WO2012101378A1 - Procede de fabrication d'un support d'analyse et utilisation pour la detection de toxines - Google Patents

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Hoang-Oanh Nghiem
Jordi Molgo
Luis BOTANA
Natalia VILARINO
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Definitions

  • the present invention relates to a method of manufacturing an analysis device comprising Torpedil membrane fragments immobilized on its surface, to the analysis device obtained and to the use of said device for the detection and characterization of molecules, particularly competitive ligands of nicotinic acetylcholine receptors.
  • the present invention finds particular applications in the field of seafood food surveillance, in the field of the monitoring of freshwater supplies, in the field of medical research, in the field of biological analysis and the characterization of molecules.
  • references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
  • the phycotoxins of dinoflagellates can be accumulated by molluscs and fish and by vector transport can reach the man (Fleming LE, Broad K, Clement A, Dewailly E, Elmir S, Knap A, Pomponi SA, Smith S, Gabriele HS, Walsh P (2006) Oceans and human health: Emerging public health risks in the marine environment Mar. Pollut, Bull., 53: 545-560 [3], Molgô J, Girard E., Benoit, E. (2007) Cyclic imines: An insight into this emerging group of bioactive marine toxins In Phycotoxins: Chemistry and Biochemistry (Botana, LM, ed.) Pp. 319-335, Blackwell Publishing Ltd, Lana [4]).
  • the neurotoxins of the family spirolides, gymnodimines and pinnatoxins are powerful antagonists nicotinic acetylcholine receptors (RnACh) muscle and neuronal type having affinities in the order picomolar and nanomolar (Bourne Y, Radie Z, Arâoz R, Talley TT, Benoit E, Servent D, Taylor P, Molgo J, Marchot P. (2010) Structural determinants in phycotoxins and AChBP conferring high affinity binding and nicotinic AChR antagonism, Proc Natl Acad Sci USA 107: 6076-6081.
  • RnACh nicotinic acetylcholine receptors
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • LC-MS Mass Spectrometry
  • the LC-MS is the official method for the detection or the monitoring of marine phycotoxins which are subject to regulation in France, thus relegating the Mouse test to the role of sanitary vigilance of the seafood (Closing of the Assises of the shellfish culture ( 15/10/2010) Speech by Bruno Le Maire, Minister of Food, Agriculture and Fisheries (http://agriculture.gouv.fr/cloture-des-assises-de-la). [2]).
  • the LC-MS method does not and can not be applied for the detection of new toxins.
  • toxins in particular neurotoxins, for example phycotoxins of the cyclized imine family, for example gymnodimines, spirolides, pinnatoxins, pteriatoxins, prorocentrolides and spiro-prorocentrimine or new toxins, for example pinnamine, acting on the RnAChs, for example for the monitoring of neurotoxic phytoplankton for the shellfish industry or the quality of bathing water in the beaches for tourism, as well as for monitoring contaminated seafood
  • neurotoxins for example phycotoxins of the cyclized imine family, for example gymnodimines, spirolides, pinnatoxins, pteriatoxins, prorocentrolides and spiro-prorocentrimine or new toxins, for example pinnamine, acting on the RnAChs, for example for the monitoring of neurotoxic phytoplankton for the shellfish industry or the quality of bathing water in the beaches for tourism, as well as for monitoring contaminated seafood
  • cyanobacteria can produce neurotoxins, it can be for example toxic species of the genus Anabaena, Oscillatoria or others producing toxoid-a or homoanatoxin-a (Sivonen K, Jones G. (1999) Cyanobacterial toxins in cyanobacteria in water: a guide to their public heaith consequences, monitoring and management (Chorus, I., ed) pp. 41-1 1 1, Bartram, JE & FN Spon, London. [9]).
  • Electrocytes means modified muscle cells having lost their contraction capacity and which have specialized in generating electricity.
  • Electrocytes can be from the electrical organ of electric fish, for example species of the Torpedinidae family such as Torpilles, or the family Electrophoridae such as the electric eel (Electrophorus electricus).
  • the cells may be cells derived from the electrical organ Torpilles.
  • Torpedo electrocytes selected from the group comprising Torpedo adenensis, Torpedo alexandrinsis or Alexandrine Torpedo, Torscherdo andersoni or Torpedo Florida, Torpedo bauchotae, Torpedo californica or Electric Ray Pacific, Torpedo fairchildi, Torpedo fuscomaculata, Toroutheasterndo mackayana, Roadster macneilli, Torpedo marmorata or Marbled Electric Skate or Marbled Torpedo, Torpedo Microdiscus, Torpedo nobiliana or Atlantic Electric Ray, Panthera Torpedo or Panther Torpedo, Peruana Torpedo, Torpedo Semipelagica, Torpedo Sinuspersici, Toroutheasterndo suessii, Torpedo tokionis, Torpedo Torpedo or Torpedo Common, Torpedo tremens.
  • the cells used are Torpedo marmorate
  • the step of isolating the membranes may further comprise a step a '), prior to the step a) of taking the electrical Torpedo tissue.
  • This step of taking the electrical Torpedo tissue can be performed by any method known to those skilled in the art. This may be, for example, the method described in Morel et al. (1985) Morel N, Marsal J, Manaranche R, Lazereg S, Mazie JC, Israel M (1985). Large-scale purification of presynaptic plasma membranes from Torpedo marmorata electric organ. J. Cell Biol., 101: 1757-1762. [15].
  • It may be a process comprising, once the torpedo is asleep on an ice layer, for example by depositing the fish on said layer for about 20 minutes, two incisions in the lateral zones of the skull are practiced at the same time. using a scalpel to cut the 4 main nerves that connect each electrical organ with the electricus lobus located behind the fish's cerebellum.
  • the two electrical organs, once taken are dipped in a buffer solution, comprising, for example, 280 mM sodium chloride (NaCl), 3 mM potassium chloride (KCl), 1.8 mM magnesium chloride (MgCl 3), 3.4 mM calcium chloride (CaCy), 5 mM NaHCO3 sodium bicarbonate, 1.2 mM phosphate buffer, 5.5 mM glucose, 300 mM urea and 100 mM sucrose.
  • a buffer solution comprising, for example, 280 mM sodium chloride (NaCl), 3 mM potassium chloride (KCl), 1.8 mM magnesium chloride (MgCl 3), 3.4 mM calcium chloride (CaCy), 5 mM NaHCO3 sodium bicarbonate, 1.2 mM phosphate buffer, 5.5 mM glucose, 300 mM urea and 100 mM sucrose.
  • the method may further comprise a step a "), prior to step a) of preparing the Torpedo electric fabric obtained in step a ').
  • the preparation may be carried out, for example by immersing the electrical tissue taken from an extraction solution, for example an electrolyte membrane extraction buffer (TEME) comprising 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 3 mM EDTA, 1 mM tetraacetic acid ethylene glycol (EGTA) and protease inhibitors.
  • an extraction solution for example an electrolyte membrane extraction buffer (TEME) comprising 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 3 mM EDTA, 1 mM tetraacetic acid ethylene glycol (EGTA) and protease inhibitors.
  • EME electrolyte membrane extraction buffer
  • the fabric can then be finely cut, for example to a thickness of 1 to 5 mm using a scalpel and immersed in a freshly prepared solution, for example the TEME buffer comprising 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 3 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) and protease inhibitors.
  • TEME buffer comprising 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 3 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) and protease inhibitors.
  • the immersion solution can be prepared extemporaneously, for example in the day, for example 10 hours before, for example 5 hours before, for example 2 hours before.
  • the step of isolating membranes from the electrical organs taken and prepared as previously described can be carried out by sedimentation, for example in a discontinuous sucrose gradient, for example according to the method described in the document Hill and al. (1991) Hill JA, Nghley H-O & Changeux J-P (1991). Serine-specific phosphorylation of nicotinic receptor associated 43K protein. Biochemistry, 30, 5579-5585. [16] or Vilariho et al. (2009) Vilariho N, Fonfria ES, Molgo J, Arao R, Botana LM (2009). Detection of Gymnodimine-A and 13-Desmethyl C Spirolide Phycotoxins by Fluorescence Polarization.
  • a prepared tissue for example as described in step a ") is homogenized in a buffer, for example TEME as defined previously using a knife mill, then the total membrane fraction is precipitated by centrifugation, for example at 20,000 rpm and taken up in a buffer, for example TEME, containing 10 to 45% sucrose, preferably 35% sucrose,
  • the discontinuous sucrose gradient can be carried out, for example with, for example, two sucrose solutions. 60 to 10%, prepared in TEME buffer by weight relative to the total weight of the solution, for example 60% and 20% solution, 30% and 50%, 35% and 45% sucrose.
  • one of the sucrose solutions may comprise Torpille's total electrolyte membranes, for example, it may be two 35% and 45% sucrose solutions, the 35% sucrose solution containing the total membranes of After ultracentrifugation, the membrane Electrolyte cells settle at the interphase between the 35% and 45% sucrose solutions from which they are recovered and washed by ultracentrifugation, for example from 20,000 to 40,000, preferably at 40,000 rpm in glycine buffer. 5 mM.
  • the electrocyte membranes sediment at the interphase between the 35% and 45% sucrose solutions from which they are recovered and washed by ultracentrifugation, for example from 20,000 to 40,000, preferably at 40,000 rpm for, for example, from 1 to 60 minutes, preferably from 30 to 40 minutes; min in 5 mM glycine buffer.
  • the Torpille membranes can be cell membranes of electrocytes, preferably are prepared from Torpedil electrocyte cells indicated above.
  • Torpille electrocyte membranes are membranes comprising nicotinic acetylcholine receptors (RnACh), in muscle-type receptors consisting of two alpha 1 subunits, a beta 1 subunit, a gamma subunit, and a delta subunit ( ⁇ 2 ⁇ ) (Changeux JP (2010).) Allosteric receptors: from electric organ to cognition, Annu Rev. Pharmacol Toxicol., 50: 1-38 [17]).
  • RnACh nicotinic acetylcholine receptors
  • Torpille electrocyte membranes are rich in RnACh, representing from 10 to 60%, 20 to 60%, preferably 20 to 40% of the total protein concentration.
  • the fragmentation of the electrocyte membranes can be carried out by mechanical fragmentation, for example using a mill, for example a glass mill, for example a Potter-Elvehjem borosilicate glass mill with Teflon piston, by ultrasonic fragmentation, for example by sonication.
  • a mill for example a glass mill, for example a Potter-Elvehjem borosilicate glass mill with Teflon piston
  • ultrasonic fragmentation for example by sonication.
  • the mill is a Potter Elvehjem borosilicate glass grinder with a Teflon piston, for example in glycine buffer of 1 to 10 mM, preferably 5 mM glycine.
  • the use of a glass / teflon crusher makes it possible to preserve the functionality of the RnAChs.
  • the preparation of the stock solutions of the membrane fragments can be carried out by any method known to those skilled in the art, it can be for example a solution of the isolated fragments according to the method described above, for example with a Potter-Elvehjem, in a solution comprising 1 to 10 mM glycine, preferably 5 mM glycine.
  • the protein concentration of the stock solution of the membrane fragments of torpedo electrocyte can be, for example, from 0.5 to 10 mg / ml.
  • the total protein concentration of the Torpedo membranes can be adjusted, for example, to a concentration of 0.5 to 5, of 1 to 4, of 1.5 to 3.5, preferably of 2.5 to 3.5 mg / ml of protein.
  • the solution comprising the membrane fragments for coating ("coating") of the plates may be a pH solution of between 6.5 to 10, this solution corresponds to the solution in which the membrane fragments are incorporated. It may be for example a tris-saline buffer solution (TBS) comprising 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl or Tris, pH 7.5, a saline phosphate buffer solution (PBS) comprising 130 mM sodium chloride, 10 mM sodium phosphate, pH 7.0 or a carbonate / bicarbonate buffer solution comprising 150 mM sodium chloride, 100 mM sodium carbonate, pH 9.5.
  • TBS tris-saline buffer solution
  • PBS saline phosphate buffer solution
  • the pH of the solution comprising the membrane fragments for coating makes it possible to promote the interaction between the ligand and the RnACh.
  • the pH of the coating solution advantageously makes it possible to stabilize the membrane fragments and that the fixed membranes are biologically active.
  • the total protein concentration in said pH recovery solution of from 6.5 to 10 may be from 5 to 200 Mg / ml.
  • the ionic strength of the solution comprising the membrane fragments for coating ("coating") of the plates may be from 0.1 to 0.7, preferably from 0.16 to 0.42.
  • the calculation of the ionic strength of the solution can be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • it may be the result obtained from the following formula (I):
  • the ionic strength of the solution comprising the membrane fragments for coating promotes the interaction between the ligand and the RnACh.
  • the ionic strength of the coating solution advantageously makes it possible to stabilize the membrane fragments and that the fixed membranes are biologically active.
  • the attachment of the membrane fragments can be carried out for example by non-covalent and nonionic interaction between the membrane fragments and the surface.
  • the method of the invention may comprise, prior to step d) of fixing a step c ') of dilution of the membrane fragments in a solution.
  • the dilution may be carried out for example in a physiological solution, for example a saline solution, for example a tris-saline buffer solution (TBS) comprising 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5, a phosphate buffered saline solution (PBS) comprising 130 mM sodium chloride, 10 mM sodium phosphate, pH 7.0 or a carbonate / bicarbonate buffer solution comprising 150 mM sodium chloride, 100 mM sodium carbonate, pH 9, 5.
  • TBS tris-saline buffer solution
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • a carbonate / bicarbonate buffer solution comprising 150 mM sodium chloride, 100 mM sodium carbonate, pH 9, 5.
  • the device may be any device known to those skilled in the art for the fixation of biological molecules, for example, it may be a device whose surface is plastic. It may be, for example a multiwell plate, for example a plate of 6, 12, 24, 48, 96, 384 wells, preferably 96 or 384 wells, a plate of 4, 8 or 12 wells or strips with 6, 8 or 12 wells. It may be, for example, an ELISA plate, a high adhesion plate for polar molecules, for example NUNC Polysorp TM (trademark) plates, Medisorp TM (trademark), Maxisorp TM (trademark), or Multisorp TM (trademark). It may be for example high adhesion plates for glycoproteins (the list of microplates is not limiting).
  • the plate is a Maxisorp TM (trademark) plate.
  • the Maxisorp TM (trademark) plate also has hydrophobic groups, with many hydrophyl groups increasing its capacity to establish bonds. hydrogen in addition to van der Waals-type interactions (Esser P, 2010. Principles in Adsorption to Polystyrene, Technical Bulletin: 06a, Thermo Fisher Scientific Inc. [18]).
  • the amount of protein of the membrane fragments can be from 0.5 to 5 g of protein per well, for example from 1 to 2 g of protein per well, from 1 to 1.5 ⁇ g of protein per well
  • the process can be implemented, for example with stock solutions of Torpedo electrocyte membranes.
  • the process can be implemented with stock solutions obtained beforehand for example, by implementing steps a) to c) of the process of the invention.
  • the stock solution may be any solution known to those skilled in the art suitable for the preservation of membrane fragments, for example a physiological solution, for example TBS, PBS, a glycine solution, for example a solution glycine at a concentration of 1 mM to 10 mM, 3 to 8 mM, preferably 5 mM.
  • a physiological solution for example TBS, PBS
  • a glycine solution for example a solution glycine at a concentration of 1 mM to 10 mM, 3 to 8 mM, preferably 5 mM.
  • the process of the invention comprises step d) of fixing the membranes from stock solutions.
  • the stock solutions may be aliquoted beforehand, for example they may be volume solutions of 10 ⁇ to 1 ml, for example 100 ⁇ to 500 ⁇ , preferably 500 ⁇ .
  • the concentration of proteins in the stock solution can be between 0.5 to 5, from 1 to 4, from 1.5 to 3.5 mg / ml, preferably from 2.5 to 3.5 mg / ml of protein.
  • the protein concentration makes it possible to avoid in particular the repetitive thawing / freezing of the membrane samples and thus preserves the functionality of the RnAChs.
  • the preservation of membrane fragments of Torpille electrocyte in aliquots also makes it possible to avoid in particular the repetitive thawing / freezing of the membrane samples and thus preserves the functionality of the RnAChs.
  • the fixing step d) can be carried out for a predetermined time, for example this step can be carried out for at least 10 minutes, preferably at least 60 minutes, for example step d) can be carried out for 1 to 30 hours, for example from 1 to 30 hours, from 3 to 24 hours, from 6 to 12 hours. Step d) can also be carried out overnight, for example for 16 to 18 hours
  • step d) makes it possible to stabilize the binding of membrane fragments of torpedo electrocyte on the surface of the wells thus increasing the detection sensitivity of the device.
  • This stabilization advantageously allows a transport of said devices by air or land for example in Europe or to other continents without altering the sensitivity of the method of the present invention and its implementation device.
  • a stock solution when used in the process of the invention, it may comprise step c ') of dilution of the stock solution.
  • the dilution of the stock solution can be 50 to 500 times, preferably 100 to 300 times, even more preferably 200 times to 250 times.
  • the dilution of the solution can make it possible, for example, to obtain a total protein concentration in torpedo electrocyte membrane fragments of from 5 g / ml to 200 ⁇ g / ml, preferably from 10 g / ml to 20 g / ml of total protein per well.
  • the dilution of the solution may also make it possible, for example, to obtain a total protein concentration in torpedo electrocyte membrane fragments of 1 g / ml to 200 ⁇ g / ml, preferably 5 g / ml. at 100 g / ml of total protein per well.
  • a total protein concentration in torpedo electrocyte membrane fragments of 1 g / ml to 200 ⁇ g / ml, preferably 5 g / ml. at 100 g / ml of total protein per well.
  • these may be dilute stock solutions as indicated above.
  • the present invention also relates to an analysis device obtained by the method according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of an analysis device according to the invention for the detection and quantification of toxins, for example neurotoxins.
  • the neurotoxins may be any neurotoxins known to those skilled in the art, for example they may be neurotoxins acting, for example on the nicotinic acetylcholine receptors, neurotoxins produced by marine phytoplankton, as some members of the genus Alexandrium, for example Alexandrium ostenfeldii, producing for example spirolide, members of the genus Karenia, for example Karenia selliformis, producing for example gymnodimine, phycotoxins of the spiroimine family, for example pinnatoxins, pteratoxins, prorocentrolides or spiroprorocentrimine likely to be produced by different species of phytoplankton (Molgô J, Girard E, Benoit, E.
  • Cyclic imines an insight into this emerging group of bioactive marine toxins In Phycotoxins: Chemistry and Biochemistry (Botana, LM, ed) pp. 319-335, Blackwell Publishing Ltd, lowa.
  • These may also be cyanobact neurotoxins For example, ⁇ -toxoid, homoanatoxin- ⁇ , produced by members of the genera Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermum, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix and
  • Raphidiopsis, or pinnamine, marine toxin with a chemical structure very close to toxoid-a and or any toxin likely to act on RnACh (Arâoz R, Molgô J, Tandeau de Marsac NT (2009) Neurotoxic cyanobacterial toxins. Toxicon 56: 813-828 [19], Molgô J, Girard E., Benoit, E. (2007) Cyclic imines: an insight into this emerging group of bioactive marine toxins. In Phycotoxins: Chemistry and Biochemistry (Botana, LM, ed) pp. 319-335, Blackwell Publishing Ltd, Lowa [4]).
  • the present invention also relates to the use of an analysis device according to the invention for the detection and quantification of nicotinic acetylcholine receptor ligands.
  • the subject of the present invention is also the use of an analysis device according to the invention for the high-throughput screening of nicotinic receptor ligands of acetylcholine.
  • the present invention advantageously makes it possible to increase the efficiency of the recovery of Torpedo membrane fragments on surfaces, for example microplates and / or strips from, for example the choice of pH, the ionic strength of said solutions and / or the choice of incorporation solutions, components of said overlay solutions.
  • the present invention takes advantage of the development of surface chemistry seeking to maximize the rate of protein binding by plastic microplates (Esser P, 2010) Principles in Adsorption to Polystyrene Technical Bulletin: 06a Thermo Fisher Scientific Inc. [18]).
  • the increase in fixation for example on Maxisorp TM plates, may involve the surface chemistry of said plates and the macromolecular nature of the Torpedo membranes.
  • membrane fragments of Torpille electrocytes are mixtures of lipids (membranes) and proteins, whose RnACh can represent up to 40% of the total protein concentration.
  • RnACh are highly glycosylated proteins (7.5%) (Da Costa CJB, Kaiser DEE, Baenziger JE (2005).) Role of Glycosylation and Membrane
  • the present invention also relates to the use of an analysis device according to the invention for the purification and physico-chemical characterization of nicotinic receptor ligands of acetylcholine.
  • the present device may also be used to purify and identify ligands of nicotinic acetylcholine receptors (RnACh).
  • RnACh nicotinic acetylcholine receptors
  • the strong adhesion of membrane fragments of Torpedo electrocytes to the surface of the plates as defined above can fix and trap at least one or more ligands interacting with Torpille RnACh.
  • the recovery of the fixed ligand (s) can be carried out, for example, after washing the device according to the invention with a washing buffer, for example Tris saline buffer (TBS) containing 0.1% Tween 20, via an elution step. with an elution solution, for example methanol in the case of lipophilic molecules such as cyclized imines or employing other ionic strength buffers, pH and detergent concentration determined by those skilled in the art which can release the ligands of the Torpille RnACh.
  • a washing buffer for example Tris saline buffer (TBS) containing 0.1% Tween 20
  • TBS Tris saline buffer
  • an elution solution for example methanol in the case of lipophilic molecules such as cyclized imines or employing other ionic strength buffers, pH and detergent concentration determined by those skilled in the art which can release the ligands of the Torpille RnACh.
  • the ligands are eluted, their chemical nature can be determined rapidly, for example in a time of about 5 minutes, for example using mass spectrometry, of MALDI-TOF-MS type and / or any known method. of the skilled person.
  • the membrane fragments of Torpedo electrocyte do not need to be chemically modified. to attach strongly to the surface of the plates.
  • the present invention therefore advantageously allows the attachment of membrane fragments without prior structural modification and advantageously makes it possible not to denature or alter the biological properties of said membrane fragments.
  • FIG. 1 is a schematic of the ligand-receptor ligand-ELISA shift assay.
  • the scheme depicts the various process steps: (1) recovery of microplate wells with Torpin membranes rich in nicotinic acetylcholine receptors (RnACh), (2) blocking of unbound plastic surfaces, (3) incubation of immobilized Torpille membranes on the well wall with a test solution (either standard toxin or seafood extract) (4) Biotin-a-bungarotoxin-bound ligand-binding competitive displacement (Biotin-a-BgTx). (5) washing.
  • FIG. 2 represents standardization curves of the ligand-receptor binding assay on ELISA microplate.
  • FIG. 2A shows saturation curves of the binding between Biotin-a-BgTx and Torpille electrocyte RnAChs using 500-fold diluted membrane solutions (-A-), 200-fold diluted membrane (- ⁇ -), 100-times diluted membrane (- ⁇ -) and 50-times diluted membrane (- ⁇ -). Each dilution was performed in Tris saline buffer (TBS). The membranes were incubated overnight with varying concentrations of biotin-a-BgTx (5 x 10 "12 M to 5 x 10" 6 M) to determine the affinity constant of Biotin-a-BgTx for RnACh of Torpedo.
  • Figure 2B is a diagram showing determination of tracer concentration (biotin-a-BgTx) for the method.
  • Microplate wells coated with a solution of Torpedil electrolyte membranes diluted 200-fold in TBS buffer were incubated with different concentrations of biotin-a-BgTx: 2 x 10 -9 M (- ⁇ -),
  • Fig. 2C is a diagram showing the determination of the dilution of Torpedo electrocyte membranes for the ligand-receptor binding assay on ELISA microplate.
  • Électrocyte different membrane dilutions Torpedo (10 to 5000 times diluted) were incubated overnight with 8 x 10 "8 M of biotin-a- BgTx.
  • FIG. 3 represents the competitive inhibition of the biotin-a-binding
  • Figure 3A is a photograph of a microplate showing competitive dose-dependent inhibition of biotin-a-BgTx binding with Torpille RnAChs by standard ⁇ -BgTx and by 13-desmethyl spirolide C-phycotoxin. Each dose has been tested in triplicate.
  • ⁇ -BgTx and 13-desmethyl SPX C competitively and dose-dependently inhibit, but to a different extent, the binding of biotin-to-BgTx to RnACh of immobilized Torpille membranes.
  • the signal plate is the negative control: wells without recovery by the membranes. 100% signal is the positive control: these are wells in which Torpedo membranes have been put in the absence of toxins or extract samples.
  • FIG. 4 represents the competitive inhibition of the biotin-a-BgTx binding with the Torpille RnACh by phycotoxins carrying cyclized imines and control and contaminated seafood extracts.
  • FIG. 4A is a photograph of a microplate showing competitive dose dependent inhibition of biotin-a-BgTx binding with Torpille RnAChs with 13-desmethyl SPX C and seafood extracts contaminated with said toxin and control extracts. Each dose was tested in triplicate.
  • FIG. 4B is a photograph of a microplate showing the competitive dose dependent inhibition of biotin-a-BgTx binding with Torpille RnAChs by gymnodimine-A, seafood extracts contaminated with said toxin and witness extracts. Each dose was tested in triplicate.
  • FIG. 4C is a photograph of a microplate showing the competitive dose-dependent inhibition of biotin-a-BgTx binding with Torpille RnAChs by 13-19 didesmethyl spirolide C, seafood extracts contaminated with said toxin and control extracts. Each dose was tested in triplicate.
  • Figure 4D is a bar graph showing the matrix effect.
  • Figure 5 depicts the screening of competing RnACh toxins / ligands from marine cyanobacterial extracts using the ligand-receptor ELISA microplate binding displacement assay with the 96-cone manual pipettor.
  • Figure 5A is a photograph of the 96-cone manual pipettor showing the loading and pipetting areas.
  • Figure 5B shows the plate plane for screening for competitive RnACh toxins / ligands from marine cyanobacterial extracts I through VII, using as a positive control the 13-
  • FIG. 5C is a photograph of a microplate showing the screening of competitive toxins / ligands of RnAChs from extracts of marine cyanobacteria I to VII tested at three dilutions: Di 0 : first row, D100: second row and D1000 third row .
  • the rectangle VIII shows the same plate on the dose-dependent competitive inhibition of binding biotin-a-BgTx with Torpedo RnACh by the 13-19 didesméthyl spirolide C: first stored: 5 X 10 "7 M, second row: 5 X 10 "8 M, third row: 5 X 10 " 9 M, fourth row: 5 X 10 "10 M, fifth row: 5 X 10 " 1 1 M, sixth row: 5 X 10 "12 M and seventh tidy: 5 X 10 "13 M.
  • Signal plate H1 -H3
  • 100% signal H4-H9
  • 100% inhibition H10-H12).
  • the overlay buffer was as follows: Tris-salt buffer (TBS) (150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5)
  • Washing buffer TBS containing 0.1% Tween 20.
  • Blocking buffer TBS containing 0.5% bovine serum albumin (BSA)
  • a 10-fold concentrated stock solution of TBS buffer at pH 7 was prepared and autoclaved and stored at room temperature, ie at 25 ° C to prepare said buffers
  • Biotinylated ⁇ -bungarotoxin (Biotin-a-BgTx) was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR, USA)
  • Gymnodimine A was purchased from NRC-CNRC Company 13-19-Didesmethyl Spirolide C was purchased from CIFGA (Lugo, Spain).
  • the toxoid-a came from the company TOCRIS (Ellisville, MO, USA)
  • Figure 1 shows the different steps of implementation of the method.
  • Coating Coating with membranes
  • a NUNC Maxisorp TM 96-well flat-bottom Elisa plate was coated with 100 ⁇ l per well of Torpille electrocyte membranes with a total protein concentration of 13.5 g / ml in TBS overlay buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, ie 1.35 ⁇ g protein per well). The plates were closed and incubated at room temperature (25 ° C) for 2 hours or overnight at 4 ° C.
  • the stock solution of membranes was diluted 200-fold in TBS buffer before the plates were covered.
  • the coating was carried out with an eLINE multichannel electronic pipetter (Biohit, Helsinki, Finland) which accelerated the loading of the membranes. Three wells were left uncovered with membranes for use as a negative control well (plate signal).
  • the wells were filled with 250 ⁇ l of blocking buffer (TBS, 0.5% BSA) per well.
  • TBS blocking buffer
  • the plate was closed and incubated for one hour at room temperature, ie 25 ° C.
  • the blocking buffer was removed and the residual liquid on the top of the plate was absorbed with absorbent paper. Without washing, the plates were loaded either with a) 100 ⁇ l of standard toxins prepared in blocking buffer or with b) 100 ⁇ l of blocking buffer containing up to 10% extracts (volume / volume). Each concentration of toxin or sample was tested 3 times. The plate was closed and incubated for three hours under constant agitation at room temperature (25 ° C), or overnight at 4 ° C for maximum sensitivity.
  • Torpedo membranes Six wells coated with Torpedo membranes were left free of toxin or extract for use as a negative control (Signal 100%). In addition, three wells coated with Torpedo membranes were left free of toxin or extract for use as non-specific inhibition control. Said wells are incubated with 1 ⁇ ⁇ -bungarotoxin (100% inhibition).
  • the concentration of methanol was kept below 1% in order to avoid any interference with ligand binding to RnACh.
  • the multichannel electronic pipettor makes it possible to minimize the differences in the exposure time to the reaction between the biotin portion of the tracer and the sptreptavidin portion of the enzyme.
  • K d 10-14 M
  • a 30 minute reaction provides a negligible effect related to the difference in exposure time for each row of wells.
  • reaction time between the Biotin-a-BgTx and streptavidin-peroxidase was determined experimentally, i.e. membranes electrocyte Torpedo immobilized on microplate well Maxisorp TM were incubated with 8 x 10 "8 M biotin- a-BgTx for 30 minutes at 25 ° C. After washing,
  • the use of a multichannel electronic pipettor avoids variations in color development due to the difference in exposure time.
  • the stoppage solution was added in the same order as the peroxidase substrate (OPD) solution was added in order to minimize the differences due to the incubation time.
  • OPD peroxidase substrate
  • the peroxidase substrate was prepared according to the supplier's recommendations. Four OPD tablets were dissolved in 12 ml deionized water at room temperature (25 ° C), whereupon after 5 ⁇ of 30% hydrogen peroxide was added.
  • the plate was recorded with an ELISA reader (Genios Pro, Tecan) at an absorbance of 492 nm ( Figure 1).
  • Inhibition% [100 x (100% signal - sample signal) / (100% signal - (100% inhibition - plate signal)]
  • Inhibition% [100 x (100% signal - sample signal) / (100% signal - 100% inhibition)]
  • RnACh antagonists of RnACh, namely: ⁇ -bungarotoxin, 13-desmethyl spirolide C, 13,19 didiesmethyl spiprolide C, gymnodimine, d-Tubocurarine (curare) and agnists of the RnACh, namely : anatoxina-a and homoanatoxin-a, inhibit the interaction between ⁇ -BgTx and Torpille's RnACh in a concentration-dependent manner with different affinities (FIGS. 3A, 3B, 4A, 4B). and 4 C).
  • This system can also be used with streptavidin coupled with alkaline phosphatase in addition to streptavidin coupled with horseradish peroxidase, and as developers of the enzymes of the substrates either producing a colorimetric reaction (OPD, Nitro blue tetrazolium chloride), or a chemiluminescence detectable substance (ECL +) (Arao R, Herdman M, Rippka R, Ledreux A, Molgo J, Changeux JP, Tandeau de Marsac N, Nghiem HO (2008) .A non-radioactive ligand-binding assay for detection of cyanobacterial anatoxins using Torpedo electrocyte membranes Toxicon 52: 163-174 [14]).
  • OPD Nitro blue tetrazolium chloride
  • ECL + chemiluminescence detectable substance
  • IC 5 o represents the concentration of neurotoxin at which there is 50% inhibition of binding between biotin-a-BgTx and Torpille RnACh; the 95% Cl is the 95% confidence interval of the corresponding IC 5 o value; the LOD is the limit of detection of the method, the LOQ, is the limit of quantification of the method; NC90 represents the concentration of neurotoxin required to inhibit 90% of the binding between biotin-a-BgTx and Torpille RnACh.
  • the non-radioactive ligand-receptor binding assay on ELISA-type microplates is a functional method based on the mechanism of action of competitive RnACh ligands. This method allows the detection of competitive agonists and antagonists of RnACh with high sensitivity.
  • the sensitivity of the method using the devices of the present invention was compared with High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (UPLC-MS / MS) for the detection of 13-SPX C, 13-19-SPX C and GYM A [Arâoz et al., Manuscript in preparation].
  • UPLC-MS / MS High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry
  • the LOD and LOQ values obtained by UPLC-MS / MS show that the sensitivity of the non-radioactive displacement method using the device of the present invention is in the same order of magnitude as that of the UPLC-MS / MS ( Table 2).
  • the use of the device obtained by the method of the invention makes it possible to detect the interaction between the RnAchs and ligands with a sensitivity as great as the most precise techniques of the state of the art. without the use of a complex and / or expensive device and in parallel with a large number of samples (96) for the simultaneous detection of several RnACh ligand / agonists / antagonists, namely spirolides, gymnodimines, pinnatoxins, toxoids, curare, ... (the list is not exhaustive).
  • Example 2 Method for the detection of desmethyl spirolide C, 13,19 didesmethyl spirolide C and gymnodimine A from seafood extracts and toxoid-a from extracts of cyanobacteria
  • Coating buffer TBS (150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5).
  • a Maxisorp 96-well flat-bottomed ELISA plate (NUNC) was coated with 100 ⁇ l per well of a solution of Torpille electrocyte membranes (13.5 g / ml total protein, ie 1.35 g of membrane protein per well) in TBS buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5) using a multichannel pipettor. The plate was closed and incubated at room temperature (25 ° C) for 2 hours or at 4 ° C overnight.
  • pulp of almonds, oysters, mussels or scallops 100g was homogenized in a maximum power knife mill and divided into 10 aliquots and kept at - 80 ° C.
  • the homogenates were centrifuged at 3500 rpm for 15 minutes at 4 ° C and the supernatants were recovered while the pellets were re-extracted twice with 4 ml of acetone as just described. The supernatant pools were evaporated and the residues were resuspended in 4 ml of water. On the aqueous extracts, 4 ml of hexane was added and left for 30 min at room temperature (25 ° C) for chemical partitioning to take place.
  • the aqueous phases were extracted three times with chloroform (1: 1, 5 v / v).
  • the chloroform layers were combined and evaporated.
  • the residues obtained were resuspendus in 100 ⁇ l of methanol and stored at -80 ° C. until use.
  • the biological material i.e., cyanobacterial filaments
  • the cyanobacterial pellet was resuspended in The lyophilized cells were resuspended in 50 mM acetic acid (10 mg: 2 ml) and lysed by sonification (5 cycles of 1 minute with 3 minutes in ice) with a Sonifier Branson 250.
  • the obtained homogenate was stirred for 4 hours protected from light and then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 15 ° C.
  • the supernatant was collected and then passed through a filtration unit (0.45 ⁇ pore) and stored at -20 ° C until use.
  • FIG. 4A shows, on the same microtiter plate, the dose-dependent inhibition of the biotin-a-BgTx-RnACh binding by serial dilutions of desmethyl spirolide C and by seafood extracts doped with the same toxin and witness extracts.
  • Figure 4B shows inhibition of biotin-a-BgTx-RnACh binding by serial dilutions of gymnodimine A and seafood extracts doped with gymnodimine A, as well as tested seafood extracts tested at two concentrations (100-fold and 200-fold diluted).
  • FIG. 4C shows the inhibition of the biotin- ⁇ -BgTx-RnACh binding by serial dilutions of 13,19 didesmethyl spirolide and seafood extracts doped with the same toxin, as well as by seafood extracts witnesses.
  • the effect of the extracts obtained from the neurotoxic cyanobacteria at Oscillatoria, strain PCC 6506 (a-toxin-a producer) and strain PCC 101 11 (homoanatoxin-a producer), on the biotin-a-BgTx bond -RnACh are shown.
  • the sensitivity of the method depends on the affinity of the toxin for the receptor. As demonstrated in this example, the detection threshold of this non-radioactive method is very low, for example 54 picograms of 13,19 didesmethyl spirolide C; 69 picograms of 13 desmethyl spirolide C and 101 picograms of gymnodimine A.
  • the method requires a very small amount of electrolyte membrane, for example 1 to 2 g of Torpedil electrocyte membrane proteins per well in this example ( Figure 2 A, 2 B and 2 C).
  • torpedo electrocyte membranes are adequately stored, for example 0.5 ml aliquots at -80 ° C, they are stable for several years.
  • coated microplates "coated” with torpedo electrocyte membranes when stored at 4 ° C in 200 ⁇ l blocking buffer (TBS, 0.5% BSA, pH 7.5), can be used up to six months after their manufacture. There is no significant difference between coated plates ("coated") the day before or plates coated (“coated”) six months previously for the detection of ligands RnACh. This proof of principle is very useful for designing the fabrication of previously pre-coated plates with ready-to-use torpedo electrocyte membranes.
  • the plates obtained in this example are designated Torpecfo-MicroReceptorPlaque.
  • the use of the device obtained by the method of the invention makes it possible to detect the interaction between RnAch and competitive ligands directly on methanolic extracts of seafood and aqueous extracts of cyanobacterial filaments.
  • the devices of the present invention namely previously pre-coated plates with ready-to-use torpedo electrocyte membranes, could be transported and distributed by post for use in other countries / continents. for the detection of competitive ligands of RnACh.
  • Example 3 High throughput screening of toxins / competitive ligands of nicotinic acetylcholine receptors.
  • Example 1 The microplates coated with Torpedo electrocyte membranes which are stored at 4 ° C. obtained in Example 1 are suitable for high-throughput methods.
  • a plate plan is prepared as shown in FIG. 5: Seven extracts of environmental cyanobacteria tested by triplicate at three dilutions (10-, 100- and 1000-fold) and serial dilutions of 13,19 didesmethyl spirolide C ranging from 5 X 10 "7 to 5 X 10 " 13 M in addition to the negative controls (control plate, 3 wells), 100% signal controls (6 wells) and 100% inhibition (1 X 10 -5 M BgTx, 3 wells) were tried by the method.
  • the plate of FIG. 6C shows in rectangles the distribution of the seven extracts of marine cyanobacteria and 13,19 didesmethyl spirolide C.
  • Rectangle I [A1 -C3], CYA01; Rectangle II [D1-F3], CYA02; Rectangles III G1-G3 and [A4-B6], CYA03; Rectangle IV [C4-E6], CYA04; Rectangles V [F4-G6] and A7-A9, CYA 05; Rectangle VI [B7-D9], CYA06; Rectangle VII [E7-G9], CYA07; Rectangle VIII [A10-G12], 13,19 didesmethyl spirolide C.
  • solutions of toxin or extract in blocking buffer identical to that of example 2 above are prepared and distributed in plates 96 tubes capable of holding up to 1 ml of solution per tube: "PLATE TOXIN / EXTRACTS".
  • the minimum volume to be prepared is 350 ⁇ per tube.
  • a third plate 96 tubes "PLATE PEROXIDASE” containing streptavidin coupled to peroxidase (D 5 ooo ⁇ 220 ng / nl protein in blocking buffer) was prepared. This solution is freshly prepared.
  • a fourth 96-tube preparation plate indicated "OPD PLATE" containing the OPD commercial substrate, at least 120 ⁇ per well, to develop a screening device is prepared.
  • This solution is freshly prepared and must be protected from light.
  • the OPD solution is prepared according to the supplier's protocol: 4 OPD tablets are dissolved in 12 ml of deionized water, in which 5 ⁇ of 30% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) is added.
  • the plate is left on a stirrer at room temperature (25 ° C) for 30 min. Once the screening device is at temperature, the adhesive film is removed, the blocking buffer is removed and after drying its surface, the plate is placed on the pipetting zone.
  • the 96-channel manual pipetter is loaded with new cones and set to 100 ⁇ , and the "TOXIN / EXTRACT PLATE" is placed on a "load” area.
  • 100 ⁇ l of the "TOXIN PLATE / EXTRACTS” containing toxin standards, samples, extracts, synthetic products or negative and positive controls are taken and poured into the Torpedo- MicroReceptorPlate placed in the pipetting zone.
  • the screening device is sealed with an adhesive film (Sealing tape, Costar) and incubated immobilized Torpille electrocyte membranes with the test samples for 3 hours with shaking.
  • the incubation is at night at 4 ° C.
  • the Torpecfo-MicroReceptorPlaque is placed on a stirrer at room temperature (25 ° C) for 30 min before being returned to the pipetting area of the Liquidator 96TM.
  • New tips are loaded and the pipettor set to 50 ⁇ and the box "PLATE ⁇ - ⁇ -BgTx" placed on the "load” area.
  • 50 ⁇ of each tube of the "PLATE ⁇ - ⁇ -BgTx” is taken and poured directly onto the Torpecfo-MicroReceptorPlaque.
  • the plate thus obtained corresponds to the screening device and is incubated for 30 minutes on a stirrer at room temperature (25 ° C.) after which the solution is removed and the plate is returned to the pipetting zone.
  • New tips are loaded and 200 ⁇ l of washing solution (TBS, 0.1% Tween 20) are taken and poured into the Torpedo- MicroReceptorPlaque wells. The wash solution is removed and the Torpedo- MicroReceptorPlaque is returned to the pipetting zone. This step is repeated three times.
  • washing solution TBS, 0.1% Tween 20
  • Torpecfo-MicroReceptorPlaque is read on the ELISA reader (GeniosPro, Tecan) and the analyzed results.
  • a 96-well "model plate” is prepared for the toxin / extract / control samples according to the plate plan to be tested.
  • the pipetting robot is capable of automating the preparation of toxin / sample dilutions for the "model plate”.
  • a dilution of the stock solution of membrane, 2.7 mg of proteins per ml, prepared according to the method described in example 1 -4 above was diluted 200 times in TBS buffer at a pH of 7.5.
  • Table 3 represents the different results obtained in terms of the sensitivity of the process as a function of the molecule to be detected.
  • the use of the device obtained by the method of the invention makes it possible to detect the interaction between the RnAchs and ligands with a sensitivity much greater than that of the methods and device of the prior art.
  • the device of the present invention namely previously coated ("pre-coated") plates with ready-to-use torpedo electrocyte membranes can be transported and dispensed, for example by mail for use in other countries / continents for the detection of competitive RnACh ligands.
  • the amounts of membrane fragments used to make the device of the invention are much lower than the quantities required in the methods of the state of the art.
  • the process of the invention advantageously makes it possible to reduce the quantity of membrane fragments to be used and thus decreases, compared with the methods of the prior art, the number of torpedos to be sacrificed while improving the detection sensitivity of the device of the invention. compared to known devices / methods.
  • EXAMPLE 6 Method for eluting the cyclized imines reacted with immobilized Torpin nicotinic acetylcholine receptors on the surface of ELISA-type plates.
  • the ready-to-use analytical device was placed at room temperature, ie at 25 ° C for 30 minutes.
  • the blocking buffer was removed and without washing, six wells were incubated with 100 ⁇ l of gymnodimine A, or with 100 ⁇ l of 13 desmethyl spirolide C, or with 100 ⁇ l of 13.19 didesmethyl spirolide C at a concentration of 1 ⁇ l. prepared in blocking buffer (TBS, 0.5% BSA, pH 7.5).
  • the device was incubated at 4 ° C overnight.
  • wash buffer comprising TBS. 0.1% Tween 20, pH 7.5.
  • the elution of gymnodimine A was carried out with 50 ⁇ l of methanol added to each of the six wells previously incubated with this toxin. After 5 min incubation at room temperature (25 ° C) the methanol was recovered. The same procedure was applied to elute desmethyl spirolide C and 13,19 didesmethyl spirolide C.
  • the use of the device obtained by the process of the invention makes it possible, for example, to capture cyclized imines that can be eluted afterwards, for example with methanol.
  • the use of the device obtained by the process of the invention thus advantageously makes it possible to facilitate the isolation / characterization of the RnACh ligands.
  • this device can also be advantageously used in research programs for new toxins.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface, au dispositif d'analyse obtenu et à l'utilisation dudit dispositif pour la détection, purification et caractérisation de molécules agissant sur des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. La présente invention trouve notamment des applications dans le domaine de la surveillance alimentaire de fruits de mer, la surveillance de phytoplancton neurotoxique pour l'industrie conchylicole, la qualité des eaux de baignade dans les plages pour le tourisme, dans le domaine de la surveillance des réserves d'eau douce, dans le domaine de la recherche médicale, dans le domaine de l'analyse biologique et de la caractérisation de molécules, par exemple dans des essais non radioactif de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA permettant par exemple de détecter des agonistes et antagonistes compétitifs de cibles, par exemple de récepteurs avec une grande sensibilité.

Description

PROCEDE DE FABRICATION D'UN SUPPORT D'ANALYSE ET UTILISATION POUR LA DETECTION DE TOXINES
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface, au dispositif d'analyse obtenu et à l'utilisation dudit dispositif pour la détection et caractérisation de molécules, en particulier ligands compétitifs des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
La présente invention trouve notamment des applications dans le domaine de la surveillance alimentaire de fruits de mer, dans le domaine de la surveillance des réserves d'eau douce, dans le domaine de la recherche médicale, dans le domaine de l'analyse biologique et de la caractérisation de molécules.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Selon des directives européennes récentes DIRECTIVE 2010/63/UE
[1], le «Test souris», qui était et le seul test officiel utilisé pour la surveillance de toxines marines, doit être remplacé par des méthodes fonctionnelles préalablement validées. Particulièrement en France, le « Test souris » a été remplacé par des méthodes physico-chimiques pour la surveillance sanitaire de fruits de mer à partir de l'année 2010 (Clôture des Assises de la conchyliculture (15/10/2010). Discours de Bruno Le Maire, Ministre de l'Alimentation, de l'Agriculture et de la Pêche)(http://agriculture.gouv.fr/cloture-des-assises-de-la). [2]. Les efflorescences de dinoflagellés marins lorsqu'elles sont dominées par une espèce toxique représentent un danger pour l'écosystème marin, les activités commerciales et la santé publique.
En effet, les phycotoxines des dinoflagellés peuvent être accumulées par des mollusques et des poissons et par transport vectoriel peuvent atteindre l'homme (Fleming LE, Broad K, Clément A, Dewailly E, Elmir S, Knap A, Pomponi SA, Smith S, Gabriele HS, Walsh P (2006) Océans and human health: Emerging public health risks in the marine environment. Mar. Pollut. Bull., 53: 545-560 [3], Molgô J, Girard E, Benoit, E. (2007) Cyclic imines: an insight into this emerging group of bioactive marine toxins. In Phycotoxins: Chemistry and Biochemistry (Botana, L. M., ed) pp. 319-335, Blackwell Publishing Ltd, lowa. [4]). En 2005, le Réseau de Surveillance Phytoplanctonique a détecté grâce au « Test souris » des mollusques contaminés avec des neurotoxines inconnues à partir des échantillons du bassin d'Arcachon. En conséquence l'Etat Français a décrété l'interdiction de la consommation d'huîtres et de coquillages du bassin d'Arcachon et a dû débloquer 2,5 millions d'euros d'aide en faveur de l'Industrie Conchylicole de la Région d'Arcachon, FRANCE. Plus tard, du spirolide A et du 13-desméthyl spirolide-C, toxines produites par le dinoflagellé Alexandrium ostenfeldii, ont été détectées dans des huîtres et des moules du bassin d'Arcachon (Amzil Z, Sibat M, Royer F, Masson N, Abadie E. (2007) Report on the first détection of pectenotoxin-2, spirolide-A and their derivatives in French shellfish. Mar. Drugs 5: 168-179.) [5].
Dans le cadre du programme ANR NEUROSPIROIMINE (Programme de Recherche financé par l'Agence Nationale de la
Recherche (PCV07-194417-Neurospiroimine)) le mécanisme d'action des imines cycliques de la famille des spirolides et des gymnodimines a été établi (Bourne Y, Radic Z, Arâoz R, Talley TT, Benoit E, Servent D, Taylor P, Molgô J, Marchot P. (2010) Structural déterminants in phycotoxins and AChBP conferring high affinity binding and nicotinic AChR antagonism.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107: 6076-6081 .[6]). Les neurotoxines de la famille des spirolides, gymnodimines et pinnatoxines sont des puissants antagonistes des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh) de type musculaire et neuronal possédant des affinités dans l'ordre picomolaire et nanomolaire (Bourne Y, Radie Z, Arâoz R, Talley TT, Benoit E, Servent D, Taylor P, Molgô J, Marchot P. (2010) Structural déterminants in phycotoxins and AChBP conferring high affinity binding and nicotinic AChR antagonism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107: 6076- 6081 . [6], Kharrat R, Servent D, Girard E, Ouanounou G, Amar M, Marrouchi R, Benoit E, Molgô J. (2008) The marine phycotoxin gymnodimine targets muscular and neuronal nicotinic acetyleholine receptor subtypes with high affinity. J. Neurochem. 107, 952-963. [7], Arâoz R, Servent D, Molgô J, lorga Bl, Fruchart-Gaillard C, Benoit E, Gu Z, Stivala C, Zakarian A. (201 1 ) Total synthesis of pinnatoxins A and G and revision of the mode of action of pinnatoxin A. J. Am. Chem. Soc. 133, 10499-1051 1 . [8]).
Les procédés actuels de détection des toxines dans l'industrie conchylicole, c'est-à-dire de phycotoxines marines sont principalement :
- le « Test souris » qui doit, de part l'évolution des règlements européen, être remplacé par un test n'utilisant pas d'animaux. Actuellement en France, le « Test souris » est seulement utilisé dans le cadre de la vigilance sanitaire de coquillages (Clôture des Assises de la conchyliculture (15/10/2010). Discours de Bruno Le Maire, Ministre de l'Alimentation, de l'Agriculture et de la
Pêche)(http://agriculture.gouv.fr/cloture-des-assises-de-la). [2]). De plus ce test est difficile à mettre en œuvre et nécessite des infrastructures importantes (i.e. animalerie) pour sa mise en œuvre. En outre, les professionnels de la conchyliculture remettent en cause de la validité de ce test et contestent les résultats obtenus.
- la chromatographie liquide de haute performance (« High Performance Liquid Chromatography » (HPLC)). Cette méthode est onéreuse nécessitant des appareils importants et coûteux et peu sensible. - HPLC couplée à la Spectrométrie de Masse (LC-MS). Cette méthode est onéreuse nécessitant des appareils importants et coûteux et des personnels qualifiés afin de les utiliser. Malgré sa haute sensibilité et spécificité, cette méthode nécessite des toxines standards pour calibrer l'appareil pour leur détection. En plus, la méthode LC-MS est d'utilisation limité dans le cadre de la détection des toxines non-connues. Depuis 2010, la LC-MS est la méthode officielle pour la détection ou la surveillance de phycotoxines marines qui sont sujet à réglementation en France, reléguant ainsi le Test souris au rôle de vigilance sanitaire des fruits de mer (Clôture des Assises de la conchyliculture (15/10/2010). Discours de Bruno Le Maire, Ministre de l'Alimentation, de l'Agriculture et de la Pêche)(http://agriculture.gouv.fr/cloture-des-assises-de-la). [2]). Toutefois, la méthode LC-MS ne permet pas et ne peut pas être appliquée pour la détection des nouvelles toxines.
II existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un dispositif simple et peu onéreux, par exemple un test fonctionnel permettant la détection de toxines, en particulier de neurotoxines, par exemple des phycotoxines de la famille des imines cyclisées, par exemple des gymnodimines, spirolides, pinnatoxines, pteriatoxines, prorocentrolides et spiro-prorocentrimine ou de nouvelles toxines, par exemple la pinnamine, agissant sur les RnACh, par exemple pour la surveillance de phytoplancton neurotoxique pour l'industrie conchylicole ou la qualité des eaux de baignade dans les plages pour le tourisme, ainsi que pour la surveillance de fruits de mer contaminés
De même, la prolifération de cyanobactéries dans les réserves d'eau douce constitue un danger potentiel pour la santé publique. En effet, des espèces de cyanobactéries peuvent produire des neurotoxines, il peut s'agir par exemple des espèces toxiques du genre Anabaena, Oscillatoria ou autres produisant de l'anatoxine-a ou homoanatoxine-a (Sivonen K, Jones G. (1999) Cyanobacterial toxins. In Toxic cyanobacteria in water: a guide to their public heaith conséquences, monitoring and management (Chorus, I., ed) pp. 41-1 1 1 , Bartram, J. E. & F.N. Spon, London. [9]). Certes, de nombreux épisodes d'envenimement de chiens ayant bu de l'eau à fort contenu en cyanobactéries produisant de l'anatoxine-a et de l'homoanatoxine-a, puissants agonistes des RnACh, se sont produits en France dans des fleuves-comme La Loue (2003) et Le Tarn (2002, 2003 et 2005) (Gugger M, Lenoir S, Berger C, Ledreux A, Druart JC, Humbert JF, Guette C, Bernard C. (2005) First report in a river in France of the benthic cyanobacterium Phormidium favosum producing anatoxin-a associated with dog neurotoxicosis. Toxicon 45, 919-928. [10], Cadel-Six S. Peyraud- Thomas C, Brient L, Tandeau de Marsac N, Rippka R, Mejean A. (2007) Différent génotypes of anatoxin-producing cyanobacteria coexist in the Tarn River, France. Applied and Environmental Microbiology 73, 7605- 7614. [11]).
Les procédés actuels de détection des neurotoxines de cyanobactéries sont principalement :
- HPLC : cette méthode est onéreuse nécessitant des appareils importants et coûteux et peu sensible.
- HPLC couplée à la Spectrométrie de Masse (LC-MS). Cette méthode est onéreuse et nécessite des appareils importants et coûteux ainsi que des personnels qualifiés afin de les utiliser.
Il existe également dans l'état de la technique des procédés de détection en solution de composés tel que le 13, 19 didesmethyl spirolide C, la gymnodimine A et le 13-desmethyl spirolide C (Fonfria et coll. « détection of 13,19 didesmethyl spirolide C by fluorescense polarization using torpédo electrocyte membranes » Analytical Biochemistry, Vol 403:
1 -2, 2010, p 102-107) [12], Vilariho et coll. « détection of gymnodimine-A and 13-desmethyl spirolide C phycotoxins by fluorescense polarization », Analytical Chemistry , Vol 81 : 7, p 2708-2714 [13]; ou de l'anatoxine-a et de l'homoanatoxine-a de cyanobactéries (Arâoz et coll. « A non radioactive ligand-binding assay for détection of cyanobacterial anatoxins using torpédo electrocytes membranes », Toxicon, Vol 52:1 , p 163-174 [14]). Toutefois, ces procédés ont des sensibilités de détection faibles et nécessitent pour la détection desdits composés l'utilisation d'appareils importants, tel que des fluoromètres à polarisation, et des détecteurs de chimiluminescence coûteux et complexes nécessitant ainsi du personnels qualifiés pour leur mise en œuvre et utilisation.
Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un dispositif, en particulier un dispositif simple et peu onéreux, par exemple un test fonctionnel, permettant d'identifier des toxines de cyanobactéries agissant sur les RnACh, par exemple afin de contrôler la qualité des eaux de reserves d'eau douce, la surveillance des suppléments alimentaires à base de cyanobactéries, la qualité des eaux de baignade, permettant de réduire les coûts, le temps de mise en œuvre et d'améliorer la fiabilité des résultats obtenus.
Description de l'invention
La présente invention permet de résoudre et de surmonter les obstacles et inconvénients de l'art antérieur précités en fournissant un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface comprenant les étapes de :
a. Isolement des membranes de cellules électrocytes de Torpille,
b. Fragmentation desdites membranes isolées,
c. Incorporation des fragments membranaires obtenus à l'étape b) dans une solution de pH compris de 6,5 à 10 d. Fixation desdits fragments membranaires à la surface du dispositif.
Selon l'invention, par cellules électrocytes on entend des cellules musculaires modifiées ayant perdu leur capacité de contraction et qui se sont spécialisées à générer de l'électricité. Les électrocytes peuvent être issues de l'organe électrique de poissons électriques, par exemple des espèces de la famille Torpedinidae comme les Torpilles, ou de la famille Electrophoridae comme l'anguille électrique (Electrophorus electricus).
Selon l'invention, les cellules peuvent être des cellules issues de l'organe électrique de Torpilles. Par exemple des electrocytes de Torpilles choisies dans le groupe comprenant Torpédo adenensis, Torpédo alexandrinsis ou Torpille alexandrine, Torpédo andersoni ou Torpille de Floride, Torpédo bauchotae, Torpédo californica ou Raie électrique du Pacifique, Torpédo fairchildi, Torpédo fuscomaculata, Torpédo mackayana, Torpédo macneilli, Torpédo marmorata ou Raie électrique marbrée ou Torpille marbrée, Torpédo microdiscus, Torpédo nobiliana ou Raie électrique de l'Atlantique, Torpédo panthera ou Torpille panthère, Torpédo peruana, Torpédo semipelagica, Torpédo sinuspersici, Torpédo suessii, Torpédo tokionis, Torpédo torpédo ou Torpille commune, Torpédo tremens. De préférence les cellules utilisées sont des cellules de Torpédo marmorate ou Torpédo californica.
Selon l'invention l'étape d'isolement des membranes peut comprendre en outre une étape a'), préalable à l'étape a) de prélèvement du tissu électrique de Torpille. Cette étape de prélèvement du tissu électrique de Torpille peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple, du procédé décrit dans le document Morel et coll. (1985)Morel N, Marsal J, Manaranche R, Lazereg S, Mazie JC, Israël M (1985). Large-scale purification of presynaptic plasma membranes from Torpédo marmorata electric organ. J. Cell Biol.,101 : 1757-1762. [15]. Il peut s'agir d'un procédé comprenant, une fois la Torpille endormie sur une couche de glace, par exemple en déposant le poisson sur ladite couche pendant environ 20 min, deux incisions au niveau des zones latérales du crâne sont pratiqués à l'aide d'un bistouri pour couper les 4 nerfs principaux qui relient chaque organe électrique avec le lobus electricus situé en derrière le cerebellum du poisson. Les deux organes électriques, une fois prélevés sont trempés dans une solution tampon, comprenant par exemple 280 mM de Chlorure de Sodium (NaCI), 3 mM de chlorure de potassium (KCI), 1 ,8 mM de chlorure de Magnésium (MgC^), 3,4 mM de chlorure de calcium (CaCy, 5 mM de bicarbonate de sodium NaHCO3, 1 ,2 mM de tampon phosphate, 5,5 mM de glucose, 300 mM d'urée et 100 mM de sucrose.
Selon l'invention le procédé peut comprendre en outre une étape a"), préalable à l'étape a) de préparation du tissu électrique de Torpille obtenu à l'étape a').
Selon l'invention, la préparation peut être réalisée, par exemple par immersion du tissu électrique prélevé dans une solution d'extraction, par exemple un tampon d'extraction de membranes d'électrocytes (TEME) comprenant 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 3 mM de EDTA, 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylène glycol (EGTA) et des inhibiteurs de protéases.
Le tissu peut être ensuite découpé finement, par exemple à une épaisseur de 1 à 5 mm à l'aide d'un bistouri et immergé dans une solution fraîchement préparée, par exemple le tampon TEME comprenant 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 3 mM de EDTA, 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylène glycol (EGTA) et des inhibiteurs de protéases.
Selon l'invention, la solution d'immersion peut être préparée extemporanément, par exemple dans la journée, par exemple 10 heures avant, par exemple 5 heures avant, par exemple 2 heures avant.
Selon l'invention, l'étape d'isolement de membranes à partir des organes électrique prélevés et préparés comme décrit préalablement peut être réalisée par sédimentation, par exemple dans un gradient discontinu de sucrose, par exemple selon le procédé décrit dans le document Hill et coll. (1991 )Hill JA, Nghiêm H-O & Changeux J-P (1991 ). Serine-specific phosphorylation of nicotinic receptor associated 43K protein. Biochemistry, 30, 5579-5585. [16] ou Vilariho et coll. (2009) Vilariho N, Fonfria ES, Molgô J, Arâoz R, Botana LM (2009). Détection of Gymnodimine-A and 13- Desmethyl C Spirolide Phycotoxins by Fluorescence Polarization.
Analytical Chemistry, 81 : 2708-2714. [13]. Par exemple un tissue préparé, par exemple tel que décrit dans l'étape a"), est homogénéisé dans un tampon, par exemple du TEME tel que défini précédemment à l'aide d'un broyeur à couteaux, puis la fraction membranaire totale est précipitée par centrifugation, par exemple à 20,000 tours par minute et reprise dans un tampon, par exemple du TEME, contenant 10 à 45% de sucrose, de préférence 35% de sucrose. Le gradient discontinu de sucrose peut être réalisé, par exemple avec, par exemple deux solutions de sucrose de 60 à 10% préparées dans le tampon TEME en poids par rapport au poids total de la solution, par exemple de solution à 60 et 20%, à 30 et 50 %, à 35 et 45 % de sucrose. Selon l'invention, une des solutions de sucrose peut comprendre les membranes totales d'électrocytes de Torpille. Par exemple, il peut s'agir de deux solutions de sucrose à 35% et à 45%, la solution à 35% de sucrose contenant les membranes totales d'électrocytes de Torpille. Après ultracentrifugation, les membranes d'électrocytes sédimentent à l'interphase entre les solutions de sucrose à 35% et à 45% d'où elles sont récupérées et lavées par ultracentrifugation, par exemple de 20,000 à 40,000, de préférence à 40,000 tours par minute dans du tampon glycine 5 mM.
Dans un autre mode de réalisation, après ultracentrifugation, par exemple de 20,000 à 40,000, de préférence à 40,000 tours par minute pendant par exemple de 1 à 5 heures, de préférence pendant 3 h, les membranes d'électrocytes sédimentent à l'interphase entre les solutions de sucrose à 35% et à 45% d'où elles sont récupérées et lavées par ultracentrifugation, par exemple de 20,000 à 40,000, de préférence à 40,000 tours par minute pendant par exemple de 1 à 60 minutes, de préférence de pendant 30 min dans du tampon glycine 5 mM.
Selon l'invention les membranes de Torpilles peuvent être des membranes de cellules électrocytes, de préférence sont préparées à partir de cellules électrocytes de Torpilles indiquées précédemment.
Les membranes d'électrocyte de Torpille sont des membranes comprenant des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh), en particulier des récepteurs de type musculaire qui sont constitués par deux sous-unités alpha 1 , une sous-unité beta 1 , une sous-unité gamma et une sous-unité delta (αΐ 2βγδ) (Changeux JP (2010). Allosteric receptors: from electric organ to cognition. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 50: 1 -38 [17]).
Les membranes d'électrocyte de Torpille sont riches en RnACh, représentant de 10 à 60%, de 20 à 60%, de préférence de 20 à 40% de la concentration totale de protéines.
Selon l'invention la fragmentation des membranes d'électrocyte peut être réalisée par fragmentation mécanique, par exemple à l'aide d'un broyeur, par exemple un broyeur en verre, par exemple un broyeur en verre de borosilicate de type Potter-Elvehjem avec piston en Téflon, par fragmentation aux ultrasons, par exemple par sonication. De préférence, le broyeur est un broyeur en verre de borosilicate de type Potter Elvehjem avec un piston en Téflon, par exemple dans du tampon glycine de 1 à 10 mM, de préférence 5 mM glycine. Avantageusement l'utilisation d'un broyeur verre/ téflon permet de préserver la fonctionnalité des RnACh.
Selon l'invention la préparation des solutions stock des fragments membranaires peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier, il peut s'agir par exemple d'une mise en solution des fragments isolées selon le procédé décrit précédemment, par exemple avec un Potter-Elvehjem, dans une solution comprenant de 1 à 10 mM de glycine, de préférence 5 mM glycine.
Selon l'invention, la concentration en protéine de la solution stock des fragments membranaire d'électrocyte de Torpille peut être par exemple de 0,5 à 10 mg/ml. Selon l'invention, la concentration de protéine totale des membranes de Torpille peut être ajustée par exemple à une concentration de 0,5 à 5, de 1 à 4, de 1 ,5 à 3,5, de préférence de 2,5 à 3.5 mg/ml de protéine.
Selon l'invention la solution comprenant les fragments membranaires pour le recouvrement (« coating ») des plaques, peut être une solution de pH compris entre 6,5 à 10, cette solution correspond à la solution dans laquelle sont incorporés les fragments membranaires. Il peut s'agir par exemple d'une solution tampon tris salin (TBS) comprenant 150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI ou Tris, pH 7,5, d'une solution tampon phosphate salin (PBS) comprenant 130 mM chlorure de sodium, 10 mM sodium phosphate, pH 7,0 ou une solution tampon carbonate/bicarbonate comprenant 150 mM chlorure de sodium, 100 mM sodium carbonate, pH 9,5.
Avantageusement, le pH de la solution comprenant les fragments membranaires pour le recouvrement (« coating ») permet de favoriser l'interaction entre le ligand et le RnACh. En outre, le pH de la solution de recouvrement permet avantageusement de stabiliser les fragments membranaires et que les membranes fixées soient biologiquement actives.
Selon l'invention la concentration de protéine totale dans ladite solution de recouvrement de pH compris de 6,5 à 10 peut être comprise entre 5 à 200 Mg/ml.
Selon l'invention, la force ionique de la solution comprenant les fragments membranaires pour le recouvrement (« coating ») des plaques peut être de 0,1 à 0,7, de préférence de 0,16 à 0,42.
Selon l'invention, le calcul de la force ionique de la solution peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier. Par exemple, il peut s'agir du résultat obtenu à partir de la formule (I) suivante :
où, z, représente la charge de l'ion /' présente dans ladite solution à une concentration molaire [X/].
Avantageusement, la force ionique de la solution comprenant les fragments membranaires pour le recouvrement (« coating ») favorise l'interaction entre le ligand et le RnACh. En outre, la force ionique de la solution de recouvrement permet avantageusement de stabiliser les fragments membranaires et que les membranes fixées soient biologiquement actives.
Selon l'invention, la fixation des fragments de membranes peut être réalisée par exemple par interaction non-covalente et non-ionique entre les fragments membranaires et la surface.
Selon l'invention, le procédé de l'invention peut comprendre préalablement à l'étape d) de fixation une étape c') de dilution des fragments membranaires dans une solution.
Selon l'invention la dilution peut être réalisée par exemple dans une solution physiologique, par exemple une solution saline, par exemple d'une solution tampon tris salin (TBS) comprenant 150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, d'une solution tampon phosphate salin (PBS) comprenant 130 mM chlorure de sodium, 10 mM sodium phosphate, pH 7,0 ou une solution tampon carbonate/bicarbonate comprenant 150 mM chlorure de sodium, 100 mM sodium carbonate, pH 9,5.
Selon l'invention, le dispositif peut être tout dispositif connu de l'homme du métier pour la fixation de molécules biologiques, par exemple, il peut s'agir d'un dispositif dont la surface est en plastique. Il peut s'agir, par exemple d'une plaque multipuits, par exemple une plaque de 6, 12, 24, 48, 96, 384 puits, de préférence 96 ou 384 puits, une plaque de 4, 8 ou 12 puits ou des barrettes à 6, 8 ou 12 puits. Il peut s'agir, par exemple, d'une plaque ELISA, une plaque de haute adhérence pour les molécules polaires, par exemple des plaques de type NUNC Polysorp™ (marque de commerce), Medisorp™ (marque de commerce), Maxisorp™ (marque de commerce), ou Multisorp™ (marque de commerce). Il peut s'agir par exemple de plaques à haute adhérence pour des glycoprotéines (la liste de microplaques n'est pas limitative).
De préférence, la plaque est une plaque Maxisorp™ (marque de commerce). Avantageusement la plaque Maxisorp™ (marque de commerce) dispose en plus de groupes hydrophobes, de beaucoup groupes hydrophyles augmentant sa capacité à établir des liaisons d'hydrogène en plus des interactions de type van der Waals (Esser P (2010). Principles in Adsorption to Polystyrène. Technical Bulletin: 06a. Thermo Fisher Scientific Inc. [18]).
Selon l'invention, lorsque qu'une plaque multipuits est utilisée, la quantité de protéine des fragments membranaires peut être de 0,5 à 5 g de protéine par puits, par exemple de 1 à 2 g de protéine par puits, de 1 à 1 ,5 μg de protéine par puits
Selon l'invention, le procédé peut être mis en œuvre, par exemple avec des solutions stock de membranes d'électrocyte de Torpille.
Selon l'invention, le procédé peut être mis en œuvre avec des solutions stock préalablement obtenues par exemple, par mise en œuvre des étapes a) à c) du procédé de l'invention.
Selon l'invention la solution stock peut être toute solution connue de l'homme du métier adaptée à la conservation de fragments de membrane, par exemple une solution physiologique, par exemple du TBS, du PBS, une solution de glycine, par exemple une solution de glycine à une concentration de 1 mM à 10 mM, de 3 à 8 mM, de préférence 5 mM.
Dans ce cas, le procédé de l'invention comprend l'étape d) de fixation des membranes à partir de solutions stocks.
Selon l'invention les solutions stock peuvent être préalablement aliquotées, par exemple il peut s'agir de solutions de volume de 10 μΙ à 1 ml, par exemple de 100 μΙ à 500 μΙ, de préférence de 500 μΙ.
Selon l'invention la concentration de protéines dans la solution stock peut être comprise entre 0,5 à 5, de 1 à 4, de 1 ,5 à 3,5 mg/ml, de préférence de 2,5 à 3,5 mg/ml de protéine.
Avantageusement la concentration de protéine permet d'éviter notamment la décongélation/ congélation répétitive des échantillons membranaires et ainsi préserve la fonctionnalité des RnACh.
Avantageusement, la conservation des fragments membranaires d'électrocyte de Torpille en aliquotes permet également d'éviter notamment la décongélation/ congélation répétitive des échantillons membranaires et ainsi préserve la fonctionnalité des RnACh.
Selon l'invention, l'étape d) de fixation peut être réalisée pendant un temps déterminé, par exemple cette étape peut être réalisée pendant au moins 10 minutes, de préférence au moins 60 minutes, par exemple l'étape d) peut être réalisée pendant 1 à 30 heures, par exemple de 1 h à 30 h, de 3h à 24 h, de 6h à 12 h. L'étape d) peut être également réalisée pendant toute une nuit, par exemple pendant de 16 à 18 heures
Avantageusement la durée de l'étape d) permet de stabiliser la fixation des fragments membranaires d'électrocyte de Torpille sur la surface des puits augmentant ainsi la sensibilité de détection du dispositif. Cette stabilisation permet avantageusement un transport desdits dispositifs par voie aérienne ou terrestre par exemple en Europe ou vers d'autres continents sans altération de la sensibilité du procédé de la présente invention et de son dispositif de mise en œuvre.
Selon l'invention, lorsqu'une solution stock est utilisée dans le procédé de l'invention, il peut comprendre l'étape c') de dilution de la solution stock.
Selon l'invention la dilution de la solution stock peut être de 50 à 500 fois, de préférence de 100 à 300 fois, de manière encore plus préférée de 200-fois à 250-fois.
Selon l'invention la dilution de la solution peut permettre d'obtenir par exemple une concentration de protéines totale dans les fragments de membrane d'électrocyte de Torpille de 5 g/ml à 200 pg/ml, de préférence de 10 g/ml à 20 g/ml de protéine total par puits.
Selon l'invention la dilution de la solution peut permettre également d'obtenir par exemple une concentration de protéines totale dans les fragments de membrane d'électrocyte de Torpille de 1 g/ml à 200 pg/ml, de préférence de 5 g/ml à 100 g/ml de protéine total par puits. De préférence lorsque le procédé est mis en œuvre avec des solutions stock de membranes d'électrocyte de Torpille, il peut s'agir de solutions stocks diluées comme indiqué précédemment.
La présente invention à également pour objet un dispositif d'analyse obtenu par le procédé selon l'invention.
La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour la détection et la quantification de toxines, par exemple des neurotoxines.
Selon l'invention les neurotoxines peuvent être toute neurotoxines connues de l'homme du métier, par exemple, il peut s'agir de neurotoxines agissant, par exemple sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, de neurotoxines produites par du phytoplankton marin comme certains membres du genre Alexandrium, par exemple Alexandrium ostenfeldii, produisant par exemple du spirolide, des membres du genre Karenia, par exemple Karenia selliformis, produisant par exemple de la gymnodimine, des phycotoxins de la famille des spiroimines par exemple les pinnatoxines, les ptériatoxines, les prorocentrolides ou le spiro- prorocentrimine susceptibles d'être produites par des différents espèces de phytoplancton (Molgô J, Girard E, Benoit, E. (2007) Cyclic imines: an insight into this emerging group of bioactive marine toxins. In Phycotoxins: Chemistry and Biochemistry (Botana, L. M., ed) pp. 319-335, Blackwell Publishing Ltd, lowa. [4]. Il peut s'agir aussi de neurotoxines des cyanobactéries, par exemple l'anatoxine-a, l'homoanatoxine-a, produites par exemple par des membres des genres Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermum, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix et
Raphidiopsis, ou de pinnamine, toxine marine avec une structure chimique très proche de l'anatoxine-a et ou de toute toxine susceptible d'agir sur des RnACh (Arâoz R, Molgô J, Tandeau de Marsac NT (2009) Neurotoxic cyanobacterial toxins. Toxicon 56: 813-828. [19], Molgô J, Girard E, Benoit, E. (2007) Cyclic imines: an insight into this emerging group of bioactive marine toxins. In Phycotoxins: Chemistry and Biochemistry (Botana, L. M., ed) pp. 319-335, Blackwell Publishing Ltd, lowa.[4]).
La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour la détection et la quantification de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour le criblage à haut débit de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
La présente invention permet avantageusement d'augmenter l'efficacité du recouvrement de fragments membranaires de Torpille sur des surfaces, par exemple des microplaques et/ou des barrettes de part, par exemple le choix du pH, de la force ionique desdites solutions et/ou le choix des solutions d'incorporation, des composants desdites solutions de recouvrement. En outre la présente invention tire profit du développement de la chimie de surface cherchant à maximiser le taux de fixation de protéines par des microplaques en plastique (Esser P (2010). Principles in Adsorption to Polystyrène. Technical Bulletin: 06a. Thermo Fisher Scientific Inc. [18]). En outre, l'augmentation de la fixation, par exemple sur des plaques Maxisorp™ peut impliquer la chimie des surfaces des dites plaques et la nature macromoléculaire des membranes de Torpille. En effet, les fragments membranaires d'électrocytes de Torpille sont des mélanges de lipides (membranes) et de protéines, dont le RnACh peut représenter jusqu'à 40% de la concentration totale de protéine. En plus, les RnACh sont des protéines fortement glycosylées (7,5%) (Da Costa CJB, Kaiser DEE, Baenziger JE (2005). Rôle of Glycosylation and Membrane
Environment in Nicotinic Acetylcholine Receptor Stability. Biophys J, 88, 1755-1764.) [20], ce qui renforce ainsi l'efficacité de la fixation et du recouvrement de la surface, par exemple de plaques Maxisorp™ de part les interactions non-covalentes et la formation de pont d'hydrogène entre les membranes d'électrocyte riche en RnACh et la surface. Avantageusement, dans la présente invention, la fixation de membranes de cellules électrocytes riches en RnACh permet la détection de quantités faibles, par exemple de l'ordre du nanogramme voir du picogramme, de substances, par exemple de neurotoxines telles qu'indiquées précédemment.
La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour la purification et caractérisation physico-chimique de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
Avantageusement, le présent dispositif peut également être utilisé afin de purifier et identifier des ligands des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh).
Avantageusement, la forte adhésion des fragments membranaires d'électrocytes de Torpille sur la surface des plaques telles que définies ci- dessus, par exemple les plaques de type Maxisorp™ (marque de commerce), ou de plaques à haute adhérence pour des glycoprotéines et membranes à forte concentration de protéine, permet de fixer et piéger au moins un ou plusieurs ligands interagissant avec les RnACh de Torpille.
La récupération du ou des ligands fixés peut être réalisée par exemple, après lavage du dispositif selon l'invention avec un tampon de lavage, par exemple du tampon salin Tris (TBS) contenant 0,1 % Tween 20, via une étape d'élution avec une solution d'élution, par exemple du méthanol dans le cas de molécules lipophiles tels que les imines cyclisées ou en employant d'autres tampons à force ionique, pH et concentration en détergent déterminés par l'homme du métier qui puissent libérer les ligands du RnACh de Torpille.
Une fois les ligands élués, leur nature chimique peut être déterminée rapidement, par exemple dans un temps d'environ 5 minutes, par exemple à l'aide de la spectrométrie de masse, de type MALDI-TOF- MS et/ou tout procédé connu de l'homme du métier.
Avantageusement, selon l'invention les fragments membranaires d'électrocyte de Torpille n'ont pas besoin d'être chimiquement modifiées pour se fixer fortement sur la surface des plaques. La présente invention permet donc avantageusement la fixation des fragments membranaires sans modification structurelle préalable et permet avantageusement de ne pas dénaturer, ni altérer les propriétés biologiques desdits fragments membranaires.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures
La figure 1 représente un schéma de l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. Le schéma représente les différentes étapes du procédé : (1 ) recouvrement des puits de microplaque avec des membranes d'électrocytes de Torpille riches en récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh), (2) blocage des surfaces plastique non liées, (3) incubation des membranes de Torpille immobilisées sur la paroi des puits avec une solution test (soit de la toxine standard ou soit de l'extrait des fruits de mer) (4) Déplacement compétitive du ligand lié au récepteur par de la Biotine-a-bungarotoxine (Biotine-a- BgTx). (5) lavage. (6) Incubation avec la streptavidine couplée à la peroxydase de raifort (HRP-streptavidine), (7) lavage, (8) détection colorimétrique du complexe HRP-streptavidine - Biotine-a-BgTx - RnACh. 9) lecture de la plaque ELISA et analyse des données. Abréviations : R = RnACh, SPX = 13-desméthyl spirolide Cl 13-19 didesméthyl spitolide C, GYM = gymnodimine A, Biotine-a-BgTx = biotine-a-bungarotoxine, E =
HRP-streptavidine.
La figure 2 représente des courbes de standardisation de l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA.
La figure 2 A représente des courbes de saturation de la liaison entre de la Biotine-a-BgTx et les RnACh d'électrocytes de Torpille en employant des solutions 500-fois diluées de membrane (-A-), 200-fois diluées de membrane (-♦-), 100-fois diluées de membrane (-·-) et 50-fois diluées de membrane (-♦-). Chaque dilution a été réalisée dans du tampon salin Tris (TBS). Les membranes ont été incubées pendant une nuit avec différentes concentrations de Biotine-a-BgTx (5 x 10"12 M to 5 x 10"6 M) afin de déterminer la constante d'affinité de la Biotine-a-BgTx pour le RnACh de Torpille.
La figure 2 B est un diagramme représentant la détermination de la concentration de traceur (biotine-a-BgTx) pour la méthode. Les puits de microplaques ayant été recouverts avec une solution de membranes d'électrocytes de Torpille diluées 200 fois dans du tampon TBS ont été incubé avec différentes concentrations de biotine-a-BgTx: 2 x 10"9 M (-▼-),
6 x 10"9 M (-¥-), 1 x 10"8 M (-m-), 4 x 10"8 M (-B-), 8 x 10"8 M (→-) et 2 x 10"
7 M (-©-) pendant 0, 0,5, 1 , 1 ,5 et 2 h. L'abscisse représente le temps d'incubation en heures (h) et l'ordonnée la densité optique mesurée à une longueur d'onde de 492nm (DO492nm)-
La figure 2 C est un diagramme représentant la détermination de la dilution de membranes d'électrocyte de Torpille pour l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. Différentes dilutions de membrane d'électrocyte de Torpille (10 à 5000 fois diluées) ont été incubées pendant la nuit avec 8 x 10"8 M de biotine-a- BgTx. L'abscisse représente la dilution des membranes (1 /X) et l'ordonnée la densité optique mesurée à une longueur d'onde de 492nm (DO492nm)- Toutes les expériences ont été réalisées au moins deux fois. Chaque point de la courbe représente la valeur moyenne ± écart moyen (n = 3).
- La figure 3 représente l'inhibition compétitive de la liaison biotine-a-
BgTx avec le RnACh de Torpille par de α-bungarotoxine et des phycotoxines portant des imines cyclisées.
La figure 3 A est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par de la α-BgTx standard et par la phycotoxine 13- desméthyl spirolide C. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche est représentée la concentration de α-BgTx / (puits): 3,3 x 10"6 (A1 - A3), 1 ,1 x 10"6 (B1 -B3), 3,7 x 10"7 (C1 -C3), 1 ,2 x 10"7 (D1 -D3), 4.1 x 10"8 (E1 -E3), 1 ,4 x 10"8 (F1 -F3), 4,6 x 10"9 (G1 -G3), 1 ,5 x 10"9 (A4-A6), 5,1 x 10" 10 (B4-B6), 1 ,7 x 10"10 (C4-C6), 5,7 x 10"1 1 (D4-D6), 1 ,9 x 10"1 1 (E4-E6), 6,2 x 10"12 (F4-F6) et 2,09 x 10"12 M a-BgTx. (G4-G6). Sur la partie droite: concentration de 13-desméthyl SPX C / (puits) : 3,3 x 10"7 (A7-A9), 1 ,1 x 10"7 (B7-B9), 3,7 x 10"8 (C7-C9), 1 ,2 x 10"8 (D7-D9), 4,1 x 10"9 (E7-E9), 1 ,4 x 10"9 (F7-F9), 4,6 x 10"10 (G7-G9), 1 ,5 x 10"10 (A10-A12), 5,1 x 10"1 1 (B10- B12), 1 ,7 x 10"1 1 (C10-C12), 5,7 x 10"12 (D10-D12), 1 ,9 x 10"12 (E10-E12), 6,2 x 10"13 (F10-F12) et 2,1 x 10"13 M 13-desméthyl SPX C (G10-G12). La α-BgTx et 13-desméthyl SPX C inhibent de façon compétitive et dose dépendante, mais dans une ampleur différente, la liaison de la biotine-â- BgTx au RnACh des membranes de Torpille immobilisées. Le signal plaque est le contrôle négatif : puits sans recouvrement par les membranes. 100% signal est le contrôle positif: il s'agit de puits dans lesquels des membranes de Torpille ont été mises en absence de toxines ou d'échantillons d'extrait.
La figure 3 B est un diagramme représentant l'inhibition dose- dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille immobilisées en utilisant l'essai de déplacement de la liaison ligand- récepteur sur microplaque de type ELISA par a-BgTx (-+-), le 13-19- didesméthyl spirolide C (-©-), le 13-desméthyl spirolide C (-·-) et par la gymnodimine A (-B-). Des expériences indépendantes ont été réalisées au moins trois fois. Chaque point représente la valeur moyenne ± écart moyen (n = 3). L'abscisse représente la concentration de toxine (M) et l'ordonnée le pourcentage d'inhibition.
La figure 4 représente l'inhibition compétitive de la liaison biotine-a- BgTx avec le RnACh de Torpille par des phycotoxines portant des imines cyclisées et des extraits de fruits de mer témoins et contaminés.
- La figure 4 A est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par du 13-desméthyl SPX C et des extraits de fruit de mer contaminés avec ladite toxine et des extraits témoins. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche : concentration de 13- desméthyl spirolide (puits) : 1 ,7 x 10"5: (A1 -A3), 5,6 x 10"6: (B1 -B3), 1 ,9 x 10"6: (C1 -C3), 6,2 x 10"7: (D1 -D3), 2,1 x 10"7: (E1 -E3), 6,9 x 10"8: (F1 -F3), 2,3 x 10"8: (G1 -G3), 7,6 x 10"9: (A4-A6), 2,5 x 10"9: (B4-B6), 8,5 x 10"10: (C4-C6), 2,8 x 10"10: (D4-D6), 9,4 x 10"11 : (E4-E6), 3,1 x 10"1 1 : (F4-F6) et 1 ,0 x 10"11 M 13-SPX-C: (G4-G6). Sur la partie droite est représentée la concentration de 13-desméthyl spirolide de 3,5 x 10"12 M (A7-A9) et les extraits de fruits de mer. Extraits de fruit de mer dopés avec du 13- desméthyl spirolide C-dilution : (puits). Amandes-D2oo: (B7-B9), amandes- D400: (C7-C9), huitres-D20o: (D7-D9), huitres-D400: (E7-E9), moules-D20o: (F7-F9), moules-D400: (G7-G9), coquilles Saint-Jacques-D20o: (A10-A12) et coquilles Saint-Jacques-D 0o: (B10-B12). Extraits témoins de fruit de mer- dilution: (puits). Amandes témoins-D20o: (C10-C12), huîtres témoins-D20o: (D10-D12), moules témoins-D20o: (E10-E12), coquilles Saint-Jacques témoins-D20o: (F10-F12) et coquilles Saint-Jacques témoins-D40o: (G10- G12). Signal plaque: puits contrôles négatifs incubées sans recouvrement par une membrane (H1 -H3); signal 100%: puits contrôles positifs dans lesquels des membranes de Torpilles ont été incubées sans toxines ou sans extrait (H4-H9); 100% inhibition : puits comprenant des membranes de Torpilles incubés avec 1 x 10"5 M de α-BgTx (H10-H12).
La figure 4 B est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par de la gymnodimine-A, des extraits de fruit de mer contaminés avec ladite toxine et des extraits témoins. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche : concentration de gymnodimine-A (puits) : 1 ,7 x 10"5: (A1 -A3), 5,6 x 10"6: (B1 -B3), 1 ,9 x 10"6: (C1 -C3), 6,2 x 10"7: (D1 -D3), 2,1 x 10"7: (E1 -E3), 6,9 x 10"8: (F1 -F3), 2,3 x 10"8: (G1 -G3), 7,6 x 10"9: (A4-A6), 2,5 x 10"9: (B4-B6), 8,5 x 10"10: (C4-C6),
2,8 x 10"10: (D4-D6), 9,4 x 10~11 : (E4-E6) et 3,1 x 10"11 M GYM-A: (F4-F6). Extraits d'amandes dopées avec de la GYM A-Dilution: (puits). Amandes- D2oo: (G4-G6). Coté droit: extraits de fruits de mer dopés avec de la GYM A-Dilution: (puits). Amandes-D40o: (A7-A9), huitres-D2oo: (B7-B9), huitres- D40o: (C7-C9), moules-D2oo: (D7-D9), moules-D40o: (E7-E9), coquilles Saint- Jacques-D2oo: (F7-F9) et coquilles Saint-Jacques-D40o: (G7-G9). Extraits témoins de fruit de mer-dilution: (puits). Amandes témoins-D2oo: (H7-H9), amandes témoins-D40o: (A10-A12), huîtres témoins-D20o: (B10-B12), huîtres témoins-D 0o: (C10-C12), moules témoins-D20o: (D10-D12), moules témoins-D40o: (E10-E12), coquilles Saint-Jacques témoins-D20o: (F10-F12) et coquilles Saint-Jacques témoins-D40o: (G10-G12). Signal plaque: (H1 - H3); signal100%: (H4-H6); 100% inhibition : (H10-H12).
La figure 4 C est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par du 13-19 didesméthyl spirolide C, des extraits de fruit de mer contaminés avec ladite toxine et des extraits témoins. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche : Concentration 13-19 didesméthyl spirolide C (puits) : 3,3 x 10"7 M (A1 -A3), 1 ,1 x 10"7 M (B1 -B3), 3,7 x 10"8 M (C1 -C3), 1 ,2 x 10"8 M (D1 -D3), 4,1 x 10"9 M (E1 -E3), 1 ,4 x 10"9 M (F1 -F3), 4,6 x 10"10 M (G1 -G3), 1 ,5 x 10"10 M (A4- A6), 5,1 x 10"11 M (B4-B6), 1 ,7 x 10"11 M (C4-C6), 5,7 x 10"12 M (D4-D6), 1 ,9 x 10"12 M (E4-E6), 6,2 x 10"13 M (F4-F6) et 2,1 x 10"13 M 13-19-SPX C (G4-G6). Coté droit: Extraits de fruits de mer dopés avec du 13-19 didesméthyl spirolide C-Dilution: (puits). Amandes-D20o : (A7-A9), amandes-D400 : (B7-B9), moules-D200 : (C7-C9), moules-D400 : (D7-D9), huitres-D20o : (E7-E9), huitres-D40o : (F7-F9), coquilles Saint Jacques-D20o :
(G7-G9) et coquilles Saint Jacques-D40o : (A10-A12). Extraits témoins de fruit de mer-dilution: (puits). Amandes témoins-D20o: (B10-B12), huîtres témoins-D20o: (C10-C12), moules témoins-D20o: (D10-D12), coquilles Saint- Jacques témoins-D20o: (E10-E12). Extraits des cyanobactéries-Dilution: (puits). PCC 6506-Dioo : (F10-F12) et PCC 101 1 1 -D100 : (G10-G12). Signal plaque: (H1 -H3); signal 100%: (H4-H9); 100% inhibition: (H10-H12). La figure 4D est un diagramme en bâton représentant l'effet matrice. Des homogénats de fruits de mer (amandes = A; huîtres = H; moules = M et coquilles St Jacques = S) ont été dopés avec du 13-19-didesméthyl spirolide C, 13-desméthyl spirolide C et gymnodimine A. Les résultats ont été obtenus avec l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. Les bâtons représentent la valeur moyenne ± erreur type sur la moyenne (n = 3 pour les échantillons dopés et n=9 pour les échantillons de fruit de mer témoins). L'abscisse représente les échantillons testés et l'ordonnée le pourcentage d'inhibition. 13-19-SPX C = 13-19-didesméthyl spirolide C, 13-SPX C = 13-desméthyl spirolide C, GYM = gymnodimine A.
La figure 5 représente le criblage des toxines/ligands compétitifs des RnACh à partir des extraits de cyanobactéries marines en employant l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA avec le pipeteur manuel à 96 cônes.
La figure 5 A est une photographie du pipeteur manuel à 96 cônes montrant les zones de charge et pipetage.
La figure 5 B représente le plan de plaque pour le criblage de toxines/ligands compétitifs des RnACh à partir des extraits de cyanobactéries marines I à VII, en employant comme control positif le 13-
19-SPX C (VIII). SP (signal de plaque), 100% (Signal 100%). BgTx (1 x 10" 6 M α-bungarotoxine : 100% inhibition).
La figure 5 C est une photographie d'une microplaque montrant le criblage de toxines/ligands compétitifs des RnACh à partir des extraits de cyanobactéries marines I à VII testés à trois dilutions : Di0 : première rangé, D100 : deuxième rangé et D1000 troisième rangé. Le rectangle VIII montre sur la même plaque l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par du 13-19 didesméthyl spirolide C : première rangé : 5 X 10"7 M, deuxième rangé : 5 X 10"8 M, troisième rangé : 5 X 10"9 M, quatrième rangé : 5 X 10"10 M, cinquième rangé : 5 X 10"1 1 M, sixième rangé : 5 X 10"12 M et septième rangé : 5 X 10"13 M. Signal plaque: (H1 -H3); signal 100%: (H4-H9); 100% inhibition : (H10-H12).
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédé de détection de l'interaction entre les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh) et des toxines
Produits utilisées
Dans l'exemple ci-dessous, les produits, dispositifs utilisés étaient les suivants :
Les plaques à fonds plats ELISA Maxisorp ont été achetées à la société NUNC (Kamstrupvej, Denmark).
Le tampon de recouvrement était le suivant: tampon tris salin (TBS) (150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI, pH 7.5)
Le tampon de lavage : du TBS contenant 0,1 % Tween 20.
Le tampon de blocage: du TBS contenant 0,5% albumine de sérum bovin (BSA)
Une solution stock 10 fois concentrée de tampon TBS à pH 7 a été préparé et a été autoclavée et conservée à température ambiante, à savoir à 25°C pour préparer lesdits tampons
La α-bungarotoxine biotinylée (Biotin-a-BgTx) a été acheté à la société Molecular Probes (Eugène, OR, USA)
Le mélange d'inhibiteurs de protéase complet (« Protease inhibitors mix Complète ») a été acheté à la société Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). L'albumine de sérum bovin (BSA) provenait de la société Sigma-AIdrich (St. Louis, MO, USA). La streptavidine couplée à la péroxidase a été achetée à la société Sigma-AIdrich. Les tablettes o- Phénylènediamine dihydrochloride ont été achetées à la société DAKO (Glostrup, Dennmark). La α-bungarotoxine a été achetée à la société Sigma-AIdrich. Le 13-Desméthyl spirolide C a été acheté à la société NRC- CNRC (institut de biosciences marine, conseil national de la recherche, Halifax, NS, Canada). La Gymnodimine A a été achetée à la société NRC- CNRC Le 13-19-didesméthyl spirolide C a été acheté à la société CIFGA (Lugo, Spain). L'anatoxin-a provenait de la société TOCRIS (Ellisville, MO, USA)
Protocole :
La figure 1 représente les différentes étapes de mise en œuvre du procédé.
Recouvrement avec les membranes (« Coating »)
Une plaque Elisa à fonds plats de 96 puits NUNC Maxisorp™ a été recouverte avec 100 μΙ par puits de membranes d'électrocyte de Torpille dont la concentration totale de protéine était de 13.5 g/ml dans du tampon de recouvrement TBS (150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5 soit 1 ,35 pg de protéine par puits). Les plaques ont été fermées et incubées à température ambiante (25°C) pendant 2 heures ou toute la nuit à 4°C.
La solution stock de membranes a été dilué 200 fois dans du tampon TBS avant le recouvrement des plaques. Le recouvrement a été effectué avec un pipeteur électronique multicanaux eLINE (Biohit, Helsinki, Finlande) qui a permis d'accélérer le chargement des membranes. Trois puits ont été laissés sans recouvrement avec des membranes pour leur utilisation comme puits contrôle négatif (signal plaque).
Blocage
L'excès de membrane a été éliminé. Le tampon résiduel sur la plaque a été éliminé avec du papier absorbent.
Sans lavage, les puits ont été remplis avec 250 μΙ de tampon de blocage (TBS, 0,5 % BSA) par puits. La plaque a été fermée et incubée pendant une heure à température ambiante, à savoir 25°C.
Les plaques ont été stockées à 4°C pour utilisation ultérieure. Des expériences en parallèles ont été réalisées avec des plaques recouvertes six mois avant et avec des plaques recouvertes le jour précédent : aucune différence significative n'a été observé entre les différentes plaques pour les courbes dose réponse de liaison du ligand (résultats non représentés). Incubation avec les toxines/extraits
Le tampon de blocage a été éliminé et le liquide résiduel sur le haut de la plaque a été absorbé avec un papier absorbant. Sans lavage, les plaques ont été chargées soit avec a) 100 μΙ de toxines standard préparées dans du tampon de blocage ou avec b) 100 μΙ de tampon de blocage contenant jusqu'à 10% d'extraits (volume/volume). Chaque concentration de toxine ou d'échantillon a été testée 3 fois. La plaque a été fermée et incubée pendant trois heures sous agitation constante à température ambiante (25°C), ou sur la nuit à 4°C pour une sensibilité maximale.
Six puits recouvert avec des membranes de Torpille ont été laissés libres de toxine ou d'extrait pour les utiliser comme contrôle négatifs (Signal 100%). En plus, trois puits recouvert avec des membranes de Torpille ont été laissés libres de toxine ou d'extrait pour les utiliser comme contrôle d'inhibition non-spécifique. Lesdits puits sont incubés avec de 1 μΜ α-bungarotoxine (100% inhibition).
La concentration de méthanol a été gardée inférieur à 1 % afin d'éviter toute interférence avec la liaison du ligand au RnACh.
Déplacement de la Biotine-BgTx:
Sans enlever les toxines et/ou les extraits, 50 μΙ de Biotine-a-BgTx
(8 x 10"8 M, concentration finale) a été ajouté dans chaque puits. La plaque a été fermée et l'ensemble a été incubé pendant 30 minutes sous agitation constante à température ambiante (25°C).
Les toxines, extraits ou Biotine-a-BgTx non liés ont été éliminés et les puits ont été lavés trois fois avec 250 μΙ de tampon de lavage (TBS, 0,1 % Tween 20). Le tampon résiduel a été absorbé avec du papier absorbant.
Réaction Straptavidine-Biotine
Une quantité de 100 μΙ de streptavidine couplée à la peroxydase
(diluée 5000 fois, -220 ng/nl protéine, SIGMA) a été ajoutée à chacun des puits avec un pipeteur électronique multicanaux eLINE (marque déposée) (Biohit). La plaque a été fermée et incubée pendant 30 minutes à température ambiante (25°C) sous agitation constante, c'est-à-dire une agitation d'environ 50 tours par minute.
La pipeteur électronique multicanaux permet de minimiser les différences dans les temps d'exposition à la réaction entre la partie biotine du traceur et la partie sptreptavidine de l'enzyme. Cependant, due au fait de la grande affinité entre la biotine et la streptavidine (Kd = 10"14 M), une réaction de 30 minutes assure un effet négligeable lié à la différence du temps d'exposition pour chaque rangé de puits. Le temps de réaction entre la Biotine-a-BgTx et la Streptavidine-péroxidase à été déterminé expérimentalement, à savoir des membranes d'electrocyte de Torpille immobilisées sur des puits de la microplaque Maxisorp™ ont été incubées avec 8 x 10"8 M biotin-a-BgTx pendant 30 minutes à 25°C. Après lavage,
100 μΙ de streptavidine couplée à la peroxydase (diluée 5000-fois) ont été ajouté à chaque puits. Le temps d'incubation a été de 0, 1 , 2,5, 5, 10, 15 et 30 min. Les puits ont été lavés et l'activité peroxidase détecté comme décris ci-dessous.
Détection colorimétrique
L'excès de Streptavidine-péroxidase a été éliminé et les puits ont été lavés trois fois avec 250 μΙ de tampon de lavage (TBS, 0,1 % Tween 20). Le tampon résiduel sur la plaque a été éliminé avec du papier absorbant. Une quantité de 100 μΙ de substrat de peroxydase OPD
(DAKO, Glostrup, Dennmark) a été ajouté à chaque puits avec un pipeteur électronique multicanaux. Lorsqu'une couleur convenable s'est développée, c'est-à-dire après environ 5 minutes d'incubation, la réaction enzymatique a été stoppée en ajoutant 100 μΙ de 0,5 M H2SO4 à chaque puits avec un pipeteur électronique multicanaux.
L'utilisation d'un pipeteur électronique multicanaux permet d'éviter les variations dans le développement de la couleur dues à la différence de temps d'exposition. La solution de stoppage a été ajoutée dans le même ordre que la solution de substrat de la péroxydase (OPD) a été ajoutée afin de minimiser les différences due au temps d'incubation.
Le substrat de la péroxydase (OPD) a été préparé selon les recommandations du fournisseur. Quatre tablettes OPD ont été dissoutes dans 12 ml d'eau déionisée à température ambiante (25°C), suite à quoi après 5 μΙ de 30% de peroxyde d'hydrogène a été ajoutés.
La plaque a été enregistrée avec un lecteur ELISA (Genios Pro, Tecan), à une absorbance de 492 nm (figure 1 ).
Le pourcentage d'inhibition a été calculé selon la formule suivante : Inhibition % = [100 x (signal 100% - signal de l'échantillon) / (signal 100% - (inhibition 100% - signal plaque)]
Le signal 100% a été obtenu dans des puits dans lesquels des membranes de Torpille ont été appliquées et incubées sans toxines/extraits; le signal plaque («plate signal ») a été obtenu des puits dans lesquels le recouvrement avec les membranes de Torpille a été omis. Des expériences indépendantes ont été réalisées au moins deux fois avec des triplicates.
Le pourcentage d'inhibition a été également calculé selon la formule suivante :
Inhibition % = [100 x (signal 100% - signal de l'échantillon) / (signal 100% - inhibition 100%)]
Le signal 100% a été obtenu dans des puits dans lesquels des membranes de Torpille ont été appliquées et incubées sans toxines/extraits; le signal inhibition 100% («inhibition 100%») a été obtenu des puits dans lesquels les membranes de Torpille ont été incubées avec de α-bungarotoxine (1 ou 10 μΜ). Des expériences indépendantes ont été réalisées au moins deux fois avec des triplicates.
Les résultats ont montrées que des antagonistes des RnACh, a savoir : α-bungarotoxine, le 13-desméthyl spirolide C, le 13,19 didiesmethyl spiprolide C, la gymnodimine, le d-Tubocurarine (curare) et des agonistes des RnACh, à savoir : l'anatoxina-a et l'homoanatoxine-a, inhibent l'interaction entre de α-BgTx et le RnACh de Torpille de façon dépendante à leur concentration avec des affinités différentes (figures 3 A, 3 B, 4 A, 4 B et 4 C).
Ce système est aussi utilisable avec de la streptavidine couplé à la phosphatase alcaline en plus de la streptavidine couplé à la peroxydase de raifort, et, comme révélateurs des enzymes des substrats soit produisant une réaction colorimétrique (OPD, Nitro blue tetrazolium chloride), soit une substance décelable par chimioluminescence (ECL +) (Arâoz R, Herdman M, Rippka R, Ledreux A, Molgô J, Changeux JP, Tandeau de Marsac N, Nghiêm HO. (2008). A non-radioactive ligand- binding assay for détection of cyanobacterial anatoxins using Torpédo electrocyte membranes. Toxicon 52:163-174. [14]). La liste de révélateurs n'est pas limitative.
Tableau 1 . Sensibilité de l'essai non radioactif de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA pour la détection de a- bungarotoxine (a-BgTx), 13 desméthyl spirolide C (13-SPX C), 13-19 didesméthyl spirolide C (13-19-SPX C), gymnodimine A (GYM A) et de l'anatoxine-a (ANTX)
a-BgTx 13-SPX-C 13,19-SPX-C GYM -A ANTX
/C50 (95% Cl) 0,27 (0,18-0,41 ) 6,84 (5,07-9,22) 3,10 (1 ,98-4,85) 74,23 (62,4-88,3) 68,81 (35,3-34,2)
LOD (nM) 0,02 1 0,8 2 2 LOQ (nM) 0,20 4 2,0 20 30
/C90 (nM) 70 60 20 2000 2000
L'IC5o représente la concentration de neurotoxine à laquelle il y a 50% d'inhibition de la liaison entre la biotine-a-BgTx et les RnACh de Torpille ; le 95% Cl est l'intervalle de confiance à 95% de la valeur IC5o correspondante ; le LOD est la limite de détection de la méthode, le LOQ, est la limite de quantification de la méthode ; NC90 représente la concentration de neurotoxine nécessaire à inhiber 90% de la liaison entre la biotine-a-BgTx et les RnACh de Torpille.
L'essai non radioactif de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA est une méthode fonctionnelle basée sur le mécanisme d'action des ligands compétitifs des RnACh. Cette méthode permet de détecter des agonistes et antagonistes compétitifs des RnACh avec une grande sensibilité.
La sensibilité de la méthode utilisant les dispositifs de la présente invention a été comparée avec la Chromatographie Liquide Ultra Performante couplé à la Spectrométrie de Masse (UPLC-MS/MS) pour la détection de 13-SPX C, 13-19-SPX C et GYM A [Arâoz et coll., manuscrit en préparation]. Les valeurs de LOD et LOQ obtenus par UPLC-MS/MS montrent que la sensibilité de la méthode de déplacement non-radioactive utilisant le dispositif de la présente invention est dans le même ordre de grandeur que celle de l'UPLC-MS/MS (Tableau 2).
Tableau 2. Sensibilité de l'UPLC-MS/MS pour la détection de 13-SPX C, 13-19-SPX C et GYM A
13-SPX-C 13,19-SPX-C GYM-A
LOD (nM) 4,78 1 ,66 1 ,52 LOQ (nM) 13,1 5,55 4,17
Tel que démontré dans cet exemple, l'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet de détecter l'interaction entre les RnAch et des ligands avec une sensibilité aussi grande que les techniques les plus précises de l'état de la technique sans utilisation d'un dispositif complexe et/ou coûteux et cela parallèlement sur un grand nombre d'échantillons (96) pour la détection simultanée des plusieurs ligands/agonistes/antagonistes des RnACh à savoir les spirolides, gymnodimines, pinnatoxines, anatoxines, curare, ...(la liste n'est pas limitative).
Exemple 2 : Procédé de détection du 13 desméthyl spirolide C, du 13,19 didesméthyl spirolide C et de la gymnodimine A à partir des extrais des fruits de mer et de l'anatoxin-a à partir des extraits de cyanobactéries
Dans cet exemple, les solutions et protocoles suivants ont été utilisés :
• Tampon de recouvrement (« coating »): TBS (150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5).
• Dilution des membranes: 200 fois. Un volume de 50 μΙ de membrane de Torpille (2.7 mg ml"1 de protéine dans 5 mM de glycine) a été dilué dans 10 ml TBS.
• Support: plaques ELISA à fonds plats Maxisorp (NUNC).
• Volume de recouvrement (« coating »): 100 μΙ de membranes de Torpille diluées 200 fois · Température et temps de recouvrement (« coating »): température ambiante (25°C) pendant 2 heures ou 4°C sur la nuit. • Extraits de fruits de mer (amandes, huîtres, moules et coquilles Saint- Jacques) témoins et dopés avec 13 desméthyl spirolide C, 13,19 didesméthyl spirolide C et gymnodimine A
• Extraits de cyanobactéries productrices d'anatoxin-a et homoanatoxin-a
Une plaque ELISA 96 puits à fonds plats Maxisorp (NUNC) a été recouverte avec 100 μΙ par puits d'une solution de membranes d'électrocyte de Torpille (13,5 g/ml protéine total, soit 1 ,35 g de protéine membranaire par puits) dans du tampon TBS (150 mM NaCI, 50 mM Tris- HCI, pH 7,5) à l'aide d'un pipeteur multicanaux. La plaque a été fermée et incubée à température ambiante (25°C) pendant 2 heures ou à 4°C sur la nuit.
Détection des phycotoxines dans des extraits de fruits de mer
Extraction des toxines lipophiliques à partir de fruits de mer :
La préparation des extraits bruts à partir d'échantillons de fruits de mer a été réalisée comme suit : de la chaire d'amandes, huîtres, moules ou coquilles Saint-Jacques (100g) a été homogénéisé dans un broyeur à couteaux à puissance maximale et divisée en 10 aliquotes et gardé à - 80°C.
50 μΙ de 13 desméthyl spirolide C standard, 50 μΙ de 13,19 didesméthyl spirolide C standard ou 50 μΙ de gymnodimine A standard, à une concentration de 10 μΜ tout les trois ; ont été ajouté séparément sur 1 g de chaque homogénat de fruit de mer.
Pour extraire ces phycotoxines lipophiliques, 4 ml d'acétone a été ajouté sur chacun d'homogénats dopés. Les mélanges ont été vortéxés pendant 10 secondes et mélangés sur un agitateur mécanique rotatif pendant 15 minutes à température ambiante (25°C). Ensuite, les homogénats ont été centrifugé à 3500 g pendant 15 minutes à 4°C et les surnageants ont été récupérés tandis que les culots ont été re-extrait deux fois avec 4 ml d'acétone comme il vient d'être décrit. Les pools de surnageants ont été évaporés et les résidus ont été resuspendus dans 4 ml d'eau. Sur les extraits aqueux, 4 ml d'hexane ont été ajoutés et laissé pendant 30 min à température ambiant (25°C) pour que la partition chimique ait lieu.
Alternativement, les homogénats ont été centrifugés à 3500 tours par minute pendant 15 minutes à 4°C et les surnageants ont été récupérés tandis que les culots ont été re-extrait deux fois avec 4 ml d'acétone comme il vient d'être décrit. Les pools de surnageants ont été évaporés et les résidus ont été resuspendus dans 4 ml d'eau. Sur les extraits aqueux, 4 ml d'hexane ont été ajoutés et laissé pendant 30 min à température ambiant (25°C) pour que la partition chimique ait lieu.
Les phases aqueuses ont été extraites trois fois avec du chloroforme (1 :1 ,5 v/v). Les couches de chloroforme ont été regroupées et évaporées. Les résidus obtenus ont été resuspendus dans 100 μΙ de méthanol et conservés à -80°C jusqu'à leur utilisation.
1 g d'homogénat de chaque bivalve (amandes, huîtres, moules et coquilles St-Jacques) ont été soumis au même traitement pour servir comme témoins.
Préparation des plaques :
Des dilutions sérielles de toxines standards, c'est-à-dire de 13 desméthyl spirolide C (1 ,7 x 10"5 - 3,5 x 10"12 M), 13,19 didesméthyl spirolide C (3,3 x 10"7 - 2,1 x 10"13 M) et gymnodimine A (1 ,7 x 10"5 - 3,1 x 10"11 M), (350 μΙ) ont été préparés avec du tampon de blocage (TBS, 0,5% BSA). De la même manière, chaque extrait de fruit de mer, témoins ou dopés avec lesdites toxines, ont été dilués 100-fois et 200-fois (350 μΙ) dans du tampon de blocage (TBS, 0,5% BSA). Chaque dose a été analysée en triplicate (100 μΙ par puits). Le 13-desméthyl spirolide C, le 13-19-didesméthyl spirolide C et la gymnodimine A sont distribués dans le commerce dans du méthanol. Les concentrations de méthanol ont été conservées à un niveau inférieur à 1 % pour éviter toute interférence avec la méthode
Préparation des extrais de cyanobactéries
Les d'extraits brut de cyanobactéries productrices d'anatoxin-a ont été préparés comme suit :
Le matériel biologique, c'est-à-dire des filaments de cyanobactéries, ont été récoltés par centrifugation (3000 tours par minute à 15°C pendant 10 minutes à partir d'une culture de cyanobactéries. Le culot de cyanobactéries a été resuspendu dans de l'eau distillé et re-centrifugé dans les mêmes conditions et lyophilisés. Les cellules lyophilisées ont été resuspendus dans 50 mM d'acide acétique (10 mg : 2 ml) et lysées par sonification (5 cycles de 1 minute avec des intervalles de 3 minutes dans la glace) avec un Sonifier Branson 250. L'homogénat obtenu a été agité pendant 4 heures protégé de la lumière et ensuite centrifugé à 10 000 tours par minute pendant 30 minutes à 15 °C. Le surnageant a été collecté puis passé à travers une unité de filtration (0,45 μιτι de pore) et stocké à - 20°C jusqu'à utilisation.
La figure 4 A montre sur la même microplaque, l'inhibition dose- dépendante de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par des dilutions sérielles du 13 desméthyl spirolide C et par des extraits de fruit de mer dopés avec la même toxine et des extraits témoins.
La figure 4 B montre l'inhibition de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par des dilutions sérielles de gymnodimine A et des extraits de fruits de mer dopés avec de la gymnodimine A, ainsi que par des extraits de fruit de mer témoins testés à deux concentrations (100-fois et 200-fois dilués).
D'autre part, la figure 4 C montre l'inhibition de la liaison biotin-a- BgTx-RnACh par des dilutions sérielles de 13,19 didesméthyl spirolide et des extraits de fruits de mer dopés avec la même toxine, ainsi que par des extraits de fruit de mer témoins. En même temps l'effet des extraits obtenus des cyanobactéries neurotoxiques à'Oscillatoria, souche PCC 6506 (productrice d'anatoxine-a) et souche PCC 101 1 1 (productrice d'homoanatoxine-a), sur la liaison biotin-a-BgTx-RnACh sont montrés. Les données d'absorption (OD492nm) ont été exprimés en pourcentage d'inhibition en employant la formule suivante : Inhibition % = 100 x [(signal 100% - signal de l'échantillon) / (signal 100% - (inhibition 100% - signal plaque))] ou avec la formule suivante. Inhibition % = [100 x (signal 100% - signal de l'échantillon) / (signal 100% - inhibition 100%)]. A partir des données d'inhibition obtenues, une courbe d'inhibition pour chacune des toxines testées a été construit (fig. 3 B). Le paramètre d'inhibition IC5o (inhibition 50 : 50% de RnACh sont occupés par la toxine empêchant la liaison biotin-a-BgTx-RnACh) a été calculé. La limite de détection (LOD) et à la limite de quantification (LOQ) de la méthode ont été aussi calculées (voir tableau 1 ).
Les résultats obtenus démontrent que la méthode non-radioactive de déplacement de la biotin-a-bungarotoxine est applicable pour la détection et quantification des phycotoxines marines, à savoir par exemple la 13 desméthyl spirolide C, 13,19 didesméthyl spirolide C et gymnodimine A à partir d'échantillons de fruits de mer contaminés (figure 4 A, 4 B, 4 C et 4 D) et des neurotoxines de cyanobactéries d'eau douce, a savoir de l'anatoxine-a ou de l'homoanatoxine-a (Tableau 1 ).
La sensitivité de la méthode dépend de l'affinité de la toxine pour le récepteur. Comme démontré dans cette exemple, le seuil de détection de cette méthode non-radioactive est très bas, par exemple 54 picogrammes de 13,19 didesméthyl spirolide C ; 69 picogrammes de 13 desméthyl spirolide C et 101 picogrammes de gymnodimine A.
De plus, la méthode nécessite une très faible quantité de membrane électrocyte, par exemple de 1 à 2 g de protéines de membranes d'électrocyte de Torpille par puits dans cet exemple (figure 2 A, 2 B et 2 C).
C'est à dire, une consommation très réduite de membranes d'électrocyte de Torpille. En plus, lorsque les membranes d'électrocyte de Torpille sont conservées adéquatement, par exemple des aliquotes de 0,5 ml à -80°C, elles sont stables pendant plusieurs années.
Très important : des microplaques recouvertes « coatés » avec des membranes d'électrocyte de Torpille, lorsqu'elles sont conservées à 4°C dans 200 μΙ de tampon de blocage (TBS, 0,5% BSA, pH 7,5), peuvent être utilisées jusqu'à six mois après leur fabrication. Il n'y a pas de différence significative entre des plaques recouvertes (« coatés ») la veille ou des plaques recouvertes (« coatés ») six mois auparavant pour la détection de ligands des RnACh. Cette preuve de principe est très utile pour concevoir la fabrication de plaques préalablement recouvertes « pre-coatés » avec des membranes d'électrocyte de Torpille prêtes à l'emploie.
Les plaques obtenues dans cet exemple sont désignés par Torpecfo-MicroReceptorPlaque.
Tel que démontré dans cet exemple, l'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet de détecter l'interaction entre les RnAch et des ligands compétitifs directement sur des extraits méthanoliques des fruits de mer et des extraits aqueux des filaments de cyanobactéries. En outre les dispositifs de la présente invention à savoir les plaques préalablement recouvertes « pre-coatés » avec des membranes d'électrocyte de Torpille prêtes à l'emploie pourraient être transportées et distribuées par la poste pour leur utilisation dans d'autres pays/continents pour la détection des ligands compétitifs des RnACh. Exemple 3 : criblage à haut débit des toxines/ligands compétitifs des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
Les microplaques recouvertes avec des membranes d'électrocyte de Torpille qui sont conservées à 4°C obtenus à l'exemple 1 sont adaptés à des méthodes de haut-débit. Al Utilisation du pipeteur manuel à 96 cônes Liquidator 96TM (Rainin) :
a) Plaques à 96-tubes à préparer avant de commencer la méthode de détection :
Préalablement, un plan de plaque est préparé tel que représenté dans la figure 5 B : Sept extraits de cyanobactéries environnementales testées par triplicate à trois dilutions (10-, 100- et 1000-fois) et des dilutions en série de 13,19 didesméthyl spirolide C allant de 5 X 10"7 a 5 X 10"13 M en plus des témoins négatifs (control plaque, 3 puits), témoins 100% signal (6 puits) et 100% inhibition (1 X 10"5 M BgTx, 3 puits) ont été essayé par la méthode.
La Plaque de la figure 6C montre en rectangles la distribution des sept extraits de cyanobactérie marines et du 13,19 didesméthyl spirolide C. Rectangle I [A1 -C3], CYA01 ; Rectangle II [D1 -F3], CYA02 ; Rectangles III G1 -G3 and [A4-B6], CYA03 ; Rectangle IV [C4-E6], CYA04 ; Rectangles V [F4-G6] and A7-A9, CYA 05 ; Rectangle VI [B7-D9], CYA06 ; Rectangle VII [E7-G9], CYA07 ; Rectangle VIII [A10-G12], 13,19 didesméthyl spirolide C. Selon le plan de plaque, des solutions de toxine où d'extrait dans du tampon de bloquage identique à celui de l'exemple 2 précité sont préparées et distribuées dans des plaques à 96 tubes capables de contenir jusqu'à 1 ml de solution par tube : « PLAQUE TOXINE/EXTRAITS ». Pour chaque toxine standard ou échantillon à tester par triplicate, le volume minimum à préparer est de 350 μΙ par tube.
Une deuxième plaque de 96 puits contenant une solution de 2,4 x 10"7 M de biotine-a-BgTx dans du tampon de bloquage (TBS, 0,5 % BSA) « PLAQUE ΒΙΟΤΙΝ-α-BgTx » est préparée. Le volume à préparer est dépendant du nombre de plaques à tester (1 microplaque à 96 puits consomme 50 μΙ x 96 = 4,8 ml). Cette solution est fraîchement préparée. Une troisième plaque à 96 tubes « PLAQUE PEROXIDASE » contenant streptavidine couplée à la péroxidase (D5ooo ~220 ng/nl protéine dans du tampon de blocage) est préparée. Cette solution est fraîchement préparée. Le volume à préparer est dépendant du nombre de plaques à tester (1 microplaque à 96 puits consomme 100 μΙ x 96 = 9,6 ml).
Une quatrième plaque de préparation à 96 tubes indiquée « PLAQUE OPD » contenant le substrat commercial OPD, au moins 120 μΙ par puits, pour développer un dispositif de criblage est préparée. Cette solution est fraîchement préparée et doit être protégée de la lumière. Le volume à préparer est dépendant du nombre de plaques à tester (1 microplaque à 96 puits consomme 100 μΙ x 96 = 9,6 ml). La solution OPD est préparée selon le protocole du fournisseur : 4 tablettes OPD sont dissoutes dans 12 ml d'eau déionisée, dans laquelle 5 μΙ de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à 30% est ajoutée.
50 ml de solution « stop » de la réaction peroxydase (0,5 M H2SO4) est préparée dans une boite rectangulaire adapté au pipeteur manuel à 96 canaux « PLAQUE STOP ».
b) Procédure
Le dispositif de criblage préalablement recouvert « pre-coatés » obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 1 , indiqué Torpedo- MicroReceptorPlaque ci après, est sorti du réfrigérateur. La plaque est laissée sur un agitateur à température ambiante (25°C) pendant 30 min. Une fois que le dispositif de criblage est à température, le film adhésif est retiré, le tampon de blocage est éliminé et après avoir séché sa surface, la plaque est placée sur la zone de pipetage.
Incubations avec des toxines/extraits :
Le pipeteur manuel à 96 canaux est chargé avec des cônes neufs et réglé sur 100 μΙ, et la « PLAQUE TOXINE/EXTRAITS » est placée sur une zone de « charge ». 100 μΙ de la « PLAQUE TOXINE/EXTRAITS » contenant des standards de toxines, des échantillons, des extraits, des produits de synthèse ou des témoins négatifs et positifs sont prélevés et versés dans la Torpedo- MicroReceptorPlaque placée dans la zone de pipetage.
Le dispositif de criblage est scellé à l'aide d'un film adhésif (Sealing tape, Costar) et laissé incuber les membranes d'électrocyte de Torpille immobilisées avec les échantillons à tester pendant 3 h avec agitation. De préférence, l'incubation se fait sur la nuit à 4°C.
Lorsque l'incubation est faite à 4°C, la Torpecfo-MicroReceptorPlaque est placée sur un agitateur à température ambiante (25°C) pendant 30 min avant d'être replacée dans la zone de pipetage du Liquidator 96TM.
Incubation avec le traceur biotin-a-BgTx
Des pointes neuves sont chargées et le pipeteur réglé sur 50 μΙ et la boîte « PLAQUE ΒΙΟΤΙΝ-α-BgTx » placée sur la zone de « charge ». 50 μΙ de chaque tube de la « PLAQUE ΒΙΟΤΙΝ-α-BgTx » est prélevé et versé directement sur la Torpecfo-MicroReceptorPlaque. La plaque ainsi obtenue correspond au dispositif de criblage et est incubée pendant 30 min sur un agitateur à température ambiante (25°C) après quoi la solution est éliminée et plaque replacée dans la zone de pipetage.
Lavage
Des pointes neuves sont chargées et 200 μΙ de solution de lavage (TBS, 0,1 % Tween 20) sont prélevés et versés dans les puits de Torpedo- MicroReceptorPlaque. La solution de lavage est éliminée et la Torpedo- MicroReceptorPlaque replacée dans la zone de pipetage. Cette étape est répétée trois fois.
Incubation avec Streptavidine-HRP/ Lavage
100 μΙ de chaque tube de la « PLAQUE PEROXIDASE » sont prélevés et versés directement sur le dispositif de criblage. La plaque est incubée pendant 30 min sur un agitateur à température ambiante (25°C). La Torpecfo-MicroReceptorPlaque est lavée comme décrit précédemment et est replacée dans la zone de pipetage.
Développement de la réaction peroxidase & stoppage de la réaction
100 μΙ de chaque puits de la « PLAQUE OPD » sont prélevés et versés sur le dispositif de criblage. La Torpedo-M icroReceptorPlaque est incubée jusqu'à ce qu'une coloration optimale soit obtenue, soit environ 5 minutes et 50 μΙ de la solution « stop » (0,5 M H2SO4) est versée à l'aide du pipeteur à 96 pointes.
Lecture & analyse des données
La Torpecfo-MicroReceptorPlaque est lue sur le lecteur ELISA (GeniosPro, Tecan) et les résultats analysés.
Les résultats sont montrés dans la figure 5. Les témoins plaque, signal 100% et inhibition non-spécifique 100% montrent le bon fonctionnement et la répétitivité du dispositif d'analyse. Dans les sept extraits de cyanobactéries environnementales d'origine marine qui ont été testés à trois dilutions (10 fois : Di0 : première rangé, 100 fois D100 : deuxième rangé et 1000 fois D10oo troisième rangé) aucun ligands des RnACh n'a été détecté. Sur la même plaque, le 13,19 didesméthyl spirolide C a été testé; première rangé : 5 X 10"7 M, deuxième rangé : 5 X 10"8 M, troisième rangé : 5 X 10"9 M, quatrième rangé : 5 X 10"10 M, cinquième rangé : 5 X 10"11 M, sixième rangé : 5 X 10"12 M et septième rangé : 5 X 10"13 M. L'inhibition de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par du 13,19 didesméthyl spirolide C est dose-dépendante et confirme les résultats préalablement obtenus pour cette toxine. L'utilisation du pipeteur à 96-pointes accélère le débit de l'analyse (10 microplaques par jour : 960 analyses possibles). En même temps, l'ajout des solutions contenant soit les toxines/extraits soit le traceur, soit la streptavidine-peroxidase, soit le substrat OPD ou la solution stop, est simultanée permettant un control plus exact du temps de réaction ou incubation. B/ Utilisation d'un robot de pipetage :
Les solutions « SOLUTION TOXINE/EXTRAITS », « SOLUTION BIOTIN-a-BgTx », « SOLUTION PEROXIDASE », « SOLUTION OPD » et « SOLUTION STOP » sont préparées comme indiqué précédemment.
Une « plaque modèle » à 96 puits est préparé pour les échantillons de toxines/extraits/ témoins selon plan de plaque à tester. Le robot de pipetage est capable d'automatiser la préparation des dilutions des toxines/échantillons, pour la « plaque modèle ».
Les étapes sont similaires aux étapes précitées.
Exemple 4 : procédé de fabrication de dispositifs de d'analyse
Les solutions, membranes et conditions expérimentales sont identiques à celles de l'exemple 2 précité.
Une dilution de la solution stock de membrane, 2,7 mg de protéines par ml, préparée selon le procédé décrit dans l'exemple 1 -4 précités a été diluée 200 fois dans du tampon TBS à un pH de 7,5.
100 μΙ de la solution de membranes de Torpille diluée 200-fois :13,5 ml"1 protéine total, soit 1 ,35 g de protéine membranaire par puits, a été distribuée dans les puits d'une microplaque à fonds plats Maxisorp (marque déposée), NUNC, comme représenté sur les figures 3, 4 et 5.
Un film adhésif a été placé sur ladite plaque et la plaque a été incubé à 4°C pendant la nuit ; soit 12-18 heures.
L'excès de membranes a été éliminé par inversion manuel de la plaque et les bords des puits ont été nettoyés avec un papier absorbant.
Enfin 200 μΙ de solution de blocage TBS, 0,5 % BSA a été versée dans chaque puits. Un film adhésif a été déposé sur la plaque dite Torpecfo-MicroReceptorPlaque et conservée à 4°C jusqu'à son utilisation.
Le dispositif d'analysé ainsi préparé est prêt à l'emploi et notamment prêt pour le transport. Exemple 5 : comparaison des procédés de détection connus avec le procédé de l'invention
Dans cet exemple, les résultats de détection obtenus dans les documents de l'art antérieur suivants Fonfria et coll. [12], Vilarifio et coll.
[13] et Arâoz et coll. [14] ont été comparés avec ceux obtenus avec le procédé et dispositif de la présente invention (exemples 1 et 2 ci-dessus)
Le tableau 3 ci-dessous représente les différents résultats obtenus que ce soit au niveau de la sensibilité du procédé en fonction de la molécule à détecter.
Tableau 3 : comparaison du procédé de l'invention avec les procédés connus
Figure imgf000044_0001
Tel que démontré dans cet exemple, l'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet de détecter l'interaction entre les RnAch et des ligands avec une sensibilité bien plus grande que celle des procédés et dispositif de l'art antérieur.
En outre, le dispositif de la présente invention à savoir les plaques préalablement recouvertes (« pre-coatés ») avec des membranes d'électrocyte de Torpille prêtes à l'emploie peuvent être transportées et distribuées, par exemple par la poste pour leur utilisation dans d'autres pays/continents pour la détection des ligands compétitifs des RnACh.
Enfin, tel que démontré dans cet exemple, les quantités de fragments membranaires utilisées pour fabriquer le dispositif de l'invention sont très inférieures aux quantités nécessaires dans les procédés de l'état de la technique. Ainsi le procédé de l'invention permet avantageusement de diminuer la quantité de fragments membranaires à utiliser et ainsi diminue, par rapport aux procédés de l'art antérieur le nombre de Torpilles à sacrifier tout en améliorant la sensibilité de détection du dispositif de l'invention par rapport aux dispositifs / procédés connus.
Exemple 6 : Procédé d'élution des imines cyclisées ayant réagi avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine de Torpille immobilisés sur la surface des plaques de type ELISA.
Produits utilisées:
- Les mêmes produits que dans l'exemple 1 .
- Un dispositif d'analyse prêt à l'emploie obtenu dans l'exemple 4 précité indiqué Torpecfo-MicroReceptorPlaque, c'est à dire une plaque recouverte avec des membranes d'électrocyte de Torpille
- Standards de gymnodimine A, 13 desméthyl spirolide C et 13,19 didesméthyl spirolide C
- Méthanol - 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)
- Acétonitrile
- Acide trifluoroacétique
Equipements:
- Lecteur de micoplaques ELISA
- MALDI-TOF (Voyager-DETM STR Workstation, Applied BioSystems, Foster City, CA, USA)
Procédure:
Le dispositif d'analyse prêt à l'emploie à été placé à température ambiante, à savoir à 25°C pendant 30 minutes.
Le tampon de blocage a été éliminé et sans lavage, six puits ont été incubés avec 100 μΙ de gymnodimine A, ou avec 100 μΙ de 13 desmethyl spirolide C, ou avec 100 μΙ de 13,19 didesmethyl spirolide C à une concentration de 1 μΜ, préparées dans du tampon de blocage (TBS, 0,5 % BSA, pH 7,5).
Le dispositif a été incubé à 4°C pendant la nuit.
Après incubation du dispositif pendant la nuit à 4°C, la plaque a été placée à température ambiante, à savoir à 25°C pendant 30 min, après quoi les puits sont lavés 5 fois avec 250 μΙ de tampon de lavage comprenant du TBS, 0,1 % Tween 20, pH 7,5.
L'élution de la gymnodimine A a été réalisé avec 50 μΙ de méthanol ajoutés dans chacun des six puits préalablement incubés avec cette toxine. Après 5 min d'incubation à température ambiante (25°C) le méthanol a été récupéré. La même procédure a été appliquée pour éluer du 13 desméthyl spirolide C et du 13,19 didesméthyl spirolide C.
Les éluas ont été ensuite analysés par MALDI-TOF. Pour cela, la préparation de la matrice a été réalisée comme suit: 10 mg d'acide 2,5- dihydroxybenzoïque ont été dissous dans 1 ml d'un mélange d'eau- acétonitrile (1 :1 ) contenant 0,3% (v/v) d'acide trifluoroacétique. Pour l'analyse par MALDI-TOF, 10 μΙ de toxine standard (1 μΜ) ont été mélangés avec 10 μΙ de matrice préparée comme décrit précédemment à l'aide d'un vortex. Un microlitre de ce mélange a été déposé sur la surface d'une plaque porte-échantillon en acier inoxydable (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA).
De la même façon, 10 μΙ de chaque élua ont été mélangés avec 10 μΙ de matrice préparée comme décrit précédemment à l'aide d'un vortex. Un microlitre de ce mélange a été déposé sur la surface d'une plaque porte-échantillon en acier inoxydable. Une fois le solvant évaporé (à savoir 2 min après avoir déposé les échantillons), le porte échantillon a été introduit dans le MALDI-TOF pour l'acquisition de données de masse.
Tableau 4 : Caractérisation physico-chimique des l'éluas obtenus à partir des puits où les RnACh de Torpille ont été incubés avec des imines cvclisées
Figure imgf000047_0001
Tel que démontré dans cet exemple l'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet, par exemple de capturer des imines cyclisées que l'on peut après éluer, par exemple avec du méthanol. L'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet donc avantageusement de faciliter l'isolement/ la caractérisation des ligands du RnACh. En particulier, il permet avantageusement de faciliter l'isolement / caractérisation physico-chimique d'un agoniste/antagoniste, par exemple compétitif des RnACh. Ainsi, ce dispositif peut être également avantageusement utilisé dans des programmes de recherche de nouvelles toxines.
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Claims

REVENDICATIONS
Procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface comprenant les étapes de :
a. Isolement des membranes de cellules électrocytes de Torpille,
b. Fragmentation desdites membranes isolées,
c. l'incorporation des fragments membranaires obtenus à l'étape b) dans une solution de pH compris de 6,5 à 10 d. Fixation desdits fragments membranaires à la surface du dispositif.
Procédé selon la revendication 1 dans lequel le procédé comprend avant l'étape d) d'immobilisation de membranes sur le dispositif, une étape c') de dilution des fragments membranaires
Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la surface du dispositif est en plastique.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel la concentration de protéine totale dans ladite solution de pH compris de 6,5 à 10 est comprise entre 5 à 200 g/ml.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la solution pour l'incorporation est une solution choisie parmi un tampon tris salin (TBS) comprenant 150 mM NaCI, 50 mM Tris, pH 7,5, ou un tampon phosphate salin (PBS) comprenant 130 mM chlorure de sodium, 10 mM sodium phosphate, pH 7,0 ou un tampon carbonate/bicarbonate comprenant 150 mM chlorure de sodium, 100 mM sodium carbonate, pH 9,5.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel la Torpille est Torpédo marmorate ou Torpédo californica.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les membranes sont des membranes plasmiques de cellules électrocytes.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la surface est une surface de puits de microplaques et/ou de barrettes 9. Dispositif d'analyse obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Dispositif selon la revendication 9 dans lequel les fragments membranaires sont fixés à la surface de puits.
1 1 . Dispositif selon la revendication 9 ou 10 dans lequel le dispositif est une plaque ELISA à 96 ou 384 puits, ou une plaque à 4, 8 ou 12 puits, ou des barrettes à 6; 8 ou 12 puits. 12. Utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1 pour la détection et la quantification de neurotoxines
13. Utilisation d'un dispositif d'analyse selon la revendication 12 dans laquelle les neurotoxines agissent sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
14. Utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1 pour la détection et la quantification de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
15. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1 pour le criblage à haut débit de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. 16. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1 pour la purification et caractérisation physico-chimique de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
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