WO2011154581A1 - Variante estructural de la hemoglobina - Google Patents
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- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
Definitions
- the present invention falls within the field of medicine, in particular, within the structural variants of hemoglobin that interfere with the methods of determining the levels of glycosylated hemoglobin in a biological sample and therefore of the methods of obtaining Useful data for the diagnosis and / or follow-up of diseases that occur with alterations in glycosylated hemoglobin levels, specifically diabetes mellitus.
- Glycosylated hemoglobin or HbAic is a hemoglobin in which glucose specifically binds to the N-terminal valine of the hemoglobin ⁇ chain, in a non-enzymatic and irreversible process.
- This hemoglobin is a biochemical marker used routinely for the evaluation and control of individuals with diabetes mellitus, since the value obtained after quantification is directly related to the patient's blood glucose levels of the last 3-4 months, for which is useful for the prediction of possible complications related to this disease, for the monitoring of the patient's treatment and even for its diagnosis.
- the accuracy of the methods for determining the HbAic level can be affected by the presence of hemoglobin variants in the patient studied.
- HbAic hemoglobin
- HbVar a date of human hemoglobin variants and thalassemias. Http://globin.cse.psu.edu/cgi-bin/hbvar/counter ).
- HbF and HbS, HbE, HbC and HbD which are encoded by the substitution of a single amino acid in the ⁇ chain.
- variants of this type are the so-called Hb Baylor, encoded by the substitution of a Leu for an Arg in residue 81 (EF5) of ⁇ globin, or Hb La Roche-sur-Yon, encoded by the substitution of a Leu for a His in that same position.
- Hb Baylor encoded by the substitution of a Leu for an Arg in residue 81 (EF5) of ⁇ globin
- Hb La Roche-sur-Yon encoded by the substitution of a Leu for a His in that same position.
- the techniques used in the determination of HbAic values have been optimized so that they are able to detect and correct the interference caused by the values of these other known Hb variants with the values obtained for HbAic, which allows , therefore, obtain values of the latter normalized and useful for the diagnosis and / or monitoring of diabetes mellitus.
- HbAic quantification values can be falsely increased or decreased depending on the analytical technique used and the type of hemoglobinopathy present in the patient (Bry L. et al., 2001, Clinical Chemistry, 47 (2): 153-163).
- methods used to measure HbAic levels those commonly employed are four, namely immunoassay, HPLC (High-Performance Liquid Chromatography), boronate affinity and enzymatic assays.
- the present invention provides a new structural variant of hemoglobin, of SEQ ID NO: 1, hereafter referred to as "peptide of the invention", as well as a method of obtaining useful data for the diagnosis and / or monitoring of diseases that occur with alterations in the levels of glycosylated hemoglobin or HbAic, and more specifically of diabetes mellitus, in an individual expressing the peptide of the invention.
- Said method comprises normalizing the value obtained for the expression level of hemoglobin, preferably HbAic, in a biological sample isolated from an individual as a function of the value obtained for the expression level of the peptide of the invention in that same biological sample.
- Hb has been isolated and characterized which is encoded by the change of a hydrophobic apolar amino acid, Leu, for another of the same characteristics, Phe, at position 81 of ⁇ globin .
- This change responds to a mutation (replacement of CTC by TTC) in codon 81 (EF5) of the ⁇ globin gene.
- the amino acid sequence of said Hb or peptide of the invention is SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 1 is preferably SEQ ID NO: 2.
- This modification does not affect the function or stability of the peptide of the invention with respect to normal HbA or Hb, although it causes structural changes that confer characteristics that allow its detection by electrophoretic and chromatographic methods.
- Hb levels detect not only this but also the peptide of the invention in those isolated biological samples of individuals who express it.
- the expression values of the latter interfere with the expression values of the former, offering results of quantification of Hb, preferably HbAic, altered that do not correspond to the real ones.
- the present invention provides a method of obtaining useful data, hereinafter "method of the invention", for the diagnosis and / or monitoring of diseases that occur with alterations in Hb levels, preferably HbAic, which comprises quantifying the amount of peptide of the invention in an isolated biological sample of an individual in which the amount of Hb of interest, preferably HbA ⁇ , whose value is desired to be known as being relevant for diagnosis has also been quantified and / or follow-up of the disease to study. Then, in said method the expression values of the latter Hb are normalized according to the expression values of the peptide of the invention.
- the interference produced by the expression values of the peptide of the invention in the expression values of the Hb of interest, preferably HbAic, is eliminated, thus obtaining useful data for the correct diagnosis and / or monitoring of these diseases, preferably of diabetes mellitus, in patients expressing the peptide of the invention.
- one aspect of the invention relates to an isolated peptide, or "peptide of the invention", which comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
- Another aspect of the invention relates to an isolated polynucleotide encoding SEQ ID NO: 1, or to a nucleotide sequence complementary to said isolated polynucleotide.
- the isolated polynucleotide encoding SEQ ID NO: 1 comprises the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.
- the peptide of the invention elutes together with other hemoglobins, such as, but not limited to, HbAiC, HbAia, HbAib, Hb F, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, HbA 2 or Hb X, in the methods of determining the levels of expression thereof, such as in HPLC, as shown by the examples of the present invention.
- hemoglobins such as, but not limited to, HbAiC, HbAia, HbAib, Hb F, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, HbA 2 or Hb X
- Hb refers to either normal HbA or Hb, which is a blood heteroprotein, of molecular weight 64,000 Daltons (64 kD), of red color, which It carries oxygen from the respiratory organs to tissues, in vertebrates and some invertebrates, and which is formed by four polypeptide chains (globins) to each of which a heme group is attached, whose iron atom is able to bind in a way reversible to oxygen; as with any structural variant of Hb or chemically modified derivatives thereof.
- hemoglobin is glycosylated hemoglobin or HbAi, including all variants thereof, such as, but not limited to, HbAia, HbAi bo HbAic; Fetal HbF or Hb, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, Hb X, carboxyhemoglobin, carbaminohemoglobin, methemoglobin, oxyhemoglobin, Hb La Roche-sur-Yon, Hb Baylor, HbS, HbE, HbC, HbD, Hb D -Punjab, Hb O-Arab, Hb G- Philadelphia, Hb Hasharon, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb M or HbA 2.
- hemoglobin is glycosylated hemoglobin or HbAic, which is a hemoglobin that has a glucose specifically bound to the N
- HbA control values taken from a reference sample from a healthy individual are between 13.8 and 17.2 g / dl in men and between 12, 1 and 15, 1 g / dl in women.
- the HbAiC control values taken from a reference sample from a healthy individual are between 2.2 and 4.8% in adult individuals and between 1, 8 and 4% in children.
- diseases that occur with alterations in hemoglobin levels are, but not limited to, anemia or, in general, any type of hemoglobinopathy, meaning "hemoglobinopathy” the group of inherited disorders in which there is an abnormal structure and / or production of the hemoglobin A molecule.
- diseases that occur with alterations in HbAic levels are, but are not limited to, diabetes mellitus, hemolytic anemia, kidney disease or chronic blood loss. In a more preferred embodiment of this aspect of the invention, the disease that occurs with alterations in HbAic levels is diabetes mellitus.
- diabetes mellitus refers to the group of metabolic disorders that affects different organs and tissues, lasts a lifetime and is characterized by an increase in blood glucose levels (hyperglycemia) with respect to control values taken from a reference sample from a healthy individual.
- the control values of glucose levels taken from a reference sample from a healthy individual are between 90 and 130 milligrams per deciliter (mg / dl) in a fasting state.
- This disease is caused by several disorders, including the low production of the hormone insulin, secreted by pancreatic beta cells, the absence or significant decrease in the mass of beta cells and / or by the increase in insulin resistance.
- diabetes mellitus The main symptoms of diabetes mellitus are, for example, but not limited to excessive urine output (polyuria), abnormal increase in the need to eat (polyphagia), increased thirst (polydipsia) or weight loss for no apparent reason.
- This term includes the types of diabetes mellitus selected from the list comprising: type I diabetes mellitus, type II diabetes mellitus, gestational diabetes or other types of diabetes mellitus.
- Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis and / or monitoring of diseases that occur with alterations in hemoglobin levels in an individual, or "method of the invention", comprising: a. quantify the amount of hemoglobin in an isolated biological sample from an individual,
- step (c) normalize the quantification value obtained in step (a) based on the quantization value obtained in step (b).
- an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of an individual, preferably human, obtained by any method known to a person skilled in the art that serves this purpose.
- isolated biological samples that could be used in the method of the invention are, but are not limited to, blood, serum or plasma. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the biological sample isolated from step (a) of the method of the invention is blood.
- the quantification of steps (a) and (b) of the method of the invention can be carried out simultaneously or sequentially, although preferably, it is carried out simultaneously.
- the methods for quantifying the amount of hemoglobin in step (a) and peptide of the invention in step (b) of the method of the invention in an isolated biological sample are known in the state of the art, including, for example, but not limited to, ES-MS (Electrospray mass spectrometry), IEF (Isoelectric focusing), electrophoresis or HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
- the quantification of steps (a) and (b) of the method of the invention is performed by HPLC.
- step (c) of the method of the invention is performed by adding, to the quantification value obtained in step (a), the quantification value obtained in step (b).
- a value corresponding to the amount of hemoglobin in step (a) is obtained that is useful for the diagnosis and / or monitoring of diseases that occur with alterations in the levels of this hemoglobin.
- the hemoglobin of step (a) of the method of the invention is HbAic.
- the disease is diabetes mellitus.
- the amount of HbAic in the isolated biological sample whose value is obtained with the method of the invention is useful for the diagnosis of, for example, but not limited to, diabetes mellitus. Therefore, when the value obtained in step (c) of the method of the invention is between 2.2 and 4.8%, the individual from whom the isolated biological sample from step (a) to the group is derived will be assigned of healthy patients, who do not have diabetes mellitus.
- the amount of HbAic in the isolated biological sample whose value is obtained with the method of the invention is useful for the follow-up of an individual previously diagnosed with, for example, but not limited to, diabetes mellitus. Therefore, when the value obtained in step (c) of the method of the invention is between 4% and 7%, it will be assigned to the previously diagnosed individual of diabetes mellitus from which the biological sample of step (a) comes to the group of well-controlled diabetes mellitus patients. When the value obtained in step (c) of the method of the invention is between 7% and 8%, the previously diagnosed individual of diabetes mellitus from which the biological sample of step (a) comes to the group of patients will be assigned of diabetes mellitus that require more control.
- step (c) of the method of the invention When the value obtained in step (c) of the method of the invention is greater than 8%, the previously diagnosed individual of diabetes mellitus will be assigned from which the biological sample from step (a) comes to the group of patients with diabetes mellitus controlled.
- a "well-controlled diabetes mellitus patient” means a diabetic individual who responds adequately to the pharmacological treatment and / or diet to which he is being subjected at the time the biological sample used in the method of the invention is taken. .
- a "poorly controlled diabetes mellitus patient” is a diabetic individual who, either is not being treated for said pathology at the time the biological sample used in the method of the invention is taken, or does not respond adequately to the treatment and / or the diet to which it is being subjected at the same time, so in both cases a medical decision must be taken as to the future treatment to be administered.
- the steps of the method of the invention can be partially or fully automated, for example, but not limited to, by means of a biochemical equipment that performs the quantification of steps (a) and (b) and / or the normalization of step (c).
- the method of the invention may comprise other additional steps, such as, but not limited to, related to obtaining and / or preparing the isolated biological sample.
- FIGURES Fig. 1 Shows the chromatogram of a patient expressing the peptide of the invention obtained by HPLC.
- EXAMPLE 1 Normalization of HbAiC expression values obtained by HPLC in the presence of the peptide of the invention.
- the study subject was a 61-year-old male individual diagnosed with type I I diabetes mellitus with poorly controlled blood glucose. Blood samples were obtained from this patient and mixed with EDTA as anticoagulant. The red blood cell index, as well as the other hematological determinations, were analyzed by an automatic blood cell counter. The results of the blood count and the biochemistry were those shown in Tables 1 and 2, respectively.
- Phentoliters, pg picograms.
- Creatinine 1 06 mg / dl 0.5-1, 1
- HbAic glycosylated hemoglobin
- HPLC glycosylated hemoglobin
- HbAic results of Hb detected by HPLC in the diabetic patient studied. HbAic was also analyzed by other techniques that were being evaluated by the Point of Care, that is, by affinity of boronate and by immunoassay, which did not present this type of interference, which offered a result of 8.1% by Boronate affinity (DCA, Siemens) and 8.4% by immunoassay (Afinitiun, IZASA) for said hemoglobin. However, by the 3 min HPLC method, the result for HbAiC was 6.4% (with a blood glucose in the patient of about 220 mg / dl), which was outside the expected ranges.
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Abstract
La presente invención proporciona una nueva variante estructural de la hemoglobina, de SEQ ID NO: 1, así como un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada o HbAic, y más concretamente de la diabetes mellitus, en un individuo que expresa esta variante de la hemoglobina. Dicho método comprende normalizar el valor obtenido para el nivel de expresión de la hemoglobina, preferiblemente de la HbAic, en una muestra biológica aislada de un individuo en función del valor obtenido para el nivel de expresión de esta nueva variante estructural de la hemoglobina en esa misma muestra biológica.
Description
VARIANTE ESTRUCTURAL DE LA HEMOGLOBINA
La presente invención se encuadra en el campo de la medicina, en concreto, dentro de las variantes estructurales de la hemoglobina que interfieren en los métodos de determinación de los niveles de hemoglobina glicosilada en una muestra biológica y por tanto, de los métodos de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada, concretamente de la diabetes mellitus.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La hemoglobina glicosilada o HbAic es una hemoglobina en la cual la glucosa se une específicamente a la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina, en un proceso no enzimático e irreversible. Esta hemoglobina es un marcador bioquímico empleado de manera rutinaria para la evaluación y control de individuos que presentan diabetes mellitus, ya que el valor obtenido tras su cuantificación se encuentra directamente relacionado con los niveles de glucemia del paciente de los últimos 3-4 meses, por lo que es de utilidad para la predicción de posibles complicaciones relacionadas con esta enfermedad, para el seguimiento del tratamiento del paciente e incluso para su diagnóstico. Sin embargo, la exactitud de los métodos de determinación del nivel de la HbAic se puede ver afectada por la presencia de variantes de la hemoglobina en el paciente estudiado.
Así, en aquellos individuos que presentan algún tipo de hemoglobinopatía, las técnicas analíticas utilizadas para la cuantificación de la HbAic suelen detectar, junto con ésta, las otras variantes de la hemoglobina (Hb) presentes en ellos cuyos valores alteran los resultados ofrecidos para la hemoglobina glicosilada. En el año 2000, se estimó que 12 millones de individuos con diabetes mellitus
en todo el mundo presentaban también otras enfermedades asociadas a alteraciones en la hemoglobina.
Son muchas las variantes estructurales de la Hb que se han identificado hasta la fecha (Globin Gene Sever. HbVar: a datábase of human hemoglobin variants and thalassemias. http://globin.cse.psu.edu/cgi-bin/hbvar/counter). Entre las más comunes se encuentran la HbF y las HbS, HbE, HbC y HbD, las cuales son codificadas por la sustitución de un solo aminoácido en la cadena β (Little R. R. and Roberts W. L, 2009, Journal of Diabetes Science and Technology, 3(3): 446-451 ). Otros ejemplos de variantes de este tipo son la denominada Hb Baylor, codificada por la sustitución de una Leu por una Arg en el residuo 81 (EF5) de la β globina, o la Hb La Roche-sur- Yon, codificada por la sustitución de una Leu por una His en esa misma posición. Las técnicas empleadas en la determinación de los valores de la HbAic se han ido optimizado de manera que son capaces de detectar y corregir la interferencia que provocan los valores de estas otras variantes conocidas de la Hb con los valores obtenidos para la HbAic, lo que permite, por tanto, obtener unos valores de esta última normalizados y útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus. No obstante, el efecto que cada variante de la Hb produce sobre los resultados obtenidos en los métodos de determinación de la HbAic varía en función del método empleado y de la variante de la Hb, de manera que los valores de cuantificación de la HbAic resultantes pueden ser falsamente incrementados o disminuidos dependiendo de la técnica analítica empleada y del tipo de hemoglobinopatía presente en el paciente (Bry L. et al., 2001 , Clinical Chemistry, 47(2): 153-163). De entre todos los métodos usados para medir los niveles de la HbAic, los comúnmente empleados son cuatro, a saber, inmunoensayo, HPLC (de sus siglas en inglés High-Performance Liquid Chromatography), afinidad de boronato y ensayos enzimáticos.
La identificación de nuevas variantes de la Hb es complicada, a no ser que éstas se manifiesten en una patología clínica, ya que la mayoría de ellas se deben a mutaciones que únicamente originan cambios en la estructura de la molécula que no conllevan manifestaciones fenotípicas. No obstante, las interferencias que las variantes de la Hb producen en los métodos de determinación de la HbAic por HPLC pueden estudiarse en el cromatograma obtenido, por lo que es importante que los usuarios de estos métodos de medida sean capaces de identificarlas para valorar si el resultado ofrecido es o no aceptable. Así, mediante la observación de los resultados ofrecidos por los métodos de medida de la HbAic, los expertos han identificado nuevas variantes de la Hb (Sacks D. B., 2003, Clinical Chemistry, 49(8): 1245-1247).
Sin embargo, existen variantes de la Hb aun desconocidas que interfieren en la exactitud de estos métodos, por lo que es necesaria su identificación para optimizar los métodos de obtención de datos útiles para determinar los valores de expresión de la HbAic en los individuos que las expresan, con el fin de mejorar así los métodos de diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus en estos pacientes.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una nueva variante estructural de la hemoglobina, de SEQ ID NO: 1 , de ahora en adelante "péptido de la invención", así como un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada o HbAic, y más concretamente de la diabetes mellitus, en un individuo que expresa el péptido de la invención. Dicho método comprende normalizar el valor obtenido para el nivel de expresión de la hemoglobina, preferiblemente de la HbAic, en una muestra biológica aislada de un individuo en función del valor obtenido para el nivel de expresión del péptido de la invención en esa misma muestra biológica.
En la presente invención, se ha aislado y caracterizado una nueva variante estructural de la Hb que es codificada por el cambio de un aminoácido apolar hidrofóbico, la Leu, por otro de las mismas características, la Phe, en la posición 81 de la β globina. Este cambio responde a una mutación (sustitución de CTC por TTC) en el codon 81 (EF5) del gen de la β globina. Así, la secuencia de aminoácidos de dicha Hb o péptido de la invención es la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos codificante para la SEQ ID NO: 1 es, preferiblemente, la SEQ ID NO: 2. Esta modificación no afecta a la función ni a la estabilidad del péptido de la invención con respecto a la HbA o Hb normal, aunque origina cambios estructurales que le confieren características que permiten su detección por métodos electroforéticos y cromatográficos.
Como muestran los ejemplos de la presente invención, los métodos de determinación de los niveles de la Hb (o métodos de cuantificación de la Hb), preferiblemente de la HbAic, detectan no solo ésta sino también el péptido de la invención en aquellas muestras biológicas aisladas de individuos que lo expresan. Así, los valores de expresión de este último interfieren en los valores de expresión de la primera, ofreciendo unos resultados de cuantificación de la Hb, preferiblemente de la HbAic, alterados que no se corresponden con los reales. Por ello, la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante "método de la invención", para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de Hb, preferiblemente de la HbAic, que comprende cuantificar la cantidad de péptido de la invención en una muestra biológica aislada de un individuo en la que también se ha cuantificado la cantidad de la Hb de interés, preferiblemente de la HbA^, cuyo valor se desea conocer por ser relevante para el diagnóstico y/o seguimiento de la enfermedad a estudiar. A continuación, en dicho método se normalizan los valores de expresión de esta última Hb en función de los valores de expresión del péptido de la invención. De este modo, se elimina la interferencia producida por los valores de expresión del péptido de la invención en los valores de expresión de la Hb de interés, preferiblemente la HbAic, obteniéndose así datos útiles para el correcto diagnóstico y/o seguimiento de
estas enfermedades, preferiblemente de la diabetes mellitus, en los pacientes que expresan el péptido de la invención.
Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado, o "péptido de la invención", que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 . Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica para la SEQ ID NO: 1 , o a una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido aislado que codifica para la SEQ ID NO: 1 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2.
El péptido de la invención eluye junto con otras hemoglobinas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la HbAiC, HbAia, HbAib, Hb F, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, la HbA2 o la Hb X, en los métodos de determinación de los niveles de expresión de las mismas, como por ejemplo, en HPLC, como muestran los ejemplos de la presente invención. Por ello, aunque dichos ejemplos se centren en la cuantificación de la HbAic por ser un dato de valor diagnóstico y/o para el seguimiento de la diabetes mellitus, éstos no pretenden ser limitativos, ya que se entiende que cuando lo que se desee cuantificar sea la cantidad de otras hemoglobinas distintas de ésta para diagnosticar y/o realizar el seguimiento de otras enfermedades que cursen con alteraciones en los niveles de las mismas, el péptido de la invención eluirá con ellas en los métodos de cuantificación, por lo que dichos métodos determinarán los valores de expresión del péptido de la invención junto con los de las otras Hb. Así, estos valores interferirán en los valores de expresión de éstas, y por tanto, habrán de tenerse en cuenta en la normalización de los resultados de expresión obtenidos para estas otras Hb distintas de la HbAic.
Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina.
En el contexto de la presente invención el término "hemoglobina" o "Hb" se refiere tanto a la HbA o Hb normal, la cual es una heteroproteína de la sangre, de peso molecular 64.000 Daltons (64 kD), de color rojo, que transporta el oxígeno desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, en vertebrados y algunos invertebrados, y que está formada por cuatro cadenas polipeptídicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupo hemo, cuyo átomo de hierro es capaz de unirse de forma reversible al oxígeno; como a cualquier variante estructural de la Hb o derivados de la misma modificados químicamente. Ejemplos de variantes estructurales de la hemoglobina o derivados de la misma modificados químicamente son, aunque sin limitarse, la Hb glicosilada o HbAi , incluyéndose dentro de ella todas sus variantes, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la HbAia, HbAi b o HbAic; la HbF o Hb fetal, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, Hb X, la carboxihemoglobina, carbaminohemoglobina, metahemoglobina, oxihemoglobina, Hb La Roche-sur- Yon, Hb Baylor, HbS, HbE, HbC, HbD, Hb D-Punjab, Hb O-Arab, Hb G- Philadelphia, Hb Hasharon, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb M o HbA2. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la hemoglobina es la hemoglobina glicosilada o HbAic, la cual es una hemoglobina que presenta una glucosa unida específicamente a la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina.
Tal y como aparece en la presente invención, el término "enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina" se refiere a cualquier situación patológica en la que los niveles de Hb se encuentren aumentados o disminuidos con respecto a unos valores control tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano. Así, por ejemplo, aunque sin limitarnos, los valores control de la HbA tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano se encuentran entre 13,8 y 17,2 g/dl en hombres y entre 12, 1 y 15, 1 g/dl en mujeres. Los valores control de la HbAiC tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano se encuentran ente un 2,2 y un 4,8% en individuos adultos y entre un 1 ,8 y un 4% en niños.
Ejemplos de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina son, aunque sin limitarnos, anemia o, en general, cualquier tipo de hemoglobinopatía, entendiéndose por "hemoglobinopatía" el grupo de trastornos hereditarios en los cuales hay una estructura y/o producción anormal de la molécula de la hemoglobina A. Ejemplos de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de HbAic son, aunque sin limitarnos, diabetes mellitus, anemia hemolítica, enfermedades renales o pérdidas de sangre crónicas. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con alteraciones en los niveles de HbAic es la diabetes mellitus.
El término "diabetes mellitus" se refiere al grupo de trastornos metabólicos que afecta a diferentes órganos y tejidos, dura toda la vida y se caracteriza por un aumento de los niveles de glucosa en la sangre (hiperglicemia) con respecto a unos valores control tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano. Los valores control de los niveles de glucosa tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano se encuentran entre 90 y 130 miligramos por decilitro (mg/dl) en situación de ayunas. Esta enfermedad está causada por varios trastornos, incluyendo la baja producción de la hormona insulina, secretada por las células beta pancreáticas, la ausencia o disminución significativa de la masa de células beta y/o por el aumento de la resistencia a la insulina. Los síntomas principales de la diabetes mellitus son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, emisión excesiva de orina (poliuria), aumento anormal de la necesidad de comer (polifagia), incremento de la sed (polidipsia) o pérdida de peso sin razón aparente. Dentro de este término se incluyen los tipos de diabetes mellitus seleccionados de la lista que comprende: diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, diabetes gestacional u otros tipos de diabetes mellitus. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con
alteraciones en los niveles de hemoglobina en un individuo, o "método de la invención", que comprende: a. cuantificar la cantidad de hemoglobina en una muestra biológica aislada de un individuo,
b. cuantificar la cantidad de péptido de la invención en la muestra biológica aislada del paso (a), y
c. normalizar el valor de cuantificación obtenido en el paso (a) en función del valor de cuantificación obtenido en el paso (b).
Una "muestra biológica aislada" incluye, aunque sin limitarse, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, preferiblemente humano, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. Ejemplos de muestras biológicas aisladas que podrían ser empleadas en el método de la invención son, aunque sin limitarse, sangre, suero o plasma. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del paso (a) del método de la invención es sangre.
La cuantificación de los pasos (a) y (b) del método de la invención puede llevarse a cabo de manera simultánea o secuencial, aunque preferiblemente, se lleva a cabo de manera simultánea. Los métodos para cuantificar la cantidad de hemoglobina en el paso (a) y de péptido de la invención en el paso (b) del método de la invención en una muestra biológica aislada son conocidos en el estado de la técnica, incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, ES-MS (de sus siglas en inglés Electrospray mass spectrometry), IEF (de sus siglas en inglés Isoelectric focusing), electroforesis o HPLC (de sus siglas en inglés High- Performance Liquid Chromatography). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la cuantificación de los pasos (a) y (b) del método de la invención se realiza mediante HPLC.
En una realización más preferida, la normalización del paso (c) del método de la invención se realiza sumando, al valor de cuantificación obtenido en el paso
(a), el valor de cuantificación obtenido en el paso (b). Así, se obtiene un valor correspondiente a la cantidad de hemoglobina del paso (a) que es útil para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de esta hemoglobina.
En otra realización preferida, la hemoglobina del paso (a) del método de la invención es la HbAic. En una realización más preferida, la enfermedad es la diabetes mellitus. La cantidad de HbAic en la muestra biológica aislada cuyo valor se obtiene con el método de la invención es de utilidad para el diagnóstico de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, la diabetes mellitus. Por ello, cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención se encuentre entre un 2,2 y un 4,8%, se asignará al individuo del cual procede la muestra biológica aislada del paso (a) al grupo de pacientes sanos, que no presentan diabetes mellitus.
La cantidad de HbAic en la muestra biológica aislada cuyo valor se obtiene con el método de la invención es de utilidad para el seguimiento de un individuo previamente diagnosticado de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, diabetes mellitus. Por ello, cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención se encuentre entre un 4% y un 7% se asignará al individuo previamente diagnosticado de diabetes mellitus del cual procede la muestra biológica del paso (a) al grupo de pacientes de diabetes mellitus bien controlados. Cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención se encuentre entre un 7% y un 8%, se asignará al individuo previamente diagnosticado de diabetes mellitus del cual procede la muestra biológica del paso (a) al grupo de pacientes de diabetes mellitus que requieren un mayor control. Cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención sea superior a un 8%, se asignará al individuo previamente diagnosticado de diabetes mellitus del cual procede la muestra biológica del paso (a) al grupo de pacientes de diabetes mellitus mal controlados.
Se entiende por un "paciente de diabetes mellitus bien controlado" un individuo diabético que responde adecuadamente al tratamiento farmacológico y/o a la dieta a la que esta siendo sometido en el momento en el que se toma la muestra biológica empleada en el método de la invención. Por el contrario, un "paciente de diabetes mellitus mal controlado" es un individuo diabético que, o bien no esta siendo tratado para dicha patología en el momento en que se toma la muestra biológica empleada en el método de la invención, o bien no responde adecuadamente al tratamiento y/o a la dieta a la que esta siendo sometido en ese mismo momento, por lo que en ambos casos debe tomarse una decisión médica en cuanto al futuro tratamiento a administrar.
Los pasos del método de la invención pueden ser parcial o totalmente automatizados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante un equipo bioquímico que realice la cuantificación de los pasos (a) y (b) y/o la normalización del paso (c). Además, el método de la invención puede comprender otros pasos adicionales, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con la obtención y/o preparación de la muestra biológica aislada.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Muestra el cromatograma de un paciente que expresa el péptido de la invención obtenido mediante HPLC.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del método de la invención en la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus en individuos que expresan el péptido de la invención. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1. Normalización de los valores de expresión de la HbAiC obtenidos por HPLC en presencia del péptido de la invención.
El sujeto de estudio fue un individuo varón de 61 años de edad diagnosticado de diabetes mellitus tipo I I con glucemia mal controlada. Se obtuvieron muestras de sangre de este paciente y se mezclaron con EDTA como anticoagulante. El índice de glóbulos rojos, así como las demás determinaciones hematológicas, se analizaron mediante un contador de células sanguíneas automático. Los resultados del hemograma y de la bioquímica fueron los que se muestran en las tablas 1 y 2, respectivamente.
Serie blanca Valores Unidades
Leucocitos 7,5 x109/l
Linfocitos 26,9 %
Linfocitos valor absoluto 2,0 x109/l
Monocitos 5,1 %
Monocitos valor absoluto 0,4 x109/l
Neutrófilos 63,7 %
Neutrófilos valor absoluto 4,8 x109/l
Reticulocitos 1 ,2 %
Tabla 1 . Resultados del hemograma del paciente diabético estudiado, fl:
fentolitros, pg: picogramos.
Prueba Valores Unidades Valores de
referencia
Glucosa 219 mg/dl 70-1 10
Urea 41 mg/dl 10-40
Creatinina 1 ,06 mg/dl 0,5-1 ,1
Proteasas 8,0 g/di 6,5-8
Totales
GOT 38 Ul/I 10-37
GPT 40 Ul/I 10-40
GGT 76 Ul/I 10-50
Fosfatasa 45 Ul/I 40-130 alcalina
Bilirrubina toral 0,59 mg/dl 0,10-1 ,20
Sodio 142 mEq/l 135-145
Potasio 4,3 mEq/l 3,5-4,5
Perfil Lipídico
Colesterol 138 mg/dl 150-200
Triglicéridos 105 mg/dl 70-170
Tabla 2. Resultados de la bioquímica del paciente diabético estudiado. Ul/I: unidades internacionales por litro. mEq/l: miliequivalentes por litro.
Este paciente fue también sometido a un control de hemoglobina glicosilada (HbAic) por HPLC (Turbo I I, BioRad, tiempo de elución 1 ,5 y 3 minutos). Así, en el análisis por HPLC (HPLC intercambio catiónico) de la primera muestra tomada de este paciente se midieron la HbA2 (2,4%) y la HbF (0%). En este mismo análisis se aisló y midió una Hb X (39,6%) que eluyó antes que la Hb A. Además, el cromatograma obtenido mostró picos anómalos: un pequeño pico después de la HbAic y un pequeño pico después de la Hb A0 que no se distinguía con claridad. Por ello, se analizó una nueva muestra procedente del mismo paciente para descartar que dichos picos se trataran de artefactos.
En el nuevo análisis que se realizó con la muestra recién extraída del paciente se observó un pico posterior a la HbA^ muy unido a ella, no conocido y que habitualmente no se observa, así como un pico delante de Hb AO que tuvo que ser ampliado para poder observarse bien. El pico desconocido no se identificaba con ninguna hemoglobinopatía conocida en los aparatos de BioRad y no se observaba mediante el diagnóstico realizado con la tecnología Menarini. Los resultados de las Hb detectadas en este análisis se muestran en la taba 3 y en la figura 1 .
Hb Area Area Tiempo Area pico correspondiente al calibrada (%) (%) retención
pico (min)
HbAia — 0,9 0,21 26.613
HbAib — 1 ,6 0,35 46.994
HbF — 0,3 0,59 9.334
HbLAiC — 1 ,2 0,77 36.882
HbAiC 6,4 — 1 ,01 1 17.391
Desconocida — 2,6 1 ,28 77.769
HbP3 — 2,0 1 ,53 59.741
HbP4 — 4,4 1 ,62 130.791
HbAO — 83,1 1 ,79 2.484.957
Area total: 2.990.472
Tabla 3. Resultados de las Hb detectadas mediante HPLC en el paciente diabético estudiado. La HbAic se analizó también por otras técnicas que se estaban evaluando por el Point of Care, es decir, por afinidad de boronato y por inmunoensayo, las cuales no presentaban este tipo de interferencias, lo que ofreció un resultado de un 8,1 % por afinidad de boronato (DCA, Siemens) y un 8,4% por inmunoensayo (Afinitiun, IZASA) para dicha hemoglobina. Sin embargo, por el método de HPLC 3 min, el resultado para la HbAiC era de un 6,4% (con una glucemia en el paciente de alrededor de 220 mg/dl), lo que se encontraba fuera de los rangos esperados. La suma del área de los dos picos mostrados en el cromatograma (el pico desconocido correspondiente al péptido de la invención y el pico correspondiente a la HbAic) resultaba en un valor muy similar al ofrecido por la determinación por afindad de boronato y por inmunoensayo (6,4% + 2,6% = 9%).
EJEMPLO 2. Caracterización estructural y funcional del péptido de la invención.
Un estudio de HPLC en fase reversa (Separations, Group, Hesperia, EEUU) reveló la presencia de una cadena β globina anormal que fluía por delante de la cadena βΑ (βχ, βΑ y αΑ). La estabilidad de la nueva hemoglobina, medida mediante un test de isopropanol, era normal y los estudios de unión de oxígeno (Hemox Analyzer) mostraron afinidad normal por el oxígeno de toda la sangre (P50 de 25 mmHg).
Para la caracterización molecular de esta nueva variante de la hemoglobina, el ADN genómico de los leucocitos se extrajo automáticamente con Bio-Robot EZ1 (Quiagen). La amplificación selectiva del gen β se llevó a cabo por PCR mediante Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler. Posteriormente, se llevó a cabo la secuenciación de este gen en ambas direcciones en un secuenciador automático (3.77 ABI, Applied Biosystems, CA), lo que mostró una sustitución de CTC por 7TC en el codon 81 . Esta mutación producía un cambio de una Leu por una Phe en la posición 81 de la β globina.
Ni la función ni la estabilidad de esta nueva variante de la hemoglobina se encontraba alterada, ya que la mutación que la codifica consiste en el cambio de un aminoácido apolar hidrofóbico (Leu) por otro de las mismas características (Phe), en la posición 5 de la hélice EF (esta posición en 3D corresponde al sitio de unión del 2,3-DPG).
Claims
1.
2. Uso del péptido según la reivindicación 1 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina.
3. Uso del péptido según la reivindicación 2 donde la hemoglobina es la HbAiC.
4. Uso del péptido según la reivindicación 3 donde la enfermedad es la diabetes mellitus.
5. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina en un individuo que comprende: a. cuantificar la cantidad de hemoglobina en una muestra biológica aislada de un individuo,
b. cuantificar la cantidad de péptido según la reivindicación 1 en la muestra biológica aislada del paso (a), y
c. normalizar el valor de cuantificación obtenido en el paso (a) en función del valor de cuantificación obtenido en el paso (b).
6. Método según la reivindicación 5 donde la cuantificación de los pasos (a) y (b) se realiza mediante HPLC.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 donde la normalización del paso (c) se realiza sumando, al valor de cuantificación obtenido en el paso (a), el valor de cuantificación obtenido en el paso (b).
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 donde la hemoglobina del paso (a) es la HbAic.
9. Método según la reivindicación 8 donde la enfermedad es la diabetes mellitus.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 donde la muestra biológica aislada del paso (a) es sangre.
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| JP2017194349A (ja) * | 2016-04-20 | 2017-10-26 | アークレイ株式会社 | 糖化ヘモグロビン測定方法、糖化ヘモグロビン測定装置、及び糖化ヘモグロビン測定プログラム |
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