WO2012084994A1 - Sonde de microscope à force atomique, son procédé de préparation et ses utilisations - Google Patents

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Jérôme Polesel-Maris
Thomas Berthelot
Pascal Viel
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Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
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    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
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    • G—PHYSICS
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    • G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
    • G01Q60/42—Functionalisation

Definitions

  • the present invention belongs to the field of sensors and, more particularly, to the field of Atomic Force Microscope (AFM) probes which are particularly useful in biology.
  • AFM Atomic Force Microscope
  • the present invention relates to the use of an AFM probe such as a piezoelectric integrated sensor probe and methods for preparing this probe for the fine chemical analysis of molecular links through the chemical force spectroscopy in a liquid medium and especially in a biological liquid medium.
  • Direct applications of this type of probe typically cover DNA sequencing, personalized diagnosis, pharmacological engineering and molecular testing in the nanotoxicological field.
  • microleviers or
  • Karra ⁇ uses, for applications in near-field optical microscopy (SNOM), the force feedback provided by the piezoelectric probe to approach a fiber. optical glued on the probe a few tens of nanometers from the surface.
  • US Pat. No. 6,240,771 describes the use of such a piezoelectric integrated sensor AFM probe with a sharp metal tip glued to the end of the probe to scan crystals with atomic resolution. Kaghesima and al. (2002, Applied Surface Science, vol 188, pp.
  • Rensen and van Hulst 2000, Appl Phys Lett, vol 77, pages 1557-1559
  • Rensen and van Hulst 2000, Appl Phys Lett, vol 77, pages 1557-1559
  • Other teams used the piezoelectric probe outside the liquid, but with the tip immersed in a meniscus of liquid to probe the surface below (eg, Koopman et al., 2003, Appl. 83, pages 5083-5085).
  • Integrated sensor probes such as piezoelectric sensors have several advantages over a standard AFM cantilever because they make it possible to dispense with the conventional optical detection system of the latter. They are easier to integrate and use in extreme environments. But an essential point about their use in biological applications is the need to be able to dive into a biological solution keeping a good mechanical and electrical behavior. This condition is not obvious to satisfy because saline solutions used in biology like HEPES, Tris or PBS are extremely conductive due to the presence of many ions in the aqueous medium. Thus, the probe can not be used as such in these liquids because of the inevitable problems of electric leakage, short circuit or corrosion effects on electrodes of the piezo electric sensor ⁇ .
  • the inventors therefore set themselves the aim to provide a system comprising a probe of AFM including an integrated sensor AFM probe piezo electric ⁇ useful for the analysis of molecular bonds in spectroscopy and chemical force in solutions buffers especially in solutions implemented in the field of biology.
  • the AFM probe must also maintain good mechanical and electrical properties, have a good quality factor, when the latter is used in buffer solutions and be obtained by a simple method of implementation.
  • the quality factor is a description of the damping of an oscillating system. It is given by the ratio between the energy transmitted and the energy lost. In the case of a probe, the quality factor represents the energy transmitted in the bandwidth around the resonance with respect to the energy contained outside the bandwidth.
  • the present invention relates to an atomic force microscope probe comprising: i) a piezoelectric resonator provided with two electrodes and coated with an insulating layer; and
  • the AFM probe according to the present invention is a piezoelectric integrated sensor probe. Indeed, it is based on a piezoelectric material associated with two electrodes.
  • the body of the AFM probe according to the present invention is made of a single piezoelectric material.
  • the two electrodes associated with the piezoelectric material make it possible to excite the resonator by applying an oscillating voltage.
  • These same two electrodes are also used to analyze the response of the piezoelectric resonator ⁇ by a current-voltage amplifier converting the displacement current into a voltage.
  • the AFM probe according to the present invention comprises only two electrodes for actuation and motion detection.
  • Figure 1A illustrates the equivalent electrical model of the piezoelectric resonator in the air.
  • C_quartz is the capacity proportional to the mechanical rigidity
  • L_quartz is the inductance proportional to the effective mass of the probe
  • R_quartz is the resistance proportional to the damping of the probe (because of the losses of energy).
  • C_stray_quartz is a parasitic capacitance formed by the two electrodes around the piezoelectric material. Therefore, if one of the three mechanical properties previously mentioned, ie mass, stiffness and damping, is modified by the external environment of the probe, this causes a change in the electrical response detected by the amplifier.
  • the resonator used in the context of the present invention is coated with an insulating layer and can be used in a biological solution.
  • the liquid medium, but also the coating modify the mechanical properties and therefore the electrical properties of the piezoelectric resonator ⁇ as illustrated by the circuit of Figure 1B.
  • the piezoelectric resonator implemented in the context of the present invention is advantageously a piezoelectric material which has the advantage of being directly piezoelectric.
  • no high pressure polarization step is necessary to align the domains and obtain piezoelectric properties, such polarization being necessary, for example, for piezoelectric polycrystalline ceramics.
  • the piezoelectric material used in the context of the present invention retains the properties piezo electric ⁇ stable over time.
  • This piezoelectric material is chosen in particular from quartz, topaz, tourmaline, berlinite, aluminum nitride, zinc oxide, cadmium sulphide, lead titanate, lead titano-zirconate, lithium niobate, lithium tantalate, potassium niobate, langasite, gallium arsenide, sodium barium niobate, bismuth germanium oxide, indium arsenide, antimonide, a piezoelectric polymer such as polyvinylidene fluoride (PVDF) and its derivatives, and mixtures thereof.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the piezoelectric resonator used in the context of the present invention is made of quartz.
  • the electrodes used in the context of the present invention are advantageously metallic and in particular of a metal chosen from among gold, nickel, aluminum, copper, tin and silver.
  • the piezoelectric resonator provided with two electrodes implemented in the context of the present invention can be in all the configurations and geometries particularly envisaged in the AFM probes. More particularly, the piezoelectric resonator provided with two electrodes is in the form of a piezoelectric tuning fork (or "tuning fork” in English) with an electrode arranged on each of the branches of the tuning fork, or in an interdigitation configuration electrodes arranged on the two branches of the tuning fork.
  • the insulating layer used to coat the resonator of the probe according to the present invention corresponds to a passivation layer necessary to protect the electrodes of this probe from any contact with a liquid. It is present on the whole of the resonator and on a part of the electrodes of which it is provided. Indeed, the ends of the non-passivated electrodes ensure good electrical contact of the resonator and in particular the piezoelectric tuning fork to a connector connected to the downstream amplification chain.
  • the critical part to be isolated and protected from the biological liquid medium via the deposition of an insulating layer is the resonator and in particular the piezoelectric tuning fork in operation. This coating must satisfy several conditions which are:
  • Any insulating layer meeting the above conditions can be used to coat the resonator of the probe according to the invention.
  • this insulating layer may be a commercial electrophoretic cathodic or anodic paint used especially in the automobile industry for coating the structure of the car and protecting it against corrosion, but also in the food industry to coat the inner part of canned foods to avoid metal contact with food.
  • this type of paint has already been used to isolate the tip of a tunneling microscope and a scanning electrochemical microscope. Examples of such a paint include BASF GLASSOPHOR electrophoretic paint and CLEARCLAD COATINGS Inc. CLEARCLAD electrophoretic paint.
  • this insulating layer may be made of a material chosen from silicon dioxide, parylene or another [2, 2] paracyclophane derivative, polyimidine, aluminum oxide, aluminum nitride, a polymer vinyl and a hydrophobic silane including a hydrophobic silane as defined in the patent application US 2010/0068697. More particularly, in the context of the present invention, the insulating layer is a parylene layer.
  • the insulating layer as previously indicated, must be thin to avoid overly affecting the mechanical properties of the probe. Therefore, its thickness will depend on the size of the piezoelectric ⁇ resonator and in particular the size of the tuning fork.
  • the insulating layer implemented in the invention advantageously has a constant or substantially constant thickness on the piezoelectric resonator. This thickness is typically between 50 nm and 20 ⁇ , in particular between 250 nm and 10 ⁇ and, in particular, between 750 nm and 5 ⁇ .
  • the fixed tip and in particular glued on the resonator probe the surface to be scanned, studied, characterized and / or analyzed.
  • This tip is in the form of a wire, a fiber or a nanotube.
  • it has an apex defined as the end portion of the tapered tip or nanotube subjected to interaction via the group or the grafted molecule (e) for the analysis of molecular links in chemical force spectroscopy.
  • the tip used in the context of the present invention comprises at least one material selected from platinum, chromium, chromium-gold, platinum-iridium, titanium-platinum, titanium nitride, tungsten carbide, tungsten, carbon or a mixture thereof.
  • the tip according to the invention may consist solely of only one of the previously listed materials.
  • the tip may be more or less flexible, or more or less rigid. It may especially be platinum-iridium or platinum.
  • the tip according to the invention may have two distinct zones, each consisting of one of the previously listed materials.
  • the element 1 is a platinum wire / iridium and 2nd a platinum wire, a graphite fiber or carbon nanotube.
  • This 2 nd element constitutes the apex as previously defined.
  • the tip used in the context of the present invention has a total length of between 2 ⁇ and 5 mm, in particular between 3 ⁇ and 1 mm, and in in particular, between 4 ⁇ and 100 ⁇ .
  • the length of the element 1 is comprised between 2 ⁇ and 4 mm and in particular between 3 ⁇ and 1 mm and the length of the 2 nd element is between 400 nm and 50 ⁇ and, in particular, between 800 nm and 10 ⁇ .
  • the apex of the tip of the probe according to the present invention is functionalized by at least one group of interest or at least one molecule of interest.
  • group of interest (or "molecule of interest”) is meant, in the context of the present invention, a group (or a molecule) capable of chemically interacting with another group or another molecule possibly present. (e) at a surface to be scanned, studied, characterized and / or analyzed by atomic force microscopy. This chemical interaction may involve a covalent bond between the molecule or a non-covalent bond such as a hydrogen or ionic bond.
  • the group of interest may be a simple or complex chemical group. It is in particular selected from -OH, -C (0) OH, -NH 2, -CH 3, -C (0) 0 ", -NH 3 +, -C (0) H, -N 3, or alkene terminal.
  • the molecule of interest is a molecule, natural or synthetic, especially biological.
  • it is chosen from peptides, oligopeptides, proteins such as enzymes, antibodies or antibody fragments, cell or membrane receptors, polysaccharides, cells or cell parts such as organelles or cell membranes, nucleic acids such as DNA and RNA, and natural or synthetic molecules for therapeutic purposes.
  • the functionalization of the tip by the group or the molecule of interest consists in grafting, via at least one covalent bond, the group or the molecule of interest on the surface of the apex of the tip.
  • This grafting can be direct or indirect.
  • the functionalization of the tip by the group or the molecule of interest is indirect and involves a connecting arm covalently bonded, on the one hand, to the tip and in particular to the surface of the apex of the tip and, on the other hand, the group or the molecule of interest.
  • the linker implemented in the context of the present invention advantageously comprises a (hetero) arylene group.
  • the linker may comprise only one (hetero) arylene group.
  • the linker may correspond to a (hetero) arylene group linked to another group of the mobile molecular chain type such as a polyethylene glycol (PEG) group.
  • PEG polyethylene glycol
  • arylene group means an aromatic hydrocarbon structure consisting of one (or more) aromatic ring (s) each comprising from 3 to 10 carbon atoms, in particular from 3 to 10 carbon atoms. to 8 carbon atoms and in particular 6 carbon atoms.
  • heteroarylene group means a heteroaromatic hydrocarbon structure consisting of one (or more) heteroaromatic ring (s) each containing from 3 to 10 carbon atoms, in particular from 3 to 10 carbon atoms. to 8 carbon atoms and, in particular, 6 carbon atoms, the (or) heteroatom (s) may be N, 0, P, Si or S and in particular N, O or S.
  • the heteroatoms can in particular interrupt an aromatic ring and / or separate two aromatic rings from an arylene group.
  • the present invention also relates to a method for preparing an atomic force microscope probe as previously described.
  • the method according to the invention comprises the steps of:
  • step (a) depositing on a resonator provided with two electrodes an insulating layer whereby a resonator is obtained; b) fixing, on the resonator provided with two electrodes and coated with an insulating layer obtained in step (a), a tip;
  • step (b) optionally cut and / or engrave the tip set in step (b);
  • Step (a) of the process according to the invention consists in depositing an insulating thin layer as defined above on the surface of the resonator. This deposit can be performed by any technique to obtain a thin layer.
  • said deposition is carried out by immersion (“dip coating”), by spray (“spray coating”), by spin coating (“spin coating”), by pyrolytic or electrochemically physical deposition.
  • the deposition during step (a) of the process according to the invention is a pyrolytic physical deposit or an electrodeposition.
  • Figure 3 and the experimental section below describe a system used for the implementation form involving electrodeposition. The person skilled in the art will know, depending on the nature and the composition of the insulating layer to be produced, the most suitable electrophoretic bath and operating mode. The experimental part below also shows a protocol involving a pyrolytic physical deposition of monomers, the corresponding insulating layer, in this case, the polymer obtained.
  • known passivation methods for intrinsically conductive materials of simple geometry may be more difficult to apply when the piezoelectric resonator is in the form of a tuning fork. Indeed, passivation can alter the mechanical properties, particularly via a meniscus effect, of this system provided with electrodes and with a more complex geometry.
  • the latter is preferably electrodeposited by implementing a voltage ramp of 0 V at a voltage of between 5 V and 50 V, in particular between 10 V and 25 V, and particular, of the order of 17 V (ie 17 V ⁇ 2 V) and this, in a time between 1 min and 20 min, especially between 2 min and 10 min and, in particular, of the order of 5 min (ie 5 min ⁇ 2 min).
  • Step (a) may be repeated several times and in particular at least two, three or four times until an insulating layer having a satisfactory thickness is obtained.
  • step (a) may comprise a step of annealing the insulating layer, in particular when the insulating layer is an electrophoretic paint, once the latter has been deposited.
  • This annealing step is carried out advantageously between 80 ° C and 180 ° C and in particular between 110 ° C and 160 ° C for 5 min to 60 min.
  • the tip is fixed on the resonator by means of a conductive adhesive such as conductive epoxy glue and in particular Epotek H21D glue.
  • a conductive adhesive such as conductive epoxy glue and in particular Epotek H21D glue.
  • the tip is glued to be perpendicular to the surface to be scanned, studied, characterized and / or analyzed. For this reason, it must be glued to a certain angle on the resonator and in particular on the branch of the tuning fork, this angle being a function of the geometrical configuration of the probe holder of the atomic force microscope used thereafter.
  • the length of the tip is critical for accurate and artifact-free measurements.
  • the length of the element 1 (rigid portion) and also the length of the 2 nd (soft or flexible part) are very critical to retain good properties and for oscillation Avoid artefacts in the measurements due to deformation of the flexible tip during the approach of the tip to the surface. Therefore, it may be necessary to cut and / or engrave the tip of the probe or the various elements constituting it. In this case, step (c) is not optional.
  • Step (c) consists more particularly in a step of electrochemical etching of the tip comprising one or two element (s).
  • Electrochemical etching is a well known method in the field of STM to prepare sharp points whose radius has a few nanometers, necessary to obtain images with high lateral resolution.
  • An electrochemical cut of the tip (from a few millimeters to several tens of micrometers long), but also a fine etching of the apex (below 100 nm) of the tip fixed on the resonator can be obtained.
  • Fotino (1993, Rev. Sci., Instruction 64, pages 159- 167) for etching tungsten tips allows more efficient etching by using the shear force of the bubble stream produced during the etching reaction.
  • the experimental part below proposes protocols for chemical etching to be used for platinum / iridium and / or platinum tips.
  • a person skilled in the art will be able to determine the optimum operating conditions for the chemical etching to be implemented during step (c) of the process. depending on the nature of the tip of the probe.
  • the chemical protocol for functionalizing the tip of the probe with a group or a molecule of interest, during step (d) of the method may consist of any protocol for grafting, covalently and directly or indirectly, a such group or molecule at the surface of the tip of the probe.
  • this protocol implements the methods described in international applications WO 2008/078052 and WO 2009/121944 in the name of the CEA. These applications describe the grafting of molecules derived from cleavable aryl salts and in particular from aryl diazonium salts by using nonelectrochemical conditions.
  • step (d) of the process according to the invention implements at least one element chosen from an aryl diazonium salt bearing a group of interest or a precursor of such a group, an aryl diazonium salt carrying a molecule of interest or a precursor of such a molecule, an aryl diazonium salt bearing an amino function or a precursor of such salts aryl diazonium.
  • precursors in the context of the present invention, an entity separated from the group of interest, the molecule of interest or the aryl diazonium salt by a single process step and easy to implement.
  • the precursors may have greater stability than the interest group, the molecule of interest or the aryl diazonium salt under the same environmental conditions.
  • arylamines are precursors of aryl diazonium salts. Indeed, by simple oxidation reaction, for example, with NaNO 2 in an acidic aqueous medium, or with NOBF 4 in an organic medium, it is possible to form the corresponding aryl diazonium salts.
  • an aryl diazonium salt bearing a -N3 ⁇ 4 group may be used to functionalize the tip with an -OH group as shown in 111.2 (C) below.
  • an aryl diazonium salt carrying a group --N3 ⁇ 4 may be grafted onto the tip of the probe and then rediazotized so as to react with a molecule of interest or with a molecule carrying a group of interest.
  • the molecule of interest and the molecule carrying a group of interest in the context of the present invention correspond to the molecule of interest of the international application WO 2009/121944.
  • the example in point 111.2 (D) illustrates this particular form of implementation.
  • the present invention also relates to the use of a probe as defined above or capable of being prepared by a process as defined previously by atomic force microscopy and in particular for chemical force spectroscopy in biological solution and for imaging. AFM in biological solution. More particularly, these probes are used in dynamic mode at an excitation frequency close to or equal to their resonance frequency. As a variant, these probes are used in off-resonance dynamic mode at an excitation frequency remote from their resonance frequency or at a frequency corresponding to a harmonic different from their fundamental resonance frequency.
  • AFM-Frequency Modulation also known as "AFM Non-Contact”
  • AM-AFM Amplitude Modulation-AFM
  • AFM Tapping also known as AFM Tapping
  • PM-AFM Phase Mode
  • the probe is advantageously used in AM-AFM mode.
  • the signals acquired at the output by approach / withdrawal spectroscopy are the amplitude of oscillation and the phase shift relative to the relative distance tip-surface.
  • These two pieces of information can then be used to recover the chemical interaction forces between the tip and the surface using the formalism proposed elsewhere (Sader et al., 2004, Appl. 84, pages 1801- 18003, Katan et al., 2009, Nanotechnology, Vol 20, 165703, Uchihashi et al., 2004, Appl Phys Lett, vol 85, pp 3575-3577).
  • the probe comprises a piezoelectric tuning fork (1) having a tip (2) functionalized by a group or a molecule of interest (3). It is brought into contact with a solid substrate (6) on which a receptor (5) is grafted, thus making it possible to assess the chemical interactions (4) between this receptor and the group or the molecule of interest.
  • the final chemical bond analysis uses several chemical force curves acquired with the probe for different charge rates (or approach-withdrawal rate) to obtain a Bell-Evans plot.
  • This Bell-Evans scheme described by Muller and Dufrêne, 2008 (Nature Nanotechnology, vol 3, pages 261-269 and Muller et al., 2009, Nature Chem Biol., Vol 5, pages 383-390) allows to obtain quantitative and qualitative chemical information on the energy landscape of chemical links.
  • the dissociation rate k Q ff the potential barriers (free enthalpies), the transition distances can be directly obtained against the charge rate, but also against the temperature or the pH of the solution.
  • the present invention finds applications in the field of diagnosis, DNA sequencing by detecting hybridization between complementary DNA or RNA strands between a target strand attached to the tip of the probe according to the invention.
  • present invention and a strand in solution or attached to a surface and / or the detection of compounds of therapeutic interest such as sugars, proteins, antibodies or oligopeptides.
  • graft onto a surface such as a surface of a solid support made of silicon, glass, metal, polymer or plastic, a membrane receptor particularly involved in a pathological state.
  • the grafting can implement a method as described in international applications WO 2008/078052 and WO 2009/121944.
  • the receptor thus grafted is maintained in a biological medium or a buffer adapted in particular so that it is in a native configuration.
  • the probe according to the invention is functionalized by a synthetic or natural molecule which one wishes to know a potential potential in the treatment of the pathological state.
  • the present invention will make it possible to know if there is a phenomenon of attraction, repulsion or harpooning between this molecule and the grafted receptor.
  • Figure 1 shows the electrical circuits, equivalent to the Butterworth-Van Dyke circuits, of a quartz: in vacuum or in air (Figure 1A), with a coating and immersed in a liquid ( Figure 1B).
  • Figure 2 is a schematic diagram of the integrated piezoelectric sensor probe for determining chemical interactions at the molecular level.
  • Figure 3 illustrates the device for electrolytic deposition to obtain a resonator coated with an insulating layer.
  • Figure 4 shows a photograph of the tuning fork obtained during an electrochemical deposition of the electrophoretic paint either without optimization of the voltage parameters (no voltage ramp, the voltage applied directly) ( Figure 4A) or by applying a slow voltage ramp (Figure 4B).
  • Figure 5 shows the voltage ramp (13) via the ramp voltage generator to optimize the electrophoretic paint layer (Figure 5A), with the simultaneous tracking of the current during electroplating during the first electroplating (14). ) and during the second electrodeposition (15) ( Figure 5B).
  • Figure 6 shows the amplitude resonance curves in three different pipe configurations obtained for the same tuning fork coated with electrophoretic paint: in the air, with the only tip immersed in the solution and with the entire probe immersed in the solution.
  • Figure 7 shows the amplitude (thin lines) and the phase (thick lines) of the same type of tuning fork but coated by a layer of parylene: in the air ( Figure 7A) and the whole probe immersed in a solution ( Figure 7B).
  • Figure 8 shows a detailed view of the arrangement of the tip carried by the tuning fork.
  • Figure 9 is a schematization of the configuration used to perform the electrochemical section but also the fine engraving of the apex of the tip fixed on a branch of the tuning fork piezoelectric ⁇ electric.
  • Figure 10 shows the optical microscope image of a platinum / iridium tip with a diameter of 50 ⁇ after the engraving of an apex end (radius of the end of the tip less than 100 nm).
  • Figure 11 shows the optical microscope images of a graphite tip with a diameter of 10 ⁇ before ( Figure 11A) and after ( Figure 11B) the engraving of a fine apex (radius of the tip of the lower tip). at 1 ⁇ ).
  • Figure 12 shows different chemical functionalizations of the tip tip presented as a triangle, based on the chemistry of the diazonium salt.
  • Figure 13 shows the chemical functionalization by BSA of a surface based on diazonium salt chemistry.
  • Figure 14 shows three approach-shrink curves performed on a surface of mica, coated with gold, clean without chemistry, with tips whose end is functionalized by ⁇ - ⁇ 3 ⁇ 4 ( Figure 14A), (p-CH 3 ( Figure 14B) and ⁇ - ⁇ ( Figure 14C) No specific chemical grafting appears.
  • Figure 15 shows three approach-shrink curves performed on a surface of mica, coated with gold and functionalized by BSA, with tips whose end is functionalized by ⁇ - ⁇ 3 ⁇ 4 ( Figure 15A), (p- CH 3 ( Figure 15B) and ⁇ - ⁇ ( Figure 15C) A specific chemical grafting signature appears clearly on the withdrawal curves
  • the graph in Figure 15D shows a tip whose non-functional end is used to probe the surface of mica, coated with gold and functionalized by BSA.
  • the piezoelectric probe used is a quartz piezoelectric resonator with two metal electrodes obtained by physical deposition (sputtering or evaporation of a metal target) of a chromium or titanium bonding layer (thickness of the order of 50 nm) followed by a second deposit of nickel or gold (thickness of the order of 400 nm) in the form of a commercially available tuning fork (eg CITIZEN AMERICA CFS206).
  • a commercially available tuning fork eg CITIZEN AMERICA CFS206.
  • Electrophoretic paint coating After an ultrasonic bath of the quartz resonator in ethanol and acetone, the quartz probe is coated in a bath of BASF GLASSOPHOR, electrophoretic cathodic paint, followed by an ultrapure water rinse Millipore and finally an annealing.
  • the device of Figure 3 comprises a piezoelectric tuning fork (1) and its two electrodes connected together (7) to an ammeter (8).
  • the mass (9) is connected to the other connector of the ammeter with the negative electrode of the voltage ramp generator (10).
  • the positive electrode of the voltage ramp generator (10) is connected to the platinum counter electrode (11) of the electrodeposition bath (12) containing the cathodic electrophoretic paint mixture diluted in ultrapure water.
  • the use of anodic electrophoretic paint is possible and involves inverting the polarities of the voltage generator of the ramp.
  • the voltage ramp rate is essential for controlling thickness and uniformity electrodeposited polymer layer of electrophoretic paint (see Figure 5).
  • a ramp from 0 V to 17 V in 300 sec was found optimal ( Figure 5A).
  • the electrophoretic coating operation (electroplating in a bath + annealing) must be repeated 2 or 3 times in order to obtain an effective insulating coating with a thickness of 3 ⁇ .
  • a current control determines a plateau phase during the ramp where the deposition of the layer is finished (current I is equal to about 300 ⁇ ), followed by a decrease. zero current indicating the end of the process (see Figure 5B).
  • the probe was tested, firstly, completely immersed in a drop of buffer solution, then, with only the tip glued to the end of one of the branches of the tuning fork immersed in the buffer solution.
  • the tip is a Platinum / Iridium wire, diameter 50 ⁇ and about 4 mm long, glued with epoxy glue on a branch of tuning fork coated with electrophoretic paint.
  • Three configurations are the tuning fork in the air, the entire tuning fork in the buffer solution and only the tip of the tuning fork in the same buffer solution were studied. As shown in FIG.
  • the method is faster than the previous one to obtain a conformal coating of the probes.
  • This is a one-step process.
  • the parylene deposit for the passivation coating is a deposit pyrolytic physics of monomers, with the sample to be coated at room temperature. This process by pyrolysis is known to those skilled in the art and reference may be made for example to the protocol of EL Heintz et al., 2001, IEEE-NANO 2001. Proceedings of the 2001 Ist IEEE Conference on Nanotechnology, pp. 346-351 (2001).
  • Parylene is well known to be hydrophobic and biocompatible, and widely used to coat surgical tools. There are several types of parylene. The most effective for a passive deposition are parylene N ([2, 2] paracyclophane) and parylene C (Dichloro [2, 2] paracyclophane). The tuning fork piezoelectric ⁇ electrical was coated in a vacuum at room temperature, after having been rinsed with ethanol and acetone. The parylene thickness was characterized at 545 nm and conforms to the shape of the resonator. Parylene N was used in this case.
  • the body of the tuning fork (1) holds, on one of its branches, a rigid tip (2a) of platinum / iridium, maintained with a point of conductive epoxy glue (16), such as Epotek H21D glue.
  • a point of conductive epoxy glue (16) such as Epotek H21D glue.
  • An adhesive point (17) is also added to the opposite branch so as to maintain mass symmetry during oscillation and thus maintain a high quality factor.
  • the length of the rigid tip (2a) and also the length of the flexible tip (2b) are very critical to maintain good oscillation properties and to avoid artifacts in the measurements due to the deformation of the flexible tip (2b). ) while approaching the point towards the surface. Therefore, these lengths were controlled by etching the tip electrochemically.
  • the device for this etching is shown in FIG. 9.
  • the tuning fork (1) is mounted on a Z-translator (19) to control the size of the tip (2) to be etched inside the electrochemical solution (20).
  • the counter-electrode (21) connects the electrochemical solution to a connector of a frequency generator (22).
  • the material of the counter-electrode (21) and the chemical composition of the electrochemical solution (20) depend on the material of the tip to be cut or etched.
  • Electrochemical CaCl 2 5g diluted in Millipore ultrapure water (30ml) with acetone (2ml).
  • a carbon counter electrode having a diameter of 4 mm and a length of 8 mm was used with an electrochemical solution of NaHCC> 3 diluted in Millipore ultrapure water (0.07 g / ml).
  • the other frequency generator connector is connected (23) to a platinum electrode (24) attached to the XYZ transducer (25) to make electrical contact with the end of the tuning fork tip (2) or the base of this tip (2) glued with the conductive epoxy on the branch of the tuning fork (1).
  • the waveform, the frequency, the amplitude and the duration of excitation of the electrical signal delivered by the frequency generator (22) makes it possible to control the fine etching or electrochemical cutting of the tip.
  • An ammeter in the circuit makes it possible to follow the etching process and to stop it in order to obtain a fine engraving, or to wait for a measured current of zero, which means that the tip is cut off.
  • a continuous sinusoidal waveform of 22 volts (peak-to-peak) with a frequency of 400 Hz was used.
  • bursts of 250 ms, spaced 750 ms, a 22-volt sine wave (peak-to-peak) with a frequency of 400 Hz were used (see Figure 10).
  • the end of the tip of the graphite probe has been selectively grafted with ⁇ - ⁇ (hydroxyl), ⁇ - ⁇ 3 ⁇ 4 (amino) or (p-CH 3 (methyl) groups, as illustrated in FIG. 12.
  • the grafting Direct protein on the tip tip can also be considered.
  • 1,4-phenylenediamine for example Sigma-Aldrich
  • 100 ml of 0.5M HCl 21.64 ml of 37% HCl in 500 ml of H 2 0.
  • the following product which can be used for approximately 2 hours at ambient temperature is obtained:
  • the functionalized surface was rinsed with acetone and ethanol, before being dried under nitrogen.
  • the surface to be functionalized i.e., the tip of the graphite tip
  • this bath is immersed for 15 minutes, then rinsed with acetone and ethanol and dried under nitrogen.
  • the surface of the functionalized apex is put, for 2 min, in a 15 ml bath of HC1 with 15 ml NaNC> 2 to diazoter the -N3 ⁇ 4 terminal again and replace it with a -N 2 + group .
  • a drop of Millipore ultrapure water is placed on the surface bearing -N 2 + groups and held for 60 min before rinsing the surface with ethanol and water. dry with nitrogen.
  • the -N 2 + group is replaced by a hydroxyl group making it possible to obtain a stable phenol.
  • the prepared protein solution is a solution of 25 mg of BSA (bovine serum albumin) in 4 ml of Millipore ultrapure water.
  • BSA bovine serum albumin
  • test surface is a freshly cleaved mica sample coated with gold and covered with diazonium salts to graft BSA. Functionalization of the gold-coated mica surface by the diazonium salt and BSA was verified by Fourier transform infrared spectroscopy or "FTIR spectroscopy".
  • Figure 14 illustrates three approach / withdrawal curves obtained under these conditions.
  • the amplitude and the phase signal are acquired simultaneously with, in thick lines, the curves of approach towards the surface and, in thin line, the curves of withdrawal, when the tip is withdrawn.
  • the decrease of the amplitude and the increase of the phase are synonymous with the fact that the tip comes into contact with the surface.
  • the approach and withdrawal curves for each case are very similar. This means that no chemical grafting occurs between the tip of the tip and the surface.
  • a clear signature of some specific molecular links between tip chemistry and surface biochemistry can be obtained by means of chemical force curves with a piezoelectric integrated sensor probe working in a saline environment necessary for study the biological material.
  • the graph of Figure 15D shows the curves obtained using a graphite tip whose end is non-functionalized and the same surface of gold-coated mica and functionalized with BSA. In the latter case, no specific chemical grafting appears on the withdrawal curves (the approach and withdrawal curves for each case are very similar) which demonstrates that chemical steepness curves with steep steps during tip removal are actually due to the presence of specific and controlled chemistry, both at the tip end and at the the surface of the sample.

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Abstract

La présente invention concerne une sonde de microscope à force atomique comprenant (i) un résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante et (ii) une pointe fixée sur ledit résonateur revêtu et fonctionnalisée par au moins un groupement ou une molécule d'intérêt. La présente invention concerne également son procédé de préparation et ses différentes utilisations.

Description

SONDE DE MICROSCOPE A FORCE ATOMIQUE,
SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET SES UTILISATIONS
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine des capteurs et, plus particulièrement, au domaine des sondes de microscope à force atomique (ou AFM pour « Atomic Force Microscope ») notamment utiles en biologie .
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une sonde d'AFM telle qu'une sonde à capteur intégré piézo-électrique et les méthodes de préparation de cette sonde pour l'analyse chimique fine de liens moléculaires par le biais de la spectroscopie de force chimique en milieu liquide et notamment en milieu liquide biologique.
Les applications directes de ce type de sonde couvrent typiquement le séquençage de 1 'ADN, le diagnostic personnalisé, l'ingénierie pharmacologique et les tests moléculaires dans le domaine nanotoxicologique .
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
L'utilisation de microleviers (ou
« cantilevers » en anglais) d'AFM standard, combinés à une détection par un levier optique externe impliquant un laser ou une photodiode, pour la spectroscopie de force chimique dans l'analyse de liaisons moléculaires a déjà été démontrée et mise en œuvre en routine (Janshoff et al., 2000, Angew. Chem. Int. Ed., vol 39, pages 3212-3237) .
Plusieurs brevets et demandes de brevet concernent la spectroscopie par force chimique utilisant une pointe d'AFM. Le brevet US 7,013,717 au nom de Veeco Instruments Inc. envisage de greffer un ADN simple-brin sur la pointe d'un cantilever d'AFM et l'ADN simple-brin complémentaire sur la surface sondée. La demande internationale WO 2007/087653 au nom de Universitât Linz propose une méthode pour détecter la 5-méthylcytosine impliquant des anticorps anti-5- méthylcytosine greffés sur la pointe d'un cantilever d'AFM.
De plus, certains systèmes commerciaux récents de spectroscopie par force chimique commencent à apparaître sur le marché comme la machine automatisée proposée par les compagnies nAmbition ou JPK.
En parallèle, l'utilisation de sondes d'AFM à capteur intégré piézo-électrique a déjà été démontrée par plusieurs équipes dans le monde.
En particulier, dans le brevet US 5,641,896, Karraï utilise, pour les applications en microscopie optique à champ proche (ou SNOM pour « scanning near- field optical microscopy ») , le retour de force fourni par la sonde piézo-électrique pour approcher une fibre optique collée sur la sonde à quelques dizaines de nanomètres de la surface. Le brevet US 6,240,771 décrit l'utilisation d'une telle sonde d'AFM à capteur intégré piézo-électrique avec une pointe métallique, bien acérée, collée à l'extrémité de la sonde pour scanner des cristaux avec une résolution atomique. Kaghesima et al. (2002, Applied Surface Science, vol. 188, pages 440-444) et Rensen et van Hulst (2000, Appl . Phys . Lett., vol. 77, pages 1557-1559) ont également démontré l'utilisation de cette sonde pour l'AFM en milieu liquide avec immersion totale de la sonde, respectivement dans une solution organique ou dans l'eau ultrapure. D'autres équipes ont utilisé la sonde piézo-électrique en-dehors du liquide, mais avec la pointe immergée dans un ménisque de liquide pour sonder la surface en-dessous (par exemple, Koopman et al., 2003, Appl. Phys. Lett., vol. 83, pages 5083-5085) .
Enfin, certains travaux ont illustré l'utilisation de ces sondes à capteur intégré piézo¬ électrique pour analyser les propriétés des liquides telles que viscosité et densité (Brevet US 6,393,895 au nom de Symyx Technologies Inc.) ou comme nez chimique permettant de détecter des molécules sélectivement greffées (Brevet US 6,393,895 et Demande de brevet US 2010/0068697 au nom de Drexel University) .
Les sondes à capteur intégré comme les capteurs piézo-électriques ont plusieurs avantages par rapport à un cantilever d'AFM standard car elles permettent de s'affranchir du système classique de détection optique de ces derniers. Elles sont plus faciles à intégrer et à utiliser dans des environnements extrêmes. Mais un point essentiel quant à leur utilisation dans des applications biologiques est la nécessité de pouvoir les plonger dans une solution biologique en gardant un bon comportement mécanique et électrique. Cette condition n'est pas évidente à satisfaire parce que les solutions salines utilisées en biologie comme HEPES, Tris ou PBS sont extrêmement conductrices en raison de la présence de nombreux ions dans le milieu aqueux. Ainsi, la sonde est inutilisable en tant que telle dans ces liquides en raison de problèmes inévitables de fuites électriques, de courts-circuits ou d'effets de corrosion sur les électrodes du capteur piézo¬ électrique .
Les inventeurs se sont donc fixés pour but de proposer un système comprenant une sonde d'AFM et notamment une sonde d'AFM à capteur intégré piézo¬ électrique utile pour l'analyse des liens moléculaires en spectroscopie de force chimique et ce, dans des solutions tampons notamment dans les solutions mises en œuvre dans le domaine de la biologie. La sonde d'AFM doit en outre conserver de bonnes propriétés mécaniques et électriques, présenter un bon facteur de qualité, lorsque cette dernière est utilisée dans les solutions tampons et être obtenue par un procédé simple de mise en œuvre. Pour rappel, le facteur de qualité est une description de l'amortissement d'un système oscillant. Il est donné par le rapport entre l'énergie transmise et l'énergie perdue. Dans le cas d'une sonde, le facteur de qualité représente l'énergie transmise dans la bande passante autour de la résonance par rapport à l'énergie contenue hors de la bande passante.
EXPOSÉ DE L' INVENTION
Les inventeurs ont résolu les problèmes techniques précités et atteint le but fixé. En effet, la présente invention concerne une sonde de microscope à force atomique comprenant : i) un résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante ; et
ii) une pointe fixée sur ledit résonateur revêtu et fonctionnalisée par au moins un groupement ou une molécule d'intérêt.
La sonde d'AFM selon la présente invention est une sonde à capteur intégré piézo-électrique. En effet, elle est basée sur un matériau piézo-électrique associé à deux électrodes. Avantageusement, le corps de la sonde d'AFM selon la présente invention est fait d'un seul matériau piézoélectrique. Les deux électrodes associées au matériau piézo-électrique permettent d'exciter le résonateur en appliquant une tension oscillante. Ces mêmes deux électrodes sont également utilisées pour analyser la réponse du résonateur piézo¬ électrique par un amplificateur de courant-tension convertissant le courant de déplacement en une tension. En d'autres termes, la sonde d'AFM selon la présente invention ne comprend que deux électrodes pour l'actuation et la détection du mouvement. La Figure 1A illustre le modèle électrique équivalent du résonateur piézo-électrique dans l'air. C_quartz est la capacité proportionnelle à la rigidité mécanique, L_quartz est l'inductance proportionnelle à la masse effective de la sonde et R_quartz est la résistance proportionnelle à l'amortissement de la sonde (à cause des pertes d'énergie) . C_stray_quartz est une capacité parasite formée par les deux électrodes autour du matériau piézo-électrique. Par conséquent, si l'une des trois propriétés mécaniques précédemment mentionnées, i.e. masse, raideur et amortissement, est modifiée par l'environnement externe de la sonde, cela entraîne une modification de la réponse électrique détectée par 1 ' amplificateur .
De plus, comme le résonateur mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est revêtu d'une couche isolante et est susceptible d'être utilisé dans une solution biologique. Le milieu liquide, mais aussi le revêtement modifient les propriétés mécaniques et donc les propriétés électriques du résonateur piézo¬ électrique comme illustré par le circuit de la Figure 1B.
Le résonateur piézo-électrique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est avantageusement en un matériau piézo-électrique qui a l'avantage d'être directement piézo-électrique. Ainsi, aucune étape de polarisation sous haute pression n' est nécessaire pour aligner les domaines et obtenir des propriétés piézo-électriques , une telle polarisation étant nécessaire, par exemple, pour des céramiques poly-cristallines piézo-électriques. De plus, le matériau piézo-électrique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention garde des propriétés piézo¬ électriques stables dans le temps. Ce matériau piézo- électrique est notamment choisi parmi le quartz, la topaze, la tourmaline, la berlinite, le nitrure d'aluminium, l'oxyde de zinc, le sulfure de cadmium, le titanate de plomb, le titano-zirconate de plomb, le niobate de lithium, le tantalate de lithium, le niobate de potassium, le langasite, l'arseniure de gallium, le niobate de baryum sodium, l'oxyde de bismuth germanium, l'arseniure d' indium, l' antimoniure, un polymère piézoélectrique tel que le polyfluorure de vinylidène (PVDF) et ses dérivés, ainsi que leurs mélanges.
Plus particulièrement, le résonateur piézo- électrique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est en quartz.
Les électrodes mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont avantageusement métalliques et notamment en un métal choisi parmi l'or, le nickel, l'aluminium, le cuivre, l'étain et l'argent.
Le résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut se présenter sous toutes les configurations et géométries notamment envisagées dans les sondes d'AFM. Plus particulièrement, le résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes se présente sous forme d'un diapason piézo-électrique (ou « Tuning fork » en anglais) avec une électrode disposée sur chacune des branches du diapason, ou dans une configuration d' interdigitation des électrodes disposées sur les deux branches du diapason.
La couche isolante utilisée pour revêtir le résonateur de la sonde selon la présente invention correspond à une couche de passivation nécessaire pour protéger les électrodes de cette sonde de tout contact avec un liquide. Elle est présente sur l'ensemble du résonateur et sur une partie des électrodes dont il est muni. En effet, les extrémités des électrodes non- passivées assurent un bon contact électrique du résonateur et notamment du diapason piézoélectrique vers un connecteur relié à la chaîne d'amplification en aval. La partie critique à isoler et protéger du milieu liquide biologique via le dépôt d'une couche isolante est le résonateur et notamment le diapason piézoélectrique en fonctionnement. Ce revêtement doit satisfaire plusieurs conditions qui sont :
être chimiquement et mécaniquement stable dans une solution saline,
présenter une barrière de résistance électrique large pour éviter les fuites de courant de moins de quelques pico-ampères (le courant de déplacement ou la sonde ont un ordre de magnitude de dizaines de pico-ampères),
- présenter une constante diélectrique faible par rapport à la fréquence pour éviter un fort effet de capacitance parasite (voir Figure 1B) avec la capacitance parasite ajoutée C_stray_coating due à la couche de revêtement,
- être conforme à la géométrie de la sonde où des angles aigus et singuliers peuvent être présents,
- être mince pour éviter de trop affecter les propriétés mécaniques de la sonde,
- être biocompatible et non-toxique.
Toute couche isolante répondant aux conditions précitées est utilisable pour revêtir le résonateur de la sonde selon l'invention.
Avantageusement, cette couche isolante peut être une peinture cathodique ou anodique électrophorétique commerciale notamment utilisée dans l'industrie automobile pour revêtir la structure de la voiture et la protéger contre la corrosion, mais aussi dans l'industrie alimentaire pour enrober la partie intérieure des conserves pour éviter tout contact du métal avec la nourriture. En outre, ce type de peinture a déjà été utilisé pour isoler la pointe d'un microscope à effet tunnel et d'un microscope électrochimique à balayage. A titre d'exemple d'une telle peinture, on peut citer la peinture électrophorétique GLASSOPHOR de BASF et la peinture électrophorétique CLEARCLAD de CLEARCLAD COATINGS Inc.
En variante, cette couche isolante peut être en un matériau choisi parmi le dioxyde de silicium, le parylène ou un autre dérivé du [ 2 , 2 ] paracyclophane, le polyimidine, l'oxyde d'aluminium, le nitrure d'aluminium, un polymère vinylique et un silane hydrophobe notamment un silane hydrophobe tel que défini dans la demande de brevet US 2010/0068697. Plus particulièrement, dans le cadre de la présente invention, la couche isolante est une couche en parylène .
La couche isolante, comme précédemment indiqué, doit être mince pour éviter de trop affecter les propriétés mécaniques de la sonde. Par conséquent, son épaisseur dépendra de la taille du résonateur piézo¬ électrique et notamment de la taille du diapason. Ainsi, la couche isolante mise en œuvre dans l'invention présente avantageusement une épaisseur constante ou sensiblement constante sur le résonateur piézo-électrique . Cette épaisseur est, typiquement, comprise entre 50 nm et 20 μπι, notamment entre 250 nm et 10 μπι et, en particulier, entre 750 nm et 5 μπι. Dans le cadre de la présente invention et de la microscopie à force atomique de façon générale, la pointe fixée et notamment collée sur le résonateur sonde la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Cette pointe se présente sous forme d'un fil, d'une fibre ou d'un nanotube. De plus, elle présente un apex défini comme la partie terminale de la pointe effilée ou du nanotube soumise à l'interaction via le groupement ou la molécule greffé (e) pour l'analyse des liens moléculaires en spectroscopie de force chimique.
La pointe mise en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend au moins un matériau choisi parmi le platine, le chrome, le chrome-or, le platine- iridium, le titane-platine, le nitrure de titane, le carbure de tungstène, le tungstène, le carbone ou un de leurs mélanges.
Avantageusement, la pointe selon l'invention peut être uniquement constituée d'un seul des matériaux précédemment listés. En fonction du matériau la constituant, la pointe pourra être plus ou moins souple, voire plus ou moins rigide. Elle peut notamment être en platine-iridium ou en platine.
En variante, la pointe selon l'invention peut présenter deux zones distinctes, chacune constituée d'un des matériaux précédemment listés.
En effet, les travaux des inventeurs ont montré que, lors de l'immersion dans une solution, une pointe trop souple sera distordue par l'interaction fluidique et électrostatique avec le liquide en évitant son contact avec la surface. La réduction de la longueur de cette pointe très flexible augmentera sa rigidité et donc, sa stabilité pour rester droite en cours du fonctionnement en milieu liquide. Mais fixer une telle pointe flexible avec une fonctionnalisation chimique spécifique, avec une longueur réduite pour augmenter suffisamment sa rigidité, directement au résonateur et notamment directement à une branche du diapason, ne sera pas compatible avec le fonctionnement de la pointe seule immergée dans une solution. Dans cette configuration, le corps du résonateur piézo-électrique est gardé à l'extérieur du liquide pour obtenir la sensibilité la plus élevée avec un facteur de qualité élevé. Les inventeurs ont donc proposé d'ajouter une pointe longue rigide entre le résonateur et notamment la branche du diapason et la pointe flexible avec une fonctionnalisation chimique spécifique qui sera en contact avec la surface. Dans cette variante, la pointe présente :
un 1er élément fixé et notamment collé au résonateur (partie rigide) et
un 2nd élément (partie souple) fixé et notamment collé au 1er élément et fonctionnalisé par un groupement ou une molécule d'intérêt.
De façon avantageuse, le 1er élément est un fil de platine/iridium et le 2nd un fil de platine, une fibre de graphite ou un nanotube de carbone. Ce 2nd élément constitue l'apex tel que précédemment défini.
Quelle que soit la variante envisagée, la pointe mise en œuvre dans le cadre de la présente invention présente une longueur totale comprise entre 2 μπι et 5 mm, notamment entre 3 μπι et 1 mm et, en particulier, entre 4 μπι et 100 μπι. Dans le cas de la variante d'une pointe avec deux éléments distincts, la longueur du 1er élément est comprise entre 2 μπι et 4 mm et, notamment, entre 3 μπι et 1 mm et la longueur du 2nd élément est comprise entre 400 nm et 50 μπι et, notamment, entre 800 nm et 10 μπι.
L'apex de la pointe de la sonde selon la présente invention est fonctionnalisé par au moins un groupement d'intérêt ou au moins une molécule d' intérêt .
Par « groupement d'intérêt » (ou « molécule d' intérêt ») , on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement (ou une molécule) susceptible d' interagir chimiquement avec un autre groupement ou une autre molécule éventuellement présent (e) au niveau d'une surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser par microscopie à force atomique. Cette interaction chimique peut faire intervenir une liaison covalente entre la molécule ou une liaison non covalente telle qu'une liaison hydrogène ou ionique .
Dans le cadre de la présente invention, le groupement d' intérêt peut être un groupement chimique simple ou complexe. Il est notamment choisi parmi -OH, -C(0)OH, -NH2, -CH3, -C(0)0", -NH3 +, -C(0)H, -N3, ou un alcène terminal.
Dans le cadre de la présente invention, la molécule d'intérêt est une molécule, naturelle ou synthétique, notamment biologique. Avantageusement, elle est choisie parmi les peptides, les oligopeptides, les protéines telles que les enzymes, les anticorps ou fragments d'anticorps, les récepteurs cellulaires ou membranaires , les polysaccharides , les cellules ou parties cellulaires telles que des organites ou des membranes cellulaires, les acides nucléiques tels qu'ADN et ARN, et les molécules naturelles ou synthétiques à visée thérapeutique.
La fonctionnalisation de la pointe par le groupement ou la molécule d'intérêt consiste à greffer, via au moins une liaison covalente, le groupement ou la molécule d'intérêt à la surface de l'apex de la pointe. Ce greffage peut être direct ou indirect. Avantageusement, la fonctionnalisation de la pointe par le groupement ou la molécule d' intérêt est indirecte et fait intervenir un bras de liaison lié de façon covalente, d'une part, à la pointe et notamment à la surface de l'apex de la pointe et, d'autre part, au groupement ou à la molécule d'intérêt.
Tout bras de liaison communément utilisé en chimie est utilisable dans le cadre de la présente invention. Toutefois, le bras de liaison mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend, de façon avantageuse, un groupement (hétéro ) arylène . Le bras de liaison peut ne comprendre qu'un groupement (hétéro ) arylène . En variante, le bras de liaison peut correspondre à un groupement (hétéro ) arylène lié à un autre groupement du type chaîne moléculaire mobile tel qu'un groupement polyéthylène glycol (PEG) . Cette variante permet de conférer, au groupement ou à la molécule d'intérêt, un degré de liberté plus grand par rapport au même groupement ou à la même molécule directement lié(e) au groupement (hétéro ) arylène . Cette augmentation du degré de liberté favorise de fait les éventuelles interactions avec la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser.
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe arylène », une structure hydrocarbonée aromatique constituée d'un (ou plusieurs) cycle (s) aromatique ( s ) comportant chacun de 3 à 10 atomes de carbone, notamment de 3 à 8 atomes de carbone et, en particulier, 6 atomes de carbone.
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe hétéroarylène », une structure hydrocarbonée hétéroaromatique constituée d'un (ou plusieurs) cycle (s) hétéroaromatique ( s ) comportant chacun de 3 à 10 atomes de carbone, notamment de 3 à 8 atomes de carbone et, en particulier, 6 atomes de carbone, le (ou les) hétéroatome ( s ) pouvant être N, 0, P, Si ou S et notamment N, 0 ou S . Les hétéroatomes peuvent en particulier interrompre un cycle aromatique et/ou séparer deux cycles aromatiques d'un groupement arylène .
La présente invention concerne également un procédé pour préparer une sonde de microscope à force atomique telle que précédemment décrite. Le procédé selon l'invention comprend les étapes consistant à :
a) déposer sur un résonateur muni de deux électrodes une couche isolante moyennant quoi un résonateur est obtenu ; b) fixer, sur le résonateur muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante obtenu à l'étape (a), une pointe ;
c) éventuellement couper et/ou graver la pointe fixée lors de l'étape (b) ;
d) fonctionnaliser la pointe fixée et affinée lors des étapes (b) et (c) par un groupement ou une molécule d'intérêt. L'étape (a) du procédé selon l'invention consiste à déposer une couche mince isolante telle que précédemment définie sur la surface du résonateur. Ce dépôt peut être effectué par toute technique permettant d'obtenir une couche mince. Avantageusement, ledit dépôt est effectué par immersion (« dip coating ») , par vaporisation (« spray coating») , par centrifugation (« spin coating ») , par dépôt physique pyrolytique ou électrochimiquement .
Plus particulièrement, le dépôt lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention est un dépôt physique pyrolytique ou un électrodépôt. La Figure 3 et la partie expérimentale ci-après décrivent un système utilisé pour la forme de mise en œuvre impliquant un électrodépôt. L'homme du métier saura, en fonction de la nature et de la composition de la couche isolante à produire, le bain électrophorétique et le mode opératoire les mieux adaptés. La partie expérimentale ci-après présente également un protocole impliquant un dépôt physique pyrolytique de monomères, la couche isolante correspondant, dans ce cas, au polymère obtenu . Il convient de remarquer que les méthodes de passivation connues pour des matériaux conducteurs intrinsèques et de géométrie simple peuvent être plus difficiles à appliquer lorsque le résonateur piézo- électrique se présente sous forme d'un diapason. En effet, la passivation peut altérer les propriétés mécaniques, via notamment un effet de ménisque, de ce système pourvu d' électrodes et à géométrie plus complexe .
Des résultats obtenus pour des résonateurs de type diapason piézoélectrique et décrits dans la partie expérimentale, il apparaît que :
- lorsque la couche isolante est une peinture électrophorétique, cette dernière est, de préférence, électrodéposée en mettant en œuvre une rampe de tension de 0 V à une tension comprise entre 5 V et 50 V, notamment entre 10 V et 25 V et, en particulier, de l'ordre de 17 V (i.e. 17 V ± 2 V) et ce, en un temps compris entre 1 min et 20 min, notamment entre 2 min et 10 min et, en particulier, de l'ordre de 5 min (i.e. 5 min ± 2 min) . Un tel procédé permet d'obtenir un dépôt conforme sur le diapason sans fuite de courant, sans perte de sensibilité et sans altération des propriétés mécaniques.
- la passivation avec le parylène connue pour des systèmes de forme simple du type poutre ou disque et impliquant un dépôt physique pyrolytique de monomères n'a jamais été décrite sur des systèmes de résonateur piézo-électrique à géométrie complexe de type diapason, et, de fait, les résultats améliorés obtenus avec une telle couche isolante sur des diapasons n'ont jamais été décrits ou suggérés.
L'étape (a) peut être répétée plusieurs fois et notamment au moins deux, trois ou quatre fois jusqu'à ce qu'une couche isolante présentant une épaisseur satisfaisante soit obtenue.
De même, l'étape (a) peut comprendre une étape de recuit de la couche isolante, notamment lorsque la couche isolante est une peinture électrophorétique, une fois cette dernière déposée. Cette étape de recuit est effectuée, avantageusement, entre 80°C et 180°C et notamment entre 110°C et 160°C pendant 5 min à 60 min.
Plusieurs travaux ont décrit différentes méthodes de fixation d'une pointe à l'extrémité d'un résonateur piézo-électrique (Brevet US 5,641,896 et Giessibl, 2003, Rev. Mod. Phys . , vol. 75, pages 949- 983), ces dernières peuvent être utilisées lors de l'étape (b) du procédé.
Avantageusement, la pointe est fixée sur le résonateur au moyen d'une colle conductrice comme la colle époxy conductrice et notamment la colle Epotek H21D. Dans la variante précédemment décrite où la pointe est constituée de deux éléments distincts, une colle conductrice, identique ou différente, est utilisée pour coller le 1er élément au résonateur, d'une part, et le 2nd élément au 1er élément, d'autre part.
La pointe est collée de façon à être perpendiculaire à la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Pour cette raison, elle doit être collée à un certain angle sur le résonateur et notamment sur la branche du diapason, cet angle étant fonction de la configuration géométrique du support de sonde du microscope à force atomique utilisé par la suite.
La longueur de la pointe, qu'elle comprenne un ou deux éléments, est critique pour effectuer des mesures précises et sans artefact. En particulier, dans le cas d'une pointe à deux éléments, la longueur du 1er élément (partie rigide) et aussi la longueur du 2nd (partie souple ou flexible) sont très critiques pour conserver de bonnes propriétés d'oscillation et pour éviter des artefacts dans les mesures à cause de la déformation de la pointe souple pendant l'approche de la pointe vers la surface. Par conséquent, il peut être nécessaire de couper et/ou de graver la pointe de la sonde ou les différents éléments la constituant. Dans ce cas, l'étape (c) n'est pas optionnelle.
L'étape (c) consiste plus particulièrement en une étape de gravure électrochimique de la pointe comprenant un ou deux élément (s) .
La gravure électrochimique est un procédé bien connu dans le domaine des STM pour préparer des pointes acérées dont le rayon présente quelques nanomètres, nécessaires pour obtenir des images à haute résolution latérale. Une coupe électrochimique de la pointe (de quelques millimètres à plusieurs dizaines de micromètres de long) , mais aussi une fine gravure de l'apex (en-dessous de 100 nm) de la pointe fixée sur le résonateur peut être obtenue. La géométrie proposée par Fotino (1993, Rev. Sci . Instruit!., vol. 64, pages 159- 167) pour graver des pointes en tungstène, permet une gravure plus efficace en utilisant la force de cisaillement du flot de bulles produit pendant la réaction de gravure.
La partie expérimentale ci-après propose des protocoles quant à la gravure chimique à mettre en œuvre pour des pointes en platine/iridium et/ou en platine. Sur la base de cet enseignement et sur la base des connaissances de l'état de la technique, l'homme du métier saura déterminer les conditions opératoires optimales pour la gravure chimique à mettre en œuvre lors de l'étape (c) du procédé en fonction de la nature de la pointe de la sonde. Le protocole chimique pour fonctionnaliser la pointe de la sonde avec un groupement ou une molécule d'intérêt, lors de l'étape (d) du procédé peut consister en tout protocole permettant de greffer, de façon covalente et de façon directe ou indirecte, un tel groupement ou une telle molécule au niveau la surface de la pointe de la sonde.
Avantageusement, ce protocole met en œuvre les procédés décrits dans les demandes internationales WO 2008/078052 et WO 2009/121944 au nom du CEA. Ces demandes décrivent le greffage de molécules issues de sels d' aryle clivable et notamment de sels d' aryle diazonium par mise en œuvre de conditions non électrochimiques.
Plus particulièrement, l'étape (d) du procédé selon l'invention met en œuvre au moins un élément choisi parmi un sel d' aryle diazonium portant un groupement d'intérêt ou un précurseur d'un tel groupement, un sel d' aryle diazonium portant une molécule d'intérêt ou un précurseur d'une telle molécule, un sel d' aryle diazonium portant une fonction aminé ou un précurseur de tels sels d' aryle diazonium.
Par « précurseur », on entend, dans le cadre de la présente invention, une entité séparée du groupement d'intérêt, de la molécule d'intérêt ou du sel d' aryle diazonium par une étape opératoire unique et aisée à mettre en œuvre. Les précurseurs peuvent présenter une stabilité plus importante que le groupement d'intérêt, la molécule d' intérêt ou le sel d' aryle diazonium dans les mêmes conditions environnementales. Par exemple, les arylamines sont des précurseurs des sels d' aryle diazonium. En effet, par simple réaction d'oxydation, par exemple, avec NaN02 dans un milieu aqueux acide, ou avec NOBF4 en milieu organique, il est possible de former les sels d' aryle diazonium correspondants. De même, un sel d' aryle diazonium portant un groupement -N¾ peut être utilisé pour fonctionnaliser la pointe avec un groupement -OH comme montré au point 111.2(C) ci-après .
De même, un sel d' aryle diazonium portant un groupement -N¾ peut être greffé sur la pointe de la sonde puis être rediazotiser de façon à réagir avec une molécule d' intérêt ou avec une molécule portant un groupement d'intérêt. La molécule d'intérêt et la molécule portant un groupement d' intérêt dans le cadre de la présente invention correspondent à la molécule d'intérêt de la demande internationale WO 2009/121944. L'exemple du point 111.2(D) illustre cette forme de mise en œuvre particulière.
L'homme du métier trouvera des informations quant aux protocoles opératoires et notamment quant aux conditions non électrochimiques à mettre en œuvre dans les demandes internationales WO 2008/078052 et WO 2009/121944 et autres enseignements découlant des procédés décrits dans ces dernières. La présente invention concerne également l'utilisation d'une sonde telle que précédemment définie ou susceptible d'être préparée par un procédé tel que précédemment défini en microscopie à force atomique et notamment pour la spectroscopie de force chimique en solution biologique et pour l'imagerie AFM en solution biologique. Plus particulièrement, ces sondes sont utilisées en mode dynamique à une fréquence d'excitation proche ou égale à leur fréquence de résonance. En variante, ces sondes sont utilisées en mode dynamique hors résonance à une fréquence d' excitation éloignée de leur fréquence de résonance ou à une fréquence correspondant à un harmonique différent de leur fréquence fondamentale de résonance.
Il convient de remarquer que, jusqu'à présent, aucun résonateur piézo-électrique de type diapason piézo-électrique n'a été utilisé avec une pointe fonctionnalisée et/ou en biologie, de même l'utilisation de ce système pour la spectroscopie de force chimique n'a jamais été décrite, voire envisagée. A l'heure actuelle, les trois principales méthodes pour conduire les sondes dynamiques en AFM sont (1) l'AFM-Modulation de fréquence (ou FM-AFM pour « Frequency Modulation-AFM ») également appelé « Non contact-AFM », (2) l'AFM-Modulation d'Amplitude (ou AM- AFM pour « Amplitude Modulation-AFM) , également appelé « Tapping AFM » et (3) 1 ' AFM-Mode Phase (ou PM-AFM pour « Phase Mode-AFM ») . Selon la méthode utilisée, les différentes variables de sortie dynamiques changeantes (changement de fréquence, amplitude, changement de phase) acquises au cours de 1 'AFM peuvent être converties en valeurs de force d'interaction entre l'extrémité de la pointe et la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser.
Dans le cadre de la présente invention, la sonde est avantageusement utilisée en mode AM-AFM. Dans ce dernier, les signaux acquis en sortie par spectroscopie approche/retrait sont l'amplitude d'oscillation et le déphasage par rapport à la distance relative pointe-surface. Ces deux informations (amplitude et phase par rapport à la distance) peuvent alors être utilisées pour récupérer les forces d'interaction chimiques entre la pointe et la surface en utilisant le formalisme proposé ailleurs (Sader et al., 2004, Appl . Phys . Lett., vol. 84, pages 1801- 18003 ; Katan et al., 2009, Nanotechnology, vol. 20, page 165703 ; Uchihashi et al., 2004, Appl. Phys. Lett., vol. 85, pages 3575-3577) .
L'interaction chimique entre la surface à analyser et la pointe fixée à l'extrémité du résonateur et notamment à l'extrémité d'une des branches du diapason piézo-électrique va modifier les propriétés de résonance du résonateur piézo-électrique. En d'autres termes, les modifications détectées des propriétés de résonance de la sonde piézo-électrique sont directement liées à l'information chimique des liaisons chimiques entre l'extrémité de la pointe et la surface comme le montre la Figure 2. Dans cette schématisation, la sonde comprend un diapason piézo-électrique (1), présentant une pointe (2) fonctionnalisée par un groupement ou une molécule d'intérêt (3) . Elle est mise en contact avec un substrat solide (6) sur lequel est greffé un récepteur (5), permettant ainsi d'apprécier les interactions chimiques (4) entre ce récepteur et le groupement ou la molécule d'intérêt.
L'analyse finale des liaisons chimiques utilise plusieurs courbes de force chimique acquises avec la sonde pour des taux de charge différents (ou vitesse d'approche-retrait) pour obtenir un diagramme de Bell- Evans . Ce schéma Bell-Evans, décrit par Muller et Dufrêne, 2008 (Nature Nanotechnology, vol. 3, pages 261-269 et Muller et al., 2009, Nature Chem. Biol., vol. 5, pages 383-390) permet d'obtenir les informations chimiques quantitatives et qualitatives sur le paysage énergétique des liens chimiques. Le taux de dissociation kQ f f , les barrières de potentiel (enthalpies libres), les distances de transition peuvent être directement obtenus contre le taux de charge, mais aussi contre la température ou le pH de la solution .
II est ainsi possible d'observer s'il y a un phénomène d'attraction, de répulsion ou d'harponnage entre le groupement ou la molécule d' intérêt fonctionnalisant la pointe de la sonde et la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser.
Par conséquent, la présente invention trouve des applications dans le domaine du diagnostic, du séquençage de l'ADN par détection de l'hybridation entre brins d'ADN ou d'ARN complémentaires entre un brin cible fixé sur la pointe de la sonde selon la présente invention et un brin en solution ou fixé sur une surface et/ou de la détection de composés à intérêt thérapeutique du type sucres, protéines, anticorps ou oligopeptides .
En effet, on peut envisager de greffer, sur une surface telle qu'une surface d'un support solide en silicium, en verre, en métal, en polymère ou en plastique, un récepteur membranaire notamment impliqué dans un état pathologique. Le greffage peut mettre en œuvre un procédé tel que décrit dans les demandes internationales WO 2008/078052 et WO 2009/121944. Le récepteur ainsi greffé est maintenu dans un milieu biologique ou un tampon adapté notamment pour qu' il se présente dans une configuration native. La sonde selon l'invention est fonctionnalisée par une molécule synthétique ou naturelle dont on souhaite connaître un éventuel potentiel dans le traitement de l'état pathologique. La présente invention permettra de savoir s'il existe un phénomène d'attraction, de répulsion ou d'harponnage entre cette molécule et le récepteur greffé .
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à la lecture des exemples ci-après donnés à titre illustratif et non limitatif et faisant référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 présente les circuits électriques, équivalents aux circuits de Butterworth-Van Dyke, d'un quartz : dans le vide ou dans l'air (Figure 1A) , avec un revêtement et immergé dans un liquide (Figure 1B) .
La Figure 2 est une schématisation de la sonde à capteur piézo-électrique intégré pour déterminer les interactions chimiques au niveau moléculaire.
La Figure 3 illustre le dispositif pour effectuer le dépôt électrolytique pour obtenir un résonateur revêtu par une couche isolante.
La Figure 4 présente une photographie du diapason obtenue lors d'un dépôt électrochimique de la peinture électrophorétique soit sans optimisation des paramètres de tension (pas de rampe de tension, la tension appliquée directement) (Figure 4A) soit en appliquant une rampe lente de tension (Figure 4B) .
La Figure 5 présente la rampe de tension (13) via le générateur de tension de rampe afin d'optimiser la couche de peinture électrophorétique (Figure 5A) , avec le suivi simultané du courant pendant 1 ' électrodéposition au cours de la première électrodéposition (14) et au cours de la seconde électrodéposition (15) (Figure 5B) .
La Figure 6 présente les courbes de résonance d'amplitude dans trois configurations différentes de la conduite obtenues pour un même diapason revêtu de la peinture électrophorétique : dans l'air, avec la seule pointe immergée dans la solution et avec la sonde entière immergée dans la solution.
La Figure 7 présente l'amplitude (traits fins) et la phase (traits épais) d'un même type de diapason mais revêtu par une couche de parylène : dans l'air (Figure 7A) et la sonde entière immergée dans une solution (Figure 7B) .
La Figure 8 présente une vue détaillée de l'arrangement de la pointe portée par le diapason.
La Figure 9 est une schématisation de la configuration utilisée pour effectuer la coupe électrochimique mais aussi la gravure fine de l'apex de la pointe fixée sur une branche du diapason piézo¬ électrique .
La Figure 10 présente l'image au microscope optique d'une pointe de platine/iridium d'un diamètre de 50 μπι après la gravure d'un fin apex (rayon de l'extrémité de la pointe inférieur à 100 nm) .
La Figure 11 présente les images au microscope optique d'une pointe de graphite d'un diamètre de 10 μπι avant (Figure 11A) et après (Figure 11B) la gravure d'un fin apex (rayon de l'extrémité de la pointe inférieur à 1 μπι) .
La Figure 12 présente différentes fonctionnalisations chimiques de l'extrémité de la pointe présentée sous forme d'un triangle, basées sur la chimie du sel de diazonium.
La Figure 13 présente la fonctionnalisation chimique par de la BSA d'une surface basée sur la chimie du sel de diazonium. La Figure 14 présente trois courbes d'approche- retrait effectuées sur une surface de mica, revêtue d'or, propre sans chimie, avec des pointes dont l'extrémité est fonctionnalisée par φ-Ν¾ (Figure 14A) , (p-CH3 (Figure 14B) et φ-ΟΗ (Figure 14C) . Aucun produit chimique spécifique du greffage n'apparaît.
La Figure 15 présente trois courbes d'approche- retrait effectuées sur une surface de mica, revêtue d'or et fonctionnalisée par de la BSA, avec des pointes dont l'extrémité est fonctionnalisée par φ-Ν¾ (Figure 15A) , (p-CH3 (Figure 15B) et φ-ΟΗ (Figure 15C) . Une signature de greffage chimique spécifique apparaît clairement sur les courbes de retrait. Le graphe de la Figure 15D présente une pointe dont l'extrémité est non fonctionnalisée utilisée pour sonder la surface de mica, revêtue d'or et fonctionnalisée par de la BSA.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I . Diapason piézo-électrique .
La sonde piézo-électrique utilisée est un résonateur piézo-électrique en quartz à deux électrodes en métal obtenues par dépôt physique (pulvérisation ou évaporation d'une cible métallique) d'une couche d'accrochage en chrome ou titane (épaisseur de l'ordre de 50 nm) suivi d'un deuxième dépôt de nickel ou d'or (épaisseur de l'ordre de 400 nm) se présentant sous forme d'un diapason accessible dans le commerce (par exemple CITIZEN AMERICA CFS206) . II . Revêtement isolant.
II.1. Revêtement de peinture électrophorétique . Après un bain à ultrasons du résonateur en quartz dans de l'éthanol et de l'acétone, la sonde en quartz est revêtue dans un bain de GLASSOPHOR de BASF, peinture cathodique électrophorétique, suivie d'un rinçage à l'eau ultrapure Millipore et enfin un recuit.
Le dispositif de la Figure 3 comprend un diapason piézo-électrique (1) et ses deux électrodes connectées ensemble (7) à un ampèremètre (8) . La masse (9) est reliée à l'autre connecteur de l'ampèremètre avec l'électrode négative du générateur de rampe de tension (10) . L'électrode positive du générateur de rampe de tension (10) est reliée à la contre-électrode en platine (11) du bain d ' électrodéposition (12) contenant le mélange de peinture électrophorétique cathodique diluée dans de l'eau ultrapure. L'utilisation d'une peinture électrophorétique anodique est possible et implique d'inverser les polarités du générateur de tension de la rampe.
La difficulté demeure pour le diapason standard en raison des effets du ménisque entre les branches comme le montre la Figure 4A. Mais après plusieurs essais faisant varier la dilution de la peinture dans le bain (40% dans l'eau ultrapure Millipore) et la température de recuit (140°C pendant 15 min), une fine couche homogène, sans effet de ménisque et sans bulles piégées dans la peinture durcie, est obtenue de façon reproductible comme illustré sur la Figure 4B.
En outre, la vitesse de rampe de tension est essentielle pour contrôler l'épaisseur et l'uniformité de la couche de polymère électrodéposé de peinture électrophorétique (voir Figure 5) . Une rampe de 0 V à 17 V en 300 sec a été trouvée optimale (Figure 5A) . L'opération de revêtement électrophorétique (électrodéposition dans un bain + recuit) doit être répétée 2 ou 3 fois afin d'obtenir un revêtement isolant efficace avec une épaisseur de 3 μπι. Au cours de la première électrodéposition dans le bain, un contrôle du courant permet de déterminer une phase en plateau au cours de la rampe où le dépôt de la couche est fini (courant I est égal à environ 300 μΑ) , suivie d'une diminution du courant à zéro indiquant la fin du processus (voir Figure 5B) .
L'isolation du revêtement a été testée directement en étudiant le diapason revêtu dans une solution tampon (pH = 8,2 ; Tris = 10 mM, NaCl = 10 mM, MgCl2 = 10 mM) en réalisant des courbes de résonance, d'une part, pour montrer que l'excitation et la détection du signal provenant de la sonde est possible sans problème de fuites de courant entre les électrodes et la solution conductrice, et, d'autre part, pour tester l'influence de l'environnement liquide sur les performances mécaniques de la sonde.
Ainsi, la sonde a été testée, tout d'abord, complètement immergée dans une goutte de solution tampon, puis, avec seule la pointe collée à l'extrémité d'une des branches du diapason immergée dans la solution tampon. La pointe est un fil de Platine/ Iridium, de diamètre 50 μπι et environ 4 mm de long, collé avec de la colle époxy sur une branche du diapason enduit de peinture électrophorétique. Trois configurations que sont le diapason dans l'air, le diapason tout entier dans la solution tampon et seule la pointe du diapason dans la même solution tampon ont été étudiées. Comme le montre la Figure 6, les courbes de résonance obtenues présentent un décalage de la fréquence de résonance vers les basses fréquences lorsque la pointe ou la sonde complète ont été immergées dans la solution tampon (fO = 31 '630 Hz dans l'air, fO = 31 '595 Hz avec seulement la pointe dans la solution, fO = 31 '146.8 Hz avec la sonde toute entière immergée dans la solution) . Dans le même temps, les effets hydrodynamiques du liquide (Maali et al., 2005, J. Appl. Phys., vol. 97, pages 074907.1-074907.6) augmentent la dissipation d'énergie diminuant le facteur de qualité de la sonde (Q = 2000 dans l'air, Q = 1300 avec seulement la pointe dans une solution, Q = 60 avec la sonde toute entière immergée dans la solution) .
Cela signifie que la sensibilité de la détection de force, dépendant du rapport entre le facteur de qualité sur la constante de raideur du résonateur, sera la meilleure avec seulement la pointe immergée dans la solution, en gardant le corps du résonateur piézo-électrique revêtu d'une peinture électrophorétique en-dehors du liquide.
II.2. Revêtement de parylène.
La méthode est plus rapide que la précédente pour obtenir un revêtement conforme des sondes. Il s'agit d'un procédé en une étape. Le dépôt parylène permettant le revêtement de passivation est un dépôt physique pyrolytique de monomères, avec l'échantillon à revêtir à température ambiante. Ce procédé par pyrolyse est connu de l'Homme du métier et on peut se reporter par exemple sur le protocole de E. L. Heintz et al., 2001, IEEE-NANO 2001. Proceedings of the 2001 lst IEEE Conférence on Nanotechnology, pp. 346-351 (2001) .
Le parylène est bien connu pour être hydrophobe et biocompatible, et très utilisé pour revêtir des outils de chirurgie. Il existe plusieurs types de parylène. Les plus efficaces pour un dépôt passivant sont le parylène N ( [ 2 , 2 ] paracyclophane ) et le parylène C (Dichloro [ 2 , 2 ] paracyclophane ) . Le diapason piézo¬ électrique a été revêtu dans le vide à température ambiante, après avoir été rincé à l'éthanol et l'acétone. L'épaisseur du parylène a été caractérisée à 545 nm et est conforme à la forme du résonateur. Le parylène N a été utilisé dans ce cas.
Encore une fois, comme présenté sur la Figure 7, les courbes d'amplitude et de résonance de phase ont été effectuées dans l'air (Figure 7A) et après une immersion complète du même diapason dans la solution tampon (Figure 7B) .
La plus mince couche de parylène comparée à la couche de peinture électrophorétique permet de garder un facteur de qualité plus élevé et une fréquence de résonance plus élevée dans l'air mais aussi dans le liquide pour le diapason (fO = 32'724 Hz, Q = 10'131 dans l'air et fO = 31'223 Hz, Q = 109 la sonde entière immergée dans la solution) . Cela signifie que la sensibilité de la détection de force, dépendant du rapport du facteur de qualité sur la constante du ressort du résonateur, sera meilleure avec une couche mince de parylène.
III . Fabrication et fonctionnalisation chimique de la pointe.
III.1. Fabrication de la pointe sur le résonateur piézo-électrique .
Comme présenté Figure 8, le corps du diapason (1) détient, sur une de ses branches, une pointe rigide (2a) en platine/iridium, maintenue avec un point de colle époxy conductrice (16), comme la colle Epotek H21D. Un point de colle (17) est également ajouté à la branche opposée de façon à conserver la symétrie de masse pendant l'oscillation et donc à maintenir un facteur de qualité élevé.
Le mode de vibration du diapason et la relation entre la symétrie de masse des branches avec le facteur de qualité sont expliqués en détail dans l'article de Ng et al. (2009, Ultramicroscopy, vol. 109, pages 291- 295) . À la fin de la pointe rigide (2a) , l'extrémité de la pointe utilisée pour la fonctionnalisation chimique (2b) est également fixée à l'extrémité de la pointe rigide (2a) avec un point de colle époxy conductrice (18) .
La longueur de la pointe rigide (2a) et aussi la longueur de la pointe flexible (2b) sont très critiques pour conserver de bonnes propriétés d'oscillation et pour éviter des artefacts dans les mesures à cause de la déformation de la pointe souple (2b) pendant l'approche de la pointe vers la surface. Par conséquent, ces longueurs ont été contrôlées en gravant électrochimiquement la pointe.
Le dispositif pour cette gravure est présentée Figure 9. Le diapason (1) est monté sur un traducteur Z (19) pour contrôler la taille de la pointe (2) à graver à l'intérieur de la solution électrochimique (20) . La contre-électrode (21) relie la solution électrochimique à un connecteur d'un générateur de fréquence (22) . Le matériau de la contre-électrode (21) et la composition chimique de la solution électrochimique (20) dépendent du matériau de la pointe à couper ou à graver.
Pour graver et couper la pointe d'un fil en platine/iridium présentant un diamètre de 50 μπι, fixé à un diapason, une contre-électrode en platine présentant un diamètre de 500 μπι et une longueur de 8 mm a été utilisée avec une solution électrochimique de CaCl2 (5 g) diluée dans l'eau ultrapure Millipore (30 ml) avec de l'acétone (2 ml) .
Pour graver et couper un fil de graphite de 10 μπι de diamètre, fixé sur la pointe rigide de platine/iridium, une contre-électrode en carbone présentant un diamètre de 4 mm et une longueur de 8 mm a été utilisée avec une solution électrochimique de NaHCC>3 dilué dans l'eau ultrapure Millipore (0,07 g/ml) . Ensuite, l'autre connecteur du générateur de fréquence est connecté (23) à une électrode de platine (24) fixée au traducteur XYZ (25) afin de faire le contact électrique avec l'extrémité de la pointe du diapason (2) ou à la base de cette pointe (2) collée avec de 1 ' époxy conductrice sur la branche du diapason (1) . Ainsi, la forme d'onde, la fréquence, l'amplitude et la durée d'excitation du signal électrique délivré par le générateur de fréquence (22) permettent de contrôler la gravure fine ou la coupe électrochimique de la pointe. Un ampèremètre dans le circuit permet de suivre le processus de gravure et de l'arrêter afin d'obtenir une gravure fine, ou d'attendre un courant mesuré de zéro ce qui signifie que la pointe est coupée .
Par exemple, pour couper la pointe d'un fil de platine/iridium, une forme d'onde sinusoïdale continue de 22 volts (crête à crête) avec une fréquence de 400 Hz a été utilisée. Pour graver l'apex de la pointe fine de platine/iridium, des salves de 250 ms, espacées de 750 ms, d'une onde sinusoïdale de 22 volts (crête à crête) avec une fréquence de 400 Hz ont été utilisées (voir Figure 10) .
Pour couper la pointe de graphite, une forme d'onde sinusoïdale continue de 16 volts (crête à crête) avec une fréquence de 46 Hz a été utilisée. Pour graver l'apex de la pointe fine de graphite, des salves de 250 ms, espacées de 750 ms, d'une onde sinusoïdale de 8 volts (crête à crête) avec une fréquence de 46 Hz ont été utilisées (voir Figure 11) . III.2. Fonctionnalisation chimique de la pointe de la sonde.
Ainsi, l'extrémité de la pointe de la sonde en graphite a été sélectivement greffée par des groupements φ-ΟΗ (hydroxyles ) , φ-Ν¾ (aminés) ou (p-CH3 (méthyle), comme illustré sur la Figure 12. Le greffage direct de protéines sur l'extrémité de la pointe peut également être envisagé.
A. Fonctionnalisation par φ-ΝΗ2
Solution n°l (100 ml d' aminé à 0,1 M) :
1,8107 g de 1 , 4-phénylènediamine (par exemple de Sigma-Aldrich) sont dissous dans 100 ml de HC1 à 0,5 M (21,64 ml de HC1 à 37% dans 500 ml de H20) . Le produit suivant utilisable pendant environ 2 heures à température ambiante est obtenu :
Ct-NH3 *^^--- NH3-C|-
Solution n°2 (100 ml de HN02 à 0,1 M) : 0, 69 g de nitrite de sodium NaN02 (par exemple de Fluka) est dissous dans 100 ml d'eau ultrapure Millipore pour réaliser la réaction chimique suivante :
NaN02 + ¾0 → HN02 + NaOH
Mélange des solutions n°2 et n°l :
Un barreau magnétique est placé dans le bain de réaction. Puis, 10 ml de la solution n°2 sont mis goutte à goutte dans 10 ml de solution n°l, c'est la première diazotisation telle que :
HN02 + NH2-cp-H3 +NCl~ → 2 H20 + NH2-cp-N2 +Cl~ L'agitation est maintenue pendant 5 min, le bain de réaction prenant alors une couleur brun-orange avec de la mousse à la surface. Puis, 1,5 g de poudre de fer est ensuite ajouté en tant que réducteur permettant ainsi :
H3 +N-cp-N2 + + Fe + 3 H+ → Η3 +Ν-φ· + Fe2+ + N2 Le mélange est ensuite chauffé à 40°C pendant une durée At pour polymériser une couche de plusieurs sels de diazonium avec une terminaison -N¾ sur la surface immergée dans le bain et à fonctionnaliser. L'épaisseur et ainsi la densité du φ-Ν¾ greffé peuvent être contrôlées en ajustant le At . Un At de 15 min a été utilisé pour la fonctionnalisation de l'apex de la pointe en graphite.
Enfin, la surface fonctionnalisée a été rincée avec de l'acétone et de l'éthanol, avant d'être séchée sous l'azote.
B. Fonctionnalisation par φ-ΟΗβ
0, 294 g d'un hémi(sel de chlorure de zinc) de p-diazo-N, N-diéthyl-m-toluidine (formule ci-dessous) est dilué dans 20 ml d'eau ultrapure Millipore :
HgC^
La solution est remuée pendant 30 min, avant l'ajout de 1,5 g de poudre de fer dans le bain.
La surface à fonctionnaliser (i.e. l'extrémité de la pointe en graphite) dans ce bain est immergée pendant 15 min, avant d'être rincée avec de l'acétone et de l'éthanol et séchée sous l'azote.
C. Fonctionnalisation par φ-ΟΗ
Le protocole suivi est identique à celui pour la fonctionnalisation par φ-Ν¾ .
La surface de l'apex fonctionnalisée est mise, pendant 2 min, dans un bain de 15 ml de HC1 avec 15 ml de NaNC>2 pour diazoter à nouveau le -N¾ terminal et le remplacer par un groupement -N2 +.
Tout de suite après, dans un endroit protégé de la lumière, une goutte d'eau ultrapure Millipore est placée sur la surface portant des groupements -N2 + et maintenue pendant 60 min avant de rincer la surface avec de l'éthanol et de la sécher avec de l'azote. Ainsi, le groupement -N2 + est remplacé par un groupement d' hydroxyle permettant d'obtenir un phénol stable.
D. Fonctionnalisation d'un mica doré par φ- protéine (BSA)
Un mica préalablement doré par pulvérisation ou évaporation thermique d'une couche d'or de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur, sur lequel on applique le protocole similaire à celui pour la fonctionnalisation par φ-ΟΗ ; sauf qu'à la dernière étape, au lieu d'ajouter une goutte d'eau ultrapure Millipore, une solution protéique est déposée et laissée pendant 15 min, avant de rincer avec une solution tampon (telle que PBS ou Tris 10 mM) . La solution protéique préparée est une solution de 25 mg de BSA (sérum albumine bovine) dans 4 ml d'eau ultrapure Millipore. La surface ainsi préparée est schématisée à la Figure 13.
IV. Expériences de « harpon moléculaire ».
IV.1. Principe et conditions.
Il est bien connu qu'en jouant avec le pH de la solution, les fonctions chimiques à l'extrémité de la pointe peuvent lier prioritairement les groupements -COOH ou -N¾ de certains acides aminés des protéines par l'intermédiaire de liaisons hydrogène.
Par conséquent, toutes les expériences de « harpon moléculaire » ont été réalisées dans une solution tampon de Tris = 10 mM, MgCl2 = 10 mM et NaCl = 10 mm avec un pH = 8,2 pour activer les liaisons hydrogène avec les protéines greffées sur la surface d'essai. La pointe fonctionnalisée de la sonde est immergée dans cette solution.
La surface d'essai est un échantillon de mica fraîchement clivé, revêtu d'or et couvert par des sels de diazonium pour greffer de la BSA. La fonctionnalisation de la surface de mica recouvert d'or par le sel de diazonium et la BSA a été vérifiée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ou « spectroscopie FTIR ».
La taille de l'extrémité de la pointe en graphite étant trop petite pour être caractérisée par une analyse par spectroscopie FTIR ou par spectroscopie de photoélectrons X (XPS), seule la spectroscopie de force chimique spectroscopie exposée dans les résultats ci-après permet de vérifier la fonctionnalisation de la pointe .
Ainsi, une combinaison de différentes expériences de spectroscopie de force chimique a été menée avec la sonde piézo-électrique préparée conformément aux protocoles des points I, II et III ci- dessus en mode AM-AFM à l'aide des courbes d'approche- retrait vers la surface. Les signaux acquis en sortie sont l'amplitude d'oscillation et le déphasage par rapport à la distance relative pointe-surface. Ces deux informations (amplitude et phase par rapport à la distance) peuvent alors être utilisées pour récupérer les forces d'interaction chimique en utilisant le formalisme proposé ailleurs (Sader et al., 2004 ; Katan et al. ; Uchihashi et al., 2004) .
IV.2. Résultats sur une surface non fonctionnalisée .
Afin de vérifier la sélectivité des « harpons moléculaires » greffés à l'extrémité de la pointe, les tests ont été d'abord effectués sur une surface de mica propre, revêtu d'or sans chimie, avec trois extrémités de pointe différentes (φ-ΟΗ, φ-ΝΗ2 et cp-CH3) .
La Figure 14 illustre trois courbes d'approche/retrait obtenues dans ces conditions. L'amplitude et le signal de phase sont acquis simultanément avec, en trait épais, les courbes d'approche vers la surface et, en trait fin, les courbes de retrait, quand la pointe est retirée.
La diminution de l'amplitude et l'augmentation de la phase sont synonymes du fait que la pointe entre en contact avec la surface. Les courbes d'approche et de retrait pour chaque cas sont très identiques. Cela signifie qu'aucun greffage chimique n'apparaît entre l'extrémité de la pointe et la surface.
IV.3. Résultats sur une surface fonctionnalisée avec des protéines de BSA.
En utilisant les mêmes pointes dont l'extrémité est fonctionnalisée par φ-ΟΗ, φ-Ν¾ ou (p-CH3, les mêmes courbes approche/retrait ont été réalisées sur une surface en mica, recouverte d'or et greffée par des protéines BSA.
En comparant les résultats obtenus sur la Figure 15 avec ceux de la Figure 14, des différences nettes apparaissent dans les courbes de retrait (trait fin) montrant différentes étapes abruptes, plus visibles sur les courbes de phase. Chaque étape correspond au détachement d'un (ou de plusieurs) lien (s) chimique (s) créé (s) lors de l'approche de la pointe et pendant le temps de résidence de l'extrémité de la pointe sur la surface, contrôlé par le retour de force donné par la sonde piézo-électrique .
Donc, une signature claire de certains liens moléculaires spécifiques entre la chimie de la pointe et la biochimie de la surface peut être obtenue, par le moyen des courbes de force chimique avec une sonde à capteur intégré piézo-électrique travaillant dans un environnement salin nécessaire pour étudier la matière biologique .
Sur la base de travaux antérieurs (Wang et al.,
2004, Langmuir, vol. 20, pages 7753-7759 ; Ebner et al., 2005, ChemPhysChem, vol. 6, pages 897-900), la sensibilité du système est de l'ordre de la centaine de picoNewtons .
Le graphique de la Figure 15D présente les courbes obtenues en utilisant une pointe en graphite dont l'extrémité est non fonctionnalisée et la même surface de mica revêtue d'or et fonctionnalisée avec de la BSA. Dans ce dernier cas, aucun greffage chimique spécifique n'apparaît sur les courbes de retrait (les courbes d' approche et de retrait pour chaque cas sont très identiques) ce qui démontre que les courbes de force chimique avec des étapes abruptes au cours du retrait de la pointe sont réellement dues à la présence d'une chimie spécifique et contrôlée, à la fois, à l'extrémité de la pointe et à la surface de 1 ' échantillon .

Claims

REVENDICATIONS
1) Sonde de microscope à force atomique comprenant :
i) un résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante ; et ii) une pointe fixée sur ledit résonateur revêtu et fonctionnalisée par au moins un groupement ou une molécule d'intérêt.
2) Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit résonateur piézo-électrique est en un matériau piézo-électrique notamment choisi parmi le quartz, la topaze, la tourmaline, la berlinite, le nitrure d'aluminium, l'oxyde de zinc, le sulfure de cadmium, le titanate de plomb, le titano-zirconate de plomb, le niobate de lithium, le tantalate de lithium, le niobate de potassium, le langasite, l'arseniure de gallium, le niobate de baryum sodium, l'oxyde de bismuth germanium, l'arseniure d' indium, l' antimoniure, un polymère piézo-électrique et leurs mélanges.
3) Sonde selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites électrodes sont métalliques et notamment en un métal choisi parmi l'or, le nickel, l'aluminium, le cuivre, l'étain et l'argent.
4) Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit résonateur piézo-électrique muni desdites deux électrodes se présente sous forme d'un diapason piézo- électrique (ou « Tuning fork » en anglais) avec une électrode disposée sur chacune des branches du diapason, ou dans une configuration d' interdigitation des électrodes disposées sur les deux branches du diapason.
5) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite couche isolante est :
- une peinture cathodique ou anodique électrophorétique commerciale ou
en un matériau choisi parmi le dioxyde de silicium, le parylène ou un autre dérivé du
[ 2 , 2 ] paracyclophane, le polyimidine, l'oxyde d'aluminium, le nitrure d'aluminium, un polymère vinylique et un silane hydrophobe.
6) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite pointe présente :
- un 1er élément fixé au résonateur et
un 2nd élément fixé au 1er élément et fonctionnalisé par un groupement ou une molécule d' intérêt .
7) Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit 1er élément est un fil de platine/iridium et ledit 2nd élément un fil de platine, une fibre de graphite ou un nanotube de carbone. 8) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit groupement d' intérêt est choisi parmi -OH, -C(0)OH, -NH2, -CH3, -C(0)0~, -NH3 +, -C(0)H, -N3 et un alcène terminal
9) Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est choisie parmi les peptides, les protéines telles que les enzymes, les anticorps ou fragments d'anticorps, les récepteurs cellulaires ou membranaires , les polysaccharides, les cellules ou parties cellulaires telles que des organites ou des membranes cellulaires, les acides nucléiques tels qu'ADN et ARN, et les molécules naturelles ou synthétiques à visée thérapeutique.
10) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la fonctionnalisation de la pointe par le groupement ou la molécule d' intérêt est indirecte et fait intervenir un bras de liaison lié de façon covalente, d'une part, à la pointe et, d'autre part, au groupement ou à la molécule d'intérêt.
11) Sonde selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit bras de liaison comprend un groupement (hétéro ) arylène . 12) Sonde selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit bras de liaison comprend un groupement polyéthylène glycol (PEG) . 13) Procédé pour préparer une sonde de microscope à force atomique selon l'une des revendications précédentes, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
a) déposer sur un résonateur muni de deux électrodes une couche isolante ;
b) fixer, sur le résonateur muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante obtenu à l'étape (a), une pointe ;
c) éventuellement couper et/ou graver la pointe fixée lors de l'étape (b) ;
d) fonctionnaliser la pointe fixée et affinée lors des étapes (b) et (c) par un groupement ou une molécule d'intérêt.
14) Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que le dépôt lors de ladite étape (a est un dépôt physique pyrolytique ou un électrodépôt.
15) Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que ladite étape (c) est une étape de gravure électrochimique de la pointe.
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que ladite étape (d) met en œuvre au moins un élément choisi parmi un sel d' aryle diazonium portant un groupement d'intérêt ou un précurseur d'un tel groupement, un sel d' aryle diazonium portant une molécule d' intérêt ou un précurseur d'une telle molécule, un sel d' aryle diazonium portant une fonction aminé ou un précurseur de tels sels d' aryle diazonium.
17) Utilisation d'une sonde telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou susceptible d' être préparée par un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 13 à 16, pour la spectroscopie de force chimique en solution biologique .
18) Utilisation d'une sonde telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou susceptible d' être préparée par un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 13 à 16, pour l'imagerie AFM en solution biologique. 19) Utilisation selon la revendication 17 ou
18, caractérisée en ce que ladite sonde est utilisée en mode dynamique à une fréquence d'excitation proche ou égale à sa fréquence de résonance. 20) Utilisation selon la revendication 17 ou
18, caractérisée en ce que ladite sonde est utilisée en mode dynamique hors résonance à une fréquence d'excitation éloignée de sa fréquence de résonance, ou à une fréquence correspondant à un harmonique différent de sa fréquence fondamentale de résonance.
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