WO2012056120A1 - Use of a modulator of the patched protein for regulating intracellular cholesterol concentration - Google Patents

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WO2012056120A1
WO2012056120A1 PCT/FR2011/000558 FR2011000558W WO2012056120A1 WO 2012056120 A1 WO2012056120 A1 WO 2012056120A1 FR 2011000558 W FR2011000558 W FR 2011000558W WO 2012056120 A1 WO2012056120 A1 WO 2012056120A1
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WO
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protein
cholesterol
patched
cells
shh
Prior art date
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PCT/FR2011/000558
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French (fr)
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Isabelle Mus-Veteau
Michel Bidet
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • Hh The Hedgehog signaling pathway (Hh) plays an important role in the growth and structuring during embryonic development.
  • the mammalian Hh signaling pathway involves a number of effectors, at least
  • Shh Sonic Hedgehog
  • Ihh Indian Hedgehog
  • Dhh Desert Hedgehog
  • Hh signaling pathway disorders of the Hh signaling pathway induce congenital malformations and disorders such as Gorlin syndrome and holoprosencephaly in humans
  • Patched protein is a membrane protein that crosses the membrane 12 times and interacts with the Hh protein at the two broad extracellular loops.
  • Patched has a sterol-sensitive domain, and recent work has shown that some cholesterol-derived oxysterols activate the Hh pathway.
  • the Applicant has been able to show by several approaches on different cellular models (see the examples), that an increase in the concentration of intracellular cholesterol can activate the Smoothened receptor and the Hedgehog pathway, and on the other hand, that the human Patched protein, known as a repressor of the Hh signaling pathway and as a receptor for the hedgehog protein, interacts with cholesterol and allows cholesterol efflux.
  • efflux of cholesterol is meant here that under the influence of the Patched protein, intracellular cholesterol is transported outside the cell.
  • the Patched membrane protein In the absence of the Hh protein, the Patched membrane protein is present at the plasma membrane of the cells, the intracellular cholesterol concentration decreases with the increase of the Patched-induced cholesterol efflux, and the Hh pathway is repressed. by inhibition of the Smoothened membrane receptor responsible for signal transmission. A decrease in the intracellular cholesterol concentration would therefore lead to an inhibition of the Hh pathway by inhibition of the Smoothened membrane receptor.
  • the Patched / Hh complex is then internalized and degraded.
  • the disappearance of the Patched protein at the level of the plasma membrane results in the stopping of the efflux of cholesterol and thus the increase in the concentration of intracellular cholesterol, which results in the lifting of the inhibition of the Smoothened receptor and therefore signal transmission to transcription factors and the nucleus.
  • An increase in intracellular cholesterol concentration would therefore lead to stimulation of the Hh pathway by activation of the Smoothened membrane receptor.
  • Patched protein would be a transmembrane transporter and would be involved in the efflux of cholesterol, and / or its oxysterol derivatives.
  • the subject of the invention is primarily an in vitro method for regulating the Hedgehog signaling pathway (Hh), characterized in that cells and a modulator of the activity of the Patched protein are brought into contact with one another to regulate the concentration. intracellular cholesterol.
  • Hh Hedgehog signaling pathway
  • modulator here means both an activator and an inhibitor.
  • the method is an in vitro method for activating the Hedgehog signaling pathway (Hh), characterized in that cells and an activator of the activity of the Patched protein are brought into contact. to lower the intracellular cholesterol concentration.
  • the method is an in vitro method for inhibiting the hedgehog signaling pathway (Hh), characterized in that cells are put in contact with an inhibitor of the activity of the protein. Patched to increase intracellular cholesterol concentration.
  • the invention also relates to the use of a modulator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for regulating the intracellular concentration of cholesterol.
  • the subject of the invention is the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol.
  • the subject of the invention is the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to increase the intracellular concentration of cholesterol.
  • the invention also relates to the use of a modulator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for regulating the intracellular concentration of cholesterol to modulate growth and structure during embryonic development.
  • the subject of the invention is the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol in order to prevent preaxial polydactyly, particularly in the human.
  • the subject of the invention is the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicinal product intended to increase the intracellular concentration of cholesterol in order to prevent morphological defects, in particular with respect to finger level, facies, teeth, ribs, encompassed under the name of Gorlin syndrome.
  • the invention further relates to the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for decreasing intracellular cholesterol concentration to prevent holoprosencephaly.
  • the subject of the invention is also the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to increase the intracellular cholesterol concentration to stimulate repair and / or regeneration of nervous system cells after injury and / or disease of said nervous system.
  • the subject of the invention is also the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol in order to inhibit the development of tumors occurring in numerous tissues, advantageously in the lung, esophagus, stomach, pancreas, bile ducts, breast, prostate and brain and thus reduce the tumor mass.
  • the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein is advantageously present in the medicament at physiologically effective doses.
  • said medicament may be formulated for the digestive or parenteral route.
  • the medicaments according to the invention may also comprise at least one other therapeutically active ingredient, whether it is active on the same pathology or on a different pathology, for simultaneous, separate or spreading use over time, in particular during a treatment in a subject with one of the aforementioned pathologies.
  • the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein can be used in the medicament, in admixture with one or more excipients or inert carriers, that is to say pharmaceutically inactive and non-toxic vehicles.
  • compositions may contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles that can be used in formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils or animal, acacia, etc.
  • vegetable oils are used.
  • the compositions may be formulated as injectable suspension, gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, capsules, etc., optionally using dosage forms or devices providing sustained and / or delayed release.
  • an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
  • the administration can be carried out by any method known to those skilled in the art, preferably orally or by injection, typically intraperitoneal, intracerebral, intrathecal, intravenous, intraarterial or intra -muscular. Oral administration is preferred.
  • the invention is usable in mammals, especially in humans.
  • the daily dose of the compound will be the minimum dose to achieve the desired therapeutic effect. If necessary, the daily dose may be administered in two, three, four, five, six or more doses taken daily or in multiple sub-doses administered at appropriate intervals during the day.
  • the amount selected will depend on multiple factors, in particular the route of administration, the duration of administration, the timing of administration, the rate of removal of the modulator (activator or inhibitor) from the activity of the Patched protein, of the one or more products used in combination with the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein, the age, weight and physical condition of the patient, as well as his medical history, and other information known in medicine.
  • Figure 1 shows the quantification of cholesterol by gas chromatography in the presence or absence of Shh protein in NIH3T3 or HT29 cells:
  • Figure 2 shows the results of the Smo stabilization study by cholesterol.
  • the figure represents an anti-Smo western blot made on membrane extracts prepared from NIH3T3 cells.
  • Shh cells treated for 6 h with 30nM of Shh
  • Shh + lova cells treated for 6 h with 30nM Shh and 10 g / ml of a cholesterol synthesis inhibitor lovastatin
  • Figure 3 shows the results of the experiments conducted to determine the relationship between the Patched protein and cholesterol and whether Patched has the capacity to transport cholesterol.
  • Thiocholesterol was coupled to one of the flow cells of a BIAcore chip and the interaction of the purified Patched protein with the cholesterol of the flow cell is measured.
  • The% inhibition of cholesterol uptake is based on the concentration of Shh (nM) (exponential curve obtained with the Origin Softway with an R 2 between 0.99 and 0.97 and a Ki between 0.83 and 1 for the different experiments performed).
  • 3C Measurement of Bodipy-Cholesterol Efflux: Yeasts controlling or expressing the human Patched protein were cultured to an optical density of 7, then centrifuged and concentrated at an optical density of 10 by resuspension in a pH buffer 7 before an incubation of 2 h with 2.5 ⁇ of Bodipy-Cholesterol (Bo-Chol). After dilution and centrifugation, the cells were resuspended in buffer. After 20 min, the yeasts were centrifuged and the Bodipy fluorescence of the supernatant was measured.
  • Figure 4 shows the results of experiments conducted to determine whether the endogenous Patched protein of mouse fibroblasts NIH3T3 promotes cholesterol efflux or not.
  • NIH3T3 cells were grown to confluence in wells of 24 wells, incubated for 2 hours with 2.5 ⁇ Bo-Chol, and then washed with PBS. Then 250 ⁇ of pH 7.4 buffer containing ( ⁇ ) or not ( ⁇ ) 30 nM of pure Shh are added to the wells and the Bodipy fluorescence is measured on 200 ⁇ of supernatant after 1 hour of incubation ( Figure 4A).
  • PFA paraformaldehyde solution
  • Figure 5 shows the results of experiments conducted to locate the Patched protein and Bo-Chol in cells with or without Shh protein.
  • NIH3T3 cells were incubated for 30 min with 2.5 ⁇ l Bo-Chol and washed. They were then incubated for 3 hours with or without 30 nM Shh.
  • Bodipy fluorescence (A) and rhodamine (B) were then analyzed by rotary disk confocal microscopy.
  • the total lipids of the cells or culture media were extracted according to a method derived from that of Folch et al. (J. Biol Chem 1957, 226: 497-509) as modified by Grandgirard et al. J. Chromatogr. A. 2004; 1040: 239-50).
  • the lipids were saponified for 16 hours at room temperature under an argon atmosphere in the dark with 1M methanolic potassium hydroxide.
  • the unsaponified fraction was extracted with tert-butyl methyl ester. Then an aliquot of this fraction was converted to trimethylsilyl ethers and injected into a gas chromatograph to quantify cholesterol.
  • the oxysterols were purified on silica cartridges (LC-Si SPE 3ml, Supelco, Sigma Aldrich, The Isle of Abeau Chesnes, France) according to the method of Lai et al. (Journal of Agriculture and Food Chemistry 1995; 43: 1112-1126) modified as follows: cholesterol and other contaminants were removed using 35 ml of a mixture of hexane-tert-butyl methyl ester (90%). 10, v / v) and 15 ml of Hexane-tert-butyl methyl ester (80:20, v / v). The oxysterols were then recovered using 5 ml of acetone.
  • the samples were transformed into trimethylsilyl derivatives with pyridine and a mixture of N, O, bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide-trimethyl chlorosilane (99: 1, v / v) at 60 ° C for 30 min.
  • the mouse fibroblast cell line NIH 3T3 was maintained in a DMEM culture medium (Invitrogen, USA) supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin at 37 ° C. in a 5% C0 2 atmosphere saturated with water.
  • the cells were cultured in 90-100% confluent monolayer and subjected to no more than 20 cell passages with subculturing every 4/5 days.
  • NIH-3T3 cells were cultured in 100 mm petri dishes. When the cultures reached the stage of subconfluent monolayers the Petri dishes were put on ice and all Subsequent steps to prepare membrane extracts were performed at 4 ° C.
  • the cell monolayers are rinsed twice with cold PBS and then rapidly rinsed with cold water.
  • the cells are then incubated with 1 ml of hypotonic 100 mM Tris buffer containing 1 mM EDTA and a cocktail of phosphatase inhibitors (Complete, Roche) for 5 min before being harvested in a 1.5 ml microtube and broken by successive passages. through a needle 4/10.
  • hypotonic 100 mM Tris buffer containing 1 mM EDTA and a cocktail of phosphatase inhibitors Complete, Roche
  • the supernatant is centrifuged at 18 000 g for 1 h and the resulting pellet was resuspended in 80-100 ⁇ l of hypotonic buffer (HB) containing a cocktail of phosphatase inhibitors and stored at -80 ° C until western blot protein characterization studies are performed.
  • HB hypotonic buffer
  • the protein content of the pellets was quantified by the Bradford method (Bio-Rad kit).
  • Yeast culture and membrane preparation S. cerevisiae strain K699 (Mata, ura3, and leu 2-3) was transformed with plasmid YEpPMAhPtc-MAP (Joubert et al., 2009, BBA Biomembrane, 1788: 1813-1821; 2010, Methods in Molecular Biology , Humana Press, Mus-Veteau (Ed.), 601: 87-103) by the lithium acetate procedure and plated in culture dishes containing minimal medium and a mixture of amino acids without leucine.
  • the clones were pre-cultured at 30 ° C to an optical density at 600 nm ( 60 ° OD) of 3 on a minimum medium (MM) (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0, 3 mM adenine, 0.5 mM uracil, 0.3 mM tyrosine and a mixture of amino acids lacking leucine) supplemented with 2% D-glucose.
  • MM minimum medium
  • This preculture is then diluted to an OD 600 of 0.1-0.2 in complete medium (yeast extract, bactopeptone, adenine) containing 2% D-glucose and cultured at 18 ° C. with stirring at 200 rpm. up to an OD 600 of 5-7.
  • complete medium yeast extract, bactopeptone, adenine
  • the yeasts were washed with cold water, resuspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 1 mM PMSF and 4 mM benzamidine, and broken twice by vortexing for 15 minutes in the presence of glass beads (425-600 ⁇ m, Sigma).
  • Unbroken yeasts and glass beads were removed by centrifugation for 5 min at 2000 g.
  • the membranes were collected by centrifugation of the supernatant obtained for 1 h at 100,000 g.
  • the pellet was washed twice in the same buffer without EDTA and resuspended at 5 mg / ml in solubilization buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10% glycerol mM PMSF and 4 mM benzamidine.
  • the proteins contained in the samples were separated by SDS / 8% polyacrylamide gel electrophoresis (8% SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham) using standard techniques.
  • the nitrocellulose membranes were first blocked for 1 h at room temperature in blocking buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 450 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 4% skim milk ), then contacted overnight at 4 ° C with either a mouse anti-HA monoclonal antibody (obtained in the laboratory from hybridomas, 1:20 dilution (Joubert et al., 2009)), or polyclonal antibodies rabbit anti-PTC (1: 1000 dilution) and anti-Smo (1: 3000 dilution) (Joubert et al., 2009).
  • nitrocellulose membranes were then washed twice in the blocking buffer.
  • Polyclonal secondary antibodies of goat, anti-mouse (1: 5000 dilution) or anti-rabbit (1: 3000 dilution) coupled to horseradish peroxidase (Dako) were then applied for 2 hours at 4 ° C.
  • the revelation of reactions was performed using the ECL kit (Millipore) and a chemiluminescence detection system for the Western blot Fusion FX7 ® (Vilber- Lourmat).
  • Bodipy-cholesterol comes from the company Avanti (Topfluor, Avanti). The 5 mM aliquots of BodCH in DMSO were stored frozen.
  • NIH3T3 for the BodCH efflux experiments, NIH 3T3 cells were inoculated into the wells of 24-well plates at the rate of 250 ⁇ l / well of Bo-chol at 2.5 ⁇ (Avanti (Topfluor, Avanti), 5mM aliquot in DMSO stored frozen) in culture medium for 2 hours at 37 ° C.
  • the cells were incubated for 1 h at 37 ° C with shaking at 50 rpm and the supernatants removed.
  • the fluorescence reading (exc 490-1 Onm; em 520-20nm) was performed on 200 ⁇ of supernatant in a plate reader (FLUOstar, Labtech) .
  • the Bo-Chol remaining in the cells was determined by counting the fluorescence residue in the cells after solubilization with 0.5% SDS.
  • yeasts expressing hPtc were pre-cultured at 30 ° C to an OD 60 o of 3 on minimal medium (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.3 mM adenine, 5 mM uracil, 0.3 mM tyrosine and a mixture of amino acids lacking leucine) supplemented with 2% D-glucose.
  • This preculture is then diluted to OD 60 of 0.2 in complete medium (yeast extract, bactopeptone, adenine), 2% of D-glucose (or 2% of galactose for YEpGAL vectors) and cultured at 18 ° C. with stirring (200 rpm) to an OD 60 o of 3-6.
  • Simultaneously Saccharomyces cerevisiae strain K699 (Mata, ura3, and leu 2-3) was cultured in complete medium to perform efflux control measures under the same conditions.
  • the cells of two exponentially growing cultures (OD 60 o: 3-6) of K699 and clones expressing PTC were simultaneously collected by centrifugations (5mn, 3000g), washed 4 times with water. and finally resuspended with care at a 60% OD of 10 in 50 mM NaOH-Hepes buffer (pH 7.0).
  • Bo-Chol 5 ⁇ of Bo-Chol were then added to the cells for 2 hours at room temperature with stirring. The cells are then washed rapidly and 1.6 ml of 60% OD yeast suspensions of 10 are then incubated at room temperature for 20 minutes in 2 ml Eppendorf microtubes with stirring. The efflux measurements of Bo-Chol were carried out in triplicate on 250 ⁇ l of yeast suspension.
  • the fluorescence remaining in the yeast was determined after exposure to 0.5% SDS buffer, 50 mM NaOH-Hepes (pH 7.0).
  • hPtc was produced in S. cerevisiae yeast and purified as described by Joubert et al. in 2009. After the solubilization of the preparations of yeast membranes with 1% dodecyl-PD-maltoside, the protein purification was carried out through a calmodulin Sepharose resin.
  • the SPR measurements were performed on a Biacore 3000 (Biacore / GE Healthcare Uppsala, Sweden) with a CM5 Biacore / GE Healthcare chip.
  • a stock solution of thiocholesterol in DMSO (1 mg / mL) was prepared and diluted 1: 50 in sodium borate buffer pH 8.5 for the covalent coupling of the thiols on the chip of a CM5 sensor.
  • Measuring cell 2 was activated with 200 mM N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), and 100 ⁇ L (50 ⁇ g) of thiocholesterol were injected at 10 ⁇ l / min. Coupling was completed by cysteine injection.
  • EDC N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the surface has been deactivated with ethanolamine.
  • Measuring cell 1 was turned on and off, and used as a reference flow cell.
  • the surfaces are then washed with three injections of 50 mM NaOH (15 ⁇ L at 5 ⁇ L / min).
  • the hPtc purification buffer was used as a run buffer during the experiments.
  • FC2 The difference between the sensorgrams recorded on FC2 and FC1 was measured.
  • the chip sensor surface was regenerated twice with 20 ⁇ l of 50 mM NaOH, 0.05% SDS at 20 ⁇ l / min.
  • Example 1 Treatment with Sonic Hedgehog Protein Increases Intracellular Cholesterol Concentration
  • a change in the content of the cell sterols and to identify the affected sterols an analysis of the sterol content of two sensitive Shh cell lines, NIH3T3 mouse fibroblasts and cells of the human colon II adenocarcinoma cell line HT29, grown in the presence and absence of pure Shh in the culture medium, was performed by gas chromatography (GC) and mass spectrometry.
  • GC gas chromatography
  • Example 2 Changes in cholesterol concentration affect Smoothened stabilization at the plasma membrane.
  • Shh protein, Smo agonist purmorphamine, cholesterol, and Shh / lovastatin mixture were added to cell cultures six hours before harvest and membrane preparation.
  • the amount of endogenous Smo stabilized at the plasma membrane of the cells is increased in the presence of cholesterol in the culture medium as when the cells were treated with pure Shh protein or purmorphamine (Fig. 2).
  • treatment with lovastatin strongly inhibits the Smo stabilization at the cell surface normally induced by the presence of the Shh protein in the medium.
  • the stabilization of Smo at the level of the plasma membrane of cells is a critical step in activation of the Hh pathway in Drosophila and in mammals.
  • Example 3 The human Patched protein expressed in yeast binds cholesterol and promotes its efflux
  • Patched protein In order to determine the relationship between Patched protein and cholesterol and whether Patched has the capacity to transport cholesterol, a functional model of expression of human Patched Protein (hPtc) in yeast Saccharomyces cerevisiae was developed. It has been shown that the purification of the protein resulting from this expression is possible and that hPtc is able to bind to the protein Shh (its natural ligand) both in the yeast membranes and in a solution of surfactant after purification ( Joubert et al., 2009).
  • Shh its natural ligand
  • the ability of the hPtc protein to bind to cholesterol was first studied by surface plasmon resonance (SPR).
  • Yeasts expressing hPtc were cultured.
  • the membrane fraction was prepared (Fig. 3A) and purified hPtc protein.
  • the purified hPtc protein was injected onto a Biacore sensor chip, one flow cell of which was covalently coupled to thiocholesterol and the other just activated without thiocholesterol for the study of nonspecific binding (control).
  • the recorded sensorgram shows a clear binding of hPtc to cholesterol ( Figure 3B).
  • NIH3T3 mouse fibroblasts were grown in 24-well confluent plates, then incubated for two hours with Bo-Chol and washed.
  • PBS buffer containing or not containing pure Shh protein was added and the fluorescence of the supernatant of each well was measured one hour later.
  • Patched in the absence of the Shh protein, Patched is at the level of the plasma membrane and promotes the efflux of Bo-Chol; in the presence of Shh, Patched is internalized in endosomes and does not promote Bo-Chol efflux, thus explaining that the amount of Bo-Chol decreased in the extracellular medium and increased in the intracellular medium.
  • NIH3T3 mouse fibroblasts were cultured on slides, incubated with Bo-Chol, then with a medium containing (+) or not (-) of the Shh protein. After three hours, the cells were fixed, permeabilized, incubated with anti-Patched antibody and observed by confocal microscopy.
  • Bo-Chol is concentrated at the level of the plasma membrane of the cells (A).
  • Patched detected with a rhodamine-labeled antibody (B)
  • B rhodamine-labeled antibody
  • C Bo-Chol

Abstract

The subject matter of the invention is novel medicaments for modulating intracellular cholesterol concentration through the modulation of the Hedgehog (Hh) signalling pathway. The invention has applications particularly in the treatment of cancers and/or the treatment of neurodegenerative diseases.

Description

UTILISATION D'UN MODULATEUR DE LA PROTÉINE PATCHED POUR RÉGULER LA CONCENTRAT INTRACELLULAIRE EN CHOLESTÉROL USE OF PROTEIN PATCHED MODULATOR TO REGULATE INTRACELLULAR CHOLESTEROL CONCENTRATE
La voie de signalisation Hedgehog (Hh) joue un rôle important dans la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire. The Hedgehog signaling pathway (Hh) plays an important role in the growth and structuring during embryonic development.
La voie de signalisation Hh chez les mammifères met en jeu de nombreux effecteurs dont au moins  The mammalian Hh signaling pathway involves a number of effectors, at least
- les protéines de la famille Hh codées par trois gènes distincts Shh (Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) et Désert Hedgehog (Dhh),  the proteins of the Hh family encoded by three distinct Shh genes (Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) and Desert Hedgehog (Dhh),
- les protéines responsables de la sécrétion et du transport des protéines  - the proteins responsible for the secretion and transport of proteins
Hh, dont Dispatched (Disp),  Hh, including Dispatched (Disp),
- Shifted, qui agit à longue distance et est requise pour l'accumulation des  - Shifted, which acts at long distance and is required for the accumulation of
protéines Hh,  Hh protein,
- les protéines réceptrices du signal Hh : Patched (Ptc), Hedgehog  the receptor proteins of the Hh: Patched (Ptc) signal, Hedgehog
interacting protein (Hip) ;  interacting protein (Hip);
- Smoothened (Smo) responsable de la transmission du signal Hh à  - Smoothened (Smo) responsible for transmitting the Hh signal to
l'intérieur de la cellule réceptrice.  inside the receiving cell.
Il est généralement admis dans l'art antérieur que Smo est constitutivement inhibée par Ptc en l'absence de protéines Hh et que la liaison du ligand Hh sur son récepteur Ptc engendre l'activation de Smo qui à son tour va activer les facteurs de transcription à doigts de zinc les facteurs Gli.  It is generally accepted in the prior art that Smo is constitutively inhibited by Ptc in the absence of Hh proteins and that the binding of ligand Hh to its Ptc receptor generates activation of Smo which in turn will activate transcription factors. zinc fingers Gli factors.
Les troubles de la voie de signalisation Hh induisent chez l'homme des malformations congénitales et des troubles tels que le syndrome de Gorlin et l'holoprosencéphalie  Disorders of the Hh signaling pathway induce congenital malformations and disorders such as Gorlin syndrome and holoprosencephaly in humans
Par exemple une expression ectopique de Sonic Hedgehog (Shh), l'un des orthologues de Hh chez les mammifères, induite expérimentalement dans la partie antérieure du bourgeon de membre engendre une polydactylie préaxiale. Ce qui est confirmé par le fait que dans la plupart des modèles murins génétiques de polydactylie préaxiale (tels que extra toes (Xt), sasquatch (Ssq)), une expression ectopique de Shh est observée dans la partie antérieure du bourgeon de membre. Ainsi, des mutations affectant la voie Shh en la stimulant seraient impliquées dans de nombreux cas de polydactylie préaxiale humaine. For example, ectopic expression of Sonic Hedgehog (Shh), one of the Hh orthologues in mammals experimentally induced in the anterior part of the limb bud produces preaxial polydactyly. This is confirmed by the fact that in most mouse genetic models of preaxial polydactyly (such as extra toes (Xt), sasquatch (Ssq)), an ectopic expression of Shh is observed in the anterior part of the limb bud. Thus, mutations affecting the Shh pathway by stimulating it would be involved in many cases of human pre-axial polydactyly.
De même les individus porteurs d'un allèle défectueux du gène PTCH1 , conduisant à une réduction d'activité de la protéine correspondante, présentent un ensemble de défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin.  Similarly, individuals carrying a defective allele of the PTCH1 gene, leading to a reduction in the activity of the corresponding protein, exhibit a set of morphological defects, in particular at the level of the fingers, facies, teeth, and ribs, encompassed under the name of Gorlin syndrome.
L'holoprosencéphalie, un défaut de développement de la ligne médiane caractérisé par la séparation incomplète du cerveau antérieur ventral en deux hémisphères cérébraux ainsi que par des anomalies crânio-faciales telles qu'une incisive médiane unique, une fente des lèvres ou du palais, une structure nasale ressemblant à un proboscis ou une cyclopie, serait la conséquence d'un défaut de la voie de signalisation Hh au niveau de la ligne médiane, qui dans la plupart des cas seraient liées à des mutations non-sens, faux-sens, des délétions et des insertions dans le gène.  Holoprosencephaly, a defect in midline development characterized by incomplete separation of the ventral forebrain into two cerebral hemispheres and by craniofacial abnormalities such as a single medial incisor, cleft lip or palate, nasal structure resembling a proboscis or cyclopia, would be the consequence of a defect of the Hh signaling pathway at the midline, which in most cases would be related to mutations nonsense, missense, deletions and insertions in the gene.
Chez les adultes, des études récentes suggèrent un rôle de la voie de signalisation Hh dans l'auto-renouvellement des cellules souches et la mobilisation des cellules souches endogènes pour la réparation et la régénération après une lésion et-/ou maladie du système nerveux.  In adults, recent studies suggest a role for the Hh signaling pathway in stem cell self-renewal and endogenous stem cell mobilization for repair and regeneration after injury and / or nervous system disease.
Il a également été montré que les mutations qui augmentent l'activité globale de la voie Hh sont impliquées dans le développement des tumeurs survenant dans de nombreux tissus comme le poumon, l'œsophage, l'estomac, le pancréas, les voies biliaires, le sein, la prostate et le cerveau. Nombre de ces tumeurs ont été décrites comme contenant des cellules souches cancéreuses qui présentent une activation de la voie Hh aberrante tout en ayant conservé les propriétés d'auto-renouvellement, représentant ainsi un réservoir infini pour le maintien de la masse tumorale.  It has also been shown that mutations that increase the overall activity of the Hh pathway are involved in the development of tumors occurring in many tissues such as the lung, esophagus, stomach, pancreas, bile ducts, kidney breast, prostate and brain. Many of these tumors have been described as containing cancer stem cells that exhibit an aberrant Hh pathway activation while retaining the self-renewing properties, thus representing an infinite reservoir for maintaining tumor mass.
La protéine Patched est une protéine membranaire qui traverse 12 fois la membrane et interagit avec la protéine Hh au niveau des deux larges boucles extracellulaires.  Patched protein is a membrane protein that crosses the membrane 12 times and interacts with the Hh protein at the two broad extracellular loops.
Les homologies de sa séquence avec celles des transporteurs bactériens de la famille RND (résistance, nodulation, division) suggèrent que cette protéine pourrait avoir une fonction de transporteur. De plus, Patched possède un domaine sensible au stérol, et des travaux récents montrent que certains oxystérols dérivés du cholestérol activent la voie Hh. The homologies of its sequence with those of bacterial carriers of the RND family (resistance, nodulation, division) suggest that this protein could have a transporter function. In addition, Patched has a sterol-sensitive domain, and recent work has shown that some cholesterol-derived oxysterols activate the Hh pathway.
Cependant à la connaissance de la demanderesse, le rôle de transporteur de la protéine Patched n'a jamais été démontré.  However, to the knowledge of the applicant, the carrier role of the Patched protein has never been demonstrated.
En effet, de manière surprenante et après de long travaux, la Demanderesse a pu montrer par plusieurs approches sur différents modèles cellulaires (voir les exemples), qu'une augmentation de la concentration en cholestérol intracellulaire peut activer le récepteur Smoothened et la voie Hedgehog, et d'autre part, que la protéine humaine Patched, connue comme répresseur de la voie de signalisation Hh et comme récepteur de la protéine Hedgehog, interagit avec le cholestérol et permet l'efflux de cholestérol.  Indeed, surprisingly and after long work, the Applicant has been able to show by several approaches on different cellular models (see the examples), that an increase in the concentration of intracellular cholesterol can activate the Smoothened receptor and the Hedgehog pathway, and on the other hand, that the human Patched protein, known as a repressor of the Hh signaling pathway and as a receptor for the hedgehog protein, interacts with cholesterol and allows cholesterol efflux.
Par efflux de cholestérol, on entend ici que sous l'influence de la protéine Patched, le cholestérol intracellulaire est transporté à l'extérieur de la cellule. By efflux of cholesterol is meant here that under the influence of the Patched protein, intracellular cholesterol is transported outside the cell.
En l'absence de la protéine Hh, la protéine membranaire Patched est présente au niveau de la membrane plasmique des cellules, la concentration intracellulaire en cholestérol diminue avec l'augmentation de l'efflux de cholestérol induit par Patched, et la voie Hh est réprimée par inhibition du récepteur membranaire Smoothened responsable de la transmission du signal. Une diminution de la concentration intracellulaire en cholestérol conduirait donc à une inhibition de la voie Hh par inhibition du récepteur membranaire Smoothened. In the absence of the Hh protein, the Patched membrane protein is present at the plasma membrane of the cells, the intracellular cholesterol concentration decreases with the increase of the Patched-induced cholesterol efflux, and the Hh pathway is repressed. by inhibition of the Smoothened membrane receptor responsible for signal transmission. A decrease in the intracellular cholesterol concentration would therefore lead to an inhibition of the Hh pathway by inhibition of the Smoothened membrane receptor.
A l'inverse, quand la protéine Hh est sécrétée dans le milieu extracellulaire, elle interagit avec Patched, le complexe Patched/Hh est alors internalisé et dégradé. La disparition de la protéine Patched au niveau de la membrane plasmique a pour conséquence l'arrêt de l'efflux de cholestérol et donc l'augmentation de la concentration du cholestérol intracellulaire, ce qui entraîne la levée de l'inhibition du récepteur Smoothened et donc la transmission du signal aux facteurs de transcription et au noyau. Une augmentation de la concentration intracellulaire en cholestérol conduirait donc à une stimulation de la voie Hh par activation du récepteur membranaire Smoothened.  Conversely, when the Hh protein is secreted in the extracellular medium, it interacts with Patched, the Patched / Hh complex is then internalized and degraded. The disappearance of the Patched protein at the level of the plasma membrane results in the stopping of the efflux of cholesterol and thus the increase in the concentration of intracellular cholesterol, which results in the lifting of the inhibition of the Smoothened receptor and therefore signal transmission to transcription factors and the nucleus. An increase in intracellular cholesterol concentration would therefore lead to stimulation of the Hh pathway by activation of the Smoothened membrane receptor.
Ainsi les différents résultats obtenus par la demanderesse conduisent à proposer que la protéine Patched serait un transporteur transmembranaire et serait impliquée dans l'efflux de cholestérol, et/ou de ses dérivés oxystérols.Thus the various results obtained by the applicant lead to propose that the Patched protein would be a transmembrane transporter and would be involved in the efflux of cholesterol, and / or its oxysterol derivatives.
Ainsi une régulation de l'activité de la protéine Patched permettrait de réguler la concentration intracellulaire de cholestérol, activateur du récepteur Smoothened et donc de réguler la voie Hh. Thus a regulation of the activity of the Patched protein would make it possible to regulate the intracellular concentration of cholesterol, activator of the Smoothened receptor and thus regulate the Hh pathway.
La découverte de cette nouvelle activité de la protéine Patched permet d'envisager de nouvelles voies de traitement des maladies liées aux troubles de la voie de signalisation Hh, comme par exemple l'apparition des malformations congénitales (l'inhibition des voies Hh activées de manière inappropriée pourrait permettre la prévention des polydactylies préaxiales humaines), du syndrome de Gorlin (la stimulation de l'activité de la protéine Patched pourrait permettre la prévention des défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin), ou encore l'holoprosencéphalie (HPE).  The discovery of this new activity of the Patched protein makes it possible to envisage new ways of treating diseases related to disorders of the Hh signaling pathway, such as for example the appearance of congenital malformations (the inhibition of the Hh pathways activated in a inappropriate could allow the prevention of human pre-axial polydactyly), Gorlin's syndrome (stimulation of the activity of the Patched protein could allow the prevention of morphological defects, especially in the fingers, facies, teeth, ribs, embedded under the name of Gorlin syndrome), or holoprosencephaly (HPE).
Cela permet également d'envisager de nouveaux traitements des lésions et- /ou maladies du système nerveux par la stimulation de l'auto-renouvellement des cellules souches et/ou de la mobilisation des cellules souches endogènes pour améliorer la réparation et la régénération des tissus nerveux lésés.  It also allows for new treatments for lesions and / or diseases of the nervous system by stimulating stem cell self-renewal and / or mobilizing endogenous stem cells to improve tissue repair and regeneration. injured nerves.
Cela permet aussi d'envisager de nouvelles stratégies dans le traitement des cancers liés à une suractivation de la voie de signalisation Hh par diminution voire inhibition de l'activité globale de la voie Hh afin d'inhiber le développement des tumeurs, particulièrement au niveau du poumon, de l'œsophage, de l'estomac, du pancréas, des voies biliaires, du sein, de la prostate et du cerveau.  This also makes it possible to envisage new strategies in the treatment of cancers related to over-activation of the Hh signaling pathway by reducing or even inhibiting the global activity of the Hh pathway in order to inhibit the development of tumors, particularly at the level of the tumor. lung, esophagus, stomach, pancreas, bile ducts, breast, prostate and brain.
Ainsi l'invention a pour objet premier une méthode in vitro de régulation de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour réguler la concentration intracellulaire en cholestérol.  Thus, the subject of the invention is primarily an in vitro method for regulating the Hedgehog signaling pathway (Hh), characterized in that cells and a modulator of the activity of the Patched protein are brought into contact with one another to regulate the concentration. intracellular cholesterol.
Par modulateur on entend ici aussi bien un activateur qu'un inhibiteur.  By modulator here means both an activator and an inhibitor.
Ainsi selon une variante de l'invention la méthode est une méthode in vitro d'activation de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un activateur de l'activité de la protéine Patched pour diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol. Et selon une autre variante de l'invention la méthode est une méthode in vitro d'inhibition de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol. Thus, according to one variant of the invention, the method is an in vitro method for activating the Hedgehog signaling pathway (Hh), characterized in that cells and an activator of the activity of the Patched protein are brought into contact. to lower the intracellular cholesterol concentration. According to another variant of the invention, the method is an in vitro method for inhibiting the hedgehog signaling pathway (Hh), characterized in that cells are put in contact with an inhibitor of the activity of the protein. Patched to increase intracellular cholesterol concentration.
Mais des applications thérapeutiques sont également envisageables.  But therapeutic applications are also possible.
Ainsi l'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en cholestérol.  Thus the invention also relates to the use of a modulator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for regulating the intracellular concentration of cholesterol.
Selon une variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol.  According to one variant, the subject of the invention is the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol.
Et selon une autre variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol.  According to another variant, the subject of the invention is the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to increase the intracellular concentration of cholesterol.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en cholestérol pour moduler la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire.  The invention also relates to the use of a modulator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for regulating the intracellular concentration of cholesterol to modulate growth and structure during embryonic development.
Selon une variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour prévenir la polydactylie préaxiale, particulièrement chez l'humain.  According to one variant, the subject of the invention is the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol in order to prevent preaxial polydactyly, particularly in the human.
Et selon une autre variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol pour prévenir les défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin.  According to another variant, the subject of the invention is the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicinal product intended to increase the intracellular concentration of cholesterol in order to prevent morphological defects, in particular with respect to finger level, facies, teeth, ribs, encompassed under the name of Gorlin syndrome.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour prévenir l'holoprosencéphalie.  The invention further relates to the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for decreasing intracellular cholesterol concentration to prevent holoprosencephaly.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol pour stimuler la réparation et/ou la régénération des cellules du système nerveux après une lésion et-/ou une maladie dudit système nerveux. The subject of the invention is also the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to increase the intracellular cholesterol concentration to stimulate repair and / or regeneration of nervous system cells after injury and / or disease of said nervous system.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour inhiber le développement des tumeurs survenant dans de nombreux tissus, avantageusement dans le poumon, l'œsophage, l'estomac, le pancréas, les voies biliaires, le sein, la prostate et le cerveau et donc réduire la masse tumorale.  The subject of the invention is also the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol in order to inhibit the development of tumors occurring in numerous tissues, advantageously in the lung, esophagus, stomach, pancreas, bile ducts, breast, prostate and brain and thus reduce the tumor mass.
Selon l'invention le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched est avantageusement présent dans le médicament à des doses physiologiquement efficaces.  According to the invention, the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein is advantageously present in the medicament at physiologically effective doses.
Selon l'invention ledit médicament peut être formulé pour la voie digestive ou parentérale.  According to the invention, said medicament may be formulated for the digestive or parenteral route.
Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, qu'il soit actif sur la même pathologie ou sur une pathologie différente, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint de l'une des pathologies précédemment citées.  The medicaments according to the invention may also comprise at least one other therapeutically active ingredient, whether it is active on the same pathology or on a different pathology, for simultaneous, separate or spreading use over time, in particular during a treatment in a subject with one of the aforementioned pathologies.
Selon l'invention, le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched peut être utilisé dans le médicament, en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques.  According to the invention, the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein can be used in the medicament, in admixture with one or more excipients or inert carriers, that is to say pharmaceutically inactive and non-toxic vehicles.
On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc.  For example, saline, physiological, isotonic, buffered, etc., solutions compatible with a pharmaceutical use and known to those skilled in the art may be mentioned. The compositions may contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. De façon préférentielle, on utilise des huiles végétales. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Agents or vehicles that can be used in formulations (liquid and / or injectable and / or solid) include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils or animal, acacia, etc. Preferably, vegetable oils are used. The compositions may be formulated as injectable suspension, gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, capsules, etc., optionally using dosage forms or devices providing sustained and / or delayed release. For this type of formulation, an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. L'administration par voie orale est préférée.  The administration can be carried out by any method known to those skilled in the art, preferably orally or by injection, typically intraperitoneal, intracerebral, intrathecal, intravenous, intraarterial or intra -muscular. Oral administration is preferred.
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.  The invention is usable in mammals, especially in humans.
En général la dose journalière du composé sera la dose minimale pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée.  In general the daily dose of the compound will be the minimum dose to achieve the desired therapeutic effect. If necessary, the daily dose may be administered in two, three, four, five, six or more doses taken daily or in multiple sub-doses administered at appropriate intervals during the day.
La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.  The amount selected will depend on multiple factors, in particular the route of administration, the duration of administration, the timing of administration, the rate of removal of the modulator (activator or inhibitor) from the activity of the Patched protein, of the one or more products used in combination with the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein, the age, weight and physical condition of the patient, as well as his medical history, and other information known in medicine.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples de réalisation de l'invention qui suivent ainsi qu'à l'observation des figures parmi lesquelles  Other features and advantages of the invention will become apparent on reading the following exemplary embodiments of the invention as well as on the observation of the figures among which
La figure 1 représente la quantification du cholestérol par chromatographie en phase gazeuse en présence■ ou en l'absence□ de protéine Shh dans des cellules NIH3T3 ou HT29 :  Figure 1 shows the quantification of cholesterol by gas chromatography in the presence or absence of Shh protein in NIH3T3 or HT29 cells:
1A : dans la cellule  1A: in the cell
1 B dans le milieu extracellulaire.  1 B in the extracellular medium.
La figure 2 représente les résultats de l'étude de la stabilisation de Smo par le cholestérol. La figure représente un western blot anti-Smo réalisé sur des extraits de membrane préparés à partir de cellules NIH3T3. Figure 2 shows the results of the Smo stabilization study by cholesterol. The figure represents an anti-Smo western blot made on membrane extracts prepared from NIH3T3 cells.
Control : cellules non traitées par Shh  Control: cells not treated by Shh
Shh : cellules traitées pendant 6 h avec 30nM de Shh  Shh: cells treated for 6 h with 30nM of Shh
Purm : cellules traitées pendant 6 h avec 10μΜ de purmorphamine  Purm: cells treated for 6 h with 10μΜ of purmorphamine
Chol : cellules traitées pendant 3 h avec 2,5μΜ de cholestérol  Chol: cells treated for 3 h with 2.5μΜ cholesterol
Shh + lova : cellules traitées pendant 6 h avec 30nM de Shh et 10 g/ml d'un inhibiteur de la synthèse du cholestérol la lovastatine  Shh + lova: cells treated for 6 h with 30nM Shh and 10 g / ml of a cholesterol synthesis inhibitor lovastatin
La figure 3 représente les résultats des expériences conduites pour déterminer le lien existant entre la protéine Patched et le cholestérol et pour savoir si Patched a la capacité de transporter le cholestérol.  Figure 3 shows the results of the experiments conducted to determine the relationship between the Patched protein and cholesterol and whether Patched has the capacity to transport cholesterol.
3A : Western-blot sur des extraits membranaires de levures S. Cerevisiae exprimant (2) ou non (1) la protéine Patched humaine.  3A: Western-blot on membrane extracts of S. cerevisiae yeasts expressing (2) or not (1) the human Patched protein.
3 B : Fixation du cholestérol à la protéine Patched humaine :  3 B: Fixation of Cholesterol to Human Patched Protein:
Du thiocholestérol a été couplé sur une des cellules d'écoulement d'une puce BIAcore et l'interaction de la protéine Patched purifiée avec le cholestérol de la cellule d'écoulement est mesuré.  Thiocholesterol was coupled to one of the flow cells of a BIAcore chip and the interaction of the purified Patched protein with the cholesterol of the flow cell is measured.
Des concentrations croissantes de Shh pure (1 ,5, 7,5, 15 nM) ont été incubées avec la protéine Patched humaine purifiée avant l'injection sur les cellules d'écoulement activée ou non.  Increasing concentrations of pure Shh (1.5, 7.5, 15 nM) were incubated with the purified human Patched protein prior to injection into activated or non-activated flow cells.
Le % d'inhibition de la fixation du cholestérol est porté en fonction de la concentration en Shh (nM) (courbe exponentielle obtenue avec le Softway Origine avec un R2 compris entre 0,99 et 0,97 et un Ki entre 0,83 et 1 pour les différentes expériences réalisées). The% inhibition of cholesterol uptake is based on the concentration of Shh (nM) (exponential curve obtained with the Origin Softway with an R 2 between 0.99 and 0.97 and a Ki between 0.83 and 1 for the different experiments performed).
— Sensorgramme résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle, obtenu après injection de 50 μΙ de protéine Patched humaine pure ;  - Sensorgram resulting from the difference between the binding to the flow cell coupled to thiocholesterol and the control, obtained after injection of 50 μΙ of pure human Patched protein;
■■■■ Sensorgramme résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle, obtenu après injection de 50 μΙ de protéine Patched humaine pure incubée avec 50 μΙ de protéine Shh pure ;  ■■■■ Sensorgram resulting from the difference between the binding to the thiocholesterol-coupled flow cell and the control, obtained after injection of 50 μΙ of pure human Patched protein incubated with 50 μΙ of pure Shh protein;
• · · · Sensorgramme résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle, obtenu après injection de 50 μΙ de protéine Shh pure. • · · · Sensorgram resulting from the difference between thiocholesterol-coupled flow cell fixation and control, obtained after injection 50 μΙ of pure Shh protein.
3C : mesure de l'efflux de Bodipy-cholestérol : Des levures contrôle ou exprimant la protéine Patched humaine ont été cultivées jusqu'à une densité optique de 7, puis centrifugée et concentrée à une densité optique de 10 par resuspension dans un tampon à pH 7 avant une incubation de 2 h avec 2,5 μΜ de Bodipy-Cholestérol (Bo-Chol). Après dilution et de centrifugation, les cellules ont été resuspendues dans du tampon. Après 20 min, les levures ont été centrifugées et la fluorescence Bodipy du surnageant a été mesurée.  3C: Measurement of Bodipy-Cholesterol Efflux: Yeasts controlling or expressing the human Patched protein were cultured to an optical density of 7, then centrifuged and concentrated at an optical density of 10 by resuspension in a pH buffer 7 before an incubation of 2 h with 2.5 μΜ of Bodipy-Cholesterol (Bo-Chol). After dilution and centrifugation, the cells were resuspended in buffer. After 20 min, the yeasts were centrifuged and the Bodipy fluorescence of the supernatant was measured.
La figure 4 représente les résultats des expériences conduites afin de déterminer si la protéine Patched endogène des fibroblastes de souris NIH3T3 favorise ou non l'efflux de cholestérol.  Figure 4 shows the results of experiments conducted to determine whether the endogenous Patched protein of mouse fibroblasts NIH3T3 promotes cholesterol efflux or not.
A. Des cellules NIH3T3 ont été cultivées jusqu'à confluence dans des boites de 24 puits, incubées pendant 2 heures avec 2,5μΜ de Bo-Chol, puis lavées avec du PBS. Puis 250 μΙ_ de tampon à pH 7.4 contenant (■) ou non (□) 30 nM de pure Shh sont ajoutés aux puits et la fluorescence Bodipy est mesurée sur 200μΙ_ de surnageant après une 1 heure d'incubation (Figure 4A).  A. NIH3T3 cells were grown to confluence in wells of 24 wells, incubated for 2 hours with 2.5μΜ Bo-Chol, and then washed with PBS. Then 250 μΙ of pH 7.4 buffer containing (■) or not (□) 30 nM of pure Shh are added to the wells and the Bodipy fluorescence is measured on 200 μΙ of supernatant after 1 hour of incubation (Figure 4A).
B. Des cellules NIH 3T3 ont été cultivées sur une lamelle et incubées 30 min avec 2,5 uM Bo-Chol. Après lavage, du tampon contenant ou non 30 nM de Shh a été ajouté dans les puits pendant 3 heures. Puis les cellules ont été fixées aux lamelles avec une solution de paraformaldéhide (PFA) à 4% et observées au microscope Delta Vision (ex = 450-490 nm, em = 500-550 nm, obj x 40).  B. NIH 3T3 cells were grown on a coverslip and incubated for 30 min with 2.5 μM Bo-Chol. After washing, buffer containing 30 nM or less of Shh was added to the wells for 3 hours. The cells were then fixed to the slides with a 4% paraformaldehyde solution (PFA) and observed under the Delta Vision microscope (ex = 450-490 nm, em = 500-550 nm, obj x 40).
La figure 5 représente les résultats des expériences conduites afin de localiser la protéine Patched et le Bo-Chol dans les cellules en présence ou non de la protéine Shh.  Figure 5 shows the results of experiments conducted to locate the Patched protein and Bo-Chol in cells with or without Shh protein.
Des cellules NIH3T3 ont été incubées 30 min avec 2,5 μΜ de Bo-Chol, puis lavées. Elles ont ensuite été incubées pendant 3 heures avec ou sans 30 nM de Shh.  NIH3T3 cells were incubated for 30 min with 2.5 μl Bo-Chol and washed. They were then incubated for 3 hours with or without 30 nM Shh.
Les cellules ont alors été lavées, fixées, perméabilisées et incubées avec un anticorps anti-Patched couplé à la rhodamine. La fluorescence de Bodipy (A) et de la rhodamine (B) ont été alors analysés par microscopie confocale à disque rotatif.  The cells were then washed, fixed, permeabilized and incubated with an anti-Patched antibody coupled to rhodamine. Bodipy fluorescence (A) and rhodamine (B) were then analyzed by rotary disk confocal microscopy.
La fusion entre les images obtenues avec Bodipy et avec la rhodamine est présentée dans la colonne (C). Exemples The fusion between the images obtained with Bodipy and with rhodamine is presented in column (C). Examples
Matériels et méthodes  Materials and methods
Analyse par chromatographie en phase gazeuse du cholestérol et des oxystérols.  Gas chromatographic analysis of cholesterol and oxysterols.
Les lipides totaux des cellules ou des milieux de culture ont été extraits selon une méthode dérivée de celle de Folch et col. (J. Biol. Chem. 1957 ; 226: 497-509) telle que modifiée par Grandgirard et col. J. Chromatogr. A. 2004 ; 1040: 239-50).  The total lipids of the cells or culture media were extracted according to a method derived from that of Folch et al. (J. Biol Chem 1957, 226: 497-509) as modified by Grandgirard et al. J. Chromatogr. A. 2004; 1040: 239-50).
Les lipides ont été saponifiés pendant 16 heures, à température ambiante, sous atmosphère d'argon, dans l'obscurité, avec 1 M d'hydroxyde de potassium méthanolique.  The lipids were saponified for 16 hours at room temperature under an argon atmosphere in the dark with 1M methanolic potassium hydroxide.
La fraction non saponifiée a été extraite avec l'ester méthylique de tert- butyle. Ensuite, un aliquot de cette fraction a été transformé en triméthylsilyléthers et injecté dans un appareil de chromatographie en phase gazeuse pour quantifier le cholestérol.  The unsaponified fraction was extracted with tert-butyl methyl ester. Then an aliquot of this fraction was converted to trimethylsilyl ethers and injected into a gas chromatograph to quantify cholesterol.
Les oxystérols ont été purifiés sur cartouches de silice (LC-Si SPE 3 ml; Supelco, Sigma Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France) selon la méthode de Lai et col. (Journal of Agriculture and Food Chemistry 1995; 43 : 1 122-1 126) modifié comme suit : le cholestérol et les autres contaminants ont été éliminées à l'aide de 35ml d'un mélange Hexane - ester méthylique de tert-butyle (90:10, v / v) et de 15 ml d'un mélange Hexane - ester méthylique de tert-butyle (80:20, v / v). Les oxystérols ont ensuite été récupérées à l'aide de 5ml d'acétone. Après l'évaporation de l'acétone, les échantillons ont été transformés en dérivés de triméthylsilyle avec de la pyridine et un mélange de N,O,bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide-trimethyl chlorosilane (99:1 , v / v) à 60°C pendant 30 min.  The oxysterols were purified on silica cartridges (LC-Si SPE 3ml, Supelco, Sigma Aldrich, The Isle of Abeau Chesnes, France) according to the method of Lai et al. (Journal of Agriculture and Food Chemistry 1995; 43: 1112-1126) modified as follows: cholesterol and other contaminants were removed using 35 ml of a mixture of hexane-tert-butyl methyl ester (90%). 10, v / v) and 15 ml of Hexane-tert-butyl methyl ester (80:20, v / v). The oxysterols were then recovered using 5 ml of acetone. After evaporation of the acetone, the samples were transformed into trimethylsilyl derivatives with pyridine and a mixture of N, O, bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide-trimethyl chlorosilane (99: 1, v / v) at 60 ° C for 30 min.
Les composants volatiles ont été évaporés sous azote et le résidu obtenu est dissous dans de l'hexane et analysés par chromatographie en phase gazeuse comme suit. Le cholestérol et les oxystérols ont été analysés en utilisant un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard 5890 Série II (Agilent, Massy-Palaiseau, France) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme à 300°C. Ils ont été quantifiés à l'aide de 5a-cholestane comme standard interne. La colonne utilisée était une "DB5-MS fused silica capillary column" (épaisseur de film : 0,25 pm, 30 m χ 0,25 mm de diamètre) (J & W Scientific, Folsom, CA, USA). Le gaz porteur était l'hélium. Après 1 min à 50°C, la température du four a été porté à 275°C à raison de 20°C / min, puis à raison de 1°C / min jusqu'à atteindre 290°C. The volatile components were evaporated under nitrogen and the resulting residue was dissolved in hexane and analyzed by gas chromatography as follows. Cholesterol and oxysterols were analyzed using a Hewlett-Packard 5890 Series II gas chromatograph (Agilent, Massy-Palaiseau, France) equipped with a flame ionization detector at 300 ° C. They were quantified using 5a-cholestane as an internal standard. The column used was a "DB5-MS fused silica capillary column" (film thickness: 0.25 μm, 30 μm × 0.25 mm diameter) (J & W Scientific, Folsom, CA, USA). The carrier gas was helium. After 1 min at 50 ° C, the oven temperature was raised to 275 ° C at 20 ° C / min, then at 1 ° C / min to 290 ° C.
Les données de chromatographie ont été traitées en utilisant le logiciel Galaxie (Varian, Les Ulis, France).  Chromatography data were processed using Galaxie software (Varian, Les Ulis, France).
Culture cellulaire et préparation de membranes Cell culture and membrane preparation
La lignée cellulaire de fibroblastes de souris NIH 3T3 a été maintenue dans un milieu de culture DMEM (Invitrogen, USA) complété avec 10% de sérum de veau fœtal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine à 37°C en atmosphère à 5% C02 saturée en eau. The mouse fibroblast cell line NIH 3T3 was maintained in a DMEM culture medium (Invitrogen, USA) supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin at 37 ° C. in a 5% C0 2 atmosphere saturated with water.
Les cellules ont été cultivées en monocouche à confluence 90-100% et soumises à pas plus de 20 passages cellulaires avec repiquage tous les 4/5 jours.  The cells were cultured in 90-100% confluent monolayer and subjected to no more than 20 cell passages with subculturing every 4/5 days.
Pour les expériences de quantification des protéines exprimées par les membranes, les cellules NIH-3T3 ont été cultivées en boîtes de Pétri de 100 mm Lorsque les cultures sont parvenues au stade de monocouches subconfluentes les boîtes de Pétri ont été mises sur la glace et toutes les étapes subséquentes pour préparer des extraits de membrane ont été réalisées à 4 °C.  For membrane-expressed protein quantification experiments, NIH-3T3 cells were cultured in 100 mm petri dishes. When the cultures reached the stage of subconfluent monolayers the Petri dishes were put on ice and all Subsequent steps to prepare membrane extracts were performed at 4 ° C.
Les monocouches cellulaires sont rincées deux fois avec du PBS froid puis rapidement rincés à l'eau froide.  The cell monolayers are rinsed twice with cold PBS and then rapidly rinsed with cold water.
Les cellules sont ensuite incubées avec 1 ml de tampon Tris 100 mM hypotonique contenant 1 mM EDTA et un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase (Complète, Roche) pendant 5min avant d'être récoltées dans un microtube 1 ,5 ml et brisées par passages successifs à travers une aiguille 4 / 10.  The cells are then incubated with 1 ml of hypotonic 100 mM Tris buffer containing 1 mM EDTA and a cocktail of phosphatase inhibitors (Complete, Roche) for 5 min before being harvested in a 1.5 ml microtube and broken by successive passages. through a needle 4/10.
Après 10 minutes de centrifugation à 5000g afin de culoter les noyaux, le surnageant est centrifugé à 18 000g pendant 1h et le culot de membranes obtenu a été resuspendu dans 80-100 pL de tampon hypotonique (HB) contenant un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase et conservé à -80 °C jusqu'à ce que les études de caractérisation des protéines par western blot soient réalisées.  After 10 minutes of centrifugation at 5000 g to pellet the nuclei, the supernatant is centrifuged at 18 000 g for 1 h and the resulting pellet was resuspended in 80-100 μl of hypotonic buffer (HB) containing a cocktail of phosphatase inhibitors and stored at -80 ° C until western blot protein characterization studies are performed.
Le contenu en protéines des culots a été quantifié par la méthode de Bradford (kit Bio-Rad).  The protein content of the pellets was quantified by the Bradford method (Bio-Rad kit).
Culture de levures et la préparation des membranes La souche K699 de S. cerevisiae (Mata, ura3, et leu 2-3) a été transformée avec le plasmide YEpPMAhPtc-MAP (Joubert et col.. 2009, BBA Biomembrane, 1788: 1813-1821 ; 2010, Methods in Molecular Biology, Humana Press, Mus-Veteau (Ed.), 601 : 87-103 ) par la procédure de l'acétate de lithium et étalées dans des boites de culture contenant un milieu minimal et un mélange d'acides aminés sans leucine. Yeast culture and membrane preparation S. cerevisiae strain K699 (Mata, ura3, and leu 2-3) was transformed with plasmid YEpPMAhPtc-MAP (Joubert et al., 2009, BBA Biomembrane, 1788: 1813-1821; 2010, Methods in Molecular Biology , Humana Press, Mus-Veteau (Ed.), 601: 87-103) by the lithium acetate procedure and plated in culture dishes containing minimal medium and a mixture of amino acids without leucine.
Les clones ont été pré-cultivés à 30°C jusqu'à une densité optique à 600 nm (DO60o) de 3 sur un milieu minimum (MM) (0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,3 mM adénine, 0,5 mM uracile, 0,3 mM tyrosine et d'un mélange d'acides aminés dépourvu de leucine) additionné de 2% de D-glucose. The clones were pre-cultured at 30 ° C to an optical density at 600 nm ( 60 ° OD) of 3 on a minimum medium (MM) (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0, 3 mM adenine, 0.5 mM uracil, 0.3 mM tyrosine and a mixture of amino acids lacking leucine) supplemented with 2% D-glucose.
Cette préculture est ensuite diluée à une DO600 de 0, 1-0,2 dans un milieu complet (extrait de levure, bactopeptone, adénine) à 2% de D-glucose et cultivée à 18°C sous agitation à 200 tr / min jusqu'à une DO600 de 5-7. This preculture is then diluted to an OD 600 of 0.1-0.2 in complete medium (yeast extract, bactopeptone, adenine) containing 2% D-glucose and cultured at 18 ° C. with stirring at 200 rpm. up to an OD 600 of 5-7.
Pour la préparation des membranes, toutes les mesures ont été effectuées à 4°C.  For the preparation of the membranes, all measurements were carried out at 4 ° C.
Les levures ont été lavées à l'eau froide, remises en suspension dans 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCI, 2,5 mM EDTA, 1 mM PMSF et 4 mM benzamidine, et brisé deux fois par agitation au vortex pendant 15 min en présence de perles de verre (425 à 600 pm, Sigma).  The yeasts were washed with cold water, resuspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 1 mM PMSF and 4 mM benzamidine, and broken twice by vortexing for 15 minutes in the presence of glass beads (425-600 μm, Sigma).
Les levures non cassées et les perles de verre ont été éliminées par centrifugation pendant 5 min à 2000 g.  Unbroken yeasts and glass beads were removed by centrifugation for 5 min at 2000 g.
Les membranes ont été collectées par centrifugation du surnageant obtenu pendant 1 h à 100 000 g.  The membranes were collected by centrifugation of the supernatant obtained for 1 h at 100,000 g.
Le culot a été lavé deux fois dans le même tampon sans EDTA et remis en suspension à 5 mg / ml dans un tampon de solubilisation contenant 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCI, 10% de glycérol, 1 mM PMSF et 4 mM benzamidine.  The pellet was washed twice in the same buffer without EDTA and resuspended at 5 mg / ml in solubilization buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10% glycerol mM PMSF and 4 mM benzamidine.
Electrophorèse sur gel et western blot  Gel electrophoresis and western blot
Les protéines contenues dans les échantillons ont été séparées par électrophorèse sur gel SDS/polyacrylamide 8% (8% SDS-PAGE) et transférées sur membrane de nitrocellulose (Amersham) en utilisant des techniques standards. Les membranes de nitrocellulose ont d'abord été bloquées 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage (20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 450 mM NaCI, 0,1 % Tween-20, 4% de lait écrémé), puis mises en contact pendant la nuit à 4°C avec soit un anticorps monoclonal de souris anti-HA (obtenu au laboratoire à partir d'hybridomes, dilution 1 :20 (Joubert et col. 2009)), soit des anticorps polyclonaux de lapin anti-PTC (dilution 1 :1000) et anti-Smo (dilution 1 :3000) (Joubert et col. 2009). The proteins contained in the samples were separated by SDS / 8% polyacrylamide gel electrophoresis (8% SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham) using standard techniques. The nitrocellulose membranes were first blocked for 1 h at room temperature in blocking buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 450 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 4% skim milk ), then contacted overnight at 4 ° C with either a mouse anti-HA monoclonal antibody (obtained in the laboratory from hybridomas, 1:20 dilution (Joubert et al., 2009)), or polyclonal antibodies rabbit anti-PTC (1: 1000 dilution) and anti-Smo (1: 3000 dilution) (Joubert et al., 2009).
Les membranes de nitrocellulose ont ensuite été lavées deux fois dans le tampon de blocage. Des anticorps secondaires polyclonaux de chèvre, antisouris (dilution 1 :5000) ou anti-lapin (dilution 1 :3000) couplés à la peroxydase de raifort (Dako) ont ensuite été appliqués pendant 2 h à 4°C. La révélation des réactions a été réalisée en utilisant le kit ECL (Millipore), et un système de détection de chimioluminescence pour le Western blot Fusion FX7® (Vilber- Lourmat). The nitrocellulose membranes were then washed twice in the blocking buffer. Polyclonal secondary antibodies of goat, anti-mouse (1: 5000 dilution) or anti-rabbit (1: 3000 dilution) coupled to horseradish peroxidase (Dako) were then applied for 2 hours at 4 ° C. The revelation of reactions was performed using the ECL kit (Millipore) and a chemiluminescence detection system for the Western blot Fusion FX7 ® (Vilber- Lourmat).
Le Bodipy-cholestérol provient de la société Avanti (Topfluor, Avanti). Les aliquots à 5 mM de BodCH dans le DMSO ont été stockés congelés.  Bodipy-cholesterol comes from the company Avanti (Topfluor, Avanti). The 5 mM aliquots of BodCH in DMSO were stored frozen.
Mesure de l'efflux du BodCH Efflux measurement of BodCH
- NIH3T3 : pour les expériences d'efflux de BodCH, des cellules NIH 3T3 ont été ensemencées sur dans les puits de plaques 24 puits à raison de 250pL/puits de Bo-chol à 2,5μΜ (société Avanti (Topfluor, Avanti), aliquoté à 5 mM dans le DMSO stockés congelés) en milieu de culture pendant 2 heures à 37°C.  NIH3T3: for the BodCH efflux experiments, NIH 3T3 cells were inoculated into the wells of 24-well plates at the rate of 250 μl / well of Bo-chol at 2.5 μΜ (Avanti (Topfluor, Avanti), 5mM aliquot in DMSO stored frozen) in culture medium for 2 hours at 37 ° C.
Après double rinçage avec 500μί de tampon NaCI (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCI2, 1 mM MgSO4, 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4) pour éliminer les molécules fluorescentes non fixées, les efflux ont été initiés par l'addition de 250pL de tampon en l'absence ou en présence de 30 nM de Shh.  After double rinsing with 500 μl of NaCl buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4) to remove unfixed fluorescent molecules, the efflux was initiated by the addition of 250 μL of buffer in the absence or presence of 30 nM Shh.
Les cellules ont été incubées pendant 1 h à 37°C sous agitation à 50 tr / min et les surnageants prélevés.  The cells were incubated for 1 h at 37 ° C with shaking at 50 rpm and the supernatants removed.
Après une centrifugation (5mn à 6800g) pour éliminer tout fragment de cellule, la lecture de la fluorescence (exc 490-1 Onm ; em 520-20nm) a été réalisée sur 200 μί de surnageant dans un lecteur de plaque (FLUOstar, Labtech). A la fin des expériences, le Bo-Chol restant dans les cellules a été déterminé en comptant le reste de fluorescence dans les cellules après solubilisation avec du SDS 0,5%. After centrifugation (5mn at 6800g) to remove any cell fragment, the fluorescence reading (exc 490-1 Onm; em 520-20nm) was performed on 200 μί of supernatant in a plate reader (FLUOstar, Labtech) . At the end of the experiments, the Bo-Chol remaining in the cells was determined by counting the fluorescence residue in the cells after solubilization with 0.5% SDS.
- Levure : des levures exprimant hPtc ont été pré-cultivées à 30°C jusqu'à une DO60o de 3 sur un milieu minimal (0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,3 mM adénine, 0,5 mM uracile, 0,3 mM tyrosine et d'un mélange d'acides aminés dépourvu de leucine) additionné de 2 % de D- glucose. Cette préculture est ensuite diluée à D060o de 0,2 dans un milieu complet (extrait de levure, bactopeptone, adénine), 2% de D-glucose (ou 2% de galactose pour les vecteurs YEpGAL) et cultivées à 18°C sous agitation (200 tr/min) jusqu'à une DO60o de 3-6. Simultanément la souche K699 de Saccharomyces cerevisiae (Mata, ura3, et leu 2-3) a été cultivée en milieu complet pour effectuer des mesures de contrôle d'efflux dans les mêmes conditions. Yeast: yeasts expressing hPtc were pre-cultured at 30 ° C to an OD 60 o of 3 on minimal medium (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.3 mM adenine, 5 mM uracil, 0.3 mM tyrosine and a mixture of amino acids lacking leucine) supplemented with 2% D-glucose. This preculture is then diluted to OD 60 of 0.2 in complete medium (yeast extract, bactopeptone, adenine), 2% of D-glucose (or 2% of galactose for YEpGAL vectors) and cultured at 18 ° C. with stirring (200 rpm) to an OD 60 o of 3-6. Simultaneously Saccharomyces cerevisiae strain K699 (Mata, ura3, and leu 2-3) was cultured in complete medium to perform efflux control measures under the same conditions.
Pour les mesures d'efflux, les cellules de deux cultures en croissance exponentielle (DO60o : 3-6) de K699 et de clones exprimant PTC ont été simultanément recueillies par centrifugations (5mn, 3000g), lavées 4 fois à l'eau et finalement remises en suspension avec soin à une D060o de 10 dans du tampon 50 mM NaOH-Hepes (pH 7,0). For the efflux measurements, the cells of two exponentially growing cultures (OD 60 o: 3-6) of K699 and clones expressing PTC were simultaneously collected by centrifugations (5mn, 3000g), washed 4 times with water. and finally resuspended with care at a 60% OD of 10 in 50 mM NaOH-Hepes buffer (pH 7.0).
5 μιη de Bo-Chol ont ensuite été ajoutés aux cellules pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Les cellules sont ensuite lavées rapidement et 1 ,6 mL de suspensions de levures à DO60o de 10 ont ensuite été incubés à température ambiante pendant 20min en microtubes Eppendorf de 2 mL sous agitation. Les mesures d'efflux de Bo-Chol ont été réalisées en triple sur 250pL de suspension de levure. 5 μιη of Bo-Chol were then added to the cells for 2 hours at room temperature with stirring. The cells are then washed rapidly and 1.6 ml of 60% OD yeast suspensions of 10 are then incubated at room temperature for 20 minutes in 2 ml Eppendorf microtubes with stirring. The efflux measurements of Bo-Chol were carried out in triplicate on 250 μl of yeast suspension.
Après centrifugation (10 000g, 3mn), la lecture de la fluorescence (exc 490-1 Onm ; em 520-20nm) a été réalisée sur 200 pL de surnageant dans un lecteur de plaque (FLUOstar, Labtech).  After centrifugation (10,000 g, 3 min), the fluorescence reading (exc 490-1 Onm; em 520-20 nm) was performed on 200 μl of supernatant in a plate reader (FLUOstar, Labtech).
À la fin de l'expérience, la fluorescence restant dans la levure a été déterminée après une exposition à un tampon 0,5% SDS, 50 mM NaOH-Hepes (pH 7,0).  At the end of the experiment, the fluorescence remaining in the yeast was determined after exposure to 0.5% SDS buffer, 50 mM NaOH-Hepes (pH 7.0).
Purification de hPtc et hSmo  HPtc and hSmo purification
hPtc a été produit dans la levure S. cerevisiae et purifiée comme décrit par Joubert et col. en 2009. Après la solubilisation des préparations de membranes de levures avec 1% de dodécyl-P-D-maltoside, la purification des protéines a été réalisée par le biais d'une résine Sepharose calmoduline.. hPtc was produced in S. cerevisiae yeast and purified as described by Joubert et al. in 2009. After the solubilization of the preparations of yeast membranes with 1% dodecyl-PD-maltoside, the protein purification was carried out through a calmodulin Sepharose resin.
Résonance plasmonique de surface (SPR) Surface plasmon resonance (SPR)
Les mesures de SPR ont été réalisées sur un Biacore 3000 (Biacore / GE Healthcare Uppsala, Suède) avec une puce CM5 Biacore / GE Healthcare. Une solution mère de thiocholesterol dans le DMSO (1 mg / mL) a été préparée et diluée 1 :50 dans du tampon borate de sodium pH 8,5 pour le couplage covalent des thiols sur la puce d'un capteur CM5. La cellule de mesure 2 (Fc2) a été activée avec 200 mM de N-éthyl-N-(3-diméthylaminopropyl) - carbodiimide (EDC) et 50 mM de N-hydroxysuccinimide (NHS), et 100 pL (50 pg) de thiocholesterol ont été injectés à 10 pL/min. Le couplage a été complété par injection de cystéine.  The SPR measurements were performed on a Biacore 3000 (Biacore / GE Healthcare Uppsala, Sweden) with a CM5 Biacore / GE Healthcare chip. A stock solution of thiocholesterol in DMSO (1 mg / mL) was prepared and diluted 1: 50 in sodium borate buffer pH 8.5 for the covalent coupling of the thiols on the chip of a CM5 sensor. Measuring cell 2 (Fc2) was activated with 200 mM N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), and 100 μL (50 μg) of thiocholesterol were injected at 10 μl / min. Coupling was completed by cysteine injection.
La surface a été désactivée avec de l'éthanolamine.  The surface has been deactivated with ethanolamine.
La cellule de mesure 1 (FC1) a été activée et désactivée, et utilisée comme une cellule d'écoulement de référence.  Measuring cell 1 (FC1) was turned on and off, and used as a reference flow cell.
Les surfaces sont ensuite lavées avec trois injections de 50 mM NaOH (15 pL à 5 pL/min).  The surfaces are then washed with three injections of 50 mM NaOH (15 μL at 5 μL / min).
Les expériences sur hPtc purifiée ont été effectuées à 10°C.  The experiments on purified hPtc were performed at 10 ° C.
Le tampon de purification de hPtc a été utilisé comme tampon de course au cours des expériences.  The hPtc purification buffer was used as a run buffer during the experiments.
50 pL de hPtc purifiée ont été injectés à la fois sur la référence (FC1) et la cellule d'écoulement couplée au Thiocholesterol (FC2) à un débit de 10 pLAnin.  50 μl of purified hPtc were injected on both the reference (FC1) and the Thiocholesterol-coupled flow cell (FC2) at a rate of 10 μLin.
La différence entre les sensorgrammes enregistrés sur FC2 et FC1 a été mesurée. La surface du capteur à puce a été régénérée deux fois avec 20 pL de NaOH 50 mM, SDS 0,05% à 20 pL/min.  The difference between the sensorgrams recorded on FC2 and FC1 was measured. The chip sensor surface was regenerated twice with 20 μl of 50 mM NaOH, 0.05% SDS at 20 μl / min.
Les expériences sur hSmo purifiée ont été effectuées à 10°C. Les différences entre les sensorgrammes enregistrées sur chaque cellule d'écoulement couplé au Thiocholesterol et sur Fc1 ont été signalées et analysés en utilisant un logiciel BiaEva.  The experiments on purified hSmo were performed at 10 ° C. The differences between the sensorgrams recorded on each Thiocholesterol coupled flow cell and on Fc1 were reported and analyzed using BiaEva software.
Quantification des protéines Quantification of proteins
Les protéines ont été quantifiées à l'aide du kit de dosage de protéines Bio-Rad.  Proteins were quantified using the Bio-Rad Protein Assay Kit.
Exemple 1 : Un traitement par la protéine Sonic Hedgehog augmente la concentration intracellulaire en cholestérol. Afin de savoir si l'activation induite par la voie Hh entraîne une modification dans le contenu des stérols cellulaires et afin d'identifier les stérols touchés, une analyse du contenu en stérols de deux lignées cellulaires Shh sensibles, des fibroblastes de souris NIH3T3 et des cellules de la lignée cellulaire humaine d'adénocarcinome du côlon grade II HT29, cultivées en présence et en l'absence de Shh pure dans le milieu de culture, a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse (GC) et par spectrométrie de masse. Example 1 Treatment with Sonic Hedgehog Protein Increases Intracellular Cholesterol Concentration To determine if Hh-induced activation results in a change in the content of the cell sterols and to identify the affected sterols, an analysis of the sterol content of two sensitive Shh cell lines, NIH3T3 mouse fibroblasts and cells of the human colon II adenocarcinoma cell line HT29, grown in the presence and absence of pure Shh in the culture medium, was performed by gas chromatography (GC) and mass spectrometry.
La quantification du cholestérol contenu dans les milieux extracellulaires et dans les extraits cellulaires totaux a montré que le traitement par Shh conduit à une augmentation significative du cholestérol intracellulaire (Fig. 1A) et à une diminution de la quantité de cholestérol dans le milieu extracellulaire (Fig. 1 B) pour les deux lignées cellulaires.  Quantification of cholesterol in extracellular media and in total cell extracts showed that Shh treatment leads to a significant increase in intracellular cholesterol (Fig. 1A) and a decrease in the amount of cholesterol in the extracellular medium (Fig 1 B) for both cell lines.
Ces résultats indiquent que le traitement Shh a modifié les concentrations en cholestérol intra- et extra-cellulaire de ces deux lignées cellulaires.  These results indicate that Shh treatment altered the intra- and extra-cellular cholesterol levels of these two cell lines.
L'augmentation de 15 à 18% de la quantité de cholestérol intracellulaire induite par le traitement Shh est surprenante puisque la concentration de cholestérol cellulaire est bien connue pour être étroitement contrôlée (Brown MS et Golstein JL, J. of Lip. Res. 2009).  The 15 to 18% increase in the amount of intracellular cholesterol induced by Shh treatment is surprising since the concentration of cellular cholesterol is well known to be tightly controlled (Brown MS and Golstein JL, J. of Lip, Res 2009). .
Exemple 2 : Des variations de concentration en cholestérol affectent la stabilisation de Smoothened à la membrane plasmique.  Example 2: Changes in cholesterol concentration affect Smoothened stabilization at the plasma membrane.
Afin de savoir si la variation de la concentration en cholestérol a un effet sur la voie Hh et à quel niveau, l'effet du traitement de fibroblastes NIH3T3 avec du cholestérol ou de la lovastatine, un inhibiteur de la biosynthèse du cholestérol, a été analysé.  In order to know if the change in cholesterol concentration has an effect on the Hh pathway and at what level, the effect of treating NIH3T3 fibroblasts with cholesterol or lovastatin, an inhibitor of cholesterol biosynthesis, was analyzed .
De la protéine Shh pure, de la purmorphamine agoniste de Smo, du cholestérol et un mélange Shh/lovastatine ont été ajoutés dans les cultures cellulaires six heures avant la récolte et la préparation des membranes. La quantité de Smo endogène stabilisé au niveau de la membrane plasmique des cellules est augmentée en présence de cholestérol dans le milieu de culture comme lorsque les cellules ont été traitées avec de la protéine Shh pure ou de la purmorphamine (Fig. 2). A l'inverse, le traitement à la lovastatine inhibe fortement la stabilisation de Smo à la surface cellulaire normalement induite par la présence de la protéine Shh dans le milieu. La stabilisation de Smo au niveau de la membrane plasmique des cellules est une étape critique de l'activation de la voie Hh chez la drosophile et chez les mammifères. Pure Shh protein, Smo agonist purmorphamine, cholesterol, and Shh / lovastatin mixture were added to cell cultures six hours before harvest and membrane preparation. The amount of endogenous Smo stabilized at the plasma membrane of the cells is increased in the presence of cholesterol in the culture medium as when the cells were treated with pure Shh protein or purmorphamine (Fig. 2). Conversely, treatment with lovastatin strongly inhibits the Smo stabilization at the cell surface normally induced by the presence of the Shh protein in the medium. The stabilization of Smo at the level of the plasma membrane of cells is a critical step in activation of the Hh pathway in Drosophila and in mammals.
Ce résultat suggère que le cholestérol est nécessaire à la stabilisation de Smo au niveau de la membrane plasmique des cellules et par conséquent nécessaire pour l'activation de la voie Hh.  This result suggests that cholesterol is necessary for the stabilization of Smo at the plasma membrane of cells and therefore necessary for activation of the Hh pathway.
Exemple 3 : La protéine Patched humaine exprimée dans la levure fixe le cholestérol et favorise son efflux  Example 3: The human Patched protein expressed in yeast binds cholesterol and promotes its efflux
Afin de déterminer le lien existant entre la protéine Patched et le cholestérol et de savoir si Patched a la capacité de transporter le cholestérol, un modèle fonctionnel d'expression de la protéine Patched humaine (hPtc) dans la levure Saccharomyces cerevisiae a été mis au point. Il a permis de montrer que la purification de la protéine issue de cette expression est possible et que hPtc est capable de se lier à la protéine Shh (son ligand naturel) aussi bien dans les membranes de levure que dans une solution de tensioactif après purification (Joubert et col. 2009).  In order to determine the relationship between Patched protein and cholesterol and whether Patched has the capacity to transport cholesterol, a functional model of expression of human Patched Protein (hPtc) in yeast Saccharomyces cerevisiae was developed. . It has been shown that the purification of the protein resulting from this expression is possible and that hPtc is able to bind to the protein Shh (its natural ligand) both in the yeast membranes and in a solution of surfactant after purification ( Joubert et al., 2009).
La capacité de la protéine hPtc à se lier au cholestérol a d'abord été étudiée par résonance plasmonique de surface (SPR).  The ability of the hPtc protein to bind to cholesterol was first studied by surface plasmon resonance (SPR).
Des levures exprimant hPtc ont été cultivées. La fraction membranaire a été préparée (Fig. 3A) et la protéine hPtc purifiée.  Yeasts expressing hPtc were cultured. The membrane fraction was prepared (Fig. 3A) and purified hPtc protein.
La protéine hPtc purifiée a été injectée sur une puce de capteur Biacore dont une cellule d'écoulement a été couplée de façon covalente à du thiocholestérol et l'autre juste activée sans thiocholestérol pour l'étude de la fixation non-spécifique (contrôle). Le sensorgramme enregistré (résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle) montre une liaison claire de hPtc au cholestérol (Fig. 3B).  The purified hPtc protein was injected onto a Biacore sensor chip, one flow cell of which was covalently coupled to thiocholesterol and the other just activated without thiocholesterol for the study of nonspecific binding (control). The recorded sensorgram (resulting from the difference between thiocholesterol-coupled flow cell binding and control) shows a clear binding of hPtc to cholesterol (Figure 3B).
Puis de la protéine hPTC pure a été incubée avec de la protéine Shh pure et le mélange a été injecté sur les cellules d'écoulement. Une diminution de fixation de la protéine hPtc au cholestérol est observée.  Then pure hPTC protein was incubated with pure Shh protein and the mixture was injected onto the flow cells. A decrease in binding of the hPtc protein to cholesterol is observed.
La liaison de la protéine hPtc au cholestérol diminue avec la concentration en protéine Shh. Une constante d'inhibition (Ki) de 0,83 + / - 0,2 nM a pu être calculée (Fig. 3B), correspondant à l'affinité de la protéine Shh pour la protéine hPtc (Joubert et col. 2009). Ces résultats montrent que la protéine Patched se lie directement au cholestérol et que l'interaction de la protéine Shh avec la protéine hPtc perturbe cette liaison à travers un changement de conformation ou l'obstruction du site de liaison du cholestérol. La capacité de transport du cholestérol par la protéine hPtc a ensuite été étudiée. Des levures de contrôle et des levures exprimant hPtc ont été incubées avec un dérivé fluorescent de cholestérol, le BOPIDY-cholestérol (Bo-Chol). La mesure de la fluorescence de Bo-Chol dans le milieu après lavage des cellules et la remise en suspension ont montré que la présence de la protéine hPtc augmente considérablement l'efflux de Bo-Chol de la levure (Fig. 3C). The binding of the hPtc protein to cholesterol decreases with the concentration of Shh protein. An inhibition constant (Ki) of 0.83 +/- 0.2 nM could be calculated (Fig. 3B), corresponding to the affinity of the Shh protein for the hPtc protein (Joubert et al., 2009). These results show that the Patched protein binds directly to cholesterol and that the interaction of the Shh protein with the hPtc protein disrupts this binding through a conformational change or obstruction of the cholesterol binding site. The transport capacity of cholesterol by the hPtc protein was then studied. Yeasts of control and yeasts expressing hPtc were incubated with a fluorescent derivative of cholesterol, BOPIDY-cholesterol (Bo-Chol). Measurement of Bo-Chol fluorescence in the medium after washing the cells and resuspension showed that the presence of the hPtc protein greatly increases the Bo-Chol efflux of the yeast (Figure 3C).
Ces résultats montrent que la protéine Patched humaine, exprimée dans S. cerevisiae est capable de se lier au cholestérol et de favoriser son efflux de la cellule.  These results show that the human Patched protein, expressed in S. cerevisiae is able to bind to cholesterol and promote its efflux of the cell.
Exemple 4 : La Protéine Patched endogène favorise l'efflux de cholestérol dans des fibroblastes de souris  Example 4: Endogenous Patched Protein Promotes Cholesterol Efflux in Mouse Fibroblasts
Afin de vérifier si la protéine Patched possède la même fonction dans le système endogène, des fibroblastes de souris NIH3T3 ont été cultivées dans des plaques 24 puits à confluence, puis incubés deux heures avec du Bo-Chol et lavés.  In order to verify whether the Patched protein has the same function in the endogenous system, NIH3T3 mouse fibroblasts were grown in 24-well confluent plates, then incubated for two hours with Bo-Chol and washed.
Du tampon PBS contenant ou non de la protéine Shh pure a été ajouté et la fluorescence du surnageant de chaque puits a été mesurée une heure après.  PBS buffer containing or not containing pure Shh protein was added and the fluorescence of the supernatant of each well was measured one hour later.
Les quantités de Bo-Chol étaient significativement plus faibles dans les puits contenant la protéine Shh (Fig. 4A), suggérant que le traitement par la protéine Shh réduit l'efflux du Bo-Chol.  The amounts of Bo-Chol were significantly lower in wells containing the Shh protein (Fig. 4A), suggesting that treatment with Shh protein reduces Bo-Chol efflux.
Des cellules cultivées sur des lamelles ont été incubées avec du Bo-Chol, lavées, suspendues une heure dans du tampon PBS contenant ou non de la protéine Shh, fixées et observées par microscopie à fluorescence en utilisant le système DeltaVision (figure 4B). La quantification de la fluorescence BODIPY contenues dans les cellules a montré que les cellules en suspension dans un tampon contenant une protéine Shh représentent 58% de la fluorescence contenue dans les cellules en suspension dans un tampon contenant une protéine Shh.  Cells grown on slides were incubated with Bo-Chol, washed, suspended for one hour in PBS buffer containing or not Shh protein, fixed and observed by fluorescence microscopy using the DeltaVision system (Figure 4B). Quantification of the BODIPY fluorescence contained in the cells showed that the cells in suspension in a buffer containing a Shh protein represent 58% of the fluorescence contained in the cells in suspension in a buffer containing a Shh protein.
Ces résultats montrent que Shh modifie la quantité de Bo-Chol dans les cellules et dans le milieu extracellulaire, de manière concomitante.  These results show that Shh modifies the amount of Bo-Chol in the cells and in the extracellular medium concomitantly.
Ces résultats sont compatibles avec une fonction d'efflux de cholestérol pour la protéine Patched dans des fibroblastes de souris :  These results are consistent with a cholesterol efflux function for Patched protein in mouse fibroblasts:
- en l'absence de la protéine Shh, Patched est au niveau de la membrane plasmique et favorise l'efflux de Bo-Chol ; - en présence de Shh, Patched est internalisée dans les endosomes et ne favorise pas l'efflux de Bo-Chol, expliquant ainsi que la quantité de Bo-Chol a diminué dans le milieu extracellulaire et augmenté dans le milieu intracellulaire. in the absence of the Shh protein, Patched is at the level of the plasma membrane and promotes the efflux of Bo-Chol; in the presence of Shh, Patched is internalized in endosomes and does not promote Bo-Chol efflux, thus explaining that the amount of Bo-Chol decreased in the extracellular medium and increased in the intracellular medium.
Ceci est en accord parfait avec les variations des concentrations de cholestérol mesurées par chromatographie en phase gazeuse sur des fibroblastes de souris et des cellules d'adénocarcinome du côlon (Fig. 1).  This is in perfect agreement with the changes in cholesterol concentrations measured by gas chromatography on mouse fibroblasts and colon adenocarcinoma cells (Fig. 1).
Exemple 4 : La protéine Patched et le Bo-Chol sont co-localisés au niveau de la membrane plasmique des cellules en l'absence de Shh EXAMPLE 4 The Patched Protein and Bo-Chol are Co-Localized at the Plasma Membrane of the Cells in the Absence of Shh
Des fibroblastes de souris NIH3T3 ont été cultivés sur des lamelles, incubés avec du Bo-Chol, puis avec un milieu contenant (+) ou non (-) de la protéine Shh. Après trois heures, les cellules ont été fixées, perméabilisées, incubées avec un anticorps anti-Patched et observées par microscopie confocale.  NIH3T3 mouse fibroblasts were cultured on slides, incubated with Bo-Chol, then with a medium containing (+) or not (-) of the Shh protein. After three hours, the cells were fixed, permeabilized, incubated with anti-Patched antibody and observed by confocal microscopy.
En l'absence de la protéine Shh (-Shh) le Bo-Chol est concentré au niveau de la membrane plasmique des cellules (A).  In the absence of the Shh (-Shh) protein, Bo-Chol is concentrated at the level of the plasma membrane of the cells (A).
En l'absence de la protéine Shh (-Shh), Patched (détectée avec un anticorps marqué à la rhodamine (B)) est concentrée au niveau de la membrane plasmique et co-localisée avec Bo-Chol (C).  In the absence of the Shh (-Shh) protein, Patched (detected with a rhodamine-labeled antibody (B)) is concentrated at the plasma membrane and co-localized with Bo-Chol (C).
La co-localisation entre Patched et Bo-Chol est moins évidente en présence de la protéine Shh, les cellules présentant outre Patched et Bo-chol au niveau de la membrane, une concentration encore élevée de Bo-Chol dans le cytoplasme de la cellule.  Co-localization between Patched and Bo-Chol is less obvious in the presence of the Shh protein, cells exhibiting in addition to Patched and Bo-chol at the membrane level, an even higher concentration of Bo-Chol in the cytoplasm of the cell.
Ces résultats sont en accord avec une activité de fixation et d'efflux du cholestérol pour Patched.  These results are consistent with cholesterol binding and efflux activity for Patched.

Claims

REVENDICATIONS
1. ) Utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en cholestérol. 1.) Use of a modulator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament for regulating intracellular cholesterol concentration.
2. ) Utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le modulateur de l'activité de la protéine Patched est un activateur de l'activité de la protéine Patched et que le médicament est destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol.  2.) Use according to claim 1, characterized in that the modulator of the activity of the Patched protein is an activator of the activity of the Patched protein and that the drug is intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol.
3. ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir la polydactylie préaxiale, particulièrement chez l'humain.  3.) Use according to claim 2, characterized in that the drug is intended to prevent pre-axial polydactyly, particularly in humans.
4. ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir l'holoprosencéphalie.  4.) Use according to claim 2, characterized in that the drug is intended to prevent holoprosencephaly.
5. ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le médicament est destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour inhiber le développement des tumeurs survenant dans de nombreux tissus, avantageusement dans le poumon, l'œsophage, l'estomac, le pancréas, les voies biliaires, le sein, la prostate et le cerveau et donc réduire la masse tumorale.  5.) Use according to claim 2, characterized in that the medicament is intended to reduce the intracellular concentration of cholesterol to inhibit the development of tumors occurring in many tissues, preferably in the lung, esophagus, the stomach, the pancreas, bile ducts, breast, prostate and brain and thus reduce tumor mass.
6. ) Utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le modulateur de l'activité de la protéine Patched est un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched et que le médicament est destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol.  6.) Use according to claim 1, characterized in that the modulator of the activity of the Patched protein is an inhibitor of the activity of the Patched protein and the drug is intended to increase the intracellular concentration of cholesterol.
7. ) Utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir le syndrome de Gorlin.  7.) Use according to claim 6, characterized in that the drug is intended to prevent Gorlin syndrome.
8. ) Utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que le médicament est destiné à stimuler la réparation et/ou la régénération des cellules du système nerveux après une lésion et-/ou une maladie dudit système nerveux.  8.) Use according to claim 6, characterized in that the medicament is for stimulating the repair and / or regeneration of the cells of the nervous system after injury and / or disease of said nervous system.
9. ) Utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le médicament est destiné à moduler la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire. 9.) Use according to claim 1, characterized in that the medicament is intended to modulate the growth and structuring during the course of Embryonic development.
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