
superficie de la capa externa creada en v) .
19. Microesfera codificada obtenible por el método según la reivindicación 18.
20. Método para la detección de material biológico que comprende los siguientes pasos:
1) inmovilizar una particular codificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una microesfera codificada como se define en la reivindicación 19, sobre una superficie ;
2) localizar dicha partícula codificada o dicha microesfera codificada;
3) contactar la superficie sobre la que se ha
inmovilizado la partícula codificada, o la microesfera codificada, en un medio que
comprende un material biológico;
4) localizar la particular codificada, o microesfera codificada, unida al material biológico .
21. Método para la detección de material biológico según la reivindicación 20, donde la localizión según los pasos 2) y/o 4) consiste en detectar la particular
codificada o la microesfera codificada mediante al menos una técnica de detección escogida del grupo: espectroscopia de absorción y/o espectroscopia de absorción-reflectancia infrarroja aumentada en superficies y/o espectroscopia de emisión de luz fluorescente y/o emisión de luz fosforescente y/o dispersión Raman, y/o espectroscopia de dispersión Raman aumentada en superficies, y/o espectroscopia de dispersión Raraan de resonancia aumentada en superficies, y/o
espectroscopia de dispersión Rayleigh.
22. Método para detección según la reivindicación 20 o 21, donde el método se lleva a cabo en una celda
microfluídica o una celda de citometría de flujo.
23. Uso de la particular codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la detección
espectroscópica o microscópica de la presencia de
microorganismos, preferentemente bacterias o virus.
24. Uso de la partícula codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la detección
espectroscópica o microscópica de agentes patógenos o células inmunogénicas , o anticuerpos.
25. Uso de la particular codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la detección
espectroscópica o microscópica de hormonas, o lípidos, o liposacáridos, o sacáridos .
26. Uso de la particular codificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la detección
espectroscópica o microscópica de reacciones químicas sobre un locus genómico determinado.
27. Uso de la microesfera codificada según la reivindicación 19, para la detección espectroscópica o microscópica de la presencia de microorganismos,
preferentemente bacterias o virus.
28. Uso de la microesfera codificada según la reivindicación 19, para la detección espectroscópica o microscópica de agentes patógenos o células inmunogénicas o anticuerpos .
29. Uso de la microesfera codificada según la reivindicación 19, para la detección espectroscópica o microscópica de hormonas, o lípidos, o liposacáridos , o sacáridos .
30. Uso de la microesfera codificada según la reivindicación 19, para la detección espectroscopica o microscópica de reacciones químicas sobre un locus genómico determinado .
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