WO2012113963A1 - Uso de inhibidores de p53 para reducir la ingesta y para reducir el peso corporal - Google Patents

Uso de inhibidores de p53 para reducir la ingesta y para reducir el peso corporal Download PDF

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WO2012113963A1
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Rubén NOGUEIRAS POZO
Carlos DIÉGUEZ GONZÁLEZ
María Jesús VÁZQUEZ VILLAR
Douglas Alfredo VELÁSQUEZ RAIMUNDO
Gloria MARTÍNEZ RÍO
Amparo ROMERO PICÓ
Katia DA BOIT MARTINELLO
Miguel LÓPEZ PÉREZ
Anxo VIDAL FIGUEROA
Daniel BEIROA TARRÍO
Mónica IMBERNÓN PIEDRA
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Universidade de Santiago de Compostela
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Universidade de Santiago de Compostela
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    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents

Definitions

  • the present invention is framed in the field of Molecular Biology, Cell Biology, Biotechnology and Biomedicine.
  • the present invention relates to the use of p53 inhibitors at the hypothalamic level to reduce food intake and to reduce body weight in the treatment of obesity or metabolic disorders associated with obesity.
  • Eating disorders are characterized by serious abnormalities in the behavior of intake, and in many of them the basis of such behavior is in a psychological disorder.
  • Some examples of disorders of this type are bulimia nervosa, atypical depression, abuse of psychoactive drugs, or psychosocial dwarfism.
  • the treatment in this type of disorders requires a multidimensional approach, including both psychological therapy and patient renutrition, being essential for the latter to regulate or control food intake.
  • the most common pharmacological therapies in this type of alterations include, among others, antidepressants, opioid antagonists, and other compounds conducive to avoiding impulsive behaviors, with only partial results.
  • the metabolic disorders that cause obesity are mainly characterized by alterations produced in the mechanisms regulating appetite and energy expenditure.
  • a reduction of at least 5% of the initial body weight is sufficient to obtain clinically significant improvements in the metabolic disorders associated with obesity.
  • This weight loss in obese patients is associated with: reductions in total cholesterol concentrations, low density lipoproteins (LDL) and triglycerides, and increases in concentrations of high density lipoproteins (HDL) in patients with hyperlipemia; increases in insulin sensitivity and decreases in plasma glucose and insulin concentrations in patients with type 2 diabetes mellitus; significant reductions in blood pressure in patients with hypertension; increased longevity, self-esteem and positive emotions.
  • LDL low density lipoproteins
  • HDL high density lipoproteins
  • Ghrelin is the only hormone synthesized in our body, mainly in the stomach, which increases intake. For this, ghrelin triggers a series of molecular processes in the hypothalamus that finally they produce the increase of the levels of certain orexigenic neuropeptides. To trigger these molecular pathways, ghrelin needs to activate the AMP-activated protein kinase (AMPK) in the hypothalamus.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • p53 tumor protein p53
  • p53 tumor protein p53
  • the deletion or mutation of p53 is strongly associated with an increased susceptibility to cancer.
  • p53 in adipose tissue is also crucial, participating in the development of insulin resistance (Minamino, T. et al., Nature Medicine, 2009, 15: 1082-1087). Inhibition of p53 activity in adipose tissue decreases proinflammatory cytokine expression and markedly improves insulin resistance in mice fed a high-fat diet (Minamino, T. et al., Nature Medicine, 2009, 15: 1082-1087). On the contrary, the Activation of p53 in adipose tissue causes insulin resistance (Minamino, T. et al., Nature Medicine, 2009, 15: 1082-1087).
  • Hepatic steatosis is a metabolic disorder strongly associated with obesity.
  • p53 is involved in the molecular mechanisms of hepatocellular injury associated with steatosis.
  • the expression of p53 is high in the liver of obese mouse models that have a fatty liver (Yahagi, N. et al., The Journal of Biological! Chemistry, 2004, 279: 20571-20755).
  • p53 deficiency in obese leptin-deficient mice ob / ob causes a marked improvement in plasma alanine aminotransferase levels, demonstrating that p53 is involved in hepatocellular injury mechanisms (Yahagi, N. et al. ., The Journal of Biological!
  • Sirtuin 1 is a NAD + dependent deacetylase that exerts its different biological actions through numerous transcription factors and microRNAs, such as FOXO1, FOXO3, Histons, Ku70, p300, HSF1, PPARY, PGC1 a, PPARa, LXRs, SREBP-1 c, UCP-2, PTP1 B, MyoD, TIP60, NF-kappa and p53 (Cakir I.
  • SIRT1 acts on tumor suppressors such as p53, producing its deacetylation and therefore its inactivation, with the final effect of restoring the normal progression of the cell cycle (Kim EJ et al, Molecular Cell, 2007, 28 (2): 277-290).
  • the interaction between SIRT1 and p53 is complex and specific to each tissue (Nemoto S. et al., Science, 2004, 306: 2105-2108).
  • SIRT1 represses p53 (Kim EJ et al, Molecular Cell, 2007, 28 (2): 277-290), in peripheral tissues (liver and musculoskeletal tissue) and under normal food conditions, it is p53 who represses SIRT1, while under fasting conditions in these tissues p53 participates in the stimulation of SIRT1 transcription (Nemoto S. et al., Science, 2004, 306: 2105-2108).
  • the complexity in the interrelationships between both proteins has been revealed by study other biological functions, having shown that some of the p53-dependent functions, such as apoptosis and developmental-related mechanisms, are independent of regulation by SIRT1 (Kamel C. et al., Aging cell, 2006, 5 (1) : 81-88).
  • SIRT1 acts on ingestion at the hypothalamic level, increasing the response to ghrelin under conditions of food restriction (Satoh A. et al., The Journal of Neuroscience, 2010, 30 (30): 10220-10232) . It has also been shown that the pharmacological and genetic inhibition of SIRT1 at the hypothalamic level is capable of reducing intake in rats, contributing to weight loss (Cakir I. et al., PLoS ONE, 2009, 4 (12): e8322) . In addition, patent application WO2010042868 describes a method for treating obesity by administering pharmacological inhibitors of SIRT1, between the latter sirtinol and Ex 527.
  • SIRT1 pharmacological inhibitors and inducers of SIRT1 are not as specific as genetic ones;
  • pharmacological inducers of SIRT1 such as resveratrol
  • AMPK AMPK
  • SIRT1 the biggest problem that SIRT1 can address as an anti-obesity target is that since it is a deacetylase that acts on multiple molecules that exert very diverse biological actions, it is very likely that hypothalamic inhibition of SIRT1 causes other physiological effects that we still do not know and, it is more than predictable that some of these effects would be undesirable.
  • the present invention relates to the new use of p53 inhibitors at the hypothalamic level to reduce food intake (anorexigenic agents), and which may also be useful for reducing body weight, for example in the treatment of those disorders where it is important to achieve a significant weight reduction, such as obesity or other metabolic disorders associated with obesity.
  • the authors of the present invention have shown that the genetic inhibition of p53 with an interfering RNA for it at the hypothalamic level: a) decreases food intake in mice, and b) prevents the normal response to ghrelin (hormone that induces appetite under normal conditions), so that in these animals there is no increase in food intake when they are stimulated with the administration of this hormone.
  • the authors of the present invention have shown that genetic inhibition of p53 at the hypothalamic level is effective as anorexigenic therapy and is therefore effective in the treatment of disorders where it is necessary to regulate or control food intake, that is, in alterations in eating behavior that can lead to impulsive intake behaviors, such as bulimia nervosa, atypical depression, psychoactive drug abuse, or psychosocial dwarfism, given that animals to which an interference RNA for this gene is administered to Hypothalamic level have been shown to reduce your intake.
  • RNA interference for p53 is specific, since the inactive or control sequence (which is called sense, and does not interfere with the expression of the p53 gene) does not blocked the orexigenic effect (intake inducer) of ghrelin.
  • the inhibition of p53 at the hypothalamic level may also be effective in disorders where the reduction of body weight is necessary to obtain a clinical improvement, such as obesity, and the associated metabolic disorders, since the reduction in food intake can help reduce weight body more effectively and with fewer side effects than drugs that induce changes in fat metabolism, for example.
  • the present invention aims to provide a solution to the treatment of hyperphagia that accompanies various alterations in eating behavior, as well as disorders in which it is important to obtain a reduction in body weight and that in many cases involves an obese stage, thus contributing to the field of technology a very useful tool in solving two problems still unsolved.
  • hypothalamic p53 genetic inhibitors in this type of patients implies an improvement in their quality of life, given that since they are genetic inhibitors, they act with greater specificity than the pharmacological inhibitors described for other targets in This type of disorders, which in general entails greater effectiveness, lower necessary doses, lower toxicity and therefore lower side effects for the patient, an aspect that has not been satisfactorily achieved to date.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition (hereinafter the pharmaceutical composition of the invention) comprising:
  • nucleic acid of the invention a nucleic acid of sequence complementary to any of the sequences SEQ ID NO: 1 to 7 , Y
  • the inhibitor comprises a nucleic acid of sequence complementary to SEQ ID NO: 1.
  • transcripts or transcipt variants of mRNA (messenger RNA) of the human p53 gene are known, for example those of SEQ ID NO: 1 to 7.
  • sequence of transcript number 1 (transcipt variant 1) of mRNA of the gene Human p53 corresponds to SEQ ID NO: 1 and forms the basis for the development of nucleic acids that inhibit the expression of the p53 gene in the present invention.
  • the term "specific inhibitor of the expression of the gene encoding the p53 protein” refers to a molecule that prevents or decreases the expression of the gene encoding the human p53 protein or "tumor protein p53” (the amino acid sequence of said protein being SEQ ID NO: 9), that is, that prevents or decreases the translation or maturation of messenger RNA, with the final effect of reducing the amount, effect and / or activity of the protein corresponding p53.
  • an inhibitory agent may be constituted by a nucleic acid, an oligonucleotide (a nucleic acid of less than 50 nucleotides), or any other type of molecule that decreases or eliminates the amount, effect and / or activity of the p53 protein.
  • the inhibitor comprises a nucleic acid whose sequence is complementary to a region or "target sequence" within the sequences SEQ ID NO: 1 to 7, which are the sequences of the different messenger RNA versions of the human p53 gene , which allows the nucleic acid to recognize the messenger RNA, hybridizing with it, and interfering with the expression of the corresponding p53 protein.
  • hybrid refers to the binding of simple DNA strands with complementary sequences.
  • complementarity is a property of double stranded nucleic acids.
  • complementary refers to the existence of a complementary relationship of nitrogenous bases, using the pairing of Watson and Crick bases, between nucleic acids, for example between the nucleic acid of the invention and the complementary sequence or target sequence in p53 messenger RNA, which is sufficient to yield specific binding between the two within a cell.
  • Watson and Crick base pairing is understood as the union between adenine and thymine by two hydrogen bonds, and the union between guanine and cytosine by three hydrogen bonds. Since there is no thymine in the RNA, complementarity is established between adenine and uracil by two hydrogen bonds.
  • nucleic acid of the invention is preferable, but not absolutely necessary, especially when nucleic acids of more than 20 nucleotides are used. In the case of nucleic acids between 15 and 30 nucleotides long, a complementarity of at least 10 of their nucleotides with the target sequence may be sufficient for recognition and hybridization with said sequence.
  • SEQ ID NO: 1 The identity of SEQ ID NO: 1, or transcript number 1 (transcipt variant 1) of mRNA of the human p53 gene, with the sequences of the remaining 6 mRNA transcripts that have been described for the human p53 gene, as well as one of mRNA transcripts for the mouse p53 gene (Mus musculus), are shown in Table 1: Number of
  • transcript number 1 (transcipt variant 1) of mRNA of human p53 gene with the remaining 6 mRNA transcripts of human p53 gene, and with mRNA transcript 2 of mouse p53 gene (Mus musculus).
  • sequence identification number is also indicated in the sequence list of the invention, and the access number in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) for the equivalent DNA sequence (i.e., the sequence of the NCBI is the mRNA sequence where uracils (U) are substituted by thymine (T)).
  • % sequence identity refers to the percentage of nucleotides of a candidate sequence that is identical to the nucleotides of SEQ ID NO: 1, after aligning the sequences to achieve the maximum percentage of sequence identity.
  • The% sequence identity can be determined by any of the procedures or algorithms established in the art, such as ALIGN or BLAST. In this document,% sequence identity is calculated by dividing the number of nucleotides that are identical after aligning SEQ ID NO: 1 and the candidate sequence, by the total number of nucleotides of SEQ ID NO: 1 and multiplying the 100 result.
  • the inhibitor is accompanied by at least one element (hereinafter "element accompanying the inhibitor of the invention") selected from the list comprising:
  • agouti-related peptide AgRP or agouti-related peptide
  • POMC pro-opiomelanocortin
  • CART cocaine / amphetamine-regulated transcript
  • GLP-1 or glucagon GLP-1 or glucagon
  • NPY neuropeptide Y
  • GLS-R1A ghrelin receptor
  • growth hormone secretagogue receptor type 1 isoform 1a AgRP or agouti-related peptide
  • POMC pro-opiomelanocortin
  • CART cocaine / amphetamine-regulated transcript
  • GLP-1 or glucagon glucagon-like peptide
  • NPY neuropeptide Y
  • GLS-R1A ghrelin receptor type 1 isoform 1a
  • the amino acid sequence of the agouti-related peptide (AgRP or agouti-related peptide) is SEQ ID NO: 16.
  • the amino acid sequence of pro-opiomelanocortin (POMC) is SEQ ID NO: 17.
  • the amino acid sequence of Cocaine / amphetamine-regulated transcript (CART) is SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid sequence of the glucagon-like peptide (GLP-1 or glucagon like peptide) is SEQ ID NO: 19.
  • the amino acid sequence of the neuropeptide And (NPY) is SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the ghrelin receptor (GHS-R1A) is SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequence of ghrelin is SEQ ID NO: 22.
  • the function of the element that accompanies the inhibitor of the invention is to direct the inhibitor to hypothalamic nuclei specifically, so that the inhibitor only acts on the expression of the p53 gene when it reaches said nuclei.
  • the hypothalamus is an endocrine gland that is part of the diencephalon, and is located below the thalamus.
  • the hypothalamus is constituted by different neuronal nuclei that among other functions regulate hunger, appetite and satiety through hormones and peptides.
  • Agouti-related peptide AgPR
  • pro-opiomelanocortin POMC
  • cocaine / amphetamine-regulated transcript CART
  • glucagon-like peptide 1 GLP-1 or glucagon like peptide
  • NPY neuropeptide Y
  • the arcuate nucleus of the hypothalamus is a nucleus of neurons that It is located in the midbasal part of the hypothalamus, where the ghrelin receptors are, such as the ghrelin receptor GHS-R1A.
  • the purpose of binding antibodies against any of the neuropeptides, or antibodies against the ghrelin receptor, or ghrelin, to the inhibitor of the invention is to make the inhibitor specifically target the hypothalamus, preferably the arcuate nucleus of the hypothalamus, acting on p53 gene expression only in this region of the hypothalamus, and not in other brain areas, avoiding undesirable side effects. In this way, it is possible to inhibit the expression of the p53 gene only in the hypothalamic pathway where p53 participates in the regulation of intake, achieving a specific inhibitory effect.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises an inhibitor of the expression of the gene encoding the p53 protein and either ghrelin, or antibodies that are directed against proteins or neuropeptides located only in hypothalamic nuclei, such that said inhibitor crosses the blood-brain barrier and reaches its hypothalamic targets, acting only on them. Therefore, in a preferred embodiment of the invention, the inhibitor is bound to antibodies against proteins or neuropeptides located only in hypothalamic nuclei.
  • One way to bind the antibodies to the inhibitor would be through the inclusion of the inhibitor in vehicles such as a nanoparticle, a liposome, a vector or a micelle, for example, to which the antibodies can be attached on their surface to target said vehicles to hypothalamic targets.
  • the inhibitor is linked to ghrelin, or to a ghrelin receptor agonist, such as BIM-28125 or BIM-28131 (described in Strassburg et al., American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2008, 295: 78-84).
  • a ghrelin receptor agonist such as BIM-28125 or BIM-28131 (described in Strassburg et al., American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2008, 295: 78-84).
  • BIM-28125 or BIM-28131 described in Strassburg et al., American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2008, 295: 78-84.
  • One way to bind ghrelin or a ghrelin receptor agonist to the inhibitor of the invention is through chemical synthesis. Once the hypothalamic target is reached, the nucleic acid comprised in the hybrid inhibitor with its complementary sequence in
  • the nucleic acid is an interfering RNA.
  • Interference RNA is understood as a single or double stranded RNA molecule that interferes with a specific messenger RNA thus leading to its degradation and / or decrease of its protein translation.
  • the interference RNA sequence (of the single strand, if single stranded, or one of them, if double stranded) is complementary to a region of the nucleotide sequence of its specific messenger RNA or "target sequence” , but not in the 5'-3 '(sense) sense, but in the 3'-5' (antisense) sense, exerting a post-transcriptional silencing mechanism, interfering with the expression or translation of said messenger RNA and therefore preventing production of a peptide or protein, causing its deficiency.
  • antisense chain is understood as the chain of the interfering RNA molecule that is complementary in the 3'-5 'sense to the sequence of the messenger RNA in whose expression it interferes. That is, to the single chain of the interfering RNA molecule if it is a single chain, and to one of the chains if it is a double chain.
  • a single stranded RNA molecule is understood as an RNA molecule formed by a single nucleotide chain. It is understood by molecule of Double stranded RNA to an RNA molecule formed by two nucleotide chains linked together by complementarity of bases.
  • RNA interference was initially coined by Fire et al. (Fire et al., Nature, 1998, 19; 391 (6669): 806-1 1), to describe the observation that double stranded RNA molecules were capable of block the expression of different genes more effectively than each individual chain separately, when any of them was introduced into the Caenorhabditis elegans worm. At present, it is known that these RNAs are capable of directing post-transcriptional and specific silencing of different genes and in different organisms, including vertebrates.
  • interference RNAs act involves the activation of an ancestral machinery that mediates the specific degradation or suppression of the messenger RNA (s) that contains the sequence complementary to the interference RNA introduced or produced, mainly producing a degradation of cytoplasmic messenger RNA and a decrease in message translation, although some of the biochemical mechanisms underlying this degradation are unknown.
  • messenger RNA s
  • interference RNA includes small interfering RNAs (siRNA or small interfering RNA), antisense RNAs, micro RNAs and hairpin RNAs (small hairpin RNA or shRNA). Therefore, in the present description, the interference RNA molecule can be both single chain and double chain, and includes both isolated natural or recombinant molecules, and chemically synthesized molecules.
  • a natural interference RNA molecule is the native interference RNA that is found naturally within the cells themselves.
  • interfering RNA molecules may contain alterations with respect to the native interference RNA sequence, by the addition, deletion, substitution and / or alteration of one or more nucleotides, phosphodiester backbone modifications, sugar modifications, modifications of the phosphate group, and any combination of themselves, in order to increase their stability in vivo, for example to resist the action of nucleases.
  • Some modifications of the phosphodiester skeleton that increase the stability of the oligonucleotides include those that give rise to phosphorothioate (PS) oligonucleotides or methyl phosphonate (MP) oligonucleotides, in which one of the oxygen atoms that do not form bonds, are substituted by a group sulfide or methyl, respectively.
  • PS phosphorothioate
  • MP methyl phosphonate
  • the interference RNA is single stranded.
  • the interference RNA is a single stranded RNA molecule whose sequence is complementary to a region of the nucleotide sequence of a specific messenger RNA in whose expression it interferes.
  • RNA molecules capable of inhibiting the translation of said messenger RNA to protein.
  • a specific region within the sequence of a specific messenger RNA can be randomly selected and a single stranded RNA molecule designed whose sequence is complementary to that but in a 3'-5 '(antisense) sense.
  • algorithms and computer procedures in the state of the art that allow a more rational selection of the regions of the messenger RNA sequence that will be more optimal for the design of the interfering RNA molecules, and that take into account various parameters such as the sequence and internal stability of the resulting interfering RNA molecule.
  • the nucleotide sequence of the interference RNA has at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, or SEQ ID NO: 12.
  • the nucleotide sequence of the interference RNA is any of the sequences SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 12.
  • Sequences SEQ ID NO: 10, 1 1 and 12 correspond to single-stranded RNA interference molecules specific for regions of the p53 messenger RNA sequence (SEQ ID NO: 1) between nucleotides 544-563, 902 -920 and 958-977 respectively. Sequences SEQ ID NO: 10, 1 1 and 12 correspond to the complementary antisense sequence of the nucleotide sequence of messenger RNA 1 of p53 between positions 544-563, 902-920 and 958-977 respectively, further comprising a TT dinucleotide additional at the 3 'end.
  • the interference RNA sequence is between 12 and 30 nucleotides in length. More preferably, it is between 18 and 22 nucleotides. Even more preferably, it is 21 nucleotides.
  • the sequence of the RNAi further comprises a TT dinucleotide at the 3 'end.
  • the dinucleotide TT at the 3 'end refers to the existence of two consecutive thymines at the 3' end of the sequence of the antisense chain of the interfering RNA molecule.
  • the binding of 2 or 3 nucleotides, preferably deoxyribonucleotides, at the 3 'end of the antisense chain, is a common practice in the design of interfering RNA molecules, since the presence of said nucleotides increases the specificity in the recognition of the target sequence in the messenger RNA in whose expression it interferes.
  • the invention relates to the use of a specific inhibitor of the expression of the gene encoding the p53 protein, wherein said inhibitor it comprises a nucleic acid of sequence complementary to any of the sequences SEQ ID NO 1 to 7, for the preparation of a medicament for reducing food intake.
  • the reduction of food intake occurs due to the alterations that the pharmaceutical composition causes in some of the mechanisms regulating the intake in the hypothalamus.
  • the inhibitor comprises a nucleic acid sequence complementary to the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid is an interfering RNA.
  • the interference RNA is single stranded.
  • the interference RNA sequence has at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, or SEQ ID NO: 12. Even more preferably, the interference RNA sequence is any of the sequences SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 12.
  • the interference RNA sequence is between 12 and 30 nucleotides in length. More preferably, it is between 18 and 22 nucleotides. Even more preferably, it is 21 nucleotides. In a preferred embodiment, the interference RNA sequence further comprises a TT dinucleotide at the 3 'end.
  • the invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for reducing body weight in a subject. Preferably, the subject suffers from obesity, or a metabolic disorder associated with obesity.
  • the term "reduce body weight” refers to any strategy that seeks to prevent weight gain, reduce possible weight gain or reduce body weight. Said body weight reduction can be carried out, for example, on an overweight subject. Overweight can be determined based on Body Mass Indexes (BMI, Body Mass Index or BMI) that are routinely used to estimate whether a patient has a normal weight, overweight or obesity, according to different parameters such as height .
  • BMI Body Mass Indexes
  • the term "obesity” refers to an increase in the amount of fat that determines an increase in body weight to a point where it is associated with certain conditions harmful to health. It is accepted that a weight reduction of at least 5% of the initial body weight is sufficient to obtain clinically significant improvements in disorders associated with obesity, such as insulin resistance, type 2 diabetes, osteoarthritis, apnea sleep, certain types of cancers, high blood pressure and the existence of high circulating levels of lipids.
  • This weight loss in obese patients is associated with: reductions in total cholesterol concentrations, low density lipoproteins (LDL) and triglycerides and increases in concentrations of high density lipoproteins (HDL) in patients with hyperlipemia; increases in insulin sensitivity and decreases in plasma glucose and insulin concentrations in patients with type 2 diabetes mellitus; significant reductions in blood pressure in patients with hypertension; increased longevity, self-esteem and positive emotions.
  • LDL low density lipoproteins
  • HDL high density lipoproteins
  • the medicament further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the vehicle must be pharmacologically acceptable.
  • a "pharmaceutically acceptable vehicle” It includes those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical and biotechnology sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but is not limited to, solids, liquids, solvents, surfactants, nanoparticles, vectors, lipid particles. nucleic acid, liposomes, micelles, virosomes and any combination thereof.
  • the vehicle can be an inert substance or action analogous to any of the inhibitors of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation and transport of the inhibitor, as well as other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the vehicle When the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • the vehicle may be a vector, which may be appropriate for gene therapy.
  • a vector is a nucleic acid molecule used to transfer genetic material to a cell. Apart from said genetic material, a vector may also contain different functional elements that include transcription control elements, such as promoters or operators, regions or enhancers of binding to transcription factors, and control elements to initiate and terminate translation.
  • Vectors include, but are not limited to: plasmids, cosmids, viruses, phages, recombinant expression cassettes and transposons.
  • the vehicle can be a nanoparticle of gold, silver or any other chemical element suitable for the preparation thereof.
  • nanoparticles as vehicles for the transport of the inhibitor may allow the gradual release of the inhibitor in its target region.
  • suitable nanoparticles for the transport of interference RNA are described in Lee et al., Small, 201 1, 7 (3): 364-370.
  • said vehicle can be coated by antibodies directed against proteins or neuropeptides located only in hypothalamic nuclei, such as the arcuate nucleus, so that the nucleic acid would cross the blood brain barrier and reach its hypothalamic targets specifically.
  • gene therapy refers to the transfer of a genetic material of interest (DNA or RNA) to a host to treat or prevent a genetic or acquired disease or condition.
  • the genetic material of interest encodes a product (a polypeptide or protein, a peptide or a functional RNA) whose in vivo production is desired.
  • the genetic material of interest may consist of an interference RNA of therapeutic value.
  • the medicament is presented in a form adapted to oral administration.
  • the medicament is presented in a form adapted to parenteral administration.
  • the medicament is presented in a form adapted to intravenous administration.
  • Oral administration is one that is done by mouth.
  • Parenteral administration is one that is done through an injection or infusion. Some examples of parenteral administration are subcutaneous, intravenous, intraarticular or intramuscular injection.
  • the pharmaceutical composition of the invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • the term "effective amount" refers to an amount of a substance sufficient to achieve the intended purpose.
  • a therapeutically effective amount of a p53 protein coding gene expression inhibitor is an amount sufficient to reduce the expression of said gene or the translation of its corresponding messenger RNA, which can be extrapolated from the data obtained. in animal trials.
  • a "therapeutically effective amount" of an inhibitor to treat a disease or disorder is an amount of the inhibitor sufficient to reduce or eliminate the symptoms of the disease or disorder.
  • the effective amount of a given substance will vary with factors such as the nature of the substance, the route of administration, the size and species of the animal that will receive the substance and the purpose for which the substance is given. The effective amount in each individual case can be determined empirically the expert in the field according to the procedures established in the art.
  • the medicament further comprises a pharmacologically acceptable excipient.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the inhibitor, stabilizes it or helps the preparation of the drug in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable refers to the fact that the compound referred to is allowed and evaluated so that it is safe, non-toxic and does not cause adverse effects to the organisms to which it is administered.
  • the medicament further comprises another active substance.
  • the medicament is administered as a combination therapy.
  • a combination therapy refers to the medication being given along with another medication.
  • Figure 1 Effect of acute intracerebroventricular Ghrelin administration (5 g) (icv) on cumulative intake (g) at 2 (A) and 6 (B) hours, in p53 wild type (WT) and knockout (KO) mice males Eight individuals per group, being: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001.
  • FIG. 1 Effect of acute treatment with intracerebroventricular Ghrelin (5 g), at 6 hours, on the levels of proteins involved in lipid metabolism in hypothalamus of male p53 wild type (WT) and knockout (KO) mice .
  • Protein analysis was performed through Western Blotting, with 8 individuals per group, being: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001.
  • the hypothalamic protein levels of pAMPKa, ⁇ , ⁇ 2, pACC, ACCa and FAS are indicated after 6 hours after administration of ghrelin.
  • A resulting gel after Western Blotting analysis.
  • VH mice treated with physiological serum (control);
  • GHR mice treated with ghrelin.
  • VH physiological serum
  • GHR ghrelin
  • sip53 RNA interference for p53, corresponding to SEQ ID NO: 1 1 (10 g)
  • NS inactive RNA sequence (sense).
  • Figure 4. Location of the specific administration of the interfering RNA and the inactive sequences of p53 in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus.
  • p53 interference RNA in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus on cumulative intake (g) at 12, 24, 36 and 48 hours in normal mice.
  • p53 RNA interference for p53, corresponding to SEQ ID NO: 1 1
  • NS inactive RNA sequence (sense), corresponding to SEQ ID NO: 14.
  • Figure 6 Effect of specific administration of p53 interference RNA in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus on body mass in normal mice.
  • p53 RNA interference for p53, corresponding to SEQ ID NO: 1 1;
  • NS inactive RNA sequence (sense), corresponding to SEQ ID NO: 14.
  • the arrows correspond to the two administrations performed, at the beginning of the experiment (time 0, left arrow) and after 24 hours (right arrow).
  • hypothalamic p53 inhibitors as anorexigenic agents or appetite suppressants.
  • EXAMPLE 1 Effects of ghrelin on intake in p53 wild type (WT) and knockout (KO) mice
  • p53 knockout (KO) and wild type (WT) mice were used, which were housed in rooms with stable temperature conditions (22-24 ° C) under a cycle of 12:12 light / dark hours and fed a standard diet.
  • Homozygous WT and KO mice originated from mating between heterozygous mice. The animals were treated and slaughtered at 10-12 weeks of age, before any sign of morbidity due to the development of tumors. Animal experiments were performed in accordance with the standards approved by the Animal Committee of the University of Santiago de Compostela.
  • the p53 knockout mice used are those described in Jacks T. et al., Current Biology, 1994, 4: 1-7. Anesthetic solution
  • This operation should be performed approximately 4 days before the experiment.
  • the objective of the implantation of these cannulas is to access the lateral ventricle.
  • Polyethylene cannulas (PE-20, PE-50, Clay Adams, Becton-Dickinson, New Jersey USA) of fine gauge (1.09 mm external diameter and 0.38 mm internal diameter) were used; at one end of the cannula, a stop is placed and it is cut into a bevel about de mm away, this part being the one that enters the brain and allows access to the lateral ventricle. The opposite end of the cannula was sealed until the day of the experiment. Once the animals were anesthetized, a cut was made in the skin of the head at the forehead and to the back of the eyes, exposing the subcutaneous tissue, which must be removed with the help of a scalpel until leaving in sight the skull.
  • the bregma was located, which separates the frontal bones from the occipitals and was used as a reference point to make a hole (1.2 mm mediolateral and 1 mm posterior) through which the cannula is inserted. Subsequently, cyanoacrylate was added so that the cannula was perfectly fixed and the entire open area was sealed. To verify that the cannula has remained in the correct position, 2% protamine was injected, dissolved in water with sodium acetate, which clearly stains the lateral ventricle, demonstrating that the cannula has been correctly placed.
  • Ghrelin was administered intracerebroventricular way through a polyethylene cannula. The animals were given a heavy amount of food and the intake was measured 2 and 6 hours after the administration of ghrelin.
  • Lysis buffer was added in proportion to the tissue, which in this case is 500 ⁇ of lysis buffer for rat hypothalamus and 160 ⁇ for mouse hypothalamus.
  • protease inhibitor "Complete, protease inhibitor cocktail tablets” (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) was used, using one tablet per 50 ⁇ of lysis buffer.
  • hypothalamus were homogenized in the homogenizer "Tissue lyser II" (Qiagen, Retsch, Germany), and the protein concentration was determined using the Bradfor colorimetric method (Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Germany) on the Sunrise spectrophotometer ( Tecan, Austria).
  • the loading buffer was added to the samples and stored at -80 ° C until used.
  • the loading buffer (buffer Sample” 5 x or loading buffer) was prepared with the following elements:
  • Proteins were separated by weight through the use of 6% Tris / glycine SDS-PAGE gels and 10% polyacrylamide. These gels consist of two phases, “Stacking Gei” and “Running gel” (prepared according to Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis, 2nd edition), and 40 .mu.g of protein were loaded onto 16 ⁇ in the case of the hypothalamus.
  • Electrophoresis was performed at 130 V for 50 minutes in case of 6% polyacrylamide gels or at 100 V for 100 minutes in case of 10% polyacrylamide gels.
  • Electrophoresis buffer 72 g of Glycine, 15 g of Tris-base, 5 g of SDS (sodium dodecyl sulfate).
  • Transfer buffer 25 X: 36.5 g Glycine 72.5 g Tris-base, 4.5 g of SDS.
  • PVDF membranes previously activated in methanol 5 minutes, in water 2 minutes in transfer buffer 2 minutes.
  • the membranes were blocked with BSA (Bovine albumin, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) and with skim milk (Nonfat-dried Milk Bovine, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) for one hour at room temperature, according to specifications of each antibody.
  • BSA Bovine albumin, Sigma Aldrich, St. Louis, USA
  • skim milk Nonfat-dried Milk Bovine, Sigma Aldrich, St. Louis, USA
  • TBS-TWEEN 100 ml-10 x TBS, 1 ml-TWEEN 20, 900 ml distilled water
  • the membranes were incubated with the primary antibody at appropriate dilutions, for one hour at room temperature or during overnight at 4 o C.
  • Table 2 Primary antibodies used in Western Blotting.
  • the secondary antibody When the secondary antibody is incubated with the substrate and the ECL, it emits a light reaction that allows the visualization, by autoradiog raffia, of the interaction of antibodies with the sample protein.
  • the membranes were placed in an autoradiography cassette with photographic films (Amershan, hyperfilm M RPN 6 K) and the films were revealed at different exposure times according to the signal, in the dark chamber.
  • RNAi interfering RNA sequence
  • p53 inactive RNA sequences of p53 (sense) tested were the following:
  • Table 3 sequences of interference RNAs and inactive RNAs (sense) designed for p53.
  • the position in the p53 sequence corresponds to the nucleotide number in the mRNA sequence (transcript variant 1) of p53.
  • the mouse p53 sequence corresponds to the access number in the NCBI (National Center for Biotechnology Information): NM_001 127233 (SEQ ID NO: 8).
  • the human p53 sequence corresponds to that of the accession number in the NCBI: NM_000546 (SEQ ID NO: 1).
  • RNA molecules interference as well as inactive RNA were designed by nLife Therapeutics S.L.
  • RNAi interference RNAs
  • EXAMPLE 4 Effects of specific administration of p53 interference RNA in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus on intake and body mass in normal mice
  • RNAi The sequence for the interference RNA for p53 (RNAi) was that corresponding to SEQ ID NO: 1 1, while the inactive RNA sequence of p53 (sense) was that corresponding to SEQ ID NO: 14 (Table 3).
  • RNAi interference RNA
  • mice that were administered the sense sequence (NS in Figure 5) in the ARC ate more than the mice treated with the RNAi.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de p53 a nivel hipotalámico para reducir la ingesta de alimentos y para la reducción del peso corporal en el tratamiento de la obesidad o de trastornos metabólicos asociados a la obesidad.

Description

Uso de inhibidores de p53 para reducir la ingesta v para reducir el peso corporal
La presente invención se enmarca en el campo de la Biología Molecular, la Biología Celular, la Biotecnología y la Biomedicina. La presente invención se refiere al uso de inhibidores de p53 a nivel hipotalámico para reducir la ingesta de alimentos y para la reducción del peso corporal en el tratamiento de la obesidad o de trastornos metabólicos asociados a la obesidad. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los trastornos de la conducta alimentaria se caracterizan por anomalías graves en el comportamiento de la ingesta, y en muchos de ellos la base de dicho comportamiento se encuentra en una alteración psicológica. Algunos ejemplos de trastornos de este tipo son la bulimia nerviosa, la depresión atípica, el abuso de drogas psicoactivas, o el enanismo psicosocial. En general, el tratamiento en este tipo de trastornos requiere un enfoque multidimensional, incluyendo tanto terapia psicológica como la renutrición del paciente, siendo imprescindible para este último aspecto regular o controlar la ingesta de alimentos. Así, las terapias farmacológicas más comunes en este tipo de alteraciones incluyen, entre otros, antidepresivos, antagonistas opioides, y otros compuestos conducentes a evitar conductas impulsivas, con resultados sólo parciales. Por otra parte, los desórdenes metabólicos que provocan la obesidad se caracterizan principalmente por alteraciones producidas en los mecanismos reguladores del apetito y del gasto energético. Las alteraciones de este "balance energético" (energía ingerida versus energía gastada) darán lugar a variaciones en la masa corporal. La obesidad se caracteriza por un incremento de la cantidad de grasa que determina un exceso de peso hasta un punto donde está asociado con ciertas condiciones perjudiciales para la salud. Es el trastorno nutricional más importante a nivel mundial, con efectos seriamente adversos para la salud, habiéndose demostrado que la obesidad aumenta el riesgo a sufrir distintos trastornos tales como la resistencia a insulina, la diabetes tipo 2, la osteoartritis, la apnea del sueño, y ciertos tipos de cánceres, asociándose con un aumento en la morbilidad y mortalidad, de tal manera que la pérdida de peso permite disminuir significativamente estos riesgos. De hecho, es fundamental destacar que una pequeña pérdida de peso en los pacientes obesos se acompaña de mejorías significativas en los distintos factores de riesgo como la tensión arterial, la tolerancia a la glucosa y la concentración de lípidos séricos. De este modo, se acepta que una reducción de al menos un 5% del peso corporal inicial es suficiente para obtener mejorías clínicamente significativas de los trastornos metabólicos asociados a la obesidad. Esta pérdida de peso en los pacientes obesos se asocia a: reducciones de las concentraciones de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y triglicéridos, y aumentos de las concentraciones de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en pacientes con hiperlipemia; aumentos de la sensibilidad a la insulina y disminuciones de las concentraciones de glucosa e insulina en plasma en los pacientes con diabetes mellitus tipo 2; reducciones significativas de la presión arterial en los pacientes con hipertensión; aumento de la longevidad, de la autoestima y de las emociones positivas.
Aunque sabemos que la obesidad es una enfermedad crónica y multifactorial, y que el enfoque del tratamiento debe en cierto modo comprender terapia dietaria y actividad física, la utilidad de la farmacoterapia para reducir el peso no debe ser subestimada. En este sentido, varios fármacos han llegado a ser utilizados en pacientes obesos (sibutramina, orlistat, rimonabant) disminuyendo el peso de los mismos y mejorando algunos de los factores de riesgo asociados a la obesidad. Sin embargo, distintos estudios han ido señalando que los efectos adversos que producen los fármacos son superiores a los beneficios que aportan. Así, el principio activo sibutramina, comercializado en España con el nombre Reductil® (laboratorios Abbott), estaba indicado -junto a dieta y ejercicio- para promover pérdidas de peso en pacientes obesos. Sin embargo, la Agencia Europea del Medicamento (EMEA en sus siglas en inglés) recomendó su suspensión en 2010 por haberse asociado con un incremento del riesgo de enfermedad cardiovascular. Además, el principio activo orlistat, comercializado en España con el nombre Xenical® (laboratorios Roche), evita que parte de la grasa de los alimentos se absorba y digiera en el intestino. Sin embargo, existen bastantes contraindicaciones para su consumo, ya que debido a que las grasas no son digeridas, éstas pasan íntegras por el conducto digestivo haciendo muy difícil que el paciente pueda contener su flujo. Además, la Agencia Americana del Medicamento {FDA, por sus siglas en inglés) ha informado del registro de 13 casos de daño hepático grave producido por el uso de orlistat. Asimismo, el principio activo rimonabant, comercializado en España con el nombre Acomplia® (laboratorios Sanofi-Aventis), ha sido el último tratamiento contra la obesidad que se ha lanzado al mercado. A finales de 2008, la EMEA concluyó que los beneficios de Acomplia® ya no justificaban los riesgos añadidos, y que éstos implicaban doblar la incidencia de desórdenes psiquiátricos (ansiedad y depresión) en los pacientes obesos o con sobrepeso, comparándolo con los pacientes que recibieron placebo.
Además de los numerosos efectos secundarios, aunque algunos de estos métodos consiguen una reducción inicial de peso, el mantenimiento a largo plazo de dicha reducción continúa siendo un desafío. La mayoría de personas que consiguen reducir su peso inicialmente, acaban volviendo a recuperarlo más tarde. Además de estos 3 fármacos que han llegado al mercado, en los últimos años, y mediante el desarrollo de nuevas tecnologías, se está investigando el diseño de nuevos tratamientos biológicos basados en la inhibición de señales estimuladoras del apetito localizadas en el sistema nervioso central, cuya eficacia todavía no ha sido demostrada.
La ghrelina es la única hormona sintetizada en nuestro organismo, principalmente en el estómago, que incrementa la ingesta. Para ello, la ghrelina desencadena una serie de procesos moleculares en el hipotálamo que finalmente producen el incremento de los niveles de ciertos neuropéptidos orexigénicos. Para desencadenar estas vías moleculares, la ghrelina necesita activar la proteína kinasa activada por AMP (AMPK) en el hipotálamo. Sin embargo, los mecanismos moleculares iniciados por el receptor de ghrelina y que llevan a la activación de AMPK no se conocen. p53 (tumor protein p53) es una proteína estudiada principalmente como un supresor de tumores en humanos y otros mamíferos. La deleción o mutación de p53 está fuertemente asociada con un aumento de la susceptibilidad al cáncer. Sin embargo, publicaciones recientes están demostrando que p53 no sólo tiene un papel esencial en acciones oncogénicas, sino que también juega un rol importante en la longevidad y el envejecimiento, el metabolismo de la glucosa y el estrés (Jones, R. G. et al., Molecular Cell, 2005, 18 (3): 283-293; Matoba, S. et al., Science, 2006, 312 (5780): 1650-1653; Lee, C. H. et al., The EMBO Journal, 2007, 26 (23): 4812-4823; Zhao, Y. et al., The Journal of Biológica! Chemistry, 2008, 283 (52): 36344-36353; Mathupala, S. P., Heese, C, and Pedersen, P. L., The Journal of Biológica! Chemistry, 1997, 272 (36): 22776-22780). Recientemente se ha demostrado que la expresión de p53 se induce en los adipocitos de ratones deficientes en leptina, que son obesos y resistentes a insulina (Yahagi, N. et al., The Journal of Biológica! Chemistry, 2003, 278: 25395-25400). La sobreexpresión de p53 suprime la actividad del promotor del gen lipogénico SREBP-1 c. Por lo tanto, la activación de p53 disminuye la acumulación de grasa en los adipocitos (Yahagi, N. et al., The Journal of Biológica! Chemistry, 2003, 278: 25395-25400).
La expresión de p53 en el tejido adiposo es también crucial, participando en el desarrollo de resistencia a la insulina (Minamino, T. et al., Nature Medicine, 2009, 15: 1082-1087). La inhibición de la actividad de p53 en el tejido adiposo disminuye la expresión de citocinas proinflamatorias y mejora notablemente la resistencia a la insulina en ratones alimentados con una dieta alta en grasa (Minamino, T. et al., Nature Medicine, 2009, 15: 1082-1087). Por el contrario, la activación de p53 en el tejido adiposo provoca resistencia a la insulina (Minamino, T. et al., Nature Medicine, 2009, 15: 1082-1087).
La esteatosis hepática es un desorden metabólico fuertemente asociado a la obesidad. p53 está implicado en los mecanismos moleculares de la lesión hepatocelular asociados con esteatosis. La expresión de p53 es elevada en el hígado de modelos de ratón obesos que presentan un hígado graso (Yahagi, N. et al., The Journal of Biológica! Chemistry, 2004, 279:20571 - 20575). Por otra parte, la deficiencia de p53 en los ratones obesos deficientes en leptina (ob/ob) provoca una notable mejora de los niveles plasmáticos de alanina aminotransferasa, demostrando que p53 está involucrada en los mecanismos de lesión hepatocelular (Yahagi, N. et al., The Journal of Biológica! Chemistry, 2004, 279:20571 - 20575). La sirtuina 1 (SIRT1 o Sirtuinl) es una deacetilasa dependiente de NAD+ que ejerce sus distintas acciones biológicas a través de numerosos factores de transcripción y microARNs, tales como FOXO1 , FOXO3, Histones, Ku70, p300, HSF1 , PPARY, PGC1 a, PPARa, LXRs, SREBP-1 c, UCP-2, PTP1 B, MyoD, TIP60, NF-kappa y p53 (Cakir I. et al., PLoS ONE, 2009, 4(12): e8322; Sasaki et al, Endocrinology, 2010, 151 (6): 2556-2566; Haigis and Sinclair, Annual Review of Pathology 2010, 5: 253-295). Así, se sabe que en algunas ocasiones SIRT1 actúa sobre supresores de tumores tales como p53, produciendo su deacetilación y por tanto su inactivación, con el efecto final de restaurar la progresión normal del ciclo celular (Kim E.J. et al, Molecular Cell, 2007, 28 (2): 277-290). Sin embargo, la interacción entre SIRT1 y p53 es compleja y específica de cada tejido (Nemoto S. et al. , Science, 2004, 306: 2105-2108). Así, mientras que en procesos tumorales SIRT1 reprime a p53 (Kim E.J. et al, Molecular Cell, 2007, 28 (2): 277-290), en tejidos periféricos (tejido hepático y músculo-esquelético) y bajo condiciones alimentarias normales, es p53 quien reprime a SIRT1 , mientras que bajo condiciones de ayuno en estos tejidos p53 participa en la estimulación de la transcripción de SIRT1 (Nemoto S. et al., Science, 2004, 306: 2105-2108). La complejidad en las interrelaciones entre ambas proteínas se ha puesto de manifiesto al estudiar otras funciones biológicas, habiéndose demostrado que algunas de las funciones dependientes de p53, tales como la apoptosis y mecanismos relacionados con el desarrollo, son independientes de regulación por SIRT1 (Kamel C. et al., Aging cell, 2006, 5 (1 ): 81 -88).
Recientemente, se ha descrito que SIRT1 actúa sobre la ingesta a nivel hipotalámico, aumentando la respuesta a la ghrelina en condiciones de restricción alimentaria (Satoh A. et al., The Journal of Neuroscience, 2010, 30(30): 10220-10232). También se ha demostrado que la inhibición farmacológica y genética de SIRT1 a nivel hipotalámico es capaz de reducir la ingesta en ratas, contribuyendo a la pérdida de peso (Cakir I. et al., PLoS ONE, 2009, 4(12): e8322). Además, la solicitud de patente WO2010042868 describe un método para tratar la obesidad mediante la administración de inhibidores farmacológicos de SIRT1 , entre estos últimos sirtinol y Ex 527. Sin embargo, uno de los problemas de esta última aproximación es que los inhibidores e inductores farmacológicos de SIRT1 no son tan específicos como los genéticos; así, por ejemplo, se sospecha que inductores farmacológicos de SIRT1 como el resveratrol, no consiguen activar la ingesta debido, por un lado, a que ejerce efectos opuestos simultáneos sobre SIRT1 y sobre otras dianas tales como AMPK, lo cual contrarresta su efecto sobre SIRT1 , y por otro, a que su eficacia para alcanzar a los grupos neuronales específicos donde está SIRT1 es baja (Cakir I. et al., PLoS ONE, 2009, 4(12): e8322). Por ello, se necesitan alternativas capaces de alcanzar a las dianas hipotalámicas que intervienen en la ingesta con mayor eficacia, y que tengan efectos sobre éstas de forma más específica, como pueden ser los inhibidores genéticos. En cuanto a la inhibición genética de SIRT1 , el mayor problema que puede plantear el abordar SIRT1 como una diana anti-obesidad, es que al ser una deacetilasa que actúa sobre múltiples moléculas que ejercen acciones biológicas muy diversas, es muy probable que la inhibición hipotalámica de SIRT1 provoque otros efectos fisiológicos que todavía desconocemos y, es más que predecible que algunos de esos efectos serían no deseables. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al nuevo uso de inhibidores de p53 a nivel hipotalámico para reducir la ingesta de alimentos (agentes anorexigénicos), y que también pueden ser útiles para reducir el peso corporal, por ejemplo en el tratamiento de aquellos trastornos donde es importante alcanzar una reducción de peso significativa, tales como la obesidad u otros trastornos metabólicos asociados a la obesidad. Los autores de la presente invención han demostrado que la inhibición genética de p53 con un ARN de interferencia para el mismo a nivel hipotalámico: a) disminuye la ingesta de alimentos en ratones, y b) impide la respuesta normal a la ghrelina (hormona que induce el apetito en condiciones normales), de modo que en dichos animales no se produce un aumento en la ingesta de alimentos cuando son estimulados con la administración de esta hormona. Por tanto, los autores de la presente invención han demostrado que la inhibición genética de p53 a nivel hipotalámico es eficaz como terapia anorexigénica y por tanto es eficaz en el tratamiento de trastornos donde es necesario regular o controlar la ingesta de alimentos, es decir, en alteraciones de la conducta alimentaria que pueden conllevar conductas impulsivas de ingesta, tales como la bulimia nerviosa, la depresión atípica, el abuso de drogas psicoactivas, o el enanismo psicosocial, dado que animales a los que se administra un ARN de interferencia para este gen a nivel hipotalámico han demostrado reducir su ingesta. Además, los autores han demostrado que la disminución de la ingesta provocada por el ARN de interferencia para p53 es específica, ya que la secuencia inactiva o control (que recibe el nombre de sense, y que no interfiere en la expresión del gen p53) no bloqueó el efecto orexigénico (inductor de ingesta) de la ghrelina. Asimismo, la inhibición de p53 a nivel hipotalámico puede ser también eficaz en trastornos donde la reducción de peso corporal es necesaria para obtener una mejora clínica, como por ejemplo la obesidad, y los trastornos metabólicos asociados a la misma, dado que la reducción en la ingesta de alimentos puede ayudar a reducir el peso corporal de forma más eficaz y con menos efectos secundarios que los fármacos que inducen cambios en el metabolismo de las grasas, por ejemplo.
Por tanto, la presente invención pretende aportar una solución al tratamiento de la hiperfagia que acompaña a diversas alteraciones de la conducta alimentaria, así como a trastornos en los que es importante obtener una reducción de peso corporal y que en muchos casos conlleva un estadio obeso, aportando con ello al campo de la técnica una herramienta muy útil en la solución de dos problemas todavía sin resolver. Así pues, el uso de los inhibidores genéticos de p53 hipotalámico en este tipo de pacientes supone una mejora de la calidad de vida de los mismos, dado que al ser inhibidores genéticos éstos actúan con una mayor especificidad que los inhibidores farmacológicos descritos para otras dianas en este tipo de trastornos, lo que en general conlleva una mayor efectividad, menores dosis necesarias, menor toxicidad y por tanto menores efectos secundarios para el paciente, aspecto que hasta la fecha no se ha podido lograr de manera satisfactoria.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica (en adelante composición farmacéutica de la invención) que comprende:
i. al menos un inhibidor específico de la expresión del gen codificante de la proteína p53, donde dicho inhibidor comprende un ácido nucleico (en adelante, "ácido nucleico de la invención") de secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 a 7, y
II. al menos un elemento seleccionado de la lista que comprende: ghrelina, anticuerpo contra péptido relacionado con agoutí (AgRP), anticuerpo contra pro-opiomelanocortina (POMC), anticuerpo contra transcrito regulado por cocaína/anfetaminas (CART), anticuerpo contra péptido similar a glucagón 1 (GLP-1 ), anticuerpo contra neuropéptido Y (NPY), anticuerpo contra receptor de ghrelina (GHS-R1A) . En una realización preferida de la invención, el inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 1 .
En la presente invención, la expresión "gen codificante de la proteína p53" y "gen p53" son equivalentes.
Las secuencias de diferentes transcritos (o transcipt variants) de ARNm (ARN mensajero) del gen p53 humano son conocidas, por ejemplo las de SEQ ID NO: 1 a 7. La secuencia del transcrito número 1 (transcipt variant 1) de ARNm del gen p53 humano corresponde a la SEQ ID NO: 1 y constituye la base para el desarrollo de ácidos nucleicos inhibidores de la expresión del gen p53 en la presente invención.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inhibidor específico de la expresión del gen codificante de la proteína p53" se refiere a una molécula que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína p53 humana o "tumor protein p53" (siendo la secuencia de aminoácidos de dicha proteína la SEQ ID NO: 9), es decir, que impide o disminuye la traducción o la maduración del ARN mensajero, con el efecto final de reducir la cantidad, efecto y/o actividad de la proteína p53 correspondiente. Un agente inhibidor puede estar constituido por un ácido nucleico, un oligonucleótido (un ácido nucleico de menos de 50 nucleótidos), o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimine la cantidad, efecto y/o la actividad de la proteína p53. En la presente invención, el inhibidor comprende un ácido nucleico cuya secuencia es complementaria a una región o "secuencia diana" dentro de las secuencias SEQ ID NO: 1 a 7, que son las secuencias de las distintas versiones de ARN mensajeros del gen p53 humano, lo cual permite que el ácido nucleico reconozca al ARN mensajero, hibridando con éste, e interfiriendo con la expresión de la proteína p53 correspondiente.
El término "híbrida", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la unión de cadenas de ADN simple con secuencias complementarias. En Biología Molecular, la complementariedad es una propiedad de los ácidos nucleicos de doble cadena.
El término "complementario" se refiere a la existencia de una relación de complementariedad de bases nitrogenadas, empleando el emparejamiento de bases de Watson y Crick, entre ácidos nucleicos, por ejemplo entre el ácido nucleico de la invención y la secuencia complementaria o secuencia diana en el ARN mensajero de p53, que es suficiente para dar lugar a la unión específica entre ambos dentro de una célula. Se entiende por apareamiento de bases de Watson y Crick a la unión entre la adenina y la timina mediante dos puentes de hidrógeno, y a la unión entre la guanina y la citosina mediante tres puentes de hidrógeno. Dado que en el ARN no existe timina, la complementariedad se establece entre adenina y uracilo mediante dos puentes de hidrógeno. Una complementariedad perfecta, (es decir, del 100% de los nucleótidos del ácido nucleico de la invención con su secuencia diana en el ARN mensajero) es preferible, pero no absolutamente necesaria, especialmente cuando se emplean ácidos nucleicos de más de 20 nucleótidos. En el caso de ácidos nucleicos de entre 15 y 30 nucleótidos de largo, una complementariedad de al menos 10 de sus nucleótidos con la secuencia diana puede ser suficiente para el reconocimiento y la hibridación con dicha secuencia.
La identidad de la SEQ ID NO: 1 , o transcrito número 1 (transcipt variant 1) de ARNm del gen p53 humano, con las secuencias de los restantes 6 transcritos de ARNm que se han descrito para el gen p53 humano, así como de uno de los transcritos de ARNm para el gen p53 de ratón (Mus musculus), se muestran en la Tabla 1 : Número de
Especie Transcrito % Identidad SEQ ID NO: acceso en
NCBI
Homo sapiens Transcrito 1 100 1 NM_000546
Homo sapiens Transcrito 2 99.8 2 NM_001 1261 12
Homo sapiens Transcrito 3 53.9 3 NM_001 1261 14
Homo sapiens Transcrito 4 53.9 4 NM_001 1261 13
Homo sapiens Transcrito 5 77.9 5 NM_001 1261 15
Homo sapiens Transcrito 6 53.9 6 NM_001 1261 16
Homo sapiens Transcrito 7 53.9 7 NM_001 1261 17
Mus musculus Transcrito 2 35.2 8 NM_001 127233
Tabla 1 : % de identidad de secuencia entre el transcrito número 1 (transcipt variant 1) de ARNm del gen p53 humano con los restantes 6 transcritos de ARNm del gen p53 humano, y con el transcrito 2 de ARNm del gen p53 de ratón (Mus musculus). Se indica también el número de identificación de secuencia en la lista de secuencias de la invención, y el número de acceso en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) para la secuencia de ADN equivalente (es decir, la secuencia del NCBI es la secuencia del ARNm donde los uracilos (U) se encuentran sustituidos por timinas (T)).
La expresión "% de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de nucleótidos de una secuencia candidata que es idéntico a los nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 , después de alinear las secuencias para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El % de identidad de secuencia se puede determinar por cualquiera de los procedimientos o algoritmos establecidos en la técnica, tales como ALIGN o BLAST. En el presente documento, el % de identidad de secuencia se calcula dividiendo el número de nucleótidos que son idénticos después de alinear SEQ ID NO: 1 y la secuencia candidata, entre el número total de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y multiplicando el resultado por 100. En la presente invención, el inhibidor va acompañado por al menos un elemento (en adelante "elemento que acompaña al inhibidor de la invención") seleccionado de la lista que comprende:
-ghrelina,
-un anticuerpo contra alguna de las proteínas: péptido relacionado con agoutí (AgRP o agouti-related peptide), pro-opiomelanocortina (POMC), transcrito regulado por cocaína/anfetaminas (CART), péptido similar a glucagón 1 (GLP- 1 o glucagon like peptide), neuropéptido Y (NPY), receptor de ghrelina (GHS- R1A o growth hormone secretagogue receptor type 1 isoform 1a).
La secuencia de aminoácidos del péptido relacionado con agoutí (AgRP o agouti-related peptide) es la SEQ ID NO: 16. La secuencia de aminoácidos de la pro-opiomelanocortina (POMC) es la SEQ ID NO: 17. La secuencia de aminoácidos del transcrito regulado por cocaína/anfetaminas (CART) es la SEQ ID NO: 18. La secuencia de aminoácidos del péptido similar a glucagón 1 (GLP-1 o glucagon like peptide) es la SEQ ID NO: 19. La secuencia de aminoácidos del neuropéptido Y (NPY) es la SEQ ID NO: 20. La secuencia de aminoácidos del receptor de ghrelina (GHS-R1A) es la SEQ ID NO: 21 . La secuencia de aminoácidos de la ghrelina es la SEQ ID NO: 22.
La función del elemento que acompaña al inhibidor de la invención es dirigir al inhibidor a núcleos hipotalámicos específicamente, de modo que el inhibidor sólo actúe sobre la expresión del gen p53 cuando alcanza dichos núcleos. El hipotálamo es una glándula endocrina que forma parte del diencéfalo, y se sitúa por debajo del tálamo. El hipotálamo está constituido por diferentes núcleos neuronales que entre otras funciones regulan el hambre, el apetito y la saciedad por medio de hormonas y péptidos. El péptido relacionado con agoutí (AgPR), la pro-opiomelanocortina (POMC), el transcrito regulado por cocaína/anfetaminas (CART), el péptido similar a glucagón 1 (GLP-1 o glucagon like peptide) y el neuropéptido Y (NPY) son neuropéptidos que se localizan principalmente en el núcleo arcuato (o núcleo infundibular) del hipotálamo. El núcleo arcuato del hipotálamo es un núcleo de neuronas que se encuentra en la parte mediobasal del hipotálamo, donde están los receptores de la ghrelina, como por ejemplo el receptor de ghrelina GHS-R1A. El propósito de unir anticuerpos contra cualquiera de los neuropéptidos, o bien anticuerpos contra el receptor de ghrelina, o bien ghrelina, al inhibidor de la invención, es hacer que el inhibidor se dirija específicamente al hipotálamo, preferiblemente al núcleo arcuato del hipotálamo, actuando sobre la expresión del gen p53 tan sólo en esta región del hipotálamo, y no en otras áreas cerebrales, evitando efectos secundarios no deseables. De esta forma, se consigue inhibir la expresión del gen p53 tan sólo en la ruta hipotalámica donde p53 participa en la regulación de la ingesta, logrando un efecto inhibitorio específico.
Existen casas comerciales que ofrecen anticuerpos contra el péptido relacionado con agoutí (AgPR) (Millipore: AB3402P Anti-Agouti Related Protein; Abcam: AB32882 AGPR Antibody), así como contra pro- opiomelanocortina (POMC) (Abcam: POMC Antibody AB32893; Santa Cruz: POMC (FL-267) SC-20148), contra CART (Santa Cruz: CART Antibody (N-20) SC-18068), contra GLP1 (Abcam: GLP1 Antibody AB22625), contra neuropéptido Y (Abcam: Neuropeptide Y Antibody AB30914), y contra el receptor de ghrelina (GHS-R1A) (Abcam: Ghrelin Receptor Antibody AB85104).
Por tanto, la composición farmacéutica de la invención comprende un inhibidor de la expresión del gen codificante de la proteína p53 y, o bien ghrelina, o bien anticuerpos que van dirigidos contra proteínas o neuropéptidos localizados únicamente en núcleos hipotalámicos, de modo que dicho inhibidor cruza la barrera hematoencefálica y alcanza a sus dianas hipotalámicas, actuando únicamente sobre éstas. Por tanto, en una realización preferida de la invención, el inhibidor va unido a anticuerpos contra proteínas o neuropéptidos localizados únicamente en núcleos hipotalámicos. Una forma de unir los anticuerpos al inhibidor sería a través de la inclusión del inhibidor en vehículos tales como una nanopartícula, un liposoma, un vector o una micela, por ejemplo, a los que se pueden unir los anticuerpos en su superficie para dirigir dichos vehículos a las dianas hipotalámicas. En otra realización preferida de la invención, el inhibidor va unido a ghrelina, o a un agonista del receptor de ghrelina, como por ejemplo BIM-28125 o BIM-28131 (descritos en Strassburg et al., American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2008, 295: 78-84). Una forma de unir la ghrelina o un agonista del receptor de ghrelina al inhibidor de la invención es a través de síntesis química. Una vez alcanzada la diana hipotalámica, el ácido nucleico comprendido en el inhibidor híbrida con su secuencia complementaria en el ARN mensajero del gen codificante de la proteína p53 hipotalámica, inhibiendo la expresión de este gen únicamente a nivel del hipotálamo.
En una realización preferida, el ácido nucleico es un ARN de interferencia.
Se entiende por ARN de interferencia (ARN de silenciamiento, ARNi o RNAi, por sus siglas en inglés), a una molécula de ARN, de cadena simple o doble, que interfiere con un ARN mensajero específico conduciendo así a su degradación y/o disminución de su traducción en proteína. La secuencia del ARN de interferencia (de la única cadena, si es de cadena simple, o de una de ellas, si es de cadena doble) es complementaria a una región de la secuencia de nucleótidos de su ARN mensajero específico o "secuencia diana", pero no en sentido 5'-3' (sentido), sino en sentido 3'-5' (antisentido), ejerciendo un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional, interfiriendo con la expresión o traducción de dicho ARN mensajero y por tanto impidiendo la producción de un péptido o proteína, provocando su deficiencia. En la presente descripción, se entiende por "cadena antisentido" a la cadena de la molécula de ARN de interferencia que es complementaria en sentido 3'-5' a la secuencia del ARN mensajero en cuya expresión interfiere. Es decir, a la única cadena de la molécula de ARN de interferencia si ésta es de cadena simple, y a una de las cadenas si ésta es de cadena doble.
Se entiende por molécula de ARN de cadena simple a una molécula de ARN formada por una sola cadena de nucleótidos. Se entiende por molécula de ARN de cadena doble a una molécula de ARN formada por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí por complementariedad de bases.
El término ARN de interferencia fue inicialmente acuñado por Fire y colaboradores (Fire et al., Nature, 1998, 19; 391 (6669): 806-1 1 ), para describir la observación de que moléculas de ARN de cadena doble eran capaces de bloquear la expresión de distintos genes de forma más efectiva que cada cadena individual por separado, cuando cualquiera de ellas era introducida en el gusano Caenorhabditis elegans. En la actualidad, se sabe que estos ARN son capaces de dirigir el silenciamiento post-transcripcional y específico de distintos genes y en distintos organismos, incluyendo a los vertebrados. El mecanismo a través del cual actúan estos ARN de interferencia implica la activación de una maquinaria ancestral que media la degradación o supresión específica del o los ARN mensajero/s que contiene/n la secuencia complementaria al ARN de interferencia introducido o producido, produciéndose principalmente una degradación del ARN mensajero citoplasmático y una disminución de la traducción del mensaje, aunque algunos de los mecanismos bioquímicos que subyacen a esta degradación se desconocen.
En la presente descripción, el término "ARN de interferencia" incluye a los ARN interferentes pequeños (siRNA o small interfering RNA), los ARN antisentido, los micro ARNs y los ARN en horquilla (small hairpin RNA o shRNA). Por tanto, en la presente descripción, la molécula de ARN de interferencia puede ser tanto de cadena simple como de cadena doble, e incluye tanto a moléculas naturales o recombinantes aisladas, como a moléculas sintetizadas químicamente. Una molécula natural de ARN de interferencia es el ARN de interferencia nativo que se encuentra de forma natural dentro de las propias células. Además, las moléculas de ARN de interferencia pueden contener alteraciones con respecto a la secuencia del ARN de interferencia nativo, mediante la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos, modificaciones del esqueleto fosfodiéster, modificaciones del azúcar, modificaciones del grupo fosfato, y cualquier combinación de las mismas, con el fin de incrementar su estabilidad in vivo, por ejemplo para resistir la acción de las nucleasas. Algunas modificaciones del esqueleto fosfodiéster que incrementan la estabilidad de los oligonucleótidos incluyen las que dan lugar a oligonucleótidos fosforotioatos (PS) o a oligonucleótidos metil fosfonatos (MP), en los cuales uno de los átomos de oxigeno que no forman enlaces, son sustituidos por un grupo sulfuro o metilo, respectivamente. Algunas de las modificaciones más comunes para moléculas de ARN de interferencia de cadena simple se describen en Dean y Bennett (Dean y Bennett , Oncogene, 2003, 22, 9087-9096).
En una realización preferida de la presente invención, el ARN de interferencia es de cadena simple.
Por tanto, preferiblemente, el ARN de interferencia es una molécula de ARN de cadena simple cuya secuencia es complementaria a una región de la secuencia de nucleótidos de un ARN mensajero específico en cuya expresión interfiere.
Conocida la secuencia de un ARN mensajero determinado, existen distintas aproximaciones conocidas en el estado de la técnica para diseñar moléculas de ARN de interferencia capaces de inhibir la traducción de dicho ARN mensajero a proteína. Así, en una aproximación simple, se puede seleccionar aleatoriamente una región concreta dentro de la secuencia de un ARN mensajero específico y diseñar una molécula de ARN de cadena simple cuya secuencia sea complementaria a aquélla pero en sentido 3'-5' (antisentido). Asimismo, existen diversos algoritmos y procedimientos informáticos en el estado de la técnica que permiten una selección más racional de las regiones de la secuencia del ARN mensajero que serán más óptimas para el diseño de las moléculas de ARN de interferencia, y que tienen en cuenta diversos parámetros tales como la secuencia y la estabilidad interna de la molécula de ARN de interferencia resultante. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica del ARN de interferencia tiene al menos un 70% de identidad con las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , o SEQ ID NO: 12. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica del ARN de interferencia es cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 o SEQ ID NO: 12.
Las secuencias SEQ ID NO: 10, 1 1 y 12 corresponden a moléculas de ARN de interferencia de cadena simple específicas para las regiones de la secuencia del ARN mensajero 1 de p53 (SEQ ID NO:1 ) entre los nucleótidos 544-563, 902-920 y 958-977 respectivamente. Las secuencias SEQ ID NO: 10, 1 1 y 12 corresponden a la secuencia complementaria antisentido de la secuencia de nucleótidos del ARN mensajero 1 de p53 entre las posiciones 544-563, 902- 920 y 958-977 respectivamente, comprendiendo además un dinucleótido TT adicional en el extremo 3'.
Preferiblemente, la secuencia del ARN de interferencia tiene una longitud de entre 12 y 30 nucleótidos. Más preferiblemente, es de entre 18 y 22 nucleótidos. Aún más preferiblemente, es de 21 nucleótidos. En una realización preferida, la secuencia del ARN de interferencia comprende además un dinucleótido TT en el extremo 3'.
El dinucleótido TT en el extremo 3' se refiere a la existencia de dos timinas consecutivas en el extremo 3' de la secuencia de la cadena antisentido de la molécula de ARN de interferencia. La unión de 2 ó 3 nucleótidos, preferiblemente desoxiribonucleótidos, en el extremo 3' de la cadena antisentido, constituye una práctica habitual en el diseño de las moléculas de ARN de interferencia, ya que la presencia de dichos nucleótidos aumenta la especificidad en el reconocimiento de la secuencia diana en el ARN mensajero en cuya expresión interfiere.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un inhibidor específico de la expresión del gen codificante de la proteína p53, donde dicho inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 a 7, para la preparación de un medicamento para reducir la ingesta de alimentos. La reducción de la ingesta de alimentos se produce debido a las alteraciones que la composición farmacéutica provoca en algunos de los mecanismos reguladores de la ingesta en el hipotálamo.
La reducción de la ingesta de alimentos es útil en el tratamiento de trastornos de la conducta alimentaria donde es necesario regular o controlar la ingesta de alimentos, y que pueden conllevar conductas impulsivas de ingesta, como por ejemplo la bulimia nerviosa, la depresión atípica, el abuso de drogas psicoactivas, o el enanismo psicosocial. En una realización preferida, el inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID NO: 1 . Preferiblemente, el ácido nucleico es un ARN de interferencia. Preferiblemente, el ARN de interferencia es de cadena simple. Preferiblemente, la secuencia del ARN de interferencia tiene al menos un 70% de identidad con las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , o SEQ ID NO: 12. Aún más preferiblemente, la secuencia del ARN de interferencia es cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , o SEQ ID NO: 12.
En otra realización preferida, la secuencia del ARN de interferencia tiene una longitud de entre 12 y 30 nucleótidos. Más preferiblemente, es de entre 18 y 22 nucleótidos. Aún más preferiblemente, es de 21 nucleótidos. En una realización preferida, la secuencia del ARN de interferencia comprende además un dinucleótido TT en el extremo 3'. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la preparación de un medicamento para reducir el peso corporal en un sujeto. Preferiblemente, el sujeto sufre de obesidad, o de un trastorno metabólico asociado a la obesidad. El término "reducir el peso corporal" se refiere a toda estrategia que pretenda evitar un aumento de peso, reducir una posible ganancia de peso o reducir el peso corporal. Dicha reducción de peso corporal se puede llevar a cabo, por ejemplo, sobre un sujeto con sobrepeso. El sobrepeso se puede determinar atendiendo a los índices de Masa Corporal (IMC, Body Mass Index o BMI) que se emplean de manera rutinaria para estimar si un paciente presenta un peso normal, sobrepeso u obesidad, de acuerdo a distintos parámetros tales como la altura.
El término "obesidad" se refiere a un incremento de la cantidad de grasa que determina un aumento del peso corporal hasta un punto donde está asociado con ciertas condiciones perjudiciales para la salud. Se acepta que una reducción de peso de al menos un 5% del peso corporal inicial es suficiente para obtener mejorías clínicamente significativas de los trastornos asociados a la obesidad, tales como la resistencia a insulina, la diabetes tipo 2, la osteoartritis, la apnea del sueño, ciertos tipos de cánceres, la hipertensión arterial y la existencia de niveles circulantes elevados de lípidos.
Esta pérdida de peso en los pacientes obesos se asocia a: reducciones de las concentraciones de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y triglicéridos y aumentos de las concentraciones de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en pacientes con hiperlipemia; aumentos de la sensibilidad a la insulina y disminuciones de las concentraciones de glucosa e insulina en plasma en los pacientes con diabetes mellitus tipo 2; reducciones significativas de la presión arterial en los pacientes con hipertensión; aumento de la longevidad, de la autoestima y de las emociones positivas.
En una realización preferida, el medicamento comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, el vehículo debe ser farmacológicamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico y biotecnológico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes, tensoactivos, nanopartículas, vectores, partículas de lípido-ácido nucleico, liposomas, micelas, virosomas y cualquier combinación de los mismos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los inhibidores de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación y el transporte del inhibidor, así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El vehículo puede ser un vector, que puede ser apropiado para la terapia génica. Un vector es una molécula de ácido nucleico usada para transferir material genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. El vehículo puede ser una nanopartícula de oro, de plata o de cualquier otro elemento químico adecuado para la elaboración de la misma. El uso de nanopartículas como vehículos para el transporte del inhibidor puede permitir la liberación gradual del inhibidor en su región diana. Ejemplos de nanopartículas adecuadas para el transporte de ARN de interferencia se describen en Lee et al., Small, 201 1 , 7(3): 364-370.
Opcionalmente, dicho vehículo puede ir recubierto por anticuerpos dirigidos contra proteínas o neuropéptidos localizados únicamente en núcleos hipotalámicos, tales como el núcleo arcuato, de modo que el ácido nucleico cruzaría la barrera hematoencefálica y alcanzaría a sus dianas hipotalámicas específicamente. El término "terapia génica", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la transferencia de un material genético de interés (ADN o ARN) a un huésped para tratar o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (un polipéptido o proteína, un péptido o un ARN funcional) cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés puede consistir en un ARN de interferencia de valor terapéutico.
En una realización preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración oral. En otra realización preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral. Preferiblemente, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración intravenosa. La administración oral es aquella que se realiza por la boca. La administración parenteral es aquella que se realiza a través de una inyección o infusión. Algunos ejemplos de administración parenteral son la inyección subcutánea, intravenosa, intraarticular o intramuscular.
En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una sustancia suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la expresión del gen codificante de la proteína p53 es una cantidad suficiente para reducir la expresión de dicho gen o la traducción de su ARN mensajero correspondiente, que puede ser extrapolada a partir de los datos obtenidos en ensayos en animales. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un inhibidor para tratar una enfermedad o trastorno es una cantidad del inhibidor suficiente para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de una sustancia dada variará con factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que va a recibir la sustancia y el propósito por el que se da la sustancia. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede determinar empíricamente el experto en la materia de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica.
En una realización preferida, el medicamento además comprende un excipiente farmacológicamente aceptable. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del inhibidor, lo estabiliza o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que se hace referencia está permitido y evaluado de modo que es seguro, no es tóxico y no causa efectos adversos a los organismos a los que se administra.
En una realización preferida, el medicamento además comprende otra sustancia activa. En una realización preferida, el medicamento se administra como terapia combinada. Una terapia combinada se refiere a que el medicamento se administra junto con otro medicamento.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efecto de la administración aguda de Ghrelina (5 g) intracerebroventricular (i.c.v.) sobre la ingesta acumulada (g) a 2 (A) y 6 (B) horas, en ratones p53 wild type (WT) y knockout (KO) machos. Ocho individuos por grupo, siendo: *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 .
Figura 2. Efecto del tratamiento agudo con Ghrelina (5 g) intracerebroventricular (i.c.v.), a las 6 horas, sobre los niveles de proteínas involucradas en el metabolismo de lípidos en hipotálamo de ratones macho p53 wild type (WT) y knockout (KO). El análisis de proteínas se realizó a través de Western Blotting, con 8 individuos por grupo, siendo: *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 . Se indican los niveles de proteína hipotalámicos de pAMPKa, ΑΜΡΚαΙ , ΑΜΡΚα2, pACC, ACCa y FAS después de 6 horas tras la administración de ghrelina. A: gel resultante tras el análisis por Western Blotting. VH: ratones tratados con suero fisiológico (control); GHR: ratones tratados con ghrelina. B: Los valores obtenidos por Western Blotting fueron normalizados con los del control interno beta actina, y los resultados se expresan como unidades arbitrarias (% de cambio respecto al control). La media de los valores se obtuvo de 8 animales por grupo. Los valores se representan como la media ± error medio estándar, *p<0.05, **p<0.01 . Las barras en blanco representan los animales tratados con suero fisiológico, y las barras en negro representan los animales tratados con ghrelina.
Figura 3. Efecto de la administración aguda de Ghrelina (5 g) y del ARN de interferencia de p53 intracerebroventricular (i.c.v.) sobre la ingesta acumulada (g) a 2, 4 y 6 horas en ratones machos (8 animales por grupo, n=8, siendo: *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 ). VH: suero fisiológico; GHR: ghrelina; sip53: ARN de interferencia para p53, correspondiente a la SEQ ID NO:1 1 (10 g); NS: secuencia inactiva de ARN (sense). Figura 4. Localización de la administración específica del ARN de interferencia y las secuencias inactivas de p53 en el núcleo arcuato (ARC) del hipotálamo. Figura 5. Efecto de la administración específica del ARN de interferencia de p53 en el núcleo arcuato (ARC) del hipotálamo sobre la ingesta acumulada (g) a 12, 24, 36 y 48 horas en ratones normales. p53: ARN de interferencia para p53, correspondiente a la SEQ ID NO:1 1 ; NS: secuencia inactiva de ARN (sense), correspondiente a la SEQ ID NO:14.
Figura 6. Efecto de la administración específica del ARN de interferencia de p53 en el núcleo arcuato (ARC) del hipotálamo sobre la masa corporal en ratones normales. p53: ARN de interferencia para p53, correspondiente a la SEQ ID NO:1 1 ; NS: secuencia inactiva de ARN (sense), correspondiente a la SEQ ID NO:14. Las flechas corresponden a las dos administraciones realizadas, al principio del experimento (tiempo 0, flecha a la izquierda) y después de 24 horas (flecha a la derecha).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del uso de inhibidores de p53 hipotalámico como agentes anorexigénicos o supresores del apetito.
EJEMPLO 1 : Efectos de la ghrelina sobre la ingesta en ratones p53 wild type (WT) y knockout (KO)
MATERIALES Y MÉTODOS
Modelos animales
En estos experimentos se utilizaron ratones p53 knockout (KO) y wild type (WT), que fueron alojados en habitaciones con condiciones estables de temperatura (22-24°C) bajo un ciclo de 12:12 horas luz/oscuridad y alimentados con una dieta estándar. Los ratones homocigotos WT y KO fueron originados de aparejamientos entre ratones heterocigotos. Los animales fueron tratados y sacrificados a las 10-12 semanas de edad, antes de cualquier signo de morbilidad debido al desarrollo de tumores. Los experimentos con animales fueron realizados de acuerdo con los estándares aprobados por el Comité de Animales de la Universidad de Santiago de Compostela. Los ratones p53 knockout utilizados son los descritos en Jacks T. et al., Current Biology, 1994, 4 :1 -7. Solución anestésica
I. -KETAMINA: 42.5 % ketolar, parke-Davius, Morris Plañís N. J. (USA) 50mg/ml
II. -XILAZINA 20% Rompun, Bayer Leverkusen, Alemania. 2 mg/ml.
III. -solución salina fisiológica 37.5 % Canulación intracerebroventricular ( i.c.v.)
Esta operación debe realizarse aproximadamente unos 4 días antes del experimento. El objetivo de la implantación de estas cánulas es acceder al ventrículo lateral.
Se utilizaron cánulas de polietileno (PE-20, PE-50, Clay Adams, Becton- Dickinson, New Jersey USA) de calibre fino (1 .09 mm de diámetro externo y 0.38 mm de diámetro interno); en uno de los extremos de la cánula se pone un tope y se corta en bisel a unos ¾ mm de distancia, siendo esta parte la que se introduce al cerebro y la que permite el acceso al ventrículo lateral. El extremo opuesto de la cánula se selló hasta el día del experimento. Una vez anestesiados los animales se realizó un corte en la piel de la cabeza a la altura de la frente y hasta la parte posterior de los ojos, dejando al descubierto el tejido subcutáneo, el cual debe ser retirado con la ayuda de un bisturí hasta dejar a la vista el cráneo. Se localizó el bregma, que separa los huesos frontales de los occipitales y que se utilizó como punto de referencia para realizar un orificio (1 .2 mm mediolateral y 1 mm posterior) a través del cual se introduce la cánula. Posteriormente se añadió cianoacrilato para que la cánula quedara perfectamente fija y se selló toda la zona abierta. Para comprobar que la cánula ha quedado en posición correcta se inyectó protamina 2 %, disuelto en agua con acetato sódico, lo cual claramente tiñe el ventrículo lateral, demostrando así que la cánula ha sido colocada correctamente.
Administración intracerebroventricular (i.c.v.) de qhrelina en ratones normales y deficientes para p53
Se establecieron los siguientes grupos experimentales:
• 10 ratones wild type control (3 μΙ suero fisiológico) · 10 ratones wild type tratados con ghrelina (5 g/3 μΙ) (human ghrelin
trifuoroacetate; referencia: H4864; Bachem)
• 10 ratones p53 knockout control (3 μΙ suero fisiológico)
• 10 ratones p53 knockout tratados con ghrelina (5 g/3 μΙ)
La ghrelina se administró de manera intracerebroventricular a través de una cánula de polietileno. A los animales se les puso una cantidad de comida pesada y se midió la ingesta a 2 y 6 horas tras la administración de la ghrelina.
RESULTADOS
En primer lugar, comprobamos que la administración central (intracerebroventricular) de la ghrelina incrementa la ingesta en ratones wild type después de 2 y 6 horas (Figura 1 ). Sin embargo, en los ratones deficientes para p53, la ghrelina no produjo este incremento de la ingesta (Figura 1 ). EJEMPLO 2: Efectos de la ghrelina sobre el metabolismo de ácidos grasos en el hipotálamo de ratones p53 wild type (WT) y knockout (KO)
MATERIALES Y MÉTODOS
Los protocolos de extracción, homogenización de proteínas y Western Blotting se llevaron a cabo tal y como se describe en: Theander-Carrillo C et al., The Journal of Clinical Investigation, 2006, 1 16:1983-93. Se utilizaron 8 individuos por cada grupo experimental.
Homogenización y extracción de proteínas para Western Blottinq
Las muestras permanecieron a -80° C, en el momento que se procesaron las muestras se mantuvieron en hielo. Se les añadió tampón de lisis en proporción al tejido que en este caso son 500 μΙ de tampón de lisis para hipotálamo de rata y 160 μΙ para hipotálamo de ratón.
Se utilizó el siguiente tampón de lisis:
Tris-HCf pH: 7.5
EGTA 0.2 M* (pH 8)
EDTA O.2 M* (pH 8)
Tritón-X 100*
Sodium Orthovanadate* 0.1 M
Sodium Fluoride*
Sodium Pyrophosphate*
Sacarosa* 0.27 M
(*)Sigma Aldrich, St. Louis, USA
Se utilizó el inhibidor de proteasas "Complete, proteasa inhibitor cocktail tablets" (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA), empleando una pastilla por cada 50 μΙ de tampón de lisis.
Se homogen izaron los hipotálamos en el homogenizador "Tissue lyser II" (Qiagen, Retsch, Germany), y se determinó la concentración de proteínas a través del método colorimétrico Bradfor (Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Germany) en el espectrofotómetro Sunrise (Tecan, Austria).
Se les añadió el tampón de carga a las muestras y se guardaron a -80°C hasta ser utilizadas.
El búffer de carga ("Sample buffer" 5 x o Tampón de carga) se preparó con los siguientes elementos:
Tris-HCI 250 mM pH : 6.8
10% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)
50% (v/v) Glicerol 0.0005 % (w/v) Bromophenol Blue
5% (v/v) β-mercaptoetanol
Al momento de utilizar las muestras se colocaron en hielo y luego se calentaron a 95°C durante 10 minutos.
Western Blottinq, electroforesis y transferencia
Se separaron las proteínas por su peso a través de la utilización de geles Tris/glicina SDS-PAGE del 6% y del 10% de poliacrilamida. Estos geles constan de dos fases, "Stacking geí" y" Running gel "(preparados según Molecular cloning, A laboratory manual, Maniatis, 2a edición), y se cargaron 40 μg de proteínas en 16 μΙ en el caso del hipotálamo.
La electroforesis se realizó a 130 V durante 50 minutos en caso de geles al 6% de poliacrilamida ó a 100 V durante 100 minutos en caso de geles al 10% de poliacrilamida.
Se utilizaron los siguientes tampones:
Tampón de electroforesis: 72 g de Glicina, 15 g deTris-base, 5 g de SDS (sodium dodecyl sulfate).
Tampón de transferencia: 25 X: 36.5 g de Glicina, 72.5 g de Tris-base, 4.5 g de SDS.
A continuación, se hizo la transferencia de los geles a membranas PVDF (fluoruro de polivinilideno, 0.45 μιτι, Millipore, Massachusetts, USA); las transferencias se realizaron a 0.18 A durante 100 minutos.
Las membranas de PVDF se activaron previamente en metanol 5 minutos, en agua 2 minutos y en tampón de transferencia 2 minutos.
Se bloquearon las membranas con BSA (Bovine albumin, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) y con leche desnatada (Nonfat-dried Milk Bovine, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) durante una hora a temperatura ambiente, según especificaciones de cada anticuerpo.
Inmunodetección Se lavaron las membranas en TBS-TWEEN (100 ml-TBS 10 x, 1 ml-TWEEN 20, 900 mi agua destilada) y luego se incubaron las membranas con el anticuerpo primario a las diluciones adecuadas, durante una hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4o C.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios (Tabla 2) a una dilución de 1 :10000 y se incubaron durante una hora o durante toda la noche:
Figure imgf000030_0001
Tabla 2: anticuerpos primarios empleados en el Western Blotting.
Se realizaron tres lavados con solución TBS-TWEEN de 5 minutos cada uno luego se incubaron con el anticuerpo secundario durante una hora temperatura ambiente. Como anticuerpos secundarios se utilizaron, con una dilución de 1 :50000, y con una incubación de una hora:
Policlonal Goat Anti-Rabbit immunoglobulins/HRP
Polyclonal rabbit Anti-Mouse immunoglobulins/Mouse HRP (Dako, Dinamarca)
Luego se realizaron tres lavados con solución TBS-TWEEN de 5 minutos cada uno y se incubaron las membranas durante 1 -2 minutos con el Sustrato de quimioluminiscencia o ECL (Pierce ECL (Enhanced Chemiluminescent Substratre) Western Blotting Substrate, Thermo, scientific, Rockford, USA) en un lugar oscuro y sin agitación.
Cuando el anticuerpo secundario se incuba con el sustrato y el ECL, emite una reacción luminosa que permite la visualización, mediante autoradiog rafia, de la interacción de anticuerpos con la proteína de la muestra.
Luego, se colocaron las membranas en un cásete de autoradriografias con películas fotográficas (Amershan, hiperfilm M RPN 6 K) y se revelaron las películas en diferentes tiempos de exposición según la señal, en la cámara oscura.
RESULTADOS
Tras comprobar que la falta de p53 bloquea el efecto orexigénico (inductor de ingesta) de la ghrelina, investigamos los mecanismos moleculares que podrían estar alterados a través de la determinación de los niveles de distintos enzimas que actúan en el metabolismo de ácidos grasos. No se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión de AMPKal (AMP-activada proteína kinasa α1 ), AMPKa2 (AMP-activada proteína kinasa a2), FAS (sintetasa de ácidos grasos) o ACCa (acetil Coenzima A carboxilasa) entre ratones wild type y knockout para p53. Sin embargo, nuestros datos indican que 6 horas tras la inyección central en ratones wild type, la ghrelina activa pAMPK en el hipotálamo (incrementa los niveles de AMPK fosforilada) (Figura 2 A y B). Sin embargo, en los ratones deficientes para p53, la ghrelina no activa AMPK (Figura 2 A y B), lo cual indica que p53 es un mediador esencial de las acciones de la ghrelina sobre AMPK. EJEMPLO 3: Efectos del ARN de interferencia de p53 sobre la ingesta y la acción orexigénica de la ghrelina en ratones normales MATERIALES Y MÉTODOS
Administración i.c.v. de ARN de interferencia para p53 y ghrelina
Se establecieron los siguientes grupos experimentales:
• 10 ratones control (3 μΙ suero fisiológico + 3 μΙ suero fisiológico)
• 10 ratones tratados con suero fisiológico (3 μΙ) + ghrelina (5 g/3 l) · 10 ratones tratados con ARN de interferencia para p53 (10 g/3 μΙ) + suero fisiológico (3 μΙ)
• 10 ratones tratados con ARN de interferencia para p53 (10 pg/3 μΙ) + ghrelina (5 g/3 μΙ)
• 10 ratones tratados con la secuencia inactiva del ARN de p53 (10 g/3 μΙ) + ghrelina (5pg/3 μΙ)
Las secuencias para los ARN de interferencia para p53 (ARNi) y las secuencias de ARN inactivas de p53 (sense) correspondientes ensayadas fueron las siguientes:
Figure imgf000032_0001
Tabla 3: secuencias de los ARN de interferencia y los ARN inactivos (sense) diseñados para p53. La posición en la secuencia de p53 corresponde al número de nucleótido en la secuencia del ARNm (transcript variant 1) de p53. La secuencia de p53 de ratón corresponde a la de número de acceso en la NCBI (National Center for Biotechnology Information): NM_001 127233 (SEQ ID NO: 8) . La secuencia de p53 de humano corresponde a la de número de acceso en la NCBI: NM_000546 (SEQ ID NO:1 ).
Las moléculas de ARN de interferencia, así como las de ARN inactivas, fueron diseñadas por nLife Therapeutics S.L.
RESULTADOS
Una vez comprobado que la deficiencia global de p53 afecta a la señal orexigénica de la ghrelina, se diseñaron tres ARN de interferencia (ARNi) para bloquear la expresión de p53 específicamente en el sistema nervioso central . Para ello, inyectamos el ARNi de manera intracerebroventricular, y observamos que por sí solo, el ARNi inhibe la ingesta de ratones normales (Figura 3). Además, el ARNi bloquea el efecto orexigénico inducido por la ghrelina (Figura 3). Para comprobar que esta disminución de la ingesta provocada por el ARNi no está provocada por un efecto inespecífico, administramos de manera intracerebroventricular, una secuencia inactiva (sense) de p53, que es idéntica a la secuencia de ARNm de p53 en dirección 5'-3', la cual no debería ejercer efecto alguno. Como se demuestra en la figura 3, la administración de la secuencia sense no bloquea el efecto orexigénico de la ghrelina. Por tanto, nuestros datos indican que el efecto anorexigénico del ARNi contra p53 en el hipotálamo es específico.
EJEMPLO 4: Efectos de la administración específica del ARN de interferencia de p53 en el núcleo arcuato (ARC) del hipotálamo sobre la ingesta y la masa corporal en ratones normales
MATERIALES Y MÉTODOS Administración de ARN de interferencia para p53 de manera específica en el ARC.
Se establecieron los siguientes grupos experimentales:
• 10 ratones tratados con la secuencia inactiva del ARN de p53 (5 g/1 μΙ)
• 10 ratones tratados con ARN de interferencia para p53 (5 g/1 μΙ)
La secuencia para el ARN de interferencia para p53 (ARNi) fue la correspondiente a la SEQ ID NO: 1 1 , mientras que la secuencia de ARN inactiva de p53 (sense) fue la correspondiente a SEQ ID NO: 14 (Tabla 3).
RESULTADOS
Una vez comprobado que el ARN de interferencia (ARNi) para bloquear la expresión de p53 específicamente en el sistema nervioso central disminuía el efecto orexigénico de la ghrelina, investigamos el efecto de este ARNi tras su administración específica en el ARC, ya que el ARC es un núcleo esencial en la regulación de la ingesta y de la masa corporal. Para ello, inyectamos el ARNi mediante estereotaxia bilateral. Es decir, dado que el ARC tiene dos áreas (situada cada área en cada hemisferio del cerebro) (Figura 4), se realizaron dos inyecciones del ARNi, una en cada área del ARC al principio del experimento (tiempo 0) y después de 24 horas. Los resultados indican que por sí solo, el ARNi inyectado en el ARC inhibe la ingesta (Figura 5) y disminuye la masa corporal (Figura 6) de ratones normales.
Como control de este grupo, administramos de la misma manera una secuencia inactiva (sense) de p53, que es idéntica a la secuencia de ARNm de p53 en dirección 5'-3', la cual no debería ejercer efecto alguno. Como se demuestra en la figura 5, los ratones a los que se les administró la secuencia sense (NS en la figura 5) en el ARC comieron más que los ratones tratados con el ARNi.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Composición farmacéutica que comprende:
i. al menos un inhibidor específico de la expresión del gen codificante de la proteína p53, donde dicho inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 a 7, y
ii. al menos un elemento seleccionado de la lista que comprende: ghrelina, anticuerpo contra péptido relacionado con agoutí (AgRP), anticuerpo contra pro-opiomelanocortina (POMC), anticuerpo contra transcrito regulado por cocaína/anfetaminas (CART), anticuerpo contra péptido similar a glucagón 1 (GLP-1 ), anticuerpo contra neuropéptido Y (NPY), anticuerpo contra receptor de ghrelina (GHS-R1 A) .
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 , donde el inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 1 .
3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, donde el ácido nucleico es un ARN de interferencia.
4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, donde el ARN de interferencia es de cadena simple.
5. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la secuencia del ARN de interferencia difiere en 1 , 2 ó 3 nucleótidos con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , 0 SEQ ID NO: 12.
6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, donde la secuencia del ARN de interferencia es cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , 0 SEQ ID NO: 12.
7. Composición farmacéutica según la reivindicación 3 ó 4, donde la secuencia del ARN de interferencia tiene una longitud de entre 12 y 30 nucleótidos.
8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, donde la secuencia del ARN de interferencia además comprende un dinucleótido TT en el extremo 3'.
9. Uso de un inhibidor específico de la expresión del gen codificante de la proteína p53, donde dicho inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 a 7, para la preparación de un medicamento para reducir la ingesta de alimentos.
10. Uso según la reivindicación 9, donde el inhibidor comprende un ácido nucleico de secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID NO: 1 .
1 1 . Uso según la reivindicación 10, donde el ácido nucleico es un ARN de interferencia.
12. Uso según la reivindicación 1 1 , donde el ARN de interferencia es de cadena simple.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la secuencia del ARN de interferencia difiere en 1 , 2 ó 3 nucleótidos con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , o SEQ ID NO: 12.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la secuencia del ARN de interferencia es cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 10, SEO ID NO: 1 1 , 0 SEQ ID NO: 12.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 12, donde la secuencia del ARN de interferencia tiene una longitud de entre 12 y 30 nucleótidos.
16. Uso según la reivindicación 15, donde la secuencia del ARN de interferencia además comprende un dinucleótido TT en el extremo 3'.
17. Uso de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un medicamento para reducir el peso corporal en un sujeto.
18. Uso según la reivindicación 17, donde el sujeto sufre de obesidad o de un trastorno metabólico asociado a la obesidad.
19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, donde el medicamento además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración oral o parenteral.
21 . Uso según la reivindicación 20, donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración intravenosa.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 21 , donde el medicamento además comprende un excipiente farmacológicamente aceptable.
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