WO2012011794A1

WO2012011794A1 - Modelo de animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre

Info

Publication number: WO2012011794A1
Application number: PCT/MX2010/000065
Authority: WO
Inventors: Alejandro Alagon Cano; Dayanira Sheira Paniagua Meza; Lucia Jimenez Martinez; Irene Vergara Bahena; Arlene Calderon Corona; Ricardo Mondragon Cortes; Melisa Benard Valle; Roberto Pablo Stock Silberman; Camilo ROMERO NUÑEZ; Hilda Vazquez Lopez; Michael J. Bernas; Leslie Victoria Boyer; Marlys H. Witte
Original assignee: Universidad Nacional Autonoma de Mexico; University of Arizona; Arizona State University ASU
Current assignee: Universidad Nacional Autonoma de Mexico; University of Arizona; Arizona State University ASU
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2013-01-20

Abstract

La presente invención se relaciona con modelos animales -específicamente animales grandes- y marcadores sustitutos para envenenamientos de animales ponzoñosos. Particularmente, la presente invención se refiere a un modelo animal grande (perros, cabras, cerdos, corderos, entre otros) al cual se le ha inducido un cuadro de envenenamiento controlado tal que permita evaluar la eficacia de antivenenos a través de la medición de la desaparición de los antígenos de los venenos en sangre y establecer la dosis (posología) de los antivenenos determinada por la ausencia sostenida de antígenos de venenos en sangre, es decir, la ausencia de recurrencia de antígenos de venenos en sangre. La patente se refiere a los procedimientos para el desarrollo de los cuadros de envenenamiento controlado para el desarrollo del modelo animal grande en cuestión y a los modelos de evaluación tanto de la cinética de los venenos como de la eficacia y dosis de antivenenos usados.

Description

MODELO DE ANIMAL GRANDE PARA EVALUACIÓN DE EFICACIA DE

ANTIVENENOS EN SANGRE CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el campo de la inmunología, especialmente se refiere a modelos animales -específicamente animales grandes- y marcadores sustitutos para envenenamientos de animales ponzoñosos. Particularmente, la presente invención se refiere a un modelo animal grande (perros, cabras, cerdos, corderos, entre otros) al cual se le ha inducido un cuadro de envenenamiento controlado tal que permita evaluar la eficacia de antivenenos a través de la medición de la desaparición de los antígenos de los venenos en sangre y establecer la dosis (posología) de los antivenenos determinada por la ausencia sostenida de antígenos de venenos en sangre, es decir, la ausencia de recurrencia de antígenos de venenos en sangre. La patente se refiere a los procedimientos para el desarrollo de los cuadros de envenenamiento controlado para el desarrollo del modelo animal grande en cuestión y a los modelos de evaluación de la eficacia y dosis de antivenenos usados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En extensas regiones del mundo la necesidad del uso de antivenenos para el tratamiento de accidentes de animales ponzoñosos es muy grande. Por ejemplo, se sabe que en México cada año, más de 250 mil pacientes reciben tratamientos con antiveneno ante picaduras de escorpiones. El tratamiento de envenenamiento ha dependido casi enteramente de la experiencia individual del médico en evaluar la severidad del envenenamiento. La eficacia de tratamiento está relacionada con la potencia de neutralización del antiveneno usado, la ruta o vía por la cual es administrado, la dosis y su farmacocinética. La introducción de inmunoensayos enzimáticos ha permitido un enfoque cuantitativo, permitiendo estimar las concentraciones del veneno y del antiveneno circulante en cualquier momento después de la mordida en pacientes o en muestras de animales experimentales, principalmente en sangre.

Existen trabajos realizados para evaluar el efecto sobre los venenos en sangre, los cuales muestran cuando un buen antiveneno es inyectado en dosis suficiente, induce una neutralización inmediata, completa y duradera de los componentes venenosos, así como una rápida redistribución del compartimiento periférico vascular. Por ejemplo, el trabajo realizado usando conejos como modelo animal, inyectados con veneno de escorpión del norte de África (Krifi et al., 2005, Toxicon, 45: 187-198). En el panel A de la Figura 1 se muestran los niveles de veneno en sangre después de inyectarlo subcutáneamente. Una fracción del veneno estaba marcado radiactivamente lo que permitió seguirlo tanto directamente (veneno total) como por ELISA (veneno libre). Se puede apreciar, de esta manera la cinética del veneno, el cual es inyectado en el tiempo 0 y los máximos niveles de absorción en la sangre se alcanzaron alrededor de 60 minutos en ambos casos. En el panel B de la misma Figura, se muestra el efecto tanto en el veneno total como en el libre, después de inyectar un antiveneno tipo F(ab')2, a los 60 minutos. Los niveles del veneno libre inmediatamente bajaron a cero y permanecieron así en todos los tiempos en que fueron analizados los conejos. Lo interesante es que el veneno total realmente se elevó en sangre después de la administración del antiveneno. Estos resultados indican que no sólo el veneno en sangre fue neutralizado (ya que no puede detectarse por ELISA), sino también que la presencia del antiveneno en sangre indujo una redistribución de veneno de los compartimientos periféricos y del sitio de la inyección del veneno.

En otros experimentos realizados por el mismo grupo de investigación (Riviére G, Choumet V, Audebert F, Sabouraud A, Debray M, Scherrmann JM, Bon C. Effect of antivenom on venom pharmacokinetics in experimentally envenomed rabbits: toward an optimization of antivenom therapy. J Pharmacol Exp Ther. 1997 Apr;281 (1):1-8) se estudió el efecto de la dosis de antiveneno sobre los niveles de veneno en sangre. En este caso se usó veneno de una víbora europea. Nuevamente el modelo animal fue en conejos y el veneno también fue administrado la vía subcutánea. El veneno total significa el veneno medido por radioactividad y el veneno libre significa el veneno medido por un procedimiento de ELISA. Cuando se dieron dosis pequeñas de antiveneno, hubo una pequeña disminución transitoria en el veneno en sangre. Cuando aumentaron la dosis de antiveneno, el veneno bajó al cero, pero, después de cierto tiempo, volvió a aumentar. Cuando aumentaron aún más la dosis, el veneno libre cayó y permaneció indetectable durante todo el tiempo del experimento. Otra vez, se observa el mismo efecto en la concentración del veneno de víbora total en sangre, como en el caso mencionado anteriormente.

Una manera de entender los resultados arriba mencionados es la siguiente: a partir un depósito de veneno (típicamente subcutáneo, aunque también pudiera ser intradérmico o intramuscular), como el que se origina por una mordida o picadura de serpiente o alacrán, respectivamente, o por simple inyección experimental, el veneno alcanza al compartimento central (la sangre) para así distribuirse a los órganos y tejidos (compartimento periférico) y alcanzar sus dianas de acción. Por supuesto, por ejemplo, en el caso de víboras de cascabel, algunos componentes del veneno actúan sobre blancos ubicados precisamente en la sangre; pero por ejemplo, en el caso del coralillo, el objetivo está fuera de la sangre, en la unión neuromuscular. Aquí es importante señalar algo que no siempre es claro: la mayor parte del veneno se queda en el sitio de la inyección o el sitio de la mordedura por horas y hasta por días. Esto ha sido determinado de acuerdo con un modelo animal como el que refiere la presente invención. Hemos podido medir este efecto en un modelo del animal grande del que nos referiremos más adelante, pero se puede decir que por ejemplo, si se administra una inyección subcutánea o intradérmica de veneno y después de varias horas, se quita la piel, se toma una sección, se extrae el veneno por maceracion en una solución con un detergente suave y se mide el veneno, lo que se encuentra es que gran parte del veneno está todavía en el sitio de la inyección. Dicho lo anterior, cuando se administra antiveneno por la ruta indicada, la intravenosa, se alcanza una concentración grande de antiveneno en la sangre que une rápidamente a los componentes del veneno circulantes. En menos de cuatro minutos, todos los antígenos del veneno desaparecen de la sangre. Luego, simplemente por efecto masa, el veneno en los compartimientos periféricos comienza a difundir fuera de los órganos y tejidos hacía la sangre donde son unidos y neutralizados por el antiveneno. Por supuesto, habrá también antiveneno en el compartimiento periférico y eventualmente también alcanzará el sitio de la inyección. De acuerdo con este razonamiento, al disminuir la concentración del veneno libre, se promoverá la disociación de los componentes del veneno de sus blancos específicos, y se acelerará la salida del veneno del área de la mordedura, picadura o inyección, disminuyendo las acciones tóxicas locales cuando éstas están presentes. Existen varios sistemas tipo ELISA para medir antígenos de diferentes tipos de veneno. Los ELISAs que tenemos son del tipo sanwich, los que utilizan anticuerpos inmunopurificados de captura pegado al soporte sólido. Estos anticuerpos capturan específicamente a los antígenos de veneno que se encuentran circulantes en la sangre. Los venenos capturados en la fase sólida son ahora detectados con un suero hiperinmune antiveneno, seguido de un anticuerpo secundario etiquetado con una enzima. Los anticuerpos de captura y de detección se provienen de especies animales diferentes como, por ejemplo, caballo-conejo o borrego-conejo. Los ELISAs pueden detectar hasta 0.25 ng/mL de veneno. Esta sensibilidad permite aplicarlos en prácticamente todos los tipos de envenenamiento. Pero por ejemplo, este tipo de ELISAs han sido muy útiles para medir antígenos de venenos en pacientes picados por alacranes y también en pacientes mordidos por serpientes.

En un artículo publicado en el año 2009 por algunos de los inventores de la presente invención (Boyer LV, Theodorou AA, Berg RA, Mallie J; Arízona Envenomation Investigators, Chávez-Méndez A, García-Ubbeiohde W, Hardiman S, Alagón A. Antivenom for criticaíly ill children with neurotoxicity from scorpion stings. N Engl J Med. 2009 May 14; 360(20) .2090-2098), se demuestra que la resolución clínica del envenenamiento de escorpión en niños tratados con antiveneno se correlaciona con la desaparición de los antígenos de venenos en plasma, como se muestra en la Figura 2.

De acuerdo a este estudio, se realizaron diferentes evaluaciones clínicas tanto al grupo de niños tratados con placebo como tratados con antiveneneno, que incluyeron movimientos anormales de los ojos, movimiento incontrolados de extremidades, dificultad respiratoria y toxicidad global. Asimismo, la cantidad del sedante (Midazolam) que administrada a los niños demuestra una diferencia enorme entre la que se tuvo que usar en los niños tratados sin antiveneno que los tratados con el mismo. La resolución clínica correlacionó muy bien con la desaparición de veneno en plasma sanguíneo. Los valores iniciales de veneno fueron comparables en ambos grupos. En el grupo tratatado con antiveneno el veneno fue ¡ndetectable; en cambio, los pacientes tratados con placebo tenían cantidades significativas de veneno en la sangre aún cuatro horas después de iniciado el tratamiento. En un estudio para evaluar la efectividad de dos antivenenos uno del tipo Fab y el otro del tipo F(ab')2 (Boyer, L.V. and Alagón A. Subacute coagulopathy in snake envenomation: a randomized, comparative trial of Fab and F(ab')2 antivenoms in Arizona. Presented at Venom Week 2009, Albuquerque, N , USA, June 3, 2009.), se encontró que la hipofibrinogenemia y trombocitopenia recurrentes en los pacientes tratados con antiveneno tipo Fab están asociadas con detección recurrente de antígenos de veneno de víbora de cascabel en plasma. Los pacientes tratados con antivenenos del tipo F(ab')2 no presentaron ni hipofibrinogenemia, ni trombocitopenia, ni niveles detectables de veneno recurrentes. En la Figura 3 se presentan los resultados obtenidos en dos pacientes, uno tratado con antiveneno tipo Fab (Paciente #102) y otro tratado con antiveneno tipo F(ab')2 (Paciente #107). Al comparar la persistencia en el cuerpo de ambos antivenenos puede observarse que los del tipo Fab caen rápidamente mientras con los del tipo F(ab')2 duran mucho más tiempo circulando en sangre. En ambos casos, el veneno en plasma se volvió indetectable poco tiempo después de su administración; así mismo, los niveles de plaquetas se recuperaron muy rápidamente en tanto que los de fibrinógeno tomaron varias horas para alcanzar niveles normales. Después de cinco días de iniciado el tratamiento el comportamiento de los marcadores difiere de manera importante. El paciente tratado con antiveneno tipo F(ab')2 mantuvo sus niveles de plaquetas y fibrinógeno dentro de valores normales al tiempo que los antígenos de veneno permanecieron indetectables. El comportamiento del paciente tratado con antiveneno del tipo Fab fue muy diferente ya que al cabo de varios días tuvo una recaída en la cuenta de plaquetas y en los niveles de fibrinógeno asociadas a un nuevo aumento de veneno en sangre. Por lo que se pudo concluir que la antigenemia (veneno en sangre) recurrente está asociada con la hipofibrinogenemia y trombocitopenia recurrentes.

En otro estudio realizado por Meyer et al., en Nigeria (Meyer WP, Habib

AG, Onayade AA, Yakubu A, Smith DC, Nasidi A, Daudu IJ, Warrell DA, Theakston RD. First clinical experiences with a new ovine Fab Echis ocellatus snake bite antivenom in Nigeria: randomized comparative trial with Institute Pasteur Serum (Ipser) Africa antivenom. Am J Trop Med Hyg. 1997 Mar;56(3):291-300), se siguieron a pacientes mordidos por Echis Ocellatus, (la víbora africana que ocasiona aproximadamente la mitad de mordeduras de serpiente en África Subsahariana), y encontraron, también, antigenemia recurrente del veneno asociada con la desaparición acelerada de antiveneno ovino tipo Fab, como se puede apreciar en la Figura 4. La presencia recurrente de veneno en sangre se acompañó de problemas de la coagulación de la sangre por lo que se tuvieron que administrar viales adicionales de antiveneno.

Los estudios referidos anteriormente demuestran la necesidad de conocer con más detalle el comportamiento del veneno en cuadros de envenenamiento, especialmente analizando lo que ocurre en sangre. Una de las formas es lo que se refiere en la presente invención, la cual consiste en un modelo animal grande mediante el cual se puede evaluar la eficacia de antivenenos (por la desaparición de los antígenos de veneno en sangre) y determinar la dosificación (por la ausencia sostenida de antígenos de veneno en sangre, es decir, la no-recurrencia de los mismos).

Los modelos animales son conocidos y existen básicamente modelos de animales pequeños y modelos de animales grandes. Los investigadores del área y los productores de antivenenos confían en su mayor parte en que el ratón modela adecuadamente para determinar la potencia de los venenos, así como también la potencia de los antivenenos. Usualmente los estudios de potencia de antivenenos son llevados a cabo preincubando in vitro el antiveneno con el veneno para después inyectar la muestra en el ratón.

Por supuesto estas pruebas son muy útiles. Pero el problema es la extrapolación de lo que se encuentra en tales animales pequeños a animales de mayor tamaño y a seres humanos. Aquí es, precisamente, donde el impacto y beneficio del uso de un modelo animal grande, como el de la presente invención, ayuda a entender mejor el comportamiento de venenos y antivenenos a través de la medición del veneno en sangre en animales tratados con antivenenos.

Por ejemplo, al usar como modelo animal una oveja, es posible tomar múltiples muestras sanguíneas para medir antiveneno/veneno muy fácilmente. El conejo, que no es tan pequeño como un ratón, también permite obtener una gran cantidad de muestras de sangre, sin embargo, el problema con el conejo es que aún dista mucho de tener un peso semejante al de un ser humano y a que son intrísicamente muy resistentes a venenos de elápidos, como el de las coralillo. Otra ventaja es que un animal grande puede proveer los medios para hacer estudios patofisiológicos y realizar estudios farmocinéticos y farmodinámicos más cercanos a lo que ocurre en pacientes humanos.

De conformidad con la presente invención, se proporciona un modelo animal, específicamente un modelo animal grande. Particularmente la presente invención se refiere a un modelo animal grande (perros, cabras, cerdos, corderos, entre otros) a los que se les induce un cuadro de envenenamiento controlado tal que permita evaluar la eficacia de antivenenos a través de la medición de la desaparición de los antígenos de los venenos en sangre y establecer la dosis (posología) de los antivenenos determinada por la ausencia sostenida de antígenos de venenos en sangre, es decir, la ausencia de recurrencia de antigenemia. La patente se refiere a los procedimientos para el desarrollo de los cuadros de envenenamiento controlado para el desarrollo en un modelo animal grande y a los modelos de evaluación de la eficacia y dosis de los antivenenos usados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1. muestra los niveles de veneno en sangre después de inyectarlo subcutáneamente en un trabajo realizado usando conejos como modelo animal, inyectados con veneno de escorpión del norte de África (Krifi et al., 2005,

Toxicon, 45: 187-198).

La Figura 2, muestra la resolución clínica del envenenamiento de escorpión en niños tratados con antiveneno, de acuerdo a trabajos previos realizados por algunos de los inventores de la presente invención.

La Figura 3, presenta los resultados obtenidos en tratados con antiveneno tipo Fab y F(ab')2. La Figura 4, muestra los resultados obtenidos por Meyer et al., .en Nigeria, con pacientes mordidos por Echis ocellatus y tratados con antiveneno ovino tipo Fab.

La Figura 5, corresponde a los datos de conformación de un modelo animal en perros basado en la inducción de un cuadro de envenenamiento por Crotalus atrox y la gráfica de comportamiento del veneno en sangre, de conformidad con la presente invención.

La Figura 6, corresponde a los datos de rescate del modelo animal en perros por envenenamiento por Crotalus atrox y la gráfica de medición de la efectividad del antiveneno en la sangre. La figura de arriba corresponde al reascate hecho una hora después de la inyección del veneno; la de abajo, dos horas después, de conformidad con la presente invención.

La Figura 7, corresponde a los datos de conformación de un modelo animal en perros basado en la inducción de un cuadro de envenenamiento por Centruroides limpidus y la gráfica de comportamiento del veneno en sangre, de conformidad con la presente invención.

La Figura 8, corresponde a los datos de rescate del modelo animal en perros por envenenamiento por Centruroides limpidus y la gráfica de medición de la efectividad del antiveneno en la sangre. La figura de arriba corresponde al reascate hecho una hora después de la inyección del veneno; la de abajo, dos horas después, de conformidad con la presente invención.

La Figura 9, corresponde a los datos de conformación de un modelo animal en borregos basado en la inducción de un cuadro de envenenamiento por icrurus fulvius y la gráfica de comportamiento del veneno en sangre, de conformidad con la presente invención. La Figura 10, corresponde a los datos de rescate del modelo animal en borregos por envenenamiento por Micrurus fulvius y la gráfica de medición de la efectividad del antiveneno en la sangre, de conformidad con la presente invención. En la figura de arriba se utilizó una dosis insuficiente de antiveneno y se observa que el veneno sube después de cierto tiempo. En la figura de abajo se utilizó una dosis suficiente para controlar los niveles del veneno en sangre durante todo el tiempo de estudio.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.

La presente invención se relaciona con modelos animales específicamente animales grandes y marcadores sustituto para envenenamiento de animales ponzoñosos. De conformidad con la presente invención, es susceptible de ser empleado en animales grandes de diferentes especies y razas, las cuales son elegidas por su capacidad para poder analizar el comportamiento de venenos en la sangre.

Consiste, básicamente, en el desarrollo de un modelo animal grande para ensayar la efectividad de antivenenos a través de la inducción de cuadros de envenenamiento controlado de animales grandes, tales como borregos, perros, cerdos y cabras, entre otros, de 25 a 60 kg aproximadamente, con el veneno a probar por la ruta por la que en un accidente normal ocurriría, por ejemplo, subcutánea para coralillos y alacranes, subcutánea/intramuscular para víboras de cascabel, intradérmica para arañas y alacranes, etc., y en la cantidad que se supone inyecta, en promedio, el animal venenoso. Después de un tiempo, se inyecta el antiveneno por la vía recomendada (intravenosa), si bien pudiera también utilizarse alguna otra. Las variables principales con el antiveneno serían la dosis y el tiempo de administración después de la inyección del veneno. Durante todo el experimento se toman muestras de sangre a tiempos regulares y con un ELISA específico, o cualquier otro método que lo permita, se cuantifica la cantidad de veneno en sangre; también puede medirse la cantidad de antiveneno circulante. La medida de eficacia ("end-point") principal del modelo animal es la remoción rápida y total del veneno circulante y la demostración de que no sube después. Se ha demostrado en estudios clínicos que la eliminación del veneno en sangre correlaciona con la recuperación de los pacientes, medida de diferentes maneras, incluyendo cuando la fisiopatología del envenenamiento lo permite, algunas pruebas de laboratorio como recuperación de parámetros de coagulación en mordeduras de víboras. Con base en los alcances y hallazgos de la presente invención, se ha podido determinar de manera altamente confiable que el modelo de la presente invención permite también establecer la dosis de antiveneno, ya que si se aplica una dosis suficiente el veneno permanece indetectable en sangre y si aplica una dosis insuficiente, el veneno disminuye y vuelve a subir (como se ve claramente en la Figura 10). Con algunos antivenenos y su correspondiente envenenamiento, pueden existir otros "end-points" de eficacia, aparte de la supresión del veneno en sangre, como las referidas pruebas de coagulación con venenos de vipéridos; esta correlación no es siempre posible de manera fácil, por lo que el "end-point- principal sigue siendo la supresión sostenida de la venenonemia. Desde el punto vista bioético, los animales se mantienen bajo anestesia general durante el experimento y hay que eutanizarlos al final del mismo, conforme a las prácticas y normas aplicables.

De esta manera, el modelo animal de la presente invención se caracteriza por obtenerse a través del siguiente procedimiento: Tomar como elemento para el desarrollo del modelo animal, uno o varios ejemplares de animales grandes, preferentemente borregos, perros, cerdos y cabras, entre otros, que preferentemente tengan un peso corporal de 25 a 60 kg aproximadamente; administrar una cantidad sustantiva de veneno a probar por la ruta por la que en un accidente normal ocurriría, por ejemplo, subcutánea para coralillos y alacranes, subcutánea/intramuscular para víboras de cascabel, intradérmica para arañas y alacranes, entre otras, en la cantidad que se supone inyecta, en promedio, el animal venenoso; después de un tiempo, realizar el procedimiento de rescate, consistente en inyectar el antiveneno al animal por la vía recomendada, que normalmente es intravenosa o bien pudiera también utilizarse alguna otra; tomar muestras de sangre a tiempos regulares y con un ELISA específico, o cualquier otro método que lo permita, a fin de cuantificar, preferentemente: la cantidad de veneno en sangre y/o la cantidad de antiveneno circulante. De conformidad con este procedimiento, la medida de eficacia ("end- point") principal del modelo animal es la remoción rápida y total del veneno circulante y la demostración de que no sube después.

Para demostrar la efectividad, eficiencia y las modalidades preferidas del modelo animal grande que caracteriza a la presente invención, perros de diversas razas y borregos de raza pelibuey fueron utilizados con un rango en peso ente 8- 25 Kg y 40-60 kg, respectivamente. Los perros fueron envenenados con veneno del alacrán Centruroides limpidus y la víbora Crotalus atrox mientras que los borregos fueron envenenados con veneno del coral Micrurus fulvius. Experimentos de rescate con los antivenenos mexicanos Alacramyn®, Antivipmyn®, y Coral myn® correspondientes al veneno inyectado, fueron realizados después de 1 o 2 horas del envenenamiento en perros y una hora después del envenenamiento en borregos. En los procesos o experimentos de rescate con Coralmyn® se emplearon dos dosis de antivenenos (3 y 10 viales, respectivamente). Durante todo el experimento se tomaron muestras de sangre a diferentes tiempos, mismas que fueron procesadas para la obtención de suero y guardadas en congelación. Ensayos tipo ELISA fueron desarrollados y validados para la cuantificación de los diferentes venenos en las muestras de suero procesadas. Todos los experimentos en animales fueron realizados de acuerdo a la norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.

Experimento Animal:

Los animales se obtuvieron de dos centros productores, donde fueron mantenidos y separados en cuarentena del resto de la población. La ausencia enfermedades, un historial clínico saludable y cuarentena aprobada fueron parámetros necesarios para el uso de los animales. En el caso de los borregos se solicitó del centro productor donde fueron obtenidos, el certificado de salud expedido por la SAGARPA (Secretaria de agricultura, ganadería, desarrollo rural, pesca y alimentación), de acuerdo a la norma NO -056-ZOO-1995, para las pruebas diagnósticas que realicen los laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria y con ello se demostró que el hato estuviese libre de enfermedades contagiosas causadas por Brucella spp., ycobacterium avium spp., Paratuberculosís spp y Virus de artritis-encefalitis.

Una semana antes de ser objeto del modelo animal de la presente invención, los animales fueron observados diariamente con el objetivo de evidenciar cualquier sintomatología de enfermedad. El día de experimentación los animales fueron transportados hacia el área quirúrgica desde los centros productores de acuerdo a la norma oficial mexicana NOM-024-ZOO-1995, sobre el traslado de animales, productos y subproductos.

Veinticuatro horas previas al experimento, los animales fueron privados de alimento con acceso a agua ad libitum. La determinación del peso de cada animal fue hecha una hora antes del inicio del experimento. La preparación prequirúrgica consistió en el rasurado de cuello, abdomen ventral (únicamente en el caso de los borregos), miembros pélvico y torácico, así como la evaluación de signos vitales tales como: temperatura corporal, tiempo de llenado capilar, frecuencias cardiaca y respiratoria.

El protocolo prequirúrgico-anestésico se inició con una dosis calculada, según el peso del animal, de tiletamina-zolacepam, con aproximadamente 12 mg/kg, intramuscular (i.m.), seguida de una dosis de butorfanol de aproximadamente 0.08 mg/kg subcutáneo (s.c), así como la canalización intravenosa (i.v.) de la vena braquial del miembro torácico derecho, para la administración de cloruro de sodio estéril (NaCI) al 0.9% y la dosificación de anestésicos vía i.v. durante todo el experimento.

El plano profundo quirúrgico se indujo con una dosis inicial i.v. de propofol con aproximadamente 4mg/kg y fue mantenido con isofluorano 1 al 2% en 100% de 02 a través de una sonda endotraqueal hasta el final del experimento. La valoración de signos vitales, a partir de este momento, se realizó cada 10-30 minutos durante el proceso quirúrgico, y cada 5 minutos, una vez inyectado el veneno.

Al término del experimentos, por razones humanitarias, se realizó eutanasia en todos los animales con una sobredosificación intravenosa de pentobarbital sódico 100-200 mg/kg, de acuerdo a la norma oficial mexicana NO -033-ZOO-1995 sobre el sacrificio humanitario de animales domésticos y silvestres.

Descripción de la parte experimental.

En los animales con plano profundo quirúrgico se realizó el lavado y embrocado quirúrgico con jabón, alcohol y yodo en el cuello lateral para canalizar la vena yugular externa derecha y en abdomen medio, sólo en el caso de los borregos, para realizar una ruminotomía, la cual consistió en fijar una sonda gástrica en rúmen exteriorizada percutáneamente con el fin de permitir la salida de los gases producidos por éste.

La canulación de vena yugular se realizó con la inserción de una cánula de silicón quirúrgico de 2 mm de diámetro por 10 cm de largo al cual se ajustó una terminación percutánea tipo "mariposa de tres vías" lo cual optimizó y facilitó la toma de muestras sanguíneas durante los tiempos requeridos para cada experimento, al finalizar la toma de cada muestra se introdujeron 1.5 mi de solución estéril de NaCI 0.9% para prevenir la coagulación de sangre dentro de la cánula.

Dosificación de diversos venenos/antivenenos

Experimentos de inyección de veneno sin aplicación de antiveneno para conocer el comportamiento del veneno en sangre:

Especie: perros

Veneno de Crotalus atrox inyectado vía subcutánea en la región dorsoplantar del miembro pélvico izquierdo, con una dosificación de 20 miligramos en 250 microlitros de solución salina estéril. Veneno de Centruroides !impidus inyectado vía intradérmica en miembro pélvico izquierdo con una dosificación de 150 microgramos en 120 microlitros de solución salina estéril.

Especie: borregos

Veneno de Micrurus fulvius: inyectado vía subcutánea en miembro pélvico derecho región dorsoplantar con una dosificación de 5 miligramos en 1 mililitro de solución salina estéril.

Experimentos de rescate

Especie: perros

Animal 1 : Veneno de Crotalus atrox.

Inyectado vía subcutánea en la región dorsoplantar del miembro pélvico izquierdo, con una dosificación de 25 miligramos en 310 microlitros de solución salina estéril. Antiveneno: 10 viales de Antivipmyn® vía intravenosa después de una hora de la inyección del veneno.

Animal 2: Veneno de Crotalus atrox.

Inyectado vía subcutánea en la región dorsoplantar del miembro pélvico izquierdo, con una dosificación de 36 miligramos en 500 Licrolitros de solución salina estéril. Antiveneno: 10 viales de Antivipmyn® vía intravenosa a las 2 horas postenvenenamiento.

Animal 3: Veneno de Centruroides limpidus.

Inyectado vía intradérmica en miembro pélvico izquierdo con una dosificación de 375 microgramos en 300 microlitros de solución salina estéril.

Antiveneno: 3 viales de "Alacramyn®" vía intravenosa después de la primera hora de envenenamiento.

Animal 4: Veneno de Centruroides limpidus. Inyectado vía intradérmica en miembro pélvico izquierdo con una dosificación de 150 microgramos en 120 microlitros de solución salina estéril.

Antiveneno: 3 viales de "Alacramyn®" vía intravenosa después de 2 horas de envenenamiento.

Especie Borregos

Veneno de Micrurus fulvius: Animales 1 y 2 inyectado vía subcutánea en miembro pélvico derecho región dorsoplantar con una dosificación de 5 miligramos en 1 mililitro de solución salina estéril.

Antiveneno : "Coral myn"

Animal 1 : Tres viales vía intravenosa

Animal 2: Diez viales vía intravenosa

Toma de muestras sanguíneas:

La colección de muestras de sangre en todos los experimentos se realizó obteniendo 5 mi de con una jeringa a través del catéter y colocándola de manera suave en tubos Vacutainer® tapón rojo; una vez formado el coágulo se procedió a la separación del suero el cual fue guardado en congelación (-18 a -20 °C) hasta su análisis por ensayos de ELISA. Además, en todos los experimentos se tomó una muestra de sangre basal, previa a la inyección del veneno.

Los protocolos para toma de muestras sanguíneas fueron los siguientes:

Protocolo 1 :

Experimentos de envenenamiento y rescate

Venenos: Crotalus atrox o Centruroides limpidus.

Antiveneno: Antivipmyn® o Alacramyn®.

Una vez inyectado el veneno se realiza la colección cada 15 minutos hasta completar la primera hora, luego cada 30 minutos hasta completar la segunda hora, y luego cada hora hasta completar 6 horas post envenenamiento. Dependiendo del experimento se rescató con antiveneno a la hora o a las dos horas y se continuó la toma de muestras hasta completar 6 horas.

Protocolo 2:

Experimentos de envenenamiento y rescate

Veneno: Micrurus fulvius.

Antiveneno: Coralmyn®.

Una vez inyectado el veneno se realiza la colección en los minutos 0, 2, 5, 7, 10 y 15, posteriormente cada 5 minutos hasta completar la primera hora, y luego cada 10 minutos hasta completar las 6 horas post envenenamiento. En los experimentos de rescate el antiveneno fue utilizado a una hora de haberse inyectado el veneno.

Los resultados obtenidos muestran la cinética de aparación de veneno en sangre a lo largo del estudio para los diferentes venenos utilizados. En los experimentos de rescate de envenenamiento por Crotalus atrox y Centruroides limpidus, pudo observarse la desaparición sostenida de los antígenos de veneno de la sangre después de la inyección del antiveneno, lo que indica que los antivenenos no sólo son eficaces sino que se utilizaron a una dosis suficiente. El mismo comportamiento se observó independientemente de que el antiveneno haya sido aplicado una o dos horas después de inyectado el veneno. Dentro de los resultados obtenidos, se aplicó a través de una inyección subcutánea una dosis de 5 mg de veneno Micrurus fulvius. De conformidad con lo observado en las gráficas correspondientes al caso, el nivel de veneno en sangre sube y luego de la administración de tres viales del antiveneno (Coralmyn®) a una hora, los niveles de veneno bajaron sustancialmente para después de 10 o 15 minutos volver a incrementarse (indicando que la dosis de antiveneno fue insuficiente), En el otro caso, se administraron 10 viales del mismo antiveneno, observándose que no se encontró la recurrencia de veneno en la sangre (indicando que la dosis de antiveneno fue suficiente).

Es así que se demuestra que el modelo del animal grande descrito conforme al alcance y objetivos de la presente invención, no sólo permite estudiar la eficacia de antivenenos en términos de la eliminación de antígenos del veneno en la sangre, sino que también permite determinar la dosis que debería usarse para neutralizar la cantidad de veneno inoculado en los casos de envenenamiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un modelo animal grande para evaluar la eficacia de antivenenos en sangre, caracterizado porque comprende:

la selección de diferentes ejemplares de especies de animales grandes; la dosificación de una cantidad sustancial de veneno por diferentes vías; la administración posterior de una o varias dosis de antiveneno;

la colecta, distintos tiempos, de muestras de sangre; y

el análisis cuantitativo tanto de la aparición del veneno en sangre como el comportamiento de la desaparición de los antígenos de veneno de la sangre después de la administración del antiveneno.

2. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la utilización de animales grandes, preferentemente borregos, perros, cerdos y cabras, entre otros, que preferentemente tengan un peso corporal de 8 y 60 kg aproximadamente

3. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque los ejemplares son seleccionados de los que presentan ausencia enfermedades, un historial clínico saludable, y en su caso, certificados conforme a las normas correspondientes a pruebas diagnósticas que realicen los laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria.

4. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el procedimiento de manejo del animal previo al envenenamiento es el siguiente: se privan de alimento con acceso a agua ad libitum; se prepara prequirúgicamente el animal y se evalúa en sus signos vitales; se inicia el protocolo prequirúrgico-anestésico con una dosis calculada, de acuerdo al peso del animal, un anestésico tal como, por ejemplo, la tiletamina- zolacepam, con aproximadamente 12 mg/kg, intramuscular (i.m.), seguida de una dosis de butorfanol de aproximadamente 0.08 mg/kg subcutáneo (s.c), así como la canalización intravenosa (i.v.) de la vena braquial del miembro torácico derecho, para la administración de cloruro de sodio estéril (NaCI) al 0.9% y la dosificación de anestésicos vía i.v.;

se induce el plano profundo quirúrgico con una dosis inicial i.v. de propofol con aproximadamente 4 mg/kg, y manteniendo con isofluorano 1 al 2% en 100% de 02 a través de una sonda endotraqueal;

se monitorean constantemente los signos vitales cada 10 a 30 minutos durante el proceso quirúrgico, y cada 5 minutos aproximadamente una vez inyectado el veneno y/o el antiveneno.

5. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la inyección del veneno para conocer el comportamiento del veneno en sangre, se realiza por la vía y dosis calculada en la cual ocurren los accidentes de mordedura o picadura de serpientes, arañas y/o alacranes, según el caso.

6. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la administración del veneno se realiza por vía subcutánea, intradérmica o por cualquier otra vía en una dosificación variable dependiendo del tipo de veneno a ser utilizado y en una solución salina estéril o cualquier otra solución fisiológica estéril.

7. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se administran dosis de antiveneno específico contra serpiente, arañas, alacranes o contra el veneno del animal ponzoñoso a analizar, en cantidades de acuerdo al peso corporal del animal y características del cuadro de envenenamiento.

8. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los antivenenos pueden ser del tipo inmunoglobulinas completas, monoclonales o policlonales, sus fragmentos Fab',o F(ab')2, o cualquier otro tipo de antiveneno natural o producido por técnicas recombinantes.

9. Un modelo animal grande para evaluación de eficacia de antivenenos en sangre, de conformidad con las reivindicaciones 7 y 8, caracterizado porque la dosis de antiveneno se administra con una solución salina estéril o cualquier otra solución fisiológica estéril.

10. Un método para evaluar la eficacia de antivenenos en sangre, caracterizado porque comprende la colecta de muestras de sangre del modelo animal modelo animal grande previo a la administración del veneno, posterior a la administración del veneno y posterior a la administración de la dosis de antiveneno;

11. Un método para evaluar la eficacia de antivenenos en sangre de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque una vez inyectado el veneno se realiza la colección cada 15 minutos hasta completar la primera hora, luego cada 30 minutos hasta completar la segunda hora, y luego cada hora hasta completar 6 horas post envenenamiento.

12. Un método para evaluar la eficacia de antivenenos en sangre de conformidad con las reivindicaciones 10 y 11 , caracterizado porque, dependiendo del caso, al animal con envenenamiento se rescata mediante la administración de antiveneno en un lapso entre una y tres horas posteriores al envenenamiento y se continúa la toma de muestras hasta completar preferentemente 6 horas.

13. Un método para evaluar la eficacia de antivenenos en sangre de conformidad con las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque se analiza la cinética de aparición de veneno en sangre para los diferentes venenos utilizados antes y después de la administración de antivenenos.

14. Un método para evaluar la eficacia de antivenenos en sangre, caracterizado porque se evalúa la eficacia de antivenenos a través de la medición de la desaparición de los antígenos de los venenos en sangre.

15. Un método para establecer la dosis de los antivenenos determinada por la ausencia sostenida de antígenos de venenos en sangre, expresado como la ausencia de recurrencia de antígenos de venenos en sangre a lo largo del experimento.