WO2011144784A1 - Lacasa de alto potencial redox - Google Patents

Lacasa de alto potencial redox Download PDF

Info

Publication number
WO2011144784A1
WO2011144784A1 PCT/ES2011/070339 ES2011070339W WO2011144784A1 WO 2011144784 A1 WO2011144784 A1 WO 2011144784A1 ES 2011070339 W ES2011070339 W ES 2011070339W WO 2011144784 A1 WO2011144784 A1 WO 2011144784A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
laccase
seq
polynucleotide
redox potential
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2011/070339
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Diana MATÉ MATE
Malena Valdivieso Ugarte
Layla FERNÁNDEZ TORRES
Miguel Alcalde Galeote
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Publication of WO2011144784A1 publication Critical patent/WO2011144784A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology, recombinant DNA technology and biotechnology. Specifically, it refers to an enzyme laccase oxidase improved in its functional expression, its catalytic activity and its thermostability.
  • the functional expression, improvement of catalytic activity and thermostability of the laccase is carried out in eukaryotic cells of Saccharomyces cerevisiae through a process of directed molecular evolution.
  • This enzyme can be used as a catalyst in industrial processes related to the transformation of lignocellulosic biomass to obtain biofuels or the production of wood and paper products with new properties, for the food sector, textile production and the chemical sector, as well as for bioremediation of effluents and environmental pollutants, and for the design of bio-devices.
  • Lacases (EC 1 .10.3.2) are a group of oxidases widely distributed in higher plants and fungi, although they have also been described in some bacteria and even in insect cuticles (Mayor, 2007. Industrial enzymes. Structure, function and applications Ed. Polaina, J. and MacCabe, AP Springer, Heidelberg (Germany), pp. 459-474). They belong to the family of blue multicore oxidases (together with ascorbate oxidase and ceruloplasmin), and are generally presented as extracellular monomeric glycoproteins.
  • Lacases individually, catalyze the oxidation of a broad spectrum of aromatic organic substances.
  • aromatic organic substances include ortho and para-diphenols, methoxy-substituted phenols, benzenethiols, hydroxyindoles, 1-naphthol and syringaldazine (Gianfreda et al., 1999. Bioremediation Journal 3: 1-25).
  • the resulting free radicals undergo different reactions depending on their structure and the conditions of reaction. Free radical coupling generating dimeric or polymeric products and oxidative decarboxylations are the most frequent reactions.
  • inorganic / organic metal compounds are lacquer substrates. Mn 2+ is oxidized to Mn 3+ and also Fe (EDTA) 2 " is accepted by the enzyme (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140: 19-26).
  • the laccases contain a copper of type 1 (T1) where oxidation of the reducing substrate takes place, and a trinuclear center or cluster with three copper, a T2 and two T3, where the reduction of 0 2 takes place.
  • T1 type 1
  • T2 trinuclear center or cluster with three copper, a T2 and two T3, where the reduction of 0 2 takes place.
  • the reaction mechanism must function as a battery, storing electrons from individual oxidation reactions to reduce molecular oxygen and produce water (Davies, 2002. Lacease. In: Handbook of Metallproteins. (Ed A. Messercschimdt et al), pp. 1359-1368 John Wiley and Sons, LTD, New York).
  • the formal redox potential ( ⁇ ° ' ) of the laccases has a direct relationship with the energy required to start an electron from the reducing substrate, constituting one of the fundamental characteristics of these enzymes.
  • the catalytic behavior of lacquers on most reducing substrates depends on E ° ' in Cu T1 (electron acceptor).
  • E ° ' in Cu T1 (electron acceptor).
  • lacquers with a higher E ° T1 are of special interest in biotechnology because they are capable of oxidizing substrates with greater E ° 'such as certain polycyclic aromatic hydrocarbons or various synthetic organic dyes.
  • E ° T1 close to +800 mV
  • E ° T1 of the different fungal lacquers from +465 mV of the Myceliophtora thermophila ascomycete laccase to +790 mV of Pycnoporus cinnabarinus basidiomy
  • lacquers of high redox potential can be used in practically the entire production chain of paper products: the production of paper pulp, chlorine-free bleaching of pastes, the elimination of pitch or the treatment of effluents
  • Nanobiotecology a) as detectors of phenols, oxygen, azides, morphine, codeine, catecholamines or flavonoids in the development of biosensors for clinical and environmental analyzes; and b) elaboration of fuel biopiles that offer clean electric energy (without using fossil fuels) by immobilizing laccases in the cathode.
  • Bioremediation degradation of PAHs (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons), AOX compounds (Absorbable Organic Halogens), etc.
  • Chemical synthesis a) production of complex polymers (eg polytecol for chromatography resins); b) synthesis of pharmacological agents: antitumor agents (eg viblastin), new antibiotic derivatives (eg cyclosporin A), or dyes (Suberasa® de Novozymes); c) cosmetics: hair dyes formulated with Iacasa.
  • lacquers at the industrial level requires robust expression systems that provide high levels of active enzyme.
  • the use of heterologous expression systems enables the production of lacases from different sources in the same host, as well as new variants with improved properties with respect to the wild enzyme.
  • cerevisiae can be significantly increased by means of directed molecular evolution techniques, which allows the design of new enzymatic functions that do not exist in natural environments or the improvement of certain enzyme properties (Arnold, 2001 Nature 409: 253-257).
  • This methodology recreates in the laboratory the key processes of natural evolution (mutation, recombination and selection) so that it is possible to design enzymes of great scientific and technological interest.
  • the selected genes subjecting the selected genes to successive cycles of molecular evolution, the different beneficial point mutations will accumulate and combine until the desired property is acquired, which is exponentially improved, generation after generation.
  • the production of the Myceliophthora thermophila ascomycete house in S. cerevisiae was increased to 18 mg / L (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995. 2003).
  • E. coli is the host organism most frequently used in the heterologous functional expression of the genes encoding the protein of interest, the different use of codons, and the impossibility of making the post-translational modifications necessary for the correct secretion of the mature protein (such as proteolytic processing or glycosylations) can cause an inappropriate folding of the protein that is accumulated in inclusion bodies, preventing its functional expression. This is especially true for fungal laccases for which their functional expression in E. coli has not yet been achieved. Some of these problems can be avoided if these genes are expressed in eukaryotic hosts. whose cellular machinery is closer to the native one, as is the case with yeasts.
  • Saccharomyces cerevisiae is of great interest since it has the ability to glycosylate and secrete the proteins to the extracellular environment (which in many cases prevents intermediate steps of cell lysis) and has a high transformation efficiency.
  • using an appropriate episodic vector it does not integrate the plasmid into its genome, thus facilitating its subsequent manipulation.
  • Another very interesting advantage from an evolutionary point of view is its high frequency of DNA recombination, which unlike E. coli allows the construction of libraries in vivo through the homologous recombination of different genes (known as in vivo shuffling DNA or "barajeo").
  • High-redox potential lacquers are a clear example of a generalist biocatalyst that converts their promiscuity of substrates by virtue. Powered by molecular oxygen, high redox potential laccases transform hundreds of substrates of different nature and complexity, ranging from xenobiotics (for example: pesticides, industrial dyes, polycyclic aromatic hydrocarbons) to biopoiimers (lignin, starch). Hence, high-redox potential lacquers find potential applications in bioremediation, textile refining, paper pulp bio-bleaching, biofuels, organic synthesis and many other processes (Xu, 2005. Biochem. J. 334, 63-70; Kunamneni et al., 2008. Microb. Cell Fact.
  • the present invention describes the directed evolution of a redox potential laccase functionally expressed in S. cerevisiae which has high activity and great thermostability.
  • the starting point was the high redox potential laccase of basidiomycete P 1, which exhibits remarkable stability and activity properties, including thermal activation (Coll et al., 1993. Appl. Environ. Microb. 59, 2607-2613) .
  • the fusion protein was subjected to 8 cycles of laboratory evolution in combination with rational approaches. The last mutant of this process is a valuable tool for designing high-redox ad hoc shells for different applications.
  • the present invention provides a new laccase with high redox potential, high production rate, high activity and high thermostability.
  • the present invention relates to the amino acid sequence of said laccase and to the nucleotide sequence encoding said laccase.
  • the authors of the present invention have used a methodological combination based on evolution and directed mutagenesis and have made a laccase that solves the need for a biocatalyst with high activity and thermostability, and which also has a high functional production rate (8 mg / L; 1400 U / L of fermented).
  • thermostability has a high thermostability
  • a first aspect of the invention relates to a polynucleotide (hereinafter called the polynucleotide of the invention) which codes for the amino acid sequence polypeptide SEQ ID NO: 1 (hereinafter called the polypeptide of the invention).
  • the polynucleotide of the invention has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.
  • the term "polynucleotide”, as used in the description, refers to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides. .
  • encodes refers to the correlation between nucleotide triplets or codons in a DNA sequence and the amino acids that form peptides, amino acid sequences or proteins.
  • a nucleotide sequence is said to encode a peptide, it means that when said nucleotide sequence is transcribed to messenger RNA (mRNA) and this mRNA is translated, said peptide will be generated.
  • mRNA messenger RNA
  • peptide polypeptide
  • protein refers to a polymeric form of amino acids of any length.
  • Another aspect of the invention relates to a genetic construct (hereinafter called the genetic construct of the invention) comprising:
  • the polynucleotide of the invention which further comprises a gene expression system or vector, operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said polynucleotide, and / or with other nucleotide sequences necessary or appropriate for in vitro transcription or in vivo and its regulation in time and place.
  • a genetic construct may include the cloning and gene expression vectors comprising the polynucleotide of the invention.
  • gene expression vectors include control sequences, such as, for example, translation control elements (such as start and stop codes) and transcription (for example, promoter-operator regions, binding sites).
  • the vectors according to the invention can include bacterial plasmids and viral vectors, and other vectors according to the procedures well known and documented in the state of the art, and can be expressed in a variety of different expression systems, also well known and documented. .
  • a variety of techniques that can be used to introduce such vectors into prokaryotic or eukaryotic cells (host cells) for expression are also known. Appropriate transformation or transfection techniques are well described in the state of the art.
  • a “vector” is a replicon to which another polynucleotide segment has been attached, to perform replication and / or expression of the bound segment.
  • a “replicon” is any genetic element that behaves as an autonomous unit of polynucleotide replication within a cell; that is, able to replicate under its own control.
  • control sequence refers to nucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the coding sequences to those that are linked.
  • control sequences differs depending on the host organism; in prokaryotes, said control sequences generally include a promoter, a ribosomal binding site, and termination signals; in eukaryotes, generally, said control sequences include promoters, termination signals, enhancers and, sometimes, silencers.
  • control sequences is intended to include, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous.
  • operatively linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way.
  • a control sequence "operatively linked" to a coding sequence is linked in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • the genetic construct of the invention further comprises a polynucleotide encoding a signal peptide enhanced by directed evolution that favors functional expression of the polypeptide of the invention.
  • the signal peptide is that of the amino acid sequence factor SEQ ID NO: 9.
  • the polynucleotide encoding the signal peptide is the nuecleotide sequence SEQ ID NO: 10.
  • the genetic construct of the invention comprises a polynucleotide encoding the amino acid sequence polypeptide SEQ ID NO: 3. More preferably, the genetic construct of the invention comprises the nucleotide sequence polynucleotide SEQ ID NO: 4.
  • signal peptide refers to a peptide that is located at the amino terminus of a polypeptide or protein, and whose function is to direct the location of the protein to different compartments of the cell (nucleus, mitochondria, chloroplast, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus (AG), etc.) or to the extracellular space, in the event that the protein is secreted.
  • the signal factor peptide is a polypeptide of 83 amino acids. The first 19 amino acids constitute the pre-leader that directs the creation polypeptide towards the ER. After entering the ER, the pre-leader is cleaved by a peptidase, leaving a pro-protein.
  • the N-glycosylations of three asparagine residues facilitate the transit of the pro-protein from RE to AG.
  • the prolific can act as a chaperone until it is processed by proteases KEX1, KEX2 and STE13 (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488; Shuster, 1991. Curr. Opin. Biotech. 2, 685 -690).
  • the prolific seems to be involved in a vacuolar signaling process, which is detrimental to heterologous secretion (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1 192-1201).
  • the nucleotide sequence encoding the amino acids glutamic acid and phenylalanine is found between the nucleotide sequence encoding the signal peptide of factor ⁇ SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence encoding for the amino acid sequence polypeptide SEQ ID NO: 1 (both improved by directed evolution), the nucleotide sequence encoding the amino acids glutamic acid and phenylalanine is found. More preferably, the genetic construct of the invention comprises the polynucleotide encoding the amino acid sequence polypeptide SEQ ID NO: 5. More preferably, the genetic construction of the invention comprises the nucleotide sequence polynucleotide SEQ ID NO: 6.
  • amino acids are a consequence of the action strategy used to fuse the nucleotide sequence that codes for the ⁇ factor with the nucleotide sequence that codes for the laccase of the invention.
  • the cell of the invention a host cell comprising the polynucleotide of the invention or the genetic construction of the invention. More preferably, the cell of the invention is a yeast. More preferably, the cell of the invention It belongs to the genus Saccharomyces. Even more preferably, the cell of the invention belongs to the species Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).
  • host cell refers to a cell that serves as a container for the polynucleotide of the invention or the genetic construct of the invention.
  • host cell may also refer to a cell that expresses a protein of interest (eg, the laccase of the invention) where the host cell is transformed with an expression vector that it contains the polynucleotide of the invention or the genetic construct of the invention, in addition to other control nucleotide sequences.
  • yeast S. cerevisiae is a unicellular fungus that belongs to Superuk Eukaryota, (Metazoa / Fungi group), Fungi Kingdom, Dikarya Subreino, Phylum Ascomycota, Saccharomycotina Subphylum, Saccharomycetes Class, Saccharomycetales Order, Saccharomycetaceae Family and Genus Saccharomycetaceae.
  • laccase of the invention Another aspect of the invention relates to a laccase of high redox potential (hereinafter called laccase of the invention) comprising the polypeptide of the invention.
  • the laccase of the invention further comprises the amino acids glutamic acid and phenylalanine at the amino terminus of the polypeptide, and its amino acid sequence is SEQ ID NO: 7.
  • the laccase of the invention further comprises the last four amino acids of the signal peptide of the factor ⁇ enhanced by directed evolution (glutamic acid, threonine, glutamic acid, alanine) at the amino terminus of the polypeptide, and its amino acid sequence is SEQ ID NO: 8.
  • the extra amino terminal tail of 2 amino acids does not alter the thermostability or activity of the laccase of the invention.
  • the presence of the last four amino acids of the signal factor peptide ⁇ is due to the lack of processing by the STE13 protease. This is a common phenomenon in cases in which a protein reaches hypersecretion levels, as is the case with the invention's laccase when it is produced by the host cell of the invention. It is well known that the amount of STE13 protease produced by the S.
  • amino terminal refers to the end from which the polypeptide or protein is created during mRNA translation. This end is called terminal mood because the amino acid that is placed in the initial position has the free amino group.
  • protease refers to a protein with enzymatic activity or enzyme capable of cutting (digesting, lysing, protecting or processing) a polypeptide or protein in a specific region of its amino acid sequence.
  • a protease can also be called peptidase or hydrolase, as it breaks the peptide bond between two amino acids of an amino acid sequence, polypeptide or protein.
  • the term "lack of processing”, as used in the description, refers to the absence of cut by the protease. Processing of an enzyme is understood as the phenomenon by which said enzyme modifies its substrate. In this case, protease processing is understood as the cutting of the polypeptide at the end of the amino acid sequence of the signal peptide of factor a.
  • the term "hypersecretion”, as used in the description, refers to a greatly increased secretion. This greatly increased secretion is due to the presence of the ⁇ -factor signal peptide with the improved amino acid sequence SEQ ID NO: 9. The hypersecretion of the laccase of the invention allows the high production rate of said laccase.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining the laccase of the invention, which comprises:
  • purify refers to the separation of the laccase of the invention and its concentration, from the culture medium of the cell of the invention.
  • the separation of the laccase can be carried out by techniques of differential solubility, chromatography, electrophoresis or isoelectric focusing. Chromatography techniques can be based on molecular weight, loading or affinity of the protein and can be performed on a column, on paper or on a plate. Protein separation can be performed, for example, by fast liquid chromatography (FPLC), in an automated system that significantly reduces purification time and increases purification performance.
  • FPLC fast liquid chromatography
  • Another aspect of the invention relates to the use of the polynucleotide of the invention or of the genetic constructs of the invention for obtaining a laccase of high redox potential.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the host cell of the invention for obtaining a laccase of high redox potential.
  • a culture of host cells refers to the process of maintaining and growing host cells.
  • Cell cultures need controlled conditions of temperature, pH, percentages of gases such as carbon dioxide and oxygen, as well as the presence of adequate nutrients to allow viability and cell division.
  • Cell cultures can be grown on solid substrates such as agar, or in a liquid medium, allowing large numbers of suspended cells to be cultured.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the host cell culture of the invention for obtaining a laccase of high redox potential.
  • FIG. 1 Shows the Route of Artificial Evolution of a-PM1.
  • a combination of evolutionary strategies was used (random mutagenesis, shuffling in vivo DNA (in English "in vivo DNA-shuffling"), in vivo assembly of mutagenic libraries with different mutational spectrum (IvAM) in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra ”) and rational (directed mutagenesis either retrieve beneficial mutations as for mutational exchange with evolved HRPL) during the evolution of gene fusion-PM1.
  • the starting point for mutations incorporated into the 7th cycle Directed mutagenesis is indicated by the dotted arrows
  • MAT improvement in total activity against the parentai type of generation previous.
  • MT improvement in thermostability compared to the parental type of the previous generation.
  • Figure 2. show the intersections suggested during the Directed Evolution of a-PM1.
  • the pre-leader of the ⁇ -factor is represented in gray, the prolific of the ⁇ -factor in white and the PM 1 matures in black.
  • the new point mutations are marked in gray.
  • Double asterisk is indicated mutant 16B10, the best mutant thermostability of the 6th generation.
  • Figure. 3. Shows the rational approach to Thermostability.
  • S454 establishes two hydrogen bonds with A458 and after the mutation, forms an additional bond with A161.
  • the dial is T1 copper.
  • FIG. 4 Shows the biochemical characterization of the OB-1 mutant.
  • A, B Activity pH profiles of the mutant lacases. White circles, mutant 5G3 (3 to G); black circles, mutant 1 D1 1 (4 to G); black triangles, mutant S454F (7a G); white triangles, mutant OB-1 (8 to G). The activities were measured in 100 mM Britton and Robinson buffer at different pHs with 3 mM DMP (A) or ABTS (B) as substrates. Lacasa activity was normalized to the optimal activity value and each point, including the standard deviation, is the average of three independent experiments.
  • C T 50 of the OB-1 mutant and other related HRPLs.
  • Enzyme samples were incubated in 10 mM Britton and Robinson buffer at different pHs, and residual activity was measured in 3 mM ABTS in 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0). Black circles, pH 3.0; white squares, pH 6.0; black triangles, pH 9.0.
  • FIG. 5 Shows the mutations in the Evolved Laccase. It shows the details of the seven mutations present in the OB-1 variant (B, D, F) compared with the corresponding residues of the native PM1 laccase (A, C, E). The spheres represent atoms of Cu. Cu T1 and trinuclear Cu T2 / T3 cluster ligands are shown. Hydrogen bridges related to mutated residues (before and after mutation) are shown as dashed lines.
  • FIG. 6 Shows the cloning strategy for the construction of -PM1.
  • Figure. 7. Shows the Route of Artificial Evolution of ⁇ -PcL. The figure shows the first three generations of Pycnoporus cinnabarinus laccase. MAP: improvement in total activity compared to the parental type of the previous generation. This figure is related to Figure 1.
  • Figure. 8. Shows the characterization of the OB-1 mutant.
  • A mass spectrum of the OB-1 mutant.
  • B Electrophoresis of the purified OB-1 muierie.
  • the rails contain the following. 1: molecular weight marker, 2: culture filtrate, 3: fractionated precipitation with ammonium sulfate, 4: anion exchange, 5: high resolution anion exchange.
  • C N-deglycosylation of OB-1.
  • the rails contain the following: 1: OB-1, 2: deglycosylated OB-1, 3: molecular weight marker.
  • the purified enzyme was deglycosylated using the N-glycosidase PNGaseF.
  • the samples were analyzed on a 12% acrylamide SDS gel and stained with Coomassie blue. This figure is related to Figure 4.
  • FIG. 9 Shows the general structure of the Evolved Lacasa OB-1.
  • the distances of mutated residues to T1 copper (represented as dashed lines) and the surface of the protein are also shown. This figure is related to Figure 5.
  • Figure 10 It shows the partial alignment of the amino acid sequence of PM1 and other highly related redox potential lacquers. The numbering includes the signal sequences. The sequence alignment was performed with the cobalt algorithm on the NCBI-Blast server.
  • PM1, basidiomycete house PM1 (CAA78144.1) SEQ ID NO: 34
  • T. trogii Lame de Trametes trogii (2HRG-A (SEQ ID NO: 36)
  • C. galilea house of Coriolopsis gallica (ABD93940.1) (SEQ ID NO: 37);
  • T. sp AH28-2 lacasa A of Trametes sp. AH28-2 (AAW28933.1) (SEQ ID NO: 39); T. versicolor, lacasa III de Trametes versicolor (AAL93622.1) (SEQ ID NO: 40); T pubescens, lacasa 2 of Trametes pubescens (AAM18407.1) (SEQ ID NO: 41); T. hirsuta, lame de Trametes hirsuta (ACC43989.1) (SEQ ID NO: 42); T. I-62, lacasa de Trametes sp.
  • laccase PM1 is highly stable in the pH range of 3 to 9 and at a high temperature (with an optimal activity at 80 ° C) (Coll et al, 1993. Appl. Environ. Microb. 59, 2607-2613, Coll et al, 1993, Appl. Environ. Microb. 59, 4129-4135). These characteristics make it highly desirable not only for practical use but also to conduct experiments of directed evolution.
  • the vector pUEX1 with the native PM1 cDNA was yielded by Prof. R. Santamar ⁇ a (University of Salamanca).
  • the lamella of Trametes versicolor, the laccases of Pycnoporus cinnabarinus and Trametes hirsuta, and the laccases of Coriolopsis gallica and Pleurotus ostreatus, were donated by Novozymes (Davis, CA, USA), Prof. E. Record (University of Marseille, France), Prof. A. Yaropolov (Institute of Biochemistry, Moscow, Russia) and Prof. R. Vázquez-Duhalt (UNAM, Cuernavaca, Mexico), respectively.
  • the ABTS (2,2' - azino-bis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), DMP (2,6-dimethoxyphenol), Taq polymerase kit and transformation in S. cerevisiae Sigma- were purchased from Aldrich
  • the competent cells of E. coli XL2-Blue and the Genemorph I and II Random mutagenesis kits are from Stratagene. Protein-deficient S. cerevisiae strain BJ5465 is from LGCPromochem.
  • the shuttle vector pJRoC30 with the ampicillin resistance gene and the uracil auxotrophy gene comes from the California Institute of Technology (Caltech, CA, USA), while the vector pGAPZa, which contains the prepro-leader of factor a, is of Invitrogen, USA Zymoprep yeast plasmid miniprep, Zymoclean gel DNA recovery, and DNA clean & concentrator TM-5 kits were purchased from Zymo Research.
  • the NucleoSpin Plasmid kit was purchased from Macherey-Nagel and the restriction enzymes BamH ⁇ and Xho ⁇ from New England Biolabs. All reagents used were the highest purity available. 1.2. Construction of ⁇ - ⁇ 1
  • the copy DNA of PM1 including the native leader signal was cloned into the shuttle vector pJRoC30 in S. cerevisiae.
  • the pUEX1 vector with the copy DNA of PM1 was used as a template to amplify PM1 including the 21 amino acids of the signal peptide.
  • the primers used for amplification were:
  • F3PM1 5'CTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATA ART-3 ' and (SEQ ID NO: 12) R3PM1: 5'GACATAACTAATTACATGATGCGGCCC TCTAGATGCATGCTCGAGCtcactggtcgtcagga grappled cells where the cells indicate specifically the cells. cerevisiae with the vector pJRoC30 linearized with BamHI and Xhol. The corresponding construction pJRoC30-PM1 did not give rise to functional expression levels in S. cerevisiae. Consequently, the native signal sequence of P 1 was replaced by the leading signals of MtLT2 (Bulter et al., 2003. Appl.
  • the construction-PM1 was obtained by gene amplification native PM1 excluding the leader signal using primers (SEQ ID NO: 13) PM1 Eco-F (5 '- gcGAATTCagcattgggccagtc-3') and (SEQ ID NO: 14) PM1 -R (5 ' - atGGCGGCCGCttactggtcgtcaggcgagagc-3 ' ), which include the targets for EcoR ⁇ and Not ⁇ (in capital letters) as well as the optimal stop codon (in bold and underlined) for Pichia Pastoris.
  • the vector pGAPZa with the preprolder of the factor c ⁇ was linearized with EcoRI and Not ⁇ , and the corresponding amplified fragment was digested with Ecof?
  • the pGAPZa-PM1 construct was used to amplify the a-PM1 fusion gene by means of the following primers: (SEQ ID NO: 15) ⁇ -F (5 ' - ATAGGATCCatgagatttccttcaatttttactgctgtt-3 ' ) that includes the BamH target ( in capital letters) and (SEQ ID NO: 16) PM1 -R (5'-tcaatgtccgcgttcgcaggga- 3 ' ). The fragment obtained was digested with Not.
  • the episomic vector pJRoC30 was digested with BamHl and amplified with Klenow for blinding with blunt ends. Finally, the plasmid was digested with Not, dephosphorylated and ligated with aPM1 to generate pJRoC30-aPM1.
  • the directed evolution strategy was developed following the following rules: i) to adequately adjust the requirements of the host secretory pathway during the functional expression of the laccase, the complete fusion gene was subject to random mutagenesis and / or recombination. Therefore, both the pre-prelinder of factor ⁇ and the foreign laccase gene were evolved together in order to adapt both elements for a successful export by S.
  • the first two evolution cycles were carried out by error-prone PCR with different mutational rates and with DNA polymerases with different mutational profiles (Figure 1, Table 1).
  • a protocol was used that He combined the construction of mutant libraries from each parent by shuffling in vivo DNA. This strategy produced complex cross-links for each offspring along with the introduction of new point mutations ( Figure 2).
  • the best variant of the fifth cycle, the 7H2 mutant had approx. 24,300 times better activity than a-PM1, with a total activity of 1, 000 U / L.
  • the preliminary characterization of 7H2 showed a strong reduction in its thermostability with a decrease in its T 50 of approx.
  • mutants 1 D1 1 and 1 1A2 (from 73 ° C to 68 ° C, Figure 3B), which was related to the significant drop in activity during long-term storage (losing approximately 30% of its activity after 14 days at 4 o C).
  • the accumulation of beneficial but destabilizing mutations during evolution is a well described phenomenon (Bloom et al., 2006. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103, 5869-5874; Bloom and Arnold, 2009. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 106, 9995-10000; Garc ⁇ a et al., 2010. Microb. Cell Fact. 9, 17).
  • thermostability screening based on the determination of the T 50 (defined as the temperature at which the temperature at which the enzyme retains 50% of its activity after 10 min incubation) (Garc ⁇ a et al., 2010. Microb. Cell Fact. 9, 17; Bommarius et al., 2006. Curr. Opin. Biotech. 17, 606-610) .
  • T 50 defined as the temperature at which the temperature at which the enzyme retains 50% of its activity after 10 min incubation
  • thermostability 16B10
  • T 50 3 o C
  • Figure 1B the best variability of thermostability
  • 6C8 mutant still improved its total activity to values of 2,000 U / L while retaining a stability similar to 7H2.
  • 7H2 incorporated a synonym mutation plus the F454S mutation, generated by mutagenesis in combination with in vivo shuffling of DNA.
  • Phe454 is located in an ⁇ helix close to the copper of the T1 site, the place where the reducing substrate binds.
  • Phe454 is located next to one of the coordination ligands of T1 copper, His455 that appears to be involved in the binding of the reducing substrate facilitating the entry of electrons to T1 copper (Bertrand et al., 2002. Biochemistry 41 , 7325-7333; Matera et al., 2008. Inorg. Chim. Acta 361, 4129-4137).
  • Model inspection suggests that the F454S mutation allows an additional H bridge with Alai 61 ( Figure 3A).
  • the S224G mutation was the only mutation present in the PM 1 -30C mutant (of the first generation) producing a 7-fold improvement in activity (Figure 1). This variant was again used as parental in the third cycle to exert a backcrossing effect and thus, S224G was incorporated into the offspring. Unfortunately, due to the aforementioned cross-linking between 1 D1 1 and 1 1A2 in the fifth cycle, the S224G mutation was finally lost. Also, the D281 E mutation appeared independently at different times of evolution (in the PM1 -1A2 and 2G5 mutants of the first and second generation) with improvements of approx. 4 times. Again, recombination between 1 D1 1 and 1 1A2 eliminated the D281 E mutation of the laccase gene.
  • cinnabarinus laccase (P394H) is in the vicinity of T1 copper.
  • the replacement of a Pro with a His at position 394 promotes a new H bridge with the Asn208 that is close to His295, one of the T1 copper ligand (Camarero et al., 2009. Patent PCT / ES2009 / 070516) .
  • the sequence alignment of laccase PM1 with laccase of P. cinnabarinus indicates that P394 belongs to a highly conserved region between lacases of high redox potential ( Figure 10).
  • the P394H mutation (P393H using the numbering of the PM1) was introduced in 6C8 during the seventh cycle with improvements in activity of up to 3,000 U / L but with a significant loss of thermostability (the T 50 under 2 o C , Figure 3C).
  • thermostability the T 50 under 2 o C , Figure 3C.
  • a thermostability analysis could not be performed in the P. cinnabarinus laccase since P394H was introduced in the first cycle, when the expression levels were virtually undetectable (Figure 7).
  • the preprolder signal sequence of factor ⁇ encodes a polypeptide of 83 amino acids of which the first 19 residues constitute the pre-leader that directs the creation polypeptide towards the endoplasmic reticulum (ER). After entering the ER, the pre-leader is cleaved by a peptidase leaving a pro-protein. At this point, the N-glycosylations of three asparagine residues facilitate the transit of the pro-protein from the ER to the Golgi apparatus. In the Golgi, the prolific can act as a chaperone until it is processed by proteases KEX1, KEX2 and STE13 (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488; Shuster, 1991. Curr.
  • Table 2 activity improvements for mutants at positions 9 and 10 of the pre-leader of factor a.
  • the mutants were constructed using the 6C8 mutant as the parental type.
  • the spacer residues provide an even more hydrophilic environment to the target of the restriction site for KEX2 (Lys-Arg), which could affect the secretion of the mature laccase (Brake, 1990. Meth Enzymol 185, 408 -421).
  • PCR fragments were washed, concentrated and loaded on a low melting agarose gel, after which they were purified using the Zymoclean gel DNA recovery kit (Zymo Research).
  • the PCR products were cloned under the control of the Gal 1 promoter of the expression vector pJRoC30, replacing the native gene present therein.
  • plasmid pJRoC30 was linearized with Xho ⁇ and BamH ⁇ and the linear plasmid was concentrated and purified in the same manner as described above for the PCR fragments.
  • the first mutagenic library ( ⁇ 15,000 mutants) was constructed with the Genemorph I kit by adjusting the mutational rate to 1.1-1.5 mutations per kb.
  • the second and third libraries ( ⁇ 15,000 mutants each) were constructed with the Genemorph II kit by adjusting the mutational rate to 0-4.5 and 4.5-9 mutations per kb, respectively.
  • Error-prone PCR was carried out in a gradient thermocycler (Mycycler, BioRad, USA) using the following parameters: 95 ° C for 2 min (1 cycle); 94 ° C for 0.45 min, 53 ° C for 0.45 min, 74 ° C for 3 min (28 cycles); and 74 ° C for 10 min (1 cycle).
  • Primers used for amplification were: Direct RMLN (SEQ ID NO: 17) (5'- CCTCTATACTTTAACGTCAAGG-3 ', which binds to pb 160-180 of pJRoC30-aPM1) and inverse RMLC (SEQ ID NO: 18) (5 - GGGAGGGCGTGAATGTAAGC-3 ', which joins pb 2028-2048 of pJRoC30-aPM 1).
  • SEQ ID NO: 18 - GGGAGGGCGTGAATGTAAGC-3 ', which joins pb 2028-2048 of pJRoC30-aPM .
  • 40 and 66 bp fragments homologous to the linear vector were designed.
  • the PCR products 400 ng
  • Transforming cells were seeded on SC plates and incubated for 3 days at 30 ° C. Colonies with the complete autonomous replication vector were chopped and subjected to screening assays, as well as additional re-screenings. From the first to the fifth cycle of evolution the libraries were explored in order to find improvements in activity, and from the sixth cycle, a thermostability test was incorporated.
  • the second generation was performed by mutagenic PCR with Mutazyme I DNA polymerase and using the PM1 -60 mutant as parental.
  • the mutational rate was adjusted to 2.1-3.5 mutations per kb and the mutagenic library ( ⁇ 1000 mutants) was prepared as described for the first generation.
  • the best variants of the second generation (3E1, 10D2, 2G5 and 4C2) were subjected to amplification with Taq / MnCI 2 and recombination by in vivo shuffling of DNA (-1,000 clones).
  • the first generation PM1 -30C mutant was also included as a parental for backcrossing.
  • Taq / MnCI 2 amplifications were prepared in a final volume of 50 pL containing 90 nM RMLN, 90 nM RMLC, 0.1 ng / pL template, 0.3 mM dNTPs (0.075 mM each), 3% DMSO, 1 , 5 mM MgCl 2 , 0.05 U / pL Taq polymerase.
  • PCR products were mixed in quantities equimolar and transformed together with the linearized vector in yeast (PCR products: vector ratio, 4: 1).
  • a library of ⁇ 1 .300 clones was constructed per assembly of IvAM mutant libraries (Zumárraga et al., 2008. Proteins 71, 250-260).
  • the 7H2 mutant was used as parental, and the Taq / MnCI 2 and Mutazyme libraries were mixed in equimolar amounts, and transformed into competent S. cerevisiae cells together with the linearized vector as described above (library ratio: vector, 8: 1). From this generation a thermostability screening was incorporated (see below).
  • the seventh and eighth generation were obtained by directed mutagenesis using "In Vivo Overlap Extension” (IVOE) (Mayor, 2010. In vitro Mutagenesis Protocols, J.Bramman, ed. (Totowa, New Jersey, US: Humana Press). simultaneously two PCR reactions to amplify the two DNA fragments that overlap at specific positions corresponding to the target regions of directed mutagenesis in the parental sequence. The PCR reactions were made in a final volume of 50 iendo containing 0.25 ⁇ of each primer, 100 ng of mold, 0.25 mM of each dNTP, 3% DMSO and 2.5 Units of Pfu-Ultra DNA polymerase.
  • IVOE In Vivo Overlap Extension
  • the PCR conditions were as follows: 95 ° C for 2 min (1 cycle); 94 ° C for 0.45 min, 55 ° C for 0.45 min, 74 ° C for 2 min (28 cycles); and 74 ° C for 10 min (1 cycle).
  • the PCR fragments were loaded on low melting agarose gels and purified using the "Zymoclean gel DNA recovery" kit. Plasmid pJRoC30 was linearized with Xho ⁇ and BamH ⁇ and the linearized vector was purified as described above for the PCR fragments.
  • the PCR fragments 400 ng each) were mixed with the linearized vector (100 ng, 8: 1 PCR product: vector ratio) and transformed into competent yeast cells as described above. On average, 50 individual clones were analyzed per mutation. Selected plasmids were isolated and sequenced to verify directed mutagenesis. 2.12. Seventh Generation
  • Mutant reversed S454F The primers for PCR 1 were: RMLN and DEL-REV (SEQ ID NO: 19) (5 ' - cgtgaacccagcctcaaggtgGAAgtcgatgtggcagtggagg-3 ' that binds at pb 5 ' - 1823-1866 -3 ' of pJRoC30-PM ).
  • Primers for PCR 2 were: OF-FOR (SEQ ID NO: 20) (5 '- cctccactgccacatcgacTTCcaccttgaggctgggttcacg-3' which binds in bp 5 '-1823- 1866-3' of pJRoC30-apM1) and RMLC.
  • Mutant S224G The primers for PCR 1 were: RMLN and 5-S315G-REV (SEQ ID NO: 21) (5 ' - gtctggggcttgagattcacGCCgtccgcctcgatgacg-3 ' that binds in pb 5 ' -1 136-1 174-3 ' of pJRoC30-aPM1).
  • Mutant D281E The primers for PCR 1 were: RMLN and 4-D372E-REV (SEQ ID NO: 23) (5'- gctcaacgggcgcagcaccTTCgtagcgaaggatggc-3 'that binds in pb 5 ' - 1308-1344-3 ' of pJRoC30- aPM1).
  • P393H mutant Primers for PCR 1 were RMLN and 3CP484HREV (SEQ ID NO: 25) (5 '- gcaagtggaaggggtgGTGgaagccgggggcggcggagg-3' which binds in bp 5 '-1639 to 1678 -3' of pJRoC30-apM1).
  • Primers for PCR 2 were: 3CP484HFOR (SEQ ID NO: 26) (5 '- cctccgccgcccccggcttcCACcaccccttccacttgc-3' which binds in bp 5 '-1639-1678- 3' pJRoC30-apM1) and RMLC.
  • the primers for PCR 1 were: RMLN-2 (SEQ ID NO: 27) (5 ' -ggtaattaatcagcgaagc-3 ' that binds in pb 5 ' -5-24-3' of pJRoC30-a) and 1 C-REVDI (SEQ ID NO: 28) (5 ' -gaggatgctgcgaataaATCatcagtaaaaattgaagg-3 ' that joins in pb 5 ' -219-257-3 ' of pJRoC30-c ⁇ PM1).
  • Primers for PCR 2 were: 1 C-fordi (SEQ ID NO: 29) (5 '- ccttcaatttttactgatGATttattcgcagcatcctc-3' which binds in bp 5 '-219-257-3' of pJRoC30-APM 1) and RMLC.
  • Double mutant Afo9lD-Dfa10] V The primers for PCR 1 were: RMLN-2 and 1 C-PREALREV (SEQ ID NO: 30) (5 ' - gaggatgctgcgaaAACATCatcagtaaaaattgaagg-3 ' that binds in pb 5 ' -219-257 - 3 ' of pJRoC30-aPM1).
  • Primers for PCR 2 were: 1 C-PREALFOR (SEQ ID NO: 31) (5'-ccttcaatttttactGATGTTttattcqcaqcatcctc-3 'which binds in bp 5' -219-257-3 'of pJRoC30-apM1) and RMLC.
  • Reversed mutant D ⁇ crfOlV The primers for PCR 1 were: RMLN-2 and 1 C- PREALDOBREV (SEQ ID NO: 32) (5 ' - gaggatgctgcgaaAACatcatcagtaaaaattgaagg-3 ' which binds at 5 ' -219-257-3 ' of the of pJRoC30-aPM1).
  • Primers for PCR 2 were: 1 PREALDOBFOR C- (SEQ ID NO: 33) (5'-ccttcaatttttactqatGTTttattcgcagcatcctc-3 'which binds in bp 5' -219-257-3 'of pJRoC30-APM 1) and RMLC. 2.13. Eighth Generation
  • the mutant OB-1 was obtained by introduction of S224G and D281 E mutations reverted mutant S454F 7 through generation.
  • the primers for the PCR1 were: RMLN and 5-S315G-REV.
  • the primers for PCR2 were: 5- S315G-FOR and 4-D372E-REV.
  • the primers for PCR3 were: 4-D372E-FOR and RMLC.
  • thermostability screenings were carried out in solid and liquid format (in 96-well plates).
  • the selected mutants were produced and purified as described below.
  • the T 50 of the OB-1 mutant was higher than those of the high-redox lacquers of Trametes hirsuta, Trametes versicolor, P. cinnabarinus, or Pleurotus ostreatus and as presumed, similar to the T 50 of Coriolopsis gallica (with 96 % sequence identity with PM1, Figure 10).
  • the stability of OB-1 was further evaluated in the presence of high concentrations of organic cosolvents with different polarities and chemical nature (Figure 4D).
  • the evolved laccase PM 1 was highly tolerant to the presence of cosolvents (retaining between 30 and 90% of its activity after 4 h of incubation in concentrations of cosolvents as high as 50% (v / v)).
  • the stability of the laccase evolved at different pH values was also evaluated, maintaining about 90% of its activity in the pH range 3-9 after 4 h of incubation ( Figure 4E).
  • the last OB-1 variant accumulated 15 mutations: 5 in the preprolder sequence of factor ⁇ (two synonyms), and 10 in the mature protein (3 synonyms).
  • Three of the five synonymous mutations favored the use of codons (Table 1), which may be a potential factor to benefit the secretion performance affecting the elongation rate (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488 ).
  • Beneficial mutations in the mature laccase were basically mapped into rather accessible waste, some located far from catalytic copper while others appeared in the vicinity of the sites. catalytic (Table 4 and Figures 5, 9 summarize the characteristics of these changes in the structure of the mutant laccase).
  • Val ⁇ 62 is one of the hydrophobic residues in the loop that delimits the pocket of the substrate pocket of the T1 site (Bertrand et al., 2002. Biochemistry 41, 7325-7333).
  • the change from Val to Ala in this position represents the replacement of a hydrophobic residue with another that is also smaller but which could favor the substrate binding ( Figures 5A, 5B).
  • Ser426 is connected by a bridge of H to Gly428 but after the mutation the bridge of H is interrupted and the resulting Asn426 establishes a new bridge of H with the adjacent Thr427.
  • Thr427 is doubly linked to His394 which is ligand of T1 copper, so this change could affect the relative position of His394 with respect to the T1 site ( Figures 5A, 5B).
  • Ala461 is adjacent to Phe460, which constitutes the position of the fourth axial ligand in plant and bacterial shells (Mayor, 2007.
  • Industrial Enzymes Structure, functions and applications, J. Polaina and AP MacCabe, eds. (Dordrecht, The Netherlands : Springer) 459-474), and establishes hydrogen bonds with the T1, His455 and Cys450 copper ligands.
  • the A461 T mutation seems to generate a new H bridge with the Phe460, which could change the local geometry of the T1 site (Xu et al., 1998. Biochem. J. 334, 63-70), Figures 5A, 5B.
  • Asp281 is located in a distal loop of domain D2 and is practically exposed to the protein surface (about 40 A from the site of copper T1).
  • the substitution of an Asp for a Glu at position 281 broke two bridges of H with the Thr188 and the Thr190 of a neighboring loop, and produced a new bridge of H with the Gly282 of the same motive, which could increase the flexibility of this zone ( Figures 5E, 5F).
  • the aforementioned mutations improve the folding and maturation of the laccase in S. cerevisiae, in addition to its possible contribution to the final robustness of the protein.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención describe la evolución dirigida de una lacasa de alto potencial redox expresada funcionalmente en S. cerevisiae que presenta una alta tasa de producción, una elevada actividad y una gran termoestabilidad. La presente invención se refiere a la secuencia aminoacídica de dicha lacasa y a la secuencia nucleotídica que codifica para dicha lacasa. La lacasa de la invención presenta aplicaciones en diversos sectores: nano-biotecnología, industria papelera, biorremediación, industria textil, industria alimentaria, industria farmacéutica, industria química, etc.

Description

Lacasa de alto potencial redox
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, la tecnología del ADN recombinante y la biotecnología. Específicamente, se refiere a una enzima oxidasa de tipo lacasa mejorada en su expresión funcional, su actividad catalítica y su termoestabilidad. La expresión funcional, mejora de actividad catalítica y termoestabilidad de la lacasa se lleva a cabo en células eucariotas de Saccharomyces cerevisiae a través de un proceso de evolución molecular dirigida. Dicha enzima pueden emplearse como catalizador en procesos industriales relacionados con la transformación de la biomasa lignocelulósica para la obtención de biocombustibles o la elaboración de productos de madera y papel con nuevas propiedades, para el sector alimentario, la producción textil y el sector químico, así como para la biorremediación de efluentes y contaminantes ambientales, y para el diseño de bionanodispositivos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las lacasas (EC 1 .10.3.2) son un grupo de oxidasas ampliamente distribuido en plantas superiores y en hongos, aunque también se han descrito en algunas bacterias e incluso en cutículas de insectos (Alcalde, 2007. Industrial enzymes. Structure, function and applications. Ed. Polaina, J. y MacCabe, A.P. Springer, Heidelberg (Alemania), pp. 459-474). Pertenecen a la familia de las oxidasas multicobre azul (junto con las ascorbato oxidasa y la ceruloplasmina), y se presentan generalmente como glicoproteínas monoméricas extracelulares.
Las lacasas, individualmente, catalizan la oxidación de un amplio espectro de sustancias orgánicas aromáticas. Entre estas sustancias se encuentran los orto y para-difenoles, los fenoles metoxi-substituidos, los bencenotioles, los hidroxindoles, el 1 -naftol y la siringaldazina (Gianfreda et al. , 1999. Bioremediation Journal 3: 1 -25). Los radicales libres resultantes sufren diferentes reacciones dependiendo de su estructura y de las condiciones de reacción. El acoplamiento de radicales libres generando productos diméricos o poliméricos y las descarboxilaciones oxidativas son las reacciones más frecuentes. También son sustratos de lacasas los compuestos metálicos inorgánicos/orgánicos. El Mn2+ es oxidado a Mn3+ y también el Fe (EDTA)2" es aceptado por la enzima (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140:19-26).
La oxidación de todos estos sustratos va acoplada a la reducción del oxígeno molecular a dos moléculas de agua. Esto significa que por cada molécula de oxígeno reducida, se oxidan 4 moléculas de sustrato sin producir peróxido de hidrógeno. Por estos motivos, las lacasas se consideran como los catalizadores "verdes" ideales ya que emplean 02 como co-sustrato generando únicamente H20 como subproducto.
Las lacasas contienen un cobre de tipo 1 (T1 ) donde tiene lugar la oxidación del sustrato reductor, y un centro o cluster trinuclear con tres cobres, un T2 y dos T3, donde tiene lugar la reducción del 02. El mecanismo de reacción debe funcionar como una batería, almacenando electrones de las reacciones de oxidación individuales para reducir el oxígeno molecular y producir agua (Davies, 2002. Lacease. En: Handbook of Metallproteins. (ed A. Messercschimdt et al), pp. 1359-1368. John Wiley and Sons, LTD, New York).
El potencial redox formal (Ε°') de las lacasas tiene una relación directa con la energía requerida para arrancar un electrón al sustrato reductor, constituyendo una de las características fundamentales de estas enzimas. De hecho, el comportamiento catalítico de las lacasas sobre la mayoría de los sustratos reductores depende del E°' en el Cu T1 (aceptor de electrones). De este modo, las lacasas con un mayor E°T1 son de especial interés en biotecnología debido a que son capaces de oxidar sustratos con mayor E°' como ciertos hidrocarburos aromáticos policíclicos o diversos colorantes orgánicos sintéticos. El E°' de diferentes lacasas ha sido ampliamente estudiado mediante técnicas espectroelectroquímicas (principalmente voltamperometría cíclica y valoraciones redox) haciendo uso de diferentes tipos de electrodos y mediadores redox (Xu, F. et al., 1998. Biochem. J. 334:63-70; Shleev, S.V. et al. 2004. Biochimie 86:693-703).
El E°' del Cu T1 de algunas lacasas fúngicas es mayor (E°T1 cercano a +800 mV) que el de las lacasas de plantas o bacterianas (por ejemplo la lacasa de Rhus vernicifera tiene un E° ' T1 = +400 mV) y otras oxidasas multicobre azul (ascorbato oxidasa E°T1 = +340 mV). Sin embargo, es importante señalar que también existen marcadas diferencias en los E°T1 de las diferentes lacasas fúngicas, desde +465 mV de la lacasa del ascomiceto Myceliophtora thermophila hasta +790 mV de la lacasa del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus. En este sentido, se ha realizado un enorme esfuerzo con la intención de dilucidar qué factores determinan estas diferencias en los E°T1 , sobre todo si se tienen en cuenta las geometrías de coordinación de los sitios de Cu, prácticamente conservadas. La mayor parte de estos estudios físico- químicos se ha servido del conocimiento aportado por los modelos cristalográficos disponibles. En concreto se han resuelto a fecha de hoy las estructuras en 3D de 8 lacasas de Coprinus cinereus, Melanocarpus albomyces, Bacillus subtilis, Trametes versicolor, Rigidoporus lignosus, Lentinus tigrinus, Trametes trogii y Pycnoporus cinnabarinus.
Las llamadas "lacasas de alto potencial redox" -procedentes de hongos basidiomicetos de podredumbre blanca- poseen un enorme potencial biotecnológico debido a su amplia especificidad de sustrato (oxidan fenoles, aminas, tioles, antraceno, etc.) y a sus bajos requerimientos de aplicación (sólo requieren oxígeno, que es transformado en agua durante la reacción). Cuando actúan sobre el polímero de lignina (o compuestos de tipo fenólico) pueden catalizar tanto actividades de degradación como de polimerización. Además, su rango de sustratos puede ser ampliado a compuestos no fenólicos más difíciles de degradar utilizando mediadores redox, de origen natural o sintético, en los denominados sistemas lacasa-mediador (Camarero et al., 2005. Appl. Environ. Microb. 71 :1775-1784). La tecnología de las lacasas de alto potencial redox puede ser empleada en prácticamente la totalidad de la cadena de producción de productos papeleros: la elaboración de la pasta de papel, el blanqueo libre de cloro de las pastas, la eliminación del pitch o el tratamiento de efluentes.
En la industria de productos forestales dos áreas más de investigación emergentes son a) el diseño de materiales lignocelulósicos con nuevas propiedades de resistencia y estabilidad mediante el injerto de compuestos fenólicos catalizado por Iacasa, en la denominada "funcionalización de las fibras de celulosa"; y b) el uso de lacasas para la mejora en la adhesión de tableros de madera (mediante el acoplamiento enzimático in situ de la lignina), sin necesidad de utilizar adhesivos tóxicos a base de formaldehído. Además, las lacasas encuentran aplicaciones en los siguientes sectores (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1 :38-50): i) La industria alimentaria: procesamiento de bebidas o de productos de panadería.
ii) La industria textil: degradación (detoxificación) de los colorantes de los efluentes o blanqueo de tejidos (lavado a la piedra de jeans).
iii) Nanobiotecología: a) como detectores de fenoles, oxígeno, azidas, morfina, codeína, catecolaminas o flavonoides en la elaboración de biosensores para análisis clínicos y medioambientales; y b) elaboración de biopilas de combustible que ofrecen energía eléctrica limpia (sin utilizar combustibles fósiles) mediante la inmovilización de lacasas en el cátodo.
iv) Biorremediación: degradación de PAHs (Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos), compuestos AOX (Halógenos Orgánicos Absorbibles), etc. v) Síntesis química: a) producción de polímeros complejos (ej. policatecol para resinas de cromatografía); b) síntesis de agentes farmacológicos: antitumorales (ej. viblastina), nuevos derivados antibióticos (ej de la ciclosporina A), o colorantes (Suberasa® de Novozymes); c) cosméticos: tintes de cabello formulados con Iacasa. La aplicación de las lacasas a nivel industrial requiere de sistemas de expresión robustos que proporcionen altos niveles de enzima activa. El empleo de sistemas de expresión heterólogos posibilita la producción de lacasas de diferentes procedencias en un mismo hospedador, así como de nuevas variantes con propiedades mejoradas con respecto a la enzima salvaje.
Por este motivo, se ha estudiado en profundidad la expresión heteróloga de lacasas fúngicas en hospedadores eucariotas (Kunameni et al. 2008 Microbial Cell Faetones. , 7:32). Se ha realizado especial hincapié en sistemas de expresión basados en hongos filamentosos (Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae y Trichoderma reseei); y levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Pichia methalonica, Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis). Gracias a los avances obtenidos en el diseño de biorreactores y a la optimización de las condiciones de expresión en levaduras, se han alcanzado niveles de expresión de unos 20 mg de lacasa activa por litro de cultivo en Yarrowia lipolytica o Pichia pastoris. Estos niveles son significativamente inferiores a los 135 mg/L obtenidos en Aspergillus oryzae o los 920 mg/L en Trichoderma. Sin embargo, la elección de levaduras como S. cerevisiae como hospedador ofrece la valiosa ventaja de poder mejorar las propiedades catalíticas de las lacasas recombinantes o su estabilidad en las condiciones de operación, mediante técnicas de evolución molecular dirigida.
Se ha estudiado la expresión en S. cerevisiae de lacasas de los hongos Coriolus hirsutus, Trametes versicolor, Melanocarpus albomyees, Trametes sp. strain C30, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus coccineus y Pleurotus eryngii, aunque los niveles de expresión funcional detectados han sido mínimos (Kunameni et al., 2008. Microbial Cell Faetones. 7:32). No obstante, la expresión funcional de lacasas fúngicas en S. cerevisiae puede ser incrementada significativamente mediante técnicas de evolución molecular dirigida, que permite el diseño de nuevas funciones enzimáticas no existentes en ambientes naturales o la mejora de ciertas propiedades de la enzima (Arnold, 2001. Nature 409:253-257). Esta metodología recrea en el laboratorio los procesos claves de la evolución natural (mutación, recombinación y selección) de manera que es posible diseñar enzimas de gran interés científico y tecnológico. De esta manera, sometiendo los genes seleccionados a ciclos sucesivos de evolución molecular, las diferentes mutaciones puntuales beneficiosas se irán acumulando y combinando hasta adquirir la propiedad deseada, que se ve mejorada de manera exponencial, generación tras generación. Utilizando este procedimiento se consiguió incrementar hasta 18 mg/L la producción de lacasa del ascomiceto Myceliophthora thermophila en S. cerevisiae (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995. 2003).
En la evolución in vitro, mediante mutagénesis aleatoria inducida y/o recombinaciones en el material genético que codifica para una o varias proteínas, se crea una diversidad genética que posteriormente se expresa y explora bajo las condiciones en las que se quiere mejorar la enzima (altas temperaturas o medios no convencionales, pHs extremos, etc.). La mayoría de las características enzimáticas -regioespecificidad, enantioespecificidad, termoestabilidad, estabilidad en disolventes orgánicos, expresión génica, incluso la búsqueda de actividades de novo en el caso de anticuerpos catalíticos- pueden ser sometidas a experimentos de evolución dirigida (Tao & Cornish, 2002. Curr. Opin. Chem. Biol. 6:858-864.).
Aunque, considerando la eficiencia de transformación, la estabilidad del ADN plasmídico y la tasa de crecimiento, E. coli es el organismo hospedador más frecuentemente utilizado en la expresión funcional heteróloga de los genes que codifican la proteína de interés, el diferente uso de codones, y la imposibilidad de realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para la correcta secreción de la proteína madura (como el procesamiento proteolítico o las glicosilaciones) pueden causar un plegamiento inapropiado de la proteína que es acumulada en cuerpos de inclusión, impidiendo su expresión funcional. Esto es especialmente cierto para las lacasas fúngicas para las que no se ha logrado todavía su expresión funcional en E. coli. Algunos de estos problemas pueden evitarse si estos genes se expresan en hospedadores eucarióticos cuya maquinaría celular sea más próxima a la nativa, como es el caso de las levaduras. En especial, el uso de Saccharomyces cerevisiae es de gran interés ya que posee la habilidad de glicosilar y secretar las proteínas al medio extracelular (lo cual evita en muchos casos pasos intermedios de lisis celular) y tiene una elevada eficiencia de transformación. Además, haciendo uso de un vector episódico adecuado, no integra el plásmido dentro de su genoma, facilitando así su posterior manipulación. Otra ventaja muy interesante desde un punto de vista evolutivo es su elevada frecuencia de recombinación de ADN, la cual a diferencia de E. coli permite la construcción de genotecas in vivo a través de la recombinación homologa de diferentes genes (conocido como in vivo ADN shuffling o "barajeo"). Por último, la ligación de los genes mutados en vectores de expresión es, en muchos casos, un paso laborioso que requiere un ajuste fino. En levaduras, el mecanismo reparador de huecos (in vivo gap repair) puede sustituir la ligación in vitro de una manera rápida y precisa (Bulter & Alcalde, 2003. Directed evolution: library creation. Methods and protocols. Ed. Arnold, F.H. y Georgiou, G. Humana Press, Totowa, New Jersey (EEUU), pp. 17-22).
La evolución molecular dirigida de lacasas fúngicas presenta como requisito indispensable la expresión funcional de la enzima en Saccharomyces cerevisiae. La expresión funcional en S. cerevisiae de lacasas de alto potencial redox -procedentes de basidiomicetos- no se ha descrito con éxito hasta el momento. Únicamente se ha reportado la mejora por evolución dirigida de lacasas de bajo potencial de oxido-reducción por el grupo de M. Alcalde y colaboradores. Dichos trabajos se han centrado en la lacasa de bajo potencial redox (E° T1 = +475 mV) del ascomiceto Myceliophthora thermophila. En estos trabajos, los niveles de expresión funcional en S. cerevisiae se lograron beneficiándose de la similitud existente entre el microorganismo de partida (Myceliophthora thermophila) y S. cerevisiae, ambos ascomicetos. Con este sistema se ha conseguido mediante evolución dirigida: i) su expresión funcional en S. cerevisiae, (Bulter et al.., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995.); y ii) su estabilización en cosolventes orgánicos, (Zumarraga et al., 2007. Chem. Biol. 14: 1052-1064.; Zumarraga et al., 2008. Proteins 71 : 250-260.; Zumarraga et al., 2007 Biocatal. Biotrans. 25: 219-228; Alcalde et al., 2005. J. Biomol. Screen. 10: 624-631 ). Dado que el rango de actuación de la lacasa evolucionada de Myceliophthora thermophila está limitado por su bajo potencia! redox (E°T1 = +475 mV) que le impide catalizar eficientemente la oxidación de moléculas con potenciales redox superiores al suyo, las lacasas de alto potencial redox producidas por hongos basidiomicetos de podredumbre de la madera suponen un punto de partida más adecuado para la mejora de las propiedades de la lacasa por evolución dirigida, debido a su mayor aplicabilidad biotecnológica.
Las lacasas de alto potencial redox son un claro ejemplo de biocatalizador generalista que convierte en virtud su promiscuidad de sustratos. Impulsadas por oxígeno molecular, las lacasas de alto potencial redox transforman cientos de sustratos de diferente naturaleza y complejidad, abarcando desde xenobióticos (por ejemplo: pesticidas, tintes industriales, hidrocarburos aromáticos policíciicos) hasta biopoiímeros (lignina, almidón). De aquí que las lacasas de alto potencial redox encuentren aplicaciones potenciales en biorremediación, refinado de textiles, bioblanqueo de pasta de papel, biocombustibles, síntesis orgánica y muchos otros procesos (Xu, 2005. Biochem. J. 334, 63-70; Kunamneni et al., 2008. Microb. Cell Fact. 7, 32; Widsten y Kandelbauer, 2008. Enzyme Microb. Tech. 42, 293-307). Además, las lacasas de alto potencial redox son de las pocas enzimas capaces de aceptar electrones de manera directa desde un compartimento catódico, siendo así esenciales para la bioelectroquímica en la ingeniería de nanobiodispositivos, lo cual genera un interés especial en el diseño de bionanosensores tridimensionales y biopilas de combustible (Shleev et al., 2005. Bioelectrochemistry 67, 1 15-124). Desafortunadamente, su diseño práctico mediante evolución dirigida se ha visto hasta ahora impedido por la falta de enfoques apropiados para evitar los complejos problemas encontrados durante su expresión funcional (Roodveldt et al., 2005. Curr. Opin. Struc. Biol. 15, 50-56). De hecho, existen únicamente unos pocos estudios preliminares debido a la pobre exocitosis producida por la levadura (Festa et al., 2008. Proteins 72, 25-34; Cusano et al., 2009; Miele et al., 2010. J. Appl. Microbiol. 108, 998-1006). La lacasa de alto potencial redox de la presente invención, diseñada ad hoc, es fácilmente exportable y soluble, en forma activa y estable, lo que abre un abanico de posibilidades para su futura ingeniería. En efecto, el meticuloso diseño experimental empleado, que involucró la evolución dirigida y la mutagénesis dirigida, ha sido crucial para crear un biocatalizador altamente activo y termoestable que ahora está disponible para enfrentarse a nuevos retos. Asimismo, la evolución conjunta del gen foráneo de la lacasa de alto potencial redox con el gen del preprolíder del factor α proporciona una forma idónea de mejorar estas capacidades a partir de niveles de expresión indetectables. Esta estrategia puede ser ahora aprovechada para diseñar otras lacasas de alto potencial redox, lo que apoya la idea general de emplear la evolución dirigida del preprolíder del factor α como molde general para la expresión de diferentes sistemas enzimáticos (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1 192-1201 ). Esperamos que en el futuro próximo, las lacasas de alto potencial redox diseñadas mediante evolución dirigida y enfoques racionales en S. cerevisiae puedan afrontar retos atractivos presentes en la biocatálisis tradicional y moderna.
El grupo de M. Alcalde y colaboradores describe en Microbial Cell Faetones (2010, 9:17) varias lacasas generadas mediante varios métodos de evolución dirigida de las secuencias polinucleotídicas que comprenden el gen de la lacasa de alto potencial redox (E°T1 = +790 mV) del hongo basidiomiceto PM1 , y la secuencia codificante de la secuencia señal nativa del factor a. De esta forma, estos autores han dado lugar a una expresión funcional mejorada en S. cerevisiae y a una actividad enzimática aumentada hacia uno o más sustratos. Sin embargo, hasta la fecha no se ha conseguido producir lacasas de alto potencial redox con una elevada actividad y una elevada termoestabilidad en cantidad suficiente. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe la evolución dirigida de una lacasa de alto potencial redox expresada funcionalmente en S. cerevisiae que presenta una elevada actividad y una gran termoestabilidad. El punto de partida fue la lacasa de alto potencial redox del basidiomiceto P 1 , la cual exhibe unas destacables propiedades de estabilidad y actividad, incluyendo activación térmica (Coll et al., 1993. Appl. Environ. Microb. 59, 2607-2613). Tras reemplazar la secuencia señal nativa por la secuencia preprolíder del factor α con el fin de regular el tráfico de la proteína heterologa, la proteína de fusión fue objeto de 8 ciclos de evolución de laboratorio en combinación con enfoques racionales. El último muíante de este proceso, constituye una valiosa herramienta para diseñar lacasas de alto potencial redox ad hoc para diferentes aplicaciones.
Por tanto, la presente invención proporciona una nueva lacasa con alto potencial redox, alta tasa de producción, alta actividad y alta termoestabilidad. La presente invención se refiere a la secuencia aminoacídica de dicha lacasa y a la secuencia nucleotídica que codifica para dicha lacasa.
Los autores de la presente invención han utilizado una combinación metodológica basada en la evolución y la mutagénesis dirigida y han confeccionado una lacasa que resuelve la necesidad de un biocatalizador con elevada actividad y termoestabilidad, y que además presenta una alta tasa de producción funcional (8 mg/L; 1400 U/L de fermentado). La lacasa de la presente invención es altamente estable frente a la temperatura (valores de T50= 73°C), la presencia de cosolventes orgánicos y en un amplio intervalo de pH (estable en el intervalo 3 a 9). Dicha lacasa posee unos valores cinéticos del orden de 6 veces superiores a los descritos para lacasas equivalentes en el estado de la técnica, por lo que su diseño evolutivo ha permitido:
i) incrementar 34000 veces los niveles de actividad total;
ii) incrementar sus constantes catalíticas,
iii) mantener una elevada estabilidad frente a diversos factores (temperatura, pH, cosolventes).
Por tanto, las principales ventajas de la lacasa de la presente invención son:
i) presenta una alta tasa de producción,
ii) presenta una elevada actividad y
iii) presenta una elevada termoestabilidad.
Un primer aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido (en adelante llamado polinucleótido de la invención) que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (en adelante llamado polipéptido de la invención). En una realización preferida, el polinucleótido de la invención tiene la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2. El término "polinucleótido", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos.
El término "codifica", tal y como se emplea en la descripción, hace referencia a la correlación que existe entre los tripletes de nucleótidos o codones en una secuencia de ADN y los aminoácidos que forman los péptidos, las secuencias aminoacídicas o las proteínas. Cuando se dice que una secuencia nucleotídica codifica para un péptido, significa que cuando dicha secuencia nucleotídica sea transcrita a ARN mensajero (ARNm) y este ARNm sea traducido, se generará dicho péptido. El término "péptido", "polipéptido" o "proteína", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud. Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética (en adelante llamada construcción genética de la invención) que comprende:
a. el polinucleótido de la invención, o
b. el polinucleótido de la invención, que además comprende un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido, y/o con otras secuencias nucleotídicas necesarias o apropiadas para la transcripción in vitro o in vivo y su regulación en tiempo y lugar.
Una construcción genética puede incluir los vectores de clonación y expresión génica que comprende el polinucleótido de la invención. Tales vectores de expresión génica incluyen secuencias de control, tales como, por ejemplo, elementos de control de la traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de la transcripción (por ejemplo, regiones de promotor-operador, sitios de unión). Los vectores conforme a la invención pueden incluir plásmidos bacterianos y vectores virales, y otros vectores de acuerdo con los procedimientos bien conocidos y documentados en el estado de la técnica, y pueden expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes, asimismo bien conocidos y documentados. Se conoce, así mismo, una variedad de técnicas que pueden utilizarse para introducir tales vectores en células procarióticas o eucarióticas (células hospedadoras) para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en el estado de la técnica. Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control. El término "secuencia de control" se refiere a secuencias de nucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. La expresión "unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
En una realización preferida, la construcción genética de la invención además comprende un polinucleótido que codifica para un péptido señal mejorado por evolución dirigida que favorece la expresión funcional del polipéptido de la invención. Preferiblemente, el péptido señal es el del factor , de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, el polinucleótido que codifica para el péptido señal es la secuencia nuecleotídica SEQ ID NO: 10. Preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3. Más preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4.
El término "péptido señal", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a un péptido que se localiza en el extremo amino de un polipéptido o proteína, y cuya función es dirigir la localización de la proteína a distintos compartimentos de la célula (núcleo, mitocondria, cloroplasto, retículo endoplásmico (RE), aparato de Golgi (AG), etc.) o al espacio extracelular, en el caso de que la proteína sea secretada. El péptido señal del factor α es un polipéptido de 83 aminoácidos. Los 19 primeros aminoácidos constituyen el prelíder que dirige el polipéptido en creación hacia el RE. Tras entrar en el RE, el prelíder es escindido por una peptidasa, dejando una pro-proteína. En este punto, las N-glicosilaciones de tres residuos de asparagina facilitan el tránsito de la pro-proteína del RE al AG. En el AG, el prolíder puede actuar como chaperona hasta que es procesado por las proteasas KEX1 , KEX2 y STE13 (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488; Shuster, 1991 . Curr. Opin. Biotech. 2, 685-690). Además, el prolíder parece estar implicado en un proceso de señalado vacuolar, que es perjudicial para la secreción heteróloga (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1 192-1201 ).
En una realización preferida de la construcción genética de la invención, entre la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal del factor α SEQ ID NO: 9 y la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (ambos mejorados por evolución dirigida), se encuentra la secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos ácido glutámico y fenilalanina. Más preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende el polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5. Más preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 6.
Estos dos aminoácidos (ácido glutámico y fenilalanina) son consecuencia de la estrategia de cionaje empleada para fusionar la secuencia nucleotídica que codifica para el factor α con la secuencia nucleotídica que codifica para la lacasa de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora (en adelante llamada célula de la invención) que comprende el polinucleótido de la invención o la construcción genética de la invención. Más preferiblemente, la célula de la invención es una levadura. Más preferiblemente, la célula de la invención pertenece al género Saccharomyces. Aún más preferiblemente, la célula de la invención pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).
El término "célula hospedadora", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a una célula que sirve como recipiente del polinucleótido de la invención o de la construcción genética de la invención. El término "célula hospedadora", tal y como se emplea en la descripción, también puede referirse a una célula que expresa una proteína de interés (por ejemplo, la lacasa de la invención) donde la célula hospedadora es transformada con un vector de expresión que contiene el polinucleótido de la invención o la construcción genética de la invención, además de otras secuencias nucleotídicas de control.
La levadura de cerveza S. cerevisiae es un hongo unicelular que pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungí, Subreino Dikarya, Phylum Ascomycota, Subphylum Saccharomycotina, Clase Saccharomycetes, Orden Saccharomycetales, Familia Saccharomycetaceae y Género Saccharomyces.
Otro aspecto de la invención se refiere a una lacasa de alto potencial redox (en adelante llamada lacasa de la invención) que comprende el polipéptido de la invención. Preferiblemente, la lacasa de la invención además comprende los aminoácidos ácido glutámico y fenilalanina en el extremo amino del polipéptido, y su secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 7. Más preferiblemente, la lacasa de la invención además comprende los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal del factor α mejorado por evolución dirigida (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina) en el extremo amino del polipéptido, y su secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 8.
La cola extra amino terminal de 2 aminoácidos no altera la termoestabilidad ni la actividad de la lacasa de la invención. La presencia de los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal del factor α (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina) se debe a la falta de procesado por parte de la proteasa STE13. Este es un fenómeno común en casos en los que una proteína alcanza niveles de hipersecreción, como sucede con la lacasa de la invención cuando es producida por la célula hospedadora de la invención. Es bien sabido que la cantidad de proteasa STE13 producida por la maquinaria de S. cerevisiae está ligada a la producción del factor a, de ahí que cuando la lacasa fusionada al preprolíder del factor se hipersecreta, los niveles de la proteasa STE13 generados no son suficientes para procesar correctamente el extremo terminal del prolíder. La cola extra amino terminal de 6 aminoácidos (los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal del factor y los dos aminoácidos producto de la estrategia de clonaje) no altera la termoestabilidad ni la actividad de la lacasa de la invención. El término "amino terminal", tal y como se emplea en la descripción, se refiere al extremo desde el que se crea el polipéptido o proteína durante la traducción del ARNm. Este extremo se denomina animo terminal porque el aminoácido que se sitúa en la posición inicial presenta el grupo amino libre. El término "proteasa", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a una proteína con actividad enzimática o enzima capaz de cortar (digerir, lisar, proteolizar o procesar) un polipéptido o proteína en una región concreta de su secuencia aminoacídica. Una proteasa también puede llamarse peptidasa o hidrolasa, ya que rompe el enlace peptídico entre dos aminoácidos de una secuencia aminoacídica, polipéptido o proteína.
La expresión "falta de procesado", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a la ausencia de corte por parte de la proteasa. Se entiende por procesamiento de una enzima el fenómeno por el cual dicha enzima modifica su sustrato. En este caso, se entiende por procesamiento de la proteasa el corte del polipéptido al final de la secuencia aminoacídica del péptido señal del factor a. El término "hipersecreción", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a una secreción aumentada en gran medida. Esta secreción grandemente aumentada se debe a la presencia del péptido señal del factor α con la secuencia aminoacídica mejorada SEQ ID NO: 9. La hipersecreción de la lacasa de la invención permite la alta tasa de producción de dicha lacasa.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de la lacasa de la invención, que comprende:
a. cultivar la célula hospedadora de la invención, y
b. purificar la lacasa.
El término "purificar", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a la separación de la lacasa de la invención y a su concentración, a partir del medio de cultivo de la célula de la invención. La separación de la lacasa puede llevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografía, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografía pueden estar basadas en el peso molecular, la carga o la afinidad de la proteína y puede realizarse en columna, en papel o en placa. La separación de la proteína puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés Fast Protein Liquid Cromatography), en un sistema automatizado que reduce notablemente el tiempo de purificación e incrementa el rendimiento de la purificación.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del polinucleótido de la invención o de las construcciones genéticas de la invención para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
Otro aspecto de la invención se refiere a un cultivo de células hospedadoras de la invención. Un cultivo de células hospedadoras se refiere al proceso de mantener y crecer las células hospedadoras. Los cultivos celulares necesitan condiciones controladas de temperatura, pH, porcentajes de gases como el dióxido de carbono y el oxígeno, así como la presencia de los nutrientes adecuados para permitir la viabilidad y la división celular. Los cultivos celulares pueden desarrollarse en sustratos sólidos como el agar, o en medio líquido, lo que permite cultivar grandes cantidades de células en suspensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del cultivo de células hospedadoras de la invención para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura. 1. Muestra la Ruta de Evolución Artificial de a-PM1 . Se empleó una combinación de estrategias evolutivas (mutagénesis aleatoria, barajado in vivo dei ADN (del inglés "in vivo DNA-shuffling"), ensamblaje in vivo de librerías mutagénicas con diferente espectro mutacional (IvAM, del inglés "in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra") y racionales (mutagénesis dirigida tanto para recuperar mutaciones beneficiosas como para el intercambio mutacional con HRPL evolucionadas) durante la evolución del gen de fusión a-PM1. El punto de partida para las mutaciones incorporadas en el 7o ciclo por mutagénesis dirigida está indicado por las flechas punteadas. MAT: mejora en la actividad total frente al tipo parentai de la generación anterior. MT: mejora en la termoestabilidad frente al tipo parental de la generación anterior.
Figura 2. Muestran los entrecruzamientos sugeridos durante la Evolución Dirigida de a-PM1 . El pre-líder del factor-α está representado en gris, el prolíder del factor-α en blanco y la PM 1 madura en negro. Las nuevas mutaciones puntuales están señaladas en gris. Con doble asterisco está señalado el mutante 16B10, el mejor mutante de termoestabilidad de la 6a generación. Figura. 3. Muestra el enfoque racional de la Termoestabilidad. (A) Detalle del modelo 3D de la lacasa mostrando la ubicación del Residuo 454 en las inmediaciones del sitio Cu T1 para el parental PM1 y el mutante 7H2. S454 establece dos puentes de hidrógeno con A458 y después de la mutación, forma un enlace adicional con A161 . La esfera es el cobre T1 . Termoestabilidad de HRPLs evolucionadas: (B) T50 de los mutantes de la 4a, 5a y 6a generación. Círculos negros, mutante 1 D1 1 (4a G); triángulos blancos, mutante 1 1A2 (4a G); triángulos negros, mutante 7H2 (5a G); círculos blancos, mutante 6C8 (6a G); cuadrados negros, mutante 16B10 (6a G). (C) T50 de los mutantes construidos por mutagénesis dirigida usando el mutante 6C8 como molde. Triángulos negros, mutante P393H; cuadrados negros, mutante D281 E; triángulos blancos invertidos, mutante S224G; círculos blancos, mutante revertido S454F.
Figura. 4. Muestra la caracterización bioquímica del mutante OB-1 . (A, B) Perfiles de pH actividad de las lacasas mutantes. Círculos blancos, mutante 5G3 (3a G); círculos negros, mutante 1 D1 1 (4a G); triángulos negros, mutante S454F (7a G); triángulos blancos, mutante OB-1 (8a G). Las actividades se midieron en buffer Britton y Robinson 100 mM a diferentes pHs con 3 mM DMP (A) o ABTS (B) como sustratos. La actividad lacasa fue normalizada al valor de actividad óptimo y cada punto, incluyendo la desviación estándar, es la media de tres experimentos independientes. (C) T50 del mutante OB-1 y otras HRPLs relacionadas. Triángulos negros, lacasa de Coriolopsis galilea; círculos negros, lacasa de Pleurotus ostreatus; cuadrados negros, lacasa de Pycnoporus cinnabarinus; triángulos blancos invertidos, lacasa de Trametes versicolor; círculos blancos, lacasa de Trametes hirsuta; cuadrados blancos, muíante OB- 1 . (D) Estabilidad de OB-1 en presencia de concentraciones crecientes (v/v) de distintos disolventes orgánicos. Los experimentos se realizaron en viales con tapón de rosca conteniendo la variante OB-1 en una mezcla disolvente/buffer Britton y Robinson 100 mM (pH 6,0). Tras 4 h, se extrajeron alícuotas y se midió la actividad con ABTS 3 mM en buffer acetato sódico 100 mM (pH 4,0). Cuadrados negros, acetonitrilo; triángulos negros invertidos, etanol; cuadrados blancos, Ν,Ν'-dimetilformamida; círculos blancos, metanol; círculos negros, dimetilacetamida; triángulos blancos, dimetilsulfóxido. La actividad residual está expresada como el porcentaje de actividad original a la correspondiente concentración de disolvente orgánico. (E) Estabilidad frente al pH del mutante OB-1 a pH 3,0, 6,0 y 9,0. Las muestras de enzima fueron incubadas en buffer Britton y Robinson 10 mM a diferentes pHs, y la actividad residual se midió en ABTS 3 mM en buffer acetato sódico 100 mM (pH 4,0). Círculos negros, pH 3,0; cuadrados blancos, pH 6,0; triángulos negros, pH 9,0.
Figura. 5. Muestra las mutaciones en la Lacasa Evolucionada. Muestra los detalles de las siete mutaciones presentes en la variante OB-1 (B,D,F) comparadas con los correspondientes residuos de la lacasa PM1 nativa (A,C,E). Las esferas representan átomos de Cu. Se muestran los ligandos del Cu T1 y del cluster trinuclear Cu T2/T3. Los puentes de hidrógeno relacionados con los residuos mutados (antes y después de la mutación) se muestran como líneas discontinuas.
Figura. 6. Muestra la estrategia de clonaje para la construcción de -PM1.
Figura. 7. Muestra la Ruta de Evolución Artificial de α-PcL. La figura muestra las tres primeras generaciones de la lacasa de Pycnoporus cinnabarinus. MAP: mejora en la actividad total frente al tipo parental de la generación anterior. Esta figura está relacionada con la Figura 1 . Figura. 8. Muestra la caracterización del muíante OB-1 . (A) espectro de masas del muíante OB-1 . (B) Electroforesis del muíaníe OB-1 purificado. Los carriles coníienen lo siguiente. 1 : marcador de peso molecular, 2: filtrado del cultivo, 3: precipitación fraccionada con sulfato de amonio, 4: intercambio aniónico, 5: intercambio aniónico de alta resolución. (C) N-deglicosilación de OB-1 . Los carriles contienen lo siguiente: 1 : OB-1 , 2: OB-1 deglicosilado, 3: marcador de peso molecular. La enzima purificada fue deglicosilada usando la N-glicosidasa PNGasaF. Las muestras se analizaron en un gel de SDS y acrilamida al 12% y se tiñeron con azul de Coomassie. Esta figura está relacionada con la Figura 4.
Figura. 9. Muestra la estructura general de la Lacasa Evolucionada OB-1 . Están representados los tres dominios de tipo cobre (D1 , D2 y D3), los átomos de cobre como esferas grises y las sustituciones de aminoácidos, en negro. También se muestran las distancias de los residuos mutados al cobre T1 (representadas como líneas discontinuas) y la superficie de la proteína. Esta figura está relacionada con la Figura 5.
Figura 10. Muestra el alineamiento parcial de la secuencia aminoacídica de PM1 y de otras lacasas de alto potencial redox muy relacionadas. La numeración incluye las secuencias señal. El alineamiento de las secuencias se realizó con el algoritmo cobalto en el servidor NCBI-Blast. PM1 , lacasa del basidiomiceto PM1 (CAA78144.1 ) (SEQ ID NO: 34); T. C30, lacasa de Trametes sp. C30 Lacd (AAF06967.1 ) (SEQ ID NO: 35); T. trogii, lacasa de Trametes trogii (2HRG-A(SEQ ID NO: 36)); C. galilea, lacasa de Coriolopsis gallica (ABD93940.1 ) (SEQ ID NO: 37); C. rígida, lacasa de Coriolopsis rígida (ACU29545.1 ) (SEQ ID NO: 38); T. sp AH28-2, lacasa A de Trametes sp. AH28-2 (AAW28933.1 ) (SEQ ID NO: 39); T. versicolor, lacasa III de Trametes versicolor (AAL93622.1 ) (SEQ ID NO: 40); T pubescens, lacasa 2 de Trametes pubescens (AAM18407.1 ) (SEQ ID NO: 41 ); T. hirsuta, lacasa de Trametes hirsuta (ACC43989.1 ) (SEQ ID NO: 42); T. I-62, lacasa de Trametes sp. I-62 (AAQ12269.1 ) (SEQ ID NO: 43); P. coccineus, lacasa de Pycnoporus coccineus (BAB69775.1 ) (SEQ ID NO: 44); P. sanguineus, lacasa de Pycnoporus sanguineus (ACN69056.1 ) (SEQ ID NO: 45); P. cinnabarinus, lacasa de Pycnoporus cinnabarinus (AAF 13052.1 ) (SEQ ID NO: 46); L. tigrinus, lacasa de Lentinus triginus (2QT6-A) (SEQ ID NO: 47).
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
EJEMPLO 1 : Punto de partida para la evolución: la construcción de a-PM1
Nuestro punto de partida fue la lacasa de alto potencial redox del basidiomiceto PM1 . Además de su elevado potencial redox (por encima de +700 mV), la lacasa PM1 es altamente estable en el intervalo de pH de 3 a 9 y a elevada temperatura (con una actividad óptima a 80° C) (Coll et al, 1993. Appl. Environ. Microb. 59, 2607-2613, Coll et al, 1993, Appl. Environ. Microb. 59, 4129-4135). Estas características la convierten en altamente deseable no sólo para uso práctico sino también para llevar a cabo experimentos de evolución dirigida. Teniendo en mente que la acumulación de mutaciones beneficiosas durante varios ciclos de evolución de laboratorio generalmente conduce a la desestabilización del molde proteico, cuanto mejor sea la estabilidad de la enzima de partida, mayor es la probabilidad de alcanzar las mejoras perseguidas sin poner en peligro la función proteica (Bloom y Arnold, 2009, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 106, 9.995-10.000). En primer lugar, el ADN copia de la lacasa PM1 con la secuencia señal nativa fue clonado en el correspondiente vector lanzadera, aunque no se detectaron niveles de expresión funcional en S. cerevisiae. Para aumentar los niveles de expresión a valores que pudieran detectarse en los ensayos de screening, la secuencia señal nativa de la lacasa PM1 fue reemplazada por diferentes péptidos señales comúnmente empleados para expresar proteínas heterólogas en levadura. El mejor resultado se consiguió con la construcción a-PM1 (Figura 6) constituida por el preprolíder de la feromona del factor α (Shuster, 1991 . Curr. Opin. Biotech. 2, 685-690) acoplada a la PM1 madura, lo cual generó niveles de expresión muy bajos pero detectables (-35 mU/L). Los coeficientes de varianza (CV) para los ensayos de screening se ajustaron durante el proceso de evolución (alcanzando CVs por debajo del 1 1 % a partir del tercer ciclo en adelante) y las condiciones de microfermentación fueron optimizadas (asimilación de cobre, composición del medio, disponibilidad de oxígeno y temperatura).
1.1. Reactivos y enzimas
El vector pUEX1 con el cDNA de la PM1 nativa fue cedido por el Prof. R. Santamaría (Universidad de Salamanca). La lacasa de Trametes versicolor, las lacasas de Pycnoporus cinnabarinus y Trametes hirsuta, y las lacasas de Coriolopsis gallica y Pleurotus ostreatus, fueron donadas por Novozymes (Davis, CA, USA), Prof. E. Record (Universidad de Marsella, Francia), Prof. A. Yaropolov (Instituto de Bioquímica, Moscú, Rusia) y Prof. R. Vázquez-Duhalt (UNAM, Cuernavaca, México), respectivamente. El ABTS (2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), el DMP (2,6-dimetoxifenol), la Taq polimerasa y el kit de transformación en S. cerevisiae fueron comprados a Sigma-Aldrich. Las células competentes de E. coli XL2-Blue y los kits Genemorph I y II Random mutagénesis son de Stratagene. La cepa BJ5465 de S. cerevisiae deficiente en proteasas es de LGCPromochem. El vector lanzadera pJRoC30 con el gen de resistencia a ampicilina y el de auxotrofía para uracilo procede del Instituto de Tecnología de California (Caltech, CA, USA), mientras que el vector pGAPZa, que contiene el prepro-líder del factor a, es de Invitrogen, USA. Los kits Zymoprep yeast plasmid miniprep, Zymoclean gel DNA recovery, y DNA clean & concentrator TM-5 se compraron a Zymo Research. El kit NucleoSpin Plasmid se compró a Macherey-Nagel y las enzimas de restricción BamH\ y Xho\ a New England Biolabs. Todos los reactivos usados fueron los de mayor pureza disponible. 1.2. Construcción de la α-ΡΜ1
El ADN copia de la PM1 incluyendo la señal líder nativa fue clonado en el vector lanzadera pJRoC30 en S. cerevisiae. El vector pUEX1 con el ADN copia de la PM1 se usó como molde para amplificar la PM1 incluyendo los 21 aminoácidos del péptido señal. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron:
(SEQ ID NO: 1 1 ) F3PM1 : 5'CTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATA ART-3' y (SEQ ID NO: 12) R3PM1 : 5'GACATAACTAATTACATGATGCGGCCC TCTAGATGCATGCTCGAGCtcactggtcgtcaggcgagagc3\ donde las letras mayúsculas indican los fragmentos que anillan específicamente in vivo en las células de S. cerevisiae con el vector pJRoC30 linearizado con BamHI y Xhol. La correspondiente construcción pJRoC30-PM1 no dio lugar a niveles de expresión funcional en S. cerevisiae. En consecuencia, la secuencia señal nativa de la P 1 fue sustituida por las señales líder de MtLT2 (Bulter et al. , 2003. Appl. Environ. Microb. 69, 987-995), la de la glucosa oxidasa de Aspergillus niger (Frederick et al., 1990. J. Biol. Chem. 265, 3793-3802) y el preprolíder del factor α (Brake et al., 1984. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 , 4642- 4646), siendo el último el único que dio lugar a niveles detectables de secreción de la PM1 en S. cerevisiae (inferior a 35 mU/L). La construcción a-PM1 se obtuvo por amplificación del gen de la PM1 nativa excluyendo la señal líder usando los cebadores (SEQ ID NO: 13) PM1 Eco-F (5'- gcGAATTCagcattgggccagtc-3') y (SEQ ID NO: 14) PM1 -R (5'- atGGCGGCCGCttactggtcgtcaggcgagagc-3'), que incluyen las dianas para EcoR\ y Not\ (en letras mayúsculas) así como el codón de parada óptimo (en negrita y subrayado) para Pichia Pastoris. El vector pGAPZa con el preprolíder del factor c¡ fue linearizado con EcoRI y Not\, y el fragmento amplificado correspondiente fue digerido con Ecof?l y Not\ y clonado en el pGAPZa linearizado, dando lugar a la construcción pGAPZa-PM1 . La construcción pGAPZa-PM1 se utilizó para amplificar el gen de fusión a-PM1 por medio de los siguientes cebadores: (SEQ ID NO: 15) α-F (5'- ATAGGATCCatgagatttccttcaatttttactgctgtt-3') que incluye la diana de BamH\ (en letras mayúsculas) y (SEQ ID NO: 16) PM1 -R (5'-tcaatgtccgcgttcgcaggga- 3'). El fragmento obtenido se digirió con Not\. El vector episómico pJRoC30 fue digerido con BamHl y amplificado con Klenow para el cionaje con extremos romos. Finalmente, el plásmido fue digerido con Not\, desfosforilado y ligado con aPM1 para generar el pJRoC30- aPM1.
EJEMPLO 2: Evolución de laboratorio de a-PM1
La estrategia de evolución dirigida fue elaborada siguiendo las siguientes reglas: i) para ajustar adecuadamente los requisitos de la ruta secretora del hospedador durante la expresión funcional de la lacasa, el gen de fusión completo fue objeto de mutagénesis aleatoria y/o recombinación. Por lo tanto, se evolucionó conjuntamente tanto el preprolíder del factor α como el gen de la lacasa foránea con el fin de adaptar ambos elementos para una exportación exitosa por S. cerevisiae; ii) para asegurar que la mejora de actividad no fuera dependiente de un sustrato en concreto, se validaron y emplearon durante la evolución molecular ensayos de screening basados en la oxidación de compuestos fenólicos (2,6 DMP) y no fenólicos (ABTS); iii) para garantizar la termoestabilidad general del mutante final, las pérdidas en estabilidad producidas por la acumulación de mutaciones durante la evolución fueron detectadas y recuperadas mediante enfoques racionales acoplados con el screening de termoestabilidad de librería de mutantes; y iv) las mutaciones que representaron mejoras significativas durante los primeros ciclos de evolución in vitro, pero que no fueron finalmente seleccionadas tras las recombinaciones y el screening, fueron recuperadas individualmente, analizadas e introducidas en las ultimas variantes mediante mutagénesis dirigida.
La generación de diversidad fue emulada aprovechando la maquinaria celular eucariota de S. cerevisiae. Los altos niveles de recombinación homologa que ofrece S. cerevisiae permiten reparar in vivo los productos mutagenizados con el vector linearizado a través de la ingeniería de extremos solapantes diseñados al efecto sin alterar la dase de lectura. Las librerías mutagénicas fueron recombinadas mediante barajado in vivo del ADN (del inglés "in vivo DNA shuffling" y/o mediante ensamblaje in vivo de librerías mutagénicas con diferente espectro mutacional (IvAM, del inglés "in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra") (Okkels, 2004. Enzyme functionality: design, engineering, and screening, A.Svendsen, ed. (New York: Marcel Dekker, Inc.). 413-424; Zumárraga et al., 2008. Proteins 71 , 250-260). Para aumentar el número de entrecruzamientos entre los insertos sin comprometer la eficiencia de transformación, se chequearon varias regiones solapantes con baja homología respecto al vector linearizado. Las tasas mutacionales se ajustaron de forma que aproximadamente 1 -3 aminoácidos por proteína de fusión fueran introducidos, de media, por cada ciclo de evolución (TraceweII y Arnold, 2009. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 3-9).
Más de 50.000 clones fueron explorados en 8 ciclos de evolución dirigida y mutagénesis dirigida, culminando en la selección de la última variante, el muíante OB-1 , con una mejora total sobre a-PM1 de 34.000 veces (Figura 1 ). Con independencia de la enzima y la característica sometida a evolución dirigida, es raro alcanzar unas mejoras tan elevadas. Parece lógico pensar que la evolución conjunta del preprolíder del factor α junto con la PM1 madura para su secreción en levadura, haya favorecido un efecto sinérgico entre ambos polipéptidos, lo cual eventualmente se traduce en una mejora en la exportación de a-PM1 por el hospedador eucariota. Durante la ruta de evolución artificial (Figura 1 ), se caracterizaron y fueron recombinados 26 mutantes con mejoras entre 1 ,3 a 12 veces respecto del mejor tipo parental correspondiente en cada ciclo. En términos generales, hasta 28 posiciones diferentes fueron mutadas (9 de ellas mutaciones sinónimas) a lo largo del gen de fusión a-PM 1 (Tabla 1 ). De éstas, 9 mutaciones se encontraron en el preprolíder del factor α y las restantes 19 en el gen de la lacasa.
Los dos primeros ciclos de evolución se llevaron a cabo mediante PCR propensa a error con diferentes tasas mutacionales y con ADN polimerasas con distinto perfil mutacional (Figura 1 , Tabla 1 ). Para acelerar aún más la evolución, a partir del segundo ciclo en adelante se empleó un protocolo que combinó la construcción de librerías mutantes a partir de cada parental mediante barajado in vivo del ADN. Esta estrategia produjo entrecruzamientos complejos para cada descendencia junto con la introducción de nuevas mutaciones puntuales (Figura 2). La mejor variante del quinto ciclo, el mutante 7H2, tuvo aprox. 24.300 veces mejor actividad que a-PM1 , con una actividad total de 1 .000 U/L. La caracterización preliminar de 7H2 demostró una fuerte reducción en su termoestabilidad con un descenso en su T50 de aprox. 5o C con respecto a sus correspondientes parentales, los mutantes 1 D1 1 y 1 1A2 (de 73° C a 68° C, Figura 3B), lo cual estuvo relacionado con la significativa caída de actividad durante su almacenamiento en largos períodos (perdiendo aproximadamente el 30% de su actividad tras 14 días a 4o C). La acumulación de mutaciones beneficiosas pero desestabilizantes durante la evolución es un fenómeno bien descrito (Bloom et al., 2006. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103, 5869-5874; Bloom y Arnold, 2009. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 106, 9995-10000; García et al., 2010. Microb. Cell Fact. 9, 17).
Para superar este problema y recuperar la estabilidad al tiempo que permitiera tolerar la introducción de un nuevo set de mutaciones beneficiosas, se incorporó en el sexto ciclo un screening de termoestabilidad basado en la determinación de la T50 (definida como la temperatura a la que la enzima retiene el 50 % de su actividad tras 10 min de incubación) (García et al., 2010. Microb. Cell Fact. 9, 17; Bommarius et al., 2006. Curr. Opin. Biotech. 17, 606- 610). Para esta ocasión, la librería se construyó mediante IvAM, mezclando diferentes perfiles y predisposiciones mutacionales. La mejor variante de termoestabilidad, 16B10, recuperó parte de su termoestabilidad con una mejora en su T50 de 3o C (Figura 3B), pero a expensas de su actividad, la cual se redujo a la mitad (de 1 .000 a 510 U/L) (Figura 1 , Tabla 1 ). Por otro lado, la mejor variante de actividad de este ciclo, el mutante 6C8, todavía mejoró su actividad total hasta valores de 2.000 U/L mientras que retuvo una estabilidad similar a 7H2. En este punto, estuvimos en la encrucijada de o bien continuar evolucionando para termoestabilidad a partir de 16B10 pero poniendo en peligro la actividad, o emplear el mutante 6C8 como parental e intentar resolver el problema de estabilidad "racionalmente".
Más que enfrentarnos con el bien conocido "trueque" que normalmente surge entre la actividad y la estabilidad para muchas mutaciones puntuales (Romero y Arnold, 2009. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 10, 866-876), decidimos volver a analizar el inestable mutante 7H2. Este mutante procede de un evento de entrecruzamiento entre 1 D1 1 y 1 1A2, lo cual permitió unir las mutaciones V(a10)D, A(a87)T y V162A del mutante 1 1A2 con las mutaciones H208Y, A239P, S426N y A461T del mutante 1 D1 1 (Figura 2, Tabla 1 ).
Tabla 1 : Mutaciones introducidas en la evolución dirigida de a-PM1 . +, mutación acumulada; ·, nueva mutación. En sombreado se detallan las mutaciones sinónimas; con subíndices se indican el uso de codones en S. cerevisiae. *EI mutante OB-1 incorporó las dos mutaciones recuperadas S224G y D281 más la mutación revertida S454F introducidas mediante mutagénesis dirigida en los ciclos de evolución 7o y 8o.
Además, 7H2 incorporó una mutación sinónima más la mutación F454S, generada por mutagénesis en combinación con barajado in vivo del ADN. Decidimos mapear esta mutación en un modelo 3D basado en la estructura cristalográfica de la lacasa de Trametes trogii (con un 97 % de identidad de secuencia con la PM1 ). La Phe454 está localizada en una α hélice cercana al cobre del sitio T1 , el lugar donde se une el sustrato reductor. De hecho, la Phe454 se sitúa al lado de uno de los ligandos de coordinación del cobre T1 , la His455 que parece estar involucrada en la unión del sustrato reductor facilitando la entrada de electrones al cobre T1 (Bertrand et al., 2002. Biochemistry 41 , 7325-7333; Matera et al., 2008. Inorg. Chim. Acta 361 , 4129- 4137). La inspección del modelo sugiere que la mutación F454S permite un puente de H adicional con la Alai 61 (Figura 3A).
Figure imgf000030_0001
Parece posible que este nuevo puente de H provoque el movimiento del segmento helicoidal donde se encuentra la His455, amplificando la distancia entre el ligando de coordinación y el cobre T1 . Este efecto incrementaría las velocidades catalíticas, pero disminuiría dramáticamente la estabilidad de la variante. Por lo tanto, se decidió revertir la mutación F454S en el mutante 6C8 mediante mutagénesis dirigida. El mutante revertido generado (mutante S454F) recupero completamente su estabilidad con una T50 idéntica a la de los parentales del 4o ciclo y anteriores (Figura 3C). Notoriamente, mientras el mutante revertido fue 0,5 veces más débil catalíticamente (900 U/L) mostró unos valores de actividad similares a los descritos para 7H2 pero siendo de nuevo altamente termoestable. El efecto sinérgico de recombinar 1 D1 1 y 1 1A2, junto con la nueva mutación beneficiosa que apareció en 6C8 (N[a23]K) sirvió para superar la pérdida de la mutación F454, que resultó ser beneficiosa pero altamente desestabilizante, en términos de mejora de actividad total.
2.1. Recuperación de mutaciones beneficiosas
Durante el diseño de la lacasa de alto potencial redox en S. cerevisiae, algunas de las mutaciones descubiertas en las fases iniciales de la evolución que afectaron la actividad fueron finalmente descartadas por el aparato de recombinación homologa de S. cerevisiae, a pesar de sus potenciales efectos beneficiosos. En el hospedador eucariota, la probabilidad de que un evento de entrecruzamiento suceda entre dos mutaciones es directamente proporcional al número de nucleótidos que separa ambas mutaciones. Así, no es sorprendente que algunas mutaciones beneficiosas no fueran finalmente incorporadas en un molde que ya contenía la mutación A239P, tales como las mutaciones S224G o D281 G (Figura 2). Pensamos que sería interesante rescatar estas mutaciones y probarlas individualmente en la variante 6C8. La mutación S224G fue la única mutación presente en el mutante PM 1 -30C (de la primera generación) produciendo una mejora de 7 veces en la actividad (Figura 1 ). Esta variante fue de nuevo empleada como parental en el tercer ciclo para ejercer un efecto de backcrossing y así, S224G se incorporó a la descendencia. Desafortunadamente, debido al ya mencionado entrecruzamiento entre 1 D1 1 y 1 1A2 en el quinto ciclo, la mutación S224G finalmente se perdió. Asimismo, la mutación D281 E apareció de forma independiente en diferentes momentos de la evolución (en los mutantes PM1 -1A2 y 2G5 de la primera y segunda generación) con unas mejoras de aprox. 4 veces. De nuevo, la recombinación entre 1 D1 1 y 1 1A2 eliminó la mutación D281 E del gen de la lacasa. Ambas mutaciones fueron estudiadas individualmente mediante mutagénesis dirigida en el séptimo ciclo y en ambos casos, la actividad total aumento sin comprometer la termoestabiiidad (Figuras 1 , 3C). Así pues, las mutaciones S224G y D281 E se incorporaron conjuntamente al muíante revertido en el último ciclo para dar lugar al mutante OB-1 .
2.2. Intercambio mutacionai con una lacasa de alto potencial redox evolucionada
En un esfuerzo paralelo, también hemos estado involucrados en la evolución dirigida de otra lacasa de alto potencial redox procedente del hongo Pycnoporus cinnabarinus (Camarero et al., 2009. Patent PCT/ES2009/070516), la cual comparte el 77 % de identidad de secuencia con la lacasa PM1. Emulando el mismo enfoque que hemos seguido con la lacasa PM1 , la secuencia señal nativa de la lacasa de P. cinnabarinus se reemplazó por el preprolíder del factor a, y la correspondiente proteína de fusión fue objeto de varios ciclos de mutagénesis aleatoria y recombinación (Figura 7). Una de las mejores mutaciones encontradas durante la evolución de la lacasa de P. cinnabarinus (P394H) se encuentra en la vecindad del cobre T1. La sustitución de una Pro por una His en la posición 394 promueve un nuevo puente de H con la Asn208 que está próxima a la His295, uno de los ligando del cobre T1 (Camarero et al., 2009. Patent PCT/ES2009/070516). El alineado de secuencias de la lacasa PM1 con la lacasa de P. cinnabarinus indica que la P394 pertenece a una región altamente conservada entre las lacasas de alto potencial redox (Figura 10). Por lo tanto, la mutación P394H (P393H empleando la numeración de la PM1 ) fue introducida en 6C8 durante el séptimo ciclo con mejoras en la actividad de hasta 3.000 U/L pero con una pérdida significativa de termoestabiiidad (la T50 bajo 2o C, Figura 3C). Realmente desconocemos si la pérdida de termoestabilidad tras la mutación fue un efecto lateral común en ambas lacasas o si únicamente aconteció en el mutante 6C8. De hecho, no se pudo realizar un análisis de termoestabilidad en la lacasa de P. cinnabarinus ya que la P394H fue introducida en el primer ciclo, cuando los niveles de expresión eran virtualmente indetectables (Figura 7). Teniendo en cuenta que nuestro principal objetivo era el diseñar una HRPL altamente activa y estable, y a pesar de la mejora en actividad, la mutación P393H no fue finalmente incorporada en el último mutante, la variante OB-1 . 2.3. Evolución dirigida del preprolíder del factor α
La secuencia señal preprolíder del factor α codifica un polipéptido de 83 aminoácidos del cual los 19 primeros residuos constituyen el prelíder que dirige el polipéptido en creación hacia el retículo endoplasmático (RE). Tras entrar en el RE, el prelíder es escindido por una peptidasa dejando una pro-proteína. En este punto, las N-glicosilaciones de tres residuos de asparagina facilitan el tránsito de la pro-proteína del RE al aparato de Golgi. En el Golgi, el prolíder puede actuar como chaperona hasta que es procesado por las proteasas KEX1, KEX2 y STE13 (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488; Shuster, 1991 . Curr. Opin. Biotech. 2, 685-690). Además, el prolíder parece estar implicado en un proceso de señalado vacuolar, que es perjudicial para la secreción heteróloga (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1 192-1201 ). Hasta 8 mutaciones, (3 sinónimas) fueron introducidas en el preprolíder del factor α durante la evolución de la a-PM1 aunque únicamente las mutaciones V[a10]D, Ν[α23]Κ, Α[α87]Τ y la mutación sinónima G[a62]G se conservaron en la última variante mutante OB-1 . V[a10]D se localiza en el dominio hidrofóbico del prelíder e interesantemente, una de las mejores mutaciones encontradas durante la evolución de la lacasa de P. cinnabarinus fusionada con el preprolíder del factor α fue también descubierta en este dominio (mutación A[a9]D, Figura 7). Se ha descrito que las mutaciones en la pre-región pueden afectar el señalado en el RE y la secreción (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488). El papel de estas dos mutaciones consecutivas en el tráfico de lacasa fue testado mediante la construcción de mutantes individuales, dobles y revertidos a partir del mutante 6C8 durante el séptimo ciclo de evolución (Tabla 2).
Figure imgf000034_0001
Tabla 2: mejoras de actividad para los mutantes en las posiciones 9 y 10 dei prelíder del factor a. Los mutantes fueron construidos empleando el mutante 6C8 como tipo parental.
Los datos experimentales indican que la mutaciones individuales, A[c¡9]D y V[a10]D, ejercen una clara mejoría en la secreción aunque no cuando son combinadas: la hidrofobicidad de este dominio es entonces disminuida drásticamente.
Es bien sabido que la mayoría de las alteraciones que reducen la eficiencia de translocación están relacionadas con el descenso general en la hidrofobicidad de este dominio (Romanos et al., 992. Yeast 8, 423-488). Suponemos que los cambios individuales en los residuos carboxílicos cargados en las posiciones 9 o 10 del preprolíder del factor α podrían afectar positivamente la interacción entre el péptido señal y la partícula de reconocimiento de señal involucrada en orientar e insertar la cadena polipeptídica de la lacasa en la bicapa de la membrana del RE (Nothwehr y Gordon, 1990. BioEssays 12, 479-484; Boyd y Beckwith, 1990. Cell 62, 1031 -1033). La mutación N[a23jK aparece en el primer de los tres sitios de Asn-glicosilación del prolíder (Romanos et al., 1992). Aunque no es absolutamente necesario para la secreción, tales glicosilaciones podrían facilitar el transporte del RE al Golgi (Rakestraw et al., 2009. Biotechnol. Bioeng. 103, 1 192-1201 ). Sin embargo, nuestros resultados no apoyan esta hipótesis ya que tras la eliminación del sitio de glicosilación en el sexto ciclo de evolución (generando el mutante 6C8) se mejoró la secreción. Finalmente, la mutación Α[α87]Τ se encontró en el sitio de procesado para STE13, una dipeptidil aminopeptidasa que elimina los residuos espaciadores (Glu/Asp-Ala)2 en el amino terminal entre el prolíder del factor α y la lacasa PM1 madura. Tras la mutación, los residuos espaciadores proporcionan un ambiente incluso más hidrofílico a la diana del sitio de restricción para la KEX2 (Lys-Arg), lo cual podría afectar a la secreción de la lacasa madura (Brake, 1990. Meth Enzymol 185, 408-421 ).
2.4. Evolución Dirigida: Aspectos Generales
En cada generación, los fragmentos de PCR se lavaron, concentraron y cargaron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión, tras lo cual se purificaron usando el kit Zymoclean gel DNA recovery (Zymo Research). Los productos de PCR se clonaron bajo el control del promotor Gal 1 del vector de expresión pJRoC30, reemplazando el gen nativo presente en el mismo. Para eliminar el gen nativo, el plásmido pJRoC30 fue linearizado con Xho\ y BamH\ y el plásmido lineal fue concentrado y purificado del mismo modo que se describió arriba para los fragmentos de PCR.
2.5. Primera Generación
Se prepararon tres librerías independientes con distintas ADN polimerasas y bajo diferentes tasas mutacionales. La primera librería mutagénica (~15.000 mutantes) se construyó con el kit Genemorph I ajustando la tasa mutacional a 1 ,1 -3,5 mutaciones por kb. La segunda y la tercera librería (~15.000 mutantes cada una) fueron construidas con el kit Genemorph II ajustando la tasa mutacional a 0-4,5 y 4,5-9 mutaciones por kb, respectivamente. La PCR propensa a error se llevó a cabo en un termociclador de gradiente (Mycycler, BioRad, USA) usando los siguientes parámetros: 95° C durante 2 min (1 ciclo); 94° C durante 0,45 min, 53° C durante 0,45 min, 74° C durante 3 min (28 ciclos); y 74° C durante 10 min (1 ciclo). Los cebadores usados para la amplificación fueron: RMLN directo (SEQ ID NO: 17) (5'- CCTCTATACTTTAACGTCAAGG-3', que se une a las pb 160-180 del pJRoC30-aPM1 ) y RMLC inverso (SEQ ID NO: 18) (5 - GGGAGGGCGTGAATGTAAGC-3', que se une a las pb 2028-2048 del pJRoC30-aPM 1 ). Para promover la ligación in vivo, se diseñaron fragmentos de 40 y 66 pb homologas al vector lineal. Los productos de PCR (400 ng) se mezclaron con el vector linerarizado (100 ng) y se transformaron en células competentes usando el kit de transformación en levadura de Sigma. Las células transformantes se sembraron en placas SC y se incubaron durante 3 días a 30° C. Las colonias con el vector completo de replicación autónoma se picaron y se sometieron a ensayos de screening, así como a re-screenings adicionales. Del primer al quinto ciclo de evolución las librerías se exploraron de cara a encontrar mejoras en de actividad, y a partir del sexto ciclo, se incorporó un ensayo de termoestabilidad.
2.6. Segunda Generación
La segunda generación se realizó por PCR mutagénica con la ADN polimerasa Mutazyme I y usando el muíante PM1 -60 como parental. La tasa mutacional se ajustó a 2,1 -3,5 mutaciones por kb y la librería mutagénica (~1 .000 mutantes) se preparó como se describió para la primera generación.
2.7. Tercera Generación
Las mejores variantes de la segunda generación (3E1 , 10D2, 2G5 y 4C2) se sometieron a amplificación con Taq/MnCI2 y recombinación por barajado in vivo del ADN (-1 .000 clones). El muíante PM1 -30C de la primera generación también fue incluido como parental para backcrossing. Las amplificaciones Taq/MnCI2 se prepararon en un volumen final de 50 pL conteniendo 90 nM RMLN, 90 nM RMLC, 0,1 ng/pL témplate, 0,3 mM dNTPs (0,075 mM de cada uno), 3 % DMSO, 1 ,5 mM MgCI2, 0,05 U/pL Taq polimerasa. Se probaron diferentes concentraciones de MnCI2 para estimar la tasa mutacional adecuada, obteniendo 0,01 mM como la concentración final, y la PCR se realizó igual que en las generaciones anteriores. Se diseñaron varias áreas de solapamiento, con un tamaño variable desde 5 a 70 pb, para aumentar el número de entrecruzamientos sin comprometer la eficiencia de la transformación. Los productos de PCR se mezclaron en cantidades equimolares y se transformaron junto con el vector linearizado en la levadura (ratio productos PCR:vector, 4:1 ).
2.8. Cuarta Generación
Las mejores variantes de la tercera generación (5G3, 7D2, 9H4, 4E12, 4B8, 8G8 y 1 1 B3) se sometieron a amplificación con Taq/MnCb y recombinación por barajado in vivo del ADN (~1 .000 clones) como se describió para la tercera generación. 2.9. Quinta Generación
Las mejores variantes de la cuarta generación (1 D1 1 , 1 1 A2, y 7F2) se sometieron a amplificación con Taq/MnC y recombinación por barajado in vivo del ADN (~1 .000 clones) como se describió para la tercera generación. 2.10. Sexta Generación
Se construyó una librería de ~1 .300 clones por ensamblaje de librerías mutantes IvAM (Zumárraga et al., 2008. Proteins 71 , 250-260). El mutante 7H2 se utilizó como parental, y las librerías Taq/MnCI2 y Mutazima se mezclaron en cantidades equimolares, y se transformaron en células de S. cerevisiae competentes junto con el vector linearizado tal y como se describió arriba (ratio librería:vector, 8:1 ). A partir de esta generación se incorporó un screening de termoestabilidad (véase más adelante).
2.11. Mutagénesis Dirigida
La séptima y octava generación se obtuvieron por mutagénesis dirigida usando "In Vivo Overlap Extensión" (IVOE) (Alcalde, 2010. In vitro Mutagénesis Protocols, J.Bramman, ed. (Totowa, New Jersey, US: Humana Press). Se realizaron simultáneamente dos reacciones de PCR para amplificar los dos fragmentos de ADN que superponen en posiciones específicas correspondientes a las regiones objetivo de mutagénesis dirigida en la secuencia parental. Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen final de 50 \iL conteniendo 0,25 μΜ de cada cebador, 100 ng de molde, 0,25 mM de cada dNTP, 3% DMSO y 2,5 Unidades de la ADN polimerasa Pfu-Ultra. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 95° C durante 2 min (1 ciclo); 94° C durante 0,45 min, 55° C durante 0,45 min, 74° C durante 2 min (28 ciclos); y 74° C durante 10 min (1 ciclo). Los fragmentos de PCR se cargaron en geles de agarosa de bajo punto de fusión y se purificaron usando el kit "Zymoclean gel DNA recovery". El plásmido pJRoC30 fue linearizado con Xho\ y BamH\ y el vector linearizado se purificó como se describió arriba para los fragmentos de PCR. Los fragmentos de PCR (400 ng de cada uno) se mezclaron con el vector linearizado (100 ng, 8:1 ratio producto PCR:vector) y se transformaron en células de levadura competentes como se describió anteriormente. En promedio, se analizaron 50 clones individuales por mutación. Los plásmidos seleccionados fueron aislados y secuenciados para verificar la mutagénesis dirigida. 2.12. Séptima Generación
Los siguientes mutantes se construyeron usando la variante 6C8 como parental:
Muíante revertido S454F: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN y DEL- REV (SEQ ID NO: 19) (5'- cgtgaacccagcctcaaggtgGAAgtcgatgtggcagtggagg-3' que se une en pb 5'- 1823-1866 -3' del pJRoC30-aPM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: DEL-FOR (SEQ ID NO: 20) (5'- cctccactgccacatcgacTTCcaccttgaggctgggttcacg-3' que se une en pb 5'-1823- 1866-3' del pJRoC30-aPM1 ) y RMLC.
Mutante S224G: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN y 5-S315G-REV (SEQ ID NO: 21 ) (5'- gtctggggcttgagattcacGCCgtccgcctcgatgacg-3' que se une en pb 5'-1 136-1 174-3' del pJRoC30-aPM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: 5-S315G-FOR (SEQ ID NO: 22) (5'- cgtcatcgaggcggacGGCgtgaatctcaagccccagac-3' que se une en pb 5'-1 136- 1 174-3' del pJRoC30-aPM1 ) y RMLC.
Mutante D281E: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN y 4-D372E-REV (SEQ ID NO: 23) (5'- gctcaacgggcgcagcaccTTCgtagcgaaggatggc-3' que se une en pb 5'- 1308- 1344-3' del pJRoC30-aPM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: 4-D372E-FOR (SEQ ID NO: 24) (5'- gccatccttcgctacGAAggtgctgcgcccgttgagc-3' que se une en pb 5'- 1639- 1678-3' del pJRoC30-aPM1 ) y RMLC.
Mutante P393H: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN y 3CP484HREV (SEQ ID NO: 25) (5'- gcaagtggaaggggtgGTGgaagccgggggcggcggagg-3' que se une en pb 5'-1639-1678 -3' del pJRoC30-aPM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: 3CP484HFOR (SEQ ID NO: 26) (5'- cctccgccgcccccggcttcCACcaccccttccacttgc-3' que se une en pb 5 '-1639-1678- 3' del pJRoC30-aPM1 ) y RMLC.
Mutante Aía91D: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN-2 (SEQ ID NO: 27) (5'-ggtaattaatcagcgaagc-3' que se une en pb 5'-5-24-3' del pJRoC30-a) y 1 C-REVDI (SEQ ID NO: 28) (5'-gaggatgctgcgaataaATCatcagtaaaaattgaagg-3' que se une en pb 5'-219-257-3' del pJRoC30-c¡PM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: 1 C-FORDI (SEQ ID NO: 29) (5'- ccttcaatttttactgatGATttattcgcagcatcctc-3' que se une en pb 5'-219-257-3' del pJRoC30-aPM 1 ) y RMLC.
Doble mutante Afo9lD-Dfa10]V: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN-2 y 1 C-PREALREV (SEQ ID NO: 30) (5'- gaggatgctgcgaaAACATCatcagtaaaaattgaagg-3' que se une en pb 5'-219-257- 3' del pJRoC30-aPM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: 1 C-PREALFOR (SEQ ID NO: 31 ) (5'-ccttcaatttttactGATGTTttattcqcaqcatcctc-3' que se une en pb 5'-219-257-3' del pJRoC30-aPM1 ) y RMLC.
Mutante revertido DícrfOlV: Los cebadores para la PCR 1 fueron: RMLN-2 y 1 C- PREALDOBREV (SEQ ID NO: 32) (5'- gaggatgctgcgaaAACatcatcagtaaaaattgaagg-3' que se une en pb 5 '-219-257- 3 'del of pJRoC30-aPM1 ). Los cebadores para la PCR 2 fueron: 1 C- PREALDOBFOR (SEQ ID NO: 33) (5 '-ccttcaatttttactqatGTTttattcgcagcatcctc-3 ' que se une en pb 5'-219-257-3' del pJRoC30-aPM 1 ) y RMLC. 2.13. Octava Generación
El mutante OB-1 se obtuvo por introducción de las mutaciones S224G y D281 E en el mutante revertido S454F de la 7a generación. Los cebadores para la PCR1 fueron: RMLN y 5-S315G-REV. Los cebadores para la PCR2 fueron: 5- S315G-FOR y 4-D372E-REV. Los cebadores para la PCR3 fueron: 4-D372E- FOR y RMLC.
Todos los codones sometidos a mutagénesis dirigida están subrayados.
2.14. Screening de alto rendimiento
Los screenings de actividad y termoestabilidad se realizaron en formato sólido y líquido (en placas de 96 pocilios). Los mutantes seleccionados fueron producidos y purificados como se describe más adelante.
Modelado de la Proteína
En la base de datos de proteínas "Protein Data Bank" se llevó a cabo una búsqueda de proteínas con homología estructural respecto a la lacasa PM1 . La proteína más similar a la PM1 fue la lacasa de Trametes trogii, cuya estructura cristalográfica está resuelta con una resolución de 1 ,58 Á y tiene un 97 % de identidad de secuencia (PDB id: 2hrgA) (Matera et al., 2008. Inorg. Chim. Acta 361 , 4129-4137). Se generó un modelo por medio del servidor para el modelado de proteínas Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/) y se analizó con DeepView/Swiss-Pdb Viewer y PyMol Viewer.
EJEMPLO 3: Caracterización del mutante OB-1
El último mutante obtenido, la variante OB-1 , fue purificado a homogeneidad y caracterizado bioquímicamente (Tabla 3, Figuras 4 y 8). La actividad específica del mutante OB-1 fue de 400 U/mg y presentó unos niveles de secreción de ~8 mg/L. La masa molecular de OB-1 fue estimada por espectrometría de masas MALDI-TOF en 60.310 Da, 3.690 Da por debajo del peso molecular para la lacasa nativa expresada por el basidiomiceto PM1 (Coll et al., 1993. Appl. Environ. Microb. 59, 2607-2613) (Figura 8). La masa molecular determinada a partir de la composición de aminoácidos de OB-1 fue 53.284 Da y la contribución a la glicosilación deducida a partir del patrón de desglicosilación fue entorno al 10 % (Figura 8).
Figure imgf000041_0001
Tabla 3: Cinéticas para la lacasa evolucionada. Nuestros resultados de evolución dirigida en S. cerevisiae de las Iacasas de P. cinnabarinus (PcL) (Camarero et al., 2009. Patent PCT/ES2009/0705 6) y de la lacasa M. thermophila (MtL) (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69, 987- 995; Zumárraga et al., 2007. Chem. Biol. 14, 1052-1064) fueron bastante diferentes y al contrario que la variante OB-1 , los mutantes de PcL y MtL fueron hiperglicosilados con residuos de azúcar que contribuyeron alrededor del 50 % del peso molecular total. Ya que en el aparato de Golgi es donde se produce la compleja adición de cadenas periféricas de carbohidratos mediante la incorporación de residuos de mañosa, la hiperglicosilación puede ser considerada como una consecuencia de tiempos de residencia más largos en este compartimento celular. Suponemos que nuestro mutante evolucionado es fácilmente secretado por S. cerevisiae mientra que otras Iacasas heterologas experimentan serias dificultades para salir del Golgi. Los perfiles de pH para compuestos fenólicos y no fenólicos no se vieron alterados significativamente durante la evolución, por lo que OB-1 y las variantes previas del proceso evolutivo mostraron similares valores de pH (aproximadamente 4,0 y 3,0 para DMP y ABTS respectivamente, Figuras 4A, 4B). Los parámetros cinéticos se valoraron con sustratos clásicos frecuentemente usados para caracterizar Iacasas (Tabla 3). Las cinéticas de OB-1 fueron ~4 a 6 veces mejores que las descritas para las Iacasas altamente relacionadas de Trametes C30 y Trametes trogii, que comparten 99 y 97 % de identidad de secuencia con la lacasa PM1 , respectivamente (Klonowska et al., 2002. Eur. J. Biochem. 269, 61 19-6125; Colao et al., 2006. Microb. Cell Fact. 5, 31 ). Notablemente, tras 8 ciclos de evolución la termoestabilidad del mutante OB-1 se conservó 100 %, con valores de T50 de ~73° C. La lacasa PM1 pertenece al grupo de lacasas de alto potencial redox aisladas de la región oeste del Mediterráneo, junto con las lacasas de T. troggi, Trametes C30 y Coriolopsis gallica. Todas estas lacasas de alto potencial redox comparten un elevado grado de identidad de secuencia (superior al 97 %) y similares características bioquímicas, incluyendo en todos los casos una elevada termoestabilidad (Colao et al., 2003. Appl. Microbiol. Biot. 63, 153-158; Hilden et al., 2009. Biotechnol. Lett. 31 , 1 1 17-1 128). Para evaluar adicionalmente la termoestabilidad de nuestra lacasa evolucionada, se comparó con una batería de lacasas de alto potencial redox de diferentes procedencias (Figura 4C). La T50 del muíante OB-1 fue mayor que las de las lacasas de alto potencial redox de Trametes hirsuta, Trametes versicolor, P. cinnabarinus, or Pleurotus ostreatus y como se presumía, similar a la T50 de Coriolopsis gallica (con un 96 % de identidad de secuencia con la PM1 , Figura 10). La estabilidad de OB-1 fue adicionalmente evaluada en presencia de altas concentraciones de cosolventes orgánicos con diferentes polaridades y naturaleza química (Figura 4D). Como era de esperar de una enzima altamente termoestable (Zumárraga et al., 2007), la lacasa evolucionada PM 1 fue altamente tolerante a la presencia de cosolventes (reteniendo entre un 30 a un 90 % de su actividad tras 4 h de incubación en concentraciones de cosolventes tan altas como 50 % (v/v)). La estabilidad de la lacasa evolucionada a diferentes valores de pHs fue también evaluada, manteniendo cerca del 90 % de su actividad en el intervalo de pH 3-9 tras 4 h de incubación (Figura 4E).
La ultima variante OB-1 acumuló 15 mutaciones: 5 en la secuencia preprolíder del factor α (dos sinónimas), y 10 en la proteína madura (3 sinónimas). Tres de las cinco mutaciones sinónimas favorecieron el uso de codones (Tabla 1 ), lo cual puede ser un factor potencial para beneficiar el rendimiento de la secreción afectando a la velocidad de elongación (Romanos et al., 1992. Yeast 8, 423-488) . Las mutaciones beneficiosas en la lacasa madura se mapearon básicamente en residuos más bien accesibles, algunos localizados lejos de los cobres catalíticos mientras que otros aparecieron en la vecindad de los sitios catalíticos (la Tabla 4 y las Figuras 5, 9 resumen las características de estos cambios en la estructura de la lacasa muíante).
En particular, las mutaciones V162A, S426N y A461 T están en la vecindad del cobre T1 . La Valí 62 es uno de los residuos hidrofóbicos en el lazo que delimita la cavidad del bolsillo de sustrato del sitio T1 (Bertrand et al., 2002. Biochemistry 41 , 7325-7333). El cambio de Val a Ala en esta posición representa la sustitución de un residuo hidrofóbico por otro que también lo es pero más pequeño, lo cual podría favorecer la unión del sustrato (Figuras 5A, 5B). La Ser426 está unida mediante un puente de H a la Gly428 pero tras la mutación el puente de H se interrumpe y la Asn426 resultante establece un nuevo puente de H con la Thr427 adyacente. A consecuencia de este efecto, la Thr427 se encuentra doblemente unida a la His394 que es ligando del cobre T1 , por lo que este cambio podría afecta la posición relativa de la His394 respecto del sitio T1 (Figuras 5A, 5B).
La Ala461 es adyacente a la Phe460, que constituye ia posición del cuarto ligando axial en lacasas de plantas y bacterianas (Alcalde, 2007. Industrial Enzymes: Structure, functions and applications, J. Polaina and A.P. MacCabe, eds. (Dordrecht, The Netherlands: Springer) 459-474), y establece puentes de hidrógeno con los ligandos del cobre T1 , His455 y Cys450. La mutación A461 T parece generar un nuevo puente de H con la Phe460, lo cual podría cambiar la geometría local del sitio T1 (Xu et al., 1998. Biochem. J. 334, 63-70), Figuras 5A, 5B.
La mayoría de las mutaciones beneficiosas restantes (H208Y, S224G, A239P, D28 E) fueron localizadas lejos de los cobres catalíticos, apareciendo en giros y motivos secundarios cuyo papel en la función de la lacasa es incierto (Tabla 4, Figuras 5C, 5D, 5E, 5F). Es altamente improbable que tales mutaciones pudieran haber sido anticipadas mediante diseño racional, sin embargo, el empleo de la evolución dirigida ha permitido descubrir la relevancia funcional de éstas regiones de la lacasa previamente desconocidas.
Figure imgf000044_0001
Por ejemplo, el Asp281 está localizado en un loop distal del dominio D2 quedando prácticamente expuesto a la superficie proteica (a unos 40 A del sitio del cobre T1 ). La substitución de un Asp por un Glu en la posición 281 rompió dos puentes de H con la Thr188 y la Thr190 de un bucle vecino, y produjo un nuevo puente de H con la Gly282 del mismo motivo, lo cual podría incrementar la flexibilidad de esta zona (Figuras 5E, 5F). En cualquier caso, tampoco se puede descartar que las mutaciones mencionadas mejoren el plegamiento y la maduración de la lacasa en S. cerevisiae, además de su posible contribución a la robustez final de la proteína.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
2. Polinucleótido según la reivindicación 1 de secuencia nucleotídica SEQ ID NO:
2.
3. Construcción genética que comprende:
a. el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
b. el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que además comprende un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido, y/o con otras secuencias nucleotídicas necesarias o apropiadas para la transcripción in vitro o in vivo y su regulación en tiempo y lugar.
4. Construcción genética según la reivindicación 3, que además comprende un polinucleótido que codifica para un péptido señal que favorece la expresión funcional del polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
5. Construcción genética según la reivindicación 4, donde el péptido señal es el del factor evolucionado de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.
6. Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, donde el polinucleótido que codifica para el péptido señal es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 10.
7. Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.
8. Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende el polinucleotido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4.
9. Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-8, donde entre la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal del factor α y la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , se encuentra la secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos ácido glutámico y fenilalanina.
10. Construcción genética según la reivindicación 9 que comprende un polinucleotido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5.
1 1 . Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 que comprende el polinucleotido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 6.
12. Célula hospedadora que comprende un polinucleotido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-1 1.
13. Célula hospedadora según la reivindicación 12, que es una levadura.
14. Célula hospedadora según la reivindicación 13, que pertenece al género Saccharomyces.
15. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 que pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae.
16. Lacasa de alto potencial redox que comprende el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
17. Lacasa de alto potencial redox según la reivindicación 16 que además comprende los aminoácidos ácido glutámico y fenilalanina en el extremo amino del polipéptido, cuya secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 7.
18. Lacasa de alto potencial redox según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, que además comprende los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal del factor α (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina) en el extremo amino del polipéptido, cuya secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 8.
19. Método de obtención de una lacasa de alto potencial redox según se describe en las reivindicaciones 16-18, que comprende:
a. cultivar la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, y
b. purificar la lacasa.
20. Uso de los polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o de las construcciones genéticas según cualquiera de las reivindicaciones 3-1 1 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
21 . Uso de la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 12-15 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
22. Cultivo celular que comprende las células hospedadoras según cualquiera de las reivindicaciones 12-15.
23. Uso del cultivo según la reivindicación 22 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.
PCT/ES2011/070339 2010-05-17 2011-05-12 Lacasa de alto potencial redox Ceased WO2011144784A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201030723A ES2370216B1 (es) 2010-05-17 2010-05-17 Lacasa de alto potencial redox.
ESP201030723 2010-05-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011144784A1 true WO2011144784A1 (es) 2011-11-24

Family

ID=44991226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2011/070339 Ceased WO2011144784A1 (es) 2010-05-17 2011-05-12 Lacasa de alto potencial redox

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2370216B1 (es)
WO (1) WO2011144784A1 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820401A (zh) * 2013-11-14 2014-05-28 李洋 一种碱性细菌漆酶在酵母中的高通量表达方法
WO2014128325A1 (es) * 2013-02-19 2014-08-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Lacasa de alto potencial redox funcional en sangre mediante evolución dirigida método de obtención y sus aplicaciones

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033836A1 (en) * 1994-06-03 1995-12-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Phosphonyldipeptides useful in the treatment of cardiovascular diseases
WO1998038287A1 (en) * 1997-02-28 1998-09-03 Novo Nordisk A/S Laccase mutants
WO2009127702A2 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Novozymes A/S Laccase variants

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033836A1 (en) * 1994-06-03 1995-12-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Phosphonyldipeptides useful in the treatment of cardiovascular diseases
WO1998038287A1 (en) * 1997-02-28 1998-09-03 Novo Nordisk A/S Laccase mutants
WO2009127702A2 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Novozymes A/S Laccase variants

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FESTA GIOVANNA ET AL.: "Development of new laccases by directed evolution: functional and computational analyses", PROTEINS, vol. 72, no. 1, 10 January 2008 (2008-01-10), pages 25 - 34 *
MATE DIANA ET AL.: "Laboratory evolution of High-Redox Potential laccases", CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 17, 24 September 2010 (2010-09-24), pages 1030 - 1041, XP027299457 *
ROODVELDT CINTIA ET AL.: "Directed evolution of proteins for heterologous expression and stability", CURRENT OPINION IN STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 15, no. 1, 13 January 2005 (2005-01-13), pages 50 - 56 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014128325A1 (es) * 2013-02-19 2014-08-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Lacasa de alto potencial redox funcional en sangre mediante evolución dirigida método de obtención y sus aplicaciones
CN103820401A (zh) * 2013-11-14 2014-05-28 李洋 一种碱性细菌漆酶在酵母中的高通量表达方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2370216A1 (es) 2011-12-13
ES2370216B1 (es) 2012-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mate et al. Laboratory evolution of high-redox potential laccases
Hoshida et al. Isolation of five laccase gene sequences from the white-rot fungus Trametes sanguinea by PCR, and cloning, characterization and expression of the laccase cDNA in yeasts
Chen et al. Cloning and expression of a new manganese peroxidase from Irpex lacteus F17 and its application in decolorization of reactive black 5
Klonowska et al. LAC3, a new low redox potential laccase from Trametes sp. strain C30 obtained as a recombinant protein in yeast
Maté et al. Directed evolution of fungal laccases
RU2483107C2 (ru) Полипептид, имеющий nadh-зависимую hmf-редуктазную активность
Coconi-Linares et al. Recombinant expression of four oxidoreductases in Phanerochaete chrysosporium improves degradation of phenolic and non-phenolic substrates
Mate et al. Switching from blue to yellow: altering the spectral properties of a high redox potential laccase by directed evolution
Behrens et al. Variants of PpuLcc, a multi-dye decolorizing laccase from Pleurotus pulmonarius expressed in Pichia pastoris
Lee et al. Heterologous expression of a new manganese-dependent peroxidase gene from Peniophora incarnata KUC8836 and its ability to remove anthracene in Saccharomyces cerevisiae
EP2142652B1 (en) Methods for transforming eukaryotic algae
Bertrand et al. Functional expression, production, and biochemical characterization of a laccase using yeast surface display technology
CN114641565B (zh) 重组血红素硫醇盐加氧酶
WO2022253815A1 (en) Methods for producing betalains in yeast
TWI410492B (zh) 新穎真菌漆化酵素及其用途
Bronikowski et al. Redesign of a new manganese peroxidase highly expressed in Pichia pastoris towards a lignin‐degrading versatile peroxidase
Zerva et al. Characterization and application of a novel class II thermophilic peroxidase from Myceliophthora thermophila in biosynthesis of polycatechol
Tsukihara et al. Mechanism for oxidation of high-molecular-weight substrates by a fungal versatile peroxidase, MnP2
Kang et al. Secretory Production of the Hericium erinaceus Laccase from Saccharomyces cerevisiae
ES2370216B1 (es) Lacasa de alto potencial redox.
ES2668910T3 (es) Enzimas que degradan la lignina de Macrophomina phaseolina y usos de las mismas
Martínez High redox potential peroxidases
Miele et al. A semi-rational approach to engineering laccase enzymes
WO2018185222A1 (en) Aminoacyl trna synthetases and orthogonal trnas
WO2010058057A1 (es) Lacasas de alto potencial redox obtenidas por evolución dirigida

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11783115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11783115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1