WO2012096557A2 - Uso de un dispositivo y kit para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas a partir del neuroepitelio olfatorio - Google Patents

Uso de un dispositivo y kit para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas a partir del neuroepitelio olfatorio Download PDF

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WO2012096557A2
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Geraldo Bernabé RAMIREZ RODRIGUEZ
Leonardo ORTIZ LOPEZ
Agustín RIQUELME SANDOVAL
Patricia PARRA CERVANTES
Ramón SOTO VAZQUEZ
Samuel ROMMERO CASTELLO
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Instituto Nacional De Psiquiatría "Ramon De La Fuente Muñiz"
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a device included in a kit of reagents and attachments for the diagnosis of neuropsychiatric diseases from a culture of neuronal precursors obtained from the lower middle turbinated region of the nasal cavity.
  • These precursor cells form mature neurons with characteristics similar to those presented by olfactory epithelial neurons in vivo, which allows them to be used to characterize biomarkers that allow a specific and timely biological diagnosis of neuropsychiatric diseases.
  • the present invention includes one or more reagent kits and attachments for obtaining the sample (1), processing and treatment of the sample (2) and diagnosis (3) which include, where appropriate, a device for sampling. , attachments, solutions, culture media, controls, markers, manuals and guides for interpretation. These kits of reagents and attachments together, allow to make the diagnosis of neuropsychiatric diseases, as well as the degree of progress of these conditions and / or the predisposition to any of these. BACKGROUND
  • the Nervous System is composed of an association of nerve cells called neurons and support cells of various types called glial cells. It is made up of nerve tissue supported by other tissues and structures that allow the body to respond to continuous changes in the external and internal environment, controlling and integrating the functions of organs and devices.
  • Glial cells constitute a cell type of neural origin with special characteristics according to their function and location. All of them are intended for the maintenance of neurons.
  • Neurons are highly specialized cells of variable morphology and size depending on the function and region of the SN in which they are found. They have an ability to be excited for the conduction of impulses that are transmitted to other nearby or distant cells through their extensions.
  • Neurons have a body or soma that contains the nucleus and the organelles that give it the morphofunctional structure, the energy supply, as well as its functionality.
  • the highly polarized structure of neurons is constituted by numerous cytoplasmic extensions classified as: a) dendrites, which are short branched projections that are born around the soma and transmit impulses from the periphery to the neuronal body, and b) axon, a unique projection and long whose function is to transmit the impulses from the soma to the synapse and emerging from a cytoplasmic growth cone.
  • the synaptic terminals are represented by a series of short final branches (Ram ⁇ rez G et al, 2007).
  • the neuronal nucleus is usually large, ovoid or spherical, has a single nucleolus and little heterochromatin. In large neurons, euchromatin is not very tangible, so the nucleus has a pale and vesiculous appearance. On the other hand, small neurons that are more abundant have a more condensed chromatin.
  • the carioplasma and nuclear membrane are similar to those of other cells.
  • Nissl bodies are observed, which correspond to the Rugged Endoplasmic Reticulum (RER) ordered in parallel and that has a specific distribution in each type of neuron.
  • RER Rugged Endoplasmic Reticulum
  • ribosomes associated with RER there are free polypyribosomes in the cytoplasm.
  • REL Smooth Endoplasmic Reticulum
  • Nissl bodies vary greatly in different physiological and pathological situations such as axonal injury that causes an interruption in axoplasmic flow.
  • the REL is not as abundant as the RER and its distribution is uniform in the pericarion, in the dendrites and in the axon.
  • the RER fulfills the function of protein synthesis by collaborating also in the production of transport vesicles together with the Golgi Complex.
  • the Golgi Complex In all neurons, the Golgi Complex is very prominent given its situation of cells producing large amounts of proteins. It appears as a perinuclear lax plot formed of branched stacks of flat cisterns surrounded by small vesicles. These are joined by tubules, their function is: 1) the production of lysosomes and plasmalema components mainly in neurosecretory neurons; 2) the synthesis of synaptic vesicle components; 3) the concentration and modification of proteins from the RER; and, 4) the production of neurotransmitters or enzymes for assembly in the axonal terminal.
  • Neurons have a large number of mitochondria dispersed in the cytoplasm. They can be shaped like a cane or filament and are thinner than those of other cells. Dendrites and axons also possess these organelles. In the axon, mitochondria are arranged at regular intervals and are very abundant in axonal terminals. The mitochondrial ridges are not only arranged transversely but also parallel to their longitudinal axis. Unlike most cells in the body, neurons lack energy storage capacity, therefore, they need a constant supply of circulating glucose and oxygen, this explains the serious consequences of a considerable decrease in cerebral blood flow.
  • the cytoskeleton of neurons is very important in the support of organelles and in the maintenance of cellular configuration and function, regulates the movement of organelles between different regions of the neuron, fixes the location of the membrane components and determines the neuronal shape . It is mainly composed of microtubules, actin microfilaments and intermediate filaments.
  • microtubules are constituted by polymers of alpha and beta tubulin subunits, as well as proteins associated with microtubules (MAPs), which provide the characteristic stability and mechanical properties of microtubules.
  • MAPs proteins associated with microtubules
  • Actin microfilaments help to protect the cell during cell motility, having an active participation in cell polarization and in the extension of neurites and axon.
  • the intermediate filaments represent the support of the cytoskeleton, are constituted by monomers organized as filamentous structures.
  • the argumentative impregnation allows to see in the neuronal pericarion a set of fibrillar elements of 2 microns in diameter called neurofibrils, which form a weft between the organelles and extend to the neuron extensions.
  • Neurofibrils are bundles formed of neurofilaments of approximately 10 nm in diameter. The latter are proteins of the neurophilamines family and have similarities with the intermediate filaments of other cell types.
  • neurofilaments are composed of small strands twisted together forming heterodimers; four dimers form a protofilament, two protofilaments form a protofibril and two rolled protofibrils form a neurofilament. In a cross section the neurofilament appears as a small thick-walled tubule and a clear central region.
  • Microfilaments are composed of two spiral polymerized actin G bands. The large part of actin binds to plasmalema through fodrin.
  • the olfactory bulb In recent years it has been shown that the continuous formation of new neurons during adulthood occurs in two regions of the brain: the olfactory bulb and the dentate gyrus of the hippocampus. In the subventricular zone, the pluripotential cells give rise to the progenitors that will migrate through the face-migratory chain to reach the olfactory bulb where they differentiate forming functional inhibitory interneurons of two types: granular and periglomerular cells, which establish contacts for modulate the sensory information process.
  • the pluripotential cells reside in the subgranular zone, and give rise to the progenitor cells, which mature locally in the granular zone of the dentate gyrus by sending their axonal projections towards the area known as Ammon's horn ( CA3) and dendritic arborizations towards the granular layer (Ram ⁇ rez G et al, 2007).
  • the sensory organ of smell consists of olfactory receptor neurons located in the upper part of the nasal mucosa. These neurons have olfactory cilia that are stimulated by chemicals dissolved in the mucus that lines the nasal epithelium (Tortosa A; 2009).
  • the olfactory mucosa is a specialized region of the nasal cavity. Histologically, it is presented as a pseudostratified cylindrical epithelium that contains different types of cells, including sensory neurons in different states, basal cells and sustainability cells (the latter with characteristics of glial cells). The cellular bodies of mature neurons are found at different levels in the epithelial layer and project their axons directly to the central nervous system, synapsing with the olfactory bulb cells where the olfactory function is integrated.
  • the mitral cells of the olfactory bulb receive the odoriferous signals perceived by the specific receptors located in the dendrites of the olfactory neurons, whose amylinic axons pass through the sieve plate and distribute their dendrites in the olfactory zone of the pituitary mucosa;
  • These terminal neuronal structures act as odoriferous receptors, capable of defining thousands of chemical combinations that constitute odors, remarkably variable sensitivity from one individual to another and that decreases with age.
  • the olfactory epithelium consists of two layers or compartments: the lamina intestinal or submucosa, which is seated on the bone or cartilage and is rich in vessels and connective tissue; and the neuroepithelium, which is separated from the submucosa by the basement membrane.
  • the submucosa has a support and nutrition function and Bowman's glands penetrate it through the basement membrane.
  • the olfactory neuroepithelium of mammals is made up of four types of cells: ciliated olfactory sensory neurons (NSO), developing neurons, basal cells (CBG) and sustainable cells (SUS). These cells form a columnar pseudostratified epithelium that is located in the upper nasal cavity, in the middle turbinated area, in the septum and in the nasal wall where mature functional receptor neurons are found (Vanelli, 1995; Feron, 1998).
  • NSO ciliated olfactory sensory neurons
  • CBG basal cells
  • SUS sustainable cells
  • the olfactory epithelial neurons transmit the olfactory perceptions to the Central Nervous System (CNS), from an olfactory stimulus captured by the receptors located in the dendrites, an impulse is generated that travels through the axon which synapses directly with the cells mitral of the olfactory bulb and these cells, in turn send axonal tracts to the structures of the limbic system.
  • CNS Central Nervous System
  • the olfactory epithelium are important cell populations for the formation of neurons among which we find the stem cells, neuroblasts, immature neurons and mature sensory neurons.
  • Both mature and immature olfactory neurons express isoform III of the ⁇ tubulin protein, which is specific for neurons and the neuronal cell adhesion molecule (NCAM) and vimentin.
  • NCAM neuronal cell adhesion molecule
  • the basal cells are in continuous division and their progeny gives rise to neurons within the nasal cavity. These basal cells that divide continuously are considered pluripotential cells.
  • Pluripotential cells divide asymmetrically causing another pluripotential cell and a progenitor cell. While the pluripotential cell remains close to the basement membrane, the progenitor cell divides to form homologous cells and thereby give rise to immature neurons that migrate from the basement membrane. Final maturation occurs when the axon of the olfactory neuron synapses in the olfactory bulb and its dendrites reach the surface of the olfactory mucosa (Priest of Lustig E, 2001).
  • Ciliated bipolar olfactory receptor cells have a specialized cilio that projects several dendrites towards the surface of the olfactory neuroepithelium that is in contact with the environment and an axon that projects towards the olfactory bulb, such that the olfactory neurons constitute the door to the CNS and are the link between the internal cerebral environment and the environment.
  • Each axon from 10 to 20 millions of olfactory receptor neurons cross the basal membrane of the epithelium towards the lamina intestinal, joined in fascicles and nerves that pass through the 15 to 20 holes of the screened lamina of the ethmoid to synapse within the olfactory bulb;
  • Microvellosal cells that have not yet been defined in olfactory function, however, their role may be supportive or to amplify the surface of olfactory neuroepithelium.
  • Basal cells are the only ones that do not project to the epithelial surface and rest on the basement membrane. They constitute a population of stem cells capable of continuously regenerating olfactory receptor neurons throughout life (Escada PA, et al; 2009).
  • the conduction of the olfactory stimulus towards the CNS is carried out when the olfactory sensory neuron receptors are coupled to the odoriferous substances causing the activation of the adenylate cyclase that is coupled to the G proteins and thus increase them .
  • levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) with the consequent opening of calcium channels causing neuronal depolarization and the spread of the nerve impulse to the olfactory bulb.
  • IP3 IP3 as a second messenger with the consequent stimulation of calcium channels.
  • the generated action potentials are transported along the axons to the olfactory bulb of the brain.
  • neuropsychiatric diseases have a cumulative point prevalence of approximately 10% in the adult population (WHO, 2000).
  • WHO World Health Organization
  • neuropsychiatric diseases include depression, bipolar affective disorder, schizophrenia, epilepsy, alcohol and psychoactive substance use disorders, Alzheimer's disease and other dementias, posttraumatic stress disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder and primary insomnia, among others.
  • the aim of the initial clinical diagnosis is to allow 'l psychiatrist development of a therapeutic strategy for the treatment and management of patients with a neuropsychiatric disorder, however, the diagnosis will depend on the answers you give the patient in each of the scales applied . This limits the assessment and an accurate diagnosis of first instance that allows to apply the appropriate treatment.
  • a method for the in vitro diagnosis of Alzheimer's disease by using a monoclonal antibody is described in the state of the art (MX / a / 2007/010934 and ES 2 259 270); a method of producing primary cultures of purified olfactory neurons from sustainably and basal cells obtained by dissection of the olfactory epithelium of animals (US 5,308,763), the obtained neurons demonstrate response to physiological levels of odorants and express a specific protein marker, vimentin; a method and kit to confirm the existence of a hemorrhagic event or cerebral ischemia by detecting four markers in the blood (US 6,235,489); a method to prepare a primary culture of olfactory neurons from epithelial cells olfactories obtained by dissection and a kit to determine the effects of odorants on these neurons (US 5,217,893); a method to diagnose Alzheimer's disease by detecting changes in the amyloid precursor protein or A68 by using an ionophore in
  • the present invention is characterized in that the sample is obtained using a semi-rigid device by means of a scraping or exudate in the nostrils, this allows a better handling of the patient and greater security for the diagnosis, in addition to that with a single sample it is possible to propagate the neurons to obtain a large number of functional neurons which allows obtaining sufficient amounts of biomass to perform metabolic, physiological and structural determinations or quantifications.
  • the present invention relates to the use of a device included in a kit of reagents and attachments for the diagnosis of neuropsychiatric diseases from a culture of neuronal precursors obtained from the lower middle turbinated region of the nasal cavity.
  • These precursor cells form mature neurons with characteristics similar to those presented by olfactory epithelial neurons in vivo, which allows them to be used to characterize biomarkers that allow a specific and timely biological diagnosis of neuropsychiatric diseases.
  • the present invention includes one or more reagent kits and attachments for obtaining the sample (1), processing and treatment of the sample (2) and diagnosis (3) which include, where appropriate, a device for sampling. , attachments, solutions, culture media, controls, markers, manuals and guides for interpretation. These kits of reagents and attachments together, allow to make the diagnosis of neuropsychiatric diseases, as well as the degree of progress of said diseases and / or the predisposition to any of them.
  • FIGURE 1 Element with bristles of the sampling device.
  • FIGURE 2. Sample collection, isolation and initial maintenance of olfactory mucosa cells.
  • FIGURE 3 Different applications and combinations of the kits that make up the "KIT NEO”.
  • FIGURE 4 Images of neuronal cells obtained from patients with neuropsychiatric diseases.
  • the present invention relates to the novel use of a device consisting of an element with bristles having a certain tension.
  • the bristles are helically distributed forming a cylinder (Al) or pyramid (Bl) (FIGURE 1), which may or may not have a protective cap on the distal tip, in relation to an attachment that in turn is maintained attached to a positioning rod.
  • the bristles have a tension and hardness which is dependent on the number of sows and their diameter. They are also flexible and are made of a material that allows sterilization.
  • the attachment that keeps the bristles positioned helically is made of plastic and / or metallic material.
  • the rod that holds the bristles and the attachment has a system that allows the exchange of the bristle device, which is disposable.
  • the "kit" of reagents and attachments for the diagnosis of neuropsychiatric diseases consists of a series of solutions and media with a composition characterized in that it allows the release of the cells attached to the sows and their subsequent maintenance in culture. The media and solutions are contained in bottles properly identified for each of the stages of the process.
  • the NEOl solution contains the culture medium characterized by containing one or more amino acids, one or more mineral salts, one or more vitamins, one or more growth factors of natural origin, and one or more antibiotics.
  • the NE02 solution contains one or more pH regulators, and one or more calcium chelating agents, whose function is to wet the cells that will subsequently be propagated.
  • the NE03 solution contains one or more substances that break proteins and allow separation between cells by dispersing them.
  • the NE04 solution contains one or more substances that allow the cells to be fixed to a support characterized by being made of glass.
  • the NE05 cryopreservation solution containing one or more cryoprotective agents of cells of neuronal origin containing one or more cryoprotective agents of cells of neuronal origin.
  • the NE06 differentiation solution containing the maintenance solution without naturally occurring growth factors, and a cyclic nucleotide compound that induces differentiation.
  • the NE07 solution containing one or more identifiers of specific protein molecules of the neuronal structure such that they can distinguish neuronal cells from patients with Neuropsychiatric diseases of healthy subjects.
  • the NE08 solution contains one or more fluorescent and / or enzymatic identifiers to recognize the identifiers of the NE07 solution.
  • the "kit-NEO” that contains in a non-limiting way, the device of paired helical bristles, the exchange rod, conical tubes, cell containers with easily washable and sterilizable material cover, a tube container, a device for growth and maintenance of cells containing a glass or plastic support, and biomass propagation bottles, solutions for growth and differentiation of cells of neuronal origin, cryopreservation container tubes, cryopreservation solution, diagnostic solutions, instruction manual, and guide for interpretation of results.
  • this "kit-NEO” is used for the growth, development, identification, differentiation and quantification of olfactory neuronal cells.
  • the process for obtaining confirmation of neuropsychiatric diseases such as depression, bipolar affective disorder, schizophrenia, epilepsy, consumption disorders is obtained in a convenient, economical, fast and non-invasive manner.
  • neuropsychiatric diseases such as depression, bipolar affective disorder, schizophrenia, epilepsy, consumption disorders is obtained in a convenient, economical, fast and non-invasive manner. of alcohol and psychoactive substances, Alzheimer's disease and other dementias, posttraumatic stress disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder and insomnia, among others.
  • the "kit-NEO" contains all the resources for carrying out the diagnosis in conditions of easy access for the user.
  • the "kit-NEO" is a turnkey system, that is, ready to be used.
  • This novel invention consists of a process to obtain neurons from olfactory epithelial cells for their propagation, in vitro culture and cryopreservation which generally consists of the following steps: 1) sampling of olfactory mucosa, isolation and initial maintenance of cells, 2) Propagation and maintenance, 3) Incubation, 4) Differentiation test, immunofluorescence and cell-s count, and 5) cryopreservation.
  • this "kit-NEO” has the novel feature of being used for different applications according to the user's needs (FIGURE 3):
  • kit-NEO-I whose function is to provide the user with everything necessary for the sampling, isolation and initial maintenance of olfactory mucosa cells (FIGURE 2), that is, it contains the paired helical bristle device, the exchange rod, the conical tubes containing the NEOl solution, the tube container, a device for the growth and maintenance of cells, and the manual with instructions for sampling the patient.
  • kit-NEO-II that allows the propagation and maintenance of cells of neuronal origin that contains the culture support that contains the NEOl solution, a bottle containing the NE02 solution, a bottle containing the NE03 solution, a device for the growth and maintenance of the cells contained in a glass or plastic support and the instructions manual for obtaining biomass.
  • kit-NEO-III for cryopreservation of cells of neuronal origin, characterized by containing, the NEOl solution, the NE05 solution, cryopreservation container tubes and instruction manual.
  • kit-NEO-IV for the differentiation of cells of neuronal origin, which consists of the NE04 solution, the NE06 solution, such a cell support that allows cell fixation and is transparent to ultraviolet light and instruction manual .
  • kit-NEO-V for the diagnosis of neuropsychiatric diseases containing the NEOl solution, the NE02 solution, the NE03 solution, the NE04 solution, the NE07 solution, the NE08 solution, a cell support that allows cell fixation and which is transparent to ultraviolet light, a instruction manual and a guide for the interpretation of results.
  • the main feature of the novel invention is observed in the sampling step of the olfactory mucosa, since in this procedure, a sampler specially designed to obtain a representative sample of olfactory epithelial tissue in a non-invasive manner is used.
  • This way of acquiring the sample eliminates the commonly used method consisting of a biopsy of the epithelial tissue, which includes the use of anesthetics that can interfere with the development and structure of cells of neuronal origin.
  • An invasive method can cause unwanted reactions in patients with a neuropsychiatric disease, so the application of the novel NEO kit described allows a better management of the patient since it is carried out safely, avoids some trauma or side effects of anesthetic agents, and allows to obtain with a single sample, the amount of neurons required to perform the corresponding analysis (s).
  • cultures of cells of neuronal origin can be obtained whose applications are not limited to: obtaining and propagating neuronal cultures, diagnosis of suffering from neuropsychiatric diseases, diagnosis of predisposition to suffering from neuropsychiatric diseases, monitoring of the patient's pathology to determine modifications in the treatment, obtaining neurons for neural transplants, obtaining neurons for the development of research through in vitro studies, obtaining multipotential stem cells and monitoring of substance use and abuse, among others described in the state of the art for the management of cell cultures.
  • the diagnosis of neuropsychiatric diseases currently consists mainly of questionnaires, standardized tests and brain images with which the mental state of patients is determined in a non-confirmatory manner.
  • the present invention establishes the use of the NEO kit for sampling and obtaining olfactory epithelial cells, their propagation, in vitro culture and cryopreservation.
  • the preparation of the patient for the sampling is the cleaning of the nostrils and humidification.
  • Sampling (A-2 of FIGURE 2), use the paired helical bristle device and the exchange rod contained in this kit for exfoliation. Dispersion of exfoliated cells in NEOl solution.
  • the cells obtained are cryopreserved using solution NE05. They are frozen at temperatures below -70 ° C in order to keep them for later use either in the diagnosis or for their propagation.
  • the cells propagated in NEOl solution are transferred to the NE06 solution, then placed in the NE04 solution to obtain differentiated neurons ready for structural diagnostic tests.
  • the cells fixed to the cell support with the NE04 solution are placed in the NE07 solution for a certain time, then the NE07 solution is removed and the NE08 is added and left for a longer time.
  • the diagnosis requires the assembly of the cells attached to another support of greater dimension and with transparency characteristics (FIGURE 4).

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de un dispositivo incluido en un kit de reactivos y aditamentos para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas, asi como el grado de avance de dichos padecimientos y/o la predisposición a alguna de éstas, mediante el uso de biomarcadores en neuronas maduras obtenidas a partir de un cultivo de precursores neuronales obtenidos de la región turbinada media inferior de la cavidad nasal.

Description

USO DE UN DISPOSITIVO Y KIT PARA EL DIAGNÓSTICO DE
ENFERMEDADES NEUROPSIQUIATRICAS A PARTIR DEL NEUROEPITELIO
OLFATORIO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de un dispositivo incluido en un kit de reactivos y aditamentos para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas a partir de un cultivo de precursores neuronales obtenidos de la región turbinada media inferior de la cavidad nasal. Estas células precursoras forman neuronas maduras con características semejantes a las que presentan las neuronas del epitelio olfatorio in vivo, lo cual permite utilizarlas para caracterizar biomarcadores que permiten hacer un diagnóstico biológico específico y oportuno de las enfermedades neuropsiquiátricas .
La presente invención incluye uno o más kits de reactivos y aditamentos para la obtención de la muestra (1), procesamiento y tratamiento de la muestra (2) y diagnóstico (3) que incluyen, en su caso de un dispositivo para la toma de muestra, los aditamentos, soluciones, medios de cultivo, controles, marcadores, manuales y guías para la interpretación. Estos kits de reactivos y aditamentos en conjunto, permiten realizar el diagnóstico de las enfermedades neuropsiquiátricas, así como el grado de avance de dichos padecimientos y/o la predisposición a alguna de estas. ANTECEDENTES
El Sistema Nervioso (SN) está compuesto por una asociación de células nerviosas llamadas neuronas y células de sostén de varios tipos llamadas células gliales. Se conforma de tejido nervioso soportado por otros tejidos y estructuras que permiten que el organismo responda a los cambios continuos del medio externo e interno, controlando e integrando las funciones de los órganos y aparatos .
Las células gliales constituyen un tipo celular de origen neural con características especiales según su función y ubicación. Todas ellas se destinan al mantenimiento de las neuronas .
Las neuronas son células altamente especializadas de morfología y tamaño variables dependiendo de la función y de la región del SN en el que se encuentren. Presentan una capacidad de ser excitadas para la conducción de impulsos que se transmiten hacia otras células cercanas o lejanas a través de sus prolongaciones.
Las neuronas cuentan con un cuerpo o soma que contiene el núcleo y los organelos que le dan la estructura morfofuncional, el aporte energético, así como su funcionalidad. La estructura altamente polarizada de las neuronas está constituida por numerosas prolongaciones citoplasmáticas clasificadas en: a) dendritas, las cuales son proyecciones ramificadas cortas que nacen alrededor del soma y transmiten impulsos desde la periferia hacia el cuerpo neuronal, y b) axón, una proyección única y larga cuya función es la de transmitir los impulsos desde el soma hacia la sinapsis y que emerge de un cono de crecimiento citoplasmático . En el extremo final del axón, se encuentran las terminales sinápticas representadas por una serie de cortas ramificaciones finales (Ramírez G et al, 2007) .
El núcleo neuronal suele ser grande, ovoideo o esférico, tiene un solo nucléolo y escasa heterocromatina . En las grandes neuronas la eucromatina es poco tangible por lo que el núcleo presenta un aspecto pálido y vesiculoso. Por otra parte, las neuronas pequeñas que son más abundantes, presentan una cromatina más condensada. El carioplasma y membrana nuclear son similares a las de otras células.
El citoplasma neuronal contiene organelos abundantes, elementos del citoesqueleto e inclusiones dispuestos concéntricamente alrededor del núcleo. Se observan unas acumulaciones muy basófilas que se denominan cuerpos de Nissl, los cuales corresponden al Retículo Endoplásmico Rugoso (RER) ordenado paralelamente y que tiene una distribución especifica en cada tipo de neurona. Además de los ribosomas asociados al RER, existen polirribosomas libres en el citoplasma. En las dendritas también hay RER en forma de túbulos ramificados, sin embargo, en la zona del cono axonal y en el propio axón solo se observa el Retículo Endoplásmico Liso (REL) . Los cuerpos de Nissl varían mucho en diferentes situaciones fisiológicas y patológicas como es la lesión axonal que produce una interrupción en el flujo axoplasmico.
El REL no es tan abundante como el RER y su distribución es uniforme en el pericarión, en las dendritas y en el axón. El RER cumple la función de síntesis de proteínas colaborando también en la producción de vesículas de transporte junto con el Complejo de Golgi.
En todas las neuronas, el Complejo de Golgi es muy prominente dada su situación de células productoras de gran cantidad de proteínas. Aparece como una trama laxa perinuclear formada de pilas ramificadas de cisternas planas rodeadas de pequeñas vesículas. Estas están unidas por túbulos, su función es: 1) la producción de lisosomas y componentes del plasmalema principalmente en neuronas neurosecretoras ; 2) la síntesis de componentes de las vesículas sinápticas; 3) la concentración y modificación de proteínas provenientes del RER; y, 4) la producción de neurotransmisores o enzimas para su ensamblaje en la terminal axonal .
Las neuronas poseen un gran número de mitocondrias dispersas en el citoplasma. Pueden tener forma de bastón o filamento y son más delgadas qué las de otras células. Las dendritas y axón también poseen estos organelos. En el axón las mitocondrias se disponen en intervalos regulares y son muy abundantes en las terminales axonales. Las crestas mitocondriales no sólo se disponen transversalmente sino también paralelamente a su eje longitudinal. A diferencia de la mayoría de las células del organismo, las neuronas carecen de capacidad de almacenamiento de energía, por lo tanto, necesitan un aporte constante de glucosa y oxígeno circulante, esto explica las graves consecuencias que tiene una disminución considerable del flujo sanguíneo cerebral.
En algunas neuronas de la sustancia negra, núcleo dorsal del vago, locus coeruleus, y ganglios simpáticos de la raíz posterior se observan unos gránulos de color negro o pardó oscuro compuestos de melanina y de función desconocida. Por otra parte, algunas neuronas presentan gránulos dispersos de color marrón amarillento y forma irregular formados de lipofuscina. Estos gránulos son cúmulos de residuos insolubles de la actividad enzimática lisosomal y son típicos en neuronas envejecidas. Su cantidad aumenta con el tiempo e incluso llegan a desplazar al núcleo, alterando la función neuronal . El hierro conforma otro pigmento que aumenta con la edad en algunos grupos neuronales como el globus pallidus y en la sustancia negra .
El citoesqueleto de las neuronas es muy importante en el soporte de organelos y en el mantenimiento de la configuración y función celular, regula el movimiento de organelos entre diferentes regiones de la neurona, fija la ubicación de los componentes de la membrana y determina la forma neuronal . Se compone principalmente de microtubulos , microfilamentos de actina y filamentos intermedios.
Los microtubulos están constituidos por polímeros de subunidades alfa y beta de tubulina, así como proteínas asociadas a los microtubulos (MAPs), las cuales proveen las propiedades de estabilidad y mecánicas características de los microtubulos .
Los microfilamentos de actina ayudan a la protección de la célula durante la motilidad celular, teniendo una participación activa en la polarización celular y en la extensión de las neuritas y el axón.
Los filamentos intermedios representan el soporte del citoesqueleto, están constituidos por monómeros organizados como estructuras filamentosas La impregnación argéntica permite ver en el pericarion neuronal un conjunto de elementos fibrilares de 2 mieras de diámetro denominados neurofibrillas , las cuales forman una trama entre los organelos y se extienden hasta las prolongaciones de la neurona. Las neurofibrillas son haces formados de neurofilamentos de aproximadamente 10 nm de diámetro. Estos últimos son proteínas de la familia de las neurofilaminas y tienen semejanza con los filamentos intermedios de otros tipos celulares. Están compuestos por pequeños filamentos trenzados entre sí formando heterodímeros ; cuatro dímeros forman un protofilamento, dos protofilamentos forman una protofibrilla y dos protofibrillas enrolladas forman un neurofilamento . En un corte transversal el neurofilamento aparece como un pequeño túbulo de pared gruesa y una región central clara.
Los microfilamentos están compuestos de dos bandas de actina G polimerizada en espiral. La gran parte de la actina se une al plasmalema mediante la fodrina.
En los últimos años se ha demostrado que la formación continua de neuronas nuevas durante la etapa adulta se presenta en dos regiones del cerebro: el bulbo olfatorio y el giro dentado del hipocampo. En la zona subventricular, las células pluripotenciales dan origen a las progenitoras que van a migrar a través de la cadena rostro-migratoria para llegar al bulbo olfatorio donde se diferencian formando interneuronas inhibitorias funcionales de dos tipos: células granulares y periglomerulares, que establecen contactos para modular el proceso de la información sensorial. Por otra parte, en el giro dentado, las células pluripotenciales residen en la zona subgranular, y dan origen a las células progenitoras , las cuales maduran localmente en la zona granular del giro dentado enviando sus proyecciones axonales hacia el área conocida como cuerno de Amón (CA3) y las arborizaciones dendriticas hacia la capa granular (Ramírez G et al, 2007).
El órgano sensorial del olfato consta de neuronas receptoras olfatorias situadas en la parte superior de la mucosa nasal. Estas neuronas poseen cilios olfatorios que se estimulan por las sustancias químicas disueltas en el moco que recubre el epitelio nasal (Tortosa A; 2009) .
La mucosa olfatoria es una región especializada de la cavidad nasal. Histológicamente se presenta como un epitelio cilindrico pseudoestratificado que contiene diferentes tipos de células, entre ellos, las neuronas sensoriales en diferentes estados, las células básales y las células sustentaculares (estas últimas con características de células gliales). Los cuerpos celulares de las neuronas maduras se encuentran en diferentes niveles en la capa epitelial y proyectan sus axones directamente al sistema nervioso central, haciendo sinapsis con las células del bulbo olfatorio en donde se integra la función olfatoria .
Las células mitrales del bulbo olfatorio reciben las señales odoríferas percibidas por los receptores específicos localizados en las dendritas de las neuronas olfatorias, cuyos axones amielínicos atraviesan la lámina cribosa y distribuyen sus dendritas en la zona olfatoria de la mucosa pituitaria; estas estructuras neuronales terminales actúan como receptores odoríferos, capaces de definir miles de combinaciones químicas que constituyen los olores, sensibilidad notablemente variable de un individuo a otro y que disminuye con la edad.
El epitelio olfatorio consta de dos capas o compartimentos: la lámina propia o submucosa, que está asentada sobre el hueso o cartílago y es rica en vasos y tejido conectivo; y el neuroepitelio, que se encuentra separado de la submucosa por la membrana basal. La submucosa tiene una función de soporte y nutrición y las glándulas de Bowman penetran en ella atravesando la membrana basal.
El neuroepitelio olfatorio de los mamíferos está constituido por cuatro tipos de células: neuronas sensoriales olfatorias ciliadas (NSO) , neuronas en desarrollo, células básales (CBG) y células sustentaculares (SUS) . Estas células forman un epitelio pseudoestratificado columnar que se localiza en la cavidad nasal superior, en la zona turbinada media, en el septum y en la pared nasal en donde se encuentran neuronas receptoras maduras funcionales (Vanelli, 1995; Feron, 1998) .
Las neuronas del epitelio olfatorio transmiten las percepciones olfatorias al Sistema Nervioso Central (SNC) , a partir de un estímulo olfatorio captado por los receptores localizados en las dendritas, se genera un impulso que viaja a través del axón el cual hace sinapsis directamente con las células mitrales del bulbo olfatorio y estas células, a su vez mandan tractos axonales a las estructuras del sistema límbico. En el epitelio olfatorio se encuentran poblaciones celulares importantes para la formación de neuronas entre las que encontramos a las células madre, neuroblastos , neuronas inmaduras y neuronas sensoriales maduras.
Tanto las neuronas olfatorias maduras como las inmaduras expresan la isoforma III de la proteina tubulina β, que es especifica de las neuronas y la molécula de adhesión celular neuronal (NCAM) y vimentina. En el epitelio, las células básales se encuentran en continua división y su progenie da lugar a las neuronas dentro de la cavidad nasal. Estas células básales que se dividen continuamente son consideradas células pluripotenciales .
Las células pluripotenciales se dividen asimétricamente originando otra célula pluripotencial y una célula progenitora. Mientras la célula pluripotencial permanece cerca de la membrana basal, la célula progenitora se divide para formar células homologas y con ello dar origen a neuronas inmaduras que migran desde la membrana basal. La maduración final ocurre cuando el axón de la neurona olfatoria hace sinapsis en el bulbo olfatorio y sus dendritas alcanzan la superficie de la mucosa olfatoria (Sacerdote de Lustig E, 2001) .
En el neuroepitelio cada una de las células que lo constituyen tiene un papel importante para su funcionamiento:
1. Las células receptores olfatorias bipolares ciliadas tienen a un cilio especializado que proyecta varias dendritas hacia la superficie del neuroepitelio olfatorio que está en contacto con el medio ambiente y un axón que proyecta hacia el bulbo olfatorio, de tal manera que las neuronas olfatorias constituyen la puerta al SNC y son el enlace entre el medio interno cerebral y el medio ambiente. Cada axón de los 10 a 20 millones de neuronas receptoras olfatorias cruza la membrana basal del epitelio hacia la lámina propia, unidos en fascículos y nervios que pasan a través de los 15 a 20 orificios de la lámina cribosa del etmoides para hacer sinapsis dentro del bulbo olfatorio;
2. Las células sustentaculares rodean las neuronas receptoras para ayudar a regular y mantener el medio iónico apropiado para la transducción olfatoria;
3. Las células microvellosas que aun no se ha definido en la función olfatoria, sin embargo, su papel puede ser de sostén o para amplificar la superficie del neuroepitelio olfatorio.
4. Las células básales son las únicas que no se proyectan a la superficie epitelial y descansan en la membrana basal. Constituyen una población de células madre capaces de regenerar continuamente a las neuronas receptoras olfatorias a lo largo de la vida (Escada PA, et al; 2009) .
La conducción del estimulo olfatorio hacia el SNC se lleva a cabo cuando los receptores de las neuronas sensoriales olfatorias se acoplan a las sustancias odoríferas causando la activación de la adenilato ciclasa que esta acoplada a las proteínas G y de esta forma se incrementan los . niveles de adenosin monofosfato cíclico (AMPc) con la consecuente apertura de los canales de calcio causando la despolarización neuronal y la propagación del impulso nervioso hacia el bulbo olfatorio.
Otras vías de transducción utilizan el inositol trifosfato
(IP3) como segundo mensajero con la consecuente estimulación de los canales de calcio. Los potenciales de acción generados son transportados a lo largo de los axones hasta el bulbo olfatorio del cerebro.
Los trastornos mentales y conductuales se consideran afecciones de importancia clínica, y se caracterizan por alteraciones de los procesos de pensamiento, de la afectividad (emociones) o del comportamiento, dichas alteraciones son duraderas o recurrentes y causan angustia personal o alteraciones del funcionamiento en uno o más aspectos de la vida.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) , la salud mental es el "bienestar que una persona experimenta como resultado de su buen funcionamiento en los aspectos cognoscitivos, afectivos y conductuales, y, en última instancia el despliegue óptimo de sus potencialidades individuales para la convivencia, el trabajo y la recreación".
Según estudios de la OMS, las enfermedades neuropsiquiátricas tienen una prevalecencia puntual acumulada del 10% aproximadamente en la población adulta (OMS, 2000) . Alrededor de 450 millones de personas padecen enfermedades neuropsiquiátricas; entre las que se encuentran la depresión, el trastorno afectivo bipolar, la esquizofrenia, la epilepsia, los trastornos por consumo de alcohol y de sustancias psicoactivas , la enfermedad de Alzheimer y otras demencias, el trastorno de estrés postraumático, el trastorno obsesivo- compulsivo, el trastorno de pánico e insomnio primario, entre otras .
En México, los principales factores causantes de trastornos mentales son: la pobreza, el desempleo, el bajo nivel educacional, la violencia y abusos tales como el maltrato físico, emocional y/o sexual, la vida de la población rural, la niñez en situación de calle, el uso de drogas, la violencia social, la prostitución, la explotación, las enfermedades de transmisión sexual, las personas con discapacidad, madres adolescentes, la vejez, la discriminación, el racismo, los accidentes, las enfermedades crónico-degenerativas y genéticos, entre otras.
En 1994, los resultados obtenidos de la Encuesta Nacional de Adicciones realizada en zonas urbanas, detectaron la prevalencia de trastornos mentales entre el 15% y el 18% de la población en general; en esta encuesta se observa que la depresión es el trastorno más frecuente tanto en hombres como en mujeres, con 7.3%, siendo las mujeres quienes presentan una mayor prevalencia; un 4.7% sufre de epilepsia o es probable que la padezca, y un 0.65% padece trastorno bipolar, entre otros trastornos psiquiátricos en población adulta. Los resultados del estudio concuerdan con los realizados en otros países e indican que una de cada seis personas sufrirá un problema de salud mental que podría requerir atención médica especializada; esto significa que, en nuestro país, para una población aproximada de 103 millones de personas, padecen trastornos mentales aproximadamente 15 millones, lo que equivale a una sexta parte de nuestra población (Sandoval de Escurdia JM, et al; 2004) .
El diagnóstico clínico de las enfermedades neuropsiquiátricas requiere de habilidades esenciales en el médico y de procedimientos y entrenamientos específicos. En la actualidad las entrevistas estructuradas, las definiciones uniformes de síntomas y signos, y los criterios de diagnóstico normalizados como el realizado por la OMS a través del capítulo sobre Trastornos Mentales de la Clasificación Internacional de las Enfermedades y por la Asociación Americana de Psiquiatría con el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales siguen siendo las primeras opciones para el diagnóstico (Farher R, 2003) .
El objetivo del diagnóstico clínico inicial es permitir a'l psiquiatra el desarrollo de una estrategia terapéutica para el tratamiento y manejo del paciente con algún trastorno neuropsiquiátrico, sin embargo, el diagnóstico dependerá de las respuestas que dé el paciente en cada una de las escalas aplicadas. Esto limita la apreciación y un diagnóstico preciso de primera instancia que permita aplicar el tratamiento adecuado.
En el estado de la técnica se encuentra descrito un método para el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer mediante el uso de un anticuerpo monoclonal (MX/a/2007/010934 y ES 2 259 270) ; un método de producción de cultivos primarios de neuronas olfatorias purificadas de células sustentaculares y células básales obtenidas por disección del epitelio olfatorio de animales (US 5,308,763), las neuronas obtenidas demuestran respuesta a niveles fisiológicos de odorantes y expresan un marcador proteico específico, la vimentina; un método y kit para confirmar la existencia de un evento hemorrágico o de isquemia cerebral mediante la detección de cuatro marcadores en sangre (US 6,235,489); un método para preparar un cultivo primario de neuronas olfatorias a partir de células epiteliales olfatorias obtenidas por disección y un kit para determinar los efectos de odorantes en dichas neuronas (US 5,217,893); un método para diagnosticar Alzheimer mediante la detección de cambios en la proteina precursora amiloide o A68 mediante la utilización de un ionóforo en neuronas olfatorias obtenidas por aislamiento de tejido humano para ser utilizadas en prueba de neurotoxicidad, tamizaje de fármacos antivirales y para diagnóstico de Alzheimer (US 5,869,266); un método para generación in vitro de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos a partir de células aisladas del tubérculo olfatorio (US 6,040,180); un método para detectar o medir la cantidad de estrés oxidativo en Alzheimer mediante un marcador utilizado en una muestra de neuronas olfatorias obtenida mediante biopsia (US 20040146946); un método para el aislamiento, propagación y diferenciación de células madre del Sistema Nervioso Central in vitro obtenidas del tubérculo olfatorio (WO/ 1997 /044442 ) . Estas patentes tienen en común, que la muestra se obtiene a partir de una biopsia o disección del tejido olfatorio.
La presente invención se caracteriza porque la muestra se obtiene utilizando un dispositivo semi-rigido mediante un raspado o exudado en las fosas nasales, esto permite un mejor manejo del paciente y mayor seguridad para el diagnóstico, además de que con una sola muestra es posible propagar las neuronas para obtener una gran cantidad de neuronas funcionales lo que permite obtener cantidades suficientes de biomasa para efectuar determinaciones o cuantificaciones metabólicas, fisiológicas y estructurales. OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de un dispositivo incluido en un kit de reactivos y aditamentos para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas a partir de un cultivo de precursores neuronales obtenidos de la región turbinada media inferior de la cavidad nasal. Estas células precursoras forman neuronas maduras con características semejantes a las que presentan las neuronas del epitelio olfatorio in vivo, lo cual permite utilizarlas para caracterizar biomarcadores que permiten hacer un diagnóstico biológico específico y oportuno de las enfermedades neuropsiquiátricas .
La presente invención incluye una o más kits de reactivos y aditamentos para la obtención de la muestra (1), procesamiento y tratamiento de la muestra (2) y diagnóstico (3) que incluyen, en su caso de un dispositivo para la toma de muestra, los aditamentos, soluciones, medios de cultivo, controles, marcadores, manuales y guías para la interpretación. Estos kits de reactivos y aditamentos en conjunto, permiten realizar el diagnóstico de las enfermedades neuropsiquiátricas, así como el grado de avance de dichos padecimientos y/o la predisposición a alguna de éstas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIGURA 1. Elemento con cerdas del dispositivo para muestreo. FIGURA 2. Toma de muestra, asilamiento y mantenimiento inicial de células de la mucosa olfatoria.
FIGURA 3. Diferentes aplicaciones y combinaciones de los kits que conforman el "KIT NEO".
FIGURA 4. Imágenes de Células neuronales obtenidas de pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al novedoso uso de un dispositivo que consiste en un elemento con cerdas que poseen una tensión determinada. Las cerdas se encuentran distribuidas de manera helicoidal que forman un cilindro (A-l) o pirámide (B-l) (FIGURA 1), que puede presentar o no, un casquete protector en la punta distal, en relación a un aditamento que a su vez se mantiene unido a un vástago posicionador . Las cerdas tienen una tensión y dureza la cual es dependiente del número de cerdas y del diámetro de las mismas . Además son flexibles y son de un material que permite su esterilización. Estas características permiten extraer las células del epitelio nasal incluidos precursores y neuronas de manera no invasiva, en dos etapas, la primera de limpieza y la segunda de remoción celular, tal que las cerdas de extracción están en contacto uno a uno con el epitelio pseudoestratificado nasal, causando el mínimo de molestia al paciente. El aditamento que mantiene a las cerdas posicionadas de forma helicoidal es de material plástico y/o metálico. El vástago que sujeta a las cerdas y el aditamento posee un sistema que permite el intercambio del dispositivo de cerdas, que es desechable. El "kit" de reactivos y aditamentos para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas consiste de una serie de soluciones y medios con una composición caracterizada porque permite la liberación de las células adheridas a las cerdas y su posterior mantenimiento en cultivo. Los medios y las soluciones se encuentran contenidos en frascos debidamente identificados para cada una de las etapas del proceso.
La solución NEOl contiene el medio de cultivo caracterizado por contener uno o más aminoácidos, una o más sales minerales, una o más vitaminas, uno o más factores de crecimiento de origen natural, y uno o más antibióticos.
La solución NE02 contiene uno o más reguladores de pH, y uno o más agentes quelantes de calcio, cuya función es humectar las células que posteriormente serán propagadas.
La solución NE03 contiene una o más sustancias que rompan proteínas y que permite la separación entre las células dispersándolas .
La solución NE04 contiene una o más sustancias que permitan fijar las células a un soporte caracterizado por ser de vidrio.
La solución NE05 de criopreservación que contiene uno o más agentes crioprotectores de las células de origen neuronal.
La solución NE06 de diferenciación que contiene la solución para mantenimiento sin factores de crecimiento de origen natural, y un compuesto nucleótido cíclico que induce la diferenciación .
La solución NE07 que contiene uno o más identificadores de moléculas proteicas específicas de la estructura neuronal tales que permiten distinguirlas células neuronales de pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas de sujetos sanos.
La solución NE08 contiene uno o más identificadores fluorescentes y/o enzimáticos para reconocer a los identificadores de la solución NE07.
El "kit-NEO" que contiene de manera no limitativa, el dispositivo de cerdas helicoidales apareadas, el vástago intercambiador, tubos cónicos contenedores de células con tapa de material fácilmente lavable y esterilizable, un contenedor para tubos, un dispositivo para el crecimiento y el mantenimiento de las células que contiene un soporte de vidrio o de plástico, y frascos de propagación de biomasa, soluciones para crecimiento y diferenciación de las células de origen neuronal, tubos contenedores para criopreservación, la solución criopreservadora, soluciones para diagnóstico, manual de instrucciones, y guia para interpretación de resultados.
De manera sorprendente y no reportada en el estado de la técnica actual este "kit-NEO" es usado para el crecimiento, desarrollo, identificación, diferenciación y cuantificación de células neuronales olfatorias. A la luz de esta invención se obtiene de manera conveniente económica, rápida, no invasiva el proceso para obtener de manera certera la confirmación sobre enfermedades neuropsiquiátricas tales como: la depresión, el trastorno afectivo bipolar, la esquizofrenia, la epilepsia, los trastornos por consumo de alcohol y de sustancias psicoactivas, la enfermedad de Alzheimer y otras demencias, el trastorno de estrés postraumático, el trastorno obsesivo-compulsivo, el trastorno de pánico e insomnio, entre otras.
De manera no limitativa el "Kit-NEO" presenta las siguientes ventajas:
- Obtención de neuronas con un procedimiento rápido, indoloro, no invasivo y con un mínimo de molestia para los pacientes neuropsiquiátricos cuyo manejo es delicado y difícil.
- Asegura la remoción celular por medio del dispositivo de cerdas helicoidales apareadas.
- Permite la comercialización de un sistema de diagnóstico preciso, sensible, rápido, selectivo "in vivo" que es de uso en clínicas, hospitales, institutos, escuelas, universidades y laboratorios.
- El "kit-NEO" contiene todos los recursos para la realización del diagnóstico en condiciones de fácil acceso para el usuario.
- El "kit-NEO" es un sistema llave en mano, es decir listo para ser utilizado.
Esta novedosa invención consiste en un proceso para obtener neuronas a partir de células del epitelio olfatorio para su propagación, cultivo in vitro y criopreservación que consiste de manera general en los siguientes pasos: 1) toma de muestra de mucosa olfatoria, aislamiento y mantenimiento inicial de las células, 2) Propagación y mantenimiento, 3) Incubación, 4) Ensayo de diferenciación, inmunofluorescencia y conteo de célula-s, y 5) criopreservación.
De manera no limitativa este "kit-NEO" posee la novedosa característica de ser utilizado para diferentes aplicaciones de acuerdo a las necesidades del usuario (FIGURA 3) :
"kit-NEO-I" cuya función es proporcionar al usuario todo lo necesario para la toma de muestra, aislamiento y mantenimiento inicial de células de la mucosa olfatoria (FIGURA 2), es decir, contiene el dispositivo de cerdas helicoidal apareado, el vástago intercambiador, los tubos cónicos conteniendo la solución NEOl, el contenedor para tubos, un dispositivo para el crecimiento y el mantenimiento de las células, y el manual con instrucciones para la toma de muestra al paciente.
"kit-NEO-II" que permite la propagación y mantenimiento de las células de origen neuronal que contiene el soporte de cultivo que contiene la solución NEOl, un frasco que contiene la solución NE02, un frasco que contiene la solución NE03, un dispositivo para el crecimiento y el mantenimiento de las células que contiene un soporte de vidrio o de plástico y el manual de instrucciones para la obtención de biomasa.
"kit-NEO-III" para la criopreservación de las células de origen neuronal, que se caracteriza por contener, la solución NEOl, la solución NE05, tubos contenedores para la criopreservación y manual de instrucciones.
"kit-NEO-IV" para la diferenciación de las células de origen neuronal, que consiste en la solución NE04, la solución NE06, un soporte celular tal que permite la fijación de células y que es transparente a la luz ultravioleta y manual de instrucciones .
"kit-NEO-V" para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas que contiene la solución NEOl, la solución NE02, la solución NE03, la solución NE04, la solución NE07, la solución NE08, un soporte celular tal que permite la fijación de células y que es transparente a la luz ultravioleta, un manual de instrucciones y una guia para la interpretación de resultados .
La posibilidad de obtener neuronas vivas de pacientes psiquiátricos se vio resuelto en los últimos años con las investigaciones que demuestran que durante la etapa adulta, las dos únicas regiones donde se lleva a cabo la formación de nuevas neuronas son el bulbo olfatorio y el hipocampo. En el estado de la técnica se encuentran descritos procedimientos para obtener neuronas a partir de tejido epitelial olfatorio, sin embargo, el tejido se obtiene mediante biopsia de pacientes vivos, de cadáveres o de animales.
La principal característica de la novedosa invención se observa en el paso de la toma de muestra de la mucosa olfatoria, ya que en dicho procedimiento, se emplea un muestreador especialmente diseñado para obtener una muestra representativa de tejido epitelial olfatorio de forma no invasiva. Esta manera de adquirir la muestra elimina el método comúnmente empleado que consiste en una biopsia del tejido epitelial, la cual incluye el uso de anestésicos que pueden interferir en el desarrollo y en la estructura de las células de origen neuronal. Un método invasivo puede provocar reacciones no deseadas en los pacientes con alguna enfermedad neuropsiquiátrica, por lo que la aplicación del novedoso kit NEO descrito permite un mejor manejo del paciente ya que se lleva a cabo de manera segura, se evita algún traumatismo o efectos secundarios de los agentes anestésicos, y permite obtener con una sola muestra, la cantidad de neuronas requeridas para realizar el o los análisis correspondientes. Mediante el novedoso dispositivo y procedimiento de muestreo, se pueden obtener cultivos de células de origen neuronal cuyas aplicaciones de manera no limitativa son: obtención y propagación de cultivos neuronales, diagnóstico del padecimiento de enfermedades neuropsiquiátricas , diagnóstico de predisposición al padecimiento de enfermedades neuropsiquiátricas, seguimiento de la patología del paciente para determinar modificaciones en el tratamiento, obtención de neuronas para trasplantes neurales, obtención de neuronas para el desarrollo de la investigación mediante estudios in vitro, obtención de células madre multipotenciales y seguimiento de uso y abuso de sustancias, entre otros descritos en el estado de la técnica para el manejo de cultivos celulares.
El diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas en la actualidad consiste principalmente en cuestionarios, exámenes estandarizados e imágenes cerebrales con los cuales se determina de manera no confirmativa, el estado mental de los pacientes. En la presente invención se establece el uso del kit NEO para el muestreo y obtención de células del epitelio olfatorio, su propagación, cultivo in vitro y criopreservación . Una vez que se obtienen las células de origen neuronal, es posible distinguir morfológicamente las neuronas de pacientes neuropsiquiátricos , de las neuronas de sujetos sanos; basado en las modificaciones que provoca el padecimiento de estas enfermedades en la morfología, cantidad, organización y distribución de los microtúbulos en el soma de las neuronas, en los centros organizadores de los microtúbulos, en las neuritas y en los conos de crecimiento, como se puede observar en la FIGURA 4, donde se observan imágenes obtenidas mediante el procedimiento descrito en la presente patente, de células neuronales de un Control (CTL) , un paciente Esquizofrénico (EZ) , de un paciente con Trastorno Bipolar (TB) y de un paciente con Demencia fronto temporal (D-FT) .
En el estado de la técnica actual, existen métodos para la obtención de células multipotenciales neuronales a partir de tejido embrionario o fetal, lo que conlleva a dilemas éticos. Por otra parte, las células multipotenciales de diversas regiones del SNC adulto han sido aisladas, sin embargo, no pueden ser removidas de estas regiones sin consecuencias serias para el donador. La identificación y caracterización mediante el novedoso "kit NEO" que permite un fácil acceso a células multipotenciales neuronales, las cuales puedan ser obtenidas sin causarle algún daño al donante o paciente.
A continuación se describe de manera no limitativa a manera de ejemplo, el uso del kit NEO:
EJEMPLO 1: Uso del KIT-NEOl
La preparación del paciente para la toma de muestra consiste en la limpieza de las fosas nasales y humectación. Toma de muestra (A-2 de la FIGURA 2), utilizar para el exfoliado dispositivo de cerdas helicoidales apareadas y el vástago intercambiador contenido en este kit. Dispersión de células exfoliadas en solución NEOl .
EJEMPLO 2: Uso del KIT-NE02
Dispersión y cultivo de las células exfoliadas en solución NEOl y separación de células en solución NE02 y solución NE03 obteniendo las células disociadas (B-2 de la FIGURA 2). La incubación se realiza a una temperatura de 37 °C por un tiempo determinado (C-2 de la FIGURA 2) . Con este kit se puede incrementar el número de células de origen neuronal con las que se puede trabajar.
EJEMPLO 3: Uso del KIT-NE03
Las células obtenidas se criopreservan utilizando la solución NE05. Se congelan a temperaturas menores de -70°C con el fin de conservarlas para su posterior uso ya sea en el diagnóstico o para su propagación.
EJEMPLO 4: Uso del KIT-NE04
Las células propagadas en solución NEOl, se transfieren a la solución NE06, posteriormente se colocan en la solución NE04 para obtener neuronas diferenciadas listas para la realización de pruebas de diagnóstico estructural.
EJEMPLO 5: Uso del KIT-NE05
Las células fijadas al soporte celular con la solución NE04 se colocan en la solución NE07 por un tiempo determinado, posteriormente se retira la solución NE07 y se adiciona la NE08 y se deja por un tiempo más. Para el diagnóstico se requiere del montaje de las células adheridas a otro soporte de mayor dimensión y con características de transparencia (FIGURA 4) .

Claims

REIVINDICACIONES
El uso de un dispositivo solo o en combinación con uno o más kits de reactivos y aditamentos para la obtención de células neuronales a partir de precursores neuronales y neuronas extraídos del epitelio nasal y su uso para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas .
Un dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, que consiste en: a) un aditamento con cerdas que se encuentran distribuidas de forma helicoidal, las cerdas poseen una tensión y dureza características y, de manera opcional, un casquete protector en la punta distal
Un dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, que es un vástago de material rígido que posee uno o varios sistemas que permiten el intercambio del dispositivo con cerdas .
Las cerdas del dispositivo de conformidad con la reivindicaciones 1 a 2 son de uno o más material polimérico, copolímero o sus derivados, duro, flexible o combinaciones de los mismos, fácilmente lavable y esterilizable .
El uso del dispositivo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, para la limpieza y remoción de precursores neuronales y neuronas del epitelio nasal.
El dispositivo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza para el muestreo de precursores neuronales, neuronas y/o células epiteliales presentes en las fosas nasales.
7. Un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque se utilizan para el muestreo, aislamiento, y mantenimiento de precursores neuronales y/o neuronas obtenidas a partir del epitelio nasal.
8. Un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque se utilizan para el muestreo, aislamiento, propagación y mantenimiento de precursores neuronales y/o neuronas obtenidas a partir del epitelio nasal.
9. Un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque se utilizan para el muestreo, aislamiento, propagación, mantenimiento y criopreservación de precursores neuronales y/o neuronas obtenidas a partir del epitelio nasal.
10. Un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque se utilizan para el muestreo, aislamiento, propagación, mantenimiento, criopreservación, ensayos de diferenciación, inmunofluorescencia y conteo de precursores neuronales y/o neuronas obtenidas a partir del epitelio nasal.
11. Un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque se utilizan para el muestreo, aislamiento, propagación, mantenimiento, criopreservación, ensayos de diferenciación, inmunofluorescencia, conteo de precursores neuronales y/o neuronas obtenidas a partir del epitelio nasal para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas .
12. Un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque se utilizan para el muestreo, aislamiento, mantenimiento de precursores neuronales y/o neuronas obtenidas a partir del epitelio nasal y el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas, estudios genéticos, determinación de anticuerpos, determinación de virus y/o bacterias y/o parásitos para una detección temprana de indicadores patógenos usados para una intervención oportuna y preventiva de las enfermedades neuropsiquiátricas, encefalitis, meningitis y/o influenza, asi como el grado de avance de dichos padecimientos y/o la predisposición a alguna de estas enfermedades, entre otras asociadas a los desórdenes a nivel del Sistema Nervioso Central en mamíferos .
13. El uso de un dispositivo de muestreo y/o uno o más kits de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas tales como la depresión, el trastorno afectivo bipolar, la esquizofrenia, la epilepsia, los trastornos por consumo de alcohol y de sustancias psicoactivas, la enfermedad de Alzheimer y otras demencias, el trastorno de estrés postraumático, el trastorno obsesivo-compulsivo, el trastorno de pánico e insomnio, así como el grado de avance de dichos padecimientos y/o la predisposición a alguna de estas enfermedades, entre otras asociadas a los desórdenes a nivel del Sistema Nervioso Central en mamíferos .
14. Un kit caracterizado porque contiene uno o más dispositivos de cerdas helicoidales apareadas, uno más vástagos intercambiadores, uno o más dispositivos para el crecimiento y mantenimiento de las células que consiste en uno o más soportes de vidrio y/o plástico, uno o más soportes celulares tales que permitan la fijación de células y que sean transparentes a la luz ultravioleta, uno o más tubos cónicos, uno más frascos de la solución NEOl, uno más frascos de la solución NE02, uno más frascos de la solución NE03, uno más frascos de la solución NE04, uno más frascos de la solución NE05, uno más frascos de la solución NE06, uno más frascos de la solución NE07, uno más frascos de la solución NE08, uno o más contenedores para tubos, uno o más dispositivos para el crecimiento y el mantenimiento de las células, uno o más manuales, uno o más guías, con instrucciones para la toma de muestra al paciente, para el crecimiento y mantenimiento de las células, para la obtención de biomasa, para la criopreservación, para la fijación de células, para la inmunotinción de marcadores específicos y/o para la obtención e interpretación de resultados .
15. La solución NEOl de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque contiene uno o más aminoácidos, una o más sales minerales, una o más vitaminas, uno o más factores de crecimiento de origen natural y/o uno o más antibióticos .
16. La solución NE02 de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque contiene uno o más reguladores de pH y/o uno o más agentes quelantes de calcio .
17. La solución NE03 de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque contiene una o más sustancias que rompan proteínas .
18. La solución NE04 de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque contiene una
0 más sustancias que permitan fijar a las células a un soporte tal que permite la fijación de células y que es transparente a la luz ultravioleta.
19. La solución NE05 de conformidad con la reivindicación
1 a 14 caracterizada porque contiene uno o más agentes crioprotectores de las células de origen neuronal .
20. La solución NE06 de conformidad con la reivindicación 1 a 14 caracterizada porque contiene uno o más aminoácidos, una o más sales minerales, una o más vitaminas, uno o más antibióticos y/o uno o más compuestos nucleótidos cíclicos.
21. La solución NE07 de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque contiene uno o más identificadores de moléculas proteicas específicas de la estructura neuronal.
22. La solución NE08 de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque contiene uno o más identificadores fluorescentes y/o enzimáticos capaces de reconocer a los identificadores de la solución NE07.
23. El uso de uno o más kits de conformidad con las reivindicaciones 1 a 22, para el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas , estudios genéticos, determinación de anticuerpos, determinación de virus y/o bacterias y/o parásitos para una detección temprana de indicadores patógenos usados para una intervención oportuna y preventiva de las enfermedades neuropsiquiátricas, encefalitis, meningitis y/o influenza, asi como el grado de avance de dichos padecimientos y/o la predisposición a alguna de estas enfermedades, entre otras asociadas a los desórdenes a nivel del Sistema Nervioso Central en mamíferos.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5726060A (en) * 1991-09-17 1998-03-10 Bridges; Michael Anthony Method for culturing mammalian respiratory epithelial cells
WO2000032110A1 (en) * 1998-12-02 2000-06-08 Mdz Beheer B.V. Brush suitable for taking a smear

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5726060A (en) * 1991-09-17 1998-03-10 Bridges; Michael Anthony Method for culturing mammalian respiratory epithelial cells
WO2000032110A1 (en) * 1998-12-02 2000-06-08 Mdz Beheer B.V. Brush suitable for taking a smear

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNOLD S. E. ET AL.: 'Dysregulation of olfactory receptor neuron lineage in schizophrenia.' ARCH GEN PSYCHIATRY. vol. 58, September 2001, pages 829 - 835 *
BENITEZ-KING, G. ET AL.: 'A non-invasive method to isolate the neuronal linage from the nasal epithelium from schizophrenic and bipolar disease.' JOURNAL OF NEUROSCIENCE METHODS. vol. 201, 07 August 2001, pages 35 - 45 *
RUTLAND J. ET AL.: 'Non-invasive sampling of nasal cilia for measurement of beat frequency and study of ultrastructure.' THE LANCET. vol. 2, no. 8194, 13 September 1980, pages 564 - 565 *

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