WO2012095792A1 - Derivados de açúcar com actividade tensioactiva e antimicrobiana - Google Patents

Derivados de açúcar com actividade tensioactiva e antimicrobiana Download PDF

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WO2012095792A1
WO2012095792A1 PCT/IB2012/050123 IB2012050123W WO2012095792A1 WO 2012095792 A1 WO2012095792 A1 WO 2012095792A1 IB 2012050123 W IB2012050123 W IB 2012050123W WO 2012095792 A1 WO2012095792 A1 WO 2012095792A1
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dodecyl
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bacillus anthracis
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Inventor
Amélia Pilar GRASES SANTOS SILVA RAUTER
Alice Isabel MENDES MARTINS
João Miguel DA CRUZ MORGADO AGOSTINHO CAIO
João Pedro ALMEIDA PAIS
Patrícia Filipa ALVES SERRA
Maria da Soledade COSTA CRAVO DA SILVA SANTOS
Ana Cristina ROSADO PELERITO DE ARAÚJO GONÇALVES
Jorge Alberto Guerra Justino
Ricardo Pedro MOREIRA DIAS
Rogério Paulo DE ANDRADE TENREIRO
Original Assignee
Universidade De Lisboa
Instituto Nacional De Saúde Dr. Ricardo Jorge
Instituto Politécnico De Santarém
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/30—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests characterised by the surfactants
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    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to compounds derived from sugars, characterized in that they are alkyl deoxyglycosides with antimicrobial properties, particularly against three strains of Bacillus anthracis.
  • the compounds of the present invention have a bacteriostatic and / or bactericidal inhibitory mechanism of action, inhibiting the growth of Bacillus species, preferably pathogenic Bacillus anthracis, Bacillus anthracis vaccinei and Bacillus anthracis ovina.
  • Some ionic surfactants particularly cationic ones, exhibit antimicrobial properties.
  • nonionic surfactants are less toxic and aggressive than the former justifies the invention of new nonionic surfactants, which involves their synthesis and subsequent application as biocidal agents.
  • L-series alkyl deoxyglycosides namely octyl and dodecyl 2,6-dideoxy-L-hexopyranoside, the synthesis of which was first developed at the FCUL Glucose Chemistry Laboratory, were found to be selective for Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis and hysteria monocytogenes and have activities promising antimicrobials [1, 2] while dodecyl glucoside is neither selective nor bioactivable comparable to this type of compounds [3].
  • the compounds of the present invention in addition to exhibiting biocidal activity exhibit reduced toxicity.
  • the present invention relates to a novel family of deoxygenated sugars which are non-toxic and exhibit antibiotic activity on three Bacillus anthracis strains and one Bacillus cereus strain.
  • Melting points were measured in capillaries in a Melting Point Apparatus apparatus, SMP3, Stuart Scientific, Bibby.
  • the present invention relates to sugar derived surfactant compounds which are deoxyglycosides series D and having the general formulas I and II:
  • R alone represents hydrogen or a methyl group
  • X represents sulfur or hydrogen
  • Y represents hydrogen or fluorine
  • the compounds have a bacteriostatic and / or bactericidal inhibitory mechanism of action and inhibit the growth of Bacillus species, preferably pathogenic Bacillus anthracis, Bacillus anthracis vaccinei and Bacillus anthracis ovina, with a minimum inhibitory concentration of between 8 mg. / l and 16 mg / l.
  • Another object of the present invention is the process of obtaining the compounds described above, which comprises the following steps: a. glycosylation reaction, using as a glycosyl donor a glycine and as glycosyl acceptor an alcohol or its long chain analog;
  • the obtaining process further comprises a deoxygenation step at position 6.
  • the glycolysis reaction occurs under stirring at room temperature for at least 12 hours.
  • the deacetylation reaction takes place under stirring at room temperature for at least 45 minutes.
  • deoxygenation occurs under stirring at room temperature for at least 72 hours.
  • the compounds of the present invention are used in the pharmaceutical industry, the cosmetic industry, the agrochemical industry and / or as a cleaning material.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • Bacillus anthracis pathogenic, vaccine and sheep
  • Bacillus cereus, belonging to the collection of INSA-National Institute of Health Doctor Ricardo Jorge, Portugal.
  • the minimum inhibitory concentrations (MIC) values were 8 mg / l for dodecyl 2,6-dideoxy- ⁇ -arajbi.nohexopyranoside (2) and 16 mg / l L for dodecyl 2,6-dideoxy-D-arajbinohexopyranoside compound (1).
  • Muller-Hinton Broth (MHB) medium (BioKar Diagnostics) was prepared according to the manufacturer's instructions: 21.0 g of medium dissolved in 1L distilled water (Milli-RO). The medium was autoclaved at 121 ° C for 15 min.
  • Dodecyl 2,6-dideoxy-D-arajinoxyroopyroside compounds (1), dodecyl 2,6-dideoxy-L-arajinoxyroopyroside (2) and 2-deoxy-D-threo compounds were tested.
  • concentrations of 16.8.4 and 2 mg / L were tested.
  • Antibiotic solutions were sterilized by syringe filtration with 0.45 ⁇ (Millipore) diaphragm polytetrafluoroethylene hydrophilic filters.
  • ATCC 6633 Bacillus subtilis
  • ATCC 11778 Bacillus cereus
  • ATCC 14579 Bacillus cereus
  • ATCC 29213 Staphylococcus aureus
  • ATCC 8739 Erichia coli
  • Inocula were prepared from freeze-dried and / or frozen cultures and flushed into Erlenmeyer flasks with about 50 mL of MHB medium. Incubation was overnight in a shaking water bath (200 rpm) at 35 ° C. After growth, colony suspensions similar to McFarland scale 0.5 (approximately at 1-2x10 8 CFU / mL) were prepared. To do this, the absorbance of the MHB culture medium at 625 nm was measured on a UV / Vis spectrophotometer (UNICAM) against the uncultivated medium which functioned as blank. Whenever necessary, culture dilutions were made in MHB medium so that the absorbance value was between 0.08 and 0.10. After normalization, a 1/10 dilution was performed.
  • UNICAM UV / Vis spectrophotometer
  • Microplate wells were filled with 150 ⁇ l MHB supplemented with each compound at the concentrations described above and 10 ⁇ l suspension of each strain to obtain an inoculum of approximately 5x10 5 CFU per well, and wells were reserved for the positive and negative controls. (MHB, MHB and DMSO, MHB and strains).
  • microplates were inserted into an automated reading system (Zenyth 3100, Anthos) and the change in absorbance at 595 nm was monitored at 10 min intervals during 72 h incubation at 35 ° C with shaking. The same growth conditions were monitored on similar equipment (Bioscreen) for comparative purposes. A third and fourth microplates were incubated in an oven at 30 ° C and 35 ° C without shaking for the same time period.
  • Figure 4 Structure of the dodecyl compound 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-deoxy-D-arachinohexopyranoside.
  • Figure 7 Structure of compound 3,4-Di-O-acetyl-D-xylyl.
  • Figure 8 Structure of dodecyl 3,4-Di-O-acetyl-2-deoxy-D-threo pentopyranoside compound.
  • Figure 9 Structure of dodecyl 4-0-Acetyl-2,3-dideoxy-D-glycero-pent-2-enopyranoside compound.
  • NCCLS Methods for Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically: Approved Standard, 3rd ed .; Villanova, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1993, M7-A3.
  • NCCLS (1997). Methods for Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically: Approved Standard, 4th ed. ; Villanova, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, M7-A4.

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Abstract

O presente invento diz respeito a compostos tensioactivos derivados de açúcares com actividade antimicrobiana sobre espécies de Bacillus, em particular de Bacillus anthracis. A presente invenção compreende ainda o processo de obtenção dos compostos tensioactivos derivados de açúcares com actividade antimicrobiana. Os compostos da presente invenção podem ser utilizados na nas áreas farmacêutica, cosmética e agroquímica, bem como na área da segurança, no domínio do combate ao bioterrorismo.

Description

DESCRIÇÃO
DERIVADOS DE AÇÚCAR COM ACTIVIDADE TENSIOACTIVA E ANTIMICROBIANA
Campo da Invenção
A presente invenção diz respeito a compostos derivados de açúcares, caracterizados por serem desoxiglicósidos de alquilo, com propriedades antimicrobianas, particularmente contra três estirpes de Bacillus anthracis .
Os compostos da presente invenção possuem um mecanismo de acção inibitória, bacteriostática e/ou bactericida, inibindo o crescimento de espécies de Bacillus, preferencialmente de Bacillus anthracis patogénica, Bacillus anthracis vacinai e Bacillus anthracis ovina.
Técnica Anterior
Alguns tensioactivos iónicos, particularmente os catiónicos, apresentam propriedades antimicrobianas. No entanto, o facto de os tensioactivos não iónicos serem menos tóxicos e agressivos que os primeiros, justifica a invenção de novos tensioactivos não iónicos, que envolve a sua síntese e posterior aplicação como agentes biocidas.
Desoxiglicósidos de alquilo da série L, nomeadamente os 2 , 6-didesoxi-L-hexopiranósido de octilo e de dodecilo, cuja síntese foi desenvolvida pela primeira vez no Laboratório de Química dos Glúcidos da FCUL, revelaram ser selectivos para Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis e histeria monocytogenes e possuir actividades antimicrobianas promissoras [1, 2] enquanto que o glucósido de dodecilo não é selectivo nem tem bioactividade comparável a este tipo de compostos [3].
Os compostos da presente invenção para além de apresentarem actividade biocida apresentam reduzida toxicidade.
Descrição pormenorizada da invenção
A presente invenção diz respeito a uma nova família de açúcares desoxigenados que são não tóxicos e apresentam actividade antibiótica sobre três estirpes de Bacillus anthracis e uma estirpe de Bacillus cereus.
As vantagens destes compostos, relativamente aos existentes actualmente no mercado, são as seguintes:
Produção sustentável e ecológica
A síntese de surfactantes baseados em estruturas glucídicas é uma área promissora da chamada "Química Verde", na medida em que pode ser efectuada a partir de recursos renováveis diversos, apresentando os compostos formados um bom índice de biodegradabilidade .
Reduzida toxicidade
Apesar de algumas entidades desta série de compostos serem dotadas de toxicidade para os linfócitos humanos, observou- se uma resposta dependente da dose, para os -anómeros de ambos os 2-desoxi-araj ino-hexopiranósidos de alquilo, sugerindo que é possível encontrar uma concentração bioactiva e, simultaneamente, desprovida de toxicidade aguda para o ser humano .
Aplicações diversificadas As vantagens descritas acima, conferem a estes compostos um vasto espectro de aplicação nas áreas farmacêutica, cosmética e agroquimica, bem como na área da segurança, no domínio do combate ao bioterrorismo .
Vantagens económicas
0 processo de síntese não é oneroso, quando comparado com o de outros antibióticos. A possibilidade de recorrer a desperdícios de biomassa diversificados diminui o preço das matérias-primas, o que é, claramente, uma mais-valia económica e ambiental.
Descrição do método
Síntese dos compostos
Os compostos foram sintetizados através das seguintes etapas :
• Reacção de glicosilação, utilizando como dador de glicosilo um glical e como aceitador de glicosilo um álcool ou seu análogo de cadeia longa.
• Desacetilação .
• Desoxigenação na posição 6, quando for o caso. PARTE EXPERIMENTAL
Foram utilizados reagentes e solventes analiticamente puros (Sigma, Fluka, e Acros) . 0 diclorometano foi utilizado como solvente em algumas das reacções, tendo-se procedido à sua secagem prévia com peneiros moleculares 4 Ã, os quais foram activados na estufa, a 200 °C. O tetra-hidrofurano (THF) utilizado nas reacções foi destilado previamente com benzofenona e sódio. A Amberlite, utilizada para a neutralização do meio, foi previamente lavada com água e metanol várias vezes.
O decorrer das reacções foi seguido através de cromatografia em camada fina (c.c.f.) utilizando-se placas de silica-gel (Merck) . Após a eluição, as placas foram pulverizadas com um revelador químico, constituído por ácido sulfúrico, 10%, em etanol.
No processo de purificação de compostos recorreu-se ao uso de cromatografia em colunas de vidro, utilizando-se como fase estacionária silica-gel 60G (0.015-0.040mm) e silica- gel 60G (0.040-0.063 mm), ambas da Merck. A eluição foi feita com misturas de acetato de etilo e de ciclo-hexano, em proporções adequadas .
Os pontos de fusão foram medidos em tubos capilares num aparelho Melting Point Apparatus, SMP3, Stuart Scientific, Bibby .
As rotações específicas [a]2^ dos diversos produtos foram medidas através do polarímetro Perkin Élmer 343.
Os espectros de ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN) e de carbono (13C-RMN) foram registados num espectrómetro Bruker Avance 400. Nos espectros de 1H-RMN foi utilizado tetrametilsilano (TMS) como padrão interno e nos espectros de 13C-RMN foi usado o sinal do próprio solvente como referência.
Sumário da Invenção
A presente invenção tem como objecto compostos tensioactivos derivados de açúcar que são desoxiglicósidos de alquilo da série D e apresentarem as fórmulas gerais I e II :
Figure imgf000006_0001
II
em que :
R representa, isoladamente, hidrogénio ou um grupo metilo,
X representa enxofre ou hidrogénio,
Y representa hidrogénio ou flúor
n = 1, 2
m > 10.
Numa realização preferencial, os compostos possuem um mecanismo de acção inibitória, bacteriostática e/ou bactericida e inibem o crescimento de espécies de Bacillus, preferencialmente de Bacillus anthracis patogénica, Bacillus anthracis vacinai e Bacillus anthracis ovina, com uma concentração inibitória mínima ser entre 8 mg/l e 16 mg/L . Um outro objecto da presente invenção é o processo de obtenção dos compostos descritos acima, que compreende os seguintes passos: a. reacção de glicosilação, utilizando como dador de glicosilo um glical e como aceitador de glicosilo um álcool ou seu análogo de cadeia longa;
b. desacetilação;
c. filtração e evaporação.
Numa forma de realização preferencial, o processo de obtenção compreende ainda um passo de desoxigenação na posição 6.
Numa outra forma de realização preferencial, a reacção de glicolisação ocorre sob agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 12 horas.
Ainda noutra forma de realização preferencial, a reacção de desacetilação ocorre sob agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 45 minutos.
Ainda noutra forma de realização preferencial, a desoxigenação ocorre sob agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 72 horas.
É ainda objecto da presente invenção uma composição química que compreende os compostos descritos acima e obtidos pelo processo descrito anteriormente.
Os compostos da presente invenção são usados na indústria farmacêutica, na indústria cosmética, na indústria agroquímica e/ou como material de limpeza. Exemplos de preparação
Para uma mais fácil compreensão da invenção descrevem-se de seguida exemplos de realizações preferenciais do invento, as quais, contudo, não pretendem, limitar o objecto da presente invenção.
EXEMPLO 1
Preparação de 2 , 6-didesoxi-a-D-arabi.no-hexopiranósido de dodecilo
Procedimento geral da reacção de glicosilação
A uma solução de glucal (5g, 18.38 mmol) em diclorometano anidro (12 mL), foi adicionado o nucleófilo (36.37 mmol) e uma solução de brometo de trifenilfosfónio, (TPHB) (716 mg. 2.115 mmol) em diclorometano anidro. A reacção foi mantida sob agitação à temperatura ambiente durante 12 horas. De seguida, adicionou-se diclorometano e a solução foi lavada com uma solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. A evaporação da fase orgânica e separação do resíduo obtido por cromatografia em coluna (c.c.) com eluente EtOAc/Cy-Hex levou à obtenção dos dois anómeros 2- desoxigenados .
Procedimento geral da reacção de desacetilação
A uma solução do açúcar (2.1 mmol) em MeOH (105 mL) foi adicionada uma solução de metóxido de sódio 1% em metanol (11 mL) . De seguida, a mistura foi deixada sob agitação à temperatura ambiente, durante 45 minutos. Após neutralização da solução com Amberlite (IR-120) procedeu-se à filtração e evaporação, obtendo-se o açúcar 2- desoxigenado ou 2 , 6-didesoxigenado .
Procedimento geral da reacção de tosilação
A uma solução do açúcar (1.5 mmol) em CH2CI2 (3 mL) foi adicionado cloreto de tosilo (3.3 mmol, 0.68 g) e piridina (3 mL) a 0 °C. De seguida, deixou-se levar à temperatura ambiente, ficando sob agitação durante 2 horas. Lavou-se a solução com NaHCC>3, extraiu-se a fase inorgânica com CH2CI2 e levaram-se as fases orgânicas reunidas ao evaporador rotativo. A purificação do resíduo obtido foi feita por c.c. com eluente 1:1 (EtOAc : cy-Hex) , obtendo-se assim o açúcar tosilado.
Procedimento geral da reacção de desoxigenação
A uma solução do açúcar (2.91 mmol) em tetra-hidrofurano (THF) (44 mL) foi adicionado hidreto de alumínio e lítio (LAH) (10.19 mmol, 0.39 g) a 0 °C. De seguida, deixou-se levar à temperatura ambiente, ficando sob agitação durante 72 horas. Adicionou-se EtOAc, gota a gota, até deixar de haver formação de efervescência. Seguidamente, colocou-se gelo até se dissolver o hidróxido de lítio formado e adicionou-se CH2CI2. Filtrou-se a solução e levou-se ao evaporador rotativo. A purificação foi feita por c.c. com eluente 5:1 (EtOAc : cy-Hex ) , obtendo-se assim o açúcar desoxigenado na posição 6.
Síntese de 3, 4, 6-tri-0-acetil-2-desoxi-a-D-araJ ino- hexopiranósido de dodecilo (4) A reacção de 3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2-desoxi-D-araJ ino-hex-l- enitol (composto de partida) com dodecanol (8.14 mL, 36.37 mmol) deu o composto 3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2-desoxi-a-D- araj ino-hexopiranósido de dodecilo (4) na forma de óleo incolor (7.00 g, 83%); [ f° =+6.6 (c=l; CH2C12) ; Rf 0.41 (EtOAc: cy-Hex) .
1H- MR (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 5.33 (ddd, IH, J3,2a = 11.93 Hz, J3;2e = 5.46 Hz, J3,4 = 9.82 Hz, H-3), 5.00 (t, IH, J4,5 = 10.02 Hz, H-4), 4.94 (d, IH, J"i,2a = 3.11 Hz, H-l), 4.32 (dd, IH, J6a,5 = 4.69 Hz, J6a,6b = 12.27 Hz, H-6a), 4.06 (dd, IH, J6b,5 = 2.18 Hz, H-6b) , 3.97 (ddd, IH, J5;4 = 10.02 Hz, H-5), 3.62 (dt, IH, Ji'a,i'b = 9.36 Hz, J1 , & i , = 6.24 Hz, Η-1'a), 3.38 (dt, IH, Ji-b,2-a,b = 6.24 Hz, Η-1'b), 2.24 (dd, IH, J2e,2a = 12.90 Hz, J2e,3 = 5.65 Hz, H-2e), 2.10 (s, 3H, C¾-Ac), 2.05 (s, 3H, C¾-Ac), 2.02 (s, 3H, C¾-Ac), 1.83 (td, IH, H-2a), 1.63-1.53 (m, 2H, H-2'a,b), 1.37-1.22 (m, 18H, H-3'-H-ll'), 0.89 (t, 3H, J12--n- = 7.06 Hz, H-12 ' ) . 13C-NMR (100.62 MHz, CDC13): δ 170.8 (C=0) , 170.2 (C=0), 170.0 (C=0), 96.9 (C-l), 69.5 (C-4), 69.2 (C-3), 67.9 (C- 1'), 67.7 (C-5), 62.4 (C-6), 35.1 (C-2), 31.9, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3 26.2, 22.7 ( C-3 ' -C-l 1 ' ) , 21.0, 20.8, 20.7 (Me-Ac) , 14.1 (C-12 ' ) .
Síntese de 2-desoxi-a-D-araJ ino-hexopiranósido de dodecilo (6) .
O procedimento geral deu origem ao composto 2-desoxi- -D- araj ino-hexopiranósido de dodecilo (6), a partir do composto 3, 4, 6-tri-0-acetil-2-desoxi-a-D-arajbi.no- hexopiranósido de dodecilo (4), na forma de cristal branco
(0.66 g, 94.5%); p.f. 114.8 °C; [Q¾° = +6.4 (C=1; MeOH) ; Rf 0.48 (EtOAc) . 1H-RMN (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 4.90 (d, IH, Ji,2a = 2.84 Hz, H-l), 3.90-3.81 (m, 2H, H-3, H-6a), 3.75-3.67 (m, 2H, H-6b, Η-1'a), 3.55 (ddd, 1H, J5, = 9.22 Hz, J5;6a = 1.95 Hz, J5,6b = 5.31 Hz, H-5), 3.38 (dt, 1H, Ji-b,2'a = Ji'b,2'b = 6.32 Hz, Ji'b,i'a = 9.82 Hz, Η-1'b), 3.26 (t, 1H, J4,3 = J ,5 = 9.22 Hz, H-4), 2.07 (dd, 1H, J2e;2a = 12.84 Hz, J2e,3 = 5.17 Hz, H-2e), 1.67-1.54 (m, 3H, H-2a, Η-2'a, Η-2'b), 1.45-1.26 (m, 18H, H-3 'a, b-H-11 'a, b) , 0.93 (t, 3H, Jn-,12' = 6.48 Hz, H-12 ' ) .
13C-RMN (100.62 MHz, CDC13) δ 99.4 (C-l), 74.8 (C-4), 74.2 (C-5), 70.9 (C-3), 69.1 (C-l'), 63.7 (C-6), 39.8 (C-2), 34.0, 31.7, 31.6, 31.6, 31.5, 31.4, 28.3, 24.6 (C-2'-C- 11') , 15.3 (C-12') .
Síntese de 2-desoxi-6-0-tosil-a-D-araJ ino-hexopiranósido de dodecilo (5)
O procedimento geral da reacção de tosilação deu origem a 2-desoxi-6-0-tosil- -D-araJbino-hexopiranósido de dodecilo (5), a partir de 2-desoxi- -D-araj ino-hexopiranósido de dodecilo (6), na forma de óleo incolor (0.68 g, 92.9%);
[o¾°=+2.4 (C=1; CH2C12); Rf 0.53 (1:1 EtOAc : cy-hexano ) .
1H-RMN (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 7.82 (d, 2H, Ph- Ts), 7.33 (d, 2H, Ph-Ts), 4.81 (d, IH, Ji,2a = 2.27 Hz, H- 1), 4.40 (dd, IH, J6a,6b=10.86 Hz, J6a,5 = 4.30 Hz, H-6a) , 4.21 (dd, IH, J6b,5 = 1.01 Hz, H-6b) , 3.97-3.91 (m, IH, H- 3), 3.71-3.67 (m, IH, Η-1'a), 3.52 (ddd, IH, H-5), 3.42 (t, IH, J4,3 = J4,5 = 9.1 Hz, H-4), 3.28 (ddd, IH, Ji-b,2'b = Ji'b2-a = 6.82 Hz, Ji'a,i'b = 9.6 Hz, Η-1'b), 2.44 (s, 3H, C¾-Ts), 2.10 (dd, IH, J2e,2a = 12.88 Hz, J2e,3 = 5.05 Hz, H-2e), 1.64 (td, 1H, J2a,3 = 9.6 Hz, H-2a), 1.51-1.48 (m, 2H, Η-2'a, H2'b) 1.32-1.22 (m, 18H, H-3 ' a, b-H-11 ' a, b ) , 0.88 (t, 3H, Jii-,12' = 6.32 Hz, H-12 ' ) .
13C-RMN (100.62 MHz , CDC13): δ 144.5, 132.7, 129.8, 127.9 (Ph-Ts), 97.3 (C-l), 69.7 (C-4), 71.6 (C-5), 69.3 (C-3), 68.9 (C-l'), 67.6 (C-2), 21.6 (C-6), 37.2, 31.9, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 26.1 (C-2 '-C-11 ' ) , 14.1 (C-12') .
Síntese de 2, 6-didesoxi-a-D-araJino-hexopiranósido de dodecilo (1) .
O procedimento geral da reacção de desoxigenação deu 2,6- didesoxi- -D-araj ino-hexopiranósido de dodecilo (1), a partir de 2-desoxi-6-0-tosil- -D-araJ ino-hexopiranósido de dodecilo (5), na forma de sólido branco (0.73 g, 79%);
Figure imgf000012_0001
(c=l; CH2C12) ; p.f. 46 °C; Rf 0.53 (3:1 EtOAc : cy- hexano) .
1H-RMN (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 4.80 (d, IH, Ji,2a = 2.78 Hz, H-l), 3.91-3.85 (m, IH, H-3), 3.65-3.59 (m, 2H, H- 5, Η-1'a), 3.34 (dt, IH, Ji-b,2.b = Ji-b2'a = 6.57 Hz, J a, b = 9.10 Hz, Η-1'b), 3.10 (m, IH, H-4), 2.10 (dd, IH, J2e,2a = 12.63 Hz, J2e,3 = 3.79 Hz, H-2e), 1.66 (td, IH, J2a,3 = 5.05 Hz, H-2a), 1.59-1.52 (m, 2H, Η-2'a, Η-2'b), 1.39-1.20 (m, 21H, H-3 'a, b-Hll 'a, b, C¾-6 ) , 0.88 (t, 3H, J7 , ;11 , = 7.33 Hz, H-12 ' ) .
13C-RMN (100.62 MHz, CDC13) : δ 97.1 (C-l), 77.8 (C-5), 69.0 (C-4), 67.5 (C-3), 67.4 (C-l'), 37.8 (C-2), 31.8, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 26.1, 22.7 ( C-2 ' -C-l 1 ' ) , 17.7 (C- 6) , 14.1 (C-12') . EXEMPLO 2
Preparação de 2-desoxi-oc-D-treo-pentopiranósido de dodecilo
Síntese de 3, 4-di-0-acetil-2-desoxi-a-D-treo- pentopiranósido de dodecilo
Reacção de glucosilação
A uma solução de 7 (0,24 g, 1,89 mmol) em diclorometano (CH2CI2) seco (1,1 mL) foi adicionado o nucleófilo dodecanol (0,52 mL, 3,25 mmol) e uma solução previamente preparada de brometo de trifenilfosfónio, TPHB (0,04 g, 0,13 mmol) em CH2CI2 seco (1,1 mL) . 0 sistema reaccional foi mantido à temperatura ambiente, com agitação permanente e em condições anidras (atmosfera de azoto) . O material utilizado na presente síntese foi previamente lavado com acetona e seco na estufa a 100 °C. A reacção foi seguida por c.c.f., com o eluente Cy-hex/EtOAc 8:1, até se verificar total consumo do composto de partida, cerca de 5 h após o início da reacção.
Adicionou-se à solução CH2CI2 (2 mL) seco e procedeu-se à lavagem da mesma com uma solução saturada de NaHCC>3 (3 x 5 mL) . Foi feita a evaporação da fase orgânica e o resíduo foi separado por coluna cromatográfica com o eluente cy- Hex/EtOAc (40:1) . Foi possível isolar o composto 3,4-di-O- acetil-2-desoxi- -D-treo-pentopiranósido de dodecilo (8), (m=0, 3201 g, 43.8%, Rf 0.36 (1:8 EtOAc : hexano ) . Foi ainda isolado o produto de Ferrier, 4-0-acetil-2 , 3-didesoxi- -D- glicero-pent-2-enopiranósido de dodecilo (9), formado na reacção [m=0, 0373 g, 9,61%, [af° = +7.6 (c=l; MeOH) , Rf 0.34 (1:6 EtOAc : hexano) ] .
Caracterização de 8 por RMN: 1H-RMN (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 5.27 (td, IH, J3,2e = 4.81 Hz, J3,2a = 9.65, J3,4= 9.34 Hz, H-3 ) , 4.86 (td, IH, J4,5e = 5.04,
Figure imgf000014_0001
Hz, H-4), 4.82 (brt, IH, Ji,2a = Ji,2e= 3.16 Hz, H-l), 3.78, 3.75 (parte A do sistema AB, IH, J5e,5a= 11.24; J4,5e= 5.18, H-5e), 3.70 - 3.59 (m, 2H, H-5a, Η-1'a), 3.35 (m, IH, Η-1'b), 2.17 (ddd, IH, J2e,2a= 13.26 Hz, H-2e), 2.05 (s, 3H, CH3-Ac), 2.04 (s, 3H, CH3-Ac), 1.76 (ddd, IH, H-2a), 1.57 (t, 2H, H-2 ' ) , 1.34 - 1.22 (m, 18 H, H-3' a H-ll'), 0.86 (t, 3H, H-12').
13C-RMN (100,6 MHz, CDC13) (δ/ ppm) : δ 170.3 (C=0), 170.1 (C=0), 96.9 (C-l), 69.4 (C-4), 68.3 (C-3), 67.7 (C-l'), 59.7 (C-5), 34.6 (C-2), 31.9, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 26.2, 22.7 (C-2' - C-ll'), 21.1 (CH3-Ac), 20.9 (CH3-Ac), 14.2 (C-12' ) .
Caracterização de 9 por RMN:
1H-RMN (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 6.06 - δ 6.04 (m, 2H, H-2; H-3), 4.99 (d, IH, Ji,2=2.20 Hz, H-l), 4.95 (t, IH,
Figure imgf000014_0002
2.78 Hz; J5a,5b= 12.30 Hz, H-5a), 3.82 (d, IH, H-5b) , 3.76 (td, IH, Ji-a,i'b= 9.47; J a,2'a=Ji'a,2'b= 7.07 Hz, Η-1'a), 3.48 (td, IH, Ji'b,2'a=Ji'b,2-b= 6.80 Hz, Η-1'b), 2.09 (s, 3H, CH3-Ac), 1.61 - 1.57 (m, 2H, Η-2'a; Η-2'b), 1.31 -1.23 (m, 18 H, H-3' a H- 11'), 0.87 (t, 3H,
Figure imgf000014_0003
H-12') .
13C-RMN (100,6 MHz, CDC13) (δ/ ppm): δ 170.7 (C=0), 131.1 (C-2), 124.9 (C-3), 93.0 (C-l), 68.7 (C-l'), 63.8 (C-4), 61.2 (C-5), 31.0, 29.7, 29.6, 29.4, 29.3, 26.2, 22.7 (C-2' - C-ll'), 21.2 (CH3-Ac), 14.1 (C-12'). HR-ESIMS: m/z calcd para [C19H34O4] Na+ 349, 23493. Valor obtido: 349, 23435; m/z: calcd. para [Ci9H340 ]K+ 365, 20887. Valor obtido: 365,20734.
Desprotecção de 3, 4-di-0-acetil-2-desoxi-a-D-treo- pentopiranósido de dodecilo (8)
Reacção de desacetilação
A desacetilação de 8 (0.93 mmol) foi realizada a partir de uma mistura deste composto com dodecanol dissolvida em metanol (50 mL) , seco em peneiros moleculares. Previamente, preparou-se uma solução de metóxido de sódio, em metanol a 1%, a qual foi de seguida adicionada à mistura reaccional (5 mL) . A solução reaccional foi mantida à temperatura ambiente, com agitação constante e em condições anidras (atmosfera de azoto) .
Foi feito o controlo da reacção por c.c.f. no sistema de eluição EtOAc/éter de petróleo (Et.P.) (2:1), no qual se verificou que, passadas 2 h 30 min, a reacção ainda apresentava como produto maioritário o composto de partida, o que levou à adição de NaOMe até se obter pH 9. No total, a reacção teve a duração de 4 h .
Após a reacção ser dada como terminada, efectuou-se a neutralização da reacção com Amberlite IR-120 (resina de troca iónica fortemente ácida) , sendo feito o controlo de pH com papel indicador. Foi efectuada a filtração com MeOH seco e a solução concentrada em evaporador rotativo. A mistura foi sujeita a coluna cromatográfica, usando-se como eluente Et.P./EtOAc (1:1), obtendo-se o dodecanol isolado e o composto 3 [0.038 g, 12.5%, [ f° = +1,3 (c=l; MeOH) , Rf 0.21 (1:1 EtOAc/Et .P. ) ] .
1H-RMN (400 MHz, CDC13) (δ/ppm; J/Hz) : δ 4.86 (dd, IH, Ji,2e = 1.60 Hz, Ji,2a = 3.24, H-l), 3.93 (ddd, IH, J3,2e = 4.80 Hz, J3,2a = 11,00 Hz, J3, =8.34 Hz, H-3), 3.70 (dd, IH, J4,5e = 4.30 Hz, J5a,5e = 9.85 Hz, H-5e), 3.63 (td, IH, Jra,2-a = Ji-a,2-b = 6.82, Ji'a,i'b= 9.60, Η-1'a), 3.58 - 3.46 (m, 2H, H- 4, H-5a,), 3.34 (td, IH, Jx , bi2 , a = J1 , b,2 , b = 6.82, Η-1'b), 2.12 (ddd, IH, J2e,2a= 13.01 Hz, H-2e) , 1.66 (ddd, IH, H- 2a), 1.60 - 1.55 (m, 2H, H-2 ' ) , 1.34 - 1.18 (m, 18 H, H-3' a H-ll'), 0.88 (t, 3H, J11 12 , = 6.57 Hz, H-12').
13C-RMN (100,6 MHz, CDC13) (δ/ ppm) : δ 97.8 (C-l), 72.0 (C- 4), 69.6 (C-3), 67.5 (C-l'), 62.0 (C-5), 37.2 (C-2), 31.9, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 26.2; 22.6 (C-2' - C-ll'), 14.1 (C- 12 ' ) .
HR-ESIMS: m/z calcd para [Ci7H3404] Na+ 325, 23493. Valor obtido: 325, 23529. m/z: calcd. para [Ci7H3404]K+ 341, 20887. Valor obtido: 341,20876.
Actividade antimicrobiana e mecanismos de acção
A determinação da susceptibilidade microbiana aos compostos sintetizados foi realizada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) , pelo método quantitativo de diluição em meio sólido, segundo as Normas do NCCLS (National Committee for Clinicai Laboratory Standards) [ 4 ] .
Testaram-se três estirpes de Bacillus anthracis (patogénica, vacinai e ovina) e uma estirpe de Bacillus cereus, pertencentes à colecção do INSA-Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Lisboa.
Foram preparadas diluições seriadas dos compostos (64, 32, 16, 8, 4, 2 e 1 mg/L) em DMSO. O crescimento ocorreu em placas com meio de Muller-Hinton, a 37 °C, durante 24 h. Utilizou-se o dimetilsulfóxido (DMSO) como controlo negativo e o cloranfenicol como controlo positivo, sendo os ensaios efectuados em triplicado.
Para as três estirpes de Bacillus anthracis testadas, os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram de 8 mg/L para o composto 2,6- didesoxi-a-L-arajbi.no- hexopiranósido de dodecilo (2) e de 16 mg/L para o composto 2 , 6-didesoxi- -D-arajbino-hexopiranósido de dodecilo (1).
No Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia do Centro de Biodiversidade, Genómica Interactiva e Funcional (BioFIG) , Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, iniciou-se o estudo dos mecanismos de acção dos compostos 1, 2 e 3 através da análise da cinética de crescimento de três estirpes de Bacillus. O crescimento das estirpes foi monitorizado num sistema automático de leitura, recorrendo- se ao método das diluições em meio líquido, em microplaca, cujo protocolo experimental foi adaptado a partir das normas emanadas pelo CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute) [5, 6], o qual se descreve em seguida.
Preparação dos meios
Utilizou-se o meio Muller-Hinton Broth (MHB) (BioKar Diagnostics) cuja preparação foi efectuada de acordo com as instruções do fabricante: 21.0 g de meio dissolvido em 1L de água destilada (Milli-RO) . O meio foi esterilizado em autoclave a 121 °C, durante 15 min.
Preparação dos antibióticos
Preparam-se soluções-stock (4mg/mL) dos compostos em estudo, os quais foram dissolvidos em DMSO (Sigma-Aldrich) sendo conservados a -80 °C, entre utilizações.
Foram testados os compostos 2 , 6-didesoxi- -D-araj ino- hexopiranósido de dodecilo (1), 2 , 6-didesoxi- -L-araj ino- hexopiranósido de dodecilo (2) e 2-desoxi- -D-treo- pentopiranósido de dodecilo (3) , utilizando-se como controlos positivos os antibióticos comerciais cloranfenicol e ciprofloxacina . Para cada fármaco, foram testadas as concentrações de 16,8,4 e 2 mg/L.
As soluções de antibióticos foram esterilizadas por filtração em seringa, com filtros hidrofilicos de politetrafluoretileno de diamentro 0.45μιτι (Millipore) em condições de assepsia.
Estirpes testadas
Foram utilizadas estirpes liofilizadas da colecção ATCC (American Type Culture Collection) : ATCC 6633 (Bacillus subtilis) , ATCC 11778 (Bacillus cereus) e ATCC 14579 (Bacillus cereus) . Como controlos experimentais usaram-se as estirpes ATCC 29213 (Staphylococcus aureus) e ATCC 8739 (Escherichia coli) .
Preparação dos inóculos
Os inóculos foram preparados a partir de culturas liofilizadas e/ou congeladas e lançadas em balões Erlenmeyer, com cerca de 50 mL de meio MHB. A incubação decorreu durante a noite, em banho-maria com agitação (200 rpm), a 35 °C. Após o crescimento, prepararam-se suspensões de colónias com turvação semelhante à unidade 0.5 da escala de McFarland (aproximadamente a l-2xl08 UFC/mL) . Para tal, mediu-se a absorvância do meio de cultura MHB, a 625 nm, num espectrofotómetro de UV/Vis (UNICAM) contra o meio sem cultura, o qual funcionou como branco. Sempre que necessário, foram feitas diluições das culturas em meio MHB, de forma a que o valor da absorvância se situasse entre 0.08 e 0.10. Após a sua normalização, foi efectuado uma diluição 1/10.
Preparação das microplacas
Os poços das microplacas foram preenchidos com 150 de meio MHB suplementado com cada composto nas concentrações descritas anteriormente e 10 de suspensão de cada estirpe de modo a obter um inoculo de aproximadamente 5xl05 UFC por poço, tendo sido reservados poços para os controlos positivos e negativos (MHB, MHB e DMSO, MHB e estirpes) .
Condições de crescimento
As microplacas foram inseridas num sistema automático de leitura (Zenyth 3100, Anthos) , tendo sido monitorizada a variação da absorvância a 595nm, em intervalos de 10 min, durante 72 H de incubação, a 35 °C, com agitação. As mesmas condições de crescimento foram monitorizadas em equipamento similar (Bioscreen) , para fins comparativos. Uma terceira e quarta microplacas foram incubadas em estufa, a 30 °C, e a 35 °C, sem agitação, durante o mesmo período de tempo.
Descrição das Figuras Para uma mais fácil compreensão da invenção juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem, limitar o objecto da presente invenção.
Figura 1 - estrutura do composto 2 , 6-Didesoxi- -D-araj ino- hexopiranósido de dodecilo.
Figura 2 - estrutura do composto 2 , 6-Didesoxi- -L-araj ino- hexopiranósido de dodecilo.
Figura 3 - estrutura do composto 2-Desoxi- -D-treo- pentopiranósido de dodecilo.
Figura 4 - estrutura do composto 3 , 4 , 6-Tri-0-acetil-2- desoxi- -D-araj ino-hexopiranósido de dodecilo.
Figura 5 - estrutura do composto 2-Desoxi-6-0-tosil- -D- araj ino-hexopiranósido de dodecilo.
Figura 6 - estrutura do composto 2-Desoxi- -D-araj ino- hexopiranósido de dodecilo.
Figura 7 - estrutura do composto 3 , 4-Di-O-acetil-D-xilal . Figura 8 - estrutura do composto 3, 4-Di-0-acetil-2-desoxi- -D-treo-pentopiranósido de dodecilo.
Figura 9 - estrutura do composto 4-0-Acetil-2 , 3-didesoxi- - D-glicero-pent-2-enopiranosido de dodecilo.
Referências
[1] Amélia P.Rauter, Susana Lucas, Tânia Almeida, Diana Sacoto, Verónica Ribeiro, Jorge Justino, Ana Neves, Filipa V.M. Silva, Maria C. Oliveira, Maria J. Ferreira, Maria- Soledade Santos, Ester Barbosa (2005) . Synthesis, surface active and antimicrobial properties of new alkyl 2,6- dideoxy-L-arabino-hexopyranosides . Carbohydrate Research, 340: 191-201. [2] Filipa V. M. Silva, Margarida Goulart, Jorge Justino, Ana Neves, Fernando Santos, João Caio, Susana Lucas, Ana Newton, Diana Sacoto, Ester Barbosa, Maria-Soledade Santos, Amélia P. Rauter (2008) . Alkyl deoxy-arabino- hexopyranosides : Synthesis, surface properties, and biological activities. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16: 4083- 4092.
[3] Matsumura, S., Kwamura, Y., Yoshikawa, S., Kawada, K., Uchiburi, T. (1993). J. Am. Oil Chem.Soc. 70: 17.
[4] NCCLS . Methods for Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactéria that Grow Aerobically: Approved Standard, 3rd ed.; document Villanova, PA: National Committee for Clinicai Laboratory Standards, 1993, M7-A3.
[5] NCCLS (1997) . Methods for Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactéria that Grow Aerobically: Approved Standard, 4th ed. ; Villanova, PA: National Committee for Clinicai Laboratory Standards, M7-A4.
[6] CLSI (2009) . Performance Sandards for Antimicrobial Susceptibility Testing: 9th Informational Supplement . Villanova, PA: Clinicai and Laboratory Standards Institute, M100- S19.
As reivindicações seguintes representam adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Compostos tensioactivos derivados de açúcar caracterizados por serem desoxiglicósidos de alquilo da série D e apresentarem as fórmulas gerais I e II :
Figure imgf000022_0001
II
em que :
R representa, isoladamente, hidrogénio ou um grupo metilo,
X representa enxofre ou hidrogénio,
Y representa hidrogénio ou flúor
n = 1, 2
m > 10.
2. Compostos de acordo com a reivindicação anterior, caracterizados por possuírem um mecanismo de acção inibitória, bacteriostática e/ou bactericida.
3. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizados por inibirem o crescimento de espécies de Bacillus, preferencialmente de Bacillus anthracis patogénica, Bacillus anthracis vacinai e Bacillus anthracis ovina .
4. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizados por a concentração inibitória mínima ser entre 8 mg/l e 16 mg/L.
5. Processo de obtenção dos compostos descritos nas reivindicações 1 a 4 caracterizado por compreender os seguintes passos: a. reacção de glicosilação, utilizando como dador de glicosilo um glical e como aceitador de glicosilo um álcool ou seu análogo de cadeia longa;
b. desacetilação;
c. filtração e evaporação.
6. Processo de obtenção de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por compreender ainda um passo de desoxigenação na posição 6.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a reacção de glicolisação ocorrer sob agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 12 horas.
8. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a reacção de desacetilação ocorrer sob agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 45 minutos.
9. Processo de acordo com as reivindicações 5 a 6 caracterizado por a desoxigenação ocorrer sob agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 72 horas.
10. Composição química caracterizada por compreender os compostos descritos nas reivindicações 1 a 4 e obtidos pelo processo descrito nas reivindicações 5 a 9.
11. Utilização do composto descrito nas reivindicações 1 a 4 e obtidos de acordo com as reivindicações 5 a 9 caracterizada por ser usado na indústria farmacêutica.
12. Utilização do composto descrito nas reivindicações 1 a 4 e obtidos de acordo com as reivindicações 5 a 9 caracterizada por ser usado na indústria cosmética.
13. Utilização do composto descrito nas reivindicações 1 a 4 e obtidos de acordo com as reivindicações 5 a 9 caracterizada por ser usado na indústria agroquímica.
14. Utilização do composto descrito nas reivindicações 1 a 4 e obtidos de acordo com as reivindicações 5 a 9 caracterizada por ser usada como material de limpeza.
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