WO2012008806A2 - ＴＧａｓｅ２와 ＶＨＬ을 이용한 ＴＧａｓｅ２ 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

ＴＧａｓｅ２와 ＶＨＬ을 이용한 ＴＧａｓｅ２ 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • VHL interacts with TGase2, and this interaction is further increased in the presence of proteasome inhibitors.
  • Cells were simultaneously infected with the indicated expression plasmids for 24 hours, followed by or without MG132 (5 mM) for 12 hours.
  • Whole cell extracts were analyzed by immunoprecipitation using anti-HA antibodies and then immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies.
  • Simultaneous immunoblot analysis of whole cell extracts with anti-TGase2 and anti-HA antibodies showed that TGase2 and VHL were stably expressed in a proteosome dependent method.
  • FIG. 8 TGase2-VHL complex undergoes proteosome-dependent degradation.
  • FIG 17 is a photograph showing that TGase2 and VHL expression is inversely related in human RCC carcinoma samples.
  • TGase2 and VHL expression were inversely related.
  • VHL expression was low or absent (A and B).
  • C and D the expression of TGase2 was relatively high (C and D).
  • E, arrow invasive progenitor cells
  • F, arrow the expression of VHL was relatively low or absent
  • VHL cDNA was subcloned into modified pET32 (Novagen) using BamHI / XhoI restriction enzymes, 23-residue polyhistidine tag (MHHHHHHGSLVPRSENLYFQGS, 6xHis) at the amino terminus of VHL, and 10-residue polyhistidine tag at the carboxy terminus (LEHHHHHH, 8 ⁇ His) was added.
  • Recombinant VHL was purified by established protocol after overexpression in E. coli strain Rosetta 2 (DE3) (Novagen).
  • VHL-TGase2 polymer was easily detected and the expression level of the polymer was increased in the cells treated with MG132.
  • TGase2 included in the polymer was also detected in anti-HA precipitation, indicating that TGase2 acts as a substrate for polymerization with the ability to catalyze polymerization with VHL (FIG. 8).
  • VHL is a substrate of TGase2
  • purified recombinant human VHL was reacted in vitro with purified guinea pig liver TGase.
  • TGase2 induced the polymerization of VHL in a dose dependent manner (FIG. 22). Recovery by high molecular weight gel fraction (arrow head in FIG.

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Abstract

본 발명은 VHL(Von Hippel-Lindau)에 TGase2(Transglutaminse 2)와 TGase2의 활성조절 후보물질을 처리하여 반응시키고, 반응산물로부터 상기 후보물질에 의한 VHL 또는 VHL-TGase2 중합체 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 TGase2 억제제 또는 촉진제를 세포내에서 또는 in vitro에서 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법으로 얻어진 TGase2 억제제는 항암제로서 사용할 수 있고, 상기 방법으로 얻어진 TGase2 촉진제는 항바이러스제로 사용할 수 있으므로, 보다 효과적인 항암제 또는 항바이러스제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＴＧａｓｅ２와 ＶＨＬ을 이용한 ＴＧａｓｅ２ 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법
본 발명은 TGase2와 VHL을 이용한 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 VHL(Von Hippel-Lindau)에 TGase2(Transglutaminse 2)와 TGase2의 활성조절 후보물질을 처리하여 반응시키고, 반응산물로부터 상기 후보물질에 의한 VHL 또는 VHL-TGase2 중합체 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 TGase2 억제제 또는 촉진제를 세포내에서 또는 in vitro에서 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
저산소증 유도 인자-1α (Hypoxia-inducible factor-1α)는 저산소증에 의해 발현이 조절되는 유도성 전사인자이다. 암세포에서 HIF-1α의 축적은 혈관생성을 유도하며, 약물 내성을 유발한다(Wartenberg, M. et al. FASEB J 17, 503-5 (2003)). 최근 보고에 의하면 HIF-1α는 TGase2에 의해 유도된다(Jang, G.Y. et al. Oncogene 29, 356-67). TGase2는 교차 연결 효소로, 암 세포의 증식, 이동, 혈관형성, 상피 세포의 간엽세포로의 변이 및 약물 내성등 다양한 세포경로에 관여한다(Verma, A. & Mehta, K. Drug Resist Updat 10, 144-51 (2007), Iismaa, S.E., Mearns, B.M., Lorand, L. & Graham, R.M. Physiol Rev 89, 991-1023 (2009), Kim, S.Y. Advnace in Enzymology 78(2010) in press). TGase2의 유도는 NF-κB의 억제자(I- κBα)의 중합을 통해 구조적 NF-κB 활성에 기여하며(Lee, J. et al. J Biol Chem 279, 53725-35 (2004)), 이는 암세포에서 약물 내성 기작 중 하나라고 보고되었다(Mehta, K., Fok, J., Miller, F.R., Koul, D. & Sahin, A.A. Clin Cancer Res 10, 8068-76 (2004). Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Cancer Res 66, 10936-43 (2006). Park, S.S., Kim, J.M., Kim, D.S., Kim, I.H. & Kim, S.Y. J Biol Chem 281, 34965-72 (2006), Gangadharan, C., Thoh, M. & Manna, S.K. J Cell Biochem 107, 203-13 (2009), Kim, D.S., Park, K.S. & Kim, S.Y. Front Biosci 14, 2514-21 (2009), Kim, J.M. et al. J Mol Biol 384, 756-65 (2008)). 유방암 조직에서 TGase2 발현의 증가는 NF-κB의 활성증가와 관련되어 있다(Park, K.S., Kim, D.S., Jeong, K.C. & Kim, S.Y. Front Biosci 14, 1945-51 (2009)). TGase2에 의한 NF-κB 연계 신호 활성의 증폭은 NF-κB억제자로 알려진 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-g)의 감소에 의한 것으로 나타난다(Maiuri, L. et al. J Immunol 180, 7697-705 (2008)). 상기 케이스 모두 감소된 염증 전사 요소(Von Hippel-Lindau, VHL) 억제자가 존재한다.
본 발명자는 TGase2 매개의 단백질-단백질 교차 결합이 번역 후 변형(post-translational modification)을 통하여 2차 신호전달의 독특한 메커니즘을 일으킨다는 것을 제안한다. 본 발명자는 TGase2의 발현이 암세포에서 HIF-1α의 억제제를 하향 조절한다는 것을 발견하였다.
본 히펠 린다우(Von Hippel-Lindau, VHL) 종양 억제 단백질은 유비퀴틴-리가제 복합체의 일부로서 폴리-유비퀴틴화 및 단백질 분해(proteosomal degradation)를 통해 HIF-1α를 하향 조절한다(Kaelin, W.G., Jr. Nat Rev Cancer 8, 865-73 (2008)). 신장 선암세포에서, VHL은 FLICE 억제 단백질(c-FLIP), 서바빈(survivin), 세포사멸-1 억제자(inhibitor of apoptosis-1, c-IAP-1) 및 c-IAP-2와 같은 NF-κB-타겟 항-세포사멸 유전자를 억제함으로써 NF-κB 활성을 하향조절하며, VHL은 세포가 종양괴사인자(TNF) 유도 독성에 민감하도록 한다(Qi, H. & Ohh, M. Cancer Res 63, 7076-80 (2003)). VHL에 의한 NF-κB억제 기작은 잘 알려져 있으나, VHL의 감소가 어떻게 NF-κB의 활성을 유도하는 지에 관해서는 알려져 있지 않다. 또한, VHL 유전자의 결실, 돌연변이 또는 프로모터의 메틸레이션에 의한 VHL 조절은 잘 알려져 있으나(Tischoff, I. & Tannapfel, A. Z Gastroenterol 46, 1202-6 (2008). Cowey, C.L. & Rathmell, W.K. Curr Oncol Rep 11, 94-101 (2009). Curtis, C.D. & Goggins, M. Methods Mol Med 103, 123-36 (2005)), 단백질 수준에서 VHL 조절 기작은 아직 설명되어 있지 않다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 단백질 수준에서 VHL 조절 기작을 규명하고자 예의 연구노력한 결과, TGase2가 VHL과 중합체를 형성하고, 상기 중합체가 프로테아좀 의존적으로 분해됨을 확인하였으므로, 상기 TGase2와 VHL의 상호작용을 이용하여 TGase2의 활성을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질로부터 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 세포내에서 TGase2와 VHL을 이용한 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 in vitro에서 TGase2와 VHL을 이용한 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법으로 얻어진 TGase2 억제제는 항암제로서 사용할 수 있고, 상기 방법으로 얻어진 TGase2 촉진제는 항바이러스제로 사용할 수 있으므로, 보다 효과적인 항암제 또는 항바이러스제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1 내지 5는 정상 및 암세포주에서, HIF-1α 발현이 TGase2 녹다운에 의해 감소하고, VHL의 발현이 TGase2 발현과 반비례 관계에 있음을 나타내는 사진이다. (도 1) HIF-1α 발현은 암세포에서 TGase2 녹다운에 의해 억제되었다. TGase2를 TGase2 특이적 siRNA의 처리에 의하여 억제시킨 다음, HIF-1α의 수준을 면역블롯으로 분석하였다. 암세포에서 VEGF 발현을 TGase2-특이적 siRNA를 이용한 TGase2 녹다운에 의해 억제하였다. VEGF 수준을 RT-PCR로 분석하였다. GAPDH mRNA 수준을 대조군으로 측정하였다. (도 2) 내생적 VHL의 발현은 TGase2가 과발현된 난소 암종 및 유방암세포에서 감소하였다. HEK293, MCF7, NCI/ADR-RES, 및 MDA-MB-231 세포의 세포질 분획을 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 사용하여 면역블롯으로 분석하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 분석하였다. (도 3) 내생적 VHL 단백질 수준은 TGase2의 과발현에 의해 하향 조절되었고, TGase2 억제제 처리 또는 TGase2 돌연변이체(C277S)의 발현에 의해 회복되었다. HEK293 및 MCF7 세포를 TGase2의 발현 벡터 또는 TGase2 C277S 돌연변이체로 24시간 동안 단계적으로 형질감염 시켰고, 시스타민을 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다(CTM; 0.5mM). 세포의 세포질 분획을 회수하고 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. (도 4) HEK-293 및 MCF7 세포에서 이소성 VHL 및 TGase2의 발현을 나타낸다. 세포를 24시간 동안 제시한 발현 플라스미드로 동시 감염시키고, 시스타민을 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다(CTM; 0.5mM). TGase2 및 VHL수준을 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 사용한 면역블롯을 통해 분석하였다. (도 5) 이소성으로 발현된 VHL은 이소성 TGase2의 용량 의존적 과발현에 의해 하향 조절되었다. 세포를 VHL발현 벡터로 동시 감염시켰고, TGase2 발현 벡터의 양은 48시간 동안 증가하였다. 세포 추출물을 준비하였고, 항-TGase2 및 VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 6 내지 8은 TGase2 및 VHL의 직접적인 물리적 상호작용이 TGase2-VHL 중합체 형성 및 프로테아좀-의존적 분해를 일으킴을 나타내는 사진이다. (도 6)TGase2는 프로테아좀 내에서 분해된 VHL 단량체의 집적을 유도한다. 세포를 24시간 동안 제시한 플라스미드로 형질감염 시키고, 회수하기 전에 12시간 동안 다양한 억제제(칼펩틴, 칼페인 억제제, 50μM; 류펩틴, 리소좀 억제제, 50μM; MG 132, 프로테아좀 억제제, 5μM)를 처리한 것과 처리하지 않은 것으로 구분하였다. TGase2 및 VHL수준을 항-TGase2 및 항-HA 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다. (도 7) VHL은 TGase2와 상호작용하고, 이러한 상호작용은 프로테아좀 억제제의 존재시 더욱 증가하였다. 세포를 지시한 발현 플라스미드로 24시간 동시 감염시켰고, 그 후 12시간 동안 MG132(5mM)를 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포 추출물을 항-HA 항체를 이용하여 면역 침전으로 분석하였고, 그 후 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. 항-TGase2 및 항-HA 항체를 이용한 전체 세포 추출물의 동시적 면역 블롯 분석은 TGase2 및 VHL이 프로테오좀 의존적인 방법으로 안정적으로 발현되는 것을 나타내었다. (도 8) TGase2-VHL 복합체는 프로테오좀-의존적인 분해가 일어난다. 세포를 지시한 발현벡터로 24시간 동시 감염시키고, MG132(5mM)를 12시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포추출물로부터 VHL을 항-HA 항체(도 7보다 5배 더 많은 세포 용해물) 이용하여 면역 침전하였고, 면역 복합체를 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 9 내지 12는 TGase2의 억제와 함께 이소성 VHL의 발현이 NF-κB 활성을 억제시키고 IGF1R-β 수준을 감소시킨다는 것을 나타내는 그래프 및 사진이다. (도 9)NF-κB 활성은 VHL의 이소성 발현 및 TGase2의 억제에 의해 감소하였다. 세포를 지시된 발현벡터로 24시간 형질 감염시킨 후 24시간 동안 시스타민(CTM; 0.5mM)을(오른쪽 패널) 또는 TGase2-특이적 siRNA를(왼쪽 패널) 처리하거나 처리하지 않았다. 배양 배지를 회수하고, NF-κB 전사활성을 SEAP 리포터 분석을 이용하여 측정하였다. 결과는 평균 ± 3 세트 실험 평균의 기본 오차(SEM)로 나타내었다(p<0.05). (도 10) (도 9)에서 설명한 세포의 핵 추출물을 32P-표지된 NF-kB 프로브를 이용한 EMSA방법으로 분석하였다. (도 11) annexin V/프로피디움 아이오다이드 염색(PI) 및 절단된 카스파아제 3 및 PARP의 면역 블롯에 의해 세포 사멸을 분석하였다. 세포를 VHL 발현 플라스미드 및 TGase2-특이적-siRNA로 형질감염시켰다. Annexin Ⅴ/PI 염색을 유세포 분석으로 측정하였다. 초기 및 후기 세포사멸과 대응하여 사분면 내의 회수된 세포의 백분율을 나타내었다(위쪽 패널). 전체 세포 추출물을 항-절단 카스파아제-3, 항-PARP 및 항-β-액틴 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다. (도 12) TGase2의 억제는 VHL 단백질 수준을 회복시켰고, 내생적 IGF1R-β 단백질 수준을 하향조절하였다. 세포를 지시한 플라스미드로 24시간 형질감염 하였고, 그 후 회수하기 전에 24시간 동안 시스타민(CTM; 0.5 mM)을 처리하거나 처리하지 않았다(왼쪽 패널). 대안적으로, 세포를 가역적 감염을 이용하여 TGase2-특이적 siRNA로 24시간 형질감염시켰고, 그 후 지시한 발현 플라스미드로 24시간 형질감염시켰다(오른쪽 패널). 전체 세포 추출물을 항-TGase2, 항-IGF1R-β 및 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 13 내지 16은 TGase2의 과발현이 체내 VHL의 억제 및 IGF1R-β 및 NF-κB의 활성을 유도하는 것을 나타내는 개략도, 사진 및 그래프이다. (도 13) TGase2 형질전환 마우스종을 생성하는데 사용한 TGase2-pCAGGS 게놈 구조체의 모식도를 나타낸다. (도 14) PCR에 의하여 TGase2 이식 유전자가 도입된 잠재적인 파운더 마우스를 확인하였다. (도 15) 관류 후에, 야생형 및 TGase2 형질전환 마우마우스로부터 유래한 동결 조직을 균질화하였고, 그 후 TGase2, VHL 및 IGF1R-β 수준을 항-TGase2, 항-VHL 및 항-IGF1R-β 항체를 이용한 면역블롯으로 상대적으로 검출하였다. (도 16) 조직은 (도 13)에서 설명한 바와 같이 준비하였고, 핵 추출물을 32P-표지된 NF-κB 프로브를 이용한 EMSA로 분석하였다. NF-κB DNA결합 활성을 밀도계측기를 이용하여 정량화하였다. 결과는 평균 ± 세 세트 샘플의 SEM으로 나타내었다(p<0.05).
도 17은 TGase2 및 VHL발현이 인간 RCC암종 시료에서 반비례 관계에 있음을 나타내는 사진이다. 11개의 RCC 세포 암종 샘플 중 9개에서 TGase2 및 VHL 발현이 반비례 관계에 있었다. TGase2의 발현이 높은 샘플의 경우, VHL 발현은 낮거나 없었다(A 및 B). TGase2의 발현이 낮은 샘플의 경우, VHL의 발현은 상대적으로 높았다(C 및 D). 침습성 전반 세포(E, 화살표)에서 TGase2의 발현은 높은 반면, VHL의 발현은 상대적으로 낮거나 없었으며(F, 화살표), 이는 TGase2 및 VHL발현의 반비례 관계를 나타내는 추가적인 증거로 제공된다. 모든 이미지 증폭 비율은 100X이다.
도 18은 NF-κB 활성에서 VHL 및 TGase2의 역할을 위해 제시된 모델을 나타내는 개략도이다. TGase2는 중합 및 단백질 분해에 의한 I-κBα(Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Reversal of drug resistance in breast cancer cells by transglutaminase 2 inhibition and nuclear factor-kappaB inactivation. Cancer Res 66, 10936-43 (2006)) 및 VHL의 감소를 통해 NF-κB의 활성을 유도되거나 확장한다. NF-κB의 잘 알려진 주요 억제제이며, VHL은 HIF-1α 및 IGF-1R을 조절하는 종양 억제제이다. I-κBα 및 VHL의 감소는 암세포에서 생존, 성장, 이동, 약물 내성 및 세포사멸의 저항을 증가시킨다.
도 19는 TGase2가 과발현된 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에서 시스타민 또는 TGase2-특이적 siRNA에 의한 TGase2 발현억제에 의하여 이소성 VHL의 발현 수준이 회복됨을 나타내는 사진이다. 세포를 48시간동안 TGase-2 특이적 siRNA 및 상기 플라스미드로 형질감염시키거나(A. 오른쪽 패널), 또는 세포회수 이전에 24시간 동안 시스타민을 처리하거나 처리하지 않고, 상기 플라스미드로 형질감염시켰다(B. 왼쪽 패널). VHL의 과발현을 항-VHL 항체를 이용한 면역 블롯 분석법으로 확인하였다.
도 20 및 21은 이소성 VHL의 국소화는 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 암세포에서 TGase2 유전자의 발현억제에 의해 조절됨을 나타내는 현미경사진이다. 세포를 24시간 동안 가역적 감염을 이용한 TGase2-특이적 siRNA 및 상기 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 회수한 다음, 이를 2개의 챔버 슬라이드에 16시간동안 재접종 하였다. 세포를 항-HA 일차항체 및 형광이 결합된 항-마우스 면역글로불린 이차 항체를 이용하여 면역화학적으로 분석함으로써, VHL를 검출하였다. 염색패턴은 VHL의 핵-세포질 분포를 나타낸다. 세포는 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 대비염색하여 핵을 가시화하였다. 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 22는 TGase2가 in vitro 조건에서 용량 의존적으로 VHL의 중합을 유도함을 나타내는 전기영동사진이다. 정제된 재조합 VHL을 기니아 피그 간 TGase2를 이용하여 in vitro 조건에서 중합하였다. VHL 중합체를 SDS-PAGE로 분리하고, 쿠마시 블루 염색으로 가시화하거나(왼쪽 패널), 또는 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯방법으로 분석하였다(오른쪽 패널).
도 23은 VHL의 단량체, 이량체 및 중합체의 순차적인 단백질분해에 의해 얻어진 펩타이드의 질량분석결과를 나타내는 도표이다. 정제된 재조합 VHL을 TGase2를 이용하여 in vitro 조건에서 중합하였다. 다중체성 VHL 복합체를 SDS-PAGE로 분리하고, 쿠마시 블루 염색으로 가시화하였다. 번호가 할당된 밴드를 수집하고, 환원시킨 다음, 트립신을 이용하여 분해하였다. 펩타이드의 질량은 MALDI-TOF MS를 사용하여 결정하였다.
도 24는 VHL에서 교차결합 부위를 규명하기 위해, 정제된 VHL 단량체 및 중합체를 MS를 이용하여 분석한 결과를 VHL 단량체 및 중합체의 아미노산 서열로서 나타낸 것으로서, 붉은색 문자는 MS에 의해 확인된 잔기를 나타내며, VHL 중합체에 표시된 파란색 문자는 중합 후 차단된 잔기를 나타낸다. 상기 분석결과는 164 및 203번 글루타민이 TGase2-유도 VHL 중합에 관여함을 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) VHL(Von Hippel-Lindau)을 발현하는 세포에 TGase2(Transglutaminse 2)의 활성을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리한 실험군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군에서 각각 TGase2의 발현을 유도하여, 상기 VHL과 TGase2를 반응시키는 단계; (b) 상기 반응에 의하여 생성되는 VHL-TGase2 중합체 또는 반응하지 않고 잔류하는 VHL의 수준을 실험군에서 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하고, 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 세포내에서 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
종양형성 과정에서 TGase2가 VHL을 조절하는 기작은 현재까지 밝혀지지 않았다. 본 발명자는 암세포에서 TGase2의 발현으로 VHL이 억제되며, 반대로 시스타민을 사용하거나 TGase2 변이체를 사용하여 TGase2를 억제시킬 경우 VHL의 수준이 회복된다는 것을 확인하였고(도 1 내지 도 5), TGase2가 VHL의 교차결합을 촉매하여 VHL 단량체(monomer)를 고갈시키고 VHL 중합체를 증가시키는 것을 확인하였으며(도 6 내지 도 8), TGase2에 의한 VHL의 하향조절이 IGF-1R 단백질 발현에 중요하다는 것을 확인하였다(도 9 내지 도 12). 또한 TGase2가 도입된 형질전환 마우스에서 TGase2가 VHL을 억제시킨 결과 생체 내에서 NF-κB의 활성과 IGF-1R의 발현이 유도됨을 확인하였고(도 13 내지 도 16), 인간 신장암 조직 시료에서 VHL와 TGase2 간의 반비례 관계를 재확인하였다(도 17).
이러한 이해를 바탕으로, TGase2의 활성을 조절하는 물질은 VHL 단백질 수준 또는 VHL단백질의 중합을 측정함으로써 검출할 수 있다. TGase2는 칼슘 의존성 효소라서 칼슘의 조그만 변화로도 활성도가 민감하게 변하므로, TGase2 단백질 수준을 측정하는 것보다 VHL 단백질 수준 또는 VHL 단백질의 중합을 측정하는 것이 신뢰도(Reliability)가 높으므로 보다 바람직하다. 이하, 본 발명의 각 단계를 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 첫 번째 단계는 VHL을 발현하는 세포에 TGase2의 활성을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리한 실험군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군에서 각각 TGase2의 발현을 유도하여, 상기 VHL과 TGase2를 반응시키는 단계이다.
본 발명의 용어, "VHL(von Hippel-Lindau)"는 종양 억제 단백질로 유비퀴틴-리가제 복합체의 일부이며, 폴리-유비퀴틴화 및 단백질 분해(proteosomal degradation)를 통해 HIF-1α를 하향조절하는 단백질을 의미한다. 상기 VHL은 p53의 전사활성을 통하여 세포사멸을 증대시키고, 세포 주기를 억제함으로써, 암억제자로서의 기능을 수행한다. 아울러, 신장암 세포에서 VHL은 c-FLIP, 서바이빈, c-IAP-1, c-IAP-2와 같은 NF-κB 타겟 항-세포사멸 유전자를 억제함으로써 NF-κB를 하향조절한다. 또한, 본 발명에서는 TGase2가 VHL을 하향조절한다는 것을 최초로 규명하였다.
본 발명의 용어, "TGase2(Transglutaminse 2)"는 트란스글루타미나제 2(E.C. 2.3.2.13, protein-glutamine γrglutamyltransferase)로서 라이신과 글루타민 사이에서 Nε-(γ-L-glutamyl)-L-lysine 아이소펩타이드 결합 형성을 촉진하는 Ca2+ 의존성 효소를 의미한다. Nε-(γ-L-glutamyl)-L-lysine 교차결합은 상피세포에서의 방어벽 기능, 세포 소멸, 세포외기질을 형성하며 세포 내 및 세포 외에 존재하는 단백질을 안정화시키는 것으로 알려져 있다. TGase2는 다양한 조직에서 정상적으로 낮은 수치로 발현되며 여러 가지 병리적인 상태에서 비정상적으로 활성화된다. 특히, TGase2 발현 수준은 염증질환에서 증가하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어 "후보 물질"은 TGase2의 발현을 감소시키거나 활성을 감소시키는 TGase2의 억제제 또는 TGase2의 발현을 증가시키거나 활성을 증가시키는 TGase2의 촉진제로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 상기 후보 물질로는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 단백질, 탄수화물, 핵산분자(RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 될 수 있다.　
본 발명에서 용어 "처리(treatment)"란 상기 후보 물질이 TGase2와 직접적으로 접촉하는 것 뿐만 아니라, 상기 후보 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 TGase2 와 접촉하거나 영향을 미치는 경우도 포함한다.　따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보 물질에는 세포막 투과성인 물질 뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함된다. 이 때, 후보 물질은 유효량의 범위내에서 처리하도록 한다.“유효량”이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위내에서 억제능 또는 촉진능을 조사하도록 한다.
본 발명의 용어, "대조군"이란 VHL 단백질 수준 또는 VHL 단백질의 중합이 TGase2의 억제제 또는 촉진제를 처리에 의해 인위적으로 조절되지 않은 세포를 의미한다.
상기 단리된 VHL 및 TGase2는 세포내 환경에서 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제와 직접적으로 작용하여 반응할 수 있는데, VHL을 발현하는 세포에 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제를 처리하고 일정 시간이 경과후에 TGase2의 발현을 유도하거나, VHL을 발현하는 세포에서 TGase2의 발현을 유도한 다음 상기 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제를 처리하거나, 또는 VHL을 발현하는 세포에 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제의 처리와 TGase2의 발현유도를 동시에 수행할 수 있다.
이때, TGase2 발현은, TGase2의 발현을 유도한다고 알려진 요소, 예들 들어, 자외선, 글루타메이트, 칼슘 아이노포어(Calcium inophore), 마이토톡신(maitotoxin), RA(Retinoic acid), 염증-유도 사이토카인, 글루타메이트 등의 처리, 산화적 환경, 바이러스 감염 등을 통하여 유도할 수 있고, TGase2를 재조합 벡터에 클로닝하여 일시적으로(transiently) 세포에 도입시킬 수 있으며, TGase2를 유도하는 물질이나 방법은 특별히 한정되지 않는다.
상기 VHL를 발현하는 세포는 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 래트, 기니피그 등의 동물기원의 모든 세포를 포함하며, 일차세포, 이차세포, 불멸화된 세포 등을 이용할 수 있다. 또한, TGase2가 유입된 재조합 벡터를 사용하여 세포 내에서 TGase2가 세포 내에서 안정적으로 또는 일시적으로 과발현되도록 조작된 세포를 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 인간 다약제 내성 유방암 세포주 NCI/ADR-RES, 유방암 세포주 MDA-MB-231, 인간 배아 신장 세포주 HEK293, 및 인간 유방암 선암 세포주 MCF-7를 사용하였다.
본 발명의 두 번째 단계는 상기 반응에 의하여 생성되는 VHL-TGase2 중합체 또는 반응하지 않고 잔류하는 VHL의 수준을 실험군에서 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하는 단계이다.
상기 VHL-TGase2 중합체 또는 VHL의 수준은 VHL에 특이적인 항체를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 항체를 이용하여 TGase2의 후보 억제제 또는 촉진제를 처리한 세포에서 VHL 단백질 수준 또는 VHL 단백질의 중합을 검출하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 등이 있으며, 세포질에서 상기 단백질을 분리하고 이를 SDS-PAGE하고 특이적인 항체를 이용하여 단백질 발현의 수준 및/또는 활성을 확인함으로써 측정하는 웨스턴 블랏이 바람직하다.
상기 검출방법에서 항원-항체 복합체의 형성량을 검출라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정가능하다.　
본 발명의 용어, "검출 라벨"은 분광분석적 (spectroscopic), 광화학적 (photochemical), 생화학적(biochemical), 면역화학적 (immunochemical), 화학적 (chemical), 다른 물리화학적 (physical) 수단에 의해 검출될 수 있는 조성물을 말한다. 이러한 검출 표지체에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세 번째 단계는 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하고, 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하는 단계이다.
상기 후보물질 처리에 의해 TGase2가 억제되거나 촉진되는 정도는 VHL 및/또는 VHL-TGase2 중합체의 수준을 대조군의 것과 비교함으로써, 유의하게 확인할 수 있다. TGase2 촉진제의 경우 대조구에 비하여 유의적으로 세포 내 VHL단량체 단백질 수준이 감소하면서 VHL 단백질 중합체의 수준이 증가하게 된다. 반면, TGase2 억제제의 경우 대조구에 비하여 유의적으로 세포 내 VHL 단량체 단백질의 수준이 증가하면서 VHL단백질 중합체의 수준이 감소하게 된다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 스크리닝방법은 상기 실험군에서 IGF-1R, HIF-1α 및 VEGF 중 어느 하나 이상의 단백질 수준을 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하여, 상기 실험군의 IGF-1R, HIF-1α 및 VEGF 중 어느 하나 이상의 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가할 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하고, 상기 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소할 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "IGF-1(insulin-like growth factor-1)"이란 인슐린-유사 성장인자-1을 의미하며 인슐린과 매우 유사한 구조를 갖는 소마토메딘이라 불리는 호르몬 그룹에 속한다. 작용 방식에 있어 성장 호르몬과 많은 유사점을 가지고 있으며, 성장 호르몬과 마찬가지로 단백질 동화작용을 증진한다. 본 발명에서는 TGase2에 의하여 VHL이 하향조절됨으로써 IGF-1R의 발현이 증가될 수 있음을 확인하였다(도 9 내지 도 16).
본 발명의 용어, "HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1α)"는 저산소상태에서 다량 유도 발현되는 핵 전사인자로서, 세포 내에서의 산소 항상성을 유지하기 위해서, 적혈구 생산, 신혈관생성 그리고 당 대사에 관련되 유전자를 발현 시키는 기능을 한다. VHL이 HIF-1α를 억제한다는 거이 알려져 있으므로, 본 발명에서 TGase2에 의하여 VHL이 하향 조절됨으로써 결과적으로 HIF-1α의 안정성이 증가될 것임을 알 수 있다.
본 발명의 용어, "VEGF(vascular endothelial growth factor)"는 혈관내피성장인자로, 암세포들에 의해 이루어지는 혈관신생(angiogenesis)에 주요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 발명에서는 TGase2-특이적 siRNA를 녹다운시킨 암세포에서 VEGF 발현이 감소함을 RT-PCR을 통해 확인하였다(도 1). 또한 IGF-1R이 VEGF를 상향 조절한다는 것이 알려져 있으므로, 본 발명에서 TGase2에 의하여 VHL이 하향조절됨으로써 IGF-1R의 발현증가와 더불어 VEGF 발현이 증가됨을 알 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 세포내의 환경이 아닌 in vito 환경에서 세포내에서 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 in vito 환경에서 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법은 (a) 단리된 VHL에 TGase2(Transglutaminse 2)의 활성을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리한 실험군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 각각 단리된 TGase2를 처리하여, 상기 VHL과 TGase2를 반응시키는 단계; (b) 상기 반응에 의하여 생성되는 VHL-TGase2 중합체 또는 반응하지 않고 잔류하는 VHL의 수준을 실험군에서 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하고, 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어, "단리된(isolated)"이란 세포에서 발현되어 분리된 단백질을 의미하고, 당업계에서 공지된 일반적인 분리기술을 적용하여 분리가능하다. 세포에서 발현된 단백질을 분리 정제하는 방법은 특별히 제한되지 않는다.
상기 단리된 VHL 및 TGase2는 세포내 환경이 아닌, in vito 환경에서 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제와 직접적으로 작용하여 반응할 수 있는데, 단리된 VHL에 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제를 처리하고 일정 시간이 경과후에 단리된 TGase2를 처리하거나, 단리된 VHL에 단리된 TGase2을 처리한 다음 상기 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제를 처리하거나, 또는 단리된 VHL에 TGase2 후보 억제제 또는 촉진제와 단리된 TGase2를 동시에 처리할 수 있다.
VHL 및/또는 VHL-TGase2 중합체의 수준을 대조군와 비교하는 방법 및 상기 VHL 및/또는 VHL-TGase2 중합체의 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.
상기 방법으로 획득한 억제제를 투여하여, 세포 내에서 TGase 2 에 의한 신호전달을 억제함으로써, TGase 2 활성 증가와 관련된 질환, 예들 들어 염증 질환 및 암 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다. 염증질환에는 자가면역 질환, 퇴행성신경 질환 등이 있다. 자가면역질환은 심각한 염증을 유발하는 T 세포와 대식세포의 비정상적인 활성과 밀접하게 연관되어 있다. 자가면역 염증성 근질환과 만성소화장애에서 TGase 2의 발현이 비정상적으로 증가하는 것이 보고되었다(Choi et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 88703-88710; Choi et al (2004) Eur. Neurol. 51, 10-14; Bruce et al., (1985) Clin. Sci. 68, 573-579).
또한, TGase 2는 대식세포 활성의 결과 자가면역 질환에서 증가하는 것으로 밝혀졌고 TGase 2의 발현 증가는 자가항체형성과 아주 밀접하게 연관되어 있는 것처럼 보인다(Novogrodsky et al., (1978) Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 1157-1161; Murtaugh et al., P. J. (1983) J. Biol. Chem. 258, 11074-11081; Leu et al., (1982) Exp. Cell Res. 141, 191-199). TGase 2의 과발현 또는 과활성과 연관되는 자가면역 질환은 만성소화장애(celiac disease)(Dieterich et al., (1997) Nat. Med. 3, 797-801), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis)(Dieterich, et al.. (1999) J. Investig. Dermatol.113, 133-136), 제 1 당뇨병(type 1 diabetes)(Lampasona et al., (1999) Diabetologia 42, 1195-1198), 낭창(Lupus)(Sanchez, et al., (2000) J. Autoimmun. 15, 441-449), 류마티스 관절염((Rheumatoid Arthritis)(Picarelli et al., (2003) Clin. Chem. 49, 2091-2094) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
뇌 염증에서, NO와 TNF-α와 같은 독성인자를 생산하는 신경교세포가 활성화되는 것으로 알려져 있다(Minagar et al., (2002) J. Neurol. Sci. 202, 13-23; Catania et al., (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci. 856, 62-68). 이 요소들의 합성과 분비는 숙주가 병원균의 침윤에 의해 파괴될 수 있는 선천면역을 형성하지만, 과도한 NO의 생성과 축적은 신경퇴행의 원인이 된다(Liu et al., (2002) Ann. N. Y. Acad. Sci. 962, 318-331). 특히, 활성화된 별아교세포에서 유도된 TGase 2는 퇴행성신경 질환의 발생기전에 관여하는 것으로 알려져 있다(Campisi et al., (2003) Brain Res. 978, 24-30; Monsonego et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 3724-3732). TGase 2의 과발현 또는 과활성과 연관되는 퇴행성신경 질환에는, 파킨슨병(Parkinson's disease)(Jung, Y. et al. Hypoxia-inducible factor induction by tumour necrosis factor in normoxic cells requires receptor-interacting protein-dependent nuclear factor kappa B activation. Biochem J 370, 1011-7 (2003)), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 신경성 후천성면역 결핍증(neuro-AIDS)등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
NF-κB에 의해 유도되는 대표적인 목적 유전자는 COX-2이다. COX-2 는 염증 치료 뿐 아니라, 암 예방 및 치료 측면에서도 중요하게 여겨지는 유전자이다.　암세포 및 악성 종양 조직에서는 COX-2의 유도가 증대되어 정상 세포에 비해 훨씬 많은 양의 프로스타글란딘이 생성된다 (Kargman et al., (1995) Cancer Research, 55:2556-2559; Ristimaki et al., (1997) Cancer Research, 57:1276-1280).　프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2: PGE2)와 같은 프로스타글란딘류는 혈관 생성을 촉진하고 세포의 증식을 촉진하므로 이들의 과잉 생성은 암세포의 성장에 좋은 환경을 제공한다.　더욱이 COX-2의 과도한 발현은 아포토시스(apoptosis)을 억제하고 암세포의 전이 능력을 증대시키는 것으로 알려졌다. 또한, 여러 암에서 COX-2의 발현 증가가 확인됨과 동시에, COX 저해제가 암의 발생을 감소시키는 것으로 확인되었다 (Noguchi et al., (1995) Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, (1997) 53:325-329 ; Thompson et al., (1997) Cancer Research, 57:267-271).　따라서, COX-2 선택적 저해제는 항염증제 뿐만 아니라 항암제로 사용 가능하다.
따라서, TGase 2억제제는 TGase2의 비정상적인 발현에 의해서 유발되는 질환의 치료제, 예컨데 항암제로 작용함을 알 수 있다. 본 발명의 발명으로 검출한 TGase 2억제제를 사용하여 예방 또는 치료할 수 암은, 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 담낭암 등을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 또한, TGase2 억제제는 염증 질환 또는 퇴행성 신경 질환의 치료제로 작용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법으로 획득한 TGase2 촉진제는, 세포 내에서 TGase 2에 의한 신호전달을 촉진함으로써, TGase 2활성 감소와 관련된 질환, 예들 들어 바이러스 감염 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다. TGase 2 는 RA(retinoic acid)에 의해서 그 발현이 촉진되는 것으로 알려져 있다 (Moore et al. (1984) J Biol Chem 259, 12794-12802). 또한, RA는 바이러스성 감염을 억제하거나, 면역을 촉진시켜 질병을 치료하는 데에 도움을 주는 것으로 알려져 있다 (Lotan R. (1996) FASEB J. 10, 1031-109). 즉, TGase 2에 의한 NF-κB의 활성화는 바이러스 등의 감염에 대한 방어기전으로 중요하게 작용하는 것을 알 수 있다. 면역 활성은 이미 잘 알려진 대로 NF-κB의 활성에 의존하고, TGase 2의 과발현에 의한 NF-κB는 활성화 된다. 따라서, 상기 방법으로 검출한 촉진제를 투여하여, 세포 내에서 TGase 2에 의한 신호전달을 촉진함으로써, 바이러스 등의 감염 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
실시예 1: 항체 및 시약
항-VHL 항체는 BD Pharmingen(미국, CA, 산디에고)에서, 항-TGase2 항체는 NeoMarkers(미국, CA, 프레몬트, 클론 CUB 7402)에서, 항-β-액틴은 Abcam(영국, 캠브리지, 헤드쿼터)에서, 항-IGF1R-β 및 항-HA-프로브(F7) 항체는 Santa cruz Biotechnology(미국, CA, 산타크루즈)에서, 항-PARP 및 항-절단 카스파아제-3(Asp175) 항체는 Cell Signaling Technologies(미국, MA, Beverly)에서 각각 구입하였다. 리포펙타민 2000, 리포펙타민 RNAiMAX 트랜스펙션 시약 및 Stealth Negative 대조군을 포함한 리포펙타민 RNAiMAX를 Invitrogen에서 구입하였고, 칼펩틴(칼바이오켐), 류펩틴(미국, MO, 성 루이스, Sigma-Aldrich Co), MG132(칼바이오켐) 및 FITC-혼성 항-마우스 면역글로불린(미국, 펜실베니아, 웨스트 그로브, 잭슨 면역 연구실)을 상업적으로 구입하였다.
실시예 2: siRNA(small interfering RNA) 처리에 의한 TGase2의 억제(silencing)
인간 TGase2를 타겟팅하는 siRNA 이중가닥(5'-AAGAGCGAGAUGAUCUGGAACTT-3':서열번호 1)을 리포펙타민 RNAiMAX(인비트로젠)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포에 도입하였다. 세포를 감염 후 48시간 째 회수하고, 세포질 분획 또는 전체 세포 추출물을 면역블롯 분석을 위해 준비하였다. 음성 대조군으로, 세포를 리포펙타민 RNAiMAX 단독 및 일반적(universal)인 음성 siRNA(인비트로젠)와 함께 배양하였다.
실시예 3: 면역블롯팅(Immunoblotting)
표준적으로 정립된 방법(Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Cancer Res 66, 10936-43 (2006))에 따라 면역블롯 분석을 수행하였다.
실시예 4: 전기영동상 변화 분석법(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)
NF-kB DNA 결합 사이트를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오디드 프로브(5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3':서열번호 2)를 Santa Cruz 생명공학사로부터 구입하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 EMSA 분석을 수행하였다.
실시예 5: 세포사멸 분석
Annexin V결합에 의한 세포사멸 분석을 Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트(미국, CA, Mountain View, BD Biosciences)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
실시예 6: TGase2+ 형질전환 마우스의 제조
인간 CMV 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터-인트론 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열을 포함하는 pCAGGS의 고유의 EcoRI-BglII 부위에 마우스 트랜스글루타미나아제 2 유전자를 삽입하였다. 5.8 kb의 DNA 단편 산물을 절단하고, 전핵(pronuclei) DNA 주입을 위한 기본적인 방법을 따라 준비하였다. 1 ㎝ 테일 클립(tail clip)으로부터 추출한 게놈 DNA의 PCR 분석을 통해 TGase2 이식 유전자(transgene)를 선별하였다. PCR은 하기의 프라이머를 이용하여 수행하였다.
5'-CAC CCT TCG TGT TTG CCG AGG TCA-3'(서열번호 3)
5'-TCT CCG AGG TGT CGT TGC CGA TGT-3'(서열번호 4)
트란스글루타미나아제 2 이식유전자 및 야생형 대립유전자를 각각 334 염기쌍(basepair, pb) 및 3,056bp로 얻었다. 이러한 방식으로, 본 발명자는 TGase2 이식유전자의 유전자 카피를 가지는 네 가지 파운더 마우스를 확인하였다.
실시예 7: 인간 RCC 시료에서 TGase2 및 VHL의 면역화학염색
일산 백병원(대한민국, 고양)에서 외과적 수술에 의해 얻은 11개의 신장 암 시료를 병리학과 기록으로부터 선별하였다. 기록된 조직의 이용은 윤리협회 및 임상시험심사위원회의 승인받았다(IRB number: 1B-2-1003-010). 면역화학염색을 Ultravision LP 검출 키트 및 DAB를 이용하여 수행하였다(미국, CA, Lab Vision Corporation Fremont). 파라핀화된 인간 RCC 조직을 염색하였다. 조직 섹션을 자일렌에 디파라핀화하였고, 항원회복을 1mM EDTA가 포함된 pH 9.0의 10mM 트리스 버퍼에서 샘플을 121℃에서 15분간 열처리하였다. 섹션을 95% 에탄올에서 고정하였고, 0.3% 과산화수소를 처리하고 울트라 V를 15분간 조사하여 고정하였다. 섹션을 20% FBS 가 포함된 0.05% TBS-T에서 항-TGase2 및 항-VHL 일차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 반응하였다. TBS-T를 세척 후, 섹션을 일차항체 증폭자로 순차적으로 반응 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase;HRP) 고분자로 각각 30분 반응하였다. TBS-T 세척 후, 슬라이드를 DAB 및 Mayer's 헤마톡실린를 이용하여 대조염색하였다(덴마크, DakoCytomation).
실시예 8: 면역화학
HA-VHL은 면역화학 및 위상차 현미경에 의해 가시화하였다. 세포를 TGase2 특이적 siRNA의 존재하에, 또는 대조군으로서 형질감염 하루 전날 일반적인(universal) 음성 siRNA 존재하에 2-웰 슬라이드 챔버에 접종하였다. 세포를 대조군 빈 벡터(mock) 또는 HA-VHL 발현 벡터로 24시간 동안 형질감염 시킨 후 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척하였다. 면역화학을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예 9: 인간 VHL의 발현 및 정제
인간 VHL cDNA를 BamHⅠ/XhoⅠ제한효소를 이용하여 변형된 pET32(Novagen)내로 서브클로닝하고, VHL의 아미노 말단에 23-잔기 폴리히스티딘 태그(MHHHHHHGSLVPRSENLYFQGS, 6xHis)를, 카복시말단에 10-잔기 폴리히스티딘 태그(LEHHHHHHHH, 8xHis)를 첨가하였다. 재조합 VHL을 대장균 균주 Rosetta 2 (DE3)(Novagen)에서 과발현 후 확립된 프로토콜에 의해 정제하였다.
실시예 10: 기니아 피그 간 TGase2에 의한 VHL의 중합
기니아 피그 간 TGase2(5㎕, U/㎖)를 정제된 인간 VHL(5 ㎍)이 포함된 반응 버퍼(50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 15 mM CaCl2) 30㎕에 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화하거나 면역블롯으로 분석하였다.
실험결과
실험예 1: VHL 및 TGase2의 반비례 관계
본 발명자는 이전의 연구에서, TGase2 발현의 증가가 암세포의 약물 내성 획득에 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. 특히 HIF-1α는 정상 산소조건에서 약물 내성 암 세포에서 증가하였다(도 1). TGase2 유전자의 녹다운은 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에서 용량 의존적으로 내생적 HIF-1α 단백질의 발현 수준을 감소시켰다(도 1). NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서 VHL의 발현수준은 HEK-293 및 MCF7 세포에서보다 낮았고(도 2), 암세포주에서 내생적 VHL 수준은 TGase2와 반비례 관계에 있었다(도 2). 내생적 VHL은 HEK293 및 MCF7 유방암세포에서 이소성(ectopic) TGase2 발현에 의해 억제되었으며, 이러한 감소는 시스타민을 이용한 TGase2의 억제에 의해, 또는 촉매적으로 불활성화된 TGase2 변이체(C277S)의 발현을 이용한 TGAse2의 억제에 의해 역전되었다(도 3). 이소성 VHL의 수준은 TGase2의 동시발현에 의하여 감소하였으며, 이러한 효과는 시스타민 또는 촉매적으로 불활성화된 TGase2 C277S의 발현을 이용한 TGase2의 억제에 의해 사라졌다(도 4). 이러한 결과는 TGase2의 교차 연결 촉매 활성이 VHL 감소의 주요한 원인이 됨을 나타낸다.
실험예 2: 암세포에서 TGase 억제에 의한 VHL의 안정성 증가
TGase2 억제제가 VHL 안정성 조절에 의해 VHL의 수준을 증가시키는지 알아보기 위해, 본 발명에서는 VHL 단백질 수준에서 내생적 TGase2 활성의 억제 효과를 확인하였다. TGase2가 높은 수준으로 발현된 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에 TGase2-특이적인 siRNA 또는 시스타민과 함께 HA-VHL 발현 벡터를 일과적으로(transiently) 형질 감염시켰다. 이소성 HA-VHL 의 수준은 TGase2 특이적 siRNA 또는 시스타민으로 처리되지 않고 HA-VHL 만 발현된 대조군 세포와 비교하여, 시스타민 또는 유전자 녹다운에 의한 TGase2 억제에 반응하여 증가하였다(도 19), 이는 도 6의 결과와 일치한다. 항-HA 단클론 항체를 이용하여 HA-VHL-형질감염 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포의 면역세포화학 염색을 수행한 결과, VHL이 핵에 편재되어 있는 것으로 나타났다. 이와 비교하여, TGase2-특이적 siRNA 로 동시-형질감염된 세포는 HA-VHL의 세포질 및 핵 부위에 나타났다(도 20 및 21). 따라서, TGase2는 TGase2가 가장 많은 세포질 내에서 VHL를 표적으로 하는 것으로 븐석되었다.
실험예 3: VHL 중합체의 프로테아좀 의존적 분해(proteasome-dependent degradation)
TGase2-촉매화된 교차 연결을 통해 생성된 VHL 중합체가 대사적으로 분해되는 지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 VHL 분해를 억제하는 능력을 위한 세 가지 서로 다른 단백질 가수분해 억제제(프로테아좀 억제제, 리소좀 억제제, 칼페인 억제제)를 실험하였다. TGase2에 의한 VHL단량체의 감소는 프로테아좀 억제제 MG132 처리에 의해 억제되었으나, 칼페인(calpain) 또는 리소좀(lysosomal) 억제제에 의해서는 억제되지 않았다(도 6). TGase2 와 VHL이 직접적으로 상호작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 MG132와 함께 또는 MG132없이, HA-VHL 및 TGase2 의 발현 벡터와 공동 형질감염시켰으며, 면역블롯 분석을 위한 항-HA 항체를 이용하여 면역침전시켰다(도 7). TGase2를 VHL 침전물 내에서 검출하였고, 침전된 VHL의 양은 MG132 처리에 의해 증가하였다(도 7). 이러한 결과는 VHL이 TGase2와 상호작용하며 형성된 VHL-TGase2 중합체가 프로테아좀-의존적 기전을 통해 분해된다는 것을 의미하는 것으로 분석되었다(도 6).
상기 VHL-TGase2 중합체는 쉽게 검출되었으며, MG132 를 처리한 세포에서 중합체의 발현 수준이 증가하였다. 또한, 상기 중합체에 포함된 TGase2 역시 항-HA 침전내에서 검출되었으며, 이는 TGase2가 VHL과의 중합을 촉매하는 기능과 더불어 중합의 기질로서 작용함을 나타낸다(도 8). VHL이 TGase2의 기질임을 확인하기 위하여, 정제된 재조합 인간 VHL을 정제된 기니아 피그 간 TGase와 함께 체외에서(in vitro) 반응시켰다. TGase2는 용량 의존적으로 VHL의 중합을 유도하였다(도 22). 고 분자량 겔 분획(도 22의 화살표 머리)회수 및 MS/MS에 의한 분석으로 VHL이 중합된 단백질 복합체의 주요 구성요소임을 확인하였다(도 23). VHL의 교차연결 부위를 규명하기 위해, 분석된 겔을 MS에 의해 VHL 단량체 및 중합체로 정제하였다. 도 24은 VHL 단량체 및 중합체의 아미노산 서열을 나타내며, 붉은색 문자는 MS에 의해 확인된 잔기를 나타내고, 파란색 문자는(VHL 중합체 내) 중합 후 차단되는 잔기를 나타낸다. 이러한 결과는 164 및 203번 글루타민이 TGase2-유도 VHL 중합화와 관련있다는 것을 나타낸다(도 24).
실험예 4: TGase 억제에 의한 VHL 발현 회복이 NF-κB 활성 억제를 유도함
NF-κB의 활성은 VHL에 의해 하향조절되는 것으로 보고되었다. NF-κB 활성은 VHL이 발현된 세포내에서 Tgase2 억제에 의해 감소하였다. 도 9 내지 도 12에서 보는 바와 같이, TGase2-특이적 siRNA 또는 Tgase2 억제자 시스타민을 처리한 HA-VHL 발현 세포에서 NF-κB 활성은 HA-VHL 만 발현된 비처치 세포에서보다 낮았다(각각, 2배 및 2.5배)(도 9). SEAP 리포터 분석과 동시에, 본 발명자들은 NF-κB DNA 결합 활성을 평가하기 위하여 전기 동력 이동 측정(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)을 수행하였다. 이소성 VHL 단독 발현 또는 TGase2 억제와 함께 발현된 NF-κB DNA 결합 활성을 감소시켰다(도 10). 세포사멸은 siRNA 단독으로 처리한 세포와 비교하여 TGase2-특이적 siRNA와 함께 처리된 HA-VHL 발현 세포에서 보다 효율적으로 유도되었으며, annexin-Ⅴ 양성 염색 및 절단된 PARP의 상대적 수준으로 측정하였다(도 9).
기존 보고에서 VHL은 IGF-1R의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 시스타민 또는 유전자 녹다운에 의한 TGase2 억제는 이소성 VHL의 안정성을 가져오고, 이는 약물 내성 암 세포주에서 감소된 IGF-1R 수준과 관련되어 있다(도 12).이러한 결과는 TGase2에 의한 VHL의 하향 조절이 IGF-1R단백질 발현의 필수적임을 나타낸다.
실험예 5: TGase2+ 형질전환 마우스에서 VHL의 하향조절
생체 내에서 VHL 및 TGase2 와의 관계를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 TGase2+ 이식 유전자가 도입된 TGase2+ 형질전환 마우스를 제조하였다(도 13 및 14). TGase2+ 형질전환 마우스의 신장은 어떠한 조직학적 이상도 보이지 않았으며, 외형도 정상이었다. 면역블롯을 통하여 서로 다른 세가지 야생형 및 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장에서 VHL 단백질 수준을 분석한 결과 야생형 마우스보다 TGase2+ 형질전환 마우스에서 VHL 발현 수준이 더 낮은 것으로 나타났다(도 15). TGase2+ 과발현에 의한 VHL감소가 IGF-1R 단백질 수준에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항-IGF-1R 항체를 이용한 면역블롯을 통하여 야생형 및 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장 샘플을 분석하였다. IGF-1R 단백질 수준은 예상대로 야생형 마우스보다 TGase2+ 형질전환 마우스에서 더 높게 발현되었다(도 15). EMSA에 의한 NF-κB DNA 결합 활성의 분석결과, NF-κB 활성이 야생형 마우스와 비교하여 TGase2+ 형질전환 마우스에서 거의 3배 증가하였다(도 16). 그러므로, VHL 수준은 야생형 마우스와 비교하여 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장에서 감소하였으며, 이것은 IGF-1R의 높은 발현수준과 관련이 있다. 이러한 결과는 TGase2+는 VHL을 억제하며, 이로써 생체내에서 NF-κB 활성 및 IGF-1R의 발현이 유도됨을 나타낸다.
실험예 6: 인간 신장 세포 암종 시료에서 TGase2+ 및 VHL 단백질 수준의 반비례 관계
암세포주와 형질전환 TGase2+ 마우스모델에서의 실험결과의 유효성을 확인하기 위해, 즉 TGase2+ 및 VHL 발현의 반비례 관계를 확인하기 위해, 본 발명자들은 면역화학분석으로 인간신장세포 암종(Renal clear cell carcinoma) 조직시료에서 VHL 및 TGase2의 발현 수준을 확인하였다(도 17). 정상 신장 조직에서는, TGase2가 사구체 세포에 존재하였고, 세뇨관 세포에 상대적으로 낮게 존재한 반면 VHL은 신세뇨관 세포에서 발현이 제한되었다. RCC 암종 조직에서, TGase2의 발현 수준은 일반적으로 증가하였고, VHL 의 발현은 감소하였다. 11개의 인간 RCC 암종 중 9개에서 TGase2 및 VHL 수준간에 반비례 관계를 나타내었다. 도 17의 A-D에서 보는 바와 같이, 6번 암에서 거의 완전한 역관계를 나타내었고, 3번 암에서는 TGase2 및 VHL의 양성 발현 영역에서 군데군데 나타났다. 일반적으로, TGase2의 발현이 높은 샘플의 경우, VHL의 발현은 낮거나 없었다(도 17의 A 및 B). TGase2의 발현이 낮은 샘플의 경우, VHL의 발현수준은 높았다(도 17의 C 및 D). 침습성 전반 세포(invasive front cell)에서, TGase2 발현은 암의 잔여 부분보다 높았으며(도 17의 E), VHL의 발현은 낮거나 없었다(도 17의 F). 이러한 결과는 TGase2 및 VHL 발현간에 역관계를 추가적으로 증명하는 것이다.

Claims (11)

  1. (a) VHL(Von Hippel-Lindau)을 발현하는 세포에 TGase2(Transglutaminse 2)의 활성을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리한 실험군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군에서 각각 TGase2의 발현을 유도하여, 상기 VHL과 TGase2를 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응에 의하여 생성되는 VHL-TGase2 중합체 또는 반응하지 않고 잔류하는 VHL의 수준을 실험군에서 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하고, 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 세포내에서 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TGase2의 발현유도는 LPS(lipopolysaccharide), 자외선, 글루타메이트(glutamate), 칼슘 아이노포어(Calcium inophore), 마이토톡신(maitotoxin), RA(Retinoic acid), 염증-유도 사이토카인, 글루타메이트, 산화적 환경 또는 바이러스 감염에 의하여 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 VHL 수준 또는 VHL-TGase2 중합체 수준의 측정은 VHL에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 VHL 수준 또는 VHL-TGase2 중합체 수준의 측정은 VHL에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 실험군에서 IGF-1R, HIF-1α 및 VEGF 중 어느 하나 이상의 단백질 수준을 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하여, 상기 실험군의 IGF-1R, HIF-1α 및 VEGF 중 어느 하나 이상의 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가할 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하고, 상기 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소할 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 IGF-1R, HIF-1α 또는 VEGF의 단백질 수준 측정은 각 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 TGase2 억제제로 판정된 후보물질은 항암제로서 사용되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 TGase2 촉진제로 판정된 후보물질은 바이러스 감염 질환 치료제로서 사용되는 것인 방법.
  9. (a) 단리된 VHL에 TGase2(Transglutaminse 2)의 활성을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리한 실험군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 각각 단리된 TGase2를 처리하여, 상기 VHL과 TGase2를 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응에 의하여 생성되는 VHL-TGase2 중합체 또는 반응하지 않고 잔류하는 VHL의 수준을 실험군에서 측정하고, 이를 대조군의 것과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 억제제인 것으로 판정하고, 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소하거나 또는 VHL-TGase2 중합체 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하는 경우에는 상기 후보물질이 TGase2 촉진제인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, in vito 환경에서 TGase2 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 VHL 수준 또는 VHL-TGase2 중합체 수준의 측정은 VHL에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 VHL 수준 또는 VHL-TGase2 중합체 수준의 측정은 VHL에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 수행되는 것인 방법.
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