WO2012011673A2 - 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물 - Google Patents

헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물 Download PDF

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    • A23V2200/316—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on regeneration or building of ligaments or muscles

Definitions

  • composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration comprising hesperetin as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration, and more particularly, a pharmaceutical composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration, containing hesperetin as an active ingredient, a pharmaceutical for treating or preventing muscle disorders. And to food compositions for improving or inhibiting muscle disorders.
  • Hesperidin and its aglycone, hesperetin are classified as citrus bioflavonoids and have anti-atheromic activity due to reduced apolipoprotein B secretion and inhibition of the expression of microsomal triglyceride transfer protein and acyl CoACcholesterol acyltransferase.
  • ant i—It is known to exhibit atherogenic activity.
  • Orally administered hesperidin is converted by the intestinal flora to hesperetin, a diglycosylated metabolite in the body. Hesperetin inhibits histamine secretion in mast cells and exhibits anti-allergic properties.
  • hesperetin inhibits the growth of breast cancer cells by protecting neurons and osteoblasts from oxidative stress and inhibiting the cell cycle at G1. Recently, hesperetin promotes osteoblast differentiation by increasing alkaline phosphatase activity and inducing RUNX2 activity in the BMP signaling pathway: regression: Known bone metabolism damage It indicates that zir r-retan works with anabolic effect.
  • Adult bone marrow mesenchymal stem cells are pluripotent stem cells that can differentiate into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, and muscle cells. Among them, muscle cell differentiation is regulated by various muscle regulatory factors (MRFs) such as MyoD, Myf5, myogenin and MRF4.
  • MRFs muscle regulatory factors
  • MyoD initiates the expression of muscle-specific genes and induces mesenchymal stem cells to differentiate into myocyte lineages. Induction of myogenin expression is regulated by MyoD activity and is an important factor in the final differentiation and induction of muscle specific genes such as MHC (myosin heavy chain) and MCK (muscle creatine kinase). Transcription factor Phosphorus myocyte enhancer factor 2 (MEF2), like MyoD and myogenin, can also regulate muscle differentiation by cooperating with muscle bHLH proteins.
  • MHC myosin heavy chain
  • MCK muscle creatine kinase
  • Muscle cell differentiation or regeneration promoters may be useful for the treatment (improvement) or prevention of muscle disorders such as muscle dystrophy, myopathy, and regeneration of damaged muscle cells. Therefore, the present inventors have studied the development of muscle cell differentiation or regenerative promoters, and for the treatment (improvement) or prevention of muscle disorders, hesperetin is different from myoblast to myocytes.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration, a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders, or a food composition for improving or preventing muscle disorders, which contains hesperetin as an active ingredient. It is.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for improving or preventing muscle disorders comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the present invention also provides hesperetin for use as a pharmaceutical composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration.
  • the present invention also provides hesperetin for use as a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders.
  • the present invention also provides hesperetin for use as a food composition for improving or inhibiting muscle disorders.
  • the present invention provides a method for promoting muscle cell differentiation or regeneration in a subject, comprising the step of administering a pharmaceutically effective amount of hesperetin to the subject.
  • the present invention provides a method for treating muscle disorders comprising administering a pharmaceutically effective amount of hesperetin to a subject having a muscle disorder.
  • the present invention provides a method for preventing muscle disorders comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of hesperetin.
  • a pharmaceutical composition for promoting muscle differentiation or regeneration comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the hesperetin is represented by the following [Formula 1], IUPAC name is (S) -2,3-dihydro-5, 7-di hydr oxy-2- (3-hydr oxy-4-me t hoxypheny 1)- 4H-1-benzopyr an-4-one.
  • the 'muscle cell differentiation' is preferably a differentiation into muscle cells such as mesenchymal stem cells capable of differentiating into muscle cells, but is not limited thereto. Promoting differentiation the muscle cell is not limited to one or preferably by means of non-activated transcription M y oD protein induced US comes to this.
  • the muscle cell regeneration is preferably one of damaged muscle cells, but is not limited thereto.
  • the damage is preferably caused by genetic factors and environmental factors such as surgery, cancer, inflammation, infection, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the term 'muscle disorder' may be due to external factors such as contusion, lacerat ion, crush, internal factors such as sudden or severe falls or muscle strain during sporting activities. Muscle damage, muscle wastage, and / or loss of muscle function that occurs when the blood supply that may occur during treatment is interrupted, which may be due to genetic and / or environmental factors. Preferred but not limited to this.
  • muscle disorders include muscle atrophy, myopathy, muscle injury, muscle dystrophy, sarcopenia 'myoneural conductive diseases and / Or skeletal muscle diseases and disorders such as nerve injury, but are not limited thereto.
  • the muscular atrophy preferably includes, but is not limited to, post-polio muscle atrophy (PPMA) and / or X-linked spinal cord muscle atrophy.
  • PPMA post-polio muscle atrophy
  • X-linked spinal cord muscle atrophy PPMA
  • the muscle injury preferably includes, but is not limited to, traumatic muscle injury.
  • the muscular dystrophy may include, but is not limited to, Duchenne muscular dystrophy, myotonic dystrophy, and / or congenital muscular dystrophy.
  • the neurological conductive disease and / or nerve damage is preferably induced by muscle damage, but is not limited thereto.
  • the prevention is preferably, but not limited to, the effect of blocking the disease before the transition to the disease due to minor muscle damage.
  • the present invention provides a food composition for improving or inhibiting muscle disorders comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the food composition may be a health functional food, the formulation is prepared according to a conventional method, and then dried with a carrier and then encapsulated, or may be formulated in the form of other tablets, granules, powders, beverages porridge, etc. Besides, it can be manufactured in any food form.
  • 'muscle damage' is preferably, but not limited to, muscle damage by genetic factors and environmental factors such as surgery, cancer, inflammation, and / or infection.
  • Hesperetin has the effect of promoting muscle cell differentiation or regeneration and treating (improving) or preventing muscle disorders.
  • the present invention provides a use of hesperetin for promoting muscle cell differentiation or regeneration, a pharmaceutical use for treating or preventing muscle disorders, and a food use for improvement or prevention.
  • the present invention also provides hesperetin for use as a pharmaceutical composition for promoting muscle cell differentiation or regeneration.
  • the present invention also provides hesperetin for use as a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders.
  • hesperetine ⁇ gong for use as a food composition for improving or inhibiting muscle disorders, hesperetine ⁇ gong.
  • Hesperetin of the present invention induces differentiation from myoblasts to myocytes, promotes the expression and final differentiation of muscle cell genes by promoting the expression of muscle regulators, and myogenin in vivo ) Promotes the differentiation and regeneration of muscle cells by promoting expression, it can be used as a muscle cell differentiation or regeneration promoter, a composition for treating or preventing muscle cells, and a food composition for improving or inhibiting muscle disorders.
  • the present invention provides a method for promoting muscle cell differentiation or regeneration in a subject, comprising the step of administering a pharmaceutically effective amount of hesperetin to the subject.
  • the present invention provides a dog having a pharmaceutically effective amount of hesperetinol muscle disorder It provides a method for treating muscle disorders comprising administering to a sieve.
  • the present invention also provides a method for preventing muscle disorders comprising the step of administering a pharmaceutically effective amount of hesperetin to a subject.
  • the muscular disorders are preferably selected from the group consisting of muscular atrophy, muscle disease, muscle damage, muscular dystrophy, sarcopenia, nerve nerve conduction disease and nerve damage, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention is equally applicable to the uses and methods of the present invention.
  • the hesperetin can be administered orally or parenterally to mammals, including humans, and can be administered by formulating an active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • diluents or excipients such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants can be used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and such solid preparations comprising at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and It is prepared by adding gelatin.
  • lubricating agents such as magnesium and talc are used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration include injectable solutions, suspensions, emulsions, lyophilizers, nasal washes and suppositories.
  • injectable solutions, suspensions and emulsions can be prepared by combining water, non-aqueous or suspending agents with active ingredients.
  • Non-aqueous and suspending solutions include vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil, and ethyl.
  • Injectable ⁇ ster such as rate
  • the gauze of the suppository may be used such as Cwitepsol), macrogol, twenty-one, cacao butter, laurin, glycerin and gelatin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection during parenteral administration.
  • compositions, uses and methods of the present invention it is possible to use a dose of 0.001-10 g / kg, preferably 0.1-1 g / kg per adult on a hesperetine basis.
  • the active ingredient in the composition of the present invention may contain 0.01-99.99% by weight of the total weight.
  • the hesperetin may be formulated by adding a pharmaceutically or food-acceptable carrier, excipient, or diluent.
  • a pharmaceutically or food-acceptable carrier for formulation, see Remington's. See, eg, Pharmaceutical Sciences (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA, and others.
  • the promoter of the present invention is effective for muscle cell differentiation and regeneration, and the composition of the present invention is effective for muscle disorders.
  • 1 is a diagram showing the chemical formula of hesperetin.
  • Figure 2 shows the results of microscopic observation of C2C12 cell morphology following hesperetin treatment.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of counting fluorescence-positive cells per field when observing C2C12 cells under a fluorescence microscope.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of microscopic observation after incubation of hesperetin-treated C2C12 cells and hesperetin-free C2C12 cells for 4 days, respectively.
  • Figure 5 shows the results of observing the morphology of C2C12 cells according to hesperetin treatment under a microscope.
  • N is a graph showing the activity of pMyogenin-luc at different concentrations of wasperetane.
  • 12 is a graph showing the activity of pMCK-luc according to the treatment concentration of hesperetin.
  • Figure 13 is a graph showing the activity of pMyogenin-kic, depending on the treatment concentration of hesperetin and the presence or absence of MyoD treatment.
  • FIG. 14 is a graph showing the activity of pMCK-luc, depending on the treatment concentration of hesperetin and the presence or absence of MyoD treatment.
  • 15 is a graph showing the activity of pMyogenin-luc according to the concentration-specific treatment of hesperetin. 16 shows the results of analyzing reporter genes in cells transformed with MyoD, MEF2C, or MyoD + MEF2C expression vector with pMyogenin-luc vector.
  • Figure 17 shows the results of performing ⁇ and immunological analysis (IB) on cells co-transformed with Myc-MyoD or MEF2C expression vector.
  • 18 shows the results of immunoblot of nuclear extracts of cells administered with hesperetin.
  • 19 is a result of performing an immunological analysis on the extract obtained from the cells treated with hesperetin.
  • 20 is a diagram showing the results of DNA pull-down analysis on extracts obtained from cells overexpressing MyoD.
  • Figure 21 shows the results of analysis of the expression levels of MyoD, myogenin and beta-actin in the cells added hesperetin by immunological analysis.
  • 22 to 24 are diagrams showing the relative expression levels of MyoD, myogenin and MCK in cells treated with hesperetin, respectively.
  • Figure 25 shows the results of observing the microscope after separating the TA muscle.
  • Figure 26 is a diagram showing the results of immunoblotting with the myogenin antibody after electrophoresis of the cell extract obtained from TA muscle by the SDS-PAGE method.
  • Hesperetine (purity 95%) was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, M0), all samples for cell culture were purchased from GIBCO-BRUlnvitrogen, Carlsbad, Calif., FBS (Fetal bovine serum) and HS (Horse serum) was obtained from HyClone (Cogan, UT).
  • C2C12 cells were grown in saturation (confluence) for 48 hours in complete medium added with 10> FBS. Cell medium was then replaced with DMEMCDulbecco's Modified Eagle Medium) growth medium with 2% HS. The cells were divided into two groups: (i) the first group was not treated with hesperetin (-Hsp), and (ii) the second group was treated with hesperetin (100 microM) (+ Hsp). The DMEM medium was changed every other day to induce cell differentiation. The two groups were fixed by penetrating 2% paraformaldehyde cell containing 0.1% Triton X-100 on Days 1, 2 and 4, and the anti-MHC antibody (Santa Cruz Biotech. , Santa Cruz, CA), followed by incubation with Alexa Fluor 488-fusion secondary antibody (Invitrogen).
  • Fluorescence-positive cells were observed under a fluorescence microscope (Zeiss Ax i overt 200 fluorescence microscope, Carl Zeiss, Germany) and the fluorescence-positive cell count was counted. The results are shown in FIGS. 2 to 4.
  • Figure 2 shows the results of fluorescence microscopy observation of the hesperetin-treated C2C12 cells (+ Hsp) group and the hesperetin-free C2C12 cells (-Hsp) group on the 1st, 2nd and 4th day. -In the 7T phase, the glance indicates—50 micrometers.
  • FIG. 3 shows fluorescence-positive cells per field in a fluorescence microscope for the hesperretin-treated C2C12 cells (+ Hsp) group and the hesperretin-free C2C12 cells (-Hsp) group on days 2 and 4.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of observation with a fluorescence microscope after culturing C2C12 cells treated with hesperetin and C2C12 cells not treated with hesperetin for 4 days. Multinuclear myotubes were observed in hesperretinol treated C2C12 cells (+ Hsp). Myoblasts are known to be fused to form multinuclear myotubes, which are then regenerated into mature myofibers, which may predict the possibility of myofiber regeneration.
  • the primary antibody was carried out in the same manner as in ⁇ 1-1>, except that an anti-myogenin antibody (Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA) was used instead of the anti-MHC antibody.
  • an anti-myogenin antibody Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA
  • Figure 5 shows the results of fluorescence microscopy observation of the hesperetin-treated C2C12 cells (+ Hsp) group and the hesperetin-free C2C12 cells (-Hsp) group on the 1st, 2nd and 4th day. .
  • the expression of myogenin is also rapidly increased in the group treated with hesperetin.
  • FIG. 6 shows fluorescence-positive cells per field in a fluorescence microscope for the hesperretin-treated C2C12 cells (+ Hsp) group and the hesperretin-free C2C12 cells (-Hsp) group on Days 1, 2 and 4 It is the result of counting. Mean and standard error from 10 fields were calculated.
  • hesperetin has an action of promoting muscle cell differentiation.
  • Example 1 after confirming that myogenin is promoted by hesperetin, the regulation mechanism of hesperetin in myogenin gene expression is known. Experiments were performed to see.
  • C2C12 cells were differentiated in the same manner as in Example ⁇ 1-1> for 2 days.
  • Whole cell extract is used to lyse cells (0.5% Triton ⁇ -100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgC12, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphate, 25 mM NaF).
  • 1 mM Na3V04 100 mg / ml PMSF, 2 mg / ml protease inhibitors
  • centrifuged to obtain supernatant. Proteins were electrophoretically separated using 7.5% acrylamide gel.
  • the current was transferred from the isolated acrylamide gel to the immobilon-P membrane (Millipore Inc., Invitrogen), followed by myogenin, MyoD, MEF2C, and beta-. Bound with an antibody against actin (Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA), followed immediately by a secondary antibody (HRP-conjugated ant i -Rabbit IgG or ant i -mouse IgG, Zymed, South San Francisco, USA) It was reacted with. Thereafter, the results of differentiation using a luminal reagent (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) are shown in FIG. 7.
  • a luminal reagent GE Healthcare, Buckinghamshire, UK
  • Figure 7 shows the results of immunoblot (i ⁇ unoblot), Hesperetin increased the expression of myogenin dose-dependently on day 2, whereas the expression levels of Myo D and MEF2C according to the concentration of hesperetin It can be seen that it does not change.
  • R A was reverse transcribed with a reverse transcriptase (Invitrogen) enzyme for cDNA synthesis.
  • Real time PCR was then performed using ABI-Prism 7000 Sequence Detector (Applied Biosystems, San Mateo, CA). Real time PCR was performed with the following specific primers:
  • Reverse primer 5 '-caatagtgatgacctggccgt-3' (SEQ ID NO:
  • MCK Forward primer 5 '-cacct ccacagcacagacag-3' (SEQ ID NO: 3)
  • Reverse primer 5'-accttggccatgtgattgtt-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Reverse primer 5 1 -aggcgctgtgggat atgcat tcact-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Reverse primer 5 '-ggtgagtcgaaacacggat cat-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Ct threshold cycle
  • hesperetin induces the expression of myogenin, but it can be confirmed that does not affect the MyoD gene transcription. It can also be seen that hesperetin increases the expression of MCK, a muscle-specific marker.
  • Example 2 it was confirmed that Hess ⁇ Retin increased the mRNA levels of maochanin and MCK, and experiments were conducted on the regulation of hesperetin in gene transcription.
  • C2C12 cells were loaded in complete medium (DMEM) until 50-60% of the bottom of the culture dish was filled with the cells (50-60 % confluence) cells were grown. Then divided into two groups: (i) The first group contains the luciferase reporter gene (p Myogenin—luc; Dr. Andrew B. Lassar (Dana Farber) linked to the myogenin promoter to C2C12 cells. From the Cancer Institute, Boston, MA), temporarily using calcium phosphate infusion methods (Jung H, Lee et al., Augmentation of PPARgamma-TAZ interaction contributes to the ant i to adiogenic activity of KR62980.
  • DMEM complete medium
  • the second group contains the luciferase reporter gene (pMCK-luc; obtained from Dr. Andrew B. Lassar (Dana Farber Cancer Institute, Boston, Mass.) Linked to the MCK promoter). Transfection was transiently performed in the same manner as i). Each group was transfected with pCMVi3 (Invitrogen) together. After 24 hours, the two groups were injected with low concentration of mitogen medium, and incubated for 24 hours by injecting hesperetin (0, 20, 100 microM), respectively.
  • pCMVi3 Invitrogen
  • Lucifer erase activity for each group was measured using a Lucif erase assay kit (Pr omega, Madison, Wis.) According to the manufacturer's manual.
  • RLU Relative luciferase unit
  • Figure 11 is a graph showing the activity of the luciferase reporter gene (pMyogenin-luc) linked to the myogenin promoter according to the treatment concentration of hesperetin
  • Figure 12 is the MCK promoter, according to the treatment concentration of hesperetin It is a graph showing the activity of the linked luciferase reporter gene (pMCK-luc).
  • myogenin promoter and MCK promoter have a bHLH protein binding site of myogenin, it was tested whether MyoD, myoDin's bHLHCbasic helix loop helix) protein, was activated by hesperetin.
  • the cell line used in the experiment was HEK 293T (ATCC, CRL-1573) maintained in DMEM medium containing 10% FBS.
  • FIG. 13 is a graph showing the activity of the luciferase reporter gene (p Myogenin-luc) linked to the myogenin promoter according to the treatment concentration of hesperetin.
  • a 293T cell line was introduced into the cell by a vector (mock) or MyoD expression vector (calcium phosphate injection) along with the pMCK-luc reporter gene to express the protein. Hesperetine (0, 20, 100 microM) was added to the cells 24 hours after the gene was introduced and further incubated for 24 hours.
  • Luciferase activity measurement and RLU determination were carried out in the same manner as in ⁇ 3-1>, and the results are shown in FIG. 14.
  • FIG. 14 is a graph showing the activity of the luciferase reporter gene (pMCK-luc) linked to the MCK promoter according to the treatment concentration of hesperetin.
  • the cell line used the same cell line as the cell line of ⁇ 3-2>. Effect of Hesperetin on the Activity of pMvogenin-luc
  • a control vector (mock) or a myogenin expression vector (Dr. Andrew B. Lassar) was introduced into a 293T cell line along with the pMyogenin-luc reporter gene and introduced into cells by calcium phosphate injection. Hesperetine (0, 20, 100 microM) was added to the cells 24 hours after the gene was introduced and further cultured for 24 hours.
  • Luciferase activity measurement and RLU determination were carried out in the same manner as in ⁇ 3-1>, and the results are shown in FIG. 15.
  • FIG. 15 is a graph showing the effect of treatment with concentrations of hesperetin on the activation of pMyogenin-luc by myogenin.
  • enhanced myogenin expression activated myogenin's own promoter activity, while hesperetin did not further increase the transcriptional activity of myogenin.
  • a control was introduced into the 293T cell line by introducing a vector of a mock, MyoD, MEF2C, or MyoD + MEF2C expression vector into the cell with the calcium phosphate transfusion method along with the pMyogenin-luc reporter gene. Hesperetin (0, 20, 100 microM) was added to the cells 24 hours after the gene was introduced and further cultured for 24 hours.
  • myogenin promoter activity by MyoD was increased by treatment with hesperetin.
  • myogenin promoter activity by MyoD was increased by MEF2C co-expression which increased MyoD activity.
  • hesperetin had no significant effect on promoting MyoD activity of MEF2C. ⁇ 4-3> Whether the interaction of MEF2C and MvoD affects the effect of hesperetin
  • Myc-labeled MyoD expression vector (Dr. Andrew B. Lassar) and MEF2C expression vector were introduced into the 293T cell line in the same manner as in ⁇ 4-2> to express the protein under the conditions as described in FIG.
  • Sperretin 100 microM was treated (+ labeled) and incubated for 24 hours before harvesting.
  • the whole cell extract (WCE) and the anti-Myc antibody were reacted to precipitate the immune binding complex (i ⁇ unoprecipitatio, IP).
  • Immunobinding complexes and total cell extracts were isolated by SDS-PAGE, and then immunoblot (IB; immunoblot assay) was performed using anti-Myc antibody and anti-MEF2C antibody. The results are shown in FIG.
  • hesperetin was treated by concentration (0, 20, 50, 100 microM) in low concentration mitogen medium and incubated for 24 hours. Thereafter, NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Re—an extract CNE) was obtained from the cells, and immunoblot analysis for MyoD was performed by the method of Example ⁇ 2-1>. It was. However, OCT 1 antibody (Santa Cruz Biotech Inc.) was used as nuclear protein loading control.
  • 18 shows the results of immunoblot of nuclear extracts of cells administered with hesperetin. 18 shows that hesperetin dose-dependently enhanced the nuclear localization of MyoD in C2C12 cells, but did not affect the level of nuclear control protein 0CT1.
  • Biotin was obtained from total cell extracts obtained by destroying cells with HKMG solution (10 mM HEPES, pH 7.9, 100 mM KC1, 5 mM MgC12, 10% giycerol, 0; 1% " NP-40, 1 mM DTT and protease Inhibitor cocktail).
  • the biotinylated myogenin promoter DNA was treated and incubated, followed by incubation with strap avidin agarose beads (beads).
  • Example ⁇ 2-1> The precipitate was washed three times with HKMG buffer and subjected to immunoblot assay using SDS-PAGE and MyoD antibodies in the same manner as in Example ⁇ 2-1>.
  • the results are shown in FIG. 20 shows DNA pull-down analysis results.
  • hesperetin increased specific DNA promoter affinity of MyoD, but did not directly change the expression level of MyoD.
  • hesperetin affects both nuclear localization and DNA binding activity of MyoD. It can be seen that.
  • the cell lines used in the experiment were C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells (ATCC CCL-226) maintained in DMEM medium containing 10% FBS. It is well known that the cells can be differentiated into osteoblasts and adipocytes according to cell culture conditions (Harada S, RodanGA: Cont ro lofosteob 1 ast funct i onandregu 1 at i onofbonemass. Na tur e2003, 423: 349-355.
  • MyoD expression vector and control vector were introduced into C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cell line. Retroviral transduction methods (Jeong H et al., 2010, FASEB J) were used for gene introduction and stable expression cell line establishment. Cell lines were established and protein expression was confirmed, exchanged with myocyte differentiation medium and simultaneously hesperetine (20, 50, 100 microM) was added and incubated for 48 hours. Cell extracts were isolated in the same manner as in Example ⁇ 2-1> and subjected to SDS-PAGE and immunoblot analysis.
  • Example ⁇ 6-1> In the differentiation conditions as in Example ⁇ 6-1>, the cells were incubated with hesperetin for 2 days, and total RNA was obtained from the cells using TRIzol reagent (Invitrogen) to perform reverse transcription reaction, followed by real-time PCR analysis. Was carried out. Real-time PCR was performed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • MyoD expression by viral transduction increased myogenin expression.
  • MyoD hesperetin dose-dependently increased gene expression of myogenin and MCK.
  • hesperetin has strong pro-myogenic activity through the regulation of MyoD activity in differentiation of mesenchymal stem cells into muscle cells.
  • cryosect i was cut to 10 micro meter thickness, and each section was stained with hematoxylin and eosin. Sections were observed under a microscope. The results are shown in FIG.
  • 25 shows the results of observing the muscle under a microscope, and the scale indicated on the figure represents 100 micro meters.
  • FIG. Figure 26 shows the immunoblotting results, it can be seen that hesperetin also enhanced the induction of myogenin during muscle differentiation and regeneration induced by muscle damage.
  • hesperetin may promote muscle cell differentiation or regeneration, and may be effective in muscle disorders (muscle atrophy, muscle disease, muscle damage, muscular dystrophy, sarcopenia, myeloconductive disease, nerve damage, etc.). Able to know.
  • Capsule was prepared by layering 50 mg of hesperetin, 3 mg of crystalline cells, 14.8 mg of lactose, 0.2 mg of magnesium stearate and gelatin capsules.

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Abstract

본 발명은 근육세포 분화 또는 재생 촉진제, 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물, 근육장애 개선 또는 억제용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 촉진제는 근육 세포 분화와 재생에 효과적이며, 본 발명의 조성물은 근육장애 치료(개선) 또는 예방에 효과적이다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학 적 조성물
【기술분야】
본 발명은 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물에 관한 것으로， 보다 구체적으로 헤스페레틴 (hesperetin)을 유효성분으로 함유하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물， 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 근 육장애 개선 또는 억제용 식품 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
헤스페리딘 (hesperidin)과 그 어글리콘인 헤스페레틴 (hesperetin)은 감귤류 바이오플라보노이드로 분류되며 아포지단백 B 분비 감소와 마이크로좀 트리글리세 라이드 전달 단백질과 acyl CoACcholesterol acyltransferase)의 발현 억제에 의해 항-아테롬 활성 (ant i— atherogenic activity)을 나타내는 것으로 알려져 있다. 경 구 투여된 헤스페리딘은 장내 세균총에 의해 체내에서 디글리코실화 대사체인 헤스 페레틴으로 전환된다. 헤스페레틴은 비만세포에서 히스타민 분비를 억제하고， 항- 알러지 특성을 나타낸다. 또한， 헤스페레틴은 신경세포와 골아세포 (osteoblast)를 산화적 스트레스에서 보호하고 세포주기를 G1에서 억제함으로써 유방암 세포의 증 식을 억제한다. 최근엔 헤스페레틴이 알카린 포스파타아제 활성을 증가시키고 BMP 신호 경로 (signaling pathway)에서 RUNX2활성을 유도하여 골아세포 분화를 촉진하 ― 는 것미 보고:퇴았다:— 아는 골 (骨)대사메서 해즈퍼 r레탄이 동화 (anabolic effect)작 용올 하는 것을 나타내는 것이다. 성인 골수 중간엽줄기세포는 다능성 줄기 세포로 골아세포， 지방세포， 연골 세포， 근육세포로 분화될 수 있다. 그 중 근육세포 분화는 MyoD, Myf5, 미오게닌 (myogenin), MRF4와 같은 다양한 근육 조절 인자 (muscle regulatory factors; MRFs)에 의해 조절된다. MyoD는 근육—특이 유전자의 발현을 개시하게 하고 중간엽 줄기세포가 근육세포 계열로 분화하는 것을 유도한다. 미오게닌 발현의 유도는 MyoD 활성에 의해 조절되고， 최종 분화와 MHC(myosin heavy chain), MCK(muscle creatine kinase)와 같은 근육 특이 유전자의 유도에 중요한 요소이다. 전사인자 인 MEF2(myocyte enhancer factor 2)류 또한 MyoD와 미오게닌 처럼 근육 bHLH 단백 질과 협동작용에 의해 근육 분화를 조절할 수 있다.
근육세포 분화 또는 재생 촉진제는 근위축증 (muscular dystrophy), 근질환 (myopathy) , 손상된 근육세포의 재생 등 근육장애 치료 (개선) 또는 예방에 유용하 게 사용될 수 있다. 이에, 본 발명자들은 근육세포 분화 또는 재생 촉진제의 개발과 근육장애 치 료 (개선) 또는 예방을 위한 연구한 결과， 헤스페레틴 (hesperetin)은 전근모세포 (myoblast)로부터 근세포 (myocytes)로의 분화를 유의적으로 유도하는 효과를 가지 는 것을 확인하였고, 근육조절인자 발현 촉진을 통한 근육세포 유전자의 발현과 최 종분화를 촉진할 수 있음을 확인하였으며， in vivo에서 미오게닌 (myogenin) 발현 촉진을 통한 근육세포 분화 및 재생 촉진효과를 확인함으로써， 상기 헤스페레틴을 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 헤스페레틴 (hesperetin)을 유효성분으로 함유하는 근육세 포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물, 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성 물， 근육장애 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
——상기 ^적을 달청하기ᅳ위하 본짤명은 헤즈 3 레틴 (hesperetin)을 유효성 분으로 포함하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 식품조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물로 사용하기 위한 헤스페레틴을 제공한다.
또한， 본 발명은 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한 헤스페레틴을 제공한다. 또한， 본 발명은 근육장애 개선 또는 억제용 식품조성물로 사용하기 위한 헤 스페레틴을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 개체에 투여하는 단 계를 포함하는 개체내 근육세포 분화 또는 재생 촉진방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 근육장애를 갖는 개 체에 투여하는 단계를 포함하는 근육장애 치료방법을 제공한다.
아울러， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육장애 예방방법을 제공한다. 이하, 본 발명올 상세히 설명한다. 본 발명은 헤스페레틴 (hesperetin)을 유효성분으로 포함하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 헤스페레틴은 하기 [화학식 1]로 표시되며， IUPAC 명은 (S)-2,3- dihydro-5， 7-d i hydr oxy-2- ( 3-hydr oxy-4-me t hoxypheny 1 ) -4H- 1-benzopyr an-4-one 이 다.
[화학식 1]
Figure imgf000005_0001
상기 '근육세포 분화'는 근육세포로 분화 가능한 중간엽줄기세포 등의 근육 세포로의 분화인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 근육세포분화촉진은 MyoD 단백질 유발 미오게닌 전사 활성화에 의한 것 이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 근육세포재생은 손상된 근육세포의 재생인 것이 바람직하나 이에 한정 되지 않는다.
상기 손상은 수술， 암， 염증， 감염 등 유전적 인자와 환경적 인자에 의한 것 이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한， 본 발명은 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 '근육장애 (muscle disorder)'는 타박상 (contusion) , 열상 ( lacerat ion)， 압좌 (crush)와 같은 외적 요인， 갑작스럽거나 심한 낙상 또는 스포츠 활동 중의 근 육 긴장 (muscle strain)과 같은 내적 요인， 치료 중 발생할 수 있는 혈액 공급이 중단될 때 발생하는 근육 손상， 근육 소모， 및 /또는 그로 인한 근육 기능의 손실 등을 포함하는 의미이며， 그 원인은 유전적 인자 및 /또는 환경적 인자에 의한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 근육장애의 예로는 근육위축증 (muscle atrophy), 근질환 (myopathy)， 근 육 손상 (muscle injury) , 근이영양증 (muscle dystrophy) , 근육감소증 (sarcopenia) ' 근신경 전도성 질병 (myoneural conductive diseases) 및 /또는 신경 손상 (nerve injury)과 같은 골격근 질병 및 장애들을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 근육위축증은 소아마비 후 근위축 (PPMA; post-polio muscle atrophy) 및 /또는 X-연관 척수구근 근위축 등을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않 는다.
상기 근육 손상은 외상성 근육 손상 등을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한 정되지 않는다.
상기 근이영양증은 듀센 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy), 근긴장 성 이영양증 (myotonic dystrophy) 및 /또는 선천성 근이영양증 등을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 근신경 전도성 질병 및 /또는 신경 손상은 근육 손상에 의해 유도되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 예방은 경미한 근육손상 등에 의해 질병으로 전이되기 전단계에서 질환 화하는 것을 차단하는 효과를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한， 본 발명은 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 억제용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 식품조성물에 있어서， 본 발명의 약학조성물에서 언급된 사항과 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
상기 식품조성물은 건강기능식품일 수 있으며， 제형은 통상의 방법에 따라 제조하며, 담체와 함께 건조한 후 캡슐화하거나 기타 정제, 과립， 분말, 음료ᅳ 죽 등의 형태로 제형화할 수 있으며， 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태로 제조 가능하다.
본 발명에 있어서， '근육 손상'은 수술， 암, 염증， 및 /또는 감염 등 유전적 인자와 환경적 인자에 의해 근육이 손상된 것을 의미하는 것이 바람직하나 이에 한 정되지 않는다.
헤스페레틴은 근육세포 분화 또는 재생 촉진 및 근육장애를 치료 (개선) 또는 예방하는 효과를 나타낸다.
따라서， 본 발명은 헤스페레틴의 근육세포 분화 또는 재생 촉진 용도 및 근 육장애 치료 또는 예방용 의약 용도와 개선 또는 예방용 식품 용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물로 사용하기 위한， 헤스페레틴을 제공한다.
또한， 본 발명은 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위 한， 헤스페레틴을 제공한다.
또한， 근육장애 개선 또는 억제용 식품 조성물로 사용하기 위한， 헤스페레틴 ^쩨공한다.
본 발명의 헤스페레틴은 전근모세포 (myoblast)로부터 근세포 (myocytes)로의 분화를 유도하고， 근육조절인자 발현 촉진을 통한 근육세포 유전자의 발현과 최종 분화를 촉진하며， in vivo에서 미오게닌 (myogenin) 발현 촉진을 통한 근육세포 분 화 및 재생 촉진하므로， 근육세포 분화 또는 재생 촉진제， 근육세포 치료 또는 예 방용 조성물, 및 근육장애 개선 또는 억제용 식품조성물로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 개체에 투여하는 단 계를 포함하는 개체내 근육세포 분화 또는 재생 촉진방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴올 근육장애를 갖는 개 체에 투여하는 단계를 포함하는 근육장애 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 개체에 투여하는 단 계를 포함하는 근육장애 예방방법을 제공한다.
상기 근육장애는 근육위축증， 근질환, 근육 손상, 근이영양증， 근육감소증， 근신경 전도성 질병 및 신경 손상으로 이루어진 군으로 부터 선택되는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.
별도의 언급이 없는 한， 본 발명의 조성물에 관한 내용은 본 발명의 용도， 방법에도 동일하게 적용된다.
상기 헤스페레틴은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구로 투여가 가능 하며， 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 층진제， 증량제, 결합제， 습윤제， 붕해제 및 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제는 정제， 환제， 산제， 과립제, 캡슐제 둥이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분, 탄산칼슘, 수크로 스， 락토오스， 및 젤라틴 등을 첨가하여 제조한다 . 또한， 마그네슘， 탈크 등 윤활 제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되며， 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경 구투여를 위한 제제에는 주사가능한 액제， 현탁제， 유제， 동결건조제， 비강세척제 및 좌제가 포함된다. 주사가능한 액제， 현탁제， 유제는 물， 비수성용제나 현탁용 제와 유효성분을 흔합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌 글리콜， 폴리에틸렌글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸을레이트와 같은 주사가능한 ^스테르 등얼 수 있다. — 좌체의 가제로는 위템솔 Cwitepsol), 마크로 골， 트원 61， 카카오지, 라우린지， 글리세를 및 젤라틴 등의 사용될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사로 투여 가능하다.
본 발명의 조성물, 용도 및 방법에서는, 헤스페레틴 기준으로 성인 기준 1일 0.001-10 g/kg, 바람직하게는 0.1-1 g/kg의 용량으로 사용가능하다.
본 발명의 조성물 중 유효성분은 총 중량 중 0.01-99.99 중량 % 함유할 수 있 다.
상기 헤스페레틴은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체， 부형제 또 는 회석제 등을 첨가하여 제제화할 수 있으며， 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science (최근판)， Mack Publishing Company , Easton PA 등의 문헌 을 참조할 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명의 촉진제는 근육 세포 분화와 재생에 효과적이며， 본 발명의 조성물 은 근육장애에 효과적이다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 헤스페레틴 (hesperetin)의 화학식을 나타낸 도이다.
도 2는 헤스페레틴 처리에 따른 C2C12 세포형태를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 C2C12세포를 형광 현미경으로 관찰시， 필드 (field) 당 형광 -양성 세 포를 계수한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 헤스페레틴을 처리한 C2C12세포와 헤스페레틴을 처리하지 않은 C2C12 세포를 각각 4일간 배양시킨 후， 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 헤스페레틴 처리에 따른 C2C12세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과 를 나타낸 것이다.
도 6은 C2C12세포를 형광 현미경으로 관찰시， 필드 당 형광 -양성 세포를 계 수한 결과이다.
도 7은 분화된 C2C12 세포 추출물을 면역블롯 (i睡 unoblot)한 결과이다.
도 8 내지 10은 각각 분화된 C2C12 세포 추출물 내의 미오게닌， myoD, 및 MCK의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
— 도 n은 해스페레탄의—처리농도에 따른， pMyogenin-luc의 활성을 나타낸 그 래프이다.
도 12는 헤스페레틴의 처리 농도에 따른， pMCK-luc의 활성을 나타낸 그래프 이다.
도 13은 헤스페레틴의 처리 농도 및 MyoD 처리 유무에 따른, pMyogenin-kic 의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 헤스페레틴의 처리 농도 및 MyoD 처리 유무에 따른， pMCK-luc의 활 성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 헤스페레틴의 농도별 처리에 따른, pMyogenin-luc의 활성을 나타낸 그래프이다. 도 16은 MyoD, MEF2C, 또는 MyoD+MEF2C 발현백터를 pMyogenin-luc 백터와 함 께 형질전환시킨 세포에서 리포터 유전자를 분석한 결과이다.
도 17은 Myc-MyoD또는 MEF2C 발현백터와 함께 공동-형질전환시킨 세포에 대 하여， ^^^^와 면역학적 분석 (IB)을 수행한 결과이다.
도 18은 헤스페레틴을 투여한 세포의 핵추출물을 면역블롯 한 결과이다. 도 19는 헤스페레틴을 처리한 세포로부터 수득한 추출물에 대하여， 면역학적 분석을 수행한 결과이다.
도 20은 MyoD가 과발현된 세포로부터 수득한 추출물에 대한 DNA 풀 -다운 (pull -down) 분석결과를 나타낸 도이다.
도 21은 헤스페레틴을 첨가한 세포에서， MyoD, 미오게닌 및 베타-액틴의 발 현 수준을 면역학적 분석방법으로 분석한 결과이다.
도 22 내지 도 24는 각각 헤스페레틴을 처리한 세포에서, MyoD, 미오게닌 및 MCK의 상대적 발현 수준을 나타낸 그림이다.
도 25은 TA근육을 분리한 후, 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 26는 TA 근육으로부터 수득한 세포추출물을 SDS-PAGE 방법으로 분리 전기영동한 후， 미오게닌 항체로 면역블롯팅 (immunoblotting)한 결과를 나타낸 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용 이 하기 실시에에 한정되는 것은 아니다.
<사약의준비 >
본 발명의 실시예에서 사용한 모든 시약은 아래와 같이 입수하였다
헤스페레틴 (순도 95%)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, M0)로부터 입수하였으며， 세포배양을 위한 모든 시료는 GIBCO-BRUlnvitrogen, Carlsbad, CA)로부터 구입하 였고， FBS(Fetal bovine serum)와 HS(Horse serum)는 HyClone(Cogan, UT)으로부터 입수하였다.
<데이타처리 >
실시예 중 데이터는 평균 士 SEM으로 나타냈다. 통계적 유의성은 unpaired Student's t-test 또는 one way ANOVA로 결정되었다. 0.05 이하의 P-값은 통계적 으로 유의성이 있는 것으로 간주하며， 도에서 *:P<0.05이고， **:P<0.005이다.
<실시예 1> 해스페레틴의 근육세포로의 분화촉진 효과 확인
<!-!> 해스페레틴의 근세포 (myocytes) 분화 유도효과
전근모세포 (myoblast)인 C2C12 세포주 (ATCC,CRL-1772, myoblast)를 저농도 미토젠 (mitogen) 배지 내에서， 헤스페레틴을 포함하는 경우와 불포함하는 경우로 나누어 근세포 (myocytes)로 분화를 유도함으로써， 헤스페레틴이 근세포 분화 유도 에 미치는 영향을 파악하고자 하였다.
구체적으로， 10 >의 FBS를 첨가한 완전배지 내에서， C2C12세포를 48시간 동안 포화상태 (confluence)로 세포성장시켰다. 그 후， 세포 배지를 2%의 HS를 첨가한 DMEMCDulbecco's Modified Eagle Medium) 성장배지로 교체하였다. 상기 세포를 두 그룹으로 나누어 (i) 첫번째 그룹에는 헤스페레틴을 처리하지 않았고 (-Hsp), (ii) 두번째 그룹에는 헤스페레틴 (100 microM)을 처리하였다 (+Hsp). 상기 DMEM 배지는 격일로 갈아주며 세포 분화를 유도하였다. 상기 두 그룹을 1일， 2일， 4일째에 0.1% Triton X-100을 함유하는 2% 파라포름알데히드로 세포침투시겨 고정하고, 1차 항체인 항 -MHC 항체 (Santa Cruz Biotech. Inc. , Santa Cruz, CA)와 함께 배양한 후 ， Alexa Fluor 488-융합 2차 항체 (Invitrogen)와 함께 배양하였다.
형광—양성 세포를 형광현미경 (Zeiss Ax i overt 200 형광 현미경， Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하고， 형광 -양성 세포수를 계수하였다. 그 결과를 도 2 내지 도 4 에 나타내었다.
도 2는 1일, 2일, 4일째의 헤스페레틴 처리 C2C12세포 (+Hsp) 그룹과 헤스페 레틴을 처리하지 않은 C2C12세포 (-Hsp) 그룹을， 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나 타낸 그림아다.― 상 7T 도—에서 눈큼은—50 micro— meter를 나타낸다.
도 2에 의하면， 미오게닌의 분화시 원통형 근세포 (myocytes)로의 형태학적 (Morphological) 변화는 시간 의존적으로 증가함을 알 수 있다.
도 3은 2일， 4일째의 헤스페레틴 처리 C2C12세포 (+Hsp) 그룹과 헤스페레틴을 처리하지 않은 C2C12세포 (-Hsp) 그룹에 대하여， 형광 현미경 내의 필드 (field) 당 형광 -양성 세포를 계수한 결과를 나타낸 도이다. 10 필드로부터의 평균 및 표준 오차를 계산하였다.
상기 도 2 및 도 3의 결과로부터， 헤스페레틴에 의해 원통형 근세포 (myocytes)의 수가 급증하였으며， MHCOnyosin heavy chain) 발현이 강화되었음을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 전근모세포 (myoblast)가 근세포 (myocytes)로 분화 하는 것을 해스페레틴이 유도하였음을 나타내는 것이다.
한편, 도 4는 헤스페레틴을 처리한 C2C12세포와 헤스페레틴을 처리하지 않은 C2C12세포를 4일간 배양한 후， 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 헤스페레틴올 처리한 C2C12세포 (+Hsp)에서 다핵성 근관 (myotubes)이 관찰되었다. 전근모세포 (myoblast)는 융합되어 다핵성 근관 (myotubes)을 형성하고 이어 성숙한 근섬유로 재생되는 것으로 알려져 있으므로， 이와 같은 결과로 부터 근섬유 재생 가능성을 예견할 수 있다.
<1-2>해스폐레틴의 미오게닌 발현 촉진 효과
1차 항체를 항 -MHC 항체 대신 항-미오게닌 항체 (Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA)를 사용한 것올 제외하고， 상기 <1-1〉과 동일한 방법으로 실시하였 다.
그 결과를 도 5와 도 6에 나타내었다.
도 5는 1일， 2일， 4일째의 헤스페레틴 처리 C2C12세포 (+Hsp) 그룹과 헤스페 레틴을 처리하지 않은 C2C12세포 (-Hsp) 그룹을 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나 타낸 그림이다.
도 5에서 보는 바와 같이 미오게닌의 발현 역시， 헤스페레틴을 처리한 그룹 에서 급격히 증가함을 알 수 있다.
도 6은 1일， 2일， 4일째의 헤스페레틴 처리 C2C12세포 (+Hsp) 그룹과 헤스페 레틴을 처리하지 않은 C2C12세포 (-Hsp) 그룹에 대하여 형광 현미경 내의 필드 당 형광 -양성 세포를 계수한 결과이다. 10 필드로부터의 평균 및 표준 오차를 계산하 였다.
아를—통해 ^스퍼†레틴이 -근육조절:인자2 Γ발현을 촉진함으로써， 근육세포 유 전자의 발현과 최종 분화를 촉진함을 확인하였다.
따라서， 헤스페레틴은 근육세포 분화를 촉진하는 작용을 나타냄을 알 수 있 다.
<실시예 2>해스페레틴에 의한 미오게닌과 MCK유전자 발현 촉진에 의한 근육세포 분화 효과 확인
<2-1>분화된 C2C12세포 추출물의 면역블롯 (i腿 unoblot)분석
상기 <실시예 1>에서， 헤스페레틴에 의해 미오게닌 발현이 촉진됨을 확인한 것에 이어， 미오게닌 유전자 발현에 있어서 헤스페레틴의 조절 메커니즘에 대해 알 아보기 위한 실험을 수행하였다.
헤스페레틴을 농도별 (0， 20, 50， 100 microM)로 처리한 배지에서， C2C12 세 포를 2일 동안 실시예 <1-1〉에서와 동일한 방법으로 분화시켰다. 전체 세포 추출 물 (Whole cell extract)은 세포를 용해용액 (0.5 % Triton Χ-100, 20 mM Tris, pH 7.5， 2 mM MgC12, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphate, 25 mM NaF, 1 mM Na3V04, 100 mg/ml PMSF, 2 mg/ml protease inhibitors)에서 용해시킨 다음， 원심분리하여 상층액을 취하여 얻었다. 7.5% 아크릴아마이드 젤을 사용하여 단백 질을 전기영동 분리하였다. 단백질이 분리된 아크릴아마이드 젤로부터 전류를 통 하여 단백질을 이모빌론— P(immobilon-P) 막 (Millipore Inc. , Invitrogen)에 이동 (transfer)시킨 후， 미오게닌， MyoD, MEF2C, 및 베타-액틴에 대한 항체 (Santa Cruz Biotech. Inc. , Santa Cruz, CA)와 함께 결합시키고， 곧이어 2차 항체 (HRP- conjugated ant i -Rabbit IgG 또는 ant i -mouse IgG, Zymed, South San Francisco, USA)와 함께 반응시켰다. 그 후， 루미날 (luminal) 시약 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 분화 (development )한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 면역블롯 (i圆 unoblot) 분석 결과로， 헤스페레틴은 2일째에 용량 -의존적으로 미오게닌의 발현을 증가시킨 반면， Myo D와 MEF2C의 발현수준은 해스페레틴의 농도 에 따라 변하지 않음을 알 수 있다.
<2-2>분화된 C2C12세포 추출물의 실시간 (real-time) PCR분석
상기 실시예 <2-1〉에서와 동일한 방법으로 분화한 세포로부터 TRIz 시약 (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 수확하여, 역전사시킨 후， 실시간 PCR분석을 다 음과 같이 수행하였다.
먼저 cDNA 합성을 위해 —상기 R A를 역전사효조 (reverse transcriptase) (Invitrogen) 효소로 역전사시켰다. 그 후 ABI-Prism 7000 서열 디텍터 (Applied Biosystems, San Mateo, CA)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 실시간 PCR은 다음의 특정 프라이머로 수행하였다:
베타 -액틴
정'방향 프라이머 (Forward primer)： 5 ' -agagggaaat cgt gcgt gac~3 ' (서열번호
1)
역방향 프라이머 (Reverse primer)： 5 ' -caatagtgatgacctggccgt-3 ' (서열번호
2)
MCK 정방향 프라이머： 5 ' -cacct ccacagcacagacag-3 ' (서열번호 3)
역방향 프라이머: 5'-accttggccatgtgattgtt-3' (서열번호 4)
미오게닌
정방향 프라이머: 5 ' -caaccaggaggagcgagacctccg-3 ' (서열번호 5)
역방향 프라이머: 51 -aggcgctgtgggat atgcat tcact-3 ' (서열번호 6)
MyoD
정방향 프라이머: 5 ' -tgggat atggagct t ct at cgc-3 ' (서열번호 7)
역방향 프라이머: 5 ' -ggtgagtcgaaacacggat cat-3 ' (서열번호 8) 각각의 상대적인 mRNA 발현량 값은 베타 -액틴 값으로 표준화 (normalization) 한 후, Ct(threshold cycle)값으로 결정하였다. 그 결과를 도 8 내지 10에 나타내 었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 수행한 후， 결과를 평균 士 SEM로 나타내 었다. (Ns:not significant , *： ρ<0.05, ***： ΡΟ.0005)
상기 도 8 내지 10에 의하면， 유전자 전사의 수준에서， 헤스페레틴이 미오게 닌의 발현을 유도하나， MyoD 유전자 전사에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있다. 또한， 헤스페레틴은 근육-특이적 마커인 MCK의 발현을 증가시킴을 알 수 있다.
이러한 결과는 헤스페레틴이 선택적으로 미오게닌과 MCK의 유전자 전사를 조 절할 수 있음을 의미한다.
<실시예 3> 해스폐레뛰의 미오게니과 MCK의 유^자 저사를 유도하는 MvoD의 활성 강화작용 확인
― 상기 <살시예 2 를 통해， 헤스^레틴이 마오채닌과 MCK의 mRNA 수준을 증가 시킴을 확인하였으며， 유전자 전사에서 헤스페레틴의 조절기능에 대한 실험을 수행 하였다.
<3-1> 해스페레틴의 미오게닌 프로모터와 MCK프로모터 활성유도 효과
헤스페레틴이 직접 미오게닌과 MCK의 유전자 전사를 조절하는지 조사하기 위 해ᅳ C2C12 세포를 완전 배지 (DMEM)에서， 배양 접시의 바닥의 50-60%를 세포가 채울 때까지 (50-60% confluence) 세포성장시켰다. 그 후， 두 그룹으로 나누어 (i) 첫번 째 그룹에는 C2C12세포에 미오게닌 프로모터에 연결된 루시퍼라제 리포터 (luciferase reporter) 유전자 (p Myogenin—luc; Dr. Andrew B. Lassar(Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)로 부터 입수)를 칼슘포스페이트형질주입방법 (Jung H, Lee 등， Augmentation of PPARgamma-TAZ interaction contributes to the ant i~ adi ogenic activity of KR62980. Biochem Pharmacol 2009 참조)으로 일시적으로 형질주입 (transfection)시키고， (ii) 두번째 그룹에는 MCK 프로모터에 연결된 루시 퍼라제 리포터 유전자 (pMCK-luc; Dr. Andrew B. Lassar(Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)로 부터 입수)를 상기 (i)과 동일한 방법으로 일시적으로 형질주입하였다. 각각의 군에는 pCMVi3(Invitrogen)을 함께 형질주입하였다. 24 시간 후, 상기 두 그룹에 저농도 미토젠 (mitogen) 배지를 주입하고， 각각 헤스페레 틴 (0， 20， 100 microM)을 주입하여 24시간 동안 배양하였다.
각각의 그룹에 대해 루시퍼라제 (lucif erase) 활성을 루시퍼라제 분석 킷트 (Lucif erase Assay Kit )(Pr omega, Madison, WI)를 이용하여， 제조사의 매뉴얼에 따 라 측정하였다.
RLU(Relative luciferase unit)은 형질주입 효율을 위해 내부 컨트를로 공- 형질주입된 pCMVP의 베타-갈락토시다아제 활성으로 표준화하여 결정하였다. fold induction은 콘트를 활성을 1로 하여 계산하였으며， 데이타는 3회의 독립적인 실험 의 평균 土 SEM로 나타내었다. ( *: p<0.05, **： P<0.005, ***： P<0.0005)
그 결과를 도 11과 도 12에 나타내었다.
도 11은 헤스페레틴의 처리 농도에 따른， 미오게닌 프로모터에 연결된 루시 퍼라제 리포터 유전자 (pMyogenin-luc)의 활성을 나타낸 그래프이며， 도 12는 헤스 페레틴의 처리 농도에 따른, MCK 프로모터에 연결된 루시퍼라제 리포터 유전자 (pMCK-luc)의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11 및 도 12에 의하면， 헤스페레틴은 미오게닌과 MCK 프로모터 모두의 활 성을 유도하였다. - 따라서， 훼스페레탄은—프로모터 활성화를 통해 미오게닌과 M— CK 의 유전자 전사를 증가시킬 수 있을 것으로 보인다.
<3-2>해스페레틴의 MvoD활성화 확인
미오게닌의 프로모터와 MCK의 프로모터는 모두 미오게닌의 bHLH 단백질 결합 부위를 가지므로， 미오게닌의 bHLHCbasic helix loop helix) 단백질인， MyoD가 헤 스페레틴에 의해 활성화 되는지 여부를 실험하였다.
실험에 사용한 세포주는 10% FBS 함유 DMEM 배지에 유지한 HEK 293T(ATCC, CRL-1573)이었다.
(1) pMyogenin-luc reporter 유전자를 이용한실험 HEK 293T 세포주에 컨트롤 백터 (mock) 또는 MyoD 발현백터 (Dr. Andrew B. Lassar)를 pMyogenin—Iuc reporter 유전자와 함께 칼슘포스페이트형질주입방법으로 세포내로 도입하고 단백질을 발현시켰다. 유전자 도입 후 24시간에 상기 세포에 헤스페레틴 (0， 20， 100 microM)을 첨가하여 24시간 더 배양하였다.
루시퍼라제 활성측정과 RLU 결정은 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 실시하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13은 헤스페레틴의 처리 농도에 따른， 미오게닌 프로모터에 연결된 루시 퍼라제 리포터 유전자 (p Myogenin-luc)의 활성을 나타낸 그래프이다.
(2) PMCK-luc reporter 유전자를 이용한 실험
293T 세포주에 컨트를 백터 (mock) 또는 MyoD 발현백터를 pMCK-luc reporter 유전자와 함께 칼슘포스페이트형질주입방법으로 세포내로 도입하고 단백질을 발현 시켰다. 유전자 도입 후 24시간에 상기 세포에 헤스페레틴 (0， 20, 100 microM)을 첨가하여 24시간 더 배양하였다.
루시퍼라제 활성측정과 RLU 결정은 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 실시하여 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14는 헤스페레틴의 처리 농도에 따른， MCK 프로모터에 연결된 루시퍼라제 리포터 유전자 (pMCK-luc)의 활성을 나타낸 그래프이다.
상기 도 13 및 도 14에서， fold induct ion은 콘트를 활성을 1로 하여 계산하 였으며， 데이타는 3회의 독립적인 실험의 평균 士 SEM로 나타내었다. ( *: p<0.05, **: P<0.005 , ***： ΡΟ.0005)
그 결과， 293Τ 세포에서 MyoD의 외적 (Ectopic) 발현은 미오게닌 프로모터의 활성과 MCK프로모터의 활성을 각각 7배， 4배 증가시켰다.
-상가와 같이， 헤스페테틴은 MyoIJ유도 유전—자 프로모터 활성을 추가로 증가 시켰으나, MyoD 발현 백터를 형질전환 시키지 않은 그룹에서는 상기와 같은 효과를 나타내지 않았다.
이러한 결과로부터， 헤스페레틴은 MyoD의 전사적 활성을 강화하여, 그 목표 유전자의 전사를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4>해스페레틴의 MvoD에 대한 선택적 활성 조절 효과 확인
미오게닌과 MCK의 프로모터 활성에 있어서， 헤스페레틴이 미오게닌과 다른 MRFs의 활성에 미치는 효과에 대한 실험을 수행하였다.
세포주는 <3-2>의 세포주와 동일한 세포주를 사용하였다. <4-l>해스페레틴이 pMvogenin-luc의 활성에 미치는 영향
293T 세포주에 컨트롤 백터 (mock) 또는 미오게닌 발현백터 (Dr. Andrew B. Lassar)를 pMyogenin-luc reporter 유전자와 함께 칼슘포스페이트형질주입방법으로 세포내로 도입하고 단백질을 발현시켰다. 유전자 도입 후 24시간에 상기 세포에 헤스페레틴 (0， 20， 100 microM)을 첨가하여 24시간 더 배양하였다.
루시퍼라제 활성측정과 RLU 결정은 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 실시하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15는 미오게닌에 의한 pMyogenin- luc의 활성화에 대한 헤스페레틴의 농도 별 처리에 따른 효과를 나타낸 그래프이다.
상기 도 15에서， fold induction은 컨트를 활성 (mock)을 1로 하여 계산하였 으며, 데이타는 3회의 독립적인 실험의 평균 士 SEM로 나타내었다 .(ns: not sigmif icant , **: P<0.005)
도 15에서 보는 바와 같이, 강화된 미오게닌 발현은 미오게닌 그 자신의 프 로모터 활성을 활성화시켰으나, 헤스페레틴은 미오게닌의 전사적 활성을 추가로 증 가시키지는 않았다.
<4-2>해스페레틴이 미오게닌과 다른 MRFs의 활성에 미치는 효과
293T 세포주에 컨트를 백터 (mock), MyoD, MEF2C, 또는 MyoD+MEF2C 발현백터 를 pMyogenin-luc reporter 유전자와 함께 칼슘포스페이트형질주입방법으로 세포내 로 도입하고 단백질을 발현시켰다. 유전자 도입 후 24시간에 상기 세포에 헤스페 레틴 (0， 20， 100 microM)을 첨가하여 24시간 더 배양하였다.
― 루시퍼라제 활설측정과 결정은 상가 과 동일한 방법으로 실시하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.
상기 도 16에서, fold induction은 콘트를 활성 (mock)을 1로 하여 계산하였 으며， 데이타는 3회의 독립적인 실험의 평균 土 SEM로 나타내었다. ( *: p<0.05, **: PO.005)
도 16에서 보는 바와 같이, MyoD에 의한 미오게닌 프로모터 활성은 해스페레 틴 처리에 의하여 증가하였다. 또한， MyoD 활성을 증가시키는 MEF2C 공동 발현에 의해 MyoD에 의한 미오게닌 프로모터 활성은 증가하였다. 그러나， 헤스페레틴은 이러한 MEF2C의 MyoD 활성 촉진에는 의미있는 영향을 미치지 않았다. <4-3>해스페레틴의 효과에 MEF2C와 MvoD의 상호작용이 영향을 미치는지 여 분
293T 세포주에 Myc-표지 MyoD 발현백터 (Dr. Andrew B. Lassar) 및 MEF2C 발 현백터를 상기 <4-2>과 동일한 방법으로 도입하여 도 17에 기재된 바와 같은 조건 으로， 단백질올 발현시키고， 해스페레틴 (100 microM)을 처리 (+ 표시군)하고 24시간 동안 배양한 후 수확하였다. 추출한 총 세포 추출물 (WCE; whole cell extract)과 항 -Myc 항체를 반웅시켜 면역결합 복합체를 침전시켰다 (i画 unoprecipitatio, IP). 분리한 면역결합복합체 및 총 세포 추출물을 SDS-PAGE 방법으로 분리한 다음， 항ᅳ Myc 항체, 항 -MEF2C 항체를 사용하여 면역학적 분석 (IB; immunoblot assay)을 수행 하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 의하면， MEF2C와 MyoD의 직접 상호작용은 헤스페레틴에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 헤스페레틴에 의한 특정 전사 조절은 MEF2C 가 아닌， MyoD의 활성화를 통해서 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 5>해스페레틴의 MvoD의 핵내 발현 촉진 및 DNA결합 활성 촉진작용 확인 <5-1>해스페레틴이 C2C12 MyoD의 nuclear localization에 더치는 효과
헤스페레틴의 MyoD 활성화에 기반을 둔 조절 메커니즘을 더 상세히 밝히기 위해, 헤스페레틴의 존재 하에서 MyoD의 세포내 위치분포 (subcellular localization)를 평가하였다.
C2C12 세포를 포화상태 (confluence)로 세포성장 시킨 후， 저농도 미토젠 (mitogen) 배지에서 헤스페레틴을 농도별 (0， 20, 50, 100 microM)로 처리하고 24시 간 동안 배양하였다. 그 후 상기 세포로부터 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Re— agent§(Pierce)로 첵 추출물 CNE)을 수득하여, 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 MyoD에 대한 면역블롯 (immunoblot) 분석을 수행하였다. 다만， OCT 1 항 체 (Santa Cruz Biotech Inc.)를 핵 단백질 loading control로 사용하였다.
도 18에 그 결과를 나타내었다.
도 18은 헤스페레틴을 투여한 세포의 핵추출물을 면역블롯 (immunoblot) 한 결과이다. 도 18에 의하면, 헤스페레틴은 C2C12 세포 내 MyoD의 nuclear localization을 용량 -의존적으로 강화시켰으나， 핵 컨트롤 단백질인 0CT1의 핵내 수준 (level)에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
<5-2> MyoD수준과 DNA와의 관계 확인 C2C12 세포를 헤스페레틴이 추가 (+), 또는 추가되지 않은 (-) 근육분화 배지 에서 48시간 배양하였다. 본 실험을 위하여 동위원소를 사용하지 않는 EMSA (electrophoretic gel mobility shift assay)로 상기 <5-l>에서 사용한 방법으로, 세포 핵 단백질을 추출하여 비오틴 (biotin)으로 표지된 DNA와 반웅용액 (10 mM HEPES, pH 7.9, 60 mM NaCl , 10 % glycerol, 0.2 % NP-40, 2 mg/ml BSA, 2 mM Na3V04, 2 mM DTT)에서 결합시켰다. 실온에서 20분간 반응시킨 다음, native 6 % 아크릴아마이드 젤에서 전기영동하였다. . 분리된 단백질을 나일론 멤브레인 (membrane)으로 이동 (transfer)하고 MyoD 단백질의 DNA 결합 복합체 확인을 위하여 호스래디쉬 퍼록시다아제 (Horse-radish peroxidase)가 표지된 스트렙트아비딘 (Strep vidin)과 반웅하고 신호를 필름으로 감지하였다. 헤스페레틴이 처리되지 않은 세포 핵단백질을 사용하여 경쟁적 DNA(competitor) 존재 유무에 따른 DNA-단 백질 결합복합체 생성을 확인하였다. 또한 헤스페레틴이 처리된 세포 핵단백질에 서의 DNA 결합 활성 증가 여부를 확인하였다.
그 결과를 도 19에 나타내었다. MyoD 단백질의 특이적 DNA 결합 복합체 형 성이 해스페레틴 처리에 의하여 증가함을 의미한다.
<5-3> DNA pull -down분석
상기 <5-2>에서와 같은 조건에서 헤스페레틴 처리에 의한 MyoD 단백질의 DNA 결합활성 증가는 핵으로 이동된 MyoD 단백질의 양적 증가에 의한 결과일 수 있다. 따라서 MyoD 단백질의 직접적인 DNA 결합력 증가에 대한 헤스페레틴의 효과 검증을 위하여 전체 단백질 추출물을 사용하여 DNA pull -down 분석을 수행하였다.
세포를 HKMG 용액 (10 mM HEPES, pH 7.9， 100 mM KC1 , 5 mM MgC12, 10% giycerol , 0； 1% "NP-40 , 1 mM DTT and protease Inhibitor cocktail)로 파괴하여 얻은 총 세포 추출물을 비오틴이 결합된 (biotinylated) 미오게닌 프로모터 DNA를 처리하여 배양한 후， 스트랩트아비딘 아가로오스 비드 (beads)를 처리하여 배양하였 다.
침전물을 HKMG 버퍼로 3회 세척한 후， 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 SDS- PAGE 및 MyoD 항체를 사용하여 면역블롯 분석 ( immunoblot assay)하였다. 그 결과 를 도 20에 나타내었다. 도 20은 DNA pull -down 분석결과이다.
도 20을 참고하면， 헤스페레틴은 MyoD의 특정 프로모터 DNA 결합 친화도를 증가시켰으나， MyoD의 발현수준을 직접 변화시키지는 않았음을 알 수 있다.
따라서 헤스페레틴은 MyoD의 핵 localization 과 DNA 결합 활성 모두에 영향 을 미칠 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 6> MvoD발현을 통한 해스페레틴의 Dromyogenic활성
실험에 사용한 세포주는 10% FBS 함유 DMEM 배지에 유지한 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포 (ATCC CCL-226)이었다. 세포 배양 조건에 따라 골세포와 지방세포 등으로 분화할 수 있음이 이미 잘 알려져 있다 (Harada S, RodanGA: Cont ro lofosteob 1 ast funct i onandregu 1 at i onofbonemass . Na tur e2003 , 423： 349-355.； Gregory CA, Ylostalo J, Prockop DJ: Adult bone marrow stem/progenitor eel Is (MSCs) are precondi t ioned by m i c r oenv i r onment a 1 "niches" in culture: a two- stage hypothesis for regulation of MSC fate. SciSTKE2005 , 2005： pe37. 참조).
<6-l> MvoD. 미오게닌 및 베타-액틴의 발현 수준의 면역학적 분석
헤스페레틴의 pr으 myogenic 활성이 premyoblast C2C12 세포에 국한되지 않음 을 입증하기 위해 하기와 같은 방법으로 실험하였다.
C3H10T1/2 중간엽줄기세포 세포주에 MyoD 발현 백터 및 컨트롤 백터를 도입 하였다. 유전자 도입 및 안정적인 발현 세포주 확립을 위하여 retroviral transduction 방법 (Jeong H et al. , 2010， FASEB J 참조)을 사용하였다. 세포주를 확립하고 단백질 발현 여부를 확인하고, 근육세포 분화 배지로 교환하고 동시에 헤 스페레틴 (20, 50, 100 microM)을 첨가하고 48시간 배양하였다. 실시예 <2-1>과 동 일한 방법으로 세포 추출물을 분리하여 SDS-PAGE, 면역블롯 분석 방법을 실시하였 다.
그 결과를 도 21에 나타내었다.
그 결과， οϋ가 비-근육—세포 형―태의 口 Τ오게닌 —전환에 중요하기 때문에, MyoD의 부재시 헤스페레틴에 의한 미오게닌 발현의 유도는 없었다.
<6-2> MvoD. 미오게닌 및 MCK의 상대적 발현수준의 real-time PCR분석
실시예 <6-1>과 같은 분화 조건에서， 세포를 헤스페레틴과 함께 2일간 배양 하고， TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 세포로부터 수득하여, 역전사 반웅을 수행하였고 곧이어 실시간 PCR 분석을 실시하였다. 실시간 PCR은 실시예 <2-2>과 동일한 방법으로 실시하였다.
MyoD, 미오게닌 및 MCK의 상대적 발현 수준을 베타 -액틴 수준을 기준으로 표 준화하여 비교한 결과를 도 22 내지 도 24에 각각 도시하였다. 각각의 상대적인 mRNA 발현량 값은 베타 -액틴 값으로 표준화 (normalization)한 후， C threshold cycle)값으로 결정하였다. 그 결과를 도 22 내지 24에 나타내었다. 데이터는 3회 의 독립적인 실험을 수행한 후， 결과를 평균 士 SEM로 나타내었다. (Ns:not significant , *: ρ<0.05 , **: Ρ<0.005)
바이러스 transduction에 의한 MyoD의 발현은 미오게닌 발현을 증가시켰다. 또한， MyoD를 발현시킨 경우, 헤스페레틴은 미오게닌과 MCK의 유전자 발현을 용량- 의존적으로 증가시켰다.
이러한 결과로부터， 헤스페레틴은 중간엽 줄기세포의 근육세포로의 분화에서 MyoD 활성의 조절올 통해 강력한 pro-myogenic 활성을 가짐을 알 수 있다.
<실시예 7> in vivo에서 해스페레틴의 근육 지 1생 효과 확인
헤스페레틴이 in vivo에서 근육세포 분화와 재생에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
C57BL/6 마우스를 Jackson Laborator ies(Bar Harbor , ME, USA)에서 구입하여 사용하였다. 마우스 (n=6)를 약하게 마취시킨 후， TA(tibialis anterior) 근육에 BaCl2(1.2% BaC12 50ul/마우스)를 근육주사하여 손상시켰다. 두 그룹으로 나누어 , 첫번째 그룹의 쥐에게 매일 헤스페레틴을 복강 (intraperitoneal) 내로 PBS에 용해 시켜 주입하였다 (50 mg/kg, i.p.). 두번째 그룹의 쥐에게는 PBS(PH0SPHATE BUFFERED SALINE)를 투여하였다. 5일 동안 상기와 같이 처리한 후， 5일째 두 그룹 의 쥐를 C02가스로 안락사시켰다. 대조를 위해 TA를 손상시키지 않은 정상 쥐를 준 비하였다.
<7-1>해스페레틴의 근육 재생 효과 현미경 관찰
TA 근육올 분리한 후， 10 micro meter 두께로 동결절단 (cryosect i이 i)하고， 각 섹션을 헤마특실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin)으로 염색하였다. 현미경으로 섹션을 관찰하였다. 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25는 상기 근육을 현미경으로 관찰한 결과이며， 도면상에 표시된 눈금은 100 micro meter를 나타낸다.
손상 후 5일째에 myofibers의 재생은 조금 일어나며， 손상된 근육은 명백한 괴사 (necrosis)를 나타내었고， 광범위한 면역 세포 침투를 나타내었다. 그러나， 헤스페레틴의 복용에 의해， 중앙 핵 재생 근섬유 (centrally nucleated regenerating myofibers)의 유도가 가속화됨을 알 수 있다. <7~2>해스페레틴의 근육 채생 효과 면역학적 관찰
TA 근육으로부터 얻은 총 세포 추출물을， SDS-PAGE 방법으로 분리전기영동 한 후， 미오게닌 항체로 면역블롯 (i隱 unoblot) 분석법을 실시하였다 (실시예 <2-1〉 과 동일한 방법임). 그 결과를 도 26에 나타내었다. 도 26은 이뮤노블롯팅 결과 를 나타내며， 헤스페레틴은 근육 손상에 의해 유도되는 근육 분화와 재생 동안 미 오게닌의 유도 또한 강화하였음을 알 수 있다.
이러한 결과로부터 헤스페레틴의 처리에 의해 생체 내에서 근육 재생 과정에 서 미오게닌 발현을 강화하고， 손상-유도된 근육 분화와 재생을 개선시킬 수 있음 올 알 수 있다.
따라서， 헤스페레틴은 근육세포 분화 또는 재생 촉진 작용을 나타내며， 근육 장애 (근육위축증， 근질환， 근육 손상， 근이영양증， 근육감소증， 근신경 전도성 질 병, 신경 손상 등)에 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
<제조예 1> 약학조성물
헤스페레틴 50 mg, 결정성 셀를로오스 3 mg, 락토오스 14.8 mg, 마그네슴 스 테아레이트 0.2 mg올 젤라틴 캡슐에 층전하여 캡술제를 제조하였다.
<제조예 2>식품 조성물
헤스페레틴 (1 중량 %)， 액상과당 (0.5 중량 %)， 을리고당 (2 중량 %)， 설탕 (2 중 량 %), 및 식염 (0.5 중량 ¾»)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후 균질하게 배합하여 순 간 살균을 하여 건강음료를 제조하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
헤스페레틴 (hesperetin)을 유효성분으로 포함하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 헤스페레틴은 하기 화학식 1로 기재되는 것을 특징으 로 하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물:
[화학식 1]
Figure imgf000023_0001
[청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 근육세포분화촉진은 MyoD 단백질 유발 미오게닌 전사 활성화에 의한 것인 것을 특징으로 하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서 , 상기 근육세포재생은 손상된 근육세포를 재생하는 것을 특 징으로 하는 근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물.
【청구항 5]
헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조 성물.
【청구항 6] 제 5항에 있어서， 상기 근육장애는 근육위축증， 근질환， 근육 손상， 근이영 양증, 근육감소증， 근신경 전도성 질병 및 신경 손상으로 구성된 군으로 부터 선택 되는 것을 특징으로 하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
【청구항 7】
헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 억제용 식품조성 물
【청구항 8】
제 8항에 있어서， 상기 근육장애는 근육위축증， 근질환， 근육 손상 근이영 양증， 근육감소증， 근신경 전도성 질병 및 신경 손상으로 이루어진 군으로 부터 선 택되는 것을 특징으로 하는 근육장애 개선 또는 억제용 식품조성물.
【청구항 9]
근육세포 분화 또는 재생 촉진용 약학적 조성물로 사용하기 위한， 헤스페레 틴.
【청구항 10]
근육장애 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， 헤스페레틴.
【청구항 11]
근육장애 개선 또는 억제용 식품 조성물로 사용하기 위한， 헤스페레틴.
【청구항 12】
약학적으로 유효한 양의 해스페레틴을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개 체내 근육세포 분화 또는 재생 촉진방법 .
【청구항 13】
약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 근육장애를 갖는 개체에 투여하는 단 계를 포함하는ᅭ근육장매 치료방 ―
【청구항 14】
약학적으로 유효한 양의 헤스페레틴을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근 육장애 예방방법 .
【청구항 15】
제 13항 및 제 14항에 있어서， 상기 근육장애는 근육위축증， 근질환， 근육 손상， 근이영양증， 근육감소증， 근신경 전도성 질병 및 신경 손상으로 이루어진 군 으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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