WO2012004543A1 - Dispositif de detection de molecules d'interet, son procede de fabrication et son utilisation - Google Patents

Dispositif de detection de molecules d'interet, son procede de fabrication et son utilisation Download PDF

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WO2012004543A1
WO2012004543A1 PCT/FR2011/051627 FR2011051627W WO2012004543A1 WO 2012004543 A1 WO2012004543 A1 WO 2012004543A1 FR 2011051627 W FR2011051627 W FR 2011051627W WO 2012004543 A1 WO2012004543 A1 WO 2012004543A1
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WO
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support
carbon nanotube
detection device
transducer
grafting
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Ceased
Application number
PCT/FR2011/051627
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English (en)
Inventor
Benoît PIRO
Vincent Noel
Minh-Chau Pham
Steeve Reisberg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Paris Diderot Paris 7
Original Assignee
Universite Paris Diderot Paris 7
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a device for detecting molecules of interest, its manufacturing process and its use.
  • biochips have been used for their ability to generate a large amount of data while using small amounts of capture molecules and biological samples.
  • Peptide biochips have been made and developed on substrates (glass slides or silicon) for the detection of antibodies against pathogens such as hepatitis C or B.
  • substrates glass slides or silicon
  • pathogens such as hepatitis C or B.
  • the immobilization of peptide probes must lead to a high density of peptides stably bound to the supports without modifying their bioreactivity.
  • Microarrays consist of a microarray of DNA probes or peptides, that is to say a two-dimensional arrangement of biomolecules probes deposited in a controlled manner on a surface such as glass or any other material (plastic, nitrocellulose , metal, ...) so that these probes are accessible to the targets present in solution.
  • the grip of the probes is usually done by creating, on the surface of the sensor, small localized spots (of a few hundred square micrometers) carrying chemical functions capable of grafting the probes. The regular arrangement of the spots then allows the reading (most often optical) of the result.
  • contact and contactless printing contact printing and non-contact printing are commonly placed in two categories: contact and contactless printing contact printing and non-contact printing Contact printing is the most widely used technology because it allows excellent reproducibility, however, the more recent non-contact printing technologies are more promising (photochemical etching, laser, inkjet, electrospray, ).
  • ODN oligodeoxynucleotide spots
  • Electrochemical procedures seem very promising.
  • techniques such as Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) have been shown to allow local electrodeposition of DNA, for example by electropolymerization in the form of oligonucleotide-modified pyrrole motif spots (Livache et al., Nucleic). Acids Res., 1994, 22, 2915, Szunerits and Langmuir, 2004, 20, 9236, E. Fortin et al., Electwnalysis, 2005, 17, 495).
  • SECM Scanning Electrochemical Microscopy
  • conductive polymers such as polypyrrole or polythiophene are suitable substrates for immobilizing strands of ODN probe (Cha, et al., Biosens Bioelectron., 2003, 18, 1241, Garnier et al., Synth Met, 1999, 100, 89).
  • Another method is to locally deprotect by electrochemistry a chemical function which will subsequently react with a probe present in the medium.
  • TALANTA 2010, 80, 1318 an electrochemical biosensor which is in the form of a thin film based on 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone on which is grafted tripeptide glutathione carrying a primary amine function.
  • Glu-NHQ has three functional groups of which only the hydroxy group of hydroxynaphthoquinone is used for electropolymerization; the amino group of glutathione is only used to fix biomolecules by post-functionalization.
  • WO 2008/132304 describes a method for producing an ion detector in a liquid phase, said detector being formed of an electroconductive support covered with a polyjuglone layer.
  • This polyjuglone layer can be prepared from 3-mercaptoaniline-5-hydroxy-1,4-naptahlenedione, which binds to the support via a carbon-carbon bond following removal of the aromatic amine function by the through the formation of a diazonium salt.
  • Existing detection devices include:
  • At least one transducer comprising a primary amine function linked to a quinone, or to a quinone derivative, via a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain,
  • At least one receptor having a primary amine function at least one receptor having a primary amine function
  • said at least one transducer and said at least one receptor are respectively covalently bound to the carbon support or nanotube, by at least one of their primary amine functions and said carbon nanotube is covalently bound to the support.
  • the inventors have discovered that by using the electrochemical properties of the primary aliphatic amine functions it is possible to directly form ultra-thin organic layers capable of translating a biological recognition event in a more sensitive and reliable manner than the whole of the existing systems. .
  • the present invention therefore relates to a detection device comprising: at least one transducer, comprising an aliphatic primary amine functional group linked to a quinone, or to a quinone derivative, by a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain,
  • At least one receptor having an aliphatic primary amine function at least one receptor having an aliphatic primary amine function
  • said at least one transducer and said at least one receptor are respectively covalently bound to the carbon support or nanotube, by electrooxidation of at least one of their aliphatic primary amine functions, and
  • said carbon nanotube is covalently bonded to the support.
  • aliphatic amine means any amine having an acyclic or cyclic carbon chain, saturated or unsaturated, with the exception of aromatic amines.
  • the monolayer thus produced by electrografting of the transducer on the conductive support constitutes a transducer assembly of a (bio) molecular recognition event.
  • the detection device comprises:
  • At least one transducer comprising a primary amine function, preferably an aliphatic primary amine, linked to a quinone, or to a quinone derivative, via a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain,
  • At least one receptor having an aliphatic primary amine function at least one receptor having an aliphatic primary amine function
  • said at least one transducer and said at least one receptor are respectively covalently bonded to the carbon nanotube, by at least one of their primary amine functions, preferably by electrooxidation of at least one of their primary aliphatic amine functions, and
  • said carbon nanotube is covalently bonded to the support.
  • said at least one receptor and said at least one transducer are each covalently bonded to the carbon nanotube by electrooxidation of their respective primary aliphatic amines.
  • the detection device according to the invention comprises:
  • At least one transducer comprising an aliphatic primary amine functional group linked to a quinone or a quinone derivative by a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain,
  • At least one receptor having an aliphatic primary amine function at least one receptor having an aliphatic primary amine function
  • said at least one receptor is covalently bonded to the carbon nanotube by at least one of the aliphatic primary amine functions
  • said at least one transducer is covalently bound to the support, by at least one of the aliphatic primary amine functions, and
  • said carbon nanotube is covalently bonded to the support.
  • said at least one receptor is covalently bonded to the carbon nanotube by electrooxidation of at least one of its primary aliphatic amine functions
  • said at least one transducer is bound in a covalent to the support by electrooxidation of at least one of its aliphatic primary amine functions.
  • the detection device comprises:
  • At least one transducer comprising an aliphatic bonded primary amine function, with a quinone, or a quinone derivative, with a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain,
  • At least one receptor having an aliphatic primary amine function at least one receptor having an aliphatic primary amine function
  • said at least one transducer is covalently bonded to the carbon nanotube, by
  • said at least one receptor is covalently bound to the support by electrooxidation of at least one of the aliphatic primary amine functions
  • the detection device comprises:
  • At least one transducer comprising an aliphatic primary amine functional group linked to a quinone or a quinone derivative by a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain,
  • At least one receptor having an aliphatic primary amine function at least one receptor having an aliphatic primary amine function
  • said at least one transducer and said at least one receptor are respectively covalently bound to the support by electrooxidation of at least one of their aliphatic primary amine functions
  • the transducer may be a compound corresponding to the following formula I:
  • n 0 or 1
  • n 0 or 1
  • R1, R2, R3, R4, R5, and R8, independently of one another, are chosen from: H, O, S, NH 2 , NO 2 , NH, OH, COOH, SH, and a group of 1 to 10 atoms of carbons, linear, branched, cyclic or aromatic,
  • R6 and R7 independently of one another are selected from:
  • X being selected from CH 2 , O, NH, S, and
  • the transducer corresponds to the following formula II:
  • R 1, R 2, R 3 and R 4 independently of one another, are chosen from: H, O, S, NH 2 , NO 2 , NH, OH, COOH, SH and a group of 1 to 10 carbon atoms, linear , branched, cyclic or aromatic,
  • R9 and RIO independently of one another are selected from:
  • p representing an integer ranging from 0 to 12 and X being selected from CH 2 , O, NH, S,
  • connections independently of each other, represent single or double covalent bonds depending on the nature of the groups R1, R2, R3, R4, R9 and R10.
  • R 6 and R 7 represents a group
  • quinone derivative means a derivative of at least one of the quinones chosen especially from the group comprising the following quinones: 1,4-benzoquinone, 1,4-naphthoquinone and anthraquinone, especially those selected from the group consisting of benzoquinonetetracarboxylic acid, tetrahydroxy-1,4-benzoquinone bicarbonate, tetrahydroxy-1,4-benzoquinone bisoxalate, coenzyme Q10, 1,4-benzoquinonetetracarboxylic dianhydride, duroquinone, idarubicin , lajuglone, plastoquinone, 5-amino-1,4-naphthoquinone, tetrahydroxy-1,4-benzoquinone and vitamin K.
  • a carbon atom or a heteroatom of a carbon chain that is to say a carbon atom, or a nitrogen, sulfur or oxygen atom belonging to a carbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms.
  • linear, branched, aromatic or cyclic group of 1 to 10 carbon atoms is understood to mean a chain selected from the group comprising, in particular, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, naphthalene and the like. butyl, isobutyl, t-butyl, n-pentyl, n-hexyl, heptyl, octyl, nonyl, and decyl. These carbon chains may contain one or more double bonds and straight or branched alkenyl chains are then obtained.
  • They may also be cyclic and include in the chain a ring selected from cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl, or aromatic and include in the chain an aromatic group, such as an aryl group, in particular a phenyl group.
  • the compound of formula (II) corresponds to the following compounds of formulas (IIIal) to (IIIa3):
  • p is an integer ranging from 0 to 12, in particular equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12.
  • the compound of formula (II) corresponds to the following compounds of formulas (Illbl) to (IIIb3):
  • p is an integer ranging from 0 to 12, in particular equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12.
  • the transducer corresponds to one of the following compounds of formula (IVal) to (IVa3):
  • the transducer corresponds to one of the following compounds of formula (IVbl) to (IVb3):
  • the concentration of surface transducer of the support, or carbon nanotube can be about 10 - "12-10 -" 8 mol. cm - " 2, especially about 10 " 12 to 10 "10 mole cm “ 2 , especially about 10 "10 to 10 " 8 mole. cm “2 .
  • the transducers of the invention make it possible to transfer the electrons at extremely low potentials, from about 0.2 to -1.6 V / SCE (saturated calomel electrode), in particular from about 0 to -1.5 V / ECS, especially about -0.2 to -1.2 V / ECS, that is to say the potentials to which the biological molecules are neither oxidized nor reduced. This eliminates any risk of interference such as the risk of oxidation or parasitic reduction of molecules to be assayed.
  • the receptor is a compound capable of entering a process of selective association with a ligand, said ligand being chosen from peptides, proteins (structural proteins that allow the cell to maintain its organization in space, recognition proteins such as antigens (for example ovalbumin in the ovalbumin / anti-ovalbumin pair, or the HPV / anti- HPV detailed below) or catalytically active proteins such as enzymes, lipids, oligosaccharides, polysaccharides, natural or artificial oligonucleotides, aptamer oligonucleotides, natural or artificial polynucleotides, ribonucleic acids, small immunogenic molecules such as examples of allergens of protein origin or low molecular weight such as haptens (isocyanates or anhydrides), and small organic molecules such as for example pharmacologically active products, for example drugs such as amphetamines, phytosanitary products, such as herbicides (atrazine etc ....), pesticides or pollutants
  • recognition proteins
  • the receptor surface concentration of the medium, or the carbon nanotube is about 10 - "13-10 -" 9 mol.cm - "2, in particular about 10 -" 13-10 - “ 11 mol.cm - " 2, especially about 10 - " 11 to 10 - " 9 mol.cm - " 2.
  • the devices according to the present invention make it possible to detect a ligand in any type of sample.
  • the sample is a biological sample.
  • this sample may have been taken from a patient for diagnostic purposes and perhaps in this case, for example, urine, blood, serum, plasma, cell extracts or a body fluid.
  • the sample may also be water in which the biological samples have been diluted.
  • the detection device comprises a carbon nanotube functionalized with at least one primary amine function.
  • the functionalized carbon nanotube has a diameter of approximately 5 to 50 nm, in particular of approximately 5 to 20 nm, in particular of approximately 20 to 50 nm, and a length of 50 nm. at 500 nm.
  • the concentration of functionalized carbon nanotube at the surface of the support is about 10 "10 to 10 " 14 mol.cm “2 , especially about 10 " 10 to 10 "12 mol.cm “ 2 , especially about 10-12 to 10-14 mol.cm -2 .
  • the functionalized carbon nanotube may be a single-wall or multi-wall nanotube, containing or not a catalyst, with a diameter of 5 to 10 nm and a length of 50 to 200 nm.
  • the functionalized carbon nanotube may be a single wall nanotube, containing a catalyst, with a diameter of 5 to 10 nm and a length of 50 to 200 nm, or a single wall nanotube containing no catalyst, with a diameter of 5 to 10 nm and length 50 to 200 nm or a multi wall nanotube, containing a catalyst, with a diameter of 5 to 10 nm and a length of 50 to 200 nm or a multiwall nanotube, containing no catalyst, with a diameter of 5 to 10 nm and a length of 50 at 200 nm.
  • any electrical conductive support known to those skilled in the art can be used, in particular those of conducting or semiconductive material having a resistivity of between 10 6 and 10 10 ohm.m, especially 10 4 and 10 "8 Ohm.m, especially 10 3 and 10 - " 8 Ohm.m.
  • the support is macroscopically scopically planar and macro scopically smoothed, porous or rough. It can be rigid or flexible and consist of a single material (massive support) or of several materials (multi-material support).
  • this support can be obtained by any technique known to those skilled in the art, in particular by screen printing, or by any method of depositing an electrical conductor on any surface.
  • the support may be chosen from metals, vitreous carbon, conductive inks deposited on support and metals deposited on support.
  • carriers include solid metal electrodes and electrodes obtained by depositing an electrical conductor on an insulating support, in particular electrodes obtained by printing processes, in particular lithography, screen printing or inkjet.
  • the invention also relates to a method for preparing a detection device comprising a support, a transducer, a receiver, and possibly a functionalized carbon nanotube, and characterized in that the said method comprises:
  • At least one grafting step of the transducer on the carbon support or nanotube said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said transducer, respectively on said support or said nanotube of carbon,
  • At least one grafting step of the receptor on the support or the optionally functionalized carbon nanotube said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said receptor, respectively on said support or said optionally functionalized carbon nanotube, and optionally, a grafting step of the carbon nanotube on the support, said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine functionalizing said carbon nanotube, on said support.
  • the method of preparation of such a device comprising a support, a transducer and a receiver, comprises:
  • At least one grafting step of the transducer on the support said grafting being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said transducer, on said support,
  • At least one grafting step of the receptor on the support said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said receptor, on said support.
  • the method for preparing a detection device according to the invention comprising a support, a transducer, a receiver, and a functionalized carbon nanotube, comprises:
  • At least one grafting step of the transducer on the carbon nanotube said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said transducer, on said carbon nanotube,
  • graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of a primary amine, preferably an aliphatic primary amine, functionalizing said receptor, on said support, and
  • At least one grafting step of the carbon nanotube on the support said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said carbon nanotube, on said support.
  • At least one grafting step of the transducer on the support said grafting being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said transducer, on said support,
  • graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of a primary amine, preferably an aliphatic primary amine, functionalizing said receptor, on said carbon nanotube and at least one grafting step of the carbon nanotube on the support, said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said carbon nanotube, on said support.
  • the method of preparing a device comprising a support, a transducer, a receiver, and a functionalized carbon nanotube, comprises:
  • At least one grafting step of the transducer on the carbon nanotube said grafting being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said transducer, on said carbon nanotube,
  • At least one grafting step of the receptor on the carbon nanotube said graft being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said receptor, on said carbon nanotube and
  • At least one grafting step of the carbon nanotube on the support said grafting being the creation of a covalent bond by electrooxidation of an aliphatic primary amine, functionalizing said functionalized carbon nanotube, on said support.
  • the attachment of the transducer by a covalent bond indicates that it is not polymerized and can not form a polymer, which gives the possibility of obtaining them in the form of thin layers which give the systems according to the invention serious advantages by compared to known systems of the state of the art.
  • the solvent used in the aforementioned process may be an acidic or neutral aqueous solvent, in particular an acidic buffered or non-buffered aqueous solution, in particular a buffered or neutral buffered aqueous saline solution.
  • an acidic or neutral aqueous solvent in particular an acidic buffered or non-buffered aqueous solution, in particular a buffered or neutral buffered aqueous saline solution.
  • a solvent there may be mentioned in particular PBS (phosphate buffered saline - phosphate buffer saline), the buffer TRIS (trihydroxymethylaminomethane), or the buffer HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid ).
  • the solvent used in the aforementioned process may be an organic solvent selected from the group consisting of acetonitrile, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dimethylsulfoxide (DMSO) and chloroform.
  • organic solvent selected from the group consisting of acetonitrile, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dimethylsulfoxide (DMSO) and chloroform.
  • the solvent may be a mixture of at least one aqueous solvent and at least one organic solvent.
  • the aqueous or organic solvent may be added to electrolytic ions selected from the group comprising K +, Li +, C10 4, NBu 4 +, BF “, Na +, Cl", S0 4 2 ", HS0 4", H 2 P0 4 ⁇ , HP0 4 2 " , P0 4 3" , Mg 2+
  • the grafting reactions are advantageously carried out at a temperature of between about 5 ° C. and about 40 ° C., in particular between about 10 ° C. and about 35 ° C., in particular between about 15 ° C. and about 25 ° C.
  • the transducer concentration relative to the substrate surface is about 10 - "8 ° to 1 (T -12" mol ⁇ cm -2, in particular of about 10 - "8-10 -" 10 mol cm -. "2, especially about 10 -" 10-10 - “. 12 mol cm - '2, when the transducer grafting step respectively on the support , or on the functionalized carbon nanotube.
  • the receptor concentration relative to the support surface, or functionalized carbon nanotube is about 10 - "13-10 -" 9 mol.cm - " 2, in particular approximately 10 - "13-10 -” 11 mol.cm - "2, especially about 10 -" 11-10 - "9 mol.cm -" 2 during the grafting step of receiver respectively on the support, or on the functionalized carbon nanotube.
  • the concentration of functionalized carbon nanotube with respect to the support surface is about 10-11 to
  • the electrochemical oxidation potential applied to the support, or functionalized carbon nanotube, during the step of grafting the transducer respectively on said support, or on said functionalized carbon nanotube is about 0 to 1.5 V / ECS, especially about 0 to 1 V / ECS, especially about 0.3 to 0.7 V / ECS.
  • the electrochemical oxidation potential applied to the support, or functionalized carbon nanotube, during the step of grafting the receiver respectively on said support, or on said functionalized carbon nanotube. is about 0 to 1.5 V / ECS, especially about 0 to 1 V / ECS, especially about 0.3 to 0.7 V / ECS.
  • the electrochemical oxidation potential applied to the support, during the grafting step of the carbon nanotube functionalized on said support is approximately 0 to 1.5 V / SCE. , in particular of approximately 0 to 1 V / ECS, in particular of approximately 0.3 to 0.7 V / ECS.
  • the duration of application of the electrochemical oxidation potential applied to the support, or to the functionalized carbon nanotube, during the various grafting steps is a matter of general knowledge of the person skilled in the art who will be able to adapt it according to the potentials. used.
  • the duration of application can be from about 0.1 to 3600 seconds, in particular from about 0.1 to 600 seconds, in particular from about 5 to 60 seconds.
  • the method for preparing a detection device comprising a support, a transducer, and a receiver, is characterized in that the support is a screen-printed electrode, and in that the steps of grafting of the receiver and the transducer on said screen-printed electrode are made
  • the present invention also relates to a detection device that can be obtained according to the implementation of a method according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a detection device as described above for the implementation of a method for detecting a receptor ligand in a detection medium, by observation of a modification. significant electro-activity of the transducer by an electrochemical measurement method.
  • the detection medium may be any type of solution, for example urine, blood, serum, plasma, cell extracts, body fluid or water in which dilute the biological samples.
  • a significant change in the electro-activity of the transducer corresponds to a signal-to-noise ratio of 3 or more.
  • the method for detecting a ligand comprises: a step of bringing said ligand into contact with a detection device as described previously in a detection medium,
  • a step of detecting by a method of electrochemical measurement of the presence of said ligand in the detection medium, by observation of a modification of the electroactivity of the transducer included in the detection device.
  • the detection medium comprises an aqueous solution, especially a buffered or neutral aqueous solution.
  • the electrochemical measurement can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by a method chosen from the group comprising chronoamperometry, cyclic voltammetry, square wave voltammetry and any other pulsed voltammetry, or spectroscopy of electrochemical impedance.
  • the detection is carried out by the transducer contained in the detection device, without addition of reagent in the detection medium and without modification of the ligand, so-called direct transduction.
  • the detection method according to the invention makes it possible to detect a ligand chosen from:
  • the potential applied to the support during the detection of a ligand is approximately 0.2 to -1.6 V / SCE, in particular from approximately 0 to -1.5. V / ECS, especially about -0.2 to -1.2 V / ECS.
  • FIG. 1 illustrates the current recorded when applying a potential of +0.7 V / SCE to the WORK electrode for 30 s in accordance with Example 2.
  • FIG. 2 shows the current recorded when the WORK electrode is swept by a potential of 0 to +0.7 V / SCE according to Example 2.
  • FIG. 3 is a cyclic voltammogram of an electrografting electrode modified by JugThioNH 2 (curve a), and of an electrode which has not undergone electrografting (curve b) according to example 2.
  • FIG. 4 represents the electrochemical characterization of a modified electrode by a monolayer of JugThioNH 2 , in PBS medium according to example 2.
  • Figure 5 is the PM-IRRAS spectrum performed on an electrode after oxidation in a solution of JugThioNH 2 .
  • FIG. 6 shows the cyclic voltammograms of an electrode modified by electrografting of HPV-16-L1-311-325, for different concentrations of this oligopeptide in solution, (a) 10.10 -6 M; (b) 1.10 " 6 M; (c) 5.10 "7 M; (d) 2.5x10" 7 M; (e) no oligopeptide in solution according to Example 3.
  • FIG. 7 shows cyclic voltammograms: (a) an electrode modified by electro-grafting of HPV-16-L1-311-325 at a concentration 2.5x10 "M then incubated in a PBS solution containing the anti HPV-16, (b) same electrode, before incubation with the antibody, (c) same electrode, before electrografting oligopeptide according to Example 4.
  • FIG. 8A shows the voltammograms obtained by voltammetry square wave (SWV) of a modified electrode JUGNH 2 5.10 "4 M (solid line) on which is then grafted HPV-16-L1 probe 5.10 -" 8 M +0.5 V for 50s (broken line); then incubated in PBS for 4 hours at 37 ° C. (dotted line) in accordance with Example 4.
  • SWV voltammetry square wave
  • 8B shows the voltammograms obtained by SWV square wave voltammetry of a electrode modified with JUGNH 2 5.10 -4 M (solid line) on which is then grafted the probe HPV-16-L1 5.10 " M at +0.5 V for 50s (dashed line), then incubated in a solution of PBS + antiHPV at 5.4 ⁇ 10 -10 M for 4 h at 37 ° C. (dotted) in accordance with example 4.
  • Figure 9 illustrates the sensitivity of the system.
  • A represents the calibration curve in linear scale
  • 7B represents the calibration curve in logarithmic scale, measured under the conditions of Example 4.
  • FIG. 10 represents the cyclic voltammograms between 0 V and +0.6 V / ECS of an electrode immersed in a solution of PBS containing 5.10 "6 M ODN GEM-C 6 -NH 2 according to Example 5.
  • FIG. 11 represents the cyclic voltammograms between -0.2 V and +0.4 V / ECS of an electrode immersed in a solution of PBS containing the ferri-ferro pair, ie K 4 Fe (CN) 6 10 -3 M and K 3 Fe (CN) 6 10 -3 M according to Example 5.
  • Curve (a) corresponds to an electrode modified by electrografting of ODN GEM-C 6 -NH 2 .
  • Curve (b) corresponds to an electrode which has only been soaked in the solution of GEM-C 6 -NH 2 , without electrografting.
  • FIG. 12 represents the voltammetry obtained by square wave voltammetry (SWV) of an electrode (a) modified by JugThioNH 2 , and (b) modified by both JugThioNH 2 and GEM-C 6 -NH 2 according to FIG. Example 6
  • FIG. 13 represents the voltammetry obtained by square wave voltammetry (SWV) of an electrode modified with JUG-NH 2 and with GEM-C 6 -NH 2 .
  • GEM square wave voltammetry
  • HMV before hybridization
  • MHIV after addition of a non-complementary target strand according to Example 6.
  • FIG. 15 represents the cyclic voltammograms of an electrode modified with SWCNT-JUG-NH 2 before (solid line) and after (dotted line) grafting by the oligonucleotide probe GEM according to example 7.
  • FIG. 16 represents the voltammetry obtained by square wave voltammetry (SWV) of an electrode modified with SWCNT-JUG-NH2 and by the GEM probe according to Example 7. Continuous trait: before hybridization; Dotted line: after hybridization with the complementary target strand HIV.
  • SWV square wave voltammetry
  • FIG. 17 represents the voltammetry obtained by square wave voltammetry (SWV) of an electrode modified by SWCNT-JUG-NH 2 and by the GEM probe according to Example 7. Continuous trait: before hybridization; Dotted line: after incubation with the non-complementary strand RAND.
  • SWV square wave voltammetry
  • EXAMPLE 1 SYNTHESIS OF 3 - [(2-AMINOETHYL) SULFANYL)] - 5-HYDROXY-1.4-NAPHTOQUINONE
  • EXAMPLE 2 ELECTRO-GRAFTING OF 3 - [(2-AMINOETHYL) SULFANYL)] - 5-HYDROXY-1,4-NAPHTOQUINONE (JugThioNH 2 )
  • the WORK electrode is rinsed with acetonitrile or dimethylformamide (DMF) and then dried with a stream of argon.
  • DMF dimethylformamide
  • FIG. 1 corresponds to the current measured during potentiostatic electrooxidation at +0.7 V, under the conditions described in section 2.1.2, and has the characteristic appearance of this type of procedure.
  • FIG. 2 corresponds to oxidation by 6 cyclic sweeps of potentials under the conditions described in section 2.1.2. We note the presence of a decreasing oxidation current regularly, testimony of the progressive deposition of the JugThioNH 2 on the surface.
  • the WORK electrode (FIG. 3, curve a) modified by electrooxidation, as indicated in example 1.1.2, is introduced into a conventional electrochemical cell with 3 electrodes containing a solution of phosphate buffer (PBS, Phosphate Buffer Saline) of pH 7. , 4, then a round-trip potential sweep is imposed between 0 V and -0.65 V / SCE at 50 mV.s- 1 .
  • the current is recorded and shown in Figure 3, curve (a).
  • the curve (b) corresponds to another WORK electrode (denoted b) previously dipped in a solution of JugThioNH 2 but having not been subjected to any oxidation potential (any other parameter being identical elsewhere).
  • the surface density of electroactive JugThioNH 2 was measured by integration of faradic current, and is equal to 1.9 + 0.3 x 10 - "10 mol cm -" 2. This value is compared with that obtained in the case of the formation of self-assembled monolayers of alkylthiol-modified juglone (G. March et al, JACS 2008, 130, 15752), for which the surface density was measured at 2.2 + 0.3 ⁇ 10 -10 mol cm " .
  • the electrodeposited layer of JugThioNH 2 is therefore comparable to a monolayer.
  • a last electrochemical characterization confirms that the surface is modified by a monolayer of JugThioNH 2 .
  • the potentials of the peaks are independent of the scanning speed.
  • their intensities vary linearly with the scanning speed (see Figure 4 a) and not linearly as a function of the square root of the scanning speed (see Figure 4 b), which is a typical behavior.
  • an electrode modified by a monolayer The current is limited by the electron transfer between the electroactive monolayer and the electrode substrate, and not by the diffusion of a species within the organic layer.
  • PM-IRRAS Polarization modulated infrared spectroscopy
  • L1 protein is a major protein of HPV type 16. It is now known that HPV infection is a risk factor for the development of cervical cancer, especially by types 16 and 18. L infection with HPV-16 results in the production of specific anti-HPV-16 antibodies. Since the L1 protein is part of the capsid, the envelope of the genome of the virus, the anti-HPV-16 have a specific affinity for this protein. This specificity is conserved for certain short sequences of this protein, and in particular for a sequence of 15 amino acids named 311-325, whose sequence is presented below (N-terminal on the left):
  • HPV-16-L1-311-325 Asn-Leu-Ala-Ser-Ser-Asn-Tyr-Phe-Pro-Thr-Pro-Ser-Gly-Ser-Met
  • the terminal amine of Asparagine (Asn) can thus be used for electrografting on an electrode. No other amino acid in this sequence carries an available aliphatic amine.
  • the HPV-16-L1-311-325 sequence is dissolved at a concentration of 5.10 " M in 20 ml of a neutral aqueous solution of PBS
  • the solution is introduced into a conventional electrochemical cell with 3 electrodes (REF, AUX, WORK
  • REF is a saturated calomel electrode (DHW)
  • DHW saturated calomel electrode
  • a potential of +0.5 V / HW is imposed on the WORK for 600 s
  • the WORK electrode is rinsed with water then dried under a stream of argon.
  • the modified WORK electrode is introduced into a conventional electrochemical cell at 3
  • the anti-HPV-16 antibody used is a mouse monoclonal antibody (AbD Serotec, Morphosys, Germany).
  • the electrode previously treated by electrografting of oligopeptide HPV-16-L1-311-325 was incubated for 1 h at 37 ° C. in 5 ml of PBS in which was added 0.1 ⁇ g of anti-HPV-16 antibody.
  • the electrode is briefly rinsed with PBS at 37 ° C and then dipped into a solution of K 4 Fe (CN) 6 10 "J and M K 3 Fe (CN) 6 10" 3 M in the PBS.
  • a potential sweep is imposed between -0.4 V and +0.5 V / ECS at 50 mV.s- 1 and the current recorded.
  • Curve (a) shows the redox signature of the ferri-ferro pair after incubation with anti-HPV-16 antibody, as discussed above.
  • FIGS. 8A and 8B They are given in FIGS. 8A and 8B.
  • the solid line curve shows the electrochemical response of an electrode (in the electroactivity domain of the JUG-Thio-NH 2 transducer) not modified by the HPV-16-L1 probe.
  • the dashed curve shows the result obtained after electrografting of the HPV-16-L1 probe (but without antibodies).
  • the dotted line curve shows the result obtained after incubation of an unmodified HPV-16-L1 electrode with anti-HPV 16, at the concentration of 1.10 - " 8 M. This curve shows the absence of complexation of anti-HPV-16 antibody, when the complexation probe is absent.
  • Figure 8B the curve in solid line shows the result obtained after electrografting of the HPV-16-L1 probe (but without antibodies).
  • the dashed line curve shows the result obtained after incubation of the HPV-16-L1 modified electrode with the anti-HPV 16, at the concentration of 1.10 "11 M.
  • the dotted line curve shows the result obtained after incubation the electrode modified with HPV-16-L1 with HPV 16, at a concentration of 1.10 "8 M.
  • the oligonucleotide GEM-C6-NH 2 portion of the TAG gene of the HIV virus is used and in which a primary aliphatic amine is available at the 3 'terminal position, on a C 6 aliphatic spacer (Eurogentec, Belgium). It is represented by the following sequence:
  • the oligonucleotide (ODN) is dissolved at a concentration of 5 ⁇ 10 -6 M in 20 ml of a neutral aqueous solution of phosphate buffered saline (PBS)
  • PBS phosphate buffered saline
  • the solution is introduced into a conventional electrochemical cell with 3 electrodes (REF) , auxiliary (AUX), working (WORK))
  • REF is a saturated calomel electrode (ECS)
  • ECS saturated calomel electrode
  • Another method is to impose a potential sweep at 0 V and 0.6 V / SCE for a few cycles.
  • the WORK electrode is rinsed with water and then dried under a stream of argon.
  • the WORK electrode modified as indicated above is introduced into a conventional 3-electrode electrochemical cell containing a solution of K 4 Fe (CN) 6 10 "J and M K 3 Fe (CN) O 10" M in PBS, then it is imposed a potential sweep between -0.2 V and +0.4 V / ECS at 50 mV.s "1 , and the current is recorded.
  • a WORK electrode on which the probe ODN has not been electrooxidized is also used under the same conditions.
  • a biomolecule ODN
  • an electroactive molecule that can act as a transducer during molecular recognition.
  • the JugThioNH 2 is an electro-active molecule capable of playing the role transducer upon hybridization between the probe strand GEM O-C -NH 2 and a complementary target strand.
  • the co-electro-grafting is carried out in two stages. First, the WORK electrode is modified by JugThioNH 2 , as described in Example 2. Secondly, this same electrode is again modified by GEM-C 6 -NH 2 , as described in Example 5.
  • SWV Square wave voltammetry
  • Curve (a) of FIG. 12 corresponds to an electrode modified solely by JugThioNH 2 (without probe ODN), while curve (b) of FIG. 12 corresponds to the electrode bearing both the GEM-C 6 probe. -NH 2 and JugThioNH 2 .
  • the results show that the grafting of GEM-C 6 -NH 2 slightly modifies the electroactivity of the JugThioNH 2 , which decreases appreciably. 6.2. Hybridization and characterization
  • Hybridization of a complementary target strand on the electro-grafted probe strand can be signed by modifying the electroactivity of the electroactive reporter JugThioNH 2 .
  • the complementary strand is here denoted HIV.
  • a strand with a mismatch was also used, noted MHIV.
  • HIV 3'-GTG GGT AGA GAG AGG AAG A- 5 'MHIV: 3'-GTG GGT AAA GAG ATG AAG A- 5'
  • the hybridization conditions are as follows: target strands at 0.1 ⁇ 10 -6 M in PBS for 2 h at 55 ° C., then the temperature is allowed to fall back to room temperature (for HIV and the MHIV strand). Electrodes are then rinsed in PBS at 37 ° C to remove non-specific adsorption.
  • the curve denoted GEM corresponds to the electrode before hybridization. After hybridization with the complementary strand HIV, an increase in the peak current (top curve) is observed, whereas the addition of a mismatched strand does not generate a significant variation (curve noted MHIV). The complementary target strand is therefore selectively recognized by a positive signal.
  • the carbon nanotubes used are of single-wall type (SWNT, dia.2-10 nm, length 1-5 microns).
  • SWNTs are oxidized in the mixture of sulfuric and nitric acid (3: 1) to reduce their length and introduce -COOH functions.
  • the nanotubes obtained (SWNT-COOH) are then treated with SOCl 2 to transform the functions -COOH into functions -COQ (acyl chloride).
  • COC1-SWNTs were then dispersed in a mixture of Jug- NH 2 and NH 2 - (CH 2) 3 NH 2 (10 "3 M), to graft these two molecules.
  • the SWCNT-JUG-NH 2 are used as individual nanoelectrodes, to graft a hybridization probe, according to an approach substantially equivalent to that described in Example 6 (the same probe and target sequences are used: GEM probe represented by the following sequence: 5'-TCG CAC CCA TCT CTC TCC TTC TAG CCT-3 ', HIV targets and non-complementary).
  • the grafting conditions are different; the GEM probe remaining native (not being modified by an amino group), the reactivity of the terminal phosphate group is then exploited for coupling with the amine carried by the SWCNTs.
  • MIA 2-methylimidazole
  • the hybridization conditions are as follows: target strands at 0.1 ⁇ 10 -6 M in PBS for 2 h at 55 ° C., then the temperature is allowed to fall back to room temperature The electrodes are then rinsed in PBS at 37 ° C. C to eliminate non-specific adsorption.
  • a control is systematically performed, considering the response after incubation in a solution containing not the complementary strand, but a random non-complementary sequence (RAND).
  • RAND random non-complementary sequence
  • FIG. 16 shows the result obtained after hybridization with the complementary strand HIV, characterized by square wave voltammetry (SWV).
  • SWV square wave voltammetry
  • the continuous curve shows the response of the electrode before hybridization, while the dotted curve shows the response after hybridization. , for which there is a clear increase in the peak current (positive signal).
  • FIG. 17 no increase in the peak current is observed after incubation with the non-complementary strand RAND (curve in full line, before incubation: curve in dashed line, after incubation). This shows that there is no hybridization. It can thus be said from FIGS. 16 and 17 that the complementary target strand is selectively recognized while the non-complementary strand is not recognized.

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Abstract

Dispositif de détection comprenant au moins un transducteur, comprenant une fonction aminé primaire liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée, au moins un récepteur possédant une fonction amine primaire, éventuellement un nanotube de carbone fonctionnalisé, et un support conducteur électrique et dans lequel ledit au moins un transducteur et ledit au moins un récepteur sont respectivement liés de façon covalente au support ou au nanotube de carbone, par l' électrooxydation d'au moins une de leurs fonctions amine primaire, et ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support.

Description

DISPOSITIF DE DETECTION DE MOLECULES D'INTERET, SON PROCEDE DE
FABRICATION ET SON UTILISATION
La présente invention a pour objet un dispositif de détection de molécules d'intérêt, son procédé de fabrication et son utilisation.
Depuis plusieurs années, les biopuces sont utilisées pour leur capacité à générer un nombre très important de données tout en utilisant de faibles quantités de molécules de capture et d'échantillons biologiques. Des biopuces à peptides ont ainsi été réalisées et développées sur des substrats (lames de verre ou silicium) pour le dépistage d'anticorps dirigés contre des pathogènes comme le virus de l'hépatite C ou B. De façon à améliorer les tests diagnostics, l'immobilisation de sondes peptidiques doit conduire à une forte densité de peptides liés de manière stable aux supports sans modifier leur bioréactivité.
Les biopuces sont constituées d'un microréseau de sondes d'ADN ou de peptides c'est-à- dire d'un arrangement bidimensionnel de biomolécules sondes déposées de façon contrôlée sur une surface telle que du verre ou toute autre matière (plastique, nitrocellulosique, métallique, ...) de telle sorte que ces sondes soient accessibles aux cibles présentes en solution. L'accroche des sondes se fait habituellement en créant, sur la surface du capteur, de petits "spots" localisés (de quelques centaines de micromètres carrés) porteurs de fonctions chimiques aptes à greffer les sondes. La disposition régulière des spots permet ensuite la lecture (le plus souvent optique) du résultat.
Les techniques de formation de ces spots sont communément rangées dans deux catégories : impression avec contact et sans contact ^'contact printing" et "non-contact printing"). L'impression avec contact est la technologie la plus largement utilisée car elle permet une excellente reproductibilité. Toutefois, les technologies d'impression sans contact, plus récentes, sont plus prometteuses (gravure photochimique, laser, jet d'encre, électrospray,...).
Des techniques de modification de surface basées sur la construction de spots d'oligodéoxynucléotides (ODN) sondes directement sur une surface plane (de type plaque de verre) ont été développées. On trouve parmi ces techniques la synthèse in situ de séquences d'ODN par photoactivations-désactivations successives, ou le dépôt local (par micro-robots) d'ODN modifiés sur des surfaces pré-activées (verre, silice, polymères,...). Ces deux approches sont développées ci-dessous : Surfaces pré-activées : Brockman et al. (Annu. Rev. Phys.Chem., 2000, 51, 41) ont montré la possibilité de former, sur des surfaces d'or, des réseaux de plots d'alkylthiols fonctionnalisés par un groupe aminé terminal. La "tête" thiol se greffe sur l'or tandis que la "queue" aminé reste disponible. Les brins d'ODN sondes sont ensuite greffés sur ces spots. D'autres configurations sont possibles, comme celles de Shumaker-Parry et al. {Anal. Chem., 2004, 76, 918) en utilisant par exemple l'enchaînement biotine - avidine - biotine. L'avantage majeur de ces techniques est qu'elles conduisent à des couches parfaitement définies pour lesquelles les séquences d'ODN, greffées après leur synthèse, ont été préalablement purifiées. Le désavantage est qu'elles nécessitent au moins deux étapes : pré-activation de la surface, puis greffage des séquences sondes.
Synthèse in-situ / Photo activation : une approche plus simple est la synthèse directe des séquences sondes sur la surface de la puce, en exploitant le principe développé par Fodor et al. (Nature, 1993, 364, 555 ; Science, 1991, 251, 767) et utilisé commercialement par Affymetrix. Le concept repose sur la modification successive d'une surface portant des groupements photolabiles activables-désactivables à volonté. L'usage de masques permet le dessin des "spots" sur la surface de la puce, chacun des spots étant porteur d'un et d'un seul type de séquence sonde. Chaque étape du processus nécessite l'utilisation d'un masque photolithographique différent. La nécessité de fabriquer un nouvel ensemble de masques photographiques pour chaque spot rend la méthode extrêmement chère et peu adaptée à l'automatisation. La méthode est complexe et longue car chaque étape de synthèse nécessite le déplacement, le remplacement et le réalignement mécaniques d'un masque photo lithographique. Ainsi, synthétiser un grand nombre de bibliothèques de spots avec cette méthode est un processus peu efficace et peu économique.
Les procédures électrochimiques (« electro-printing ») semblent très prometteuses. Ainsi il a été démontré que des techniques comme la Microscopie Electrochimique à Balayage (SECM) permettent Γ électrodéposition locale d'ADN, par exemple par Γ électropolymérisation sous forme de spots de motifs pyrroles modifiés par des brins d'oligonuléotides (Livache et al. Nucleic Acids Res., 1994, 22, 2915.; Szunerits et al. Langmuir, 2004, 20, 9236 ; E. Fortin et al., Electwnalysis, 2005, 17, 495). Il est en effet d'ores et déjà démontré que les polymères conducteurs tels que le polypyrrole ou le polythiophène sont des substrats appropriés pour l'immobilisation de brins d'ODN sonde (Cha, et al. Biosens. Bioelectron., 2003, 18, 1241; Garnier et al. Synth. Met., 1999, 100, 89). Une autre méthode consiste à déprotéger localement par électrochimie une fonction chimique qui par la suite réagira avec une sonde présente dans le milieu.
Au cours de leurs travaux les inventeurs ont déjà décrit (Reisberg et al. TALANTA 2010, 80, 1318) un biocapteur électrochimique qui se présente sous la forme d'un film mince à base de 5-hydroxy-l,4-naphtoquinone sur laquelle est greffée du glutathion tripeptide porteur d'une fonction aminé primaire. Le Glu-NHQ présente trois groupes fonctionnels parmi lesquels seul le groupe hydroxy de l'hydroxynaphtoquinone est utilisé pour Γ électropolymérisation ; le groupe aminé du glutathion est utilisé uniquement pour fixer les biomolécules par post-fonctionnalisation. WO 2008/132304 décrit un procédé de production d'un détecteur d'ions dans une phase liquide ledit détecteur étant formé d'un support électroconducteur recouvert d'une couche de polyjuglone. Cette couche de polyjuglone peut être préparée à partir de 3-mercapto-aniline-5-hydroxy-l,4-naptahlenedione, laquelle se fixe sur le support par une liaison carbone-carbone suite à l'élimination de la fonction aminé aromatique par le biais de la formation d'un sel de diazonium.
Néanmoins ces différentes méthodes ne sont pas satisfaisantes et il existe un besoin de mettre à la disposition des spécialistes, une méthode qui permette un adressage non manuel et direct des différentes sondes biologiques sur des microélectrodes individuelles.
Des dispositifs existant de détection comprennent :
- au moins un transducteur, comprenant une fonction aminé primaire liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction aminé primaire,
- éventuellement un nanotube de carbone fonctionnalisé, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un transducteur et ledit au moins un récepteur sont respectivement liés de façon covalente au support ou au nanotube de carbone, par au moins une de leurs fonctions aminé primaire et ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support.
Les inventeurs ont découvert qu'en utilisant les propriétés électrochimiques des fonctions aminés primaires aliphatiques il était possible de former directement des couches organiques ultra-minces capables de traduire un événement de reconnaissance biologique de façon plus sensible et plus fiable que l'ensemble des systèmes existants.
Aussi la présente invention a pour objet un dispositif de détection comprenant : - au moins un transducteur, comprenant une fonction aminé primaire aliphatique liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction aminé primaire aliphatique,
- éventuellement un nanotube de carbone fonctionnalisé, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un transducteur et ledit au moins un récepteur sont respectivement liés de façon covalente au support ou au nanotube de carbone, par Γ électrooxydation d'au moins une de leurs fonctions aminé primaire aliphatique, et
ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support.
Au sens de la présente invention, on entend par aminé aliphatique toute aminé possédant une chaîne carbonée acyclique ou cyclique, saturée ou insaturée à l'exclusion des aminés aromatiques.
Conformément à l'invention, la monocouche ainsi produite par électrogreffage du transducteur sur le support conducteur constitue un ensemble transducteur d'un événement de reconnaissance (bio)moléculaire.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif de détection comprend :
- au moins un transducteur, comprenant une fonction aminé primaire, de préférence une aminé primaire aliphatique, liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction aminé primaire aliphatique,
- un nanotube de carbone fonctionnalisé, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un transducteur et ledit au moins un récepteur sont respectivement liés de façon covalente au nanotube de carbone, par au moins une de leurs fonctions aminé primaire, de préférence par Γ électrooxydation d'au moins une de leurs fonctions aminé primaire aliphatique, et
ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit au moins un récepteur et ledit au moins un transducteur sont liés chacun de façon covalente au nanotube de carbone par Γ électrooxydation de leurs aminés aliphatiques primaires respectives. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le dispositif de détection selon l'invention comprend :
- au moins un transducteur, comprenant une fonction amine primaire aliphatique, liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction amine primaire aliphatique,
- un nanotube de carbone fonctionnalisé, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un récepteur est lié de façon covalente au nanotube de carbone, par au moins une des fonctions amine primaire aliphatique,
ledit au moins un transducteur est lié de façon covalente au support, par au moins une des fonctions amine primaire aliphatique, et
ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit au moins un récepteur est lié de façon covalente au nanotube de carbone par Γ électrooxydation d'au moins une de ses fonctions amine primaire aliphatique, et ledit au moins un transducteur est lié de façon covalente au support par Γ électrooxydation d'au moins une de ses fonctions amine primaire aliphatique.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif de détection comprend :
- au moins un transducteur, comprenant une fonction amine primaire liée aliphatique, à une quinone, ou un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction amine primaire aliphatique,
- un nanotube de carbone fonctionnalisé, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un transducteur est lié de façon covalente au nanotube de carbone, par
Γ électrooxydation d'au moins une des fonctions amine primaire aliphatique,
ledit au moins un récepteur est lié de façon covalente au support, par Γ électrooxydation d'au moins une des fonctions amine primaire aliphatique, et
ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif de détection comprend :
- au moins un transducteur, comprenant une fonction amine primaire aliphatique, liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction amine primaire aliphatique, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un transducteur et ledit au moins un récepteur sont respectivement liés de façon covalente au support par Γ électrooxydation d'au moins une de leurs fonctions amine primaire aliphatique,
Conformément à l'invention, le transducteur peut être un composé correspondant à la formule I suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle
n est égal à 0 ou 1,
m est égal à 0 ou 1,
RI, R2, R3, R4, R5, et R8 indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi : H, O, S, NH2, N02, NH, OH, COOH, SH, et un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, cyclique ou aromatique,
R6 et R7 indépendamment l'un de l'autre sont choisis parmi :
- H, O, S, NH2, N02, NH, OH, COOH, SH,
un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, cyclique ou aromatique, ou un groupe
Figure imgf000007_0002
avec p représentant un nombre entier variant de 0 à 12 et X étant choisi parmi CH2, O, NH, S, et
! , indépendamment les unes des autres, représentent des liaisons covalentes simples ou doubles selon la nature des groupements RI, R2, R3, R4, R5,
R6, R7 et R8 et selon les valeurs de m et n.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le transducteur correspond à la formule II suivante :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle
RI, R2, R3, et R4, indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi : H, O, S, NH2, N02, NH, OH, COOH, SH et un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, cyclique ou aromatique,
R9 et RIO indépendamment l'un de l'autre sont choisis parmi :
- H, O, S, NH2, N02, NH, OH, COOH, SH,
un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, cyclique ou aromatique ou, groupe H2N^X
p représentant un nombre entier variant de 0 à 12 et X étant choisi parmi CH2, O, NH, S,
les liaisons ; indépendamment les unes des autres, représentent des liaisons covalentes simples ou doubles selon la nature des groupements RI, R2, R3, R4, R9 et RIO. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention l'un au moins
de R6 et R7 représente un groupe
Figure imgf000009_0001
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé de quinone, un dérivé de l'une au moins des quinones choisies notamment dans le groupe comprenant les quinones suivantes : 1,4-benzoquinone, 1,4-naphtoquinone et anthraquinone, notamment ceux choisis dans le groupe comprenant l'acide benzoquinonetétracarboxylique, le bicarbonate de tétrahydroxy- 1,4-benzoquinone, le bisoxalate de tétrahydroxy- 1,4-benzoquinone, le coenzyme Q10, le dianhydride 1,4-benzoquinonetétracarboxylique, la duroquinone, l'idarubicine, lajuglone, la plastoquinone, la 5-amino- 1,4-naphtoquinone, la tétrahydroxy- 1,4-benzoquinone et la vitamine K.
Au sens de la présente invention, on entend par « un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée », soit un atome de carbone, soit un atome d'azote, de soufre ou d'oxygène appartenant à une chaîne carbonée comprenant entre 1 et 12 atomes de carbone.
Au sens de la présente invention, on entend par groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, aromatique ou cyclique une chaîne choisie dans le groupe comprenant notamment le méthyle, l'éthyle, le propyle, l'isopropyle, le n-butyle, l'isobutyle, le t-butyle, le n-pentyle, le n-héxyle, l'heptyle, l'octyle, le nonyle, et le décyle. Ces chaînes carbonées peuvent contenir une ou plusieurs doubles liaisons et on obtient alors des chaînes alcényles droites ou ramifiées. Elles peuvent également être cycliques et comprendre dans la chaîne un cycle choisi parmi les groupes cyclopropyle, cyclobutyles, cyclopentyle et cyclohexyle, ou aromatique et comprendre dans la chaîne un groupe aromatique, comme par exemple un group aryle, en particulier un groupe phényle.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le composé de formule (II) correspond aux composés de formules (Illal) à (IIIa3) suivantes :
Figure imgf000009_0002
(mal)
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
dans lesquelles p est un nombre entier variant de 0 à 12, notamment égal à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le composé de formule (II) correspond aux composés de formules (Illbl) à (IIIb3) suivantes:
Figure imgf000010_0003
Figure imgf000010_0004
Figure imgf000011_0001
dans lesquelles p est un nombre entier variant de 0 à 12, notamment égal à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le transducteur correspond à un des composés de formule (IVal) à (IVa3) suivantes :
Figure imgf000011_0002
(IVal) ou JugThioNH2, ou 3-mercaptoéthylamine-5-hydroxy-l,4-naphtoquinone
Figure imgf000011_0003
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le transducteur correspond à un des composés de formule (IVbl) à (IVb3) suivantes :
Figure imgf000012_0001
Les composés de formule (I), (II), (Illal) à (IIIa3), (Illbl) à (IIIb3), (IVal) à (IVa3) et (IVbl) à (IVb3) peuvent être synthétisés par des méthodes connues de l'homme du métier à partir de composés décrits dans la littérature ou disponibles dans le commerce.
Conformément à l'invention, la concentration de transducteur en surface du support, ou du nanotube de carbone, peut être d'environ 10 -"12 à 10 -"8 mol. cm -"2 , notamment environ 10"12 à 10"10 mol. cm"2, notamment d'environ 10"10 à 10"8 mol. cm"2.
Les transducteurs de l'invention permettent de transférer les électrons à des potentiels extrêmement bas, d'environ 0,2 à -1,6 V / ECS (électrode au calomel saturé), notamment d'environ 0 à -1,5 V / ECS, notamment d'environ -0,2 à -1,2 V / ECS, c'est-à-dire des potentiels auxquels les molécules biologiques ne sont ni oxydées, ni réduites. Cela permet d'éliminer tout risque d'interférence comme par exemple les risques d'oxydation ou de réduction parasites de molécules à doser.
Conformément à l'invention, le récepteur est un composé susceptible d'entrer dans un processus d'association sélectif avec un ligand, ledit ligand étant choisi parmi les peptides, les protéines (protéines de structure qui permettent à la cellule de maintenir son organisation dans l'espace, protéines de reconnaissance comme par exemple des antigènes (par exemple l'ovalbumine dans le couple ovalbumine/anti-ovalbumine, ou le couple HPV/anti-HPV détaillé plus loin) ou les protéines à activité catalytique comme les enzymes, les lipides, les oligosaccharides, les polysaccharides, les oligonucléotides naturels ou artificiels, les oligonucléotides aptamères, les polynucléotides naturels ou artificiels, les acides ribonucléiques, des petites molécules immunogènes comme par exemple des allergènes d'origine protéique ou de bas poids moléculaire tels que les haptènes (isocyanates ou anhydrides), et les petites molécules organiques comme par exemple des produits pharmacologiquement actifs, par exemple des drogues comme les amphétamines, des produits phytosanitaires, comme les herbicides (atrazine etc....), des pesticides ou des polluants. Le récepteur fixé sur le support est spécifique du ligand à détecter, avec lequel il forme avantageusement un couple anti-ligand/ligand.
Conformément à l'invention, la concentration de récepteur en surface du support, ou du nanotube de carbone, est d'environ 10 -"13 à 10 -"9 mol.cm -"2 , notamment environ 10 -"13 à 10 -"11 mol.cm -"2 , notamment environ 10 -"11 à 10 -"9 mol.cm -"2.
Les dispositifs selon la présente invention permettent de détecter un ligand dans tout type d'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic et peut-être dans ce cas par exemple, de l'urine, du sang, du sérum, du plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel. L'échantillon peut être également de l'eau dans laquelle ont été dilués les échantillons biologiques.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif de détection comprend un nanotube de carbone fonctionnalisé avec au moins une fonction aminé primaire.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le nanotube de carbone fonctionnalisé a un diamètre d'environ 5 à 50 nm, notamment d'environ 5 à 20 nm, notamment d'environ 20 à 50 nm, et une longueur 50 à 500 nm.
Conformément à l'invention, la concentration de nanotube de carbone fonctionnalisé à la surface du support est d'environ 10"10 à 10"14 mol.cm"2, notamment d'environ 10"10 à 10"12 mol.cm"2, notamment d'environ 10"12 à 10"14 mol.cm"2.
Conformément à l'invention, le nanotube de carbone fonctionnalisé peut être un nanotube simple- ou multi- paroi, contenant ou pas un catalyseur, de diamètre 5 à 10 nm et de longueur 50 à 200 nm. Ainsi le nanotube de carbone fonctionnalisé peut être un nanotube simple paroi, contenant un catalyseur, de diamètre 5 à 10 nm et de longueur 50 à 200 nm ou un nanotube simple paroi, ne contenant pas de catalyseur, de diamètre 5 à 10 nm et de longueur 50 à 200 nm ou un nanotube multi paroi, contenant un catalyseur, de diamètre 5 à 10 nm et de longueur 50 à 200 nm ou un nanotube multi paroi, ne contenant pas de catalyseur, de diamètre 5 à 10 nm et de longueur 50 à 200 nm.
Conformément à l'invention, tout support conducteur électrique connu de l'homme du métier peut être utilisé, en particulier ceux en matériau conducteur ou semi-conducteur ayant une résistivité comprise entre 106 et 10"10 Ohm.m, notamment 104 et 10"8 Ohm.m, notamment 10 3 et 10 -"8 Ohm.m.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le support est macro scopiquement plan et macro scopiquement lissé, poreux ou rugueux. Il peut être rigide ou souple et être constitué d'un seul matériau (support massif) ou de plusieurs matériaux (support multi matériaux).
Conformément à l'invention, ce support peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par impression sérigraphiée, ou par toute méthode de dépôt d'un conducteur électrique sur une surface quelconque.
Le support peut être choisi parmi les métaux, le carbone vitreux, les encres conductrices déposées sur support et les métaux déposés sur support. On peut notamment citer à titre d'exemples de supports, les électrodes métalliques massives et les électrodes obtenues par dépôt d'un conducteur électrique sur un support isolant, notamment les électrodes obtenues par procédés d'imprimerie, notamment de lithographie, de sérigraphie ou de jet d'encre.
L'invention a également pour objet, un procédé de préparation d'un dispositif de détection comprenant un support, un transducteur, un récepteur, et éventuellement un nanotube de carbone fonctionnalisé, et caractérisé en ce que ledit procédé comprend :
- au moins une étape de greffage du transducteur sur le support ou le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit transducteur, sur respectivement ledit support ou ledit nanotube de carbone,
- au moins une étape de greffage du récepteur sur le support ou le nanotube de carbone éventuellement fonctionnalisé, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d' une aminé primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit récepteur, sur respectivement ledit support ou ledit nanotube de carbone éventuellement fonctionnalisé, et - éventuellement une étape de greffage du nanotube de carbone sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire aliphatique fonctionnalisant ledit nanotube de carbone, sur ledit support.
Lorsque le dispositif selon l'invention ne comprend pas de tube de carbone, alors le procédé de préparation d'un tel dispositif comprenant un support, un transducteur et un récepteur, comprend :
- au moins une étape de greffage du transducteur sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit transducteur, sur ledit support,
- au moins une étape de greffage du récepteur sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit récepteur, sur ledit support.
Lorsque le transducteur est greffé sur le nanotube, alors le procédé de préparation d'un dispositif de détection selon l'invention comprenant un support, un transducteur, un récepteur, et un nanotube de carbone fonctionnalisé, comprend :
- au moins une étape de greffage du transducteur sur le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit transducteur, sur ledit nanotube de carbone,
- au moins une étape de greffage du récepteur sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire, de préférence une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit récepteur, sur ledit support, et
- au moins une étape de greffage du nanotube de carbone sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit nanotube de carbone, sur ledit support.
Lorsque le récepteur est greffé sur le nanotube, alors le procédé dé préparation d'un dispositif de détection comprenant un support, un transducteur, un récepteur, et un nanotube de carbone fonctionnalisé comprend :
- au moins une étape de greffage du transducteur sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit transducteur, sur ledit support,
- au moins une étape de greffage du récepteur sur le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une amine primaire, de préférence une amine primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit récepteur, sur ledit nanotube de carbone et - au moins une étape de greffage du nanotube de carbone sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit nanotube de carbone, sur ledit support.
Lorsque le récepteur et le transducteur sont greffés sur un nanotube, alors le procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support, un transducteur, un récepteur, et un nanotube de carbone fonctionnalisé, comprend :
- au moins une étape de greffage du transducteur sur le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit transducteur, sur ledit nanotube de carbone,
- au moins une étape de greffage du récepteur sur le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit récepteur, sur ledit nanotube de carbone et
- au moins une étape de greffage du nanotube de carbone sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique, fonctionnalisant ledit nanotube de carbone fonctionnalisé, sur ledit support.
La fixation du transducteur par une liaison covalente indique que celui-ci n'est pas polymérisé et ne peut pas former de polymère ce qui donne la possibilité de les obtenir sous forme de couches minces qui confèrent aux systèmes selon l'invention de sérieux avantages par rapport aux systèmes connus de l'état de la technique.
Conformément à l'invention, le solvant utilisé dans le procédé mentionné précédemment peut être un solvant aqueux acide ou neutre, notamment une solution aqueuse acide tamponnée ou non, en particulier une solution aqueuse saline neutre tamponnée ou non. A titre d'exemple de solvant, on peut citer notamment le PBS (tampon phosphate salin - phosphate buffer saline), le tampon TRIS (trihydroxyméthylaminométhane), ou le tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-l-pipérazine éthane sulfonique).
Conformément à l'invention, le solvant utilisé dans le procédé mentionné précédemment peut être un solvant organique choisi dans le groupe comprenant l'acétonitrile, le diméthylformamide (DMF), le tétrahydrofurane (THF), le dimétylsulfoxyde (DMSO) et le chloroforme.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le solvant peut être un mélange d'au moins un solvant aqueux et d'au moins un solvant organique.
Le solvant aqueux ou organique peut être additionné d'ions électrolytiques choisis dans le groupe comprenant K+, Li+, C104 , NBu4 +, BF ", Na+, Cl", S04 2", HS04 ", H2P04 ~ , HP04 2", P04 3", Mg2+ Les réactions de greffage sont avantageusement réalisées à une température comprise entre environ 5°C et environ 40°C, notamment entre environ 10°C et environ 35°C, en particulier entre environ 15°C et environ 25°C.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, la concentration de transducteur par rapport à la surface du support, est d'environ 10 -"8° à 1(T -12" mol .cm -2 , notamment d'environ 10 -"8 à 10 -"10 mol. cm -"2 , notamment d'environ 10 -"10 à 10 -"12 mol. cm -"2 , lors de l'étape de greffage du transducteur respectivement sur le support, ou sur le nanotube de carbone fonctionnalisé.
Dans un autre mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention la concentration de récepteur par rapport à la surface de support, ou de nanotube de carbone fonctionnalisé, est d'environ 10 -"13 à 10 -"9 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"13 à 10 -"11 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"11 à 10 -"9 mol.cm -"2 , lors de l'étape de greffage du récepteur respectivement sur le support, ou sur le nanotube de carbone fonctionnalisé.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, la concentration de nanotube de carbone fonctionnalisé par rapport à la surface de support est d'environ 10"11 à
10 -"14 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"11 à 10 -"12 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"12 à 10 -"14 mol.cm" , lors de l'étape de greffage du nanotube de carbone fonctionnalisé sur le support.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, ou au nanotube de carbone fonctionnalisé, lors de l'étape de greffage du transducteur respectivement sur ledit support, ou sur ledit nanotube de carbone fonctionnalisé, est d'environ 0 à 1,5 V/ECS, notamment d'environ 0 à 1 V/ECS, notamment d'environ 0,3 à 0,7 V/ECS.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, ou au nanotube de carbone fonctionnalisé, lors de l'étape de greffage du récepteur respectivement sur ledit support, ou sur ledit nanotube de carbone fonctionnalisé, est d'environ 0 à 1,5 V/ECS, notamment d'environ 0 à 1 V/ECS, notamment d'environ 0,3 à 0,7 V/ECS.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, lors de l'étape de greffage du nanotube de carbone fonctionnalisé sur ledit support, est d'environ 0 à 1,5 V/ECS, notamment d'environ 0 à 1 V/ECS, notamment d'environ 0,3 à 0,7 V/ECS.
La durée d'application du potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, ou au nanotube de carbone fonctionnalisé, lors des différentes étapes de greffage, relève des connaissances générales de l'homme du métier qui saura l'adapter en fonction des potentiels utilisés. A titre d'exemple la durée d'application peut être d'environ 0,1 à 3600 secondes, notamment d'environ 0,1 à 600 secondes, notamment d'environ 5 à 60 secondes.
Dans un mode particulièrement avantageux de l'invention, le procédé de préparation d'un dispositif de détection comprenant un support, un transducteur, et un récepteur, est caractérisé en ce que le support est une électrode sérigraphiée, et en ce que les étapes de greffage du récepteur et du transducteur sur ladite électrode sérigraphiée sont réalisés
- durant environ 10 secondes à environ 120 secondes, notamment environ 30 secondes à environ 90 secondes, particulièrement environ 60 secondes,
- à un potentiel d'environ 0,1 V à environ 2 V, notamment environ 0,5 V à environ 1 V, particulièrement environ 0,7 V, et
- à une température d'environ 10°C à environ 35°C, notamment d'environ 15°C à environ 25°C, particulièrement environ 20°C.
La présente invention a également pour objet un dispositif de détection susceptible d'être obtenu selon la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention.
La combinaison entre Γ électrooxydation d'une amine aliphatique primaire portée par des dérivés de quinones, ou portée par un nanotube de carbone fonctionnalisé par un dérivé de quinone et formant ainsi ledit « transducteur » et la transduction électrochimique directe de la reconnaissance moléculaire entre un analyte et sa sonde immobilisée sur ledit « transducteur », permet d'aboutir à la transduction électrochimique directe d'une reconnaissance moléculaire à partir d'une couche mince électroactive composée de dérivés de quinone greffés de manière covalente sur l'électrode par l'intermédiaire d'une amine primaire aliphatique électrooxydée.
Aussi la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un dispositif de détection tel que décrit précédemment pour la mise en œuvre d'une méthode de détection d'un ligand du récepteur dans un milieu de détection, par observation d'une modification significative de l'électro-activité du transducteur par une méthode de mesure électrochimique.
Au sens de la présente invention, le milieu de détection peut être tout type de solution, par exemple de l'urine, du sang, du sérum, du plasma, des extraits cellulaires, un fluide corporel ou de l'eau dans laquelle ont été dilués les échantillons biologiques.
Au sens de la présente invention, une modification significative de l'électro-activité du transducteur correspond à un rapport signal sur bruit de 3 ou plus.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la méthode de détection d'un ligand comprend : - une étape de mise en contact dudit ligand avec un dispositif de détection tel que décrit précédemment dans un milieu de détection,
- une étape d'application d'un potentiel électrique au dit dispositif de détection et
- une étape de détection, par une méthode de mesure électrochimique de la présence dudit ligand dans le milieu de détection, par observation d'une modification de Γ électroactivité du transducteur compris dans le dispositif de détection.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le milieu de détection comprend une solution aqueuse, notamment une solution aqueuse neutre tamponnée ou non.
La mesure électrochimique peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une méthode choisie dans le groupe comprenant la chronoampérométrie, la voltamètrie cyclique, la voltamétrie à vagues carrées et toute autre voltamétrie puisée, ou encore la spectroscopie d'impédance électrochimique.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la détection est effectuée par le transducteur contenu dans le dispositif de détection, sans ajout de réactif dans le milieu de détection et sans modification du ligand, On parle alors de transduction directe.
La méthode de détection selon l'invention permet de détecter un ligand choisi parmi :
- un peptide,
- une protéine de structure
- une protéine de reconnaissance (Antigène/ Anticorps)
- une protéine à activité catalytique (enzyme)
- un oligonucléotide,
- un polynucléotide,
- un oligonucléotide aptamère,
- un acide ribonucléique,
- un oligosaccharide,
- un polysaccharide,
- un composé pharmacologiquement actif,
- un composé phytosanitaire,
- une petite molécule immunogène.
Elle permet de détecter un ligand présent à une concentration d'environ 300 fmol.L"1 à environ 1 mmol.L"1, notamment d'environ 1 pmol.L 1 à environ 1 « moLL 1, notamment d' environ 10 pmol.L"1 à environ 100 nmol.L"1 Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le potentiel appliqué au support lors de la détection d'un ligand est d'environ 0,2 à -1,6 V / ECS, notamment d'environ 0 à -1,5 V / ECS, notamment d'environ -0,2 à -1,2 V / ECS.
Les exemples 1 à 7 et les figures 1 à 17 qui suivent illustrent l'invention.
La figure 1 illustre le courant enregistré lors de l'application d'un potentiel de +0,7 V / ECS à l'électrode WORK pendant 30 s conformément à l'exemple 2.
La figure 2 représente le courant enregistré lorsque l'électrode WORK est balayée par un potentiel de 0 à +0,7 V / ECS conformément à l'exemple 2.
La figure 3 est un voltammogramme cyclique d'une électrode modifiée par électrogreffage par JugThioNH2 (courbe a), et d'une électrode n'ayant pas subi d' électro-greffage (courbe b) conformément à l'exemple 2.
La figure 4 représente la caractérisation électrochimique d'une électrode modifiée par une monocouche de JugThioNH2, en milieu PBS selon l'exemple 2. (a) Tracés des courants de pics anodique et cathodique en fonction de la vitesse de balayage ; (b) Tracés des courants de pics anodique et cathodique en fonction de la racine carrée de la vitesse de balayage.
La figure 5 est le spectre PM-IRRAS effectué sur une électrode après oxydation dans une solution de JugThioNH2. (b) Spectre IRTF classique réalisé par transmission sur une pastille de JugThioNH2 dans KBr.
La figure 6 représente les voltammogramme s cycliques d'une électrode modifiée par électro-greffage de HPV-16-L1-311-325, pour différentes concentrations de cet oligopeptide en solution, (a) 10.10"6 M ; (b) 1.10"6 M ; (c) 5.10"7 M ; (d) 2,5.10"7 M ; (e) pas d' oligopeptide en solution conformément à l'exemple 3.
La figure 7 représente les voltammogrammes cycliques : (a) d'une électrode modifiée par électro-greffage de HPV-16-L1-311-325 à une concentration 2,5.10" M puis incubée dans une solution de PBS contenant l'anticorps anti-HPV-16 ; (b) même électrode, avant incubation avec l'anticorps ; (c) même électrode, avant électro-greffage de Γ oligopeptide conformément à l'exemple 4.
La figure 8A représente les voltammogrammes obtenus par voltamétrie à vagues carrées (SWV) d'une électrode modifiée par JUGNH2 5.10"4M (trait plein) ; sur laquelle est ensuite greffée la sonde HPV-16-L1 5.10 -"8 M à +0,5 V pendant 50s (trait discontinu) ; puis incubée dans du PBS pendant 4h à 37°C (pointillés) conformément à l'exemple 4. La figure 8B représente les voltammogrammes obtenus par voltamétrie à vagues carrées SWV d'une électrode modifiée par JUGNH2 5.10"4M (trait plein) ; sur laquelle est ensuite greffée la sonde HPV-16-L1 5.10" M à +0,5 V pendant 50s (trait discontinu) ; puis incubée dans une solution de PBS + antiHPV à 5,4.10"10M pendant 4h à 37°C (pointillés) conformément à l'exemple 4.
La figure 9 illustre la sensibilité du système. 9 A représente la courbe de calibration en échelle linéaire, et 7B représente la courbe de calibration en échelle logarithmique, mesurée dans les conditions de l'exemple 4.
La figure 10 représente les voltammogrammes cycliques entre 0 V et +0,6 V/ECS d'une électrode plongée dans une solution de PBS contenant 5.10"6 M d'ODN GEM-C6-NH2 conformément à l'exemple 5.
La figure 11 représente les voltammogrammes cycliques entre -0,2 V et +0,4 V/ECS d'une électrode plongée dans une solution de PBS contenant le couple ferri-ferro, soit K4Fe(CN)6 10"3M et K3Fe(CN)6 10"3M conformément à l'exemple 5. La courbe (a) correspond à une électrode modifiée par électro-greffage de l'ODN GEM-C6-NH2. La courbe (b) correspond à une électrode ayant seulement été trempée dans la solution de GEM-C6-NH2, sans électro-greffage.
La figure 12 représente les voltammogrammes obtenus par voltamétrie à vagues carrées (SWV) d'une électrode (a) modifiée par JugThioNH2, et (b) modifiée à la fois par JugThioNH2 et par GEM-C6-NH2 conformément à l'exemple 6.
La figure 13 représente les voltammogrammes obtenus par voltamétrie à vagues carrées (SWV) d'une électrode modifiée par JUG-NH2 et par GEM-C6-NH2. (GEM) : avant hybridation ; (HIV) : après hybridation avec le brin cible complémentaire ; (MHIV) : après ajout d'un brin cible non-complémentaire conformément à l'exemple 6.
La figure 14 représente le voltammogramme cyclique d'une électrode initialement nue, puis sur laquelle sont greffés les CNT-JUG-NH2 conformément à l'exemple 7. Vitesse de balayage = 50 mV.s"1. Milieu PBS, pH 7,2.
La figure 15 représente les voltammogrammes cycliques d'une électrode modifiée par SWCNT-JUG-NH2 avant (trait plein) et après (trait pointillé) greffage par la sonde oligonucléotidique GEM conformément à l'exemple 7.
La figure 16 représente les voltammogrammes obtenus par voltamétrie à vagues carrées (SWV) d'une électrode modifiée par SWCNT-JUG-NH2 et par la sonde GEM conformément à l'exemple 7. Trait continu : avant hybridation ; Trait pointillé : après hybridation avec le brin cible complémentaire HIV.
La figure 17 représente les voltammogrammes obtenus par voltamétrie à vagues carrées (SWV) d'une électrode modifiée par SWCNT-JUG-NH2 et par la sonde GEM conformément à l'exemple 7. Trait continu : avant hybridation ; Trait pointillé : après incubation avec le brin non-complémentaire RAND.
EXEMPLE 1 : SYNTHESE DE LA 3-[(2-AMINOETHYL)SULFANYL)]-5- HYDROXY-1.4-NAPHTOQUINONE
Figure imgf000022_0001
Cystéamine 3 - [(2- aminoethyl) suif anyl) ] - 5 - 5-amino- 1 ,4- (2-aminoethanethiol) hydroxy- naphtoquinone 1 ,4-naphtoquinone
450 mg (2,6. 10" moles) de 5-hydroxy-l,4-naptoquinone (Juglone) sont dissous dans 25 mL d'éthanol. La solution est placée sous ultrasons pendant 10 minutes puis chauffée sous agitation jusqu'à 45°C. Une solution contenant 174 mg (2,26 .10" moles) de cystéamine (2-aminoethanethiol) dans 10 mL d'éthanol est alors ajoutée. Après 10 minutes de réaction, le chauffage et l'agitation sont arrêtés. La solution est ensuite placée à - 18°C pendant 48 heures, puis lavée par de l'éthanol froid (-18°C) sous filtration sous vide, et le solide récupéré.
On obtient 250 mg environ de produit sous forme d'un solide de couleur orangée.
Le produit est ensuite purifié par recristallisation dans l'éthanol, puis analysé par RMN. On obtient en 1H RMN (CDCl3)ô ppm : 14,54 (1 H) ; 7,59 - 7,40 - 7,16 (3ΗΆΙ) ; 6,60 (lHar) ; 4,31 (2H-CH2) ; 3,00 (2H-CH2) ; aminé non visible en RMN mais visible en IRTF (Figure 5).
EXEMPLE 2 : ELECTRO-GREFFAGE DE LA 3-[(2-AMINOETHYL)SULFANYL)]-5- HYDROXY-l,4-NAPHTOQUINONE (JugThioNH2)
2.1. Greffage
2.1.1. Mode opératoire
La 3-[(2-aminoethyl)sulfanyl)]-5-hydroxy- l,4-naphtoquinone (JugThioNH2) est dissoute à la concentration de 5.10"4 M dans 20 mL d'une solution d'acétonitrile (ACN) ou de diméthylformamide (DMF) + L1CIO4 5.10" M. La solution est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3 électrodes (référence (REF), auxiliaire (AUX), de travail (WORK)). La REF est une électrode à calomel saturé (ECS). Un potentiel de +0,7 V / ECS ou un balayage de potentiel entre 0 et 0,7 V, à 50 mV.s"1 est imposé à la WORK pendant 30 s, et le courant est enregistré.
A l'issue de l'un ou l'autre de ces traitements, l'électrode WORK est rincée à l'acétonitrile ou au diméthylformamide (DMF), puis séchée par un courant d'argon.
2.1.2. Résultats
Ils sont donnés dans les figures 1 et 2.
La figure 1 correspond au courant mesuré pendant Γ électrooxydation potentiostatique à +0,7 V, dans les conditions décrites au point 2.1.2, et présente l'allure caractéristique de ce type de procédure.
La figure 2 correspond quant à l'oxydation par 6 balayages cycliques de potentiels, dans les conditions décrites au point 2.1.2. On note la présence d'un courant d'oxydation décroissant régulièrement, témoignage du dépôt progressif de la JugThioNH2 sur la surface.
2.2. Mise en évidence du greffage
2.2.1. Caractérisations électrochimiq ues
2.2.1.1. Mode opératoire
L'électrode WORK (figure 3, courbe a) modifiée par électrooxydation, comme indiqué dans l'exemple 1.1.2 est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3 électrodes contenant une solution de tampon phosphate (PBS, Phosphate Buffer Saline) de pH 7,4, puis un balayage de potentiel aller-retour est imposé entre 0 V et -0,65 V/ECS à 50 mV.s"1. Le courant est enregistré et représenté sur la figure 3, courbe (a).
Comme référence, la courbe (b) correspond à une autre électrode WORK (notée b) auparavant trempée dans une solution de JugThioNH2 mais n'ayant été soumise à aucun potentiel d'oxydation (tout autre paramètre étant identique par ailleurs).
2.2.1.2. Résultats
Ils sont donnés dans les figures 3 à 5.
L'électrode non soumise à un potentiel ne donne qu'un signal capacitif et aucun signal faradique (figure 3, courbe b). En revanche, les résultats montrent Γ électroactivité bien définie de l'électrode préparée selon l'invention (figure 3, courbe a) dans la zone d' électroactivité de la JugThioNH2.Ceci montre le greffage de JugThioNH2 sur la surface de l'électrode.
La densité surfacique de JugThioNH2 électroactive a été mesurée par intégration des courants faradiques, et est égale à 1,9+0,3 x 10 -"10 mol cm -"2. Cette valeur est à comparer avec celle obtenue dans le cas de la formation de monocouches auto-assemblées de juglone modifée par un groupement alkylthiol (G. March et al, JACS 2008, 130,15752), pour lesquelles la densité surfacique a été mesurée à 2,2+0,3 x 10"10 mol cm" . La couche électrodéposée de JugThioNH2 est donc assimilable à une monocouche.
Une dernière caractérisation électrochimique permet de confirmer que la surface est modifiée par une monocouche de JugThioNH2. En effet, les potentiels des pics (anodique, à -0,5 V/ECS et cathodique à -0,55 V/ECS) sont indépendants de la vitesse de balayage. D'autre part, leurs intensités varient linéairement avec la vitesse de balayage (cf. Figure 4 a) et non pas linéairement en fonction de la racine carrée de la vitesse de balayage (cf. Figure 4 b), ce qui est un comportement classique d'une électrode modifiée par une monocouche. Le courant est limité par le transfert électronique entre la monocouche électroactive et le substrat d'électrode, et non par la diffusion d'une espèce à l'intérieur de la couche organique.
2.2.2. Caractérisation spectroscopique
2.2.2.1. Mode opératoire
Une analyse de surface par spectroscopie infrarouge à modulation de polarisation (PM-IRRAS) a été utilisée afin de démontrer la présence de JugThioNH2 sous forme de monocouche à la surface de l'électrode (Figure 5, courbe a) En référence, la courbe b montre le spectre infrarouge de la molécule JugThioNH2, avant greffage.
2.2.2.2. Résultats
Ils sont donnés dans la figure 5.
La similarité entre les 2 spectres (a) et (b) démontre l'intégrité de la JugThioNH2 greffée en surface. Les 2 différences marquées concernent la chaîne alkyle, particulièrement visible entre 3000 et 2800 cm"1 sur le spectre PM-IRRAS (ceci probablement du fait de l'orientation de cette chaîne perpendiculairement à la surface d'électrode) et un pic centré à 1100 cm"1, attribuable à la présence d'anions perchlorate C104 " utilisés comme électrolyte lors de Γ électro-oxydation.
EXEMPLE 3 : ELECTRO-GREFFAGE D'UN OLIGOPEPTIDE. APPLICATION A LA PROTEINE HPV-16-L1. La protéine Ll est une protéine majeure du virus HPV de type 16. Il est maintenant connu que l'infection par le HPV est un facteur de risque au développement de cancer du col de l'utérus, notamment par les types 16 et 18. L'infection par le HPV- 16 engendre la production d'anticorps spécifiques anti-HPV-16. La protéine Ll faisant partie de la capside, enveloppe du génome du virus, les anti-HPV-16 présentent une affinité spécifique pour cette protéine. Cette spécificité est conservée pour certaines séquences courtes de cette protéine, et notamment pour une séquences de 15 acides aminés nommées 311-325, dont la séquence est présentée ci-dessous (N-terminal à gauche):
HPV-16-L1-311-325 : Asn-Leu-Ala-Ser-Ser-Asn-Tyr-Phe-Pro-Thr-Pro-Ser-Gly-Ser-Met
L' aminé terminale de l'asparagine (Asn) peut ainsi être utilisée pour Γ électro-greffage sur une électrode. Aucun autre acide aminé de cette séquence ne porte d' aminé aliphatique disponible.
3.1. Greffage
3.1.1. Mode opératoire
La séquence HPV-16-L1-311-325 est dissoute à la concentration de 5.10" M dans 20 mL d'une solution aqueuse neutre de PBS. La solution est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3 électrodes (REF, AUX, WORK). La REF est une électrode à calomel saturé (ECS). Un potentiel de +0,5 V / ECS est imposé à la WORK pendant 600 s. A l'issue de ce traitement, l'électrode WORK est rincée à l'eau puis séchée sous un courant d'argon.
3.2 Mise en évidence du greffage
3.2.1. Mode opératoire
Différentes concentrations de l'oligopeptide ont été utilisées, de 0,25.10"6 M à 10.10"6 M. L'électrode WORK modifiée est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3
-3
électrodes contenant une solution (appelée ferri/ferro) de K4Fe(CN)6 10"JM et K3Fe(CN)6 10" M dans le PBS, puis lui est imposé un balayage de potentiel entre -0,4 V et +0,5 V/ECS à 50 mV.s"1 et le courant enregistré.
Une électrode WORK non modifiée est également utilisée dans les mêmes conditions.
3.2.2. Résultats
Ils sont donnés dans la figure 6. Ils montrent un blocage électrochimique partiel de l'électrode traitée par la protéine Ll, dépendant de la concentration en protéine dans la solution d' électro-greffage, tous paramètres égaux par ailleurs. Ceci démontre le greffage de la protéine Ll à la surface de l'électrode (figure 6 courbes a à d). L'électrode non modifiée (figure 6, courbe e) concserve, elle, Γ électroactivité typique de la sonde ferri/ferro mise en solution.
EXEMPLE 4 : CO-ELECTRO-GREFFAGE DE L'OLIGOPEPTIDE HPV-16-L1 ET DU MARQUEUR REDOX JUG-THIO-NH2. APPLICATION A LA DETECTION D'UN ANTICORPS ANTI-HPV-16.
4.1. Détection indirecte de l'anticorps anti-HPV-16
4.1.1. Mode opératoire
L'anticorps anti-HPV-16 utilisé est un anticorps monoclonal de souris (AbD Serotec, Morphosys, Allemagne).
L'électrode préalablement traitée par électro-greffage de l'oligopeptide HPV-16-L1- 311-325 (comme indiqué dans l'Exemple 3) a été incubée 1 h à 37°C dans 5 mL de PBS dans lequel a été ajouté 0,1 · g d'anticorps anti-HPV-16. A l'issue de ce traitement, l'électrode est brièvement rincée au PBS à 37 °C, puis plongée dans une solution de K4Fe(CN)6 10"JM et K3Fe(CN)6 10"3M dans le PBS. On impose un balayage de potentiel entre -0,4 V et +0,5 V/ECS à 50 mV.s"1 et le courant enregistré.
4.1.2. Résultats
Ils sont donnés dans la figure 7.
La courbe (a) présente la signature rédox du couple ferri-ferro après incubation avec l'anticorps anti-HPV-16, comme exposé ci-dessus.
Deux témoins sont présentés pour comparaison : la même électrode portant l'oligopeptide avant incubation avec Γ anti-HPV-16 (courbe b), et la même électrode avant modification par l'oligopeptide HPV-16-L1 (courbe c). La diminution des courants rédox après incubation avec l'anticorps anti-HPV-16 démontre la complexation de l'anticorps sur la surface (par blocage stérique partiel),
4.2. Détection directe de l'anticorps anti-HPV-16
4.2.1. Mode opératoire Le co-électro-greffage de la sonde HPV-16-L1 et du transducteur JUG est réalisé en deux temps. Premièrement, l'électrode WORK est modifiée par JugThioNH2, comme décrit dans l'exemple 2. Deuxièmement, cette même électrode est à nouveau modifiée par HPV-16- Ll, comme décrit dans l'exemple 3.
Cette fois-ci, aucun couple rédox (ferri/ferro) n'est rajouté en solution, puisque c'est le transducteur immobilisé JUG-Thio-NH2 qui joue ce rôle. La voltamétrie à vague carrée (SWV) a été utilisée pour caractériser ces greffages successifs.
4.2.2. Résultats
Ils sont donnés dans les figures 8 A et 8B.
Figure 8A, la courbe en trait plein montre la réponse électrochimique d'une l'électrode (dans le domaine d' électroactivité du transducteur JUG-Thio-NH2) non modifiée par la sonde HPV-16-L1. La courbe en trait discontinu montre le résultat obtenu après électrogreffage de la sonde HPV-16-L1 (mais sans anticorps). La courbe en trait pointillé montre le résultat obtenu après incubation d'une électrode non modifiée par HPV-16-L1 avec l'anti-HPV 16, à la concentration de 1.10 -"8 M. Cette courbe montrent l'absence de complexation de l'anticorps anti-HPV-16, lorsque la sonde de complexation est absente.
Figure 8B, la courbe en trait plein montre le résultat obtenu après électrogreffage de la sonde HPV-16-L1 (mais sans anticorps). La courbe en trait discontinu montre le résultat obtenu après incubation de l'électrode modifiée par HPV-16-L1 avec l'anti-HPV 16, à la concentration de 1.10"11 M. La courbe en trait pointillé montre le résultat obtenu après incubation de l'électrode modifiée par HPV-16-L1 avec l'anti-HPV 16, à la concentration de 1.10"8 M.
La méthode selon l'invention permet donc de mettre en évidence la complexation de l'anticorps sur l'antigène correspondant, sélectivement avec une sensibilité satisfaisante. 4.3. Sensibilité
4.3.1. Mode opératoire
Les conditions sont reprises des résultats ci-dessus. On utilise, pour l'étape d'incubation, l'anti-HPV- 16 à des concentrations croissantes allant de 1.10 -"11 M à 1.10 -"8 M
4.3.2. Résultats
Ils sont donnés dans les figures 9, donnant la variation de courant relative en fonction de la quantité d'anticorps spécifiques ajoutée. Compte-tenu de ces résultats, la sensibilité de la méthode est de l'ordre de 0,1 nM. EXEMPLE 5 : ELECTRO-GREFFAGE D'UN OLIGONUCLEOTIDE AMINO- MODIFIE
5.1. Greffage
5.1.1. Mode opératoire
On utilise l'oligonucléotide GEM-C6-NH2 portion de gène TAG du virus HIV et dans lequel une aminé aliphatique primaire est disponible en position terminale 3', sur un espaceur aliphatique C6 (Eurogentec, Belgique). Il est représenté par la séquence suivante :
5' -TCG CAC CCA TCT CTC TCC TTC TAG CCT- 3 '-Ce - NH2
L'oligonucléotide (ODN) est dissous à la concentration de 5.10"6 M dans 20 mL d'une solution aqueuse neutre de tampon phosphate salin (PBS). La solution est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3 électrodes (référence (REF), auxiliaire (AUX), de travail (WORK)). La REF est une électrode à calomel saturé (ECS). Un potentiel de +0,5 V / ECS est imposé à la WORK pendant 300 s. Une autre méthode consiste à imposer un balayage de potentiel en 0 V et 0,6 V/ECS, pendant quelques cycles.
5.1.2. Résultats
Ils sont donnés dans la figure 10.
Un pic irréversible d'oxydation est clairement visible lors du premier balayage (1er cycle), avec un maximum de courant vers +0,43 V/ECS. Lors des cycles suivants, les potentiels de pic se décalent vers la droite et les courants diminuent. Ceci témoigne de Γ électro-greffage progressif de l'ODN en surface de l'électrode.
A l'issue de ce traitement, l'électrode WORK est rincée à l'eau puis séchée sous un courant d'argon.
5.2. Mise en évidence du greffage
52.1. Mode opératoire
L'électrode WORK modifiée comme indiqué ci-dessus est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3 électrodes contenant une solution de K4Fe(CN)6 10"JM et K3Fe(CN)ô 10" M dans le PBS, puis lui est imposé un balayage de potentiel entre -0,2 V et +0,4 V/ECS à 50 mV.s"1 , et le courant est enregistré. Une électrode WORK sur laquelle l'ODN sonde n'a pas été électrooxydé est également utilisée dans les mêmes conditions.
5.2.2. Résultats
Les résultats sont donnés dans la figure 11.
Ils montrent un blocage électrochimique partiel de l'électrode traitée par l'ODN (figure 12, courbe a), tandis qu'aucun blocage n'est visible pour l'électrode non traitée par l'ODN (figure 12, courbe b). Ceci témoigne de Γ électrogreffage de l'ODN sur la surface de l'électrode.
EXEMPLE 6 : CO-ELECTRO-GREFFAGE D'UN OLIGONUCLEOTIDE AMINO- MODIFIE (GEM-C6-NH2) ET DU TRANSDUCTEUR JUG-THIO-NH2 APPLICATION COMME BIOCAPTEUR ELECTROCHIMIQUE A ADN.
Comme pour l'exemple 4, il est possible de co-immobiliser deux molécules différentes. Par exemple, une biomolécule (l'ODN) et une molécule électroactive susceptible de jouer le rôle de transducteur lors d'une reconnaissance moléculaire. La JugThioNH2 est une molécule électroactive susceptible de jouer le rôle de transducteur lors d'une hybridation entre le brin sonde GEM-CÔ-NH2 et un brin cible complémentaire.
6.1. Co- greffage
6.1.1. Mode opératoire
Le co-électro-greffage est réalisé en deux temps. Premièrement, l'électrode WORK est modifiée par JugThioNH2, comme décrit dans l'exemple 2. Deuxièmement, cette même électrode est à nouveau modifiée par GEM-C6-NH2, comme décrit dans l'exemple 5.
La voltamétrie à vague carrée (SWV) a été utilisée pour caractériser ces greffages successifs.
6.1.2. Résultats
Ils sont donnés dans la figure 12.
La courbe (a) de la figure 12 correspond à une électrode modifiée uniquement par JugThioNH2 (sans ODN sonde), tandis que la courbe (b) de la figure 12 correspond à l'électrode portant à la fois la sonde GEM-C6-NH2 et la JugThioNH2. Les résultats montrent que le greffage du GEM-C6-NH2 modifie légèrement Γ électroactivité de la JugThioNH2, qui diminue sensiblement. 6.2. Hybridation et caractérisation
6.2.1. Mode opératoire
L'hybridation d'un brin cible complémentaire sur le brin sonde électro greffé peut être signée par la modification de Γ électroactivité du rapporteur électroactif JugThioNH2.
Le brin complémentaire est ici noté HIV. Un brin portant un mésappariement a également été utilisé, noté MHIV.
HIV : 3' -C GTG GGT AGA GAG AGG AAG A- 5' MHIV : 3' -C GTG GGT AAA GAG ATG AAG A- 5'
Les conditions d'hybridation sont les suivantes : brins cibles à 0,1.10"6 M dans PBS pendant 2h à 55°C, puis la température est laissée retomber jusqu'à l'ambiante (pour le HIV et le brin MHIV). Les électrodes sont ensuite rincées dans PBS à 37°C pour éliminer l'adsorption non spécifique.
6.2.2. Résultats
Ils sont donnés dans la figure 13.
La courbe notée GEM correspond à l'électrode avant hybridation. Après hybridation avec le brin complémentaire HIV, on observe une augmentation du courant de pic (courbe du haut), tandis que l'ajout d'un brin mésapparié n'engendre pas de variation significative (courbe notée MHIV). Le brin cible complémentaire est donc reconnu sélectivement, par un signal positif.
EXEMPLE 7 : ELECTRO-GREFFAGE DE NANOTUBES DE CARBONE (CNT)
7.1. Mode opératoire
7.1.1. Modification chimique
Les nanotubes de carbone utilisés sont de type mono-parois (SWNT, dia.2-10 nm, longueur 1-5 microns).
Les SWNT sont oxydés dans le mélange d'acide sulfurique et nitrique (3: 1) afin d'en réduire la longueur et d'y introduire des fonctions -COOH. Les nanotubes obtenus (SWNT- COOH) sont ensuite traités par SOCl2 pour transformer les fonctions -COOH en fonctions -COQ (chlorure d'acyle). Les SWNT-COC1 sont ensuite dispersés dans un mélange de Jug- NH2 et NH2-(CH2)3-NH2 (10"3M), pour y greffer ces deux molécules.
Le schéma réactionnel de la synthèse des CNT-JUG-NH2 est le suivant :
Figure imgf000031_0001
Plusieurs aminés aliphatiques sont donc disponibles en surface des CNT.
Greffage et Mise en évidence du greffage
2 mg de CNT-JUG-NH2 sont mis en suspension dans 20 mL d'une solution de DMF + LiC104 10"1 M. La solution est introduite dans une cellule électrochimique classique à 3 électrodes (REF, AUX, WORK). La REF est une électrode à calomel saturé (ECS). Un potentiel de +0,5 V / ECS est imposé à la WORK pendant 600 s. A l'issue de ce traitement, l'électrode WORK est rincée dans le DMF et l'EtOH, puis séchée sous un courant d'argon. L'électrode est ensuite caractérisée par voltamétrie cyclique, dans un milieu PBS.
7.1.3. Application : détection électrochimique de l'hybridation d'ADN
Les SWCNT-JUG-NH2 sont utilisés comme des nanoélectrodes individuelles, pour y greffer une sonde d'hybridation, selon une approche sensiblement équivalente à celle exposée dans l'Exemple 6 (les mêmes séquences sonde et cibles sont utilisées : sonde GEM représentée par la séquence suivante : 5' -TCG CAC CCA TCT CTC TCC TTC TAG CCT- 3', cibles HIV et non-complémentaire).
Les conditions de greffage sont différentes ; la sonde GEM restant native (n'étant pas modifiée par un groupement aminé), on exploite alors la réactivité du groupe phosphate terminal, pour un couplage avec l'aminé portée par les SWCNT. L'électrode est plongée dans une solution aqueuse de 2-méthyl-imidazole (MIA) (v/v =1/1) avec 10"3M EDC et 10"6M d'ODN GEM, pendant 12h à 60 °C. L'électrode est ensuite rincée dans le PBS pendant 30 min.
La caractérisation de l'hybridation se fait ensuite par voltammétrie à vague carrée
(SWV)
Les conditions d'hybridation sont les suivantes : brins cibles à 0,1.10"6 M dans PBS pendant 2h à 55°C, puis la température est laissée retomber jusqu'à l'ambiante. Les électrodes sont ensuite rincées dans PBS à 37°C pour éliminer l'adsorption non spécifique.
Un contrôle est systématiquement réalisé, en considérant la réponse après incubation dans une solution contenant non pas le brin complémentaire, mais une séquence non- complémentaire aléatoire (RAND). Les conditions d'hybridation sont identiques à celles décrites précédemment.
7.2. Résultats
Ils sont donnés dans les figures 14 à 17
Après électrogreffage des nanotubes de carbone fonctionnalisés par JUG-NH2, il apparaît un couple rédox fin et réversible entre -0,8 V et -0,35 V, typique du groupe JUG (figure 14).
On observe une nette différence entre le voltammogramme avant (figure 15, courbe en trait plein) et après (figure 15 courbe en trait pointillé), greffage de la sonde GEM. Ceci témoigne des interactions entre la sonde GEM et le transducteur JUG-NH2.
La figure 16 présente le résultat obtenu après hybridation avec le brin complémentaire HIV, caractérisé par voltammétrie à vague carrée (SWV), La courbe en trait continu présente la réponse de l'électrode avant hybridation, tandis que la courbe pointillée présente la réponse après hybridation, pour laquelle observe une nette augmentation du courant de pic(signal positif). En revanche (résultats exposés sur la figure 17),on n'observe aucune augmentation du courant de pic après incubation avec le brin non complémentaire RAND (courbe en trait plein, avant incubation : courbe en trait pointillé, après incubation). Ceci montre qu'il n'y a pas hybridation. On peut donc dire, d'après les figure 16 et 17, que le brin cible complémentaire est reconnu sélectivement, tandis que le brin non complémentaire n'est pas reconnu.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de détection comprenant :
- au moins un transducteur, comprenant une fonction aminé primaire aliphatique liée à une quinone, ou à un dérivé de quinone, par un atome de carbone ou un hétéroatome d'une chaîne carbonée,
- au moins un récepteur possédant une fonction aminé primaire aliphatique,
- éventuellement un nanotube de carbone fonctionnalisé, et
- un support conducteur électrique,
et dans lequel
ledit au moins un transducteur et ledit au moins un récepteur sont respectivement liés de façon covalente au support ou au nanotube de carbone, par Γ électrooxydation d'au moins une de leurs fonctions aminé primaire aliphatique, et
ledit nanotube de carbone est lié de façon covalente au support.
2. Dispositif de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le transducteur est un composé correspondant à la formulé I suivante :
Figure imgf000033_0001
dans laquelle
n est égal à 0 ou 1,
m est égal à 0 ou 1,
RI, R2, R3, R4, R5, et R8 indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi : H, O, S, , N02, , OH, COOH, SH, et un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, cyclique ou,
R6 et R7 indépendamment l'un de l'autre sont choisis parmi :
- H, O, S, NO2, OH, COOH, SH, un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, ou cyclique, un groupe
Figure imgf000034_0001
avec p représentant un nombre entier variant de 0 à 12 et X étant choisi parmi CH2, O, NH, S, et
! , indépendamment les unes des autres, représentent des liaisons covalentes simples ou doubles selon la nature des groupements RI, R2, R3, R4, R5,
R6, R7 et R8 et selon les valeurs de m et n,
à condition que l'un au moins des groupes R6 et R7 représente un groupe pj Ν^^χ^
3. Dispositif de détection selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le transducteur correspond à la formule II suivante :
Figure imgf000034_0002
dans laquelle
RI, R2, R3, et R4, indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi : H, O, S, N02, OH, COOH, SH et un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, ou cyclique,
R9 et RIO indépendamment l'un de l'autre sont choisis parmi :
- H, O, S, N02, OH, COOH, SH,
un groupement de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire, ramifié, cyclique ou aromatique, ou
- un groupe ¾N^X^ avec p représentant un nombre entier variant de 0 à 12 et X étant choisi parmi CH2, O, NH, S, et les liaisons | : indépendamment les unes des autres, représentent des liaisons covalentes simples ou doubles selon la nature des groupements RI, R2, R3, R4, R9 et RIO.
4. Dispositif de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le récepteur est un composé susceptible d'entrer dans un processus d'association sélectif avec un ligand, ledit ligand étant choisi parmi les peptides, les protéines, les polynucléotides naturels ou artificiels et les petites molécules organiques d'intérêts biologiques.
5. Dispositif de détection selon la revendication 4, caractérisé en ce que le récepteur est un composé choisi parmi :
- un peptide,
- une protéine de structure
- une protéine de reconnaissance (Antigène/ Anticorps)
- une protéine à activité catalytique (enzyme)
- un oligonucléotide,
- un polynucléotide,
- un oligonucléotide aptamère,
- un acide ribonucléique,
- un oligosaccharide,
- un polysaccharide,
- un composé pharmacologiquement actif,
- un composé phytosanitaire,
- une petite molécule immunogène.
6. Dispositif de détection selon la revendication 1 caractérisé en ce que le nanotube de carbone fonctionnalisé est fonctionnalisé avec au moins une fonction aminé primaire aliphatique.
7. Dispositif de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est un matériau conducteur ou semi-conducteur ayant une résistivité comprise entre 106 et 10"10
Ohm.m, notamment 10 4 et 10-"8 Ohm.m, notamment 103 et 10-"8 Ohm.m.
8. Dispositif de détection selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le support est choisi parmi les métaux, le carbone vitreux, les encres conductrices déposées sur support et les métaux déposés sur support.
9. Procédé de préparation d'un dispositif de détection comprenant un support, un transducteur, un récepteur, et éventuellement un nanotube de carbone fonctionnalisé, et caractérisé en ce que ledit procédé comprend :
- au moins une étape de greffage du transducteur sur le support ou le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique fonctionnalisant ledit transducteur, sur respectivement ledit support ou ledit nanotube de carbone
- au moins une étape de greffage du récepteur sur le support ou le nanotube de carbone, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique fonctionnalisant ledit récepteur, sur respectivement ledit support ou ledit nanotube de carbone, et
- éventuellement une étape de greffage du nanotube de carbone sur le support, ledit greffage étant la création d'une liaison covalente par Γ électrooxydation d'une aminé primaire aliphatique fonctionnalisant ledit nanotube de carbone, sur ledit support.
10. Procédé de préparation d'un dispositif de détection selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration de récepteur par rapport à la surface de support, ou de nanotube de carbone fonctionnalisé, est d'environ 10 -"13 à 10 -"9 mol. cm -"2 , notamment d'environ 10 -"13 à 10 -"11 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"11 à 10 -"9 mol.cm -"2 , lors de l'étape de greffage du récepteur respectivement sur le support, ou sur le nanotube de carbone.
11. Procédé de préparation d'un dispositif de détection selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration de nanotube de carbone fonctionnalisé par rapport à la surface de support est d'environ 10 -"11 à 10 -"14 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"11 à 10 -"12 mol.cm -"2 , notamment d'environ 10 -"12 à 10 -"14 mol.cm -"2 , lors de l'étape de greffage du nanotube de carbone fonctionnalisé sur le support.
12. Procédé de préparation d'un dispositif de détection selon la revendication 9 caractérisé en ce que le potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, ou au nanotube de carbone, lors de l'étape de greffage du transducteur respectivement sur ledit support, ou sur ledit nanotube de carbone, est d'environ 0 à 1,5 V/ECS, notamment d'environ 0 à 1 V/ECS, notamment d'environ 0,3 à 0,7 V/ECS.
13. Procédé dé préparation d'un dispositif de détection selon la revendication 9 caractérisé en ce que le potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, ou au nanotube de carbone, lors de l'étape de greffage du récepteur respectivement sur ledit support, ou sur ledit nanotube de carbone, est d'environ 0 à 1,5 V/ECS, notamment d'environ 0 à 1 V/ECS, notamment d'environ 0,3 à 0,7 V/ECS.
14. Procédé de préparation d'un dispositif de détection selon la revendication 9 caractérisé en ce que le potentiel d'oxydation électrochimique appliqué au support, lors de l'étape de greffage du nanotube de carbone fonctionnalisé sur ledit support, est d'environ 0 à 1,5 V/ECS, notamment d'environ 0 à 1 V/ECS, notamment d'environ 0,3 à 0,7 V/ECS.
15. Procédé de préparation d'un dispositif de détection selon l'une quelconque des revendications 10, 12 et 13 comprenant un support, un transducteur, et un récepteur, caractérisé en ce que le support est une électrode sérigraphiée, et en ce que les étapes de greffage du récepteur et du transducteur sur ladite électrode sérigraphiée sont réalisés
- durant environ 10 secondes à environ 120 secondes, notamment environ 30 secondes à environ 90 secondes, particulièrement environ 60 secondes,
- à un potentiel d'environ 0,1 V à environ 2 V, notamment environ 0,5 V à environ 1 V, particulièrement environ 0,7 V, et
- à une température d'environ 10°C à environ 35°C, notamment d'environ 15°C à environ 25°C, particulièrement environ 20°C.
16. Dispositif de détection susceptible d'être obtenu selon la mise en œuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15.
17. Utilisation d'un dispositif de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la misé en œuvre de la détection d'un ligand du récepteur dans un milieu de détection, par observation d'une modification significative de Γ électro-activité du transducteur par une méthode de mesure électrochimique.
18. Utilisation d'un dispositif de détection selon la revendication 17, caractérisé en ce que le ligand détecté est choisi parmi :
- un peptide,
- une protéine de structure
- une protéine de reconnaissance (Antigène/ Anticorps)
- une protéine à activité catalytique (enzyme)
- un oligonucléotide,
- un polynucléotide,
- un oligonucléotide aptamère,
- un acide ribonucléique,
- un oligosaccharide,
- un polysaccharide,
- un composé pharmacologiquement actif,
- un composé phytosanitaire,
- une petite molécule immunogène.
19. Utilisation d'un dispositif de détection selon l'une quelconque des revendications 17 et 18, caractérisé en ce que le ligand à détecter est présent à une concentration d'environ 300 fmol.L"1 à environ 1 mmol.L"1, notamment d'environ 1 pmol.L 1 à environ 1 « moLL 1, notamment d' environ 10 pmol.L"1 à environ 100 nmol.L"1
20. Utilisation d'un dispositif de détection selon l'une quelconque des revendications 17 à 19 caractérisé en ce que le potentiel appliqué au support lors de la détection d'un ligand est d'environ 0,2 à -1,6 V / ECS, notamment d'environ 0 à -1,5 V / ECS, notamment d'environ -0,2 à -1,2 V / ECS.
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