WO2012093064A1 - Conjugué, son procédé de préparation et ses utilisations - Google Patents

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WO2012093064A1
WO2012093064A1 PCT/EP2011/074234 EP2011074234W WO2012093064A1 WO 2012093064 A1 WO2012093064 A1 WO 2012093064A1 EP 2011074234 W EP2011074234 W EP 2011074234W WO 2012093064 A1 WO2012093064 A1 WO 2012093064A1
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WO
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hetero
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formula
group
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Application number
PCT/EP2011/074234
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Inventor
Thomas Berthelot
Mohamed Anis ALOUINI
Sandra ALBENQUE-RUBIO
Gérard DELERIS
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Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C243/00—Compounds containing chains of nitrogen atoms singly-bound to each other, e.g. hydrazines, triazanes
    • C07C243/40—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups being quaternised
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C243/00—Compounds containing chains of nitrogen atoms singly-bound to each other, e.g. hydrazines, triazanes
    • C07C243/10—Hydrazines
    • C07C243/12—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C243/16—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/0066—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of a carbocyclic ring,(e.g. benzene, naphtalene, cyclohexene, cyclobutenene-quadratic acid)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
    • C09B23/086—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines more than five >CH- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C09B69/00—Dyes not provided for by a single group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology and in particular the field of molecular targeting of biological events.
  • the present invention provides a conjugate comprising both a hydrophilic core, two targeting entities and a functional entity.
  • the present invention also relates to a method of preparation and the various uses of such a conjugate.
  • the cooperative effect or multivalence effect plays a central role in life recognition events. Indeed, rather than directly improving the strength of each interaction, nature tends to increase the multivalent effect to increase the binding affinity between the Ligand / Receptor complex.
  • the multivalence effect is based on the creation of multiple, non-covalent interactions between a system having multiple ligands and a target having multiple recognition sites. This type of phenomenon is found in a large number of "biological processes" such as the immune response, cell adhesion, signal transduction, some enzymatic systems, etc.
  • the cooperative effect is to lower the thermodynamics of the Ligand / Receptor system to increase the binding affinity of this pair by subjecting a Receiver to multiple recognition of the same Ligand. This amounts to getting a benefit in Enthalpy and an increase in the entropy of the system.
  • skeleton type constructs to support these ligands or recognition elements.
  • These skeletons can be classified into 2 categories: (i) low valence skeletons such as calixarenes, porphyrins and derivatives, flat aromatic skeletons, cyclic RAFT peptides ... and (ii) high valence skeletons such as that dendrimers and derivatives, polymers, polyrotaxanes and derivatives, nanoparticles ... [1, 2].
  • skeletons are therefore a keystone to obtain multivalent or cooperative systems.
  • drawbacks among which can be mentioned a long, complicated and expensive synthesis, poor solubility in a physiological medium, toxicity induced, for example, by the aromatic rings and benzonitric rings that these skeletons can present.
  • the inventors have set themselves the goal of designing and preparing a molecular skeleton suitable for application in the context of molecular targeting of biological events.
  • the inventors have, first of all, designed a molecule having three functionalization sites (of which 2 are identical and of the same reactivity) with a hydrophilic core and having axial symmetry (Diagram D ⁇
  • This molecule has an apical amine function (site 1) and two carboxylic acid functions (sites 2 and 3), the apical function being orthogonal to both carboxylic functions.
  • site 1 apical amine function
  • site 2 and 3 carboxylic acid functions
  • the apical site of this diacid molecule offers the possibility of functionalizing the system with a probe for imaging, a drug delivery system or a nano-object.
  • the two remaining sites give the possibility of a symmetrical grafting of the recognition molecules.
  • the synthesis of this molecule takes place in two stages with high yields.
  • Figure 2 From left to right: Aspartic Acid, Glutamic Acid and Lysine.
  • these molecules do not have symmetry with respect to their two identical functions (either carboxylic acid for glutamic acid and aspartic acid, or amino for lysine). Therefore, they will not have the same reactivity.
  • the inventors have tried to directly couple peptides on these identical functions (either carboxylic acid for glutamic acid and aspartic acid, or aminated for lysine) in a single step in order to obtain directly a backbone comprising 2 peptides and one orthogonal function that can be subsequently functionalized.
  • the inventors have never obtained the desired system or in extremely low yields and as a result of long and complicated purification.
  • the inventors have synthesized derivatives of the diacid molecule incorporating spacer arms ending in various functions such as azides, amines or carboxylic acids. These spacer arms being of the same type for each of the derivatives, the initial symmetry of the diacid molecule is respected. This therefore makes it possible, as for the diacid molecule, to functionalize them, in a single step and with high yields, with molecules of interest. This also makes it possible to vary the functional groups at the end of the spacer arms and not to be content with the carboxylic acid functions of the molecule of Scheme 1.
  • the present invention therefore relates to a conjugate of formula (I) below:
  • A represents a functional entity
  • B represents a targeting entity
  • R 1 and R 2 which may be identical or different, each represent a bond or a linking group comprising from 1 to 40 carbon atoms and in particular from 1 to 30 carbon atoms.
  • R 1 is an optionally substituted (hetero) alkylene group or an optionally substituted (hetero) vinylene group.
  • alkylene group means a linear, branched or cyclic saturated hydrocarbon group comprising from 1 to 30 carbon atoms, especially from 1 to 20 carbon atoms, and in particular from 1 to 10 carbon atoms.
  • heteroalkylene group means a linear, branched or cyclic saturated hydrocarbon group comprising at least one heteroatom and from 1 to 30 carbon atoms, especially from 1 to 20 carbon atoms. and, in particular, from 1 to 10 carbon atoms, the heteroatom (s) possibly being N, O, P, Si or S and especially N, O, or S.
  • the heteroatoms can in particular interrupt an alkylene chain, start an alkylene chain and / or terminate an alkylene chain.
  • the heteroatom (s) can (with) at least one atom of the alkylene chain, a triazole. It is clear that such a triazole ring can interrupt an alkylene chain, start an alkylene chain and / or terminate an alkylene chain.
  • vinyl group is intended to mean a linear, branched or cyclic unsaturated hydrocarbon group comprising at least one ethylenic unsaturation and from 1 to 30 carbon atoms, in particular from 1 to 20 carbon atoms. carbon and in particular from 1 to 10 carbon atoms.
  • heterovinylene group is intended to mean a linear, branched or cyclic unsaturated hydrocarbon group comprising at least one ethylenic unsaturation and from 1 to 30 carbon atoms, in particular from 1 to 20 carbon atoms. carbon and, in particular, from 1 to 10 carbon atoms, the heteroatom (s) may be N, O, P, Si or S and especially N, O, or S.
  • substituted (hetero) alkylene group or “Substituted (hetero) inylene” group, a (hetero) alkylene group or a (hetero) inylene group as previously defined, mono- or polysubstituted with a group selected from a halogen; an amine; a diamine; a carboxyl; a carboxylate; an aldehyde; an ester; an ether; a hydroxyl; a halogen; optionally substituted (hetero) alkyl and especially such as methyl, ethyl, propyl or hydroxypropyl; an amine; a friend of ; a sulfonyl; a sulfoxide; a sulfonate; an acyl; a vinyl; a hydroxyl; an epoxy; a phosphonate; a sulfonic acid; an isocyanate; a group selected from a halogen; an amine; a
  • R 2 the following groups may be mentioned:
  • R3 representing a bond, optionally substituted (hetero) alkylene or optionally substituted (hetero) vinylene as previously defined;
  • R representing a bond, optionally substituted (hetero) alkylene or optionally substituted (hetero) vinylene as previously defined;
  • R 5 representing a bond, optionally substituted (hetero) alkylene or (hetero) vinylene optionally substituted as previously defined and R6 represents a hydrogen atom, a methyl, an ethyl or a propyl; -N (R 7 ) -R 8 - or -R 8 -N (R 7 ) - with R 8 representing a bond, an optionally substituted (hetero) alkylene or optionally substituted (hetero) vinylene as previously defined and R 7 representing a hydrogen atom, a methyl, an ethyl or a propyl;
  • R12 representing a bond, optionally substituted (hetero) alkylene or optionally substituted (hetero) vinylene as previously defined;
  • R13 representing a bond, optionally substituted (hetero) alkylene or optionally substituted (hetero) vinylene as previously defined;
  • R1 representing a bond, optionally substituted (hetero) alkylene or (hetero) vinylene optionally substituted as previously defined;
  • R i representing a bond, an optionally substituted (hetero) alkylene or optionally substituted (hetero) vinylene as previously defined and R16 representing a hydrogen atom, a methyl, an ethyl or a propyl;
  • R 7 representing a bond, a (hetero) alkylene optionally substituted or an optionally substituted (hetero) inylene as previously defined.
  • R 3 , R, R 5, R 8 , R 12, R 13, R 11 R 17 or R 17 are an optionally substituted heteroalkylene or a optionally substituted heterovinylene interrupted by at least
  • Ri and R2 groups include the groups as previously defined wherein R3, R4, R5, Rs, Rio, Ri2 Ri3 f f io R15 or R17 correspond to one of the following formulas :
  • RI8 RI9 f f R20 and R21 represent a bond or a (hetero) alkylene optionally substituted as defined above;
  • n 0 or 1
  • n 0 or an integer between 1 and 10, especially between 1 and 5 and, in particular, 1, 2, 3 or 4;
  • R 8, R 19, R 20 and R 2 1 are a bond; an alkylene as defined above and advantageously an alkylene having 1, 2, 3 or 4 carbon atoms or an optionally substituted (hetero) alkylene having a triazole.
  • R 1 and R 2 the following groups may be mentioned:
  • the group R 1 represents a bond and the groups R 2 represent the same linking group comprising from 1 to 40 carbon atoms as previously defined;
  • the group R 1 represents a linking group comprising from 1 to 40 carbon atoms such that previously defined and the groups R 2 represent a bond.
  • Ri group represents a 1-binding moiety comprising from 1 to 40 carbon atoms as defined above and the groups R 2 represent the same 2 nd linking group comprising from 1 to 40 carbon atoms as defined above, the 1 st and 2 nd link groups that can be identical or different.
  • “functional entity” is meant, in the context of the present invention, a group which confers on the conjugate a function especially in the detection, diagnosis and / or preventive, prophylactic or therapeutic treatment.
  • the functional entity is chosen from an easily detectable group, a cytotoxic group, a therapeutic agent or a nano-ob and.
  • an easily detectable group is meant, in the context of the present invention, a group that can be detected by implementing a suitable noninvasive detection technique such as microscopy, scintigraphy, resonance spectrometry paramagnetic, fluorescence spectrometry, infrared spectrometry, positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (SPECT or SPECT) and magnetic resonance imaging (MRI).
  • a conjugate according to the invention comprising such an easily detectable group is particularly suitable for the field of imaging and diagnosis. In particular, it makes it possible to identify and locate sites at which the molecular structure recognized by the targeting entities is present, produced or overexpressed.
  • the easily detectable moiety may be an enzyme or a molecule capable of generating a detectable signal and optionally quantifiable under special conditions as when the power in the presence of a suitable substrate.
  • an enzyme or a molecule capable of generating a detectable signal and optionally quantifiable under special conditions as when the power in the presence of a suitable substrate.
  • biotin digoxygenine, 5-bromodeoxyuridine, alkaline phosphatase, peroxidase, glucose amylase and lysozyme.
  • the easily detectable moiety may be a fluorescent label, chimiofluorescent or bioluminescent such as cyanine and derivatives thereof, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, GFP (for " Green Fluorescent Protein ”) and its derivatives, coumarin and its derivatives and umbelliferone; luminol; luciferase and luciferin.
  • the latter may be a marker or radioactive isotope or an organic group containing at least one marker or radioactive isotope.
  • a marker or radioactive isotope is especially iodine-123, iodine-125, iodine-126, iodine 133, iodine-131, iodine-124, indium-111, indium-113m, bromine-77, bromine-76, gallium-67, gallium-68, ruthenium-95 ruthenium-97, technetium-99m, fluorine-19, fluorine-18, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, oxygen-15, oxygen-14, scandium-47, tellurium-122m, thulium-165, yttrium-199, copper-64, copper-62, carbon-11, nitrogen-13, gadolidium-68 and rubidium- 82. It should be noted that certain radioactive atoms used as easily
  • the latter may be a paramagnetic or ferromagnetic marker such as 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidine N-oxide (TEMPO) or a complex capable of chelating paramagnetic ions or ferromagnetic such as Gd 3+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Fe 2+ and Mn 2+ .
  • TEMPO 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidine N-oxide
  • the latter may be a gold particle or a dense compound such as a nanoparticle and in particular, for example, a ferric oxide nanoparticle.
  • cytotoxic group is meant a directly or indirectly toxic group for the binding site and in particular the cells targeted by the targeting entity of the conjugate according to the present invention.
  • directly cytotoxic is meant a group which is in itself cytotoxic.
  • Indirectly cytotoxic means a group which, although not cytotoxic in itself, can induce cytotoxicity, for example by its action on another molecule or by an additional action on it.
  • cytotoxic chemotherapeutic agent In the era shaped work of the cytotoxic moiety layout, it is a cytotoxic chemotherapeutic agent.
  • cytotoxic chemotherapeutic agents that can be used in the context of the present invention. The activity of these agents can be increased under irradiation.
  • alkylating agents such as mechlorethamine or chlorambucil; methotrexate; 5-fluorouracil; vinblastine; gemcitabine; fludarabine; nicotinamide; doxorubicin; mitomycin; L-asparaginase; cisplatin; taxol and its analogues / derivatives.
  • the cytotoxic moiety is a (poly) peptide cytotoxic such as ricin, abrin, Pseudomonas exotoxin, TNFa and one interleukin 2.
  • cytotoxic chemotherapeutic agent In 3 rd form of work of the cytotoxic moiety layout, it is indirectly cytotoxic chemotherapeutic agent.
  • Such an agent also called “pro-drug” is not or little cytotoxic as such but is capable of giving, especially following an enzymatic reaction or irradiation, a cytotoxic substance (or drug) in particular as defined in the form of the era put implemented.
  • a cytotoxic substance or drug in particular as defined in the form of the era put implemented.
  • methotrexate-alanine mitomycin phosphate, 5-fluorocytosine
  • photofrin and capecitabine By way of illustrative and nonlimiting examples, mention may be made of methotrexate-alanine; mitomycin phosphate, 5-fluorocytosine; photofrin and capecitabine.
  • the cytotoxic moiety it is a (poly) peptide indirectly cytotoxic.
  • indirectly cytotoxic poly (peptide) group is meant a polypeptide which has an enzymatic activity and can convert a relatively non-toxic pro-drug, especially as defined in the third embodiment, into a cytotoxic substance, in particular as defined in US Pat. the era the form of implementation.
  • a peptidase such as a carboxypeptidase, an aminopeptidase or an endopeptidase; phosphatase; sulfatase; an amidase; a kinase; glycosidase; deaminase; a reductase; and an oxidase.
  • the latter is a nucleic acid molecule which is directly or indirectly cytotoxic such as an antisense oligonucleotide.
  • therapeutic agent is meant, in the context of the present invention, a biologically active agent or principle capable of inducing a therapeutic, preventive or prophylactic effect, especially where the binding site recognized by the targeting entities is present, product or overexpressed and, in fact, to the human or animal subject who has received the conjugate according to the invention. It should be noted that the previously listed cytotoxic groups are also part of the therapeutic agents.
  • the therapeutic agent that can be used at the level of the conjugate according to the invention can be selected from the active ingredients conventionally used in pharmacotherapy and in particular in the following pharmacotherapeutic families: allergology, anesthesia / resuscitation, oncology and hematology, cardiology and angiology, contraception and termination of pregnancy, dermatology, endocrinology, gastroenteroheopathology, gynecology and obstetrics, immunology and transplantation drugs, infectiology and parasitology, metabolism, diabetes and nutrition, neurology / psychiatry, ophthalmology, otolaryngology , pneumology, rheumatology, stomatology, toxicology, urology / nephrology, as well as among analgesic / anti-pyretic and anti-spasmodic, anti ⁇ inflammatories, diagnostic preparations, hemostatic and treatment of blood products and derivatives.
  • the therapeutic agent may be selected from the group consisting of anti inflammatory ⁇ including non-steroidal anti-inflammatory drugs, antiepileptics, antiparkinsonian agents, antimyasthAUques, antispastic, antiepileptics, antipsychotics, antidepressants, psychotropic drugs, anticholinesterase inhibitors, antagonists NMDA receptors, antacids, gastric antisecretory agents, dopamine antagonists, antispasmodics, antimigraine agents, choleretics, hepatotropic agents, laxatives, vitamin A derivatives, antivirals, anticancer agents, analgesics, anti-ulcers, antipsoriatic agents, antibiotics, cyclooxygenase inhibitors (COX inhibitors), cytokines, and hormones such as sex hormones (eg, anti-estrogens, estrogens, progestins, androgens, and anti- androgens).
  • anti inflammatory ⁇ including non-steroidal
  • nano-ob and is meant, in the context of the present invention, an object of any shape and having at least one spatial dimension of nanometric size.
  • at least one spatial dimension of this nano-object is between 5 and 5000 nm and in particular between 10 and 2000 nm. It may especially be a nanoparticle, a nanocrystal, a nanowire, a nanofiber, a nanotube, a nano-star or a nanocolumn.
  • nano-objects that can be used in the context of the present invention, mention may be made of a carbon nanotube, a silicon oxide nanotube, a polymeric nanoparticle, an iron nanoparticle, a nanoparticle of silicon, a paramagnetic or superparamagnetic nanoparticle such as a ferric oxide nanoparticle or SPIONs (for "SuperParamagnetic Iron Oxide Nanoparticles"), a liposome containing ions paramagnetic or paramagnetic or superparamagnetic nanoparticles, a quantum dot (QDOT), a lipid vesicle, a terpenoic vesicle, an organic and / or inorganic supramolecular assembly, a polymeric vesicle, a gold nano-star.
  • QDOT quantum dot
  • targeting entity in the context of the present invention an entity capable of targeting the conjugate according to the invention at a binding site.
  • the targeting implemented involves molecular recognition between the targeting entity and the link site.
  • the binding site may be an animal or plant organism or may be located or produced in an animal or plant organism such as a cell, a cell type, a tissue, or a virus. It may be present on a protein such as an enzyme, a membrane receptor, an antibody or it may be present on a polynucleotide Alternatively, the binding site may be ex vivo and in particular in a biological fluid previously extracted or obtained from an animal or plant organism. In another variant, the binding site may have been grafted onto a solid support such as a biochip support.
  • the targeting entity implemented in the context of the present invention is chosen from a protein; a polypeptide; a peptide; a steroid a cytokine; a neurotransmitter; an antigen; an antibody; an antibody fragment such as a Fab, F (ab ') 2 f Fv, scFv and diabody; a membrane receptor or nuclear ; an agonist of a receptor; a receptor antagonist; a small molecule; a sugar or a polysaccharide; a glycane; a leptin; a polynucleotide; an enzyme; an enzymatic substrate; and a growth factor.
  • polynucleotide in the context of the present invention a nucleic acid, a nucleic sequence, a nucleic acid sequence, an oligonucleotide, a polynucleotide sequence, a nucleotide sequence, a single-stranded DNA, a double DNA -branch, an RNA or an aptamer.
  • a polynucleotide in the context of the present invention may comprise natural nucleotides and unnatural nucleotides.
  • the present invention also relates to a process for preparing a conjugate as defined above.
  • the method comprises the steps of:
  • the protection of the amine function during step (ai) of the process according to the present invention may consist of the conversion of the amino group in an acetamido or amido group.
  • this protection may consist in protecting this function by a BOC group (for "tertiobutyl carbonyl"), a FMOC group (for "9FluorenylMethoxycarbonyl”) or a CBZ group (for "BenZyloxyCarbonyl”).
  • the protection of the carboxyl functions during step (a 2 ) of the process according to the present invention may consist in converting them, by reaction with an alcohol, into ester functions and in particular into azidomethoxybenzyl ester.
  • step (bi) consists in first preparing a precursor of the group -R. And then reacting it with the compound of formula (II) optionally protected so as to obtain the compound of formula (III), the primary amine function is optionally protected.
  • the group -R 2 - corresponds to the group -Gi-G 2 -.
  • steps (bi), (di), (b 2 ) and (d 2 ) and the different variants envisaged for these steps and in particular during steps (ii), (iii), ( ⁇ '), (iv') and (v) ') involve the presence on the two compounds reacting together of two chemical functions, identical or distinct, and capable of forming a covalent bond.
  • a carboxyl function (capable of reacting with an amine function, an alcohol function or a thiol function), a hydroxyl function or an alcohol function (capable of reacting with a carboxyl or isocyanate function), an amine function (capable of reacting with an ester function or with a carboxyl function), an ester function (capable of reacting with an amine function), a ketone function (capable of reacting with two alcohol functions, acetalysis ), an epoxy function (capable of reacting with an amine function), an isocyanate function (capable of reacting with a hydroxyl function), a maleimide function (capable of reacting with a thiol function, an amine function or a diene), a diene (capable of reacting with a maleimide function) and a thiol function (capable of reacting with a maleimide function, a carboxyl function or another thio
  • the present invention relates to a conjugate according to the present invention or capable of being prepared by a method according to the present invention for use as a medicament or in diagnosis.
  • the application in medicine relates in particular to the case where the functional entity is a directly or indirectly cytotoxic group or a therapeutic agent as previously defined.
  • the diagnostic application advantageously concerns the case where the functional entity is an easily detectable agent. Whether the application is in medicine or in diagnosis, those skilled in the art will be able to determine the targeting entities to be used depending on the biological target involved.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit comprising at least one conjugate according to the present invention or capable of being prepared by a method according to the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active principle, at least one conjugate according to the present invention or capable of being prepared by a process according to the present invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable carrier any substance that is added to the conjugate according to the present invention. to promote its transport, avoid its substantial degradation in said composition, increase its half-life and / or preserve its therapeutic or prophylactic properties.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle is sterile and pyrogen-free. It is chosen according to the type of application of the pharmaceutical composition of the invention and in particular according to its mode of administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention consists of at least one conjugate according to the present invention in free form or in the form of an addition salt with a pharmaceutically acceptable acid, in the pure form or in the form of a composition in which it is combined with any other pharmaceutically compatible product.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be used systemically; parenterally, for example intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, intraventricular, intrasternal, intracranial, intramuscular or subcutaneous; topically; oral; rectally; intranasally or by inhalation.
  • compositions for oral administration it is possible to use tablets, pills, powders, etc. where the conjugate according to the invention is mixed with one or more inert diluents conventionally used, and possibly with other substances such as that, for example, a lubricant, a dye, a coating etc ....
  • inert diluents conventionally used
  • other substances such as that, for example, a lubricant, a dye, a coating etc ....
  • liquid compositions for oral or ocular administration it is possible to use suspensions, solutions, emulsions, pharmaceutically acceptable syrups containing inert diluents conventionally used, and possibly other substances such as wetting agents, sweeteners, thickeners, etc. ....
  • the sterile compositions for parenteral administration may be aqueous solutions or not, suspensions or emulsions.
  • solvent or vehicle water, propylene glycol, vegetable oils or other suitable organic solvents may be employed.
  • These compositions may also contain adjuvants, such as wetting agents, isotonizing agents, emulsifiers, etc.
  • compositions for topical administration may be, for example, creams, lotions, mouthwashes, nasal or eye drops or aerosol.
  • the daily dose level of conjugate according to the present invention is usually from 1 to 1000 mg per adult (i.e., from about 0.015 to 15 mg / kg), administered in single or divided doses. These doses are given for illustrative purposes only. The doctor, in any case, will be able to determine the most appropriate real dose for a given individual patient and the latter will vary, on the one hand, according to the directly or indirectly cytotoxic group or the therapeutic agent of the conjugate and, on the other hand, depending on age, weight and patient response.
  • the present invention relates to a conjugate according to the present invention or capable of being prepared by a method according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the present invention for treating and / or preventing a disorder or pathology related to one of the families. pharmacotherapeutic agents previously listed or involving curative, preventive or prophylactic treatment with one of the therapeutic agents previously listed.
  • the present invention relates to the use of a conjugate according to the present invention or capable of being prepared by a process according to the present invention or of a pharmaceutical composition according to the present invention for the preparation of a medicament for the treatment, prevention and / or prophylaxis of a disorder or pathology as defined above.
  • the present invention relates to a method for treating and / or preventing a disorder or pathology in a patient suffering or likely to suffer from such a disorder or pathology.
  • This method comprises administering to said patient an effective amount of a conjugate according to the present invention or capable of being prepared by a method according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the present invention finally relates to the use of a compound of formula (II) below:
  • the present invention relates to the use of a compound of formula (II) below:
  • a 1N NaOH solution was used in the presence of said product in a mixture of acetonitrile / water solvent (60 ml / 30 ml), the reaction was stirred at room temperature for 12 h. Then the acetonitrile was evaporated under reduced pressure and a washing with ether was carried out in stride. The recovered aqueous phase is subsequently freeze-dried.
  • the reaction is stirred at ambient temperature and under N 2 for 12 h.
  • 80 ml of DCM are added and a wash with 30 ml of water is repeated 3 times.
  • a washing of the recovered organic phase is carried out twice with 30 ml of a solution of HCl at 0.5 N.
  • Finally a last washing with water is carried out twice with 30 ml each time.
  • the CB0-P11 peptide is a mime of VEGF (for "Vascular Endothelial Growth Factor”). It targets the VEGF receptor on endothelial cells (Patent Application FR 2814744 [4]).
  • VEGF for "Vascular Endothelial Growth Factor”
  • SEQ ID NO: 1 protected CBO-P11 peptide (SEQ ID NO: 1) were solubilized.
  • 3.75 mg (0.025 mmol) of HOBt are added.
  • 9 mg (0.69 ⁇ 10 -2 mmol) of compound 5 are added.
  • 8.7 ⁇ (0.05 mmol) of DIC and 2.5 ⁇ (0.01 mmol) of triethylamine are added to the above mixture.
  • the reaction mixture is stirred at ambient temperature and under a N 2 atmosphere for 2 pm At the end of the reaction, the solvent is evaporated under reduced pressure.
  • the product obtained is purified by HPLC using a mixture of water / acetonitrile eluent. At the end of the purification, the pure product is recovered as a green solid.
  • the grafted peptides are then deprotected with a mixture of 0.75 g of phenol in 0.25 ml of TIS, 0.5 ml of H 2 0, 0.5 ml of thianisol and 10 ml of TFA.
  • the previously purified product is solubilized in 5 ml of deprotection solution.
  • the reaction mixture is stirred for 3 h at room temperature.
  • the solvent is evaporated to 20% of its original volume and the product is precipitated in cold ether.
  • Compound 6 is filtered and dried under reduced pressure. Thus, 12.3 mg of this product are obtained (yield 34%).

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Abstract

La présente invention concerne un conjugué de formule A−R1−N (H) −N (CH2−C (=O) −R2−B) 2 dans laquelle A représente une entité fonctionnelle; B représente une entité de ciblage; et R1 et R2, identiques ou différents, représentent, chacun une liaison ou un groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone et notamment de 1 à 30 atomes de carbone. La présente invention concerne un procédé de préparation d'un tel conjugué et son utilisation en médecine ou dans le diagnostic.

Description

CONJUGUE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES
UTILISATIONS
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne le domaine de la biotechnologie et notamment le domaine du ciblage moléculaire d'événements biologiques.
Plus particulièrement, la présente invention propose un conjugué comprenant à la fois un cœur hydrophile, deux entités de ciblage et une entité fonctionnelle .
La présente invention concerne également un procédé de préparation et les différentes utilisations d'un tel conjugué.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
L'effet coopératif ou l'effet de multivalence joue un rôle central dans les événements de reconnaissance du vivant. En effet, plutôt que d'améliorer directement la force de chaque interaction, la nature a tendance à augmenter l'effet multivalence pour accroître l'affinité de liaison entre le complexe Ligand/Récepteur .
L'effet de multivalence repose sur la création d' interactions multiples et non-covalentes entre un système présentant des ligands multiples et une cible possédant des sites de reconnaissance multiples. Ce type de phénomène se trouve dans un grand nombre de « procédés biologiques » comme la réponse immunitaire, l'adhérence cellulaire, la transduction du signal, certains systèmes enzymatiques , etc..
L'effet coopératif est le fait d'abaisser la thermodynamique du système Ligand/Récepteur pour augmenter l'affinité de liaison de ce couple en soumettant un Récepteur à une reconnaissance multiple du même Ligand. Cela revient à obtenir un bénéfice en Enthalpie et une augmentation de l'Entropie du système.
Afin d'obtenir ces effets de « multivalence » ou de « coopérativité », il est nécessaire d'avoir des constructions de type « squelette » pour supporter ces ligands ou éléments de reconnaissance. Ces squelettes peuvent se classer en 2 catégories : (i) les squelettes à faible valence tels que les calixarènes, les porphyrines et dérivés, les squelettes aromatiques plats, peptides cycliques de type RAFT... et (ii) les squelettes à forte valence tels que les dendrimères et dérivés, les polymères, les polyrotaxanes et dérivés, les nanoparticules... [1, 2].
Ces squelettes sont donc une des clés de voûte pour obtenir des systèmes multivalents ou coopératifs. Cependant, ils possèdent des inconvénients parmi lesquels on peut citer une synthèse longue, compliquée et coûteuse, une solubilité pauvre en milieu physiologique, une toxicité induite, par exemple, par les cycles aromatiques et les noyaux benzonitriques que peuvent présenter ces squelettes. De plus, certains ne présentent pas la possibilité d'être, par la suite, modifiés par une sonde notamment fluorescente, radioactive, paramagnétique..., ou bien couplés soit à un système de type « drug delivery », soit à un nano-ob et comme un nanotube de carbone, un nanotube de silicium ou à une nanoparticule.
Il faut également noter que certains de ces squelettes ne présentent aucune symétrie en leur sein ce qui donne lieu à des molécules asymétriques et donc à des différences de réactivité de leurs sites fonctionnalisables . Il en résulte donc des synthèses et des purifications longues et difficiles conduisant à des rendements très faibles.
Les inventeurs se sont fixé pour but de concevoir et préparer un squelette moléculaire adapté pour une application dans le cadre du ciblage moléculaire d'événements biologiques.
EXPOSÉ DE L' INVENTION
Pour arriver au but fixé et contourner les inconvénients des squelettes de l'état de la technique, les inventeurs ont, tout d'abord, conçu une molécule présentant trois sites de fonctionnalisation (dont 2 identiques et de même réactivité) avec un cœur hydrophile et présentant une symétrie axiale (Schéma D ·
Figure imgf000004_0001
Schéma 1
Cette molécule présente une fonction aminé apicale (site 1) et deux fonctions acides carboxyliques (sites 2 et 3), la fonction apicale étant orthogonale aux deux fonctions carboxyliques . Le site apical de cette molécule diacide offre la possibilité de fonctionnaliser le système avec une sonde pour l'imagerie, un système de « drug delivery » ou un nano- objet. Les deux sites restant donnent la possibilité d'un greffage symétrique des molécules de reconnaissance. De plus, la synthèse de cette molécule se déroule en deux étapes avec des rendements élevés.
Afin de montrer l'intérêt d'une telle molécule utilisée comme squelette, les inventeurs l'ont comparée à des systèmes approchant comme certains acides aminés tels que la lysine (2 fonctions aminés, 1 fonction acide carboxylique) , l'acide aspartique (2 fonctions acides carboxyliques, 1 fonction aminé) et l'acide glutamique (2 fonctions acides carboxyliques, 1 fonction aminé) (Schéma 2) .
Figure imgf000005_0001
Schéma 2 : De gauche à droite : Acide Aspartique, Acide Glutamique et Lysine.
Il faut, tout d'abord, noter que ces molécules ne présentent pas de symétrie par rapport à leurs deux fonctions identiques (soit acide carboxylique pour l'acide glutamique et l'acide aspartique, soit aminé pour la lysine) . Par conséquent, elles n'auront pas la même réactivité. Les inventeurs ont essayé de coupler directement des peptides sur ces fonctions identiques (soit acide carboxylique pour l'acide glutamique et l'acide aspartique, soit aminé pour la lysine) en une seule étape afin d'obtenir directement un squelette comportant 2 peptides et une fonction orthogonale pouvant être, par la suite, fonctionnalisée. Cependant, les inventeurs n'ont jamais obtenu le système désiré ou bien dans des rendements extrêmement faibles et à la suite de purifications longues et compliquées.
Ces dérivés comme d' autres ne permettent donc pas d'obtenir, de façon rapide, peu coûteuse et relativement pure, un système multimérique (ici dimérique) en une seule étape.
Au contraire, les inventeurs ont pu fonctionnaliser la molécule du Schéma 1 sur sa partie diacide avec des peptides ou autres molécules organiques en une seule étape et avec de très bons rendements (cf. partie expérimentale ci-après) . Ce phénomène peut s'expliquer par l'axe de symétrie qui existe dans la molécule diacide conférant aux deux fonctions acides la même réactivité. Un autre avantage directement lié à la structure de la molécule du Schéma 1 réside dans le fait que les fonctions acides ne sont pas encombrées comme, par exemple, dans le cas de l'acide glutamique ou de la lysine.
De plus, afin de conférer un degré de liberté plus important aux molécules possédant une activité biologique, les inventeurs ont synthétisé des dérivés de la molécule diacide incorporant des bras espaceurs terminant par diverses fonctions comme des azides, des aminés ou bien des acides carboxyliques . Ces bras espaceurs étant du même type pour chacun des dérivés, la symétrie initiale de la molécule diacide est respectée. Ceci permet donc, comme pour la molécule diacide, de les fonctionnaliser, en une seule étape et avec des rendements élevés, avec des molécules d'intérêt. Ceci permet aussi de varier les groupements fonctionnels en bout des bras espaceurs et de ne pas se contenter des fonctions acides carboxyliques de la molécule du Schéma 1.
La présente invention concerne donc un conjugué de formule (I) suivante :
A-Ri-N (H) -N (CH2-C (=0) -R2-B) 2 ( I )
dans laquelle
A représente une entité fonctionnelle ;
B représente une entité de ciblage ;et
Ri et R2, identiques ou différents, représentent, chacun une liaison ou un groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone et notamment de 1 à 30 atomes de carbone.
Avantageusement, Ri (ou R2) est un groupe (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un groupe (hétéro ) vinylène éventuellement substitué.
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe alkylène », un groupe hydrocarboné saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, comprenant de 1 à 30 atomes de carbone, notamment de 1 à 20 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 10 atomes de carbone . Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe hétéroalkylène », un groupe hydrocarboné saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, comprenant au moins un hétéroatome et de 1 à 30 atomes de carbone, notamment de 1 à 20 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 10 atomes de carbone, le ou les hétéroatomes pouvant être N, 0, P, Si ou S et notamment N, 0, ou S . Les hétéroatomes peuvent en particulier interrompre une chaîne alkylène, démarrer une chaîne alkylène et/ou terminer une chaîne alkylène. De même, le (ou les) hétéroatome ( s ) peu (ven) t former avec au moins un atome de la chaîne alkylène, un triazole. Il est clair qu'un tel cycle triazole peut interrompre une chaîne alkylène, démarrer une chaîne alkylène et/ou terminer une chaîne alkylène.
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par groupe « vinylène », un groupe hydrocarboné insaturé, linéaire, ramifié ou cyclique, comprenant au moins une insaturation éthylénique et de 1 à 30 atomes de carbone, notamment de 1 à 20 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 10 atomes de carbone.
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe hétérovinylène », un groupe hydrocarboné insaturé, linéaire, ramifié ou cyclique, comprenant au moins une insaturation éthylénique et de 1 à 30 atomes de carbone, notamment de 1 à 20 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 10 atomes de carbone, le ou les hétéroatomes pouvant être N, 0, P, Si ou S et notamment N, 0, ou S .
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe (hétéro ) alkylène substitué » ou « groupe (hétéro ) inylène substitué », un groupe (hétéro ) alkylène ou un groupe (hétéro ) inylène tel que précédemment défini, mono- ou polysubstitué par un groupement choisi parmi un halogène ; une aminé ; une diamine ; un carboxyle ; un carboxylate ; un aldéhyde ; un ester ; un éther ; un hydroxyle ; un halogène ; un (hétéro ) alkyle éventuellement substitué et notamment tel qu'un méthyle, un éthyle, un propyle ou un hydroxypropyle ; une aminé ; un amide ; un sulfonyle ; un sulfoxyde ; un sulfonate ; un acyle ; un vinyle ; un hydroxyle ; un époxy ; un phosphonate ; un acide sulfonique ; un isocyanate ; un thiol ; un glycidoxy et un acryloxy. A titre d'exemples avantageux de groupes Ri et
R2, on peut citer les groupes suivants :
-0-R3- ou -R3-0- avec R3 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini ;
-O-R4-O- avec R représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini ;
-0-R5-N(R6)- ou -N(R6) -R5-0- avec R5 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini et R6 représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle ; -N ( R7 ) -R8 - ou -R8 -N ( R7 ) - avec R8 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini et R7 représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle ;
-N ( Rg ) -Rio-N ( Ru ) - avec Rio représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini et R9 et Ru , identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle
-S-R12 - ou -R12-S- avec R12 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini ;
-S-R13-S- avec R13 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini ;
-O-R14-S- ou -S-R14-O- avec R1 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini ;
- S-R15-N ( Rie ) - ou -N ( Rie ) -R15- S - avec Ri 5 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué tel que précédemment défini et R16 représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle ;
- C(0) -Ri7 - ou -Ri7 - C(0)- avec Ri 7 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) inylène éventuellement substitué tel que précédemment défini.
A titre d'exemples particuliers de groupes Ri et R2, on peut citer les groupes tels que précédemment définis dans lesquels R3, R , R5, R8, Rio R12, R13, Ri Ris ou R17 sont un hétéroalkylène éventuellement substitué ou un hétérovinylène éventuellement substitué interrompu par au moins un groupement choisi parmi -S- maléimido- ; maléimido-S- ; -S-S- ; -S-C (=0) - ; -C (=0) - S- ; -N(H)-C(=0)- ; -C(=0)-N(H)- ; -O-C (=0) - ; -C (=0) - 0- ; -N-C(=0)-0- ; -0-C(=0)-N- et un triazole.
A titre d'exemples plus particuliers de groupes Ri et R2, on peut citer les groupes tels que précédemment définis dans lesquels R3, R4, R5, Rs, Rio, Ri2f Ri3f io R15 ou R17 répondent à l'une des formules suivantes :
-Rie- (N (H) -C (=0) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (N (H) -C (=0) ) p-R2i- -Rie- (C(=0)-N(H) )m-R19- (C2H40) n-R2o- (N (H) -C(=0) ) p-R2i-
-Ri8- (N (H) -C (=0) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (C (=0) -N (H) ) p-R21- -Rie- (C (=0) -N (H) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (C (=0) -N (H) ) p-R21- dans lesquelles
Ri8f Ri9f R20 et R21 représentent une liaison ou un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué tel que précédemment défini ;
m représente 0 ou 1 ;
n représente 0 ou un nombre entier compris entre 1 et 10, notamment entre 1 et 5 et, en particulier, 1, 2, 3 ou 4 ; et
p représente 0 ou 1. Avantageusement, Ri8, R19, R20 et R21 représentent une liaison ; un alkylène tel que précédemment défini et avantageusement un alkylène présentant 1, 2, 3 ou 4 atomes de carbone ou un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué et présentant un triazole. A titre d'exemples encore plus particuliers de groupes Ri et R2, on peut citer les groupes suivants :
-N(H) -C2H4- OC2H4)2- -N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 3" -N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 4" -N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- OC2H4)2- -N (H) C (=0) -C2H4-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 3" -N (H) C (=0) -C2H4-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 4" -N (H) C (=0) -C2H4-
-N(H) -C2H4- OC2H4)2- -triazole- ■N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 3" -triazole- ■N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 4" -triazole- ■N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- OC2H4)2- -triazole- ■N (H) C (=0) -C2H4-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 3" -triazole- ■N (H) C (=0) -C2H4-
-N(H) -C2H4- OC2H4) 4" -triazole- ■N (H) C (=0) -C2H4-
De plus, en ce qui concerne les groupes Ri et R2 d'un même conjugué selon la présente invention, on peut envisager les cas de figures suivants :
- le groupe Ri et les groupes R2 représentent tous une liaison ;
- le groupe Ri représente une liaison et les groupes R2 représentent un même groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone tel que précédemment défini ;
le groupe Ri représente un groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone tel que précédemment défini et les groupes R2 représentent une liaison .
- le groupe Ri représente un 1er groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone tel que précédemment défini et les groupes R2 représentent un même 2nd groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone tel que précédemment défini, les 1er et 2nd groupements de liaison pouvant être identiques ou différents .
Par « entité fonctionnelle », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement qui confère au conjugué une fonction notamment dans la détection, le diagnostic et/ou le traitement préventif, prophylactique ou thérapeutique.
Avantageusement, l'entité fonctionnelle est choisie parmi un groupement facilement détectable, un groupement cytotoxique, un agent thérapeutique ou un nano-ob et .
Par « groupement facilement détectable », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement qui peut être détecté par mise en œuvre d'une technique de détection appropriée avantageusement non invasive telle que la microscopie, la scintigraphie, la spectrométrie de résonance paramagnétique, la spectrométrie de fluorescence, la spectrométrie infrarouge, la tomographie d'émission de positrons (TEP) , la tomographie d'émission monophotonique (TEMP ou SPECT en anglais) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) . Un conjugué selon l'invention comprenant un tel groupement facilement détectable est particulièrement adapté au domaine de l'imagerie et du diagnostic. Il permet notamment d'identifier et localiser des sites au niveau desquels la structure moléculaire reconnue par les entités de ciblage est présente, produite ou surexprimée.
Dans une lere forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être une enzyme ou une molécule capable de générer un signal détectable et éventuellement quantifiable dans des conditions particulières comme lors de la mise en présence d'un substrat adapté. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la biotine, la digoxygénine, la 5-bromodéoxyuridine, une phosphatase alcaline, une peroxydase, une glucose amylase et un lysozyme.
Dans une 2eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être un marqueur fluorescent, chimiofluorescent ou bioluminescent tel que la cyanine et ses dérivés, la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (pour « Green Fluorescent Protein ») et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés et 1' umbelliférone ; le luminol ; la luciférase et la luciférine.
Dans une 3eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être un marqueur ou isotope radioactif ou un groupement organique contenant au moins un marqueur ou isotope radioactif. Un tel marqueur ou isotope radioactif est notamment l'iode-123, l'iode-125, l'iode-126, l'iode- 133, l'iode-131, l'iode-124, l' indium-111, l'indium- 113m, le brome-77, le brome-76, le gallium-67, le gallium-68, le ruthénium-95, le ruthénium-97 , le technétium-99m, le fluor-19, le fluor-18, le carbone- 13, l'azote-15, l' oxygène-17, l' oxygène-15, l'oxygène- 14, le scandium-47, le tellurium-122m, le thulium-165, 1' yttrium-199, le cuivre-64, le cuivre-62, le carbone- 11, l'azote-13, le gadolidium- 68 et le rubidium-82. Il convient de remarquer que certains atomes radioactifs utilisés comme groupements facilement détectables peuvent aussi constituer des groupements cytotoxiques du fait de la quantité de radioactivité qu' ils peuvent délivrer .
Dans une 4eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être un marqueur paramagnétique ou ferromagnétique tel que du 2 , 2 , 6, 6-tétraméthylpipéridine N-oxyde (TEMPO) ou un complexe capable de chélater des ions paramagnétiques ou ferromagnétiques comme Gd3+, Cu2+, Fe3+, Fe2+ et Mn2+.
Dans une 5eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être une particule d'or ou un composé dense tel qu'une nanoparticule et notamment, à titre d'exemple, une nanoparticule d'oxyde ferrique.
Par « groupement cytotoxique », on entend un groupement directement ou indirectement toxique pour le site de liaison et notamment les cellules ciblées par l'entité de ciblage du conjugué selon la présente invention. Par « directement cytotoxique », on entend un groupement qui est en lui-même cytotoxique. Par « indirectement cytotoxique », on entend un groupement qui, bien que non cytotoxique en lui-même, peut induire une cytotoxicité, par exemple par son action sur une autre molécule ou par une action supplémentaire sur lui .
Dans une lere forme de mise en œuvre du groupement cytotoxique, ce dernier est un agent chimiothérapeutique cytotoxique. L'homme du métier connaît différents agents chimiothérapeutiques cytotoxiques utilisables dans le cadre de la présente invention. L'activité de ces agents peut être augmentée sous irradiation. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer les agents alkylants comme la méchloréthamine ou le chlorambucile ; la méthotrexate ; la 5-fluoro-uracile ; la vinblastine ; la gemcitabine ; la fludarabine ; la nicotinamide ; la doxorubicine ; la mitomycine ; la L-asparaginase ; le cisplatine ; le taxol et ses analogues/dérivés.
Dans une 2eme forme de mise en œuvre du groupement cytotoxique, ce dernier est un groupement (poly) peptidique cytotoxique tel que la ricine, l'abrine, l'exotoxine de Pseudomonas, le TNFa et 1 ' interleukine 2.
Dans une 3eme forme de mise en œuvre du groupement cytotoxique, ce dernier est un agent chimiothérapeutique indirectement cytotoxique. Un tel agent également appelé « pro-drogue » n' est pas ou peu cytotoxique en tant que tel mais est apte à donner, notamment suite à une réaction enzymatique ou à une irradiation, une substance cytotoxique (ou drogue) notamment telle que définie dans la lere forme de mise en œuvre. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la méthotrexate-alanine ; la mitomycine phosphate, la 5-fluorocytosine ; la photofrine et la capécitabine .
Dans une 4eme forme de mise en œuvre du groupement cytotoxique, ce dernier est un groupement (poly) peptidique indirectement cytotoxique. Par groupement poly (peptidique ) indirectement cytotoxique, on entend un polypeptide qui présente une activité enzymatique et peut convertir une pro-drogue relativement non toxique notamment telle que définie dans la 3eme forme de mise en œuvre en une substance cytotoxique notamment telle que définie dans la lere forme de mise en œuvre. Parmi de tels groupements (poly) peptidiques indirectement cytotoxiques , on peut citer une peptidase telle qu'une carboxypeptidase, une aminopeptidase ou une endopeptidase ; une phosphatase ; une sulfatase ; une amidase ; une kinase ; une glycosidase ; une désaminase ; une réductase ; et une oxydase.
Dans une 5eme forme de mise en œuvre du groupement cytotoxique, ce dernier est une molécule d' acide nucléique qui est directement ou indirectement cytotoxique telle qu'un oligonucléotide anti-sens.
Par « agent thérapeutique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un agent ou principe biologiquement actif capable d'induire un effet thérapeutique, préventif ou prophylactique notamment là où le site de liaison reconnu par les entités de ciblage est présent, produit ou surexprimé et, de fait, au sujet humain ou animal qui a reçu le conjugué selon l'invention. Il convient de remarquer que les groupements cytotoxiques précédemment listés font également partie des agents thérapeutiques.
L'agent thérapeutique susceptible d'être mis en œuvre au niveau du conjugué selon l'invention peut être sélectionné parmi les principes actifs classiquement utilisés en pharmacothérapie et notamment dans les familles pharmacothérapeutiques suivantes : allergologie, anesthésie/ réanimation, cancérologie et hématologie, cardiologie et angiologie, contraception et interruption de grossesse, dermatologie, endocrinologie, gastro-entéro-hépathologie, gynécologie et obstétrique, immunologie et médicaments de la transplantation, infectiologie et parasitologie, métabolisme, diabète et nutrition, neurologie/ psychiatrie, ophtalmologie, oto-rhino- laryngologie, pneumologie, rhumatologie, stomatologie, toxicologie, urologie/ néphrologie, ainsi que parmi les antalgiques/ anti-pyrétiques et antispasmodiques, anti¬ inflammatoires, les produits de diagnostic, les hémostatiques et les produits de traitement du sang et dérivés .
Notamment, l'agent thérapeutique peut être sélectionné dans le groupe constitué par les anti¬ inflammatoires et notamment les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les anti-épileptiques , les antiparkinsoniens , les antimyasthéniques , les antispastiques , les antiépileptiques , les neuroleptiques, les antidépresseurs, les psychotropes, les anticholinestérasiques , les antagonistes des récepteurs NMDA, les anti-acides, les antisécrétoires gastriques, les antagonistes de la dopamine, les antispasmodiques, les antimigraineux, les cholérétiques , les hépatotropes , les laxatifs, les dérivés de la vitamine A, les antiviraux, les anticancéreux, les antalgiques, les anti-ulcériques , les antipsoriasiques, les antibiotiques, les inhibiteurs des cyclooxygénases (inhibiteurs COX) , les cytokines et les hormones telles que les hormones sexuelles (par exemple, les anti-œstrogènes, les œstrogènes, les progestatifs, les androgènes et les anti-androgènes ) .
Par « nano-ob et », on entend, dans le cadre de la présente invention, un objet de forme quelconque et ayant au moins une dimension spatiale de taille nanométrique . Généralement, au moins une dimension spatiale de ce nano-objet est comprise entre 5 et 5000 nm et notamment entre 10 et 2000 nm. Il peut notamment s'agir d'une nanoparticule, d'un nanocristal, d'un nanofil, d'une nanofibre, d'un nanotube, d'une nano-étoile ou d'une nanocolonne.
A titre d'exemples particuliers de nano-objets utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer un nanotube de carbone, un nanotube d'oxyde de silicium, une nanoparticule polymérique, une nanoparticule de fer, une nanoparticule d'oxyde de silicium, une nanoparticule paramagnétique ou superparamagnétique comme une nanoparticule d'oxyde ferrique ou les SPION (pour « SuperParamagnetic Iron Oxide Nanoparticles ») , un liposome contenant des ions paramagnétiques ou des nanoparticules paramagnétiques ou superparamagnétiques , un quantum dot (QDOT) , une vésicule lipidique, une vésicule terpénoïque, un assemblage supramoléculaire organique et/ou inorganique, une vésicule polymérique, une nano-étoile d' or .
Par « entité de ciblage », on entend dans le cadre de la présente invention une entité apte à cibler le conjugué selon l'invention au niveau d'un site de liaison. Le ciblage mis en œuvre implique une reconnaissance moléculaire entre l'entité de ciblage et le site de liaison. Le site de liaison peut être un organisme animal ou végétal ou peut se situer ou être produit dans un organisme animal ou végétal comme une cellule, un type cellulaire, un tissu, ou un virus. Il peut être présent sur une protéine comme une enzyme, un récepteur membranaire, un anticorps ou bien il peut être présent sur un polynucléotide En variante, le site de liaison peut se situer ex vivo et notamment dans un fluide biologique préalablement extrait ou obtenu à partir d'un organisme animal ou végétal. En variante encore, le site de liaison peut avoir été greffé sur un support solide tel qu'un support de biopuce.
Avantageusement, l'entité de ciblage mise en œuvre dans le cadre de la présente invention est choisie parmi une protéine ; un polypeptide ; un peptide ; un stéroïde ; une cytokine ; un neurotransmetteur ; un antigène ; un anticorps ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab' )2f Fv, scFv et diabody ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste d'un récepteur ; un antagoniste d'un récepteur ; une petite molécule ; un sucre ou un polysaccharide ; un glycanne ; une leptine ; un polynucléotide ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; et un facteur de croissance.
Par « polynucléotide », on entend, dans le cadre de la présente invention un acide nucléique, une séquence nucléique, une séquence d'acide nucléique, un oligonucléotide, une séquence polynucléotidique, une séquence nucléotidique, un ADN simple-brin, un ADN double-brin, un ARN ou un aptamère. Un polynucléotide dans le cadre de la présente invention peut comprendre des nucléotides naturels et des nucléotides non naturels.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un conjugué tel que précédemment défini. Dans une lere forme de mise en œuvre d'un tel procédé, ce dernier comprend les étapes consistant à :
ai) éventuellement protéger la fonction aminé primaire du composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II) ;
bi) remplacer les groupements -OH du composé de formule (II) éventuellement protégé par des groupements -R.2-B avec R2 et B tels que précédemment définis de façon à obtenir un composé de formule (III) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) -R2-B) 2 (III) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée ; Ci) éventuellement déprotéger la fonction aminé primaire du composé de formule (III) éventuellement protégé ; et
di) remplacer un des deux hydrogènes de l' aminé primaire du composé de formule (III) par un groupement -Ri-A avec Ri et A tels que précédemment définis de façon à obtenir le composé de formule (I) tel que précédemment défini. Dans une 2nde forme de mise en œuvre d'un tel procédé, ce dernier comprend les étapes consistant à :
B2) éventuellement protéger les fonctions carboxyles du composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II) ;
b2) remplacer un des hydrogènes de l' aminé primaire du composé de formule (II) par un groupement -Ri-A avec Ri et A tels que précédemment définis de façon à obtenir le composé de formule (IV) suivante :
A-Ri-N (H) -N (CH2-C (=0) OH) 2 (IV) dont les fonctions carboxyles sont éventuellement protégées ;
C2) éventuellement déprotéger les fonctions carboxyles du composé de formule (IV) éventuellement protégé ; et
d2) remplacer les groupements -OH du composé de formule (IV) par un groupement -R2-B avec R2 et B tels que précédemment définis de façon à obtenir le composé de formule (I) tel que précédemment défini.
La protection de la fonction aminé lors de l'étape (ai) du procédé selon la présente invention peut consister en la transformation du groupement amino en un groupement acétamido ou amido. En variante, cette protection peut consister à protéger cette fonction par un groupement BOC (pour « tertioButylOCarbonyle ») , un groupement FMOC (pour « 9FluorenylMéthOxycarbonyle ») ou un groupement CBZ (pour « BenZyloxyCarbonyle ») .
De même, la protection des fonctions carboxyles lors de l'étape (a2) du procédé selon la présente invention peut consister à les transformer, par réaction avec un alcool, en fonctions esters et notamment en ester d' azidométhoxybenzyle .
Plusieurs variantes sont envisageables en ce qui concerne les étapes (bi) , (di) , (b2) et (d2) des procédés selon l'invention.
Une lere variante de l'étape (bi) consiste à préparer préalablement un précurseur du groupement -R.2-B puis à le faire réagir avec le composé de formule (II) éventuellement protégé de façon à obtenir le composé de formule (III) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée.
Une 2nde variante de l'étape (bi) consiste à (i) préparer un précurseur du groupement -R2 ; (ii) le faire réagir avec le composé de formule (II) éventuellement protégé de façon à obtenir un composé de formule (V) suivante : H2N-N (CH2-C (=0) -R2' ) 2 (V) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée avec R2' représentant un précurseur du groupement -R2- ; (iii) faire réagir le composé de formule (V) éventuellement protégé avec un précurseur du groupement -B de façon à obtenir le composé de formule (III) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée. Une 3eme variante de l'étape (bi) consiste à (i') préparer un précurseur d'un groupement -Gi ; (ϋ') le faire réagir avec le composé de formule (II) éventuellement protégé de façon à obtenir un composé de formule (VI) suivante : H2N-N (CH2-C (=0) -Gi) 2 (VI) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée ; (iii') préparer un précurseur d'un groupement -G2 ; (iV) le faire réagir avec un précurseur du groupement -B de façon à obtenir un précurseur du groupement -G2-B ; (v' ) faire réagir le composé de formule (VI) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée avec le précurseur du groupement -G2-B de façon à obtenir le composé de formule (III) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée. Le groupement -R2- correspond dans ce cas de figure au groupement -Gi-G2- .
Ces 3 variantes s'appliquent mutatis mutandis aux étapes (di) , (b2) et (d2) des procédés selon 1 ' invention .
Les réactions mises en œuvre lors des étapes
(bi) , (di) , (b2) et (d2) et des différentes variantes envisagées pour ces étapes et notamment lors des étapes (ii), (iii), (ϋ'), (iv') et (v' ) impliquent la présence sur les deux composés réagissant ensemble de deux fonctions chimiques, identiques ou distinctes, et capables de former une liaison covalente. Ces fonctions chimiques sont avantageusement choisies dans le groupe constitué par une fonction carboxyle (susceptible de réagir avec une fonction aminé, une fonction alcool ou une fonction thiol), une fonction hydroxyle ou une fonction alcool (susceptible de réagir avec une fonction carboxyle ou isocyanate) , une fonction aminé (susceptible de réagir avec une fonction ester ou avec une fonction carboxyle) , une fonction ester (susceptible de réagir avec une fonction aminé), une fonction cétone (susceptible de réagir avec deux fonctions alcool, acetalysation) , une fonction époxy (susceptible de réagir avec une fonction aminé), une fonction isocyanate (susceptible de réagir avec une fonction hydroxyle) , une fonction maléimide (susceptible de réagir avec une fonction thiol, une fonction aminé ou un diène) , un diène (susceptible de réagir avec une fonction maléimide) et une fonction thiol (susceptible de réagir avec une fonction maléimide, une fonction carboxyle ou une autre fonction thiol), une fonction azide (susceptible de réagir avec une fonction alcyne) , une fonction arylazide (susceptible de réagir par photochimie avec des fonctions hydrogénées), une fonction aryldiazonium...
En fonction des composés mis en œuvre, des fonctions chimiques présentes sur ces derniers, l'homme du métier connaît les modes opératoires et conditions expérimentales à utiliser lors des étapes des procédés de l'invention, notamment lors des étapes (bi) , (di) , (b2) et (d2) et des différentes variantes envisagées pour ces étapes et, en particulier, lors des étapes (ii), (iii), (ϋ'), (ίν') et (ν' ) . Ces étapes peuvent mettre en œuvre des techniques classiques de synthèse chimique et/ou des techniques dites de « click chemistry ».
Avantageusement, les réactions lors des étapes
(bi) , (di) , (b2) et (d2) et des différentes variantes envisagées pour ces étapes et, notamment, lors des étapes (ii), (iii), (ϋ'), (iv') et (v' ) sont une estérification, une thioestérification ou une amidation .
La présente invention concerne un conjugué selon la présente invention ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la présente invention pour utilisation comme médicament ou en diagnostic. L'application en médecine concerne notamment le cas où l'entité fonctionnelle est un groupement directement ou indirectement cytotoxique ou un agent thérapeutique tel que précédemment défini. L'application en diagnostic concerne avantageusement le cas où l'entité fonctionnelle est un agent facilement détectable. Que l'application soit en médecine ou en diagnostic, l'homme du métier saura déterminer les entités de ciblage à utiliser en fonction de la cible biologique impliquée. La présente invention concerne également un kit de diagnostic comprenant au moins un conjugué selon la présente invention ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la présente invention.
Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, au moins un conjugué selon la présente invention ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la présente invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée au conjugué selon la présente invention pour favoriser son transport, éviter sa dégradation substantielle dans ladite composition, augmenter sa demi-vie et/ou préserver ses propriétés thérapeutiques ou prophylactiques. Avantageusement, un tel véhicule pharmaceutiquement acceptable est stérile et apyrogène. Il est choisi en fonction du type d'application de la composition pharmaceutique de l'invention et notamment en fonction de son mode d'administration.
Ainsi, la composition pharmaceutique selon l'invention est constituée par au moins un conjugué selon la présente invention sous forme libre ou sous forme d'un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable, à l'état pur ou sous forme d'une composition dans laquelle il est associé à tout autre produit pharmaceutiquement compatible. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être employées par voie systémique ; par voie parentérale, par exemple intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, intrathécale, intraventriculaire, intrasternale, intracrânienne, intramusculaire ou sous-cutanée ; par voie topique ; par voie orale ; par voie rectale ; par voie intranasale ou par inhalation.
A titre de compositions solides pour administration orale, on peut utiliser des comprimés, des pilules, des poudres, etc.. où le conjugué selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes classiquement utilisés, et éventuellement à d'autres substances telles que, par exemple, un lubrifiant, un colorant, un enrobage etc.... A titre de compositions liquides pour administration orale ou oculaire, on peut utiliser des suspensions, des solutions, des émulsions, des sirops pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes classiquement utilisés, et éventuellement d'autres substances comme des produits mouillants, édulcorants, épaississants, etc....
Les compositions stériles pour administration parentérale peuvent être des solutions aqueuses ou non, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol , des huiles végétales ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, comme des agents mouillants, isotonisants , émulsifiants, etc....
Les compositions pour l'administration topique peuvent être par exemple des crèmes, lotions, collutoires, gouttes nasales ou oculaires ou aérosol.
Le niveau de dose quotidien de conjugué selon la présente invention est habituellement de 1 à 1 000 mg par adulte (c'est-à-dire d'environ 0,015 à 15 mg/kg) , administrés en doses uniques ou fractionnées. Ces doses ne sont données qu'à titre illustratif. Le médecin, dans tous les cas, saura déterminer la dose réelle la plus adaptée à un patient individuel donné et cette dernière variera, d'une part, selon le groupement directement ou indirectement cytotoxique ou l'agent thérapeutique du conjugué et, d'autre part, selon l'âge, le poids et la réponse du patient. La présente invention concerne un conjugué selon la présente invention ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon la présente invention pour traiter et/ou prévenir un trouble ou une pathologie lié(e) à une des familles pharmacothérapeutiques précédemment listées ou impliquant un traitement curatif, préventif ou prophylactique par un des agents thérapeutiques précédemment listés.
En d'autres termes, la présente invention concerne l'utilisation d'un conjugué selon la présente invention ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement, à la prévention et/ou à la prophylaxie d'un trouble ou d'une pathologie tels que précédemment définis.
En d'autres termes encore, la présente invention concerne un procédé pour traiter et/ou prévenir un trouble ou une pathologie chez un patient souffrant ou susceptible de souffrir d'un tel trouble ou d'une telle pathologie. Ce procédé consiste à administrer audit patient une quantité efficace d'un conjugué selon la présente invention ou susceptible d'être préparé par un procédé selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention.
La présente invention concerne enfin l'utilisation d'un composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II) pour préparer un composé multimérique notamment tel que le conjugué selon l'invention, utile pour le ciblage de molécules d' intérêt en thérapie et/ou en diagnostic .
La présente invention concerne l'utilisation d'un composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II)
dont la fonction aminé primaire est protégée et/ou dont les fonctions carboxyles sont protégées
pour préparer un composé multimérique notamment tel que le conjugué selon l'invention, utile pour le ciblage de molécules d' intérêt en thérapie et/ou en diagnostic . D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à la lecture des exemples ci-après donnés à titre illustratif et non limitatif . EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Composé N°l
Figure imgf000030_0001
C9Hi6N206
MM : 248,11 g/mole Dans un ballon de 100 ml contenant 30 ml de toluène, 1 g (7,57 mmol) de carbazate terbutyle a été ajouté. Après solubilisation de ce premier produit, 3,47 g (22,7 mmol) de méthyle bromoacétate et 2,08 g (15,13 mmol) de carbonate de potassium ont été additionnés au mélange réactionnel.
Le mélange ainsi obtenu a été porté à 90°C pendant 48 h. Par la suite, le solvant a été évaporé sous pression réduite. Le produit de la réaction n'étant pas pur, une purification par chromatographie sur gel de silice Flash a été réalisée avec comme éluant un mélange Dichlorométhane/Acétate d'Ethyle (DCM/ACoEt ; 90/10 ; vol/vol) .
Pour effectuer la saponification du produit, une solution NaOH à 1 N a été utilisée en présence dudit produit dans un mélange de solvant acétonitrile/eau (60 ml/30 ml), la réaction a été maintenue sous agitation à température ambiante pendant 12 h. Ensuite 1 ' acétonitrile a été évaporé sous pression réduite et un lavage avec de l'éther a été réalisé dans la foulée. La phase aqueuse récupérée est par la suite lyophilisée.
Le produit enfin récupéré se présentant sous forme de sel de sodium, une acidification de ce dernier a été réalisée avec une solution 30 ml de HC1 à 0,1 N. La réaction a été maintenue pendant 2 h sous agitation et à température ambiante, ensuite une extraction avec 50 ml d'acétate d' éthyle a été réalisée 3 fois. Enfin un lavage avec 50 ml d'eau de la phase organique récupérée a été effectué. Après évaporation du solvant organique sous pression réduite, 1,49 g de produit pur a été récupéré, soit un rendement réactionnel de 80%.
Le procédé de synthèse du composé 1 à partir de 1 ' hydrazine-acide carboxylique 1.1 ester et de bromo- acétate peut être schématisé comme suit schéma 3) :
Figure imgf000032_0001
NaOH IN, H20/CH3CN
12h, TA
HC1 2N, 2h, TA
Figure imgf000032_0002
Schéma 3
RMN XH (MeOD) δ ppm : 10,23 (s, 2H, ( (CC¾H2--CCOOOOHH)) 2?)) ; 8,5 (s, NH-N) ; 3,35 (s, 4H, (CH2) 2COOH) 1,3 (s, 9H, (CH3)-Boc)
RMN 13 3,C (CDCI3) δ ppm : 173,01 (2C,
(CH2-COOH) 2) 156, 29 (0-C=0-NH) ; 72, 67 (0-C-(CH3)3) ; 61, 63 (N-CH2-COOH) 2) ; 27,3 (3C, (CH3)3)
SM (ESI) : m/z calculé [M+Na]+: 261,11 g/mole; m. trouvé: 261,19 g/mole.
Composé N°2 :
C8Hi8N403
MM : 218,26 g/mole La synthèse du composé 2 également nommé « bras espaceur TEG » a été décrite par Gonçalves. M et al.
[3] .
Six étapes sont nécessaires pour l'obtention du produit final à partir du tétraéthylèneglycol . Le produit final a été purifié sur gel de silice flash avec un mélange d' éluant Dichlorométhane/Méthanol (DCM/MeOH ; 85/15 ; vol/vol) et 5 g du produit final ont été récupérés avec un rendement total de 62%.
RMN XH (CDC13) δ ppm : 3, 69-3, 56 (m, 10H; (5C, (OC¾)5) ; 3,51 (t, 2H; OCH2CH2N3) ; 3,35 (t, 2H, OCH2CH2NH2) ; 3,19 (t, 2H; CH2N3) ; 2,87 (bs, 2H, CH2NH2) .
RMN 13C (CDCI3) δ ppm : 73, 39 (OCH2CH2NH2) ;
71,94-71,51 ((OCH2)5) ; 51,99 (CH2N3) ; 42, 59 (CH2NH2) .
SM (E S I ) : m/z calculé [M+H]+ : 219,11 g/mole; m. trouvé : 219,14 g/mole. La synthèse de ce bras espaceur bifonctionnel avec NH2 d'un côté et N3 de l'autre (composé 2) peut être schématisée comme suit (schéma 4) :
Figure imgf000034_0001
Schéma 4
Composé N°3 :
Figure imgf000034_0002
C25H48 10O10
MM : 648,36 g/mole
Dans 20 ml de DCM, 500 mg (2,01 mmol) du composé 1 ont été solubilisés pendant 15 min. A cette solution, 1,08 g (8,06 mmol) de N-hydroxybenzotriazole (HOBt) et 923 mg du composé 2 (4,23 mmol) ont été ajoutés. Enfin, 1,86 ml (12,06 mmol) de diisopropylocarbodiimide (DIC) et 0,59 ml (4,23 mmol) de triéthylamine ont été additionnés au mélange réactionnel.
La réaction est maintenue sous agitation à température ambiante et sous atmosphère de N2 pendant 12 h. A la fin de la réaction, 80 ml de DCM sont ajoutés et un lavage avec 30 ml d'eau est répété 3 fois. Ensuite un lavage de la phase organique récupérée est réalisé deux fois avec 30 ml d'une solution de HC1 à 0,5 N. Enfin un dernier lavage à l'eau est réalisé deux fois avec 30 ml à chaque fois.
La phase organique récupérée à la fin des lavages est séchée avec du MgSC et le solvant évaporé sous pression réduite. Une purification du produit final a été réalisée sur gel de silice flash avec un mélange d' éluant DCM/MeOH 95/05. Le produit pur est récupéré sous forme d'huile jaunâtre dont la masse a été de 1,11 g (1,71 mmol), ce qui fait un rendement réactionnel de 85%.
RMN XH (CDC13) δ ppm : 7,59 (bs, 2H, (CH2NHO)2) ; 7,08 (bs, 1H, NNHO) ; 3,67 (s, 20H, { {O R2) 5) 2) i 3,56 (s, 8H, (OCH2CH2N3) 2, (NCH20)2) ; 3,48 (s, 4H, (OCH2NH)2) ; 3,40 (s, 4H, (CH2N3)2) ; 1,43 (s, 9H, (CH3) 3) ·
RMN 13C (CDCI3) δ ppm : 170,9 (CH2-C=0-NH) ; 157,01 (0-C=0-NH) ; 70, 79-71, 29 (6C, ( (-CH2-0-CH2) 3) 2) ; 71,97 (0-C-(CH3)3) ; 62, 48 (2C, (N-CH2-C=0) 2 ) ; 51,99 (2C, (O-CH2-CH2-N3) 2) ; 40, 29 (2C, (NH-CH2-CH2-0) 2 ) ; 29, 53 (3C, (CH3) 3) . SM (ESI) : m/z calculé [M+H]+: 649,36 g/mole ; m. obtenue : 649,12 g/mole.
La synthèse du composé 3 peut être schématisée comme suit schéma 5) :
Figure imgf000036_0001
Schéma 5
Composé N°4 :
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0001
MM : 1348,56 g/mole
500 mg (0,77 mmole) du composé 3 sont solubilisés dans 10 ml de mélange DCM/TFA (7/3 v/v) , la réaction de déprotection est maintenue pendant 2 h à température ambiante. Par la suite, une neutralisation du pH de la solution est réalisée par l'addition de NaHCC>3 en poudre. Une fois la neutralité atteinte, le produit obtenu est extrait dans du DCM. Enfin la phase organique est séchée via MgSC et le solvant est alors évaporé sous pression réduite. 409 mg de produit sont alors récupérés sous forme de poudre, ce qui donne un rendement réactionnel de 97%.
300 mg (0,55 mmole) du produit fraîchement obtenu à l'étape précédente sont solubilisés dans 10 ml de DMF. A ce mélange, sont additionnés 147 mg (1,1 mmoles) de HOBt, puis 495 mg (0,6 mmole) de cyanine CyTE777 (développée au sein du CBO) sont ajoutés. Enfin, 300 μΐ (2,2 mmoles) de diisopropylocarbodiimide et 83 μΐ (0,6 mmole) de triéthylamine sont ajoutés au mélange réactionnel. La réaction est maintenue sous agitation pendant 5 h à température ambiante et sous atmosphère de N2, à l'abri de la lumière car le chromophore peut se détériorer.
A la fin de la réaction, le solvant est évaporé sous pression réduite, le produit est ensuite solubilisé dans 50 ml de DCM et un lavage à l'eau (20 ml) est réalisé 3 fois. Le produit est récupéré sous forme de solide mou verdâtre (644 mg, rdt : 87%) . RMN XH (CD3OD) δ ppm : 8,89 (d, 3H) ; 7,53 (d, 4H) ; 7,43 (t, 4H) ; 6,32 (m, 4H) ; 4,19 (t, 4H) ; 3,35-3,28 (m, 36H) ; 3,14-3,06 (m, 2H) ; 2,97 (t, 4H) ; 2,91 (t, 4H) ; 2,68 (t, 2H) ; 2,00-1,92 (m, 10H) ; 1,76 (s, 12H) .
MALDI-TOF m/e (M+H+) trouvée : 1349,14 g/mole ; calculée : 1349,56 g/mole.
Composé N°5 :
Figure imgf000038_0001
: 1296,58 g/mol
300 mg (0,22 mmoles) du composé 4 sont solubilisés dans 10 ml de DMF distillé, ensuite 63 mg (0,24 mmole) de PPh3 sont ajoutés et le mélange réactionnel est placé sous atmosphère de N2. La solution est agitée pendant 12 h à température ambiante et toujours sous atmosphère de N2. Le solvant est ensuite évaporé jusqu'à 10% de son volume initial. Un mélange 1 :1 d' éther de pétrole et d' éther est ajouté et l'ensemble a été mis à 0°C, la solution est alors filtrée pour éliminer la triphénylphosphine oxydée. Le filtrat obtenu est alors évaporé et le produit est purifié sur gel de silice avec un mélange d' éluant DCM/MeOH (7/3 v/v) . 239, 6 mg (0,18 mmoles)du composé 5 ont été récupérés, ce qui donne un rendement final de la réaction de 84%.
NMR XH (CD3OD) δ ppm : 8,89 (d, 3H) ; 7,53 (d, 4H) ; 7,43 (t, 4H) ; 6,32 (m, 4H) ; 4,19 (t, 4H) ; 3,35-3,28 (m, 32H) ; 3,20 (t, 4H) ; 3,14-3,06 (m, 2H) ; 2,97 (t, 4H) ; 2,91 (t, 4H) ; 2,81 (bs, 4H) ; 2,68 (t, 2H) ; 2,00-1,92 (m, 10H) ; 1,76 (s, 12H) .
MALD I - TOF m/e (M+H+) trouvée 1297,32 g/mol calculée 1297,58 g/mol.
Composé N°6 :
Figure imgf000040_0001
C248H279 64Na059S5
MM : 5257,28 g/mol
Le peptide CB0-P11 est un mime du VEGF (pour « Vascular Endothelial Growth Factor ») . Il cible le récepteur du VEGF sur des cellules endothéliales (Demande de brevet FR 2814744 [4]) . Dans 5 ml de DCM, ont été solubilisés 50 mg (1,38.1CT2 mmole) de peptide CBO-P11 protégé (SEQ ID NO: 1) . A ce mélange, 3,75 mg (0,025 mmole) de HOBt sont additionnés. Ensuite, 9 mg (0,69.10~2 mmole) du composé 5 sont ajoutés. Enfin 8,7 μΐ (0,05 mmole) de DIC et 2,5 μΐ (0,01 mmole) de triéthylamine sont additionnés au mélange précédent. Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation à température ambiante et sous atmosphère de N2 pendant 14 h. A la fin de la réaction, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit obtenu est purifié par HPLC en utilisant un mélange d' éluant eau/acétonitrile. A la fin de la purification, le produit pur est récupéré sous forme d'un solide de couleur verte.
Les peptides greffés sont ensuite déprotégés avec un mélange de 0,75 g de phénol dans 0,25 ml de TIS, 0,5 ml de H20, 0,5 ml de thianisol et 10 ml de TFA. Le produit purifié précédemment est solubilisé dans 5 ml de solution de déprotection. Le mélange réactionnel est agité pendant 3 h à température ambiante. Le solvant est évaporé jusqu'à 20 % de son volume initial et le produit est précipité dans de l'éther froid. Le composé 6 est filtré et séché sous pression réduite. Ainsi, sont obtenus 12,3 mg de ce produit (Rdt 34%) .
MALDI -TOF m/e (M+H+) trouvée : 5258,62 g/mole ; calculée : 5258,19 g/mole
Analyses UV et fluorescence : Àmax = 780 nm ; Ariuo max = 760 nm
Composé N°7 :
Figure imgf000042_0001
C252H28lN7o a059S5
MM : 5391,32 g/mole
Dans un ballon tricol, 17,53 mg (0,013 mmole) du composé 4 on été solubilisés dans 50 ml d'un mélange eau/tert-butanol (1/1), puis 29,1 mg (0,014 mole, 1,1 équi) de peptide (Pli propargylé) a été additionné, suivi du sulfate de cuivre (0,5 mM) et de l'ascorbate de sodium (1 mM) . Le mélange réactionnel a été agité sous atmosphère d'azote et à 40°C pendant 72 heures.
Ensuite le tert-butanol a été évaporé sous pression réduite et la solution aqueuse restante a été lyophilisée. Le solide obtenu a enfin été purifié par HPLC préparative. 4,90 mg du composé 7 sont obtenus sous forme de solide vert (Rdt 61%) . MALDI -TOF m/e (M+H+) trouvée : 5392,06 g/mol ; calculée : 5392,92 g/mole
Analyses UV et fluorescence : Àmax = 780 nm ; Ariuo max = 760 nm
RÉ FÉRENCE S
[1] Richard Morphy and Zoran Rankovic. "Perspective Designed Multiple Ligands. An Emerging Drug Discovery Paradigm." J. Med. Chem., 2005, 48(21), pp 6523-6543.
[2] Vera Martos, Pilar Castrefio, Juliân Valero and Javier de Mendoza. "Binding to protein surfaces by supramolecular multivalent scaffolds." Current Opinion in Chemical Biology, 2008, 12(6), pp 698-706.
[3] Gonçalves M. et al., « Design, synthesis and évaluation of original carriers for targeting vascular endothelial growth factor receptor interactions. » Pharmaceutical Research, 2005, 22(8), pp 1411-1421. [4] Demande de brevet FR 2814744
« Cyclopeptides, leur procédé de préparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de 1 ' angiogenèse » au nom du CEA publiée le 5 mai 2002.

Claims

REVENDICATIONS
1) Conjugué de formule (I) suivante :
A-Ri-N (H) -N (CH2-C (=0) -R2-B) 2 ( I )
dans laquelle
A représente une entité fonctionnelle ; B représente une entité de ciblage ;et
Ri et R2, identiques ou différents, représentent, chacun une liaison ou un groupement de liaison comprenant de 1 à 40 atomes de carbone et notamment de 1 à 30 atomes de carbone.
2) Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que Ri et/ou R2 est un groupe (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un groupe (hétéro ) vinylène éventuellement substitué.
3) Conjugué selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que Ri et/ou R2 est un groupe choisi parmi :
-0-R3- ou -R3-0- avec R3 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué ;
-O-R4-O- avec R représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué ;
-0-R5-N(R6)- ou -N(R6)-R5-0- avec R5 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué et R6 représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle ; -N (R7) -R8- ou -R8-N (R7) - avec R8 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué et R7 représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle ;
-N (Rg) -Rio-N (Ru) - avec Rio représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué et R9 et Ru, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle
-S-R12- ou -R12-S- avec R12 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué ;
-S-R13-S- avec R13 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué ;
-O-R14-S- ou -S-R14-O- avec R1 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué ;
-S-R15-N (Rie) - ou -N (Rie) -R15-S- avec Ri5 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué et R16 représentant un atome d'hydrogène, un méthyle, un éthyle ou un propyle ;
-C(0) -Ri7- ou -Ri7-C(0)- avec Ri7 représentant une liaison, un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ou un (hétéro ) vinylène éventuellement substitué .
4) Conjugué selon la revendication caractérisé en ce que : R3, R 5, s, Rio, R12, Rl3, Rl4, Rl5 OU R17 répondent à l'une des formules suivantes :
-Rie- (N (H) -C (=0) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (N (H) -C (=0) ) p-R2i- -R18- (C (=0) -N (H) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (N (H) -C (=0) ) p-R2i- -R18- (N (H) -C (=0) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (C (=0) -N (H) ) p-R21- -R18- (C (=0) -N (H) ) m-Ri9- (C2H40) n-R20- (C (=0) -N (H) ) p-R21- dans lesquelles
Ri8f Ri9f 2o et R21 représentent une liaison ou un (hétéro ) alkylène éventuellement substitué ;
m représente 0 ou 1 ;
n représente 0 ou un nombre entier compris entre 1 et 10, notamment entre 1 et 5 et, en particulier, 1, 2, 3 ou 4 ; et
p représente 0 ou 1.
5) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que Ri et/ou R2 est un groupe choisi parmi :
-N(H) -C2H4- (OC2H4)2 -N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 3 -N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 4 -N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- (OC2H4)2 -N (H) C (=0) -C2H4~
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 3 -N (H) C (=0) -C2H4~
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 4 -N (H) C (=0) -C2H4~
-N(H) -C2H4- (OC2H4)2 -triazole- N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 3 -triazole- N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 4 -triazole- N (H) C (=0) -CH2-
-N(H) -C2H4- (OC2H4)2 -triazole- N (H) C (=0) -C2H4~
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 3 -triazole- N (H) C (=0) -C2H4~
-N(H) -C2H4- (OC2H4) 4 -triazole- N (H) C (=0) -C2H4~ 6) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite entité fonctionnelle est choisie parmi un groupement facilement détectable, un groupement cytotoxique, un agent thérapeutique ou un nano-ob et.
7) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite entité de ciblage est choisie parmi une protéine ; un polypeptide ; un peptide ; un stéroïde ; une cytokine ; un neurotransmetteur ; un antigène ; un anticorps ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv, scFv et diabody ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste d'un récepteur ; un antagoniste d'un récepteur ; une petite molécule ; un sucre ou un polysaccharide ; un glycanne ; une leptine ; un polynucléotide ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; et un facteur de croissance. 8) Procédé de préparation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes consistant à :
ai) éventuellement protéger la fonction aminé primaire du composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II) ;
bi) remplacer les groupements -OH du composé de formule (II) éventuellement protégé par des groupements -R2-B avec R2 et B tels que définis à la revendication 1, de façon à obtenir un composé de formule (III) suivante : H2N-N (CH2-C (=0) -R2-B) 2 (III) dont la fonction aminé primaire est éventuellement protégée ;
Ci) éventuellement déprotéger la fonction aminé primaire du composé de formule (III) éventuellement protégé ; et
di) remplacer un des deux hydrogènes de l' aminé primaire du composé de formule (III) par un groupement -Ri-A avec Ri et A tels que définis à la revendication 1, de façon à obtenir le composé de formule (I) tel que défini à la revendication 1.
9) Procédé de préparation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes consistant à :
a2) éventuellement protéger les fonctions carboxyles du composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II) ;
b2) remplacer un des hydrogènes de l' aminé primaire du composé de formule (II) par un groupement -Ri-A avec Ri et A tels que définis à la revendication 1, de façon à obtenir le composé de formule (IV) suivante :
A-Ri-N (H) -N (CH2-C (=0) OH) 2 (IV) dont les fonctions carboxyles sont éventuellement protégées ;
C2) éventuellement déprotéger les fonctions carboxyles du composé de formule (IV) éventuellement protégé ; et
d2) remplacer les groupements -OH du composé de formule (IV) par un groupement -R2-B avec R2 et B tels que définis à la revendication 1, de façon à obtenir le composé de formule (I) tel que défini à la revendication 1.
10) Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la revendication 8 ou 9 pour utilisation comme médicament ou en diagnostic.
11) Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, au moins un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou susceptible d' être préparé par un procédé selon la revendication 8 ou 9 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable .
12) Kit de diagnostic comprenant au moins un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou susceptible d'être préparé par un procédé selon la revendication 8 ou 9.
13) Utilisation d'un composé de formule (II) suivante :
H2N-N (CH2-C (=0) OH) 2 (II)
pour préparer un composé multimérique utile pour le ciblage de molécules d'intérêt en thérapie et/ou en diagnostic.
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FR2814744A1 (fr) 2000-10-04 2002-04-05 Commissariat Energie Atomique Cyclopeptides, leur procede de preparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de l'angiogenese
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RICHARD MORPHY; ZORAN RANKOVIC: "Perspective Designed Multiple Ligands. An Emerging Drug Discovery Paradigm.", J. MED. CHEM., vol. 48, no. 21, 2005, pages 6523 - 6543, XP002434603, DOI: doi:10.1021/jm058225d
VERA MARTOS; PILAR CASTRENO; JULIÂN VALERO; JAVIER DE MENDOZA: "Binding to protein surfaces by supramolecular multivalent scaffolds.", CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, vol. 12, no. 6, 2008, pages 698 - 706, XP025800687, DOI: doi:10.1016/j.cbpa.2008.08.024

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