WO2012038565A2 - PROTEÍNAS DE LA FAMILIA CRY COMO MARCADORES PARA DETERMINAR EL RIESGO A DESARROLLAR UNA α-SINUCLEINOPATÍA O DETERMINAR DICHA ENFERMEDAD - Google Patents

PROTEÍNAS DE LA FAMILIA CRY COMO MARCADORES PARA DETERMINAR EL RIESGO A DESARROLLAR UNA α-SINUCLEINOPATÍA O DETERMINAR DICHA ENFERMEDAD Download PDF

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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Definitions

  • Proteins of the Crv family as markers to determine the risk of developing an ⁇ -synucleinopathy or determining said disease.
  • the present invention falls within the field of medical sciences and more specifically refers to a method for determining the risk of developing an ⁇ -synucleinopathy or determining said neurodegenerative disease, preferably Parkinson's disease, by detecting and / or quantifying Cry proteins, neurotoxic agents that can give rise to this disease.
  • neurodegenerative diseases are the consequence of abnormalities in the process of certain proteins (mainly the amyloid proteins synuclein and Tau) that intervene in the cell cycle and that, when accumulating in the nervous tissue, inside and outside the neurons, decrease or cancel their functions producing clinical manifestations, mainly dementia.
  • proteins mainly the amyloid proteins synuclein and Tau
  • a classification of neurodegenerative diseases is based on the presence of abnormal accumulations of the tau proteins and the a-synuclein protein giving rise to ⁇ -synucleinopathies and taupatias.
  • ⁇ -synucleinopathy is used to refer to those neurodegenerative diseases that have in common the abnormal deposition of a-synuclein in the cytoplasm of neurons or glial cells, or in the neuropil in the form of Lewy bodies or the like.
  • ⁇ -Synuclein is a presynaptic protein that seems to be involved in synaptic plasticity processes. The conformational and biochemical changes that this protein undergo determine cytoplasmic inclusions that characterize various disorders Neurodegenerative diseases including Parkinson's disease, Lewy body dementia and multisystemic atrophy.
  • Parkinson's disease is one of the most important neurodegenerative disorders, affecting almost 1% of the population over 65 who begins slowly and progressively, at a variable rate, for 10-20 years or more before end in severe disability and death.
  • Parkinson's disease is characterized by the progressive death of dopaminergic neurons of the black substance, resulting in a decrease in striatal dopamine concentration, conditioning the appearance of muscle stiffness, slowness of movement and tremor.
  • the symptomatology of PD is mainly due to the strong loss of dopamine neurons located in the black substance (greater than 80%), a midbrain nucleus that receives this name due to its dark appearance due to the high presence of the neuromelanin pigment.
  • the black substance through the nigrostriate pathway participates in the normal modulation of the movement. Dysfunction of this pathway due to lack of dopamine causes serious motor disorders, such as tremor at rest, akinesia, difficulty walking, normal balance disturbance, amymia (lack of facial expression), etc.
  • PET Positron emission tomography
  • 15 fluorodopa radioactive dopaminergic markers
  • Lewy bodies inclusions of 5 to 25 microns in diameter with a dense eosinophilic nucleus composed of deposits of proteins such as ubiquitins, ⁇ -synuclein and neurofilament residues and surrounded by a pale halo (Lewy FH, Pathologi Anatomie, 1912, 920- 933), are not only detected in the black substance but have also been seen in other places of the nervous system, such as the intestinal plexus, the olfactory bulb, mesencephalic centers and even in the cerebral cortex, suggesting the presence of a disease global neurodegenerative
  • pathogens that may be related to the appearance of PD have led to different theories that suggest that several pesticides such as rotenone, dieldrin, dithiocarbamates and 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3 , 6-tetrahydropyridine (MPTP) a contaminant of heroin, cause parkinsonian conditions (Langston JW, Ballard PA Jr. N Engl J Med. 1983, 309 (5), 310), however, its environmental presence in the genesis of EP has not been proven.
  • MPTP 6-tetrahydropyridine
  • Lewy bodies would therefore be due to the action of an unknown pathogen capable of causing the alteration of the ⁇ -synuclein that would be deposited forming the proteinaceous nucleus of the Lewy body.
  • the pathogen could be a bacterium, a neurotrope virus (with affinity for nerve tissue) or a prion (pathogenic abnormal proteins perhaps similar to ⁇ -synuclein), but so far no pathogen capable of producing ⁇ -synucleinopathies has been identified and, specifically, EP.
  • the present invention relates to a method for determining the risk of developing an ⁇ -synucleinopathy (neurodegenerative disease that involves the formation of ⁇ -synuclein inclusions) or determining said neurodegenerative disease by the detection and / or quantification of Cry proteins, agents neurotoxics that can give rise to this disease.
  • the ⁇ -synucleinopathy is Parkinson's.
  • the The present invention relates to a Cry protein specific antibody or a fragment thereof for use as a biomarker to determine the risk of developing ⁇ -synucleinopathy or to determine said neurodegenerative disease.
  • the present invention shows how Cry proteins, delta-endotoxins from Bacillus thuringiensis (Bt), are capable of inducing a-synucleinopathy and more preferably Parkinson's disease, in a healthy individual.
  • Cry proteins were only known for their potent activity as an insecticide.
  • An important characteristic of the Cry proteins produced by Bt besides being an important alternative to the traditional chemical insecticides that generated environmental pollution problems, is that they were considered highly specific and safe for vertebrates and other non-target insects. Therefore, Bt has become the most widely used biological insecticide and transgenic plants that produce Cry toxins have been developed, and in particular CryIA toxin, which confer resistance to the plant against the attack of pest insects, making this toxin one of the most successful bioinsecticides worldwide.
  • the present invention reveals the toxic effects that these neurotoxins produce in animals and humans and provides a method for the diagnosis of ⁇ -synucleinopathies and more preferably PD, before the development of nerve degeneration and the onset of symptoms of disease based on the identification of Cry type oxidizing proteins in a biological tissue or fluid, where the biological fluid is preferably cerebrospinal fluid or plasma.
  • the present invention also provides a treatment capable of preventing or curing these diseases through passive immunotherapy based on vaccination with antibodies specific for Cry proteins.
  • the present invention solves the technical problem posed by the difficulty of finding a diagnostic method capable of identifying the pathology before the development of nerve degeneration and the appearance of the characteristic symptomatology associated with ⁇ -synucleinopathies and more preferably the Parkinson's disease, allowing among other applications:
  • a first aspect of the present invention relates to the method, hereinafter the method of the invention, for determining the risk of developing an ⁇ -synucleinopathy or determining said neurodegenerative disease comprising: a. obtain an isolated biological sample from an individual,
  • step (a) detect and / or quantify a protein with at least 65% identity with SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or with at least 55% identity with SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof, in the sample obtained in step (a).
  • Said method of the invention is a method of obtaining useful data to determine the risk of developing an ⁇ -synucleinopathy or determining said neurodegenerative disease in an individual.
  • risk of developing an ⁇ -synucleinopathy refers to the predisposition of an individual to suffer or develop said neurodegenerative disease.
  • the method provides useful data to determine if an individual is developing or can develop a-synucleinopathy.
  • ⁇ -synucleinopathy refers to all those neurodegenerative diseases related to cognitive disorders due to an increase in the processes of cell death, reducing the number of neurons and generating changes in behavior, which have in common the abnormal deposition of ⁇ -synuclein in the cytoplasm of neurons or glial cells, or in the neuropil, forming inclusions of ⁇ -synuclein that may be in the form of Lewy bodies.
  • Such diseases are, but are not limited to, Shy-Drager disease, multisystemic atrophy, Pick's disease, Lewy body syndrome, dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease.
  • a-synucleinopathy is Parkinson's disease.
  • isolated biological sample refers to, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of an individual, preferably cerebrospinal fluid or plasma, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • individual refers to mammals, preferably humans or animals.
  • protein refers to any isolated or recombinant amino acid sequence comprising two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds, that is, peptide isoesters.
  • % identity refers to the% identity between two amino acid sequences, that is, the number of amino acid positions over the total length of the sequence being compared, where all Amino acids in that position are identical.
  • the protein detected and / or quantified in step (b) of said method, described in previous paragraphs, can have at least 65, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 79, 80, 83, 85 , 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100% identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2 and at least one 55, 56, 58, 60, 63 , 65, 67, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 79, 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100% identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 3.
  • the protein detected and / or quantified in step (b) has at least 80% identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2 or at least 70% identity with respect to to the sequence SEQ ID NO: 3. More preferably the protein detected and / or quantified in step (b) has at least 90% identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2 or at least 80% identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 3. Even more preferably said protein is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the CryIAb protein of Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki strain HD-1 with accession number AAA22561, protein contained in Dipel n highest proportion
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the CryIAa protein of Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki strain HD -1 with accession number AAA22353
  • SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence ca of the Bacillus thuringiensis subspecies CryIAc protein kurstaki strain HD-1 with accession number AAD38701.
  • Table 1 shows the percentages of identity of the three proteins with each other. Data obtained through the use of the ClustalW2 program.
  • CryIAb amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and accession number AAA22561
  • CryIAa amino acid sequence SEQ ID NO: 2 and accession number AAA22353
  • CryIAc amino acid sequence SEQ ID NO: 3 and accession number AAD38701.
  • Table 2 shows the percentages of protein identity belonging to subtype 1A with respect to the sequence protein SEQ ID NO: 1.
  • identity percentages of proteins belonging to subtype 1A with respect to the sequence proteins SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 respectively are shown in Tables 3 and 4.
  • Proteins with a percentage of identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of at least 65% are isoforms or amino acid sequences that are homologous to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 respectively in Bacillus thuringiensis bacteria and proteins with a percentage of identity with respect to the sequence SEQ ID NO: 3 of at least 55% are isoforms or amino acid sequences that are homologous to SEQ ID NO: 3 in the Bacillus thuringiensis bacteria.
  • detect and / or quantify refers to the detection of the presence and / or the measure of the amount or concentration, preferably semi-quantitative or quantitative.
  • the detection and / or quantification of the protein of the invention can be carried out by any method known in the state of the art.
  • the detection and / or quantification is carried out by immunoassay.
  • immunoassay refers to any analytical technique, based on the conjugation reaction of the amino acid sequence of the protein of the invention, its variants or a fragment thereof. with an antibody that recognizes them.
  • immunoassays known in the state of the art are, for example, but not limited to: immunoblot, enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA), linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, immunohistochemistry or protein microarrays.
  • ELISA enzyme-linked immunoadsorbent assay
  • LIA linear immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • immunofluorescence immunohistochemistry or protein microarrays.
  • the immunoassay can be an enzyme-linked immunoadsorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
  • ELISA is based on the premise that an immunoreactive (biological sample antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then bringing that system into contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a marker compound.
  • immunoreactive biological sample antigen or antibody
  • the ELISA may be an indirect ELISA, which may comprise the following steps: (a) coating a solid support with a cell lysate with the protein of the invention (b) incubating the coated support of step (a) with an isolated biological sample obtained from the individual under conditions that allow the formation of an immunocomplex of the antibody against the protein of the invention present in the sample, with the antigens comprising the protein of the invention; and (c) incubating with a secondary antibody, which recognizes the antibody against the amino acid sequence of the protein of the invention, conjugated or bound to a marker compound.
  • marker compound refers to a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive and / or chemiluminescent signal that allows the detection and / or quantification of the amount of the antibody against the amino acid sequence of the protein of the invention.
  • the marker compound is selected from the list comprising radioisotopes, enzymes, fluorophores or any molecule capable of being conjugated with another molecule or detected and / or quantified directly. This marker compound can bind to the antibody directly, or through another compound.
  • directly binding marker compounds are, but are not limited to, enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase, radioactive isotopes such as 33P or 35S, fluorochromes such as fluorescein or metal particles, for direct detection by colorimetry, auto-radiography, fluorimetry , or metallography, respectively.
  • the method of the invention further comprises comparing the data obtained in (b) with reference values to find a significant deviation.
  • the method of the invention further comprises attributing the significant deviation to the risk of developing an-synucleinopathy or the presence of said neurodegenerative disease in the individual.
  • the ⁇ -synucleinopathy is Parkinson's.
  • significant deviation refers to the presence of the protein of the invention or a greater concentration thereof in the isolated biological sample with respect to a sample of a healthy individual, is that is, an individual who does not present said protein or present it in a concentration at which the protein does not produce any toxic effects in the organism.
  • the deviation of the results obtained in section (b) is compared with respect to controls or reference values. Controls or reference values are, but are not limited to, those samples that do not present the proteins of the invention or present it at a concentration in which the protein is harmless.
  • mice Considering their neurotoxic levels in mice (example 1), their concentration in the plasma of a human individual so that they do not exert a toxic effect on it, should be less than 10 mg / l of blood.
  • This deviation is a significant deviation from the established statistical standards, such as, but not limited to, the deviation from the mean or median with respect to the control. However, the statistically significant deviation can be determined by any statistical technique known to the person skilled in the art.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the protein of the invention or of a specific antibody to the protein of the invention, or any fragment thereof, as a biomarker to determine the risk. of developing an ⁇ -synucleinopathy or to determine said neurodegenerative disease.
  • the ⁇ -synucleinopathy is Parkinson's.
  • biomarker or, alternatively, “molecular marker”, as used herein, refers to a molecule or the expression product of a gene or fragments and variants thereof that show substantial changes in a determined disease and that can be used both to determine the risk of developing the disease and to determine said disease by detecting the appearance of said changes in the biomarker.
  • biomarker can also be used to track the efficacy of a treatment for that disease by detecting changes in the biomarker as opposed to those that occur in the disease or clinical situation.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with the protein of the invention.
  • immunoglobulin M immunoglobulin M
  • IgD immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgA immunoglobulin A
  • IgE immunoglobulin E
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a protein inhibitor agent of the invention for the manufacture of a medicament, hereinafter medicament of the invention, wherein said medicament has a therapeutically effective amount of inhibitor agent.
  • the inhibitory agent is capable of generating an immune response in an individual. More preferably the inhibitory agent is a protein specific antibody of the invention.
  • a preferred embodiment relates to the medicament of the invention, for the treatment and / or prevention of an ⁇ -synucleinopathy, where preferably the ⁇ -synucleinopathy is Parkinson's.
  • treatment refers to combating the effects caused as a result of a disease or pathological condition of interest in a subject (preferably mammal, and more preferably a human) that includes:
  • prevention consists in preventing the onset of the disease, that is, preventing the disease or pathological condition from occurring in a subject (preferably mammal, and more preferably a human), in particularly, when said subject has a predisposition for the pathological condition, but has not yet been diagnosed as having it.
  • an effective amount of a protein inhibitor agent of the invention is an amount sufficient to treat and / or prevent neurodegenerative disease.
  • a "therapeutically effective amount” of the protein inhibitor agent of the invention for treating and / or preventing a disease or disorder is an amount of sufficient inhibitory agent to reduce or eliminate the symptoms of the disease or disorder.
  • the effective amount of a given substance will vary with factors such as the nature of the substance, the route of administration, the size and species of the animal that will receive the substance and the purpose for which the substance is given. The effective amount in each individual case can be determined empirically by the person skilled in the art according to the procedures established in the art.
  • inhibitory agent or, alternatively, “inhibitor compound” as used herein refers to a molecule that, when bound or interacts with the protein of the invention, decreases or eliminates intensity or duration. of its biological activity. This definition also includes those compounds such as interfering RNAs that prevent or decrease the expression of the gene encoding the protein of the invention, that is, that prevent or diminish gene transcription, mRNA maturation, mRNA translation and post-translational modification.
  • An inhibitory agent may be constituted by a peptide, a protein, a nucleic acid or polynucleotide, a carbohydrate, an antibody, a chemical compound or any other type of molecule that diminishes or eliminates the effect and / or function of the protein in the invention.
  • the term "medicament of the invention”, as used herein, refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • the medicament referred to in the present invention can be for human or veterinary use.
  • the "medicine for human use” is any substance or combination of substances that is presented as having properties for the treatment or prevention of diseases in humans or that can be used in humans or administered to humans in order to restore, correct or modify physiological functions exerting a pharmacological, immunological or metabolic action, or establishing a medical diagnosis.
  • the "veterinary medicinal product” is any substance or combination of substances that is presented as having curative or preventive properties with respect to animal diseases or that can be administered to the animal in order to restore, correct or modify its physiological functions by exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or to establish a veterinary diagnosis.
  • veterinary drugs are "premezcias for medicated feed” prepared to be incorporated into a feed.
  • the term “medicament of the invention” refers to a protein-inhibiting agent of the invention, which is capable of generating an immune response against a given organism, which is causing said disease in man. or the animals
  • the medicament of the invention is a vaccine.
  • the term "vaccine” refers to an antigenic preparation used to establish the response of the immune system to a disease, antigen preparations that once inside the organism elicit the response of the immune system, through production of antibodies, and generate immunological memory producing permanent or transient immunity.
  • the vaccine may comprise pharmacologically acceptable excipients such as, but not limited to, an adjuvant.
  • the vaccine has a recombinant origin.
  • adjuvant refers to an agent, as long as it does not have an antigenic effect in itself, which can stimulate the immune system by increasing its response to the vaccine.
  • aluminum salts “aluminum phosphate” and “aluminum hydroxide” are the two adjuvants most commonly used in vaccines. Other substances, such as squalene, can also be used as adjuvants.
  • the medicament of the invention is presented in a form adapted to parenteral, cutaneous, oral, epidural, sublingual, nasal, intracatecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal or inhaled administration.
  • the adapted form refers to how to adapt the medicament of the invention so that it can be administered for example but not limited, parenterally, orally, rectally or transdermally.
  • Parenteral administration refers to a physical state that can allow its injectable administration, that is, preferably in a liquid state.
  • Parenteral administration can be carried out by intramuscular, intra-arterial, intravenous, intradermal, subcutaneous or intraosseous administration but not limited to these types of parenteral administration routes.
  • the form adapted to oral administration is selected from the list comprising, but not limited to, drops, syrup, herbal tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, seal, pill, tablet, tablet, tablet, troccus or lyophilized.
  • the form adapted to rectal administration is selected from the list comprising, but not limited to, suppository, rectal capsule, rectal dispersion or rectal ointment.
  • the form adapted to transdermal administration is selected from the list comprising, but not limited to, transdermal patch or iontophoresis.
  • the medicament of the invention comprises at least one excipient and / or at least one pharmacologically acceptable carrier. In another preferred embodiment the medicament of the invention comprises at least one other active ingredient.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the medicament of the invention, stabilizes it or helps its preparation in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protection function of the medicament of the invention such as for example isolating it from the air and / or moisture, filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • a “pharmacologically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the carrier can be an inert substance or action analogous to any of the compounds of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the medicament of the invention as well as other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and form. When the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • active principle is any matter, whatever its origin, human, animal, plant, chemical or other, to which an appropriate activity is attributed to constitute a medicine.
  • composition of the invention which comprises at least one protein inhibitor agent of the invention,
  • the inhibitory agent is capable of generating an immune response in an individual.
  • the pharmaceutical composition is a set of components that is formed at least by a protein-inhibiting agent of the invention, which has at least one application in the improvement of the physical or physiological or psychological well-being of a subject, which implies an improvement of the general state of your health, for example a cosmetic application, although it may not imply a physiological effect on the organism, it implies an improvement in the well-being of the subject related to his psychology. Therefore, said pharmaceutical composition may be a personal hygiene product, a cosmetic product or a product that may constitute the basis for the preparation of the above products or the basis for the preparation of a medicament. Preferably the pharmaceutical composition is used for the preparation of a medicament.
  • the "personal hygiene product” is defined as the substances or preparations that, without having the legal consideration of medicines, medical devices, cosmetics or biocides, are intended to be applied to the skin, teeth or mucous membranes of the human body for the purpose of hygiene or aesthetic, or to neutralize or eliminate ectoparasites.
  • the "cosmetic product” is defined as any substance or preparation intended to be put in contact with the various surface parts of the human body (epidermis, hair and hair system, nails, lips and external genital organs) or with teeth and oral mucous membranes , with the exclusive or main purpose of cleaning them, perfuming them, modifying their appearance, and / or correcting body odors, and / or protecting them or keeping them in good condition.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises at least one excipient and / or at least one vehicle. pharmacologically acceptable. In another preferred embodiment the pharmaceutical composition of the invention comprises at least one other active ingredient.
  • kit hereinafter kit of the invention, comprising at least one molecule indicating the presence of the protein of the invention.
  • the molecule is at least one antibody specific to the protein of the invention.
  • kits of the invention to determine the risk of developing an ⁇ -synucleinopathy or to determine said neurodegenerative disease, in an isolated biological sample of an individual, where the isolated biological sample can be, but without limited, a tissue or a biological fluid of said individual.
  • the kit of the invention provides useful data for determining the risk of developing an synucleinopathy or determining said neurodegenerative disease in an individual.
  • the biological sample is a biological fluid and more preferably cerebrospinal fluid or plasma.
  • the individual is, but not limited to, a mammal, preferably human or animal.
  • the ⁇ -synucleinopathy is Parkinson's.
  • FIGURES Fig. 1 Shows the levels of anti-oxidant molecules superoxide dismutase, glutathione, glutathione reductase and peroxidated glutathione.
  • IA It shows the levels measured in the black substance of rats exposed to Cry proteins (Dipel) or vehicle (control rats (not exposed to Cry proteins)) intraperitoneally six months after exposure.
  • the darkest bars represent the levels measured in the right black substance and the lighter bars represent the levels measured in the left black substance.
  • I B Displays the levels measured in the dorsal striatum of rats exposed to Cry ⁇ Dipel) or vehicle (control rats (not exposed to Cry proteins)) intraperitoneally, six months after exposure.
  • the darkest bars represent the levels measured in the right striatum and the lighter bars represent the levels measured in the left striatum.
  • Fig. 2 It shows the expression of tyrosine hydroxylase (TH) and neuropathological alterations in brain sections of 22 month old rats exposed to Cry proteins at six months of age. 2A. It shows an image of a rat mesencephalic section exposed to Cry proteins. Unilateral degeneration of the left black substance with intense TH neuronal loss (asterisk) is observed compared to the non-degenerated right black substance.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • 2B-2D It shows degenerate regions of the black substance in 2A. Intense neuronal loss is shown with dystrophic and thickened neurites (2B), TH + neurons with strange shapes with dystrophic neurites (white arrows Figure 2C) and the boundary between the degenerated area (right in Figure 2D) and non-degenerated (left in the Figure 2D) of the black substance.
  • Fig. 3 It shows the expression of tyrosine hydroxylase (TH) and neuropathological alterations in rat brain sections of 22 months of age, exposed to Cry proteins at six months of age.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • 3A It shows the mesencephalic section of a rat exposed to Cry proteins. Intense degeneration of the black substance is observed, compared to the contralateral black substance.
  • 3B It shows regional degeneration of the lateral end of the black substance (indicated by dashed line) in a rat exposed to Cry proteins.
  • 3C. 3B enlarged image. It shows intense neuronal loss with dystrophic and thickened (degenerated) neurites. 3D It shows the very degenerated black substance of another rat exposed to Cry proteins where only a few TH + neurons remain (white arrows) and numerous dystrophic neurites are observed in the black substance.
  • Fig. 4. Shows the expression of ⁇ -synuclein or eosinophilic inclusions in rats exposed to Cry proteins at six months of age.
  • SNc black substance pars compacta
  • SNr cross-linked pars black substance
  • 4G-4H It shows a staining with hematoxylin-eosin where the presence of neurons with dense eosinophilic cytoplasm (black arrowheads) in the black substance is observed (in 4H, the enlarged image of a eosinophilic neuron).
  • Fig. 5 It shows an ELISA and colorimetric analysis of the presence of Cry proteins in mesencephalic brain tissue (ventral segment and black substance) of rats exposed to Cry proteins at six months of age, and sacrificed at 22 months of age.
  • Solutions containing mesencephalic tissue from rats exposed to Cry proteins included in the Dipel bioinsecticide (formulation of the HD-1 strain of Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki, containing 28% CryIAa, 53% CryIAb, 19% CryIAc and spores are shown in dark ).
  • the invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which demonstrates the specificity and effectiveness of the method of the invention for determining ot-synucleinopathy, neurodegenerative disease that occurs with the formation of a-synuclein inclusions, and, specifically, Parkinson's disease (PD), through the detection and / or quantification of Cry protein.
  • PD Parkinson's disease
  • the Cry protein is capable of inducing an ⁇ -synucleinopathy, where the ⁇ -synucleinopathy is preferably EP.
  • the exposure of laboratory rats (Wistar lineage) to Dipel a commercial insecticidal composition containing the CryIA protein of Bacillus thuringiensis gave rise to an oxidative process in the nervous system accompanied by, among other pathologies, neuronal loss and appearance of intraneuronal deposits of a-synuclein similar to Lewy bodies that appear in neurodegenerative diseases type EP.
  • the following specific examples provided in this patent document serve to illustrate the nature of the present invention.
  • Dipel (formulation of the HD-1 strain of Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki, containing 28% CryIAa, 53% CryIAb, 19% CryIAc and spores) was injected into laboratory rats of the Wistar line with six months of age for 20 days, by intraperitoneal injections. Dipel was injected at a daily dose of 1 mg / 100 g of weight.
  • the black substance was dissected under a microscope and froze immediately. Then, the tissue was thawed, and homogenized in a buffer (homogenous buffer) with 150 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1 mM fluorinated phenylmethisulfonyl, 0.6 ⁇ leupeptin, and 1% Triton X-100, pH 7.4.
  • a buffer homogenous buffer
  • nitrotyrosine, nitric oxide synthetase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase were quantified with commercial Bioxytech kits (Oxis International Inc., Portland, OR, USA: Nitrotyrosine-EIA, NOS -22113, GR-340, cGPX-340, and SOD-525).
  • glutathione and glutathione-S-transferase levels were measured with BioVision incorporated kits (Mountain View, CA, USA: Glutathione Assay Kit (K264-100), and GST (K263-100)). Data were compared with one-way ANOVA followed by Bonferroni test.
  • mesencephalic tissue was obtained containing the black substance of rats treated with Dipel pesticide and control rats.
  • the kit was used according to the manufacturer's suggestions (Pathoscreen kit for Bt-Cry1 Ab / 1 Ac protein, peroxidase label, Agdia Incorporated, Indiana, USA).
  • the test gave a positive result (turn to blue; in Figure 5 dark wells) indicating the presence of Cry1Ab-Ac proteins.
  • the rats were sacrificed at 22 months of age, the brain was removed and stored in 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (PB) (pH 7.2-7.4) at 4 ° C, and then immersed overnight in 20% sucrose in PBS (phosphate buffered saline). Brain sections (30 ⁇ ⁇ thickness) were cut in a cryostat (Microm, Italy) and stored in PBS.
  • PB phosphate buffer
  • PBS-T Triton X-100
  • FCS bovine fetal serum
  • BSA bovine serum albumin
  • mice anti-tyrosine-hydroxylase monoclonal antibody anti-tyrosine-hydroxylase monoclonal antibody
  • mouse anti-alfasinuclein antibody from English mouse anti-alpha-synuclein antibody (1: 1000, Sigma-Aldrich) in PBS-T
  • biotin-conjugated mouse antibody from English anti-mouse biotin conjugated antibody
  • the ABC kit (1: 100, Pierce, USA) was then used, and the tissue was developed with diaminobenzidine 3,3'-tetrahydrochloride ⁇ DAB, Sigma-Aldrich, USA) as a chromogen, and hydrogen peroxide.
  • the Cavaleri principle and the physical dissector were applied according to the usual laboratory methodology (Fernández Espejo E., et al., J Neurosci 2001, 21, 9888-9895; El Banoua F, et al., Neurobiol Disease 2004, 16, 377-385; Galán-Rodr ⁇ guez B, et al., Neurobiol Disease 2008, 29, 529-542.
  • Oxidative stress in the black substance was detected bilaterally, although the degeneration of the black substance was partial or unilateral, indicating that other phenomena apart from oxidation must be involved in neurodegeneration.
  • these proteins are responsible for the appearance in rodents of a neurodegenerative condition characterized by the oxidative action of Cry proteins on the nigrostriated circuit and other short-term catecholaminergic centers, and the rest of pathological characteristics of diseases neurodegeneratives that occur with the formation of ⁇ -synuclein inclusions (or ⁇ -synucleinopathies) and, in particular, with long-term PE, including: degeneration of the black substance with neuronal death of dopamine neurons as well as of other catecholaminergic centers such as dorsal raphe and the presence of intraneuronal deposits of ⁇ -synuclein in the cytoplasm of dopamine neurons of the black substance.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para determinar el riesgo a desarrollar una a-sinucleinopatía o determinar dicha enfermedad neurodegenerativa, mediante la detección y/o cuantificación de proteínas Cry, agentes neurotóxicos que pueden dar lugar a dicha enfermedad. Preferentemente la a-sinucleinopatía es Parkinson.

Description

Proteínas de la familia Crv como marcadores para determinar el riesgo a desarrollar una α-sinucleinopatía o determinar dicha enfermedad.
La presente invención se encuadra dentro del campo de las ciencias médicas y más concretamente se refiere a un método para determinar el riesgo a desarrollar una α-sinucleinopatía o determinar dicha enfermedad neurodegenerativa, preferentemente la enfermedad de Parkinson, mediante la detección y/o cuantificación de proteínas Cry, agentes neurotóxicos que pueden dar lugar a dicha enfermedad.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El conocimiento de las enfermedades neurodegenerativas ha estado circunscrito durante muchos años a sus aspectos clínicos. Hoy sabemos que las enfermedades neurodegenerativas son la consecuencia de anormalidades en el proceso de ciertas proteínas (principalmente las proteínas amiloides sinucleina y Tau) que intervienen en el ciclo celular y que, al acumularse en el tejido nervioso, dentro y fuera de las neuronas, disminuyen o anulan sus funciones produciendo manifestaciones clínicas, principalmente demencia.
Así, una clasificación de las enfermedades neurodegenerativas se basa en la presencia de acúmulos anormales de las proteínas tau y de la proteína a- sinucleína dando lugar a las α-sinucleinopatías y a las taupatías.
El término α-sinucleinopatía se utiliza para referirse a aquellas enfermedades neurodegenerativas que tienen en común el depósito anormal de a-sinucleína en el citoplasma de neuronas o de células gliales, o en el neurópilo en forma de cuerpos de Lewy o similar. La α-sinucleína es una proteína presináptica que parece estar involucrada en procesos de plasticidad sináptica. Los cambios conformacionales y bioquímicos que sufre esta proteína determinan inclusiones citoplasmáticas que caracterizan a diversos trastornos neurodegenerativos entre los que se incluyen la enfermedad de Parkinson, la demencia por cuerpos de Lewy y la atrofia multisistémica.
La enfermedad de Parkinson (EP) es uno de los desórdenes neurodegenerativos más importantes, afectando a casi un 1 % de la población mayor de 65 años que comienza de forma lenta y progresiva, a ritmo variable, durante 10-20 años o más antes de terminar en invalidez grave y muerte.
Originalmente descrita por James Parkinson en 1817, de un modo preciso: "movimiento trémulo involuntario, con debilidad muscular, en parte sin estar en acción o incluso afectando el normal apoyo; con tendencia al encorvamiento hacia delante y a acelerar el paso sin motivo; estando los sentidos y el intelecto intactos", la enfermedad de Parkinson se caracteriza por la muerte progresiva de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, lo que produce disminución de la concentración de dopamina estriatal, condicionando aparición de rigidez muscular, lentitud de movimientos y temblor.
La sintomatología de la EP se debe principalmente a la fuerte pérdida de neuronas de dopamina localizadas en la sustancia negra (mayor del 80%), un núcleo del mesencéfalo que recibe dicho nombre por su aspecto oscuro debido a la alta presencia del pigmento neuromelanina. La sustancia negra a través de la vía nigroestriada, participa en la normal modulación del movimiento. La disfunción de esta vía por falta de dopamina origina trastornos motores serios, como temblor en reposo, acinesia, dificultad para caminar, alteración del equilibrio normal, amimia (falta de expresión facial), etc. Las imágenes de tomografía de emisión de positrones (PET) de personas con EP utilizando marcadores dopaminérgicos radioactivos (15fluorodopa) que se emplean para el diagnóstico enfermedad, muestran claramente la hipoactividad dopaminérgica en los ganglios básales. A más o menos largo plazo la persona también sufre de trastornos de memoria, emocionales, e incluso demencia, pues se van afectando funciones superiores. El rasgo neuropatológico más característico de la EP es la presencia de los llamados cuerpos de Lewy en la sustancia negra. Los cuerpos de Lewy, inclusiones de 5 a 25 mieras de diámetro con un núcleo eosinofílico denso compuesto por depósitos de proteínas como ubiquitinas, α-sinucleína y restos de neurofilamentos y rodeado por un halo pálido (Lewy FH, Pathologische Anatomie, 1912, 920-933), no sólo se detectan en la sustancia negra sino que se han visto también en otros lugares del sistema nervioso, como los plexos intestinales, el bulbo olfatorio, centros mesencefálicos y hasta en la corteza cerebral, lo que sugiere la presencia de una enfermedad neurodegenerativa global.
La presencia de α-sinucleína en las inclusiones de cuerpos de Lewy hace por tanto que la EP se incluya dentro del grupo de las a-sinucleinopatías.
Aunque la causa de la EP es desconocida, se acepta que existe un factor genético importante cuando la enfermedad aparece a edades tempranas (anterior a los 50 años) y, en ausencia de una causa genética, las influencias ambientales parece que juegan un papel determinante en la patogénesis de la EP. En esta línea, se propone que la acción oxidativa de un patógeno desconocido (toxina ambiental) puede ser la causa de la formación de inclusiones de α-sinucleína en forma de cuerpos de Lewy.
La búsqueda de agentes patógenos que puedan estar relacionados con la aparición de la EP ha dado lugar a distintas teorías que apuntan que varios pesticidas como la rotenona, la dieldrina, los ditiocarbamatos y la 1-metil-4- fenil-1 ,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) un contaminante de la heroína, provocan cuadros parkinsonianos (Langston JW, Ballard PA Jr. N Engl J Med. 1983, 309(5), 310), sin embargo, su presencia ambiental en la génesis de la EP no ha sido demostrada. Por otro lado, otras investigaciones dirigidas al estudio de patógenos ambientales relacionados con la EP, apoyan la teoría de patógenos de tipo bacteriano o vírico que dañarían el sistema nervioso poniendo en marcha procesos oxidativos.
La presencia de cuerpos de Lewy en determinados centros cerebrales ha sido estudiada por diversos grupos de investigación (Braak H, Del Tredici K. Exp Neurol. 2008, 212(1), 226-229) y en estos estudios se propone que en la EP estaría involucrado un patógeno desconocido que afecta centros nerviosos de un modo ordenado y predecible.
Así, se ha visto que el proceso patológico afecta a algunos tipos neuronales de los plexos nerviosos del intestino, sistema nervioso periférico y sistema nervioso central que se desarrolla durante años. El factor común es que se afectan centros conectados entre sí por fibras nerviosas no mielínicas. La formación de los cuerpos de Lewy sería debida, por tanto, a la acción de un patógeno desconocido capaz de provocar la alteración de la α-sinucleína que se depositaría formando el núcleo proteináceo del cuerpo de Lewy.
El patógeno podría ser una bacteria, un virus neurotropo (con afinidad por el tejido nervioso) o un prión (proteínas anómalas patógenas quizás similares a la α-sinucleína), pero hasta el momento no se ha identificado ningún patógeno capaz de producir α-sinucleinopatías y, en concreto, EP.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para determinar el riesgo a desarrollar una α-sinucleinopatía (enfermedad neurodegenerativa que cursa con la formación de inclusiones de α-sinucleína) o determinar dicha enfermedad neurodegenerativa mediante la detección y/o cuantificación de proteínas Cry, agentes neurotóxicos que pueden dar lugar a dicha enfermedad. Preferentemente la α-sinucleinopatía es Parkinson. Asimismo, la presente invención se refiere a un anticuerpo específico de las proteínas Cry o un fragmento del mismo para su uso como biomarcador para determinar el riesgo a desarrollar la α-sinucleinopatía o para determinar dicha enfermedad neurodegenerativa.
La presente invención muestra cómo las proteínas Cry, delta-endotoxinas procedentes de Bacillus thuringiensis (Bt), son capaces de inducir una a- sinucleinopatía y más preferentemente la enfermedad de Parkinson, en un individuo sano.
Hasta ahora las proteínas Cry sólo eran conocidas por su potente actividad como insecticida. Una característica importante de las proteínas Cry producidas por Bt, además de ser una importante alternativa a los tradicionales insecticidas químicos que generaban problemas de contaminación ambiental, es que se consideraban altamente específicas e inocuas para vertebrados y otros insectos no diana. Por todo ello, Bt se ha convertido en el insecticida biológico más utilizado y se han desarrollado plantas transgénicas que producen toxinas Cry, y en particular la toxina CryIA, que confieren resistencia a la planta frente el ataque de insectos plaga, convirtiéndose esta toxina en uno de los bioinsecticidas con mayor éxito a escala mundial.
Sin embargo, la presente invención revela los efectos tóxicos que producen estas neurotoxinas en animales y humanos y proporciona un método para el diagnóstico de α-sinucleinopatías y más preferentemente la EP, antes del desarrollo de la degeneración nerviosa y la aparición de los síntomas de la enfermedad basado en la identificación de proteínas oxidantes tipo Cry en un tejido o fluido biológico, donde el fluido biológico es, preferentemente, líquido cefalorraquídeo o plasma.
Es de destacar que en la presente invención se revela además el potencial que poseen los anticuerpos específicos de las proteínas Cry como marcadores para el diagnóstico de dichas enfermedades neurodegenerativas y, en particular, de la EP, de forma que la presente invención proporciona también un tratamiento capaz de prevenir o curar estas enfermedades a través de inmunoterapia pasiva basada en la vacunación con anticuerpos específicos para las proteínas Cry.
Por tanto, la presente invención resuelve el problema técnico que plantea la dificultad de encontrar un método de diagnóstico capaz de identificar la patología antes del desarrollo de la degeneración nerviosa y la aparición de la sintomatología característica asociada a las α-sinucleinopatías y más preferentemente a la enfermedad de Parkinson, permitiendo entre otras aplicaciones:
• Detectar proteínas oxidantes tipo Cry en un tejido o fluido biológico, donde el fluido biológico es, preferentemente, líquido cefalorraquídeo o plasma, mediante un anticuerpo específico para las proteínas Cry, proporcionando un método fiable para el diagnóstico de la EP y otras a-sinucleinopatías.
• Prevenir y/o tratar dichas enfermedades a través de inmunoterapia pasiva utilizando una dosis eficiente de anticuerpo que reaccione específicamente contra las proteínas Cry detectadas.
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere al método, en adelante método de la invención, para determinar el riesgo a desarrollar una α-sinucleinopatía o determinar dicha enfermedad neurodegenerativa que comprende: a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo,
b. detectar y/o cuantificar una proteína con al menos un 65% de identidad con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o con al menos un 55% de identidad con SEQ ID NO:3 o un fragmento de las mismas, en la muestra obtenida en el paso (a).
Dicho método de la invención es un método de obtención de datos útiles para determinar el riesgo a desarrollar una α-sinucleinopatía o determinar dicha enfermedad neurodegenerativa en un individuo.
El término "riesgo a desarrollar una α-sinucleinopatía" tal y como se entiende en la presente invención se refiere a la predisposición de un individuo para sufrir o desarrollar dicha enfermedad neurodegenerativa. Así el método proporciona datos útiles para determinar si un individuo está desarrollando o puede desarrollar la a-sinucleinopatía.
El término "α-sinucleinopatía" tal y como se entiende en la presente invención se refiere a todas aquellas enfermedades neurodegenerativas relacionadas con desórdenes cognitivos debidos a un aumento en los procesos de muerte celular, reduciendo el número de neuronas y generando cambios en la conducta, que tienen en común el depósito anormal de α-sinucleína en el citoplasma de neuronas o de células gliales, o en el neurópilo, formando inclusiones de α-sinucleína que pueden estar en forma de cuerpos de Lewy.
Tales enfermedades son, pero sin limitarse, la enfermedad de Shy-Drager, la atrofia multisistémica, la enfermedad de Pick, el síndrome de cuerpos de Lewy, la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson. Preferentemente la a-sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson.
A lo largo de la presente invención se demuestra que la exposición a proteínas CryIA de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki a través de una composición bioinsecticida comercialmente conocida como Dipel (formulación de la cepa HD-1 de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki que contiene un 28% de CryIAa, un 53% de CryIAb y un 19% de CryIAc y esporas), provoca la oxidación de la sustancia negra de los animales expuestos, manifestado por una reducción de los niveles de sustancias anti-oxidantes como glutatión y superóxido dismutasa en dicha zona. Además, se revela degeneración en la sustancia negra con muerte neuronal de las neuronas de dopamina y otros centros catecolaminérgicos y la presencia de depósitos intraneuronales de a- sinucleína en el citoplasma de las neuronas de dopamina de la sustancia negra que se depositan con una disposición similar a la de los cuerpos de Lewy en humanos (ejemplo 1). Manifestaciones que concuerdan con las observadas en las α-sinucleinopatías y, en particular, en la enfermedad de Parkinson.
El término "muestra biológica aislada", tal y como se utiliza en la descripción se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, preferentemente líquido cefalorraquídeo o plasma, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a mamíferos, preferiblemente humanos o animales.
El término "proteína" hace referencia a cualquier secuencia aminoacídica aislada o recombinante que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos.
El término "% de identidad" tal y como se entiende en la presente invención se refiere al % de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, es decir, al número de posiciones aminoacídicas sobre la longitud total de la secuencia que se compara, donde todos los aminoácidos en esa posición son idénticos.
La proteína detectada y/o cuantificada en el paso (b) de dicho método, descrito en párrafos anteriores, puede tener al menos un 65, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 79, 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a la secuencia SEQ ID NO: 2 y al menos un 55, 56, 58, 60, 63, 65, 67, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 79, 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 3.
Preferiblemente la proteína detectada y/o cuantificada en el paso (b) posee al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a la secuencia SEQ ID NO: 2 o al menos un 70% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 3. Más preferiblemente la proteína detectada y/o cuantificada en el paso (b) posee al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a la secuencia SEQ ID NO: 2 o al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 3. Aún más preferiblemente dicha proteína es SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Donde SEQ ID NO: 1 es la secuencia aminoacídica de la proteína CryIAb de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 con número de acceso AAA22561 , proteína contenida en Dipel n mayor proporción, SEQ ID NO: 2 es la secuencia aminoacídica de la proteína CryIAa de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 con número de acceso AAA22353 y SEQ ID NO: 3 es la secuencia aminoacídica de la proteína CryIAc de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 con número de acceso AAD38701.
En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de identidad de las tres proteínas entre sí. Datos obtenidos mediante el uso del programa ClustalW2.
Tabla 1. Porcentajes de identidad entre las distintas proteínas CryIA que componen Dipel: CryIAb (de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 y número de acceso AAA22561), CryIAa (de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 y número de acceso AAA22353) y CryIAc (de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y número de acceso AAD38701).
SEQ SEQ
Proteína 1 ID N° Acceso Proteína 2 ID N° Acceso % de Identidad
NO. NO.
CryIAb 1 AAA22561 CryIAa 2 AAA22353 92 CrylAb 1 AAA22561 CrylAc 3 AAD38701 84
CrylAa 2 AAA22353 CrylAc 3 AAD38701 77
En la Tabla 2 se muestran los porcentajes de identidad de proteínas pertenecientes al subtipo 1A con respecto a la proteína de secuencia SEQ ID NO: 1 . Además, en las tablas 3 y 4 se muestran los porcentajes de identidad de proteínas pertenecientes al subtipo 1A con respecto a las proteínas de secuencia SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 respectivamente. Datos obtenidos de Blastp, NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
Tabla 2. Porcentajes de identidad de distintas proteínas CryIA con la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (número de acceso AAA22561 ).
% de
Proteína N° Acceso
Identidad
CryIAe [Bacillus
thuringiensis serovar
ZP_04106093.1 100
berliner ATCC 10792]
CrylAb [Bacillus
ABS18384.1 99
thuringiensis]
CryIAe [Bacillus
thuringiensis IBL ZP_04075355.1 95
200
CryIAf [Bacillus
AAB82749.1 93
thuringiensis]
CryIAe [Bacillus
thuringiensis
ZP_04 30277.1 91
subespecie
sotto str. T04001]
CrylAa [Bacillus
thuringiensis serovar BAA00257.1 90
aizawai] CrylAc [Bacillus
thuringiensis serovar CAA70856.1 90
kurstaki]
CrylAd [Bacillus AAA22340.1 86 thuringiensis]
CrylAg [Bacillus
Q9S515.1 86
thuringiensis]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis serovar ZP_04118188.1 86
kurstaki str. T03a001]
Cry1Ac22 [Bacillus
thuringiensis serovar ABZ01836.1 86
kurstaki]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis IBL ZP_04075345.1 66
200]
Tabla 3. Porcentajes de identidad de distintas proteínas Cry A con la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 (número de acceso AAA22353).
% de
Proteína N° Acceso
Identidad
Cry Aa [Bacillus
thuringiensis] P0A366.1 99
CrylAc [Bacillus
thuringiensis serovar CAA70856.1 99
kurstaki]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis serovar ZP_04130277.1 97
sotto str. T04001]
CrylAg [Bacillus
Q9S515.1 94
thuringiensis] CrylAe [Bacillus
thuringiensis IBL ZP_04075355.1 93
200]
CrylAd [Bacillus
Q03744.1 91
thuringiensis]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis serovar ZP_04106093.1 90
berliner ATCC 10792]
CryIAb [Bacillus 89
ABS18384.1
thuringiensis]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis serovar ZP_04118188.1 85
kurstaki str. T03a001]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis serovar AAX18704.2 85
kenyae]
CryIA [Bacillus
AAQ14326.1 74
thuringiensis]
CrylAe [Bacillus
thuringiensis IBL ZP_04075345.1 66
200]
Tabla 4. Porcentajes de identidad de distintas proteínas CryIA con la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 (número de acceso AAD38701 ).
% de
Proteína N° Acceso
Identidad
CrylAe [Bacillus
thuringiensis] AAN07788.1 99
CrylAe [Bacillus
thuringiensis serovar ZP_04118188.1 99
kurstaki str. T03a001]
Cry1Ac22 [Bacillus ABZ01836.1 99 thuringiensis serovar
kurstaki]
CrylAc [Bacillus
thuringiensis serovar CAQ30431.1 96
kurstaki]
CrylAb [Bacillus
ABB72460.1 83
thuringiensis]
CryIAe [Bacillus
thuringiensis serovar ZP_04106093.1 83
berliner ATCC 10792]
CrylAb [Bacillus
thuringiensis AAZ06794.1 83 serovar tolworthi]
CryIAf [Bacillus 79
P96315.1
thuringiensis]
CryIAa [Bacillus
AAP40639.1 76
thuringiensis]
CryIAd [Bacillus
Q03744.1 73
thuringiensis]
Cry1A32 [Bacillus
AAX86871.1 65
thuringiensis]
CryIAe [Bacillus
thuringiensis IBL ZP_04075374.1 56
200]
Las proteínas con un porcentaje de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 de al menos un 65% son isoformas o secuencias aminoacídicas que son homologas a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 respectivamente en la bacteria Bacillus thuringiensis y las proteínas con un porcentaje de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 3 de al menos un 55% son isoformas o secuencias aminoacídicas que son homologas a SEQ ID NO: 3 en la bacteria Bacillus thuringiensis. Por ello, de aquí en adelante, para hacer referencia a cualquiera de las proteínas descritas en párrafos anteriores que tienen al menos un 65% de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 o con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o cualquier fragmento de las mismas así como a cualquiera de las proteínas descritas en párrafos anteriores que tienen al menos un 55% de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 o cualquier fragmento de las mismas, se puede emplear el término "proteína/s de la invención".
La expresión "detectar y/o cuantificar" tal y como se emplea en la descripción del método de la invención, hace referencia a la detección de la presencia y/o a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa.
De acuerdo con la presente invención, la detección y/o cuantificación de la proteína de la invención puede ser llevada a cabo por cualquier método conocido en el estado de la técnica. Preferentemente la detección y/o cuantificación se lleva a cabo mediante inmunoensayo.
El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier técnica analítica, basada en la reacción de conjugación de la secuencia aminoacídica de la proteína de la invención, de sus variantes o de un fragmento de las mismas con un anticuerpo que las reconoce.
Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), ¡nmunofluorescencia, inmunohistoquímica o microarrays de proteínas.
El inmunoensayo puede ser un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno de la muestra biológica o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sandwich.
El ELISA puede ser un ELISA indirecto, que puede comprender los siguientes pasos: (a) recubrir un soporte sólido con un lisado de células con la proteína de la invención (b) incubar el soporte recubierto del paso (a) con una muestra biológica aislada obtenida del individuo en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo del anticuerpo frente a la proteína de la invención presente en la muestra, con los antígenos que comprenden a la proteína de la invención; y (c) incubar con un anticuerpo secundario, que reconoce al anticuerpo frente a la secuencia aminoacídica de la proteína de la invención, conjugado o unido a un compuesto marcador.
El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y/o cuantificación de la cantidad del anticuerpo frente a la secuencia aminoacídica de la proteína de la invención. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 33P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa por colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía, respectivamente. En una realización preferida, el método de la invención además comprende comparar los datos obtenidos en (b) con unos valores de referencia para encontrar una desviación significativa.
Y, en una realización más preferida, el método de la invención además comprende atribuir la desviación significativa al riesgo de desarrollar una a- sinucleinopatía o a la presencia de dicha enfermedad neurodegenerativa en el individuo. Preferentemente, la α-sinucleinopatía es Parkinson.
El término "desviación significativa" tal y como se emplea en la presente invención hace referencia a la presencia de la proteína de la invención o de una mayor concentración de la misma en la muestra biológica aislada con respecto a una muestra de un individuo sano, es decir, un individuo que no presente dicha proteína o la presente en una concentración a la cual la proteína no produce ningún efecto tóxico en el organismo. Así, para encontrar una desviación significativa, se compara la desviación de los resultados obtenidos en el apartado (b) con respecto a unos controles o valores de referencia. Los controles o valores de referencia son, pero sin limitarse, aquellas muestras que no presentan las proteínas de la invención o la presentan a una concentración en la cual la proteína es inocua. Considerando sus niveles neurotóxicos en ratones (ejemplo 1), la concentración de las mismas en el plasma de un individuo humano para que no ejerzan un efecto tóxico en éste, debería ser inferior a 10 mg/l de sangre. Dicha desviación es una desviación significativa de las normas estadísticas establecidas, como por ejemplo, pero sin limitarse, la desviación de la media o mediana con respecto al control. No obstante, la desviación estadísticamente significativa puede determinarse mediante cualquier técnica estadística conocida por el experto en la materia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la proteína de la invención o de un anticuerpo específico de la proteína de la invención, o cualquier fragmento del mismo, como biomarcador para determinar el riesgo de desarrollar una α-sinucleinopatía o para determinar dicha enfermedad neurodegenerativa. En una realización preferida, la α-sinucleinopatía es Parkinson.
El término "biomarcador" o, de forma alternativa, "marcador molecular", tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula o al producto de expresión de un gen o fragmentos y variantes del mismo que muestran cambios sustanciales en una enfermedad determinada y que se pueden usar tanto para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad como para determinar dicha enfermedad detectando la aparición de dichos cambios en el biomarcador.
Adicionalmente, el biomarcador también puede ser usado para seguir la eficacia de un tratamiento para esa enfermedad detectando cambios en el biomarcador en oposición a aquellos que se dan en la enfermedad o situación clínica.
El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la proteína de la invención. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un agente inhibidor de la proteína de la invención para la fabricación de un medicamento, en adelante medicamento de la invención, donde dicho medicamento tiene una cantidad de agente inhibidor terapéuticamente efectiva. Preferentemente el agente inhibidor es capaz de generar una respuesta inmune en un individuo. Más preferentemente el agente inhibidor es un anticuerpo específico de la proteína de la invención.
Una realización preferida se refiere al medicamento de la invención, para el tratamiento y/o prevención de una α-sinucleinopatía, donde preferentemente la α-sinucleinopatía es Parkinson.
El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.
La expresión "cantidad efectiva" o "cantidad eficaz" tal y como se emplea en el presente documento se refiere a una cantidad de una sustancia suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un agente inhibidor de la proteína de la invención es una cantidad suficiente para tratar y/o prevenir la enfermedad neurodegenerativa. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de agente inhibidor de la proteína de la invención para tratar y/o prevenir una enfermedad o trastorno es una cantidad de agente inhibidor suficiente para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de una sustancia dada variará con factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que va a recibir la sustancia y el propósito por el que se da la sustancia. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede determinar empíricamente el experto en la materia de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica.
El término "agente inhibidor" o, de forma alternativa "compuesto inhibidor" tal y como se emplea en el presente documento se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína de la invención, disminuye o elimina la intensidad o la duración de su actividad biológica. En esta definición se incluye además aquellos compuestos como RNA interferentes que impiden o disminuyen la expresión del gen codificante de la proteína de la invención, es decir, que impiden o diminuyen la transcripción del gen, la maduración del RNAm, la traducción del RNAm y la modificación post- traduccional. Un agente inhibidor puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico o polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimine el efecto y/o la función de la proteína de la invención.
El término "medicamento de la invención", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.
Por tanto, el medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezcias para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.
En el contexto de la presente invención el término "medicamento de la invención" se refiere a un agente inhibidor de la proteína de la invención, que es capaz de generar una respuesta inmune frente a un organismo dado, que está causando dicha enfermedad en el hombre o los animales. Preferentemente el medicamento de la invención es una vacuna.
En el contexto de la presente invención, el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para establecer la respuesta del sistema inmune a una enfermedad, preparados de antígenos que una vez dentro del organismo provocan la respuesta del sistema inmunitario, mediante la producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.
La vacuna, puede comprender excipientes farmacológicamente aceptables como por ejemplo pero sin limitarse, un adyuvante. Además, la vacuna presenta un origen recombinante.
En esta memoria, el término "adyuvante" se refiere a un agente, mientras no posea un efecto antigénico por si mismo, que puede estimular el sistema inmune incrementando su respuesta a la vacuna. Aunque sin limitarse, las sales de aluminio "fosfato de aluminio" e "hidróxido de aluminio" son los dos adyuvantes más comúnmente empleados en las vacunas. Otras sustancias, como por ejemplo el escualeno, también se pueden emplear como adyuvantes.
Preferentemente el medicamento de la invención se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, cutánea, oral, epidural, sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
La forma adaptada hace referencia al modo de adecuar el medicamento de la invención para que pueda ser administrado por ejemplo pero sin limitarse, por vía parenteral, oral, rectal o transdérmica. La administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intra-arterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. La forma adaptada a la administración rectal se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, cápsula rectal, dispersión rectal o pomada rectal. La forma adaptada a la administración transdérmica se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, parche transdérmico o iontoforesis.
En otra realización preferida el medicamento de la invención comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacológicamente aceptable. En otra realización preferida el medicamento de la invención comprende al menos otro principio activo.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del medicamento de la invención, lo estabiliza o ayuda a su preparación en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento de la invención como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
Un "vehículo farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del medicamento de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
El término "principio activo" es toda materia, cualquiera que sea su origen, humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende, al menos, un agente inhibidor de la proteína de la invención, preferentemente el agente inhibidor es capaz de generar una respuesta inmune en un individuo.
La composición farmacéutica, es un conjunto de componentes que está formado al menos por un agente inhibidor de la proteína de la invención, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud, por ejemplo una aplicación cosmética, aunque puede no implicar un efecto fisiológico en el organismo, implica una mejora en el bienestar del sujeto relacionada con su psicología. Por tanto, dicha composición farmacéutica puede ser un producto de higiene personal, un producto cosmético o un producto que puede constituir la base para la elaboración de los productos anteriores o la base para la elaboración de un medicamento. Preferiblemente la composición farmacéutica se usa para la elaboración de un medicamento.
El "producto de higiene personal" se define como las sustancias o preparados que, sin tener la consideración legal de medicamentos, productos sanitarios, cosméticos o biocidas, están destinados a ser aplicados sobre la piel, dientes o mucosas del cuerpo humano con finalidad de higiene o de estética, o para neutralizar o eliminar ectoparásitos.
El "producto cosmético" se define como toda sustancia o preparado destinado a ser puesto en contacto con las diversas partes superficiales del cuerpo humano (epidermis, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos) o con los dientes y las mucosas bucales, con el fin exclusivo o principal de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto, y/o corregir los olores corporales, y/o protegerlos o mantenerlos en buen estado.
En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacológicamente aceptable. En otra realización preferida la composición farmacéutica de la invención comprende al menos otro principio activo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, en adelante kit de la invención, que comprende al menos una molécula indicadora de la presencia de la proteína de la invención. En una realización preferida, la molécula es, al menos, un anticuerpo específico de la proteína de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para determinar el riesgo de desarrollar una α-sinucleinopatía o para determinar dicha enfermedad neurodegenerativa, en una muestra biológica aislada de un individuo, donde la muestra biológica aislada puede ser, pero sin limitarse, un tejido o un fluido biológico de dicho individuo. El kit de la invención proporciona datos útiles para determinar el riesgo a desarrollar una a- sinucleinopatía o determinar dicha enfermedad neurodegenerativa en un individuo.
Preferentemente la muestra biológica es un fluido biológico y más preferentemente líquido cefalorraquídeo o plasma. El individuo es, pero sin limitarse, un mamífero, preferiblemente humano o animal.
En una realización preferida, la α-sinucleinopatía es Parkinson.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Muestra los niveles de las moléculas anti-oxidantes superóxido dismutasa, glutatión, glutatión reductasa y glutatión peroxidada.
IA. Muestra los niveles medidos en la sustancia negra de ratas expuestas a proteínas Cry (Dipel) o vehículo (ratas control (no expuestas a proteínas Cry)) por vía intraperitoneal seis meses tras la exposición.
Las barras más oscuras representan los niveles medidos en la sustancia negra derecha y las barras más claras representan los niveles medidos en la sustancia negra izquierda.
I B. Muestra los niveles medidos en el estriado dorsal de ratas expuestas a proteínas Cry {Dipel) o vehículo (ratas control (no expuestas a proteínas Cry)) por vía intraperitoneal, seis meses tras la exposición.
Las barras más oscuras representan los niveles medidos en el estriado derecho y las barras más claras representan los niveles medidos en el estriado izquierdo.
Las mediciones se realizaron con la técnica ELISA. Media ± EEM, ** p<0.01 vs. grupo correspondiente de las ratas tratadas con vehículo (test de la t de Studenf).
Cry, expuestos a proteínas Cry.
C, U/mg.
D, μΜ/mg.
Fig. 2. Muestra la expresión de tirosina-hidroxilasa (TH) y alteraciones neuropatológicas en secciones cerebrales de ratas de 22 meses de edad expuestas a proteínas Cry a los seis meses de edad. 2A. Muestra una imagen de una sección mesencefálica de rata expuesta a proteínas Cry. Se observa degeneración unilateral de la sustancia negra izquierda con pérdida neuronal TH intensa (asterisco) en comparación con la sustancia negra derecha no degenerada.
L, izquierda; R, derecha.
2B-2D. Muestra regiones degeneradas de la sustancia negra en 2A. Se muestra una intensa pérdida neuronal con neuritas distróficas y engrosadas (2B), neuronas TH+ con formas extrañas con neuritas distróficas (flechas blancas figura 2C) y el límite entre el área degenerada (derecha en la figura 2D) y no degenerada (izquierda en la figura 2D) de la sustancia negra.
2E. Muestra otra imagen mesencefálica de ratas expuestas a proteínas Cry. Se observa degeneración unilateral de la sustancia negra (asterisco).
2F. Muestra otra imagen mesencefálica de ratas expuestas a proteínas Cry. Se observa una pérdida casi completa de neuronas TH+ en la sustancia negra de la rata expuesta a proteínas Cry (asterisco).
Fig. 3. Muestra la expresión de la tirosina-hidroxilasa (TH) y alteraciones neuropatológcas en secciones de cerebro de rata de 22 meses de edad, expuestas a proteínas Cry a los seis meses de edad.
3A. Muestra la sección mesencefálica de una rata expuesta a proteínas Cry. Se observa degeneración intensa de la sustancia negra, en comparación con la sustancia negra contralateral.
3B. Muestra degeneración regional del extremo lateral de la sustancia negra (indicada con línea discontinua) en una rata expuesta a proteínas Cry.
3C. Imagen ampliada de 3B. Muestra intensa pérdida neuronal junto a neuritas distróficas y engrosadas (degeneradas). 3D. Muestra la sustancia negra muy degenerada de otra rata expuesta a proteínas Cry donde solo quedan algunas neuronas TH+ (flechas blancas) y se observan numerosas neuritas distróficas en la sustancia negra.
Fig. 4. Muestra la expresión de α-sinucleína o inclusiones eosinofílicas en las ratas expuestas a proteínas Cry a los seis meses de edad.
4A. Muestra la inmunorreactividad de α-sinucleína que se detecta en la sustancia negra (cuernos medial y lateral) o en el núcleo rojo parvicelular (RPC), otro núcleo mesencefálico.
SNc, sustancia negra pars compacta; SNr, sustancia negra pars reticulada.
4B. Muestra una microfotografía donde se observan numerosas neuronas positivas a α-s'inucleína, con una distribución difusa en el citoplasma (flechas negras), inclusiones intensas (puntas de flecha negra) o inclusiones similares a cuerpos de Lewy ¡nmunorreactivas a a-sinucleína.
4C-4D. Muestra microfotog rafias ampliadas de inclusiones tipo cuerpos de Lewy (flechas negras).
4E. Muestra como la α-sinucleína también se encuentra distribuida difusamente en el citoplasma (flecha negra) y algunas neuronas presentan neuritas tipo Lewy con morfología engrosada (puntas de flecha negra).
4F. Muestra como a nivel del cuerpo estriado, también se observan ocasionales neuritas tipo Lewy (puntas de flecha negra)
4G-4H. Muestra una tinción con hematoxilina-eosina donde se observa la presencia de neuronas con citoplasma denso eosinofílico (puntas de flecha negra) en la sustancia negra (en 4H, se muestra la imagen ampliada de una neurona eosinofiílica).
Fig. 5. Muestra un análisis ELISA y colorimétrico de la presencia de proteínas Cry en tejido cerebral mesencefálico (segmento ventral y sustancia negra) de ratas expuestas a proteínas Cry a los seis meses de edad, y sacrificadas a los 22 meses de edad.
Se muestra en oscuro las soluciones que contenían tejido mesencefálico de ratas expuestas a proteínas Cry incluidas en el bioinsecticida Dipel (formulación de la cepa HD-1 de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, que contiene 28% CryIAa, 53% CryIAb, 19% CryIAc y esporas).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad del método de la invención para determinar una ot-sinucleinopatía, enfermedad neurodegenerativa que cursa con la formación de inclusiones de a-sinucleína, y, en concreto, la enfermedad de Parkinson (EP), mediante la detección y/o cuantificación de proteína Cry.
A lo largo de los distintos ejemplos se demuestra cómo la proteína Cry es capaz de inducir una α-sinucleinopatía, donde la α-sinucleinopatía es, preferentemente, EP. Así, se observa como la exposición de ratas de laboratorio (estirpe Wistar) a Dipel, una composición comercial insecticida que contiene la proteína CryIA de Bacillus thuringiensis dio lugar a un proceso oxidativo en el sistema nervioso acompañado de, entre otras patologías, pérdida neuronal y aparición de depósitos intraneuronales de a-sinucleína similares a los cuerpos de Lewy que aparecen en las enfermedades neurodegenerativas tipo EP. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones de la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. Así, aunque en los ejemplos de la presente invención se ha usado la proteína CryIAa, CryIAb y CryIAc de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones de la invención que aquí se reivindica, siendo los resultados extrapolables a cualquier proteína CryIA de Bacillus thuringiensis.
EJEMPLO 1.
Se inyectó Dipel (formulación de la cepa HD-1 de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, que contiene 28% CryIAa, 53% CryIAb, 19% CryIAc y esporas) a ratas de laboratorio de la estirpe Wistar con seis meses de edad durante 20 días, mediante inyecciones intraperitoneales. Dipel se inyectó a una dosis diaria de 1 mg/100 g de peso.
La medida de la distancia recorrida por las ratas a las que se les había inyectado Dipel en cajas de actividad (45 x 45 cm) indicó que la exposición a proteínas Cry induce hipercinesia espontánea en las ratas, desde el 10° mes de edad hasta el final. Algunas ratas mostraron rotaciones tras anfetamina, indicativa de degeneración unilateral del circuito nigroestriado motor.
1.1. Técnica ELISA.
Seis meses tras la exposición a proteínas Cry, las pruebas ELISA de moléculas antioxidantes del tejido diseccionado de la sustancia negra revelaron que había un proceso oxidativo en dicho núcleo, manifestado por una reducción en los niveles de glutatión y de superóxido dismutasa (Figura 1)-
Para las pruebas ELISA, se diseccionó la sustancia negra bajo microscopio y se congeló inmediatamente. Luego, se descongeló el tejido, y se homogeneizó en un tampón (del inglés: buffer) de homogenado con 150 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1 mM fenilmetiisulfonil fluorado, 0.6 μΜ leupeptina, y 1 % Tritón X-100, pH 7.4. Se cuantificaron los niveles de diversas proteínas y enzimas relacionadas con el metabolismo oxidativo como nitrotirosina, sintetasa de óxido nítrico, glutatión peroxidasa, y superóxido dismutasa con kits comerciales de Bioxytech (Oxis Internacional Inc., Portland, OR, USA: Nitrotyrosine-EIA, NOS-22113, GR-340, cGPX-340, y SOD-525). Además se midieron los niveles de glutatión y glutatión-S-transferasa con kits de BioVision incorporated (Mountain View, CA, USA: Glutathione Assay Kit (K264-100), y GST (K263-100)). Los datos se compararon con ANOVA de una vía seguido de test de Bonferroni.
Por otro lado, se realizó una prueba ELISA de la presencia de proteínas Cry1Ab-1Ac en tejido mesencefálico fresco de las ratas expuestas a proteínas Cry a los 22 meses de edad.
Para esta prueba se obtuvo tejido mesencefálico que contenía la sustancia negra de ratas tratadas con pesticida Dipel y ratas control. Se empleó el kit según las sugerencias del fabricante (Pathoscreen kit for Bt-Cry1 Ab/1 Ac protein, peroxidase label, Agdia Incorporated, Indiana, USA). El test dio un resultado positivo (viraje a azul; en Figura 5 pocilios oscuros) indicando la presencia de las proteínas Cry1Ab-Ac.
1.2. Estudio neuropatológico.
Para el estudio neuropatológico se sacrificaron las ratas a los 22 meses de edad, se extirpó el cerebro y se almacenó en 4% paraformaldehido en tampón fosfato (PB) 0.1 M (pH 7.2-7.4) a 4°C, y luego se sumergió toda la noche en 20% sacarosa en PBS (tampón fosfato salino). Se cortaron secciones cerebrales (30 μιτ\ espesor) en un criostato (Microm, Italia) y se guardó en PBS. Luego se inactivo la peroxidasa endógena con 0.3% H2O2 en 0.05 Tris buffer (pH=7.6) por 2 horas y las secciones se incubaron en PBS/0.1 % Tritón X-100 (PBS-T) con 10% FCS (suero fetal bovino) (Vector, USA) y BSA (albúmina de suero bovino) (1 mg/ml, Sigma-Aldrich, USA) durante 4 horas para bloquear sitios inespecíficos. La secciones se incubaron toda la noche con anticuerpo monoclonal de ratón antitirosin-hidroxilasa (del inglés mouse anti-tyrosine-hydroxylase monoclonal antibody) (anti-TH, 1 :1000, Sigma-Aldrich, USA), o anticuerpo de ratón anti-alfasinucleína (del inglés mouse anti-alpha-synuclein antibody) (1 :1000, Sigma-Aldrich) en PBS-T, y seguidamente se incubaron durante 6 horas con anticuerpo de ratón conjugado con biotina (del inglés anti-mouse biotin conjugated antibody) (1 :200, Santa Cruz Technology, USA). Luego se empleó el kit ABC (1 :100, Pierce, USA), y se reveló el tejido con 3,3'- tetrahidrocloruro de diaminobencidina {DAB, Sigma-Aldrich, USA) como cromógeno, y agua oxigenada.
Respecto a los métodos estereológicos, se aplicó el principio de Cavaleri y el disector físico según la metodología habitual del laboratorio (Fernández Espejo E., et al., J Neurosci 2001 , 21 , 9888-9895; El Banoua F, et al., Neurobiol. Disease 2004, 16, 377-385; Galán-Rodríguez B, et al., Neurobiol. Disease 2008, 29, 529-542.
El estudio neuropatológico a los 22 meses de edad reveló la presencia de neurodegeneración en la sustancia negra como pérdida regional o unilateral de neuronas de dopamina, neuritas engrosadas y distróficas positivas a a- sinucleína (Figuras 2 y 3) y presencia intraneuronal de depósitos difusos de a- sinucleina o de inclusiones de α-sinucleína con una disposición similar a la de los cuerpos de Lewy en humanos (Figura 4). Estas últimas manifestaciones acerca de la α-sinucleína son similares a las observadas en las α-sinucleinopatías y, en concreto, en la enfermedad de Parkinson. Otros centros nerviosos, como el estriado dorsal, el núcleo rojo, y el rafé dorsal estaban también afectados, indicando una degeneración extensa del tejido nervioso.
El estrés oxidativo en la sustancia negra se detectó bilateralmente, aunque la degeneración de la sustancia negra fue parcial o unilateral, indicando que otros fenómenos aparte de la oxidación han de estar involucrados en la neurodegeneración.
Todos estos datos demuestran que las proteínas Cry a concentraciones iguales o mayores de 10 mg/l en humanos (dosis en rata durante 20 días de 1 mg/100g de peso) pueden causar enfermedades neuronales que cursan con la formación de inclusiones de α-sinucleína y, principalmente, son responsables de la enfermedad de Parkinson.
Así, se ha visto que estas proteínas son las responsables de la aparición en los roedores de un cuadro neurodegenerativo caracterizado por la acción oxidante de las proteínas Cry sobre el circuito nigroestriado y otros centros catecolaminérgicos a corto plazo, y al resto de características anatomopatológicas de enfermedades neurodegenerativas que cursan con la formación de inclusiones de α-sinucleína (o α-sinucleinopatías) y, en particular, con EP a largo plazo, entre las que se incluyen: la degeneración de la sustancia negra con muerte neuronal de las neuronas de dopamina así como de otros centros catecolaminérgicos como el rafé dorsal y la presencia de depósitos ¡ntraneuronales de α-sinucleína en el citoplasma de las neuronas de dopamina de la sustancia negra.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para determinar el riesgo de desarrollar una α-sinucleinopatía o para determinar dicha enfermedad neurodegenerativa, que comprende: a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo, b. detectar y/o cuantificar una proteina con al menos un 65% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o con al menos un 55% de identidad con SEQ ID NO: 3 o un fragmento de las mismas, en la muestra obtenida en el paso (a).
2. Método según la reivindicación 1 , donde la proteína detectada y/o cuantificada en (b) tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 3.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la proteína detectada y/o cuantificada en (b) tiene, al menos, un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 3.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína detectada y/o cuantificada en el paso (b) es SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende comparar los datos obtenidos en el paso (b) con valores de referencia para encontrar una desviación significativa.
6. Método según la reivindicación 5, que además comprende atribuir la desviación significativa al riesgo de desarrollar una α-sinucleinopatía o a la presencia de dicha enfermedad neurodegenerativa en el individuo.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la muestra biológica del paso (a) es un tejido o un fluido biológico.
8. Método según la reivindicación 7, donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo o plasma.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la proteína del paso (b) es detectada y/o cuantificada por inmunoensayo.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la a- sinucleinopatía es Parkinson.
11. Uso de una proteína o de un anticuerpo específico de dicha proteína con al menos un 65% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o con al menos un 55% de identidad con SEQ ID NO: 3 o un fragmento de las mismas, como biomarcador para determinar el riesgo de desarrollar una o sinucleinopatía o para determinar dicha enfermedad neurodegenerativa.
12. Uso de la proteína o del anticuerpo específico de dicha proteína según la reivindicación 11 , donde la proteína tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 3.
13. Uso de la proteína o del anticuerpo específico de dicha proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde la proteína tiene, al menos, un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 3.
14. Uso de la proteína o del anticuerpo específico de dicha proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la proteína es SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
15. Uso de la proteína o del anticuerpo específico de dicha proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde la α-sinucleinopatía es Parkinson.
16. Uso de un agente inhibidor de una proteína con, al menos, un 65% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o con al menos un 55% de identidad con SEQ ID NO: 3 o un fragmento de las mismas para la fabricación de un medicamento.
17. Uso según la reivindicación 16, donde la proteína tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 3.
18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde la proteína tiene, al menos, un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 3.
19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde la proteína es SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para el tratamiento y/o prevención de una a-sinucleinopatía.
21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde el agente inhibidor es un anticuerpo específico de dicha proteína.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21 , donde la o sinucleinopatía es Parkinson.
23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, donde el medicamento comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.
24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, donde el medicamento comprende al menos otro principio activo.
25. Composición farmacéutica que comprende, al menos, un agente inhibidor de una proteína con al menos un 65% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o con al menos un 55% de identidad con SEQ ID NO: 3 o un fragmento de las mismas.
26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25 donde la proteína tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO:3.
27. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 ó
26 donde la proteína tiene, al menos, un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 3.
28. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a
27 donde la proteína es SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
29. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que además comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.
30. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29 que comprende al menos otro principio activo.
31. Kit que comprende al menos una molécula indicadora de la presencia de una proteína con al menos un 65% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o con al menos un 55% de identidad con SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma.
32. K¡t según la reivindicación 31 , donde la proteína tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 3.
33. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, donde la proteína tiene, al menos, un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 3.
34. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33 donde la proteína es SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, donde la molécula indicadora es, al menos, un anticuerpo específico de dicha proteína.
36. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para determinar el riesgo de desarrollar una α-sinucleinopatía o para determinar dicha enfermedad neurodegenerativa, en una muestra biológica aislada de un individuo.
37. Uso según la reivindicación 36 donde la muestra biológica es un tejido o un fluido biológico.
38. Uso según la reivindicación 37, donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo o plasma.
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, donde la a- sinucleinopatía es Parkinson.
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