WO2012123606A1 - Método para la conservación indefinida de esperma de cefalópodos - Google Patents

Método para la conservación indefinida de esperma de cefalópodos Download PDF

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spermatophore
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Vanesa ROBLES RODRÍGUEZ
Felipe MARTÍNEZ PASTOR
Roger VILLANUEVA LÓPEZ
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Universidad de Leon
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Leon
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    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer

Definitions

  • the present invention is encompassed in the technical sector of the preservation of living invertebrate cells. It also belongs to the sector of the preservation of live parts of animals. As for the application of the invention, it belongs to the invertebrate breeding sector.
  • the present invention presents a method for the conservation of cephalopod sperm, suspended or maintained inside spermatophore and / or spermatangios, which can be preserved whole or sectioned in portions.
  • Cephalopods constitute a group of marine invertebrates of great interest to the food industry and as well as applications in the pharmaceutical and cosmetic industry; e.g., patents KR20080086751, KR100659040, US2005129739), or for biomedical research (Lee et al. 1994). Cephalopods are mainly obtained through fishing activities, with 4,313,510 tonnes captured in 2007, with a value of US $ 7,351 million (FAO 2009), mainly squid of the Dosidicus, /// ex and Todadores genera. However, unlike other aquatic species, aquaculture production is still very small, producing only 30 tons.
  • spermatophors constitute characteristic structures of each species and therefore have taxonomic importance. All cephalopod species present these structures, varying in size and shape. They are generally tubular in shape and encapsulate a sperm mass inside (Austin et al., 1964). Cephalopod spermatophors are more elaborate than those of other mollusks, and have the peculiarity of having a mechanism that, under certain mechanical stimuli and during intercourse, executes the so-called spermatophoric reaction, during which, the spermatophore is avoided and forms a Spermatangium that will remain anchored on different surfaces of the female's body. Sperm are formed in the testis, vas deferens and sperm duct.
  • spermatophors already with sperm inside, are finally stored in the male's Needham bag. They are transferred to the female during intercourse, usually by means of a modified arm called hectocótil and / or an organ similar to a penis called terminal organ.
  • spermatangs can be stored in the female's seminal receptacles located around the buccal membrane, or implanted directly inside or outside the mantle surface, nuchal cartilage, the surface of arms and head, or included directly in the distal oviducts and even reach the ovary. Days, weeks or months after intercourse, females fertilize their oocytes using sperm from these spermatangs.
  • sperm mobility begins by contact with seawater, but within spermatophore or sperm attached to the female, sperm are quiescent. This allows sperm to remain viable for long periods within these structures. Therefore, the spermatophore and spermatangios would be the proper structures by themselves to cryopreserve the sperm of this group of mollusks, not being necessary to freeze the sperm mass alone. One time thawed, sperm mass would be extracted from these structures and used to fertilize the oocytes (for example, using methods such as those described in CN101703013 or CN101427658).
  • cryopreservation is a very useful technique for the indefinite conservation of biological material.
  • the main advantages of cryopreservation are summarized below:
  • sperm cryopreservation technique began in the mid-twentieth century, and has been used successfully in numerous species of mammals and, progressively, in other vertebrate orders. In aquatic invertebrates, studies have been increasing, but they are still limited to a few species of echinoderms (sea urchins and starfish), mollusks (oysters, sea ears and some clams), polychaetes and decapod crustaceans of commercial interest . The creation of sperm banks in these species has enormous potential for hybridization programs, selection of races or genetic lines, gynogenesis, domestication and conservation of genetic stocks (Gwo, 2000).
  • the method for freezing sperm of these species is to pass the sperm mass or intact spermatophore to a medium with cryoprotectant, freeze in vapors of liquid nitrogen or a freezer and keep the samples in a freezer or liquid nitrogen. Defrosting is done in a water or air bath.
  • the methodology varies considerably from one group to another, given the phylogenetic differences that exist between them. Therefore, it is necessary to define its own methodology for each group.
  • cephalopods the Reproductive mechanisms and the basic structure of the spermatophore, with some exceptions, are similar in the different groups, which allows to design methods common to different species, with small adjustments in several parameters (eg, cryoprotectant concentration).
  • the only significant limitation in designing such an invention lies in the size of the spermatophore, which in some large species, for example in the giant North Pacific octopus Enteroctopus dofleini and in the giant squid Architeuthis, can reach a considerably larger size.
  • the sperm of the cephalopod species is constituting a sperm mass within structures called spermatophore that react mechanically during intercourse, becoming spermatangios, a state in which they are implanted in various female body areas.
  • the use of the cryopreservation technique of the present invention with the sperm and / or spermatophore / spermatangios of these cephalopod species would allow the creation of conservation programs for endangered species and would facilitate captive breeding of numerous oceanic cephalopod species with High commercial interest.
  • the performance of the cryopreservation technique of the present invention with the spermatophore / spermatangios further supposes an added advantage over the conservation of free sperm mass, since it facilitates handling and storage, as well as ensuring that sperm are quiescent.
  • the method designed and proposed in the present invention for cryopreservation of spermatozoa and / or cephalopod spermatophore / spermatophan uses cryoprotective substances, exposure times and temperatures that are not toxic to sperm, thus guaranteeing excellent sperm viability. prior to performing the procedure.
  • the cryopreservation protocol of the present invention has been designed to be performed in field conditions without the need to use programmable bio-freezers. The method can be used in a precise but simple way, even allowing its use in fishing and oceanographic vessels, which significantly enhances its value and utility.
  • the spermatophore (obtained from mature males) or spermatangios (obtained from females that have copulated) are sent to the laboratory in refrigeration (4 ° C to 10 ° C), in a solution of artificial seawater or filtered seawater.
  • the present procedure is useful both for those species characterized by small spermatophore / spermatangios, which can be stored without problems in cryotubes preferably from 2 mL to 5 mL or similar containers, as well as for species with larger spermatophore, from 1 cm to 20 cm. In said spermatophors of greater length, these could be cut into sections preferably from 1 cm to 4 cm in length and included in cryotubes.
  • cryoprotective solutions are prepared in seawater (preferably filtered at 0.2 ⁇ (FSW) or also in artificial seawater (ASW)), at a final concentration preferably from 5% to 30%.
  • FSW seawater
  • ASW artificial seawater
  • sulfoxide group specifically DMSO
  • sulfoxides, amides and alcohols methanol and polyalcohols such as glycerol, propanediol, ethylene glycol
  • the temperature and exposure time must be adequate and sufficient to guarantee the penetration of the cryoprotectant into the structure without it being toxic to sperm cells.
  • the spermatophore / spermatangios are exposed to the cryoprotectant (preferably 0.5 ml_ to 2 ml_) at a temperature of approximately 4 ° C to reduce toxicity and for a period of time preferably 5 min to 30 min, to ensure entry of the cryoprotectant (older spermatophors require longer times).
  • Exposure to the cryoprotectant can be performed once at the final concentration or in successive steps at increasing concentrations (for example, preferably at 5%, 10% and 20%), preferably remaining 2 min to 10 min in each solution.
  • the spermatophore / spermatangium is transferred to a cryovial preferably with 0.5 mL to 2 mL of cryoprotective solution.
  • the cryovial is subjected to a cooling process so that the packaged sample follows a predefined freezing ramp, preferably from the initial 4 ° C at a temperature preferably of -80 ° C or less.
  • a predefined freezing ramp preferably from the initial 4 ° C at a temperature preferably of -80 ° C or less.
  • cryovials containing the biological sample are exposed to liquid nitrogen vapors.
  • a bio freezer device can be used. For this, they are placed on a floating support at a height preferably between 1 cm and 6 cm from the surface of the liquid nitrogen, obtaining a freezing ramp preferably between -5 ° C / min to - 40 ° C / min.
  • the cryovials remain in the vapors for an appropriate time (preferably 10 min to 30 min), until the temperature is balanced with that of the vapors.
  • the sample is stored in the liquid nitrogen tank for the desired time, since this procedure allows its preservation indefinitely. If necessary, the sample could be stored in a deep cold freezer (-80 ° C), although the stability of the sample cannot be guaranteed beyond a few weeks.
  • a thermostated bath For defrosting a thermostated bath is used at a temperature preferably between 20 ° C and 40 ° C, for 30 s to 2 min, checking the defrosting of the entire contents. After freezing, the sample is subjected to the washing of the cryoprotectants.
  • This washing consists of the transfer of spermatophore / spermatangium preferably at a volume of 1 ml_ to 2 mL of wash solution.
  • one to four washings of this type can be performed, with a time of 2 min to 5 min in each wash.
  • the wash solution may consist of FSW or ASW, or cryoprotectant diluted in FSW or ASW at a concentration lower than that used for freezing (for example, if it is frozen with 20% cryoprotectant, a first step in cryoprotectant can be performed at 5% and a second step in FSW or ASW).
  • the spermatophore / spermatangium is finally transferred to a tube preferably with FSW or ASW for use.
  • a method for cryopreservation of cephalopod sperm comprising the following steps:
  • cryoprotective solution in a base solution at a final concentration between 5% and 50% and in a preferred case between 5% and 30%, preferably said base solution is filtered seawater or artificial seawater, more preferably
  • the cryoprotective solution is selected from: dimethylsulfoxide, compounds of the amides and alcohols group, even more preferably the cryoprotective solution is selected from: DMSO, methanol, glycerol, propanediol and ethylene glycol.
  • sperm a volume of cryoprotective solution between 0.1 mL and 10 mL, and in a preferred case between 0.5 mL and 2 mL, at a temperature between 0 ° C and 25 ° C, preferably 10 ° C, and more preferably from 4 ° C, for 0 to 2 h, in a preferred case for 5 min to 30 min, in a cryovial,
  • the method for cryopreservation of sperm from Cephalopods are characterized in that the spermatophore or spermatangios are whole or preferably sectioned in sections between 1 cm and 4 cm in length, before being introduced into the cryotubes or cryovials.
  • the method for cryopreservation of cephalopod sperm is characterized in that the selected individuals belong to a species of cephalopods whose spermatophore and spermatangios have a size from 1 cm to 20 cm, and can be stored in cryotubes from 2 mL to 5 mL, or similar containers, whole or in sections preferably 1 cm to 4 cm in length.
  • the method for cryopreservation of cephalopod sperm is characterized in that the selected individuals belong to a species of cephalopods whose spermatophore and spermatangios can be stored without problems in cryotubes from 2 mL to 5 mL, or similar, whole containers or in sections preferably 1 cm to 4 cm in length.
  • cephalopod species belongs to any order, although preferably it belongs to one of the following orders: Nautilide, Spirulida, Sepiida, Sepiolida, Teuthida, Octopodida and Vampyromorphida.
  • said species belongs to the genus Sepia or the genus Octopus, and more preferably to the species Flying /// former coindetW or /// former coindetii Flying.
  • the sperm is stored at a temperature between 4 ° C and 10 ° C in a base solution that is filtered seawater or artificial seawater.
  • the method for cryopreservation of cephalopod sperm is characterized in that steps b) and c) are repeated with increasing final concentrations, at intervals of 1%, up to 25% of the diluent, preferably 5%, 10% and 20% and equilibration times between 1 min and 120 min, preferably between 2 min and 10 minutes, of the diluted sperm.
  • the method for cryopreservation of cephalopod sperm is characterized in that step d) of cooling by freezing ramp is by exposure to liquid nitrogen vapors or in a freezer or bio-freezer, from -20 ° C to - 130 ° C
  • the exposure to liquid nitrogen vapors is carried out by placing a floating support at a height between 0.5 cm to 10 cm, preferably between 1 cm and 6 cm, of the liquid nitrogen surface, more preferably for 2 min to 120 min, in a preferred case for 10 min to 30 min.
  • the method for cryopreservation of cephalopod sperm is characterized in that it can comprise the following additional steps:
  • cryopreserved sperm at a temperature between 4 or - 80 ° C, preferably between 20 ° C and 40 ° C, and more preferably between 20 ° C to 35 ° C, for a period of time between 2 s and 60 min , preferably between 30 s and 5 min, and more preferably between 30 s and 2 min, and, additionally,
  • the washing can be repeated at least 1 to 4 times.
  • the washing solution may be water, filtered seawater or artificial seawater.
  • the method for cryopreservation of cephalopod sperm is characterized in that the washing solution of step f) is cryoprotectant solution diluted in base solution, preferably filtered seawater or artificial seawater, at a concentration less than used in step b).
  • cryopreservation is understood as the process by which biological samples are frozen and maintained at very low temperatures (generally between -80 ° C and -196 ° C).
  • Cephalopod means a marine invertebrate of the Cephalopoda Class belonging to the Mollusca Edge. Includes Orders: Nautilide, Spirulida, Sepiida, Sepiolida, Teuthida, Octopodida and Vampyromorphida. It comprises 47 families, 139 genera and just over 700 species, according to the latest classification commonly accepted by specialists in this group (Sweeney and Roper 1998).
  • Base Solution means the homogeneous mixture of two or more substances on which the cryoprotective agents are added.
  • cryoprotective solution means the chemical compound that protects the biological sample during the cooling and freezing / thawing process.
  • Preparation of the cryoprotective solution is understood as the process by which the cryoprotective agents are diluted in the base solution, in increasing partial concentrations or at final concentration.
  • “Dilution of the cryoprotective solution” means the process by which the concentration of the cryoprotectant solution is reduced by one or more washing steps in solutions without cryoprotectant or with decreasing concentrations of cryoprotectant.
  • cryoprotective agent a proportion or ratio between the amount of cryoprotective agent and the final volume of the solution, between 5% and 50%.
  • time interval of exposure to the cryoprotective solution is understood to be the range of times in which the biological sample is exposed to the cryoprotective solution, from 0 to 2 h.
  • temperature range of exposure to the cryoprotective solution is understood as the temperature range in which the biological sample is exposed to the cryoprotectant solution, from 0 ° C to 25 ° C.
  • cooling ramp speed is understood as the decrease in the temperature of the sample in a given time, which can be variable or constant, from -1 ° C / min to -1000 ° C / min.
  • cooling time interval means the duration of the process during which it is subjected to sperm, spermatangium, spermatophore or the tube containing them at a lower, fixed or decreasing temperature, to achieve cooling and freezing This cooling time interval can extend from 2 min to 120 min.
  • cooling temperature range means the range of temperatures at which the sperm, spermatangium or spermatophore sample is found after cooling. This temperature can range from -20 ° C to -120 ° C.
  • the term "Defrosting time interval” means the duration of the process (from 2 s to 60 min) during which the tube containing the sample is subjected to a temperature above the freezing point of the cryoprotectant medium, so that at least the medium thaws completely.
  • "Defrost temperature range” means the range of temperatures to which the frozen sample is subjected for defrosting. Temperatures from 4 ° C to 80 ° C can be used.
  • washing solution means the solution without cryoprotectant or with a cryoprotectant concentration lower than the cryoprotectant solution, used to reduce the amount of cryoprotectant in the sample.
  • Preparation of the wash solution means the preparation of the base solution with decreasing concentrations of the cryoprotective agent or without cryoprotectant.
  • exposure time to wash solution is understood to mean the duration of exposure of the sperm sample to the wash solution (one or several steps), each step covering up to 60 min.
  • temperature range of exposure to the wash solution is understood as the range of temperatures to which the thawed sample is subjected to the wash solution or solutions. Temperatures from 4 ° C to 25 ° C can be used.
  • sperm viability means the proportion of viable sperm (with the plasma membrane intact according to a staining of cell vitality (propidium iodide, YO-PRO-1, etc.) with respect to the total sperm population of a sample.
  • sperm mobility is understood as the proportion of sperm with their own movement (evaluated by microscopy) with respect to the total sperm population of a sample.
  • FIG. 1 Effect of the combination of 15% cryoprotectants and times (DMS: dimethylsulfoxide; ETG: ethylene glycol; GLY: glycerol; MET: methanol; PPD: propanediol).
  • the baseline is the control (viability: 55.4 ⁇ 6.2).
  • the results are shown as 95% confidence intervals of the average value of the effect (circles).
  • Neorossia caroli (Cephalopoda: Sepiolidae) from the southern Sardinian sea (western Mediterranean). J Mar Biol Assoc UK 87: 971-976.
  • the spermatophore / spermatangios of Volador /// ex coindetii (oceanic squid present in Atlantic and Mediterranean waters) were introduced into cryovials containing 1 mL of 15% cryoprotectant in FSW.
  • the cryoprotectants tested in this example were DMSO, methanol, glycerol, propanediol and ethylene glycol.
  • Several replications were performed to test the viability of sperm (Hoechst 33342 positive sperm, membrane rupture indicator; flow cytometry evaluation) after 5 min, 15 min and 30 min at 4 ° C.
  • the spermatophors were washed in two steps (1 mL of the 5% cryoprotectant and 1 mL of FSW, 2 min in each solution). A triplicate was performed within each combination of time and temperature. The presence of mobile sperm was checked by phase contrast microscopy.
  • the spermatophore / spermatangios were introduced into cryovials containing 1 mL of 15% DMSO in FSW. Exposure to the cryoprotectant was performed at 4 ° C for 30 min. After that time, the cryovials were placed on a floating support 2 cm from the surface of the liquid nitrogen in two configurations: vertical in a plastic rack and horizontal. The set is inside an insulated box with a lid. After 30 min, the cryovials were immersed in liquid nitrogen and stored in liquid nitrogen until defrosted.
  • the cryovials were placed in a thermostated bath at 30 ° C for 2 min 20 s. 1 mL of FSW was immediately added at 4 ° C to the cryovial. After 1 min, the spermatophore / spermatangium was captured with tweezers and placed in a well of a 24-well plate containing a solution of the cryoprotectant diluted 1/4 in FSW with respect to the cryoprotective solution used for freezing. After 1 min, the spermatophore / spermatangium was placed in another well of the plate with FSW. One minute later, the spermatophore / spermatangium was processed to extract the sperm mass for analysis, assessing sperm viability as in the case of the toxicity experiment.
  • Cryopreservation of spermatophors at -80 ° C The spermatophore / spermatangios were introduced into cryovials containing 1 ml_ of 15% cryoprotectant in FSW.
  • the cryoprotectants used were DMSO, ethylene glycol and glycerol. Exposure to the cryoprotectant was performed at 4 ° C for 30 min. After this time, the cryovials were placed in an isothermal box to achieve slow cooling. The box was placed in a freezer at -80 ° C.
  • the cryovials were placed in a thermostated bath at 30 ° C for 2 min 20 s. 1 mL of FSW was immediately added at 4 ° C to the cryovial. After 1 min, the spermatophore / spermatangium was captured with tweezers and placed in a well of a 24-well plate containing a solution of the cryoprotectant diluted 1/4 in FSW with respect to the cryoprotective solution used for freezing. After 1 min, the spermatophore / spermatangium was placed in another well of the plate with FSW. One minute later, the spermatophore / spermatangium was processed to extract the sperm mass for analysis, assessing sperm viability as in the case of the toxicity experiment.

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Abstract

La presente invención reivindica un método de conservación a largo plazo del esperma de cefalópodos mediante la criopreservación de sus espermatóforos y espermatangios. La criopreservación se obtiene mediante el empleo de protocolos óptimos de incorporación y eliminación de crioprotectores permeables (alcoholes, sulfóxidos y formamidas en solución acuosa), y rampas de congelación y descongelación adecuadas. El método aquí descrito presenta una elevada utilidad en la cría en cautividad de especies de cefalópodos con interés comercial, en la conservación de especies en peligro de extinción y en investigaciones que desarrollan técnicas de fertilización in vitro en cefalópodos.

Description

MÉTODO PARA LA CONSERVACIÓN INDEFINIDA DE ESPERMA DE CEFALÓPODOS
La presente invención se engloba en el sector técnico de la preservación de células vivas de invertebrados. También pertenece al sector de la preservación de partes vivas de animales. En cuanto a la aplicación de la invención, pertenece al sector de la cría de invertebrados.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La presente invención presenta un método para la conservación de espermatozoides de cefalópodo, en suspensión o mantenidos en el interior de espermatóforos y/o espermatangios, los cuales pueden conservarse enteros o seccionados en porciones.
Los cefalópodos constituyen un grupo de invertebrados marinos de gran interés para la industria alimentaria y así como con aplicaciones en industria farmacéutica y cosmética; e.g., patentes KR20080086751 , KR100659040, US2005129739), o para investigación en biomedicina (Lee et al. 1994). Los cefalópodos se obtienen principalmente mediante actividades pesqueras, capturándose 4.313.510 toneladas en el año 2007, con un valor de 7.351 millones de US$ (FAO 2009), principalmente calamares de los géneros Dosidicus, ///ex y Todadores. No obstante, al contrario que otras especies acuáticas, la producción mediante acuicultura es aún muy reducida, produciéndose sólo 30 toneladas. Aún así informes de expertos indican que los esfuerzos para establecer cultivos intensivos y semi-intensivos de estos animales deberían intensificarse, debido a las características propias de este grupo de rápido crecimiento y riqueza en proteína, su importancia económica actual, el estado de las pesquerías y la proyección futura de su creciente consumo (Sykes et al., 2006; Pierce et al. 2010).
La incipiente acuicultura de cefalópodos se ha desarrollado principalmente con los géneros Sepia y Octopus (Vaz-Pires et al. 2004; Sykes et al., 2006). En la última década se han realizado engordes de ejemplares subadultos de pulpo (Octopus vulgaris) con fines comerciales en el noroeste de la Península Ibérica (Chapela et al. 2006; Rodríguez et al., 2006). Existen varias patentes orientadas a la cría de cefalópodos, especialmente relacionadas con estructuras y métodos para el mantenimiento y engorde de individuos subadultos y adultos (e.g., CN201 163931 , ES2121700, JP2002360105, CN201 160421 , JP9023782, CN201204867, CN101268767, CN101491226, CN101637141 ). El principal problema actualmente consiste en la cría de paralarvas y juveniles, habiéndose realizado progresos significativos en los últimos años (Iglesias et al., 2007; Villanueva & Norman 2008; Jones et al., 2010; Uriarte et al., 2010), reflejados en algunas patentes para la cría de paralarvas (CN101317551 , CN101455188) y fertilización in vitro en cefalópodos (CN 101703013, CN 101427658). La patente CN101703034 propone un sistema para la cría de pulpo que incluye entornos para el apareamiento de los adultos, la puesta de huevos y la separación y cría de las paralarvas.
El esfuerzo realizado en investigación y su transferencia en tecnología permite augurar un rápido crecimiento de la acuicultura de cefalópodos, y un incremento de su importancia relativa en la producción destinada a su consumo o utilización industrial. Al mismo tiempo que se mejoran las técnicas de cultivo de cefalópodos y se incrementa el rendimiento de las instalaciones, se pretende mantener el ciclo vital completo de las especies en cautividad. La presente invención se encuadra en este contexto. La aplicación de tecnologías reproductivas ha permitido mejorar la gestión, reducir costes y facilitar programas de selección genética en otras especies (Gosden et al., 2002). Dentro de estas tecnologías, la congelación de esperma, extendiendo su vida útil indefinidamente, tiene una importancia crucial, ya que ha permitido la extensión de programas de inseminación artificial, e incluso el comercio de dosis seminales. La aplicación de esta tecnología en cefalópodos sería muy beneficiosa para mejorar el rendimiento de cultivos de especies oceánicas mediante fertilización in vitro (Sakurai et al. 1995), para la selección de stocks de progenitores (Iglesias et al. 2007), así como para la conservación de especies en peligro de extinción (Freeman et al., 2010).
En la actualidad no existe publicado ningún estudio científico ni ninguna patente en relación con la congelación de espermatozoides ni espermatóforos o espermatangios en cefalópodos. Existen varios estudios relacionados con la estructura y características morfológicas de los espermatozoides de varias especies (Diaspro et al., 1997; Giménez-Bonafé et al., 2002; Giménez-Bonafé et al., 2004; Cuccu et al., 2007; Li et al., 2010), así como con la fisiología de los espermatoforos de cefalópodos (Austin et al., 1964; Mann et al., 1981 ; Naud et al., 2006; Wada et al., 2010).
Los espermatoforos constituyen estructuras características de cada especie y por ello tienen importancia taxonómica. Todas las especies de cefalópodos presentan estas estructuras, variando entre ellos el tamaño y la forma de los mismos. Generalmente son de forma tubular y encapsulan en su interior una masa espermática (Austin et al., 1964). Los espermatoforos de los cefalópodos son más elaborados que los de otros moluscos, y poseen la peculiaridad de poseer un mecanismo que, bajo ciertos estímulos mecánicos y durante la cópula, ejecuta la llamada reacción espermatofórica, durante la cual, el espermatóforo se evierte y forma un espermatangio que permanecerá anclado en diferentes superficies del cuerpo de la hembra. Los espermatozoides se forman en el testículo, vasos deferentes y espermiducto. Los espermatoforos, ya con esperma en su interior se almacenan finalmente en la bolsa de Needham del macho. Son transferidos a la hembra durante la cópula, generalmente mediante un brazo modificado denominado hectocótilo y/o un órgano similar a un pene denominado órgano terminal. Dependiendo de las especies los espermatangios pueden ser almacenados en receptáculos seminales de la hembra situados alrededor de la membrana bucal, o implantados directamente en el interior o exterior de la superficie del manto, cartílago nucal, la superficie de brazos y cabeza, o incluidos directamente en los oviductos distales e incluso llegar hasta el ovario. Días, semanas o meses después de la cópula, las hembras fertilizan sus oocitos utilizando los espermatozoides provenientes de estos espermatangios.
La movilidad espermática se inicia por contacto con el agua de mar, pero dentro de los espermatoforos o de los espermatangios unidos a la hembra, los espermatozoides son quiescentes. Esto permite que los espermatozoides permanezcan viables durante largos periodos dentro de estas estructuras. Por lo tanto, los espermatoforos y espermatangios serían las estructuras adecuadas por sí mismas para criopreservar los espermatozoides de este grupo de moluscos, no siendo necesario congelar la masa espermática por sí sola. Una vez descongelados, la masa espermática sería extraída de estas estructuras y utilizada para fertilizar los oocitos (por ejemplo, utilizando métodos como los descritos en CN101703013 o CN101427658).
La criopreservación seminal es una técnica de gran utilidad para la conservación indefinida de material biológico. Las principales ventajas de la criopreservación se resumen a continuación:
- posibilidad de preservar o conservar el material genético;
- posibilidad de analizar y comparar el material genético, entre varios individuos de una misma especie;
- ayuda o facilitación de cruces, comparado con el cruce de animales formados;
- posibilidad de seleccionar el entrecruzamiento más óptimo en función de por ejemplo las condiciones ambientales;
- posibilidad de comprobar la ausencia de contaminación por agentes infecciosos;
- beneficio de preservar volúmenes reducidos de líquido, comparado con el mantenimiento de animales ya formados.
La técnica de criopreservación de espermatozoides se inició a mediados del siglo XX, y ha sido utilizada exitosamente en numerosas especies de mamíferos y, progresivamente, en otros órdenes de vertebrados. En invertebrados acuáticos, los estudios se han ido incrementando, pero están aún limitados a unas pocas especies de equinodermos (erizos de mar y estrellas de mar), moluscos (ostras, oreja de mar y algunas almejas), poliquetos y crustáceos decápodos de interés comercial. La creación de bancos de esperma en estas especies tiene un enorme potencial para los programas de hibridización, selección de razas o líneas genéticas, ginogénesis, domesticación y conservación de stocks genéticos (Gwo, 2000). Generalmente, el método para congelar espermatozoides de estas especies consiste en pasar la masa espermática o el espermatóforo intacto a un medio con crioprotector, congelar en vapores de nitrógeno líquido o un congelador y mantener las muestras en un congelador o en nitrógeno líquido. La descongelación se realiza en un baño de agua o al aire. Obviamente, la metodología varía considerablemente de unos grupos a otros, dadas las diferencias filogenéticas que existen entre ellos. Por lo tanto, es preciso definir una metodología propia para cada grupo. En el caso de los cefalópodos, los mecanismos reproductivos y la estructura básica del espermatóforo, con algunas excepciones, es similar en los distintos grupos, lo cual permite diseñar métodos comunes a distintas especies, con pequeños ajustes en varios parámetros (e.g., concentración de crioprotector). La única limitación apreciable para diseñar tal invención reside en el tamaño del espermatóforo, que en algunas especies de gran tamaño, por ejemplo en el pulpo gigante del Pacífico norte Enteroctopus dofleini y en el calamar gigante Architeuthis, pueden alcanzar un tamaño considerablemente mayor.
La ausencia de un método adecuado para la conservación a largo plazo del esperma de cefalópodo reduce significativamente tanto la posibilidad de cría en cautividad de algunas de estas especies de gran valor económico, como la creación de programas de conservación de especies de cefalópodos actualmente consideradas en peligro de extinción. Esta técnica nunca ha sido empleada en cefalópodos, ni se ha propuesto ninguna metodología con este fin. Esto hace que sea necesaria la búsqueda de un método para criopreservar los espermatozoides de cefalópodos, en suspensión o mantenidos en el interior de espermatoforos y/o espermatangios, mediante el empleo de protocolos óptimos de incorporación y eliminación de crioprotectores permeables, y rampas de congelación y descongelación adecuadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El esperma de las especies de cefalópodos se encuentra constituyendo una masa espermática dentro de unas estructuras denominadas espermatoforos que reaccionan mecánicamente durante la cópula convirtiéndose en espermatangios, estado en el que se encuentran implantados en varias áreas corporales de hembras. El empleo de la técnica de criopreservación de la presente invención con los espermatozoides y/o los espermatóforos/espermatangios de estas especies de cefalópodos permitiría crear programas de conservación de especies en peligro de extinción y facilitaría la cría en cautividad de numerosas especies de cefalópodos oceánicos con elevado interés comercial. La realización de la técnica de criopreservación de la presente invención con los espermatóforos/espermatangios supone además una ventaja añadida frente a la conservación de la masa espermática libre, puesto que facilita su manipulación y almacenamiento, además de asegurar que los espermatozoides se encuentren quiescentes. El método diseñado y propuesto en la presente invención para la criopreservación de los espermatozoides y/o los espermatóforos/espermatangios de cefalópodo utiliza sustancias crioprotectoras, tiempos y temperaturas de exposición que no resultan tóxicos para los espermatozoides, garantizando, por tanto, una excelente viabilidad espermática previa a la realización del procedimiento. Además, el protocolo de criopreservación de la presente invención ha sido diseñado para poder ser realizado en condiciones de campo sin necesidad de utilizar biocongeladores programables. El método puede ser utilizado de forma precisa pero sencilla, permitiendo incluso su empleo en buques pesqueros y oceanográficos, lo que potencia significativamente su valor y utilidad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los espermatoforos (obtenidos de machos maduros) o espermatangios (obtenidos de hembras que han copulado) son enviados al laboratorio en refrigeración (4 °C a 10 °C), en una solución de agua de mar artificial o agua de mar filtrada. El presente procedimiento es útil tanto para aquellas especies que caracterizadas por espermatóforos/espermatangios de pequeño tamaño, que pueden almacenarse sin problemas en criotubos preferentemente de 2 mL a 5 mL o recipientes similares, como para especies con espermatoforos más grandes, desde 1 cm hasta 20 cm. En dichos espermatoforos de mayor longitud, éstos podrían cortarse en secciones preferentemente de 1 cm a 4 cm de longitud e incluirse en criotubos.
Antes de someter los espermatóforos/espermatangios al proceso de congelación, éstos son expuestos a las sustancias crioprotectoras. Se preparan las soluciones crioprotectoras en agua de mar (filtrada preferentemente a 0,2 μιτι (FSW) o también en agua de mar artificial (ASW)), a una concentración final preferentemente de 5% a 30%. Los estudios realizados muestran que los crioprotectores permeables del grupo de los sulfóxidos, específicamente el DMSO, proporcionan la mayor crioprotección. En cuanto a la toxicidad, hemos comprobado que los sulfóxidos, amidas y alcoholes (metanol y polialcoholes como el glicerol, propanodiol, etilén glicol) presentan una toxicidad muy baja o inapreciable.
La temperatura y el tiempo de exposición han de ser adecuados y suficientes para garantizar la penetración del crioprotector en la estructura sin que éste resulte tóxico para las células espermáticas. Preferentemente los espermatóforos/espermatangios son expuestos al crioprotector (preferentemente de 0,5 ml_ a 2 ml_) a una temperatura aproximada de 4 °C para reducir la toxicidad y durante un periodo de tiempo preferentemente de 5 min a 30 min, para asegurar la entrada del crioprotector (espermatóforos mayores requieren tiempos más prolongados). La exposición al crioprotector se puede realizar de una vez a la concentración final o en pasos sucesivos a concentraciones crecientes (por ejemplo, preferentemente a 5%, 10% y 20%), permaneciendo preferentemente de 2 min a 10 min en cada solución.
El espermatóforo/espermatangio se transfiere a un criovial preferentemente con 0,5 mL a 2 mL de solución crioprotectora. El criovial se somete a un proceso de enfriamiento de manera que la muestra envasada siga una rampa de congelación predefinida, preferentemente de los 4 °C iniciales a una temperatura preferentemente de -80 °C o menor. Para conseguir la rampa de congelación óptima, los crioviales que contienen la muestra biológica son expuestos a vapores de nitrógeno líquido. Alternativamente, se puede utilizar un dispositivo biocongelador. Para ello se sitúan en un soporte flotante a una altura preferentemente entre 1 cm y 6 cm de la superficie del nitrógeno líquido, consiguiendo una rampa de congelación preferentemente de entre -5 °C/min a - 40 °C/min. Los crioviales permanecen en los vapores un tiempo apropiado (preferentemente de 10 min a 30 min), hasta que la temperatura se equilibra con la de los vapores.
La muestra es almacenada en el tanque de nitrógeno líquido durante el tiempo deseado, ya que este procedimiento permite su conservación de forma indefinida. En caso necesario, se podría almacenar la muestra en un congelador de frío profundo (-80 °C), aunque la estabilidad de la muestra no se puede garantizar más allá de unas semanas.
Para la descongelación se utiliza un baño termostatizado a una temperatura preferentemente entre 20 °C y 40 °C, durante 30 s a 2 min, comprobando la descongelación de todo el contenido. Tras la congelación, la muestra se somete al lavado de los crioprotectores. Este lavado consiste en la transferencia del espermatóforo/espermatangio preferentemente a un volumen de 1 ml_ a 2 mL de solución de lavado. Se pueden realizar preferentemente de uno a cuatro lavados de este tipo, con un tiempo de 2 min a 5 min en cada lavado. La solución de lavado puede consistir en FSW o ASW, o en crioprotector diluido en FSW o ASW a una concentración menor que la utilizada para congelar (por ejemplo, si se congela con crioprotector al 20%, se puede realizar un primer paso en crioprotector al 5% y un segundo paso en FSW o ASW).
El espermatóforo/espermatangio es finalmente transferido a un tubo preferentemente con FSW o ASW para su utilización.
En una realización preferente de la invención se protege un método para la criopreservación del esperma de cefalópodos que comprende los siguientes pasos:
a) obtención del esperma de los individuos seleccionados, preferentemente el esperma de cefalópodos se encuentra contenido dentro de espermatóforos o espermatangios,
b) preparación de la solución crioprotectora en una solución base a una concentración final entre 5% y 50% y en un caso preferente entre 5% y 30%, preferentemente dicha solución base es agua de mar filtrada o agua de mar artificial, más preferentemente la solución crioprotectora se selecciona entre: dimetilsulfóxido, compuestos del grupo de las amidas y alcoholes, aún más preferentemente la solución crioprotectora se selecciona entre: DMSO, metanol, glicerol, propanodiol y etilenglicol.
c) exposición del esperma a un volumen de solución crioprotectora entre 0.1 mL y 10 mL, y en un caso preferente entre 0,5 mL y 2 mL, a una temperatura entre 0 °C y 25 °C, preferentemente de 10 °C, y más preferentemente de 4 °C, durante 0 a 2 h, en un caso preferente durante 5 min a 30 min, en un criovial,
d) enfriamiento por rampa de congelación del criovial a una velocidad entre -1 °C/min y -100 °C/min, en un caso preferente entre -5 °C/min y -40° C/min, desde una temperatura de +25 °C a por lo menos -20 °C, en un caso más referente desde una temperatura de +4 °C a -80 °C.
En un caso preferente el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque los espermatóforos o espermatangios se encuentran enteros o bien seccionados preferentemente en secciones de entre 1 cm y 4 cm de longitud, antes de introducirse en los criotubos o crioviales.
En una realización preferente, el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque los individuos seleccionados pertenecen a una especie de cefalópodos cuyos espermatóforos y espermatangios presentan un tamaño desde 1 cm hasta 20 cm, pudiendo ser almacenados en criotubos de 2 mL a 5 mL, o recipientes similares, enteros o en secciones preferentemente de 1 cm a 4 cm de longitud.
En una realización más preferente, el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque los individuos seleccionados pertenecen a una especie de cefalópodos cuyos espermatóforos y espermatangios se pueden almacenar sin problemas en criotubos de 2 mL a 5 mL, o recipientes similares, enteros o en secciones preferentemente de 1 cm a 4 cm de longitud.
En una realización más preferente dicha especie de cefalópodos pertenece a cualquier orden, aunque preferentemente pertenece a uno de los siguientes ordenes: Nautilida, Spirulida, Sepiida, Sepiolida, Teuthida, Octopodida y Vampyromorphida. En una realización más preferente dicha especie pertenece al género Sepia o al género Octopus, y más preferentemente a la especie Volador ///ex coindetW o ///ex coindetii Volador.
En otra realización más preferente en el paso a) se conserva el esperma a una temperatura entre 4 °C y 10 °C en una solución base que es agua de mar filtrada o agua de mar artificial.
En otra realización más preferente el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque los pasos b) y c) se repiten con concentraciones finales crecientes, a intervalos de 1 %, hasta 25% del diluyente, preferentemente de 5%, 10% y 20% y tiempos de equilibrado entre 1 min y 120 min, preferentemente entre 2 min y 10 minutos, del esperma diluido. En otra realización más preferente el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque el paso d) de enfriamiento por rampa de congelación es por exposición a vapores de nitrógeno líquido o en un congelador o dispositivo biocongelador, de -20 °C a -130 °C. Preferentemente la exposición a vapores de nitrógeno líquido se realiza situando un soporte flotante a una altura entre 0,5 cm a 10 cm, preferentemente entre 1 cm y 6 cm, de la superficie de nitrógeno líquido, más preferentemente durante 2 min a 120 min, en un caso preferente durante 10 min a 30 min.
En otra realización más preferente el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque puede comprender los siguientes pasos adicionales:
e) descongelación del esperma criopreservado, a una temperatura entre 4o- 80 °C, preferentemente entre 20 °C y 40 °C, y más preferentemente entre 20 °C a 35 °C, por un periodo de tiempo entre 2 s y 60 min, preferentemente entre 30 s y 5 min, y más preferentemente entre 30 s y 2 min, y, adicionalmente,
f) lavado del esperma descongelado con un volumen entre 0.5 ml_ a 10 ml_, preferentemente entre 1 ml_ - 2ml_, de una solución de lavado, por un periodo de tiempo de hasta 60 min, en un caso preferente por un periodo de tiempo entre 2 min y 5 min, a una temperatura de 4 °C a 25 °C. En un caso más preferente el lavado se puede repetir al menos entre 1 y 4 veces. En un caso particular, la solución de lavado puede ser agua, agua de mar filtrada o agua de mar artificial.
En otra realización más preferente el método para la criopreservación de esperma de cefalópodos está caracterizado porque la solución de lavado del paso f) es solución crioprotectora diluida en solución base, preferentemente agua de mar filtrada o agua de mar artificial, a una concentración menor que la empleada en el paso b). En la presente invención se entiende por "Criopreservación" el proceso mediante el cual se congelan y mantienen muestras biológicas a muy bajas temperaturas (generalmente entre -80 °C y -196 °C).
En la presente invención se entiende por "Cefalópodo" un invertebrado marino de la Clase Cephalopoda perteneciente al Filo Mollusca. Incluye los Ordenes: Nautilida, Spirulida, Sepiida, Sepiolida, Teuthida, Octopodida y Vampyromorphida. Comprende 47 Familias, 139 géneros y algo más de 700 especies, acorde con la última clasificación comúnmente aceptada por especialistas en este grupo (Sweeney and Roper 1998).
En la presente invención se entiende por "Solución Base" la mezcla homogénea de dos o más sustancias sobre las que se añaden los agentes crioprotectores. En la presente invención se entiende por "Solución crioprotectora" el compuesto químico que protege a la muestra biológica durante el proceso de enfriamiento y congelación/descongelación.
En la presente invención se entiende por "Preparación de la solución crioprotectora" el proceso mediante el cual los agentes crioprotectores se diluyen en la solución base, en concentraciones parciales crecientes o a concentración final.
En la presente invención se entiende por "Dilución de la solución crioprotectora" el proceso mediante el cual se reduce la concentración de la solución crioprotectora mediante uno o más pasos de lavado en soluciones sin crioprotector o con concentraciones decrecientes de crioprotector.
En la presente invención se entiende por "Concentración del agente crioprotector"! a proporción o relación entre la cantidad de agente crioprotector y el volumen final de la solución, entre 5% y 50%.
En la presente invención se entiende por "Intervalo de tiempo de exposición a la solución crioprotectora" al rango de tiempos en el que la muestra biológica es expuesta a la solución crioprotectora, de 0 a 2 h.
En la presente invención se entiende por "Intervalo de temperatura de exposición a la solución crioprotectora" al rango de temperaturas en el que la muestra biológica es expuesta a la solución crioprotectora, de 0 °C a 25 °C.
En la presente invención se entiende por "Velocidad de rampa de enfriamiento" la disminución de la temperatura de la muestra en un tiempo determinado, que puede ser variable o constante, de -1 °C/min a -1000 °C/min. En la presente invención se entiende por "Intervalo de tiempo de enfriamiento! la duración del proceso durante el cual se somete al esperma, espermatangio, espermatoforo o al tubo que los contiene a una temperatura inferior, fija o decreciente, para conseguir su enfriamiento y congelación. Este intervalo de tiempo de enfriamiento puede extenderse de 2 min a 120 min.
En la presente invención se entiende por "Intervalo de temperatura de enfriamiento" el rango de temperaturas a las que se encuentra la muestra de esperma, espermatangio o espermatoforo tras el enfriamiento. Esta temperatura puede abarcar de -20 °C a -120 °C.
En la presente invención se entiende por "Intervalo de tiempo de descongelación" la: duración del proceso (de 2 s a 60 min) durante el cual se somete al tubo que contiene la muestra a una temperatura por encima del punto de congelación del medio crioprotector, para que, al menos, el medio se descongele completamente. En la presente invención se entiende por "Intervalo de temperatura de descongelación"el rango de temperaturas a las que se somete la muestra congelada para su descongelación. Pueden utilizarse temperaturas de 4 °C a 80 °C.
En la presente invención se entiende por "Solución de lavado" la solución sin crioprotector o con una concentración de crioprotector menor que la solución crioprotectora, utilizada para reducir la cantidad de crioprotector de la muestra. En la presente invención se entiende por "Preparación de la solución de lavado" la preparación de la solución base con concentraciones decrecientes del agente crioprotector o sin crioprotector.
En la presente invención se entiende por "Intervalo de tiempo de exposición a la solución de lavado" la duración de la exposición de la muestra de esperma a la solución de lavado (uno o varios pasos), abarcando cada paso hasta 60 min.
En la presente invención se entiende por "Intervalo de temperatura de exposición a la solución de lavado" el rango de temperaturas a las que se somete la muestra descongelada a la solución o soluciones de lavado. Pueden utilizarse temperaturas de 4 °C a 25 °C.
En la presente invención se entiende por "Viabilidad espermática" la proporción de espermatozoides viables (con la membrana plasmática intacta según una tinción de vitalidad celular (ioduro de propidio, YO-PRO-1 , etc.) respecto a la población total de espermatozoides de una muestra. En la presente invención se entiende por "Movilidad espermática" la proporción de espermatozoides con movimiento propio (evaluados mediante microscopía) respecto a la población total de espermatozoides de una muestra.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efecto de la combinación de crioprotectores al 15% y tiempos (DMS: dimetilsulfóxido; ETG: etilénglicol; GLY: glicerol; MET: metanol; PPD: propanodiol). La línea base es el control (viabilidad: 55,4±6,2). Los resultados se muestran como intervalos de confianza al 95% del valor medio del efecto (círculos).
Figura 2. Criopreservación de espermatóforos usando DMSO al 15% y criotubos colocados en posición horizontal o vertical sobre los vapores de nitrógeno líquido (media y error estándar del porcentaje de espermatozoides con membranas dañadas).
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EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1.
Toxicidad de los crioprotectores:
Se ha comprobado que existe una gran variabilidad en otras especies de moluscos en cuanto a la toxicidad de los crioprotectores sobre los espermatozoides. En cambio, no parece existir una toxicidad acusada para los espermatozoides de cefalópodo mantenidos en espermatóforos/espermatangios y expuestos a distintos crioprotectores.
Los espermatóforos/espermatangios de Volador ///ex coindetii (calamar oceánico presente en aguas atlánticas y mediterráneas) se introdujeron en crioviales conteniendo 1 mL de crioprotector al 15% en FSW. Los crioprotectores ensayados en este ejemplo fueron DMSO, metanol, glicerol, propanodiol y etilén glicol. Se realizaron varias réplicas para ensayar la viabilidad de los espermatozoides (espermatozoides positivos a Hoechst 33342, indicador de rotura de membrana; evaluación mediante citometría de flujo) tras 5 min, 15 min y 30 min a 4 °C. Tras el tiempo correspondiente, los espermatóforos se lavaron en dos pasos (1 mL del crioprotector al 5% y 1 mL de FSW, 2 min en cada solución). Dentro de cada combinación de tiempo y temperatura se realizó un triplicado. Se comprobó la presencia de espermatozoides móviles mediante microscopía de contraste de fases.
En los resultados (Fig. 1 ).se comprobó que no había evidencia clara de toxicidad. No obstante, se observó una tendencia hacia un efecto negativo del glicerol, especialmente a los 30 min. En todos los casos se observó movilidad espermática.
EJEMPLO 2
Criopreservación de espermatóforos en vapores de nitrógeno líquido:
Los espermatóforos/espermatangios fueron introducidos en crioviales conteniendo 1 mL de DMSO al 15% en FSW. La exposición al crioprotector se realizó a 4 °C durante 30 min. Transcurrido dicho tiempo, los crioviales fueron colocados en un soporte flotante a 2 cm de la superficie del nitrógeno líquido en dos configuraciones: vertical en una gradilla de plástico y horizontal. El conjunto se encuentra dentro de una caja aislante con tapa. Tras 30 min, los crioviales se sumergieron en el nitrógeno líquido y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta el momento de su descongelación.
Para la descongelación, los crioviales se introdujeron en un baño termostatizado a 30 °C durante 2 min 20 s. Se añadió inmediatamente 1 mL de FSW a 4 °C al criovial. Tras 1 min, el espermatóforo/espermatangio se capturó con pinzas y se colocó en un pocilio de una placa de 24 pocilios conteniendo una solución del crioprotector diluida 1/4 en FSW respecto a la solución crioprotectora utilizada para la congelación. Transcurrido 1 min, el espermatóforo/espermatangio se colocó en otro pocilio de la placa con FSW. Un minuto después, el espermatóforo/espermatangio se procesó para extraer la masa espermática para su análisis, evaluando la viabilidad espermática como en el caso del experimento de toxicidad.
Tras la congelación, la mayoría de los espermatozoides tenían daños de membrana si los criotubos se habían colocado en posición vertical, pero esta proporción se redujo en los espermatóforos que se habían congelado con los criotubos en posición horizontal (Fig. 2). Posiblemente, cuando los criotubos se colocan en posición horizontal, se evita un gradiente de temperatura que puede perjudicar la congelación.
EJEMPLO 3.
Criopreservación de espermatóforos a -80 °C: Los espermatóforos/espermatangios fueron introducidos en crioviales conteniendo 1 ml_ de crioprotector al 15% en FSW. Los crioprotectores utilizados fueron DMSO, etilenglicol y glicerol. La exposición al crioprotector se realizó a 4 °C durante 30 min. Transcurrido dicho tiempo, los crioviales fueron colocados en una caja isoterma para conseguir un enfriamiento lento. La caja se introdujo en un congelador a -80 °C.
Para la descongelación, los crioviales se introdujeron en un baño termostatizado a 30 °C durante 2 min 20 s. Se añadió inmediatamente 1 mL de FSW a 4 °C al criovial. Tras 1 min, el espermatóforo/espermatangio se capturó con pinzas y se colocó en un pocilio de una placa de 24 pocilios conteniendo una solución del crioprotector diluida 1/4 en FSW respecto a la solución crioprotectora utilizada para la congelación. Transcurrido 1 min, el espermatóforo/espermatangio se colocó en otro pocilio de la placa con FSW. Un minuto después, el espermatóforo/espermatangio se procesó para extraer la masa espermática para su análisis, evaluando la viabilidad espermática como en el caso del experimento de toxicidad.
Tras la descongelación, no se recuperaron espermatozoides viables, excepto en el tratamiento con DMSO (6,3±2,2%).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método para la criopreservación del esperma de cefalópodos que comprende los siguientes pasos:
a) obtención del esperma de los individuos seleccionados,
b) preparación de la solución crioprotectora en una solución base a una concentración final entre 5% y 50%,
c) exposición del esperma a un volumen de solución crioprotectora entre 0,1 ml_ y 10 ml_, a una temperatura entre 0 °C a 25 °C, de 0 a 2 h en un criovial,
d) enfriamiento por rampa de congelación del criovial a una velocidad entre -1 °C/min y -100 °C/min, desde una temperatura de +25 °C a por lo menos -20 °C.
2. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 1 , caracterizado porque el esperma de cefalópodo está contenido dentro de espermatóforos o espermatangios.
3. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 2, caracterizado porque los espermatóforos o espermatangios se encuentran enteros o en secciones de entre 1 cm y 4 cm.
4. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha especie de cefalópodos pertenece a los Ordenes: Nautilida, Spirulida, Sepiida, Sepiolida, Teuthida, Octopodida y Vampyromorphida. .
5. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 4, caracterizado porque la especie de cefalópodo es ///ex coindetii Volador.
6. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en el paso a) se conserva el esperma a una temperatura entre 4 °C y 10 °C en una solución base que es agua de mar filtrada o agua de mar artificial.
7. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución crioprotectora del paso b) se selecciona entre: dimetilsulfóxido, compuestos del grupo de las amidas y alcoholes.
8. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 7, caracterizado porque la solución crioprotectora del paso b) se selecciona entre: DMSO, metanol, glicerol, propanodiol y etilenglicol.
9. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los pasos b) y c) se repiten con concentraciones finales crecientes a intervalos de 1 a 25% del diluyente y tiempos de equilibrado entre 1 min y 120 min del esperma diluido.
9. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el paso d) de enfriamiento por rampa de congelación está seleccionado del grupo que comprende: por exposición a vapores de nitrógeno líquido, en un congelador de -20 °C a -130 °C y en un dispositivo biocongelador.
10. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 9, caracterizado porque la exposición a vapores de nitrógeno líquido se realiza situando un soporte flotante a una altura entre 0,5 cm y 10 cm de la superficie de nitrógeno líquido, por un periodo de tiempo entre 2 min y 120 min.
1 1 . Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende los siguientes pasos adicionales:
e) descongelación del esperma criopreservado, a una temperatura entre 4 °C - 80 °C, por un periodo de tiempo entre 2 s y 60 min, y f) lavado del esperma descongelado con un volumen entre 0,5 mL y 10 mL de una solución de lavado, por un periodo de tiempo de hasta 60 min y a una temperatura de 4 °C a 25 °C.
12. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el paso f) se realiza al menos 1 vez.
13. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 1 1 o 12, caracterizado porque la solución de lavado del paso f) es agua de mar filtrada o agua de mar artificial.
14. Método para la criopreservación de esperma de cefalópodos según la reivindicación 1 1 o 12, caracterizado porque la solución de lavado del paso f) es solución crioprotectora diluida en solución base a una concentración menor que la empleada en el paso b).
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