WO2012052629A2 - Biomarqueurs de tumorigénèse et applications pour l'obtention de composés anti-métastatiques - Google Patents

Biomarqueurs de tumorigénèse et applications pour l'obtention de composés anti-métastatiques Download PDF

Info

Publication number
WO2012052629A2
WO2012052629A2 PCT/FR2011/000559 FR2011000559W WO2012052629A2 WO 2012052629 A2 WO2012052629 A2 WO 2012052629A2 FR 2011000559 W FR2011000559 W FR 2011000559W WO 2012052629 A2 WO2012052629 A2 WO 2012052629A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cyc
cells
rhoa
metastatic
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2011/000559
Other languages
English (en)
Other versions
WO2012052629A3 (fr
Inventor
Jean-Marie Blanchard
Bénédicte LEMMERS
Nawal Bendris
Nikola Arsic
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2012052629A2 publication Critical patent/WO2012052629A2/fr
Publication of WO2012052629A3 publication Critical patent/WO2012052629A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57535—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the large intestine, e.g. colon, rectum or anus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4739—Cyclin; Prad 1

Definitions

  • the subject of the invention is tumorigenesis biomarkers and their applications for obtaining anti-metastatic compounds.
  • Metastasis is the central problem of cancer. Much research therefore focuses on the design of therapeutic compounds specifically anti-invasive to consider side effects lower than conventional anti-cancer.
  • Cyc A2 cyclin A2
  • the research carried out has made it possible to highlight an unexpected function of Cyc A2.
  • the cells acquire increased invasiveness through a decrease in RhoA activity.
  • the expression of Cyc A2 is detected in human primary tumors, but decreases in liver metastases from the same patients.
  • an inverse correlation between the cellular level of Cyc A2 and the invasiveness of the cells has been established.
  • the work carried out has shown that the acquisition of the invasiveness of the cells, following a Cyc A2 deficiency, is due to a decrease in the activity of the RhoA / ROCK pathway.
  • the RhoA / ROCK pathway is activated by the interaction between the amino-terminal portion of Cyc A2 and RhoA.
  • the restoration of this pathway obtained by reintroducing Cyc A2 in the deficient cells, makes it possible to reduce the invasiveness acquired by the cells.
  • the Cyc A2 / RhoA interaction therefore constitutes a preferred target for the screening of anti-metastatic compounds.
  • Mimetics, in terms of function, of the amino-terminal portion of Cyc A2, particularly peptide analogs, are drug candidates for anti-metastatic action.
  • the object of the invention is therefore to provide a specific biomarker for the invasiveness of cells, in particular for metastases.
  • the invention therefore relates to Cyc A2 for use as a biomarker specific to the invasive capacity of cancer cells of human or animal origin. More specifically, the invention is directed to the use of Cyc A2 as a predictive biomarker of metastases, a low level of Cyc A2 in cancer cells indicating a poor prognosis.
  • the invention thus also relates to a method for evaluating the invasiveness of cancer cells, characterized in that it comprises the detection of Cyc A2 level on biopsies, of human or animal origin, more particularly cell lysates derived from biopsies, the rate then being reported at the GAPDH level, or on sections of a tissue of human or animal origin, already qualified as cancerous, in comparison with pre-established tumors as strongly or weakly expressing Cyc A2. Therefore, a Cyc A2 deficiency or low expression of Cyc A2 will be associated with an invasive character of the cell.
  • the detection of the Cyc A2 level is advantageously carried out by Western Blot or, in the case of biopsies, by immunohistochemistry.
  • the invention thus provides the means of directing an anticancer treatment towards the necessity or not of heavy therapeutic treatments.
  • the invention provides a Cyc A2 composition for use as an anti-metastatic drug.
  • composition characterized in that it contains a therapeutically effective amount of Cyc A2 or its N-terminal part in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the cDNA encoding Cyc A2 has the sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention aims to use the Cyc A2 / RhoA interaction site as a target for the screening of anti-metastatic compounds capable of activating the RhoA / ROCK pathway.
  • a fourth aspect it relates to the use of the amino-terminal part of Cyc A2 and any peptide analogue (functional mimetic), as a drug candidate with anti-metastatic action.
  • Cycline A2 The N-terminal half of Cycline A2 was found to be the only one capable of restoring a normal distribution of actin in shRNAcycA2-treated cells. The region involved is reduced to the first 70 amino acids.
  • the amino-terminal portion of Cyc A2 and the fragments of this portion of 70, 140 and 196 amino acids are encoded by sequence cDNAs, respectively, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • Anti-metastatic compounds corresponding to mimetics of the amino-terminal portion of Cyc A2 are also within the scope of the invention.
  • the invention is directed in particular to peptides corresponding to mimetics of the amino-terminal part of Cyc A2 and exhibiting anti-metastatic properties.
  • the compounds are used in doses and routes of administration most appropriate for those skilled in the art in view of the intended applications.
  • FIGS. 1 to 7 represent, respectively,
  • FIG. 2 the correction of the cytoplasmic phenotype by Cyc A2 WT and the mutant Cyc A2 (Cyc A2 Mut).
  • a and B Immunofluorescence Analysis of the Organism of Actin-F in NIH3T3 Sh Cyc A2 Cells Not Transfected or Transfected by Cyc A2 WT, Cyc A2 Mut or Cyc A2 Mut Containing NLS of SV40 T Antigen (Cyc A2 Mut NLS).
  • B quantification of the percentage of NIH3T3 sh cells Cyc A2 showing a restoration of a normal actin cytoskeleton after Cyc A2 WT, Cyc A2 Mut or Cyc A2 Mut-NLS transfection.
  • NIH3T3 sh Cyc A2 cells show corticalization of the actin cytoskeleton.
  • the normal organization of the cytoskeleton (illustrated by NIH3T3 sh Luke cells) is restored in about 90% of Cyc A2 WT NIH 3T3 Sh Cyc A2 cells and 75% of Cyc A2 Mut transfected cells, in contrast to Cyc transfected cells.
  • A2 Mut-NLS (about 10% of restoration).
  • Figure 3 Modulation of RhoA activity in cells deficient in Cyc A2 or having a forced expression of Cyc A2.
  • A Western Blot detection of the proportion of RhoA active forms after precipitation with GST-Rhotekin beads on cell lysates generated from control NIH3T3 cells (sh Luc and control), cells deficient in Cyc A2 (sh Cyc A2) or overexpressing Cyc A2 (+ Cyc A2-Flag).
  • B quantification of the RhoA activity detected by Western Blot and established in relation to the amount of total RhoA protein (Total) and the amount of total protein (GAPDH).
  • Cyc A2 deficiency (sh Cyc A2) induces a decrease in the amount of active forms of RhoA (activity ratio of 0.48 compared to control of 1) whereas its forced expression leads to an increase in the proportion of active forms of RhoA (activity ratio of 2 vs 1).
  • the activity of RhoA is therefore decreased in the absence of Cyc A2 and increased during its overexpression.
  • Figure 4 The migratory and invasive power of cells deficient in Cyc A2 is increased.
  • A migration rate of NIH3T3 sh Cyc A2 cells established by injury test on a confluent carpet of NIH3T3 sh Luc cells or sh Cyc A2 (2D) cells. The migration rate of the NIH 3T3 sh Cyc A2 cells was calculated from a real-time video microscopy record taken 24H after wound establishment and normalized to the speed of the NIH3T3 sh Luc cells.
  • B invasion rate of NIH3T3 and NIH3T3RasV12 cells, deficient (sh Cyc A2) or not (sh Luc) in Cyc A2 in a collagen I matrix (3D).
  • Cyc A2 interacts directly with RhoA via its N-terminal portion (aal at 196 and aal at 70).
  • Cell lysates generated from NIH3T3 cells transfected with an empty vector (ctr1) or expressing RhoAV14-GFP were immunoprecipitated by GFP-Trap beads. The interaction between the two molecules was detected by western blotting using anti-Cyc A2 antibody (Sigma) after gel migration and immunoprecipitate (IP) transfer. The expression of Cyc A2 and RhoAV14 in these cells is determined in parallel (input).
  • Cyc A2 (bacterial production) was incubated either with glutathione beads as control (beads) or recombinant RhoA protein coupled to glutathione beads (RhoA GST beads). The Cyc A2 fraction bound to the RhoA-GST protein was detected by Western Blot after elution.
  • C left panel: schematic representation of the deletion mutants of Cyc A2.
  • the N-terminal mutant (N-ter) comprises the N-terminal portion of Cyc A2 from amino acid 1 to 196 upstream of the "cyclin box" portion.
  • the C-terminal mutant comprises the C-terminal portion of Cyc A2 from 197 to 422 which includes the "cyclin box".
  • Cyc A2 Two deletion mutants of the N-terminal portion of Cyc A2 were generated and comprise respectively fragments 1 to 70 (N-terl-70) and 1 to 140 (N-terl-140) of Cyc A2.
  • D and E interaction of RhoA with the different fragments of Cyc A2.
  • Immunoprecipitations performed using anti-Flag antibody coupled to agarose beads were performed on cell lysates generated from NIH3T3 cells co-transfected with the plasmids encoding RhoA-EGFP and the different fragments, respectively. of Cyc A2.
  • RhoA binding to Cyc A2 fragments was detected by immunoblotting using the anti-GFP antibody.
  • Figure 6 Restoring the effect of Cyc A2 deficiency on the cytoskeleton by the N-terminal portion of Cyc A2.
  • A Immunofluorescence analysis of the actin cytoskeleton (F-actin is detected by phalloidin-Rhodamine labeling) in NIH3T3 cells with or without Cyc A2 deficiency and after transfection of Cyc A2 WT or N-ter fragments ( 1-196) and C-ter. The expression of Cyc A2 WT and fragments is detected using anti-Flag antibody labeling.
  • B quantification of the percentage of NIH3T3 sh Cyc A2 cells presenting a restoration of a normal actin cytoskeleton after transfection with Cyc A2 WT, Cyc A2 N-ter or Cyc A2-C-ter.
  • NIH3T3 sh Cyc A2 cells show corticalization of the actin cytoskeleton.
  • the normal organization of the cytoskeleton (exemplified by NIH3T3 sh Lu cells) is restored in about 90% of Cyc A2 WT-transfected NIH 3T3 Sh Cyc A2 cells and 80% of N-ter Cyc A2-transfected cells in contrast to transfected cells. by Cyc A2 C-ter.
  • Figure 7 Quantification of Cyc A2 (Western Blot) in various samples of primary human tumors of the colon (T) and their hepatic metastases (M) from six patients. For all of these samples, an identical quantity of proteins (20 ⁇ g) was separated by electrophoresis and then transferred and analyzed for the expression of Cyc A2 using the anti-Cyc A2 antibody (Sigma).
  • B Quantification of Cyc A2 expression level from Western blot analysis. Normalization is performed by relating the level of expression of Cyc A2 to that of the GAPDH protein.
  • FIG. 8 Recombinant Cyc A2 interacts directly and preferentially with the empty form of RhoA (A) and potentiates its GTP loading in the presence of two GEFs: Dbl (B, C) and Tgat (D, E). B and D: kinetics of incorporation of fluorescent GTP; C and E: quantization of the initial velocities.
  • Figure 9 coprecipitation of endogenous Cyclin A2 after transfection of NIH3T3 cells with RhoB-GFP or RhoC-GFP-expressing constructs (pull down GFP and Western Blot Cyclin A2).
  • FIG. 10 The NMuMG epithelial cells treated with shRNAcycA2 adopt a fibroblastic morphology (A) associated with a loss of E cadherin (B) and a redistribution of vinculin, ⁇ catenin as well as p 120 catenin (C).
  • A fibroblastic morphology associated with a loss of E cadherin
  • B redistribution of vinculin, ⁇ catenin as well as p 120 catenin
  • C p 120 catenin
  • Figure 1 1 Cells lacking Cyclin A2 are more invasive (A). While the activity of Racl is not modified (B), that of RhoA is inhibited (C) and that of RhoC increased (D). Cyclin A2 interacts with RhoC (E).
  • Figure 12 Modulation of 1 marqu markers by removal of Cyclin A2 in normal NMuMG or RasV12 transformed cells. Comparison with the effect of an inducer such as TGF beta.
  • Figure 13 Rasu12-transformed NMuMG cells lacking Cyclin A2 form more tumorospheres that contain more cells.
  • Cyc A2 cDNA of sequence SEQ ID No. 1 of mice was obtained from NIH3T3 cells by RT-PCR and was cloned into pBluescriptII (KS) (Stratagene) and sequenced.
  • KS pBluescriptII
  • the mutants of Cyc A2 were obtained by site-directed mutagenesis using the QuickChange II Mutagenesis kit (Stratagene) to allow the substitution of amino acids selected by Alanine.
  • Cyc A2 constructs were further mutated to be resistant to the shRNA used and subcloned into pcDNA3 (Invitrogen). All the cDNAs thus mutated or not of Cyc A2 were fused to a 3xFlag label at their 3 'end.
  • NIH3T3 cells NIH3T3 RasV12
  • FCS fetal calf serum
  • the MDA-MB-231 cells were cultured in MEM-10% FCS medium.
  • the ectopic expression of Cyc A2 or its inactivation in the cells is effective after transfection with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) or after viral infection.
  • the cells were selected for 2 days in the presence of 1-10 ⁇ g / ml puromycin (InvivoGen) (retrovirus infection coding for Cyc A2 sh RNA), or 200-250 ⁇ g / ml. ⁇ / ⁇ 1 of hygromycin B (Invitrogen) (ectopic expression of Cyc A2) according to the cell lines.
  • Anti-cyclin A2 monoclonal antibody (clone CY-A1-Sigma), anti-Cyc A2 (sc-751, Santa Cruz Biotechnology) anti-RhoA (sc-418 Santa Cruz Biotechnology), anti-GAPDH (G9545, Sigma).
  • the following antibodies were used for immunofluorescence staining: anti-vinculin monoclonal (clone (hVIN-Sigma) .
  • the staining of F-actin was performed with phalloidin conjugated with rhodamine (Sigma).
  • AlexaFluor conjugated antibodies (Invitrogen) were used as secondary antibodies.
  • the cells were fixed with 3.2% paraformaldehyde and permeabilized with 0.2% Triton X-100. Cells were visualized using a Leica DMRA or DM600 microscope and MetaMorph software.
  • Invasion test This test was carried out in a 96-well plate coated with 0.2% bovine serum albumin and according to the conditions described in the article Smith and Marsall, J. Cell Biol 182, 777-790 (2008).
  • the cell lysates were incubated for 1 h at 4 ° C. with 60 ⁇ g of GST-Rhotekin-RBD (Cytoskeleton) beads. After washing and separation on acrylamide gel, the amount of RhoA-GTP forms thus precipitated was evaluated by western blotting.
  • Cyc A2 The analysis of the expression of Cyc A2 was performed by Western Blot on six pairs of biopsies of human colorectal cancers (primary tumors and corresponding liver metastases). 4 tumors were identified as colon cancers and 2 as rectal cancers.
  • All tumors are adenocarcinomas classified by the 7th TNM classification of malignant tumors.
  • the frozen sections of the tumor samples were homogenized in extraction buffer (150 mM Nacl, 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 1MM EGTA, 1% Triton Y-100, 0.5% NP 40 supplemented with protease inhibitors) for 20 sec at 4000 Hz, using the Mag NA Lysa system (Roche Diagnostic). After incubation on ice (30 min.), The samples are centrifuged for 30 min. at 14000 rpm. For each sample, 20 ⁇ g of the total protein extract is analyzed by Western Blot.
  • the second phenotype is unexpected and shows corticalization of the actin cytoskeleton and redistribution of the focal adhesion plates ( Figure 1). Surprisingly, the mutant is just as effective as WT in restoring a normal phenotype.
  • this mutant is cytoplasmic: Cyc A2 lacking a nuclear localization signal (NLS) commutes between nucleus and cytoplasm thanks to its association with its partners.
  • NLS nuclear localization signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention porte sur Cyc A2 pour utilisation en tant que biomarqueur spécifique de la capacité invasive des cellules cancéreuses d'origine humaine ou animale et sur une méthode d'évaluation du pouvoir invasif de cellules cancéreuses. Application comme médicaments et pour le criblage de composés anti-métastatiques.

Description

Biomarqueurs de tumorigénèse et applications pour l'obtention de composés anti- métastatiques
L'invention a pour objet des biomarqueurs de tumorigénèse et leurs applications pour l'obtention de composés anti-métastatiques.
La métastase est le problème central du cancer. De nombreuses recherches portent donc sur la conception de composés thérapeutiques spécifiquement anti-invasifs permettant d'envisager des effets secondaires plus faibles que les anti-cancéreux classiques.
Dans ce contexte, les travaux des inventeurs ont porté sur l'étude du rôle d'un constituant clé dans la régulation du cycle cellulaire, à savoir la cycline A2 (ci-après Cyc A2 en abrégé), dans la migration et le potentiel métastatique des cellules cancéreuses. Cyc A2 est impliquée dans le contrôle de la phase S et de la mitose du cycle cellulaire. Les recherches effectuées ont permis de mettre en évidence une fonction inattendue de Cyc A2.
Plus spécialement, il est apparu que Pinactivation de Cyc A2 endogène par ARN interférence, à l'aide de shARNs, engendre 2 phénotypes distincts : 1) l'un sur le cycle cellulaire correspondant à la fonction déjà connue de Cyc A2 selon une activité dépendante des kinases CDK1 et CDK2 ; 2) l'autre sur le cytosquelette d'actine et la migration cellulaire correspondant à une nouvelle fonction de Cyc A2, cytoplasmique, ne nécessitant pas d'activation des kinases CDK1 et CDK2. Les inventeurs ont alors établi que la déficience de cellules en Cyc A2 était associée à une augmentation de la motilité cellulaire et du pouvoir invasif.
En absence de la Cyc A2, les cellules acquièrent un pouvoir invasif accru via une diminution de l'activité RhoA. Corrélativement, l'expression de Cyc A2 est détectée dans des tumeurs primaires humaines, mais diminue dans les métastases hépatiques issues de mêmes patients. Ainsi, une corrélation inverse entre le niveau cellulaire de Cyc A2 et le pouvoir invasif des cellules a été établie. De plus, les travaux effectués ont montré que l'acquisition du caractère invasif des cellules, suite à une déficience en Cyc A2, est due à une diminution de l'activité de la voie RhoA/ROCK. Comme démontré par les inventeurs, la voie RhoA/ROCK est activée grâce à l'interaction entre la partie amino-terminale de Cyc A2 et RhoA. La restauration de cette voie, obtenue en réintroduisant de la Cyc A2 dans les cellules déficientes, permet de diminuer le caractère invasif acquis par les cellules. L'interaction Cyc A2/RhoA constitue donc une cible privilégiée pour le criblage de composés anti-métastatiques. Des mimétiques, en termes de fonction, de la partie amino-terminale de Cyc A2, en particulier des analogues peptidiques, sont des candidats médicaments pour une action anti-métastatique. L'invention a donc pour but de fournir un biomarqueur spécifique du pouvoir invasif des cellules, en particulier pour les métastases.
Elle a également pour but l'utilisation du site d'interaction de Cyc A2 avec RhoA comme système de criblage de composés anti-métastatiques.
Elle vise en outre à fournir, en tant que nouveaux produits, la partie amino-terminale de Cyc A2 avec RhoA et les analogues peptidiques, comme candidats médicaments à action anti- métastatique. Selon un premier aspect, l'invention vise donc Cyc A2 pour une utilisation en tant que biomarqueur spécifique de la capacité invasive des cellules cancéreuses d'origine humaine ou animale. Plus spécialement, l'invention vise l'utilisation de Cyc A2 comme biomarqueur prédictif des métastases, un niveau faible de Cyc A2 dans les cellules cancéreuses indiquant un mauvais pronostic.
L'invention vise ainsi également une méthode d'évaluation du pouvoir invasif de cellules cancéreuses, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection du taux de Cyc A2 sur des biopsies, d'origine humaine ou animale, plus spécialement des lysats cellulaires issus des biopsies, le taux étant alors rapporté au taux de GAPDH, ou sur des coupes d'un tissu d'origine humaine ou animale, déjà qualifié comme cancéreux, en comparaison à des tumeurs préétablies comme exprimant fortement ou faiblement Cyc A2. Dès lors, une déficience en Cyc A2 ou une faible expression de Cyc A2 sera associée à un caractère invasif de la cellule. La détection du taux de Cyc A2 est avantageusement réalisée par Western Blot ou, dans le cas de biopsies, par immunohistochimie.
L'invention fournit ainsi les moyens d'orienter un traitement anticancéreux vers la nécessité ou non de traitements thérapeutiques lourds.
Selon un deuxième aspect, l'invention vise une composition de Cyc A2 pour utilisation comme médicament anti-métastatique.
Elle vise ainsi plus spécialement une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme une quantité thérapeutiquement efficace de Cyc A2 ou de sa partie N-terminale en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'ADNc codant pour Cyc A2 présente la séquence SEQ ID N° 1.
Selon un troisième aspect, l'invention vise l'utilisation du site d'interaction Cyc A2/RhoA comme cible pour le criblage de composés anti-métastatiques capables d'activer la voie RhoA/ROCK.
Selon un quatrième aspect, elle vise l'utilisation de la partie amino-terminale de Cyc A2 et tout analogue peptidique (mimétique fonctionnel), comme candidat médicament à action anti- métastatique.
Les expérimentations réalisées par les inventeurs ont montré, comme illustré par les exemples, que la partie amino-terminale de Cyc A2, en particulier, les fragments N-terminaux de 70, 140 et 196 acides aminés de Cyc A2 qui ne contiennent pas le domaine « cyclin box » de Cyc A2 s'avèrent appropriés comme composés anti-métastatiques.
La moitié N terminale de Cycline A2 s'est révélée seule capable de restaurer une distribution normale de l'actine dans les cellules traitées par shRNAcycA2. La région impliquée est réduite aux 70 premiers acides aminés. La partie amino-terminale de Cyc A2 et les fragments de cette partie de 70, 140 et 196 acides aminés sont codés par des ADNc de séquences, respectivement, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4.
Les composés anti-métastatiques correspondant à des mimétiques de la partie amino- terminale de Cyc A2 entrent également dans le champ de l'invention. L'invention vise en particulier des peptides correspondant à des mimétiques de la partie amino-terminale de Cyc A2 et présentant des propriétés anti-métastatiques.
Dans les applications comme médicaments, les composés sont utilisés à des doses et selon des voies d'administration les plus appropriées pour l'homme du métier au vu des applications envisagées.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés à titre illustratif dans les exemples qui suivent, avec référence aux Figures 1 à 7, qui représentent, respectivement,
- Figure 1 : la redistribution de l'actine et de la vinculine dans les cellules déficientes en cycline A2. A : analyse par Western Blot de l'expression de Cyc A2 dans les cellules
NIH3T3 non infectées, ou infectées par un sh contrôle (sh Luc) ou sh Cyc A2 ( on note la disparition de la protéine Cyc A2 dans les cellules sh Cyc A2 par rapport aux contrôles) . B : marquage de l'actine-F et des plaques focales d'adhérence dans les cellules NIH3T3 contrôle (sh Luc) ou sh Cyc A2 par immunofluorescence à l'aide de la phalloïdine-Rhodamine (rouge) et d'un anticorps anti- Vinculine (vert), respectivement. Les cellules sh Cyc A2 présentent une corticalisation du cytosquelette d'actine et une redistribution des plaques focales d'adhérence par rapport aux cellules contrôle sh Luc.
- Figure 2 : la correction du phénotype cytoplasmique par la Cyc A2 WT et la Cyc A2 mutante (Cyc A2 Mut). A et B : analyse par immunofluorescence de l'organisation de l'actine-F dans les cellules NIH3T3 sh Cyc A2 non transfectées ou transfectées par Cyc A2 WT, Cyc A2 Mut ou Cyc A2 Mut comportant le NLS de l'antigène T de SV40 (Cyc A2 Mut NLS). B : quantification du pourcentage de cellules NIH3T3 sh Cyc A2 présentant une restauration d'un cytosquelette d'actine normal après transfection par Cyc A2 WT, Cyc A2 Mut ou Cyc A2 Mut-NLS.
Commentaire : les cellules NIH3T3 sh Cyc A2 présentent une corticalisation du cytosquelette d'actine. L'organisation normale du cytosquelette (illustrée par les cellules NIH3T3 sh Luc) est rétablie dans près de 90% des cellules NIH 3T3 Sh Cyc A2 transfectées par Cyc A2 WT et 75 % des cellules transfectées par Cyc A2 Mut contrairement aux cellules transfectées par Cyc A2 Mut-NLS (environ 10% de restauration).
Figure 3 : modulation de l'activité RhoA dans les cellules déficientes en Cyc A2 ou présentant une expression forcée de Cyc A2. A : détection par Western Blot de la proportion des formes actives RhoA après précipitation à l'aide de billes GST- Rhotekin sur des lysats cellulaire générées à partir de cellules NIH3T3 contrôle (sh Luc et contrôle), cellules déficientes en Cyc A2 (sh Cyc A2) ou présentant une surexpression de Cyc A2 (+ Cyc A2-Flag). B : quantification de l'activité de RhoA détectée par Western Blot et établie en rapport à la quantité de protéine RhoA totale (Total) et la quantité de protéine totale (GAPDH).
Commentaire : la déficience en Cyc A2 (sh Cyc A2) induit une diminution de la quantité des formes actives de RhoA (ratio d'activité de 0.48 par rapport au contrôle de 1) alors que son expression forcée conduit à une augmentation de la proportion des formes actives de RhoA (ratio d'activité de 2 par rapport à 1). L'activité de RhoA est donc diminuée en absence de Cyc A2 et augmentée lors de sa surexpression.
Figure 4 : le pouvoir migratoire et invasif des cellules déficientes en Cyc A2 est augmenté. A : vitesse de migration des cellules NIH3T3 sh Cyc A2 établie par test de blessure sur un tapis confluent de cellules NIH3T3 sh Luc ou sh Cyc A2 (2D). La vitesse de migration des cellules NIH 3T3 sh Cyc A2 est calculée d'après un enregistrement par vidéo microscopie en temps réel effectué pendant 24H après l'établissement de la blessure et normalisé par rapport à la vitesse des cellules NIH3T3 sh Luc. B : taux d'invasion des cellules NIH3T3 et NIH3T3RasV12, déficientes (sh Cyc A2) ou non (sh Luc) en Cyc A2 dans une matrice collagène I (3D). C : invasion des cellules de cancer mammaire MDA-MB-231 déficientes en Cyc A2 (sh Cyc A2) ou exprimant de façon ectopique Cyc A2 (Cyc A2 Flag) dans une matrice de collagène I (3D). Le taux d'invasion des cellules inactivées en Cyc A2 ou surexprimant la Cyc A2 est établi par rapport aux cellules contrôles. Commentaire : l'inactivation de Cyc A2 dans les cellules NIH3T3 induit une augmentation de la vitesse de migration en 2D (A). Ces cellules nécessitent une étape de transformation par RasV12 pour présenter des capacités invasives mesurables en test 3D (B). Dans ces conditions, les cellules NIH3T3RasV12 déficientes pour Cyc A2 présentent un pouvoir invasif supérieur aux cellules NIH3T3RasV12 sh Luc (B). Ces observations ont été confirmées dans un modèle cellulaire de cancer mammaire, les MDA-MB-231 (C). Inversement, dans ce même modèle, l'expression forcée de Cyc A2 induite par infection rétrovirale inhibe le potentiel invasif des cellules par rapport aux cellules contrôle infectées par un virus vide.
Figure 5 : Cyc A2 intéragit directement avec RhoA par l'intermédaire de sa partie N- terminale (aal à 196 et aal à 70). A : Co-immunoprécipitation de Cyc A2 endogène avec RhoA. Des lysats cellulaires générés à partir de cellules NIH3T3 transfectées à l'aide d'un vecteur vide (ctrl) ou exprimant RhoAV14-GFP ont été immunoprécipités par des billes GFP-Trap. L'interaction entre les deux molécules a été détectée par western blotting à l'aide de l'anticorps anti- Cyc A2 (Sigma) après migration sur gel et transfert des immunoprécipitats (IP). L'expression de Cyc A2 et RhoAV14 dans ces cellules est déterminée en parallèle (Input). B : Cyc A2 recombinante (production en bactéries) a été incubées soit avec les billes glutathion comme contrôle (billes) ou la protéine recombinante RhoA couplée aux billes glutathion (RhoA GST billes). La fraction de Cyc A2 liée à la protéine RhoA-GST a été détectée par Western Blot après élution. C : panneau de gauche : représentation schématique des mutants de délétion de la Cyc A2. Le mutant N-terminal (N-ter) comprend la partie N-terminale de Cyc A2 de l'acide aminé 1 à 196 en amont de la partie « cyc lin box ». Le mutant C- terminal comprend la partie C-terminale de Cyc A2 de 197 à 422 qui inclut la « cyclin box ». Deux mutants de délétion de la partie N-terminale de Cyc A2 ont été générés et comprennent respectivement les fragments 1 à 70 (N-terl-70) et 1 à 140 (N-terl-140) de Cyc A2. D et E : interaction de RhoA avec les différents fragments de Cyc A2. Des immunoprécipitations effectuées à l'aide de l'anticorps anti-Flag couplé à des billes d'agarose ont été effectuées sur des lysats cellulaires générés à partir de cellules NIH3T3 co-transfectées par les plasmides codant respectivement pour RhoA-EGFP et les différents fragments de Cyc A2. La liaison de RhoA aux fragments Cyc A2 a été détectée par immunoblotting à l'aide de l'anticorps anti-GFP. L'expression des différents fragments dans les cellules et leur immunoprécipitation Cyc A2 est indiquée en E, panel droit. Commentaire : la détection de Cyc A2 par Western Blot dans l'immunoprécipitat RhoAV14-GFP (IP) démontre l'existence d'une interaction entre Cyc A2 et RhoA in cellulo (A). La présence de Cyc A2 dans l'éluat des billes RhoA-GST démontre l'existence d'une intéraction directe entre RhoA et Cyc A2 in vitro (B). La forte proportion de N-ter Cyc A2 (aal-196) dans l'immunoprécipitat RhoA-GFP par rapport à la proportion du fragment C-ter démontre une association de RhoA avec le fragment N-ter de Cyc A2 (D). L'utilisation de fragments Cyc A2 plus petits (aa 1 à 140 et aa 1 à 70) dans les mêmes types d'expériences démontre que la région de liaison de RhoA à Cyc A2 se situe entre les acides aminés 1 à 70 de Cyc A2 (E).
Figure 6 : la restauration de l'effet de la déficience de Cyc A2 sur le cytosquelette par la partie N-terminale de Cyc A2. A. Analyse par immunofluorescence du cytosquelette d'actine (l'actine F est détectée par un marquage à la phalloïdine- Rhodamine) dans les cellules NIH3T3 déficientes ou non en Cyc A2 et après transfection de Cyc A2 WT ou des fragments N-ter (1-196) et C-ter. L'expression de Cyc A2 WT et des fragments est détectée à l'aide d'un marquage par l'anticorps anti- Flag. B : quantification du pourcentage de cellules NIH3T3 sh Cyc A2 présentant une restauration d'un cytosquelette d'actine normal après transfection par Cyc A2 WT, Cyc A2 N-ter ou Cyc A2-C-ter.
Commentaire : les cellules NIH3T3 sh Cyc A2 présentent une corticalisation du cytosquelette d'actine. L'organisation normale du cytosquelette (illustrée par les cellules NIH3T3 sh Luc) est rétablie dans près de 90% des cellules NIH 3T3 Sh Cyc A2 transfectées par Cyc A2 WT et 80 % des cellules transfectées par Cyc A2 N-ter contrairement aux cellules transfectées par Cyc A2 C-ter.
Figure 7 : les quantifications de Cyc A2 (Western Blot) dans divers échantillons de tumeurs humaines primaires du colon (T) et leurs métastases hépatiques (M) issues de six patients. Pour l'ensemble de ces échantillons, une quantité identique de protéines (20 μg) a été séparée par éléctrophorèse puis transférée et analysée pour l'expression de Cyc A2 à l'aide de l'anticorps anti-Cyc A2 (Sigma). B. Quantification du taux d'expression de Cyc A2 à partir de l'analyse par Western Blot. La normalisation s'effectue en rapportant le taux d'expression de Cyc A2 sur celui de la protéine GAPDH.
Figure 8 : Cyc A2 recombinante interagit directement et préférentiellement avec la forme vide de RhoA (A) et potentialise sa charge en GTP en présence de deux GEF : Dbl (B, C) et Tgat (D, E). B et D : cinétique d'incorporation de GTP fluorescent ; C et E : quantification des vitesses initiales.
Figure 9 : coprécipitation de Cycline A2 endogène après transfection de cellules NIH3T3 avec des constructions exprimant RhoB-GFP ou RhoC-GFP (pull down GFP et Western Blot Cycline A2).
Figure 10 : les cellules épithéliales NMuMG traitées par shRNAcycA2 adoptent une morphologie fibroblastique (A) associée à une perte de E cadhérine (B) et une redistribution de la vinculine, de la β caténine ainsi que de la p 120 caténine (C).
Figure 1 1 : les cellules dépourvues de Cycline A2 sont plus invasives (A). Alors que l'activité de Racl n'est pas modifiée (B), celle de RhoA est inhibée (C) et celle de RhoC augmentée (D). Cycline A2 interagit avec RhoC (E).
Figure 12 : modulation des marqueurs de 1ΈΜΤ par l'élimination de la Cycline A2 dans des cellules NMuMG normales ou transformées par RasV12. Comparaison avec l'effet d'un inducteur comme le TGF β.
Figure 13 : les cellules NMuMG transformées par RasV12 et dépourvues de Cycline A2 forment plus de tumorosphères qui contiennent plus de cellules.
Matériels et Méthodes
Plasmides
L'ADNc de Cyc A2 de séquence SEQ ID N°l de souris a été obtenu à partir de cellules NIH3T3 par RT-PCR et a été cloné dans pBluescriptll (KS) (Stratagene) et séquencé.
Les mutants de Cyc A2 ont été obtenus par mutagénèse dirigée à l'aide du kit QuickChange II Mutagenesis (Stratagene) afin de permettre la substitution d'acides aminés choisis par l'Alanine.
Les différentes constructions de Cyc A2 ont été en outre mutées pour être résistantes au shRNA utilisé et sous-clonées dans pcDNA3 (Invitrogen). L'ensemble des cDNA ainsi mutés ou non de Cyc A2 ont été fusionnés à une étiquette 3xFlag à leur extrémité 3'.
Dans le cas du Mutant Cyc A2, le signal de localisation nucléaire (NLS) du grand antigène T de SV40 a été inséré entre l'ADNc de Cyc A2 et le tag Flag. Flag-CycA2 de type sauvage et les ADNc mutés ont été introduits dans pMSCVhyg (Clontech) pour la production de rétro virus. Pour la détermination des interactions Cyc A2/RhoA in vitro, l'ADNc de Cyc A2 de séquence SEQ ID N°l et celui de RhoA de séquence SEQ ID N°5 ont respectivement été sous-clonés dans pGEX-6P-l et pGEX-2T (GE Healthcare). Les shARNs a et b répondant aux séquences SEQ ID N°6 et 7 ont été utilisés pour induire l'inactivation de Cyc A2 dans les cellules: a) : SEQ ID N°6 : 5 ' -G A AATGGAGGTTAAATGA-3 '
b) : SEQ ID N°7 : 5 ' -GT AGC AG AGTTTGTGT AT A-3 '
Ces séquences ont été clonées dans le vecteur RNAi-Ready pSIREN-RetroQ (Clontech).
Culture cellulaire, transfections et infections Les cellules NIH3T3, NIH3T3 RasV12, ont été cultivées dans un milieu DMEM-10% de sérum de veau fœtal (SVF). Les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées en milieu MEM- 10% SVF.
L'expression ectopique de Cyc A2 ou son inactivation dans les cellules est effective après transfection à l'aide de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ou après infection virale. Dans le cas de l'infection, les cellules ont été sélectionnées pendant 2 jours en présence de 1-10 μg/ml de puromycine (InvivoGen) (infection par les rétrovirus codant pour le sh RNA de Cyc A2), ou de 200-250 μ§/ηι1 d'hygromycine B (Invitrogen) (expression ectopique de Cyc A2) selon les lignées cellulaires.
Anticorps, immunoblots et immunofluorescence
Les anticorps suivants ont été utilisés pour réaliser les immunoblots :
Anticorps monoclonal anti-cycline A2 (clone CY-A1 -Sigma), anti-Cyc A2 (sc-751, Santa Cruz Biotechnology) anti-RhoA (sc-418 Santa Cruz Biotechnology), anti-GAPDH (G9545, Sigma).
Les anticorps suivants ont été utilisés pour la coloration par immunofluorescence : monoclonal anti-vinculine (clone (hVIN-Sigma). La coloration de la F-actine a été réalisée avec de la phalloïdine conjuguée à de la rhodamine (Sigma). Les anticorps conjugués AlexaFluor (Invitrogen) ont été utilisés comme anticorps secondaires. Avant d'effectuer les analyses par immunofluorescence, les cellules ont été fixées avec 3,2% de paraformaldéhyde et perméabilisées avec 0,2% de Triton X-100. Les cellules ont été visualisées en utilisant un microscope Leica DMRA ou DM600 et le logiciel MetaMorph.
Tests de migration et d'invasion
Test de blessure : la migration des cellules a été évaluée en réponse à une blessure pratiquée sur le tapis de cellules confluentes. L'enregistrement des données s'est effectué toutes les 5 minutes pendant 24H à l'aide d'un microscope Zeiss Axiovert 200M géré par le logiciel MetaMorph.
Test d'invasion : cet essai s'est effectué en plaque 96 puits recouverts de 0.2% d'albumine sérique bovine et selon les conditions décrites dans l'article Smith and Marsall, J Cell Biol 182, 777-790 (2008).
Quantification de l'activité Rho A
Les lysats cellulaires ont été incubés pendant lh à 4°C avec 60 μg de billes GST-Rhotekin- RBD (Cytoskeleton). Après lavages et séparation sur gel d'acrylamide, la quantité des formes RhoA-GTP ainsi précipitée a été évaluée par western blotting.
Co-immunoprécipitation et GST Les immunoprécipitations anti-Cyc A2 et anti-RhoA ont été réalisées à l'aide de billes anti- Flag M2 (Sigma) et de billes GFP-Trap® (Chromotek), respectivement. L'existence d'un complexe RhoA/Cyc A2 a été identifiée après séparation des protéines immunoprécipitées et western blotting. La détermination de l'existence d'une interaction directe entre Cyc A2 et RhoA in vitro a été réalisée à l'aide des protéines Cyc A2 et RhoA fusionnées à la GST et produites en bactéries. Cyc A2 recombinante a été purifiée à partir des billes conjuguées à la GST par digestion en utilisant une protéase PreScision et incubée avec RhoA GST lié aux billes d'agarose. Après lavage, les billes de RhoA-GST et les billes contrôle sont récupérées et soumises à une analyse par Western Blot.
Sélection d'échantillons de tumeurs humaines primaires ou métastatiques
L'analyse de l'expression de Cyc A2 a été effectuée par Western Blot sur six couples de biopsies de cancers colorectaux humains (tumeurs primaires et métastases hépatiques correspondantes). 4 tumeurs ont été identifiées comme cancers du colon et 2 comme cancers rectaux.
Toutes les tumeurs sont des adénocarcinomes classifiées d'après la 7ième classification TNM des tumeurs malignes. Pour la détection des taux de Cyc A2 par Western Blot, les sections congelées des échantillons de tumeurs ont été homogénéisées dans un tampon d'extraction (150 mM Nacl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1MM EGTA, 1% Triton Y- 100, 0,5% NP 40 complété par des inhibiteurs de protéases) pendant 20 sec à 4000 Hz, à l'aide du système Mag NA Lysa (Roche Diagnostic). Après incubation sur glace (30 min.), les échantillons sont centrifugés 30 min. à 14000 rpm. Pour chaque échantillon, 20 μg de l'extrait protéique total est analysé par Western Blot.
Analyse statistique Les analyses statistiques sont effectuées en utilisant le test de Mann Whitney non paramétrique et le logiciel GraphPad Prism (PO ; 05 est retenu comme étant significatif d'un point de vue statistique).
Résultats
Effets d'une déficience en CycA2 sur la morphologie cellulaire,
Un système fondé sur l'inactivation de Cyc A2 endogène par shRNA a été utilisé. Une série de mutants (voir Matériels et Méthodes) ont été construits pour évaluer leur capacité à restaurer les phénotypes altérés dans des cellules NIH3T3. Deux phénotypes ont été obtenus lors de l'inactivation de Cyc A2, dont le premier était attendu : les cellules s'accumulent en phase G2/M et présentent des défauts mitotiques. La réintroduction de Cyc A2 native (ci-après WT) insensible au shRNA, corrige ces défauts, contrairement aux mutants qui s'avèrent incapables d'activer CDK1 et CDK2, validant ainsi le système.
Le deuxième phénotype est inattendu et montre une corticalisation du cytosquelette d'actine et une redistribution des plaques focales d'adhérence (Figure 1). De manière surprenante, le mutant est tout aussi efficace que le WT dans la restauration d'un phénotype normal.
De façon intéressante, ce mutant est cytoplasmique : Cyc A2 n'ayant pas de signal de localisation nucléaire (NLS) fait la navette entre noyau et cytoplasme grâce à son association à ses partenaires. Au vu de cette observation, Cyc A2 a été fusionnée au NLS de l'antigène T de SV40 et dans ce cas, le mutant n'est plus opérationnel (Figure 2).
Les mêmes observations sont valables dans un contexte dépourvu d'activités CDK1 et CDK2. Ces résultats mettent en évidence l'existence d'une nouvelle fonction pour Cyc A2 qui apparaît cytoplasmique et indépendante des activités des kinases du cycle cellulaire.
Effets de la déficience de CycA2 sur Vactivation de RhoA et l'invasion cellulaire
Les cellules déficientes en Cyc A2 révèlent une diminution de l'activation de la voie RhoA/ROCK (Figure 3), associée à une augmentation de la motilité cellulaire telle qu'on peut la mesurer dans des tests de blessure en culture 2D (Figure 4 A).
Toutefois, les cellules NIH3T3 dans lesquelles ces observations ont été effectuées ne sont pas invasives dans un test 3D conduit en matrice de collagène (figures 4B).
Ces résultats ont conduit à tester la possibilité qu'un événement de transformation soit requis à l'acquisition de cette propriété. Les résultats obtenus montrent qu'effectivement, les mêmes cellules transformées par Ras V12 acquièrent un pouvoir invasif, et l'inactivation de cycline A2 augmente signifîcativement ce pouvoir (Figure 4B). Ces résultats ont été reproduits pour une lignée cellulaire issue de cancer du sein humain, MDA-MB-231 (Figure 4C). Inversement, dans cette lignée, l'expression forcée de Cyc A2 réduit le potentiel invasif (Figure 4C). Ce phénotype est corrélé à une augmentation de l'état d'activation de RhoA (Figure 3 A et B)
Interaction directe entre RhoA et Cyc A2 Du point de vue mécanistique, les résultats montrent une interaction entre RhoA et Cyc A2 (pull down) (Figure 5A et B) in cellulo et in vitro. Une caractérisation plus poussée de la partie de Cyc A2 interagissant avec RhoA a permis de déterminer l'implication du fragment N-terminal de Cyc A2 ( Figure 5C, D, E) dans l'interaction avec RhoA. De même que pour la Cyc A2 WT, la réintroduction du fragment Cyc A2 N-ter 1-196 dans les cellules déficientes pour Cyc A2 permet de restaurer un cytosquelette d'actine normal (Figure 6)
Expression de CycA2 dans les tumeurs primaires et métastases de cancers humains.
Ces observations expliquent potentiellement la diminution du taux d'expression de Cyc A2 dans les métastases hépatiques de cancers colorectaux humains par rapport aux tumeurs primaires (Figure 7). Le faible taux d'expression de Cyc A2 apparaît donc inversement corrélé au pouvoir invasif des cellules cancéreuses et doit donc représenter un facteur de mauvais pronostic.
Interaction, in vitro, de Cyc A2 avec la forme vide de RhoA
In vitro, Cycline A2 recombinante interagit de façon préférentielle avec la forme dépourvue de tout nucléotide de RhoA. Elle est par ailleurs capable de potentialiser (40-50% d'augmentation) l'activité de deux GEF de RhoA (Tgat et Dbl) dans un test cinétique de charge en GTP (Figure 8). Interaction de Cyc A2 avec RhobB et RhoC
Les résultats montrant l'interaction de Cyc A2 également avec RhoB et RhoC sont donnés sur la Figure 9.
Effets de l'élimination de Cyc A2 dans des cellules épitheliales mammaires normales de souris : changements morphologiques etgéniques.
L'élimination de Cycline A2 dans des cellules épithéliales mammaires normales de souris induit des changements morphologiques et géniques possédant certaines des caractéristiques de ΓΕΜΤ (transition épithélio-mésenchymateuse), phénomène renforcé si transformation des cellules par Ras V12 (Figure 10). Dans ce cas, l'inhibition de RhoA est associée à une activation de RhoC alors que Rac 1 n'est toujours pas touché (Figure 11). Les cellules voient leur potentiel invasif augmenté ainsi que la production de marqueurs comme les facteurs de transcription El 2, E47, Twist 2, Slug, ou encore les métallo protéases matricielles MMP3, MMP7 et MMP14 (Figure 12). Les cellules deviennent également résistantes à l'anoïkis et forment un plus grand nombre de tumorosphères qui contiennent plus de cellules (Figure 13).

Claims

REVENDICATIONS
1 - Cyc A2 pour utilisation en tant que biomarqueur spécifique de la capacité invasive des cellules cancéreuses d'origine humaine ou animale.
2 - Cyc A2 pour utilisation selon la revendication 1 , comme biomarqueur prédictif des métastases.
3 - Méthode d'évaluation du pouvoir invasif de cellules cancéreuses, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection du taux de Cyc A2 sur des biopsies d'origine humaine ou animale, plus spécialement sur des lysats cellulaires issus des biopsies, le taux de Cyc A2 étant alors rapporté au taux de GAPDH ou, sur des coupes d'un tissu d'origine humaine ou animale, déjà qualifié comme cancéreux, en comparaison à des tumeurs préétablies comme exprimant fortement ou faiblement Cyc A2, une déficience en Cyc A2 ou une faible expression de Cyc A2 sera alors associée à un caractère invasif de la cellule.
4 - Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la détection du taux de Cyc A2 est réalisée par Western Blot ou par immunohistochimie dans le cas de biopsies.
5 - Composition de Cyc A2 pour utilisation comme médicament anti-métastatique.
6 - Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme une quantité thérapeutiquement efficace de Cyc A2 ou de sa partie N-aminoterminale ou de fragments de cette partie, notamment les fragments N-terminaux de 70, 140 et 196 acides aminés de Cyc A2, codés respectivement par les ADNc de séquences SEQ ID N°2, 3 et 4 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
7 - Utilisation du site d'interaction Cyc A2/RhoA comme cible pour le criblage de composés anti-métastatiques capables d'activer la voie RhoA/ROCK.
8 - Utilisation de la partie amino-terminale de Cyc A2 et de mimétique peptidique fonctionnel, comme candidat médicament à action anti-métastatique.
9 - Composés anti-métastatiques correspondant à des mimétiques de la partie amino-terminale de Cyc A2.
10 - Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides.
PCT/FR2011/000559 2010-10-18 2011-10-18 Biomarqueurs de tumorigénèse et applications pour l'obtention de composés anti-métastatiques Ceased WO2012052629A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1058459A FR2966249B1 (fr) 2010-10-18 2010-10-18 Biomarqueurs de tumorigenese et applications pour l'obtention de composes anti-metastatiques
FR1058459 2010-10-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2012052629A2 true WO2012052629A2 (fr) 2012-04-26
WO2012052629A3 WO2012052629A3 (fr) 2012-06-14

Family

ID=43919797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2011/000559 Ceased WO2012052629A2 (fr) 2010-10-18 2011-10-18 Biomarqueurs de tumorigénèse et applications pour l'obtention de composés anti-métastatiques

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2966249B1 (fr)
WO (1) WO2012052629A2 (fr)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1631306A4 (fr) * 2003-05-19 2009-08-12 Univ Columbia Compositions et methodes de traitement et de prevention de la degeneration du tissu cardiaque et leurs utilisations
WO2009154790A2 (fr) * 2008-06-20 2009-12-23 University Of Massachusetts Nouveaux gènes suppresseurs de métastase et utilisations associés

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SMITH, MARSALL, J CELL BIOL, vol. 182, 2008, pages 777 - 790

Also Published As

Publication number Publication date
FR2966249A1 (fr) 2012-04-20
WO2012052629A3 (fr) 2012-06-14
FR2966249B1 (fr) 2012-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Loss of PDZK1 expression activates PI3K/AKT signaling via PTEN phosphorylation in gastric cancer
Ikari et al. Nuclear distribution of claudin-2 increases cell proliferation in human lung adenocarcinoma cells
Dráberová et al. Overexpression and nucleolar localization of γ-tubulin small complex proteins GCP2 and GCP3 in glioblastoma
Huang et al. CAPG enhances breast cancer metastasis by competing with PRMT5 to modulate STC-1 transcription
EP2820041B1 (fr) Phosphorylation d'iaspp et potentiel métastatique
RU2609649C2 (ru) Блокада сигнализации ccl18 через ccr6 как терапевтический способ лечения при фиброзных заболеваниях и раке
Bedau et al. Cancer-associated mutations in the canonical cleavage site do not influence CD99 shedding by the metalloprotease meprin β but alter cell migration in vitro
EP3114233B1 (fr) Procédé de prédiction de la réactivité à un traitement avec un anticorps anti-cd20
Wang et al. Lack of bombesin receptor–activated protein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice
US10358467B2 (en) Therapeutic targets for cancer progression
WO2012052629A2 (fr) Biomarqueurs de tumorigénèse et applications pour l'obtention de composés anti-métastatiques
Leinung et al. Molecular and functional in vivo characterisation of murine Dectin‐1 isoforms
Daoud et al. The efficacy of immunohistochemistry in the diagnosis of molecular genetic alterations in central nervous system gliomas: Next-generation sequencing of 212 mutations in 112 patients
Alabassi Assessment of ZYXIN and E-cadherin tumour marker in Iraqi patients with glioma lesion of the brain
WO2020045349A1 (fr) Agent permettant d'activer ou d'inhiber la communication cellule-cellule à l'aide d'une protéine fonctionnelle, anticorps ou aptamère, méthode de criblage dudit agent, protéine de fusion, acide nucléique codant pour ladite protéine, vecteur recombinant, cellule hôte transformée, modulateur de la fonction de l'exosome, et exosome
EP1430081A2 (fr) Complexes moleculaires brca1/acc alpha, applications diagnostiques et therapeutiques
Wang Remodeling of the Intercalated Disk in Cardiac Specific β-Catenin Knockout Mice: 18
Bergmann Mice with Heart-Restricted β-Catenin Deletion Develop a Modest Cardiac Hypertrophic Phenotype but a Normal Hypertrophic Response to Angiotensin II: 9
Van Eyk First Proteomic Association between a Single Nucleotide Polymorphism in Δ3, 5Δ2, 4 Dienoyl-CoA Isomerase and Ischemic Heart Failure: 12
Leinwand Blocking Cardiac Growth in Hypertrophic Cardiomyopathy Induces Cardiac Dysfunction and Decreased Survival in Only Males: 15
Hirota SH2-Containing Protein Tyrosine Phosphatase Functioning in LIF-Induced Signaling Pathway Inhibits Skeletal α-Actin Gene Expression in Cardiomyocytes: 10
Wang Role of the Transient Outward Current in Regulating Ventricular Action Potential and Contractility: A Dynamic Clamp Study: 28
Xiao Compartment of Protein Kinases and Phosphoprotein Phosphorases in Pressure Overload-Induced Hypertrophic Rat Hearts: 27
Deschepper The Chromosome Y Contributes to Features of Dilated Eccentric Hypertrophy in Male C57Bl/6J Mice: 21
Cerbai Prenatal Exposure to Carbon Monoxide Delays Postnatal Cardiac Electrophysiological Maturation: Focus on Functional and Molecular Properties of f-Current: 31

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11779745

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11779745

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2