WO2011110722A1 - Método para la proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico - Google Patents

Método para la proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico Download PDF

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cell
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isolated
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PCT/ES2011/070165
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Adrián KHOO
Franz MARTÍN BERMUDO
Bernat Soria Escoms
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Fundación Progreso Y Salud
Universidad Pablo De Olavide
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Definitions

  • the present invention falls within the field of biomedicine. Specifically it refers to a method for rapid "in vitro" proliferation of cells from tissues of endodermal origin, preferably pancreatic beta cells. It also refers to the cell culture medium that induces the proliferation employed in said method, to the cells and cell populations obtainable therefrom and to the drugs comprising these cells or cell populations for use in somatic cell therapy of lesions or diseases of tissues derived from the endoderm, preferably from lesions or diseases of the pancreas, more preferably from diabetes mellitus.
  • pancreatic islets have proven to be an effective alternative for the treatment of diabetes mellitus, by cell therapy.
  • the number of pancreatic islets that are isolated from cadaveric donors is low and this implies the need for pancreas from 2-3 cadaveric donors to ensure the success of islet transplantation.
  • the number of donors has been increasing in recent years, the amount is clearly insufficient to ensure the transplantation of islets to a significant number of patients with diabetes.
  • a possible alternative to overcome this problem would be the development of protocols that allowed the proliferation of pancreatic beta cells "in vitro" prior to transplantation. In this way, the mass of beta cells to be transplanted would be increased.
  • the protocols that have been developed to date to increase the proliferation of beta cells are mainly based on modifying the culture conditions "in vitro". In this sense, the growth factors or extracellular matrices that are added to the culture media are modified (Beattie, GM., Et al., 1997, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 82: 1852-1856). However, these procedures have failed to increase the proliferation of beta cells beyond 2% every 24 hours. In addition, many of these protocols lead to an unrecoverable loss of the phenotype and function of beta cells (Ouziel-Yahalom L, et al., 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications, 341: 291-298), which prevents their subsequent clinical application
  • epithelial cell dedifferentiation has been associated with a phenomenon called epithelial-mesenchymal transition (EMT).
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • pancreatic beta cells can undergo EMT, dedifferentiate to fibroblast-like cells, proliferate and eventually be redifferentiated to cells expressing insulin and glucagon (Ouziel-Yahalom L, et al., 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications , 341: 291-298; Gershengorn MC, et al., 2004, Science, 306: 2261-2224).
  • EMT does not induce multipotent properties in dedifferentiated pancreatic beta cells, indicating that these cells retain a restricted differentiation potential and, therefore, are more susceptible to redifferentiation into functional beta cells (Russ HA., Et al., 2009 , Pios One, 4: e6417).
  • pancreatic beta cells in order to achieve an increase in cell density and thus have a sufficient amount of cells for transplantation, within of the treatment methods based on cell therapy, there is still a need to develop "in vitro" culture methods that improve the proliferation of these cells. In this way, a greater cell mass will be obtained in a shorter period of time, in relation to conventional methods, and in addition, the loss of the phenotype and the biological functionality of the cells during their expansion in culture.
  • the present invention provides a method for the rapid "in vitro" proliferation of cells from tissues of endodermal origin, preferably pancreatic beta cells. It also refers to the proliferation inducing cell culture medium employed in said method, to the cells and cell populations obtainable therefrom and to the drugs comprising these cells or cell populations for use in somatic cell therapy of tissue lesions or diseases. Endoderm derivatives, preferably from lesions or diseases of the pancreas, more preferably from diabetes mellitus.
  • the method developed in the invention consists in the establishment of a culture enriched in cells derived from tissues of endodermal origin, preferably in pancreatic beta cells or hepatocytes, by culturing them in the presence of a cell culture medium inducing proliferation, and its subsequent coculture with inactivated endothelial cells.
  • This method allows rapid proliferation of endodermal cells “in vitro", preventing their complete dedifferentiation and, therefore, their loss of functionality.
  • the cells obtainable by this "in vitro" cell proliferation method have a phenotype of endocrine precursor cells.
  • the proliferation rate of murine adult pancreatic beta cells is 0.5-1% and when they are forced to proliferate, a greater increase of 10% is not achieved and at the expense of the loss of their beta cell phenotype.
  • this "in vitro" cell proliferation method of the invention it has been possible to move from a culture under control conditions with 69 ⁇ 3% of beta cells, to a culture with 98 ⁇ 2% of beta cells in approximately 14 days.
  • the increase in cell proliferation observed for beta cells is 4.02 ⁇ 0.3 times and 2.8 ⁇ 0.2 times for hepatocytes.
  • one aspect of the invention relates to a DMEM cell culture medium, hereafter referred to as "culture medium of the invention” or “proliferation inducing culture medium”, supplemented with: a. between 4% and 10% fetal calf serum or “calf serum” or “CF”, b. between 90 and 1 10 U / ml of penicillin and between 80 and 120 g / ml of streptomycin,
  • LIF leukemia inhibitor factor
  • epidermal growth factor j. between 9 and 1 1 ng / ml of epidermal growth factor or "EGF".
  • the "DMEM” or “Dulbecco's modified Eagle's medium” medium is a cell culture medium for the growth of mammalian cells whose composition is known to one skilled in the art.
  • this DMEM medium comprises between 0.5 g / l and 1.5 g / l glucose.
  • the DMEM medium comprises 1 g / l of glucose, a concentration which, as the examples of the present invention show, has been shown to be optimal for the cultivation of pancreatic beta cells.
  • the concentration of DMEM which, as shown in the examples of the present invention, has proven to be optimal for cell culture is 4.5 g / l glucose. Therefore, in another preferred embodiment, the DMEM medium comprises 4.5 g / l glucose when it is to be used, for example but not limited to, for hepatocyte culture.
  • DMEM 4.5 g / l glucose with glutamax (between 2 and 4 mM), sodium pyruvate (between 0.1 and 1 mM) and hepes (between 10 and 20 mM), supplemented with the elements ( a) to (h) of the culture medium of the invention.
  • Glutamax is a cell culture medium of composition known to one skilled in the art and formed by L-alanyl-L-glutamine.
  • Pyruvate is the carboxylate anion of pyruvic acid.
  • Hepes is N-2-hydroxyethylpiperacin-N'-2'-ethanesulfonic acid.
  • EGTA is the chemical compound of CAS number 67-42-5.
  • the non-essential amino acids that could be used in the culture medium of the invention are preferably glycine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-proline and L-serine.
  • the culture medium of the invention comprises DMEM 1 g / l glucose supplemented with: 5% fetal calf serum, 100 U / ml-100 pg / ml penicillin-streptomycin, 1 mM pyruvate sodium, 1% non-essential amino acids, 0.1 mM 2-beta-mercaptoethanol, 0.1 pg / ml hydrocortisone, 5 g-5 g-5 ng / ml insulin-transferrin-selenium, 1,000 U / ml of leukemia inhibitory factor, 10 ng / ml of epidermal growth factor and 1.5 mM of EGTA, amounts that, as shown by the examples of the present invention, have been proven optimal for pancreatic beta cell culture.
  • the culture medium of the invention comprises DMEM 4.5 g / l glucose, glutamax (2 mM), sodium pyruvate (1 mM) and hepes (10 mM), supplemented with: 10% serum fetal calf, 100 U / ml-100 g / ml penicillin-streptomycin, 0.1 mM 2-beta-mercaptoethanol, 0.1 g / ml hydrocortisone, 5 g-5 g-5 ng / ml insulin -transferrin-selenium, 1 000 U / ml of leukemia inhibitor factor and 1.5 mM of EGTA, amounts that, as shown by the examples of the present invention, have been proven optimal for hepatocyte culture.
  • each of the elements with which the culture medium of the invention is supplemented can vary within experimentally reasonable ranges depending on the cell type to be cultivated, therefore the amounts of such elements will be adjusted experimentally, so as the physical-chemical parameters of the culture, depending on the cell type derived from a tissue of endodermal origin to be cultivated.
  • Another aspect of the invention relates to a method for obtaining cells from isolated tissues of endodermal origin, hereinafter "method of the invention", comprising: a. isolate cells from an isolated biological sample from a tissue of endodermal origin of a mammal by means of a collagenase digestion protocol,
  • step (b) culturing the isolated cells in step (a) in the presence of the culture medium of the invention for 70-74 hours
  • step (c) add to the culture of step (b) inactivated endothelial cells, and d. cocultivate the culture of step (b) and the inactivated endothelial cells added in step (c) for 10-12 days.
  • the density of the cells cultured in step (b) is between 90,000 and 1 10,000 cells / cm 2 at the beginning of the culture. In a more preferred embodiment, the density of the cells cultured in step (b) is 100,000 cells / cm 2 at the beginning of the culture. In another preferred embodiment, the density of the inactivated endothelial cells of step (c) is between 50,000 and 70,000 cells / cm 2 at the time of their addition to the culture of step (b). In a more preferred embodiment, the density of the inactivated endothelial cells of step (c) is 60,000 cells / cm 2 at the time of their addition to the culture of step (b).
  • the tissue of endodermal origin of step (a) is pancreatic tissue.
  • the biological sample isolated from step (a) is an islet of Langerhans.
  • the cells isolated in step (a) are pancreatic beta cells.
  • the inactivated endothelial cells of step (c) are derived from the Mil Seven 1 cell line.
  • the tissue of endodermal origin of step (a) is liver tissue.
  • the cells isolated in step (a) are hepatocytes.
  • the inactivated endothelial cells of step (c) come from the liver.
  • tissues of endodermal origin means those tissues that are part of the organs selected from the list comprising: pancreas, trachea, bronchi, lungs, liver, bladder, digestive system, thyroid, thymus, tympanic cavity, ear tube, tonsils or parathyroids.
  • a "cell from a tissue of endodermal origin” is any cell comprised in said endodermal tissues.
  • An isolated biological sample includes, but is not limited to tissues and / or biological fluids from a tissue of endodermal origin of a mammal, obtained by any method known to a person skilled in the art that serves this purpose.
  • the isolated biological sample can be, for example, but not limited, fresh or frozen.
  • the biological sample isolated from a tissue of endodermal origin of a mammal is from a human, more preferably from a corpse of a human.
  • the isolation of the cells from the biological sample isolated from step (a) is performed by means of a collagenase digestion protocol.
  • Collagenase digestion protocols for cell isolation are known in the state of the art.
  • the hepatocyte isolation protocol is the Seglen protocol (Seglen, PO, 1976 , Methods in Cell Biology, vol. XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 4: 29-83).
  • the tissue of endodermal origin of step (a) of the method of the invention is pancreatic tissue and the isolated biological sample from it is islets of Langerhans
  • said collagenase digestion protocol for the isolation of pancreatic islets is, preferably, the protocol developed by Lernmark (Lernmark A., 1974, Diabetology, 10: 431-438) with the modifications explained below.
  • the collagenase digestion protocol of step (a) of the method of the invention hereinafter "digestion protocol of the invention”
  • step (c) incubate at 37 ° C the container of step (c) and shake it for 15 seconds in minutes 5, 7 and 9,
  • step (d) stop the incubation of step (d) in minute 10 by adding between 3 and 6 ml of the solution of step (a),
  • step (e) centrifuge twice the solution obtained in step (e) at 200 g for 3 to 5 minutes at room temperature and remove the supernatant in each centrifuge,
  • step (f) isolate the pancreatic islets present in the solution obtained in step (f), by manual fishing with a pipette and under a stereoscopic magnifying glass, and place them in a container with the solution of step (a),
  • a phosphate buffer solution comprising between 0.5% and 3% bovine albumin, between 1 and 3 mM glucose and 1.1 mM MgCl 2 , to the vessel of step (g).
  • step (h) centrifuge the solution from step (h) at 50 g for 1 to 3 minutes at room temperature and remove the supernatant
  • step (i) adds to the solution obtained in step (i) between 2 and 4 ml of a non-enzymatic cell dissociation solution at 37 ° C,
  • step (j) incubate at 37 ° C for 8 minutes the solution of step (j) and mechanically disperse the pancreatic islets of the solution by means of 10 pipteites in minutes 2, 4 and 6 of said incubation,
  • step (m) centrifuge the solution from step (m) at 200 g for 3 to 5 minutes at room temperature and remove the supernatant
  • step (n) adds to the solution obtained in step (n) between 1 and 2 ml of the culture medium of step (m),
  • step (o) p. filter the solution obtained in step (o) through a 70 ⁇ mesh
  • step (p) centrifuge the filtrate obtained in step (p) at 200 g for 3 to 5 minutes at room temperature
  • step (a) of the digestion protocol of the invention an islet isolation solution is prepared, which should preferably be at 4 o C.
  • the buffer composition of said solution is preferably (in mM): 1 NaCI, 5 KCI, 10 NAHCO 3 , 1, 1 MgCl 2 , 1, 2 NaH 2 PO 4 , 1 CaCI 2 and between 0.5 and 1 glucose, preferably 0.5 mM glucose.
  • To this solution is added between 0.5% and 3% bovine albumin, preferably 0.5% of, for example, but not limited to, Sigma bovine albumin, and its pH is adjusted to 7.3.
  • step (c) of the digestion protocol of the invention the pancreas is placed in a container, preferably in a tube, with between 5 and 9 ml, preferably 7 ml, of collagenase.
  • step (d) of this protocol the tube with the pancreas is placed in a 37 ° C incubation bath.
  • the pancreas is vigorously shaken by hand, for 15 seconds, at minutes 5, 7 and 9.
  • Incubation is stopped, in step (e) of this protocol, at minute 10 by the addition of between 3 and 6 ml, preferably 5 ml, of isolation solution at 4 o C, without collagenase (step solution (a) of the digestion protocol of the invention).
  • step (f) of this protocol The resulting solution is centrifuged twice at 200 g for 3 to 5 minutes, preferably for 5 minutes, at room temperature, in step (f) of this protocol. In each centrifuge, the supernatant is removed.
  • step (g) of the digestion protocol of the invention the pancreatic islets present in the solution obtained in step (f) are isolated by manual fishing using a pipette, under a stereoscopic dissection magnifier, and placed in a container, preferably in a petri dish, with isolation solution without cold collagenase (solution of step (a) of the digestion protocol of the invention). Pancreatic islets that are not completely separated from the exocrine tissue are dissected manually, preferably with two insulin syringes.
  • step (h) of the digestion protocol of the invention After isolation of the pancreatic islets they are washed, in step (h) of the digestion protocol of the invention, adding a phosphate buffer solution, preferably a Dulbbeco phosphate buffer solution, comprising between 0.5% and 3%, preferably 1%, of bovine albumin, between 1 and 3 mM, preferably 2.5 mM, of glucose and 1.1 mM MgC, to the passage vessel (g) comprising the islets.
  • the islets in this wash solution are centrifuged once at 50 g, for 1 to 3 minutes, preferably for 1 minute, at room temperature, in step (i) of the digestion protocol of the invention, and the supernatant is removed .
  • step (j) of this protocol between 2 and 4 ml, preferably 3 ml, of a solution, at 37 ° C, of non-enzymatic cell dissociation, such as, but not limited to, the solution is added of dissociation of non-enzymatic cells Sigma, catalog number C5914.
  • the solution obtained in step (j) is incubated for 8 minutes in an incubation bath at 37 ° C, in step (k) of the digestion protocol of the invention.
  • the islets are mechanically dispersed by pipetting 10 consecutive times, with a pipette of preferably 1 ml, at minutes 2, 4 and 6 of said incubation. Pipetting should be smooth and careful not to cause bubbles.
  • a trypsin-EDTA solution for example, although without limiting the trypsin-EDTA solution (Gibco) 0.1 xy mechanical dispersion is continued by pipetting, in step (I) of the digestion protocol of the invention.
  • step (m) of this protocol between 3 and 6 ml, preferably 5 ml, of DMEM culture medium are added, for example, but not limited to, DMEM (Gibco) , containing 4.5 g / l of glucose and supplemented with 1.0% fetal bovine serum, for example, even though not limited, fetal bovine serum (Hyclone).
  • DMEM Gibco
  • fetal bovine serum for example, even though not limited, fetal bovine serum (Hyclone).
  • step (n) of this protocol the cell suspension comprised in the solution of step (m) is centrifuged at 200 g for 3 to 5 minutes, preferably for 5 minutes, at room temperature, the supernatant is removed and between 1 and 2 ml, preferably 1 ml, of the previous culture medium added also in step (m) is added in step (o). Then, in step (p), the cell suspension is filtered through a 70 ⁇ mesh, for example, but not limited to, a Becton Dickinson mesh, preferably using a 1 ml pipette and at high speed.
  • a 70 ⁇ mesh for example, but not limited to, a Becton Dickinson mesh, preferably using a 1 ml pipette and at high speed.
  • the cell suspension is centrifuged again, in step (q), at 200 g for 3 to 5 minutes, preferably for 5 minutes, at room temperature and finally the cells are seeded in step (r) of the digestion protocol of the invention.
  • the times and quantities of products included in the digestion protocol of the invention may vary within experimentally reasonable ranges, due to the possible variations inherent in the implementation of said method.
  • the cells isolated in step (a) are seeded, preferably at a cell density of between 90,000 and 1 10,000 cells / cm 2 , and more preferably at a cell density of 100,000 cells / cm 2 , in a culture vessel, such as but not limited to, in a culture plate, preferably of low volume and, more preferably, with adherent plastic surface, and in the presence of the medium of cell culture of the invention, for 70-74 hours and preferably for 72 hours. After this period of time, inactivated endothelial cells are added to the culture of step (b).
  • Endothelial cells means flattened cells that line the inside of blood vessels and especially the capillaries, forming part of its wall, whose nucleus has a flattened morphology and appears elliptical in the cuts viewed under the microscope.
  • “Inactivated endothelial cells” are those endothelial cells that have lost their mitotic capacity.
  • the endothelial cells of step (c) of the method of the invention preferably come from the Mil Seven 1 (MS 1) cell line, known to a person skilled in the art and available, for example, but without imitating us, in the American Type Culture Collection (catalog number CRL-2279), when the cells isolated in step (a) of the method of the invention are pancreatic beta cells.
  • the endothelial cells used will come, for example, but not limited to, the liver itself.
  • Inactivated endothelial cells can be obtained by, for example but not limited to, the "in vitro" culture of endothelial cells with mitomycin C, preferably in an amount of between 2 and 3 pg / ml, and more preferably in an amount of 2.5 pg / ml, preferably between 2 and 3 hours, and more preferably for 2 hours.
  • the inactivated endothelial cells are added in step (c) of the method of the invention to the culture of step (b), preferably, at a density of between 50,000 and 70,000 cells / cm 2 , and more preferably at a density of 60,000 cells / cm 2 Said cell density can be achieved, in the case of cells from the MS 1 cell line, culturing said cells, for example, but not limited to, in a DMEM culture medium 4.5 g / l glucose supplemented with between 3-6% fetal bovine serum, preferably with 5% of fetal bovine serum.
  • step (d) of the method of the invention the inactivated endothelial cells and the cells cultured in the culture medium of the invention in step (b) are cocultured for 10-12 days, preferably, for 11 days.
  • the examples of the present invention show, after this period of coculture cell colonies are obtained that proliferate very rapidly and have markers of endocrine precursors, demonstrating the viability of the method of the invention as well as the fact that the cells obtained They have not lost their phenotype.
  • pancreas refers to the glandular organ located in the digestive and endocrine systems of vertebrates. It is both an endocrine gland (produces insulin, glucagon and somatostatin), and an exocrine gland (secretes pancreatic juice that contains digestive enzymes that pass into the small intestine). It has a conical shape and in the human species, its length ranges between 20 and 30 cm, has a width of approximately 4 cm and a thickness of approximately 5 cm; with a weight of approximately 30 g.
  • a "pancreatic tissue” is any tissue that is part of this organ.
  • islet of Langerhans or “pancreatic islet” is the accumulation of cells that are responsible for preferentially producing hormones such as insulin and glucagon, with a purely endocrine function. They also secrete other hormones and peptides. They form small cell groups of about 1,500 to 3,000 cells, scattered throughout the pancreas. In sections stained with hematoxylin-eosin they look like irregular pale pink islets widely distributed among the darker exocrine acini.
  • Pantencreatic beta cells are a type of pancreas cells located on the islets of Langerhans that synthesize and secrete insulin.
  • the method of the invention allows an "in vitro" expanded cell population of pancreatic beta cells to be obtained from pancreatic beta cells isolated from an islet of Langerhans or from islets of isolated Langerhans obtained from an isolated or partially isolated pancreas.
  • said method could comprise other additional steps, for example, but not limited to, in relation to the isolation of cells from step (a).
  • Another aspect of the invention relates to a cell obtainable by the method of the invention, hereafter referred to as "endodermal cell of the invention".
  • the endodermal cell of the invention is a pancreatic beta cell, hereinafter “pancreatic beta cell of the invention”.
  • the endodermal cell of the invention is a hepatocyte, hereinafter "hepatocyte of the invention”.
  • Another aspect of the invention relates to a cell population obtainable by the method of the invention, hereafter referred to as "endodermal cell population of the invention".
  • the endodermal cell population of the invention is formed by pancreatic beta cells, hereinafter “pancreatic beta cell population of the invention”.
  • the endodermal cell population of the invention is formed by hepatocytes, hereafter “hepatocyte population of the invention”.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the endodermal cell or cell population of the invention, preferably the pancreatic beta cell or the pancreatic beta cell population, the hepatocyte or the hepatocyte population of the invention, for the Preparation of a medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the endodermal cell or cell population of the invention for the preparation of a medicament for somatic cell therapy of lesions or diseases of endoderm-derived tissues.
  • pancreatic beta cell or cell population of the invention for the preparation of a medicament for somatic cell therapy of lesions or diseases of the pancreas.
  • the disease of the pancreas is diabetes mellitus.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the hepatocyte or hepatocyte population of the invention for the preparation of a medicament for somatic cell therapy of liver lesions or diseases.
  • the endodermal cell of the invention is a pancreatic beta cell when the cells isolated in step (a) of the method of the invention are pancreatic beta cells.
  • the endodermal cell population of the invention is formed by pancreatic beta cells when the cells isolated in step (a) of the method of the invention are pancreatic beta cells.
  • the endodermal cell of the invention is a hepatocyte when the cells isolated in step (a) of the method of the invention are hepatocytes.
  • the endodermal cell population of the invention is formed by hepatocytes when the cells isolated in step (a) of the method of the invention are hepatocytes.
  • treatment is to combat the effects caused as a result of lesions or diseases of tissues derived from the endoderm, preferably, of lesions or diseases of the pancreas, more preferably, of diabetes mellitus, to stabilize the status of individuals or prevent further damage.
  • Somatic cell therapy means the use of live somatic cells, both autologous (from the patient itself), and allogeneic (from another human being) or xenogeneic (from animals), whose biological characteristics may have been altered as a result of their manipulation, to obtain a therapeutic, diagnostic or preventive effect, by metabolic, pharmacological or immunological means.
  • Somatic cell therapy medications include, for example, but not limited to: manipulated cells to modify its immunological, metabolic or other functional properties in qualitative or quantitative aspects; classified cells, selected and manipulated, which are subsequently subjected to a manufacturing process in order to obtain the finished product; cells manipulated and combined with non-cellular components (for example, matrices or biological or inert medical devices) that exert the intended action in principle on the finished product; autologous cell derivatives expressed ex vivo (in vitro) under specific culture conditions; or cells genetically modified or subjected to another type of manipulation to express homological or non-homological functional properties previously not expressed.
  • non-cellular components for example, matrices or biological or inert medical devices
  • Cells, as well as cell populations, obtainable by the method of the invention can be used for, for example, but not limited to, the prevention and / or regeneration of tissue lesions by transplantation to the damaged organ, as well as metabolic diseases or Genetic Said cells and cell populations can be used in cell therapy together with one or more compounds, drugs or cells useful for the prevention or treatment of lesions or diseases of endoderm-derived tissues, simultaneously or sequentially.
  • injuries or diseases of tissues derived from the endoderm are understood as all those injuries or metabolic or genetic diseases that affect or that occur in tissues derived from the endoderm.
  • One of the "lesions or diseases of the pancreas" for which the medicaments of the present invention could be useful is, for example, but not limited to, diabetes mellitus.
  • diabetes mellitus refers to the group of metabolic disorders that affects different organs and tissues, lasts a lifetime and is characterized by an increase in blood glucose levels: hyperglycemia. It is caused by several disorders, including the low production of the hormone insulin, secreted by pancreatic beta cells, the absence or significant decrease in beta cell mass and / or by increased insulin resistance.
  • the main symptoms of diabetes mellitus are: excessive emission of urine (polyuria), abnormal increase in the need to eat (polyphagia), increased thirst (polydipsia) and weight loss for no apparent reason.
  • This term includes the types of diabetes mellitus selected from the list comprising: type 1 diabetes mellitus, type 2 diabetes mellitus, gestational diabetes or other types of diabetes mellitus.
  • Liver lesions or diseases for which the medicaments of the present invention could be useful are, for example, but not limited to, cirrhosis, hepatitis A, B or C, liver cancer, hepatocarcinoma, hepatocellular carcinoma or hepatoma, hemochromatosis , liver ischemia or liver disease or liver disease.
  • kit of the invention which comprises the cell culture medium of the invention.
  • the kit of the invention further comprises inactivated endothelial cells.
  • the kit of the invention also comprises all the elements necessary to carry out the digestion protocol of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the kit of the invention for obtaining cells from isolated tissues of endodermal origin.
  • Said kit may comprise, without any limitation, culture media, sera, factors that favor the growth of cells in culture, such as amino acids, antibiotics, cytokines, etc., buffers, reagents, agents to prevent contamination. It may also comprise primers, probes, polymerases, antibodies, reagents, etc. and, in general, the means necessary to carry out cellular characterization.
  • the kit may include methods and means necessary to carry out the extraction, purification, etc. of nucleic acids and / or proteins. It could also include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
  • the kit will contain elements necessary for obtaining cells from isolated tissues of endodermal origin, by the technique described above.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • Fig. 1 It shows the enrichment in the pancreatic beta cell culture in the presence of the proliferation inducing medium.
  • the cells shown in the figure are positive for insulin.
  • C graph showing the percentage of alpha and beta cells of the cultures for conditions A and B.
  • the controls refer to condition A and the protocol to condition B.
  • Fig. 2 It shows the formation of rapidly growing colonies of beta cells at different days of culture, after co-culture with inactivated endothelial cells. It is a phase contrast image.
  • A colony formation after 6 days of cultivation.
  • B colony formation after 10 days of cultivation.
  • Fig. 3 It shows the formation of rapidly growing hepatocyte colonies at different days of culture, after co-culture with inactivated endothelial cells. It is a phase contrast image.
  • A colony formation after 6 days of cultivation.
  • B colony formation after 10 days of cultivation.
  • Fig. 4 It shows the incorporation of BrdU in islets grown in control culture medium (control) and in the proliferation inducing medium (protocol), for 10 days.
  • B: Graph showing the level of BrdU incorporation in islets grown in control culture medium (control) and in the proliferation inducing medium (protocol), for 10 days. The results of a representative experiment of the 10 performed are shown. * p ⁇ 0.001 control vs protocol. Bar 50 ⁇ .
  • Fig. 6 Shows an immunofluorescence image in islets grown in the proliferation inducing medium (protocol), for 14 days.
  • the image shows positive cells for neurogenin 3 and cells positive for cytokeratin 19.
  • the nuclei are marked with DAPI. It is a colony after 14 days of cultivation.
  • Example 1 Proliferation "in vitro" of beta cells from pancreatic islets.
  • Pancreatic islets were isolated by the islet isolation protocol developed by Lernmark (Lernmark A., 1974, Diabetology, 10: 431-438) with a modification, by collagenase digestion, of the mouse strain OF1, males 8-12 weeks of age and 35-40 g.
  • an islet isolation solution was prepared. This solution was at 4 o C.
  • the buffer composition of the solution was (in mM): 1 15 NaCI, 5 KCI, 10 NAHCOs, 1, 1 MgCl 2 , 1, 2 NaH 2 PO 4 , 1 CaCI 2 and 0 , 5 glucose.
  • 0.5% bovine albumin (Sigma) was added and its pH adjusted to 7.3.
  • the islets in this wash solution were centrifuged once at 50 g, for 1 minute, at room temperature. Subsequently, the supernatant was removed and 3 ml of a solution, at 37 ° C, of non-enzymatic cell dissociation (Sigma, catalog No. C5914) was added. Next, the islets were incubated for 8 minutes in a 37 ° C incubation bath. During the incubation time, The islets were mechanically dispersed by pipetting 10 consecutive times, with a 1 ml pipette, in minutes 2, 4 and 6. The pipetting should be smooth and taking care not to cause bubbles.
  • the cell suspension was filtered through a 70 ⁇ mesh (Becton Dickinson) using a 1 ml high speed pipette. After filtration, the cell suspension was centrifuged again at 200 g for 5 minutes, at room temperature. Finally, the cells were seeded in low volume culture plates, with adherent plastic surface (Greiner, catalog number 627170). The cells were seeded at 60 ⁇ per well, at a density of 100,000 cells / cm 2 .
  • Islets and dissociated cells were cultured in the presence of different media, for 72h.
  • the islets were grown in control medium ( Figure 1 A), which consisted of DMEM 1 g / l glucose (Gibco), 5% fetal calf serum (Hyclone), penicillin-streptomycin 100 U / ml-100 g / ml ( Gibco).
  • Dissociated cells were grown in the proliferation inducing medium ( Figure 1 B).
  • This medium carried DMEM 1 g / l glucose (Gibco), 5% fetal calf serum (Hyclone), 100 U / ml-100 g / ml penicillin-streptomycin (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), non-essential amino acids 1% (Gibco), 0.1 mM 2-beta-mercaptoethanol (Gibco), 0.1 g / ml hydrocortisone (Sigma), insulin-transferrin-selenium 5 g-5 g-5 ng / ml (Roche), factor 1 000 U / ml mouse recombinant leukemia inhibitor (Chemicon), 10 ng / ml epidermal growth factor (Sigma) and 1 mM EGTA (Sigma).
  • MS 1 Mil Seven 1 cell line
  • It is a capillary endothelial cell line that was purchased from the American Type Culture Collection (catalog number CRL-2279). Previously, this cell line was inactivated by culturing it with 2.5 g / ml mitomycin C (Sigma) for 2h.
  • the culture medium of the line was DMEM 4.5 g / l glucose (Gibco) supplemented with 5% fetal bovine serum (Gibco).
  • Example 2 Proliferation "in vitro" of hepatocytes from liver tissue.
  • liver tissue was developed.
  • hepatocytes were isolated by the traditional two-step collagenase digestion protocol, developed by Seglen (Seglen, PO, Methods in Cell Biology, vol. XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 1976; Chapter 4, pp. 29-83) and were cultured in the presence of endothelial cells of the liver itself.
  • the cells were seeded at 60 ⁇ per well, at a density of 100,000 cells / cm 2 .
  • Endothelial cells from the liver itself they were at a density of 60,000 cells / cm 2 .
  • the culture medium in this case was: DMEM 4.5 g / l glucose with glutamax (2 mM), sodium pyruvate (1 mM) and hepes (1.0 mM) (Gibco), 1% fetal calf serum (Hyclone ), penicillin ina-streptomycin 1 00 U / ml-100 g / ml (Gibco), 0.1 mM 2-beta-mercaptoethanol (Gibco), 0.1 g / ml hydrocortisone (Sigma), insulin-transferrin-selenium 5 g-5 g-5 ng / ml (Roche), 1 000 U / ml mouse recombinant leukemia inhibitor factor (Chemicon) and 1.5 mM EGTA (Sigma).
  • Example 4 Epithelial-mesenchymal transition of cultured cell colonies in the presence of the inducing medium.
  • Cytokeratin 19 is a marker of epithelial tissue.
  • insulin it was used as primary monoclonal anti-insulin antibody (Sigma, catalog number 12018), at a dilution 1/200.
  • Alexa Fluor 594 Alexa Fluor 594 (Invitrogen) was used as a secondary antibody, at a dilution 1/300.
  • a polyclonal anti-cytokeratin 19 (Abcam, catalog number ab15463) was used as primary antibody for cytokeratin 19, at a dilution of 1/200.
  • Alexa Fluor 488 (Invitrogen) was used as a secondary antibody, at a dilution 1/300.
  • Example 5 Marking for endocrine precursors in the cells of the proliferating colonies.
  • Neurogenin 3 is a marker of endocrine precursor cells. Neurogenin 3 was used as the primary monoclonal anti-neurogenin 3 antibody (Beta Cell Biology Consortium, catalog number AB2013), at a dilution 1/50. Alexa Fluor 488 (Invitrogen) was used as a secondary antibody, at a dilution of 1/300. A polyclonal anti-cytokeratin 19 (Abcam, catalog number ab15463) was used as primary antibody for cytokeratin 19, at a dilution of 1/200.
  • Alexa Fluor 594 (Invitrogen) was used as a secondary antibody, at a dilution 1/300.
  • This colocalization, in all the cells of the colony indicated that although the rapidly replicating cells in the colony underwent a dedifferentiation process, they had properties of endocrine precursor cells. That is, a population of rapidly proliferating cells with characteristics of endocrine precursors was being obtained.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para la rápida proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente de células beta pancreáticas. También se refiere al medio de cultivo celular inductor de la proliferación empleado en dicho método, a células y poblaciones celulares obtenibles mediante el mismo y a los medicamentos que comprenden estas células o poblaciones celulares para su uso en terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, preferiblemente de lesiones o enfermedades de páncreas, más preferiblemente de la diabetes mellitas.

Description

Método para la proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico
La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina. Específicamente se refiere a un método para la rápida proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente de células beta pancreáticas. También se refiere al medio de cultivo celular inductor de la prol iferación empleado en d icho método, a las células y poblaciones celulares obtenibles mediante el mismo y a los medicamentos que comprenden estas células o poblaciones celulares para su uso en terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tej idos derivados del endodermo, preferiblemente de lesiones o enfermedades del páncreas, más preferiblemente de la diabetes mellitus.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El protocolo de Edmonton (Shapiro AMJ., et al., 2000, The New England Journal of Medicine, 343: 230-238) para el trasplante de islotes pancreáticos procedentes de donantes cadavéricos, ha demostrado ser una alternativa eficaz para el tratamiento de la diabetes mellitus, mediante terapia celular. Lamentablemente, el número de islotes pancreáticos que se aislan de los donantes cadavéricos es bajo y esto supone la necesidad de disponer de páncreas de 2-3 donantes cadavéricos para garantizar el éxito del trasplante de islotes. A pesar de que el número de donantes ha ido en aumento en los últimos años, su cantidad es claramente insuficiente para asegurar el trasplante de islotes a un número significativo de pacientes con diabetes. Una posible alternativa para superar este problema sería el desarrollo de protocolos que permitieran la proliferación de las células beta pancreáticas "in vitro" previamente a su trasplante. De esta manera, se aumentaría la masa de células beta a trasplantar.
Los protocolos que se han desarrollado hasta la fecha para aumentar la proliferación de las células beta se basan principalmente en modificar las condiciones de cultivo "in vitro". En este sentido, se modifican los factores de crecimiento o las matrices extracelulares que se añaden a los medios de cultivo (Beattie, GM., et al., 1997, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 82: 1852-1856). Sin embargo, estos procedimientos no han conseguido incrementar la proliferación de las células beta más allá de un 2% cada 24h. Además, muchos de estos protocolos conducen a una pérdida irrecuperable del fenotipo y la función de las células beta (Ouziel-Yahalom L, et al., 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications, 341 : 291 -298), lo que impide su posterior aplicación clínica.
Por otro lado, la desdiferenciación de las células epiteliales se ha asociado con un fenómeno denominado transición epitelio-mesénquima (EMT). Bajo ciertas condiciones de cultivo, las células beta pancreáticas pueden sufrir EMT, desdiferenciarse hacia células parecidas a fibroblastos, proliferar y finalmente ser rediferenciadas hacia células que expresan insulina y glucagón (Ouziel- Yahalom L, et al., 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications, 341 : 291 -298; Gershengorn MC, et al., 2004, Science, 306: 2261 -2264). El EMT no induce propiedades multipotentes en las células beta pancreáticas desdiferenciadas, lo que indica que estas células retienen un potencial de diferenciación restringido y que, por tanto, son más susceptibles a rediferenciarse hacia células beta funcionales (Russ HA., et al., 2009, Píos One, 4: e6417).
Se ha comprobado que las señales enviadas por los vasos sanguíneos juegan un papel importante en la proliferación y la especificación de la identidad de las células hepáticas y pancreáticas (Lammert E., et al., 2001 , Science, 294: 564- 567). Esto en parte es debido a la secreción de factores de crecimiento y citoquinas por parte de las células del endotelio vascular (Johansson M., et al., 2006, Endocrinology, 147: 2315-2324), así como, por la matriz extracelular secretada por las mencionadas células (Nikolova G., et al., 2006, Developmental Cell, 10: 397-405). En resumen, aunque se han realizado esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de cultivo "in vitro" de las células beta pancreáticas, con el fin de conseguir un aumento en la densidad celular y disponer así de una cantidad suficiente de células para su transplante, dentro de los métodos de tratamiento basados en la terapia celular, continúa existiendo la necesidad de desarrollar métodos de cultivo "in vitro", que mejoren la proliferación de estas células. De esta manera se obtendrá una mayor masa celular en un menor periodo de tiempo, en relación a los métodos convencionales, y además, se evitará la pérdida del fenotipo y de la funcionalidad biológica de las células durante su expansión en cultivo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método para la rápida proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente de células beta pancreáticas. También se refiere al medio de cultivo celular inductor de la proliferación empleado en dicho método, a las células y poblaciones celulares obtenibles mediante el mismo y a los medicamentos que comprenden estas células o poblaciones celulares para su uso en terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, preferiblemente de lesiones o enfermedades del páncreas, más preferiblemente de la diabetes mellitus.
El método desarrollado en la invención consiste en el establecimiento de un cultivo enriquecido en células derivadas de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente en células beta pancreáticas o hepatocitos, mediante el cultivo de las mismas en presencia de un medio de cultivo celular inductor de la proliferación, y su posterior cocultivo con células endoteliales inactivadas. Este método permite una rápida proliferación de las células endodérmicas "in vitro", evitando su desdiferenciación completa y, por ende, su pérdida de funcionalidad. Como se muestra en los ejemplos de la presente invención, las células obtenibles mediante este método de proliferación celular "in vitro" presentan un fenotipo de células precursoras endocrinas. La tasa de proliferación de las células beta pancreáticas adultas murinas es del 0,5-1 % y cuando se las fuerza a proliferar no se consigue un incremento mayor del 10% y a expensas de la pérdida de su fenotipo de células beta. Mediante este método de proliferación celular "in vitro" de la invención se ha conseguido pasar de un cultivo en condiciones control con un 69 ± 3% de células beta, a un cultivo con un 98 ± 2% de células beta en aproximadamente 14 días. Asimismo, el incremento de la proliferación celular observado para las células beta es de 4,02 ± 0,3 veces y de 2,8 ± 0,2 veces para los hepatocitos. Esto quiere decir que el método de proliferación celular "in vitro" de la invención permite expandir la masa de células beta pancreáticas, y en general, de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, por encima de los protocolos existentes y además conservando su fenotipo, lo cual es de especial relevancia en terapia celular de enfermedades tales como la diabetes, donde el principal problema es la falta de células beta pancreáticas para transplantar. Por ello, un aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo celular DMEM, de ahora en adelante "medio de cultivo de la invención" o "medio de cultivo inductor de la proliferación", suplementado con: a. entre el 4% y el 10% de suero fetal de ternera o "calf serum" o "CF", b. entre 90 y 1 10 U/ml de penicilina y entre 80 y 120 g/ml de estreptomicina,
c. entre 0,5 y 2 mM de piruvato sódico,
d. entre 0,05 y 0,2 mM de 2-beta-mercaptoetanol,
e. entre 0,05 y 0,2 pg/ml de hidrocortisona,
f. entre 4 g-4 g-4 ng/ml y 6 g-6 g-6 ng/ml de insulina-transferrina- selenio,
g. entre 900 y 1 .100 U/ml de factor inhibidor de leucemia o "LIF", h. entre 1 y 2 mM de EGTA,
i. entre el 0,5% y el 2% de aminoácidos no esenciales, y
j. entre 9 y 1 1 ng/ml de factor de crecimiento epidermal o "EGF".
El medio "DMEM" o "Dulbecco's modified Eagle's médium" es un medio de cultivo celular para el crecimiento de células de mamífero cuya composición es conocida por un experto en la materia. En una realización preferida, este medio DMEM comprende entre 0,5 g/l y 1 ,5 g/l de glucosa. En una realización más preferida de este aspecto de la invención el medio DMEM comprende 1 g/l de glucosa, concentración que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se ha demostrado óptima para el cultivo de células beta pancreáticas.
Para el cultivo de otros tipos celulares procedentes de tejidos de origen endodérmico, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, de hepatocitos, la concentración de DMEM que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se ha demostrado óptima para el cultivo celular es de 4,5 g/l de glucosa. Por tanto, en otra realización preferida, el medio DMEM comprende 4,5 g/l de glucosa cuando va a ser empleado, por ejemplo pero sin limitarnos, para el cultivo de hepatocitos. En una realización más preferida, para dicho cultivo de hepatocitos se emplea DMEM 4,5 g/l de glucosa con glutamax (entre 2 y 4 mM), piruvato sódico (entre 0,1 y 1 mM) y hepes (entre 10 y 20 mM), suplementado con los elementos (a) a (h) del medio de cultivo de la invención. "Glutamax" es un medio de cultivo celular de composición conocida por un experto en la materia y formado por L-alanil-L-glutamina. El "piruvato" es el anión carboxilato del ácido pirúvico. El "hepes" es el ácido N-2- hidroxietilpiperacina-N'-2'-etanesulfónico.
El EGTA es el compuesto químico de número CAS 67-42-5. Los aminoácidos no esenciales que podrían ser empleados en el medio de cultivo de la invención son, preferiblemente, glicina, L-alanina, L-asparragina, L-ácido aspártico, L-ácido glutámico, L-prolina y L-serina.
En otra realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende DMEM 1 g/l de glucosa suplementado con: un 5% de suero fetal de ternera, 100 U/ml-100 pg/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico, un 1 % de aminoácidos no esenciales, 0,1 mM de 2-beta-mercaptoetanol, 0,1 pg/ml de hidrocortisona, 5 g-5 g-5 ng/ml de insulina-transferrina-selenio, 1 .000 U/ml de factor inhibidor de leucemia, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidermal y 1 ,5 mM de EGTA, cantidades que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se han demostrado óptimas para el cultivo de células beta pancreáticas.
En otra realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende DMEM 4,5 g/l de glucosa, glutamax (2 mM), piruvato sódico (1 mM) y hepes (10 mM), suplementado con: un 10% de suero fetal de ternera, 100 U/ml-100 g/ml de penicilina-estreptomicina, 0,1 mM de 2-beta-mercaptoetanol, 0,1 g/ml de hidrocortisona, 5 g-5 g-5 ng/ml de insulina-transferrina-selenio, 1 .000 U/ml de factor inhibidor de leucemia y 1 ,5 mM de EGTA, cantidades que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se han demostrado óptimas para el cultivo de hepatocitos.
Las cantidades óptimas de cada uno de los elementos con los que se suplementa el medio de cultivo de la invención pueden variar dentro de unos rangos experimentalmente razonables dependiendo del tipo celular a cultivar, por ello se ajustarán experimentalmente las cantidades de tales elementos, así como los parámetros físico-químicos del cultivo, en función del tipo celular derivado de un tejido de origen endodérmico a cultivar.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende: a. aislar las células de una muestra biológica aislada de un tejido de origen endodérmico de un mamífero mediante un protocolo de digestión con colagenasa,
b. cultivar las células aisladas en el paso (a) en presencia del medio de cultivo de la invención durante 70-74 horas,
c. añadir al cultivo del paso (b) células endoteliales inactivadas, y d. cocultivar el cultivo del paso (b) y las células endoteliales inactivadas añadidas en el paso (c) durante 10-12 días.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la densidad de las células cultivadas en el paso (b) es de entre 90.000 y 1 10.000 células/cm2 al inicio del cultivo. En una realización más preferida, la densidad de las células cultivadas en el paso (b) es de 100.000 células/cm2 al inicio del cultivo. En otra realización preferida, la densidad de las células endoteliales inactivadas del paso (c) es de entre 50.000 y 70.000 células/cm2 en el momento de su adición al cultivo del paso (b). En una realización más preferida, la densidad de las células endoteliales inactivadas del paso (c) es de 60.000 células/cm2 en el momento de su adición al cultivo del paso (b).
En otra realización preferida, el tejido de origen endodérmico del paso (a) es tejido pancreático. En una realización más preferida, la muestra biológica aislada del paso (a) es un islote de Langerhans. En una realización aun más preferida, las células aisladas en el paso (a) son células beta pancreáticas. En otra realización preferida, las células endoteliales inactivadas del paso (c) proceden de la línea celular Mil Seven 1 .
En otra realización preferida, el tejido de origen endodérmico del paso (a) es tejido hepático. En una realización más preferida, las células aisladas en el paso (a) son hepatocitos. En una realización aun más preferida, las células endoteliales inactivadas del paso (c) proceden del hígado. En la presente invención se entiende por "tejidos de origen endodérmico" aquellos tejidos que forman parte de los órganos seleccionados de la lista que comprende: páncreas, tráquea, bronquios, pulmones, hígado, vejiga, aparato digestivo, tiroides, timo, cavidad timpánica, tubo auditivo, amígdalas o paratiroides. Una "célula procedente de un tejido de origen endodérmico" es cualquier célula comprendida en dichos tejidos endodérmicos.
Una muestra biológica aislada incluye, pero sin limitarnos a tejidos y/o fluidos biológicos procedentes de un tejido de origen endodérmico de un mamífero, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. Asimismo, la muestra biológica aislada puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca o congelada. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un tejido de origen endodérmico de un mamífero procede de un humano, más preferiblemente de un cadáver de un humano.
El aislamiento de las células de la muestra biológica aislada del paso (a) se realiza mediante un protocolo de digestión con colagenasa. Los protocolos de digestión con colagenasa para el aislamiento de células son conocidos en el estado de la técnica. Así, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el caso de que el tejido de origen endodérmico del paso (a) del método de la invención sea tejido hepático, el protocolo de aislamiento de hepatocitos es el protocolo de Seglen (Seglen, P.O., 1976, Methods in Cell Biology, vol. XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 4: 29-83). En el caso de que el tejido de origen endodérmico del paso (a) del método de la invención sea tejido pancreático y la muestra biológica aislada procedente del mismo sean islotes de Langerhans, dicho protocolo de digestión con colagenasa para el aislamiento de islotes pancreáticos es, preferiblemente, el protocolo desarrollado por Lernmark (Lernmark A., 1974, Diabetología, 10: 431 -438) con las modificaciones que se explican a continuación. Así, en otra realización preferida, el protocolo de digestión con colagenasa del paso (a) del método de la invención, de ahora en adelante "protocolo de digestión de la invención", comprende: a. preparar una solución que comprende 1 15 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM NAHCOs, 1 ,1 mM MgCI2, 1 ,2 mM NaH2PO4, 1 mM CaCI2, entre 0,5 y 1 mM de glucosa y entre 0,5% y 3% de albúmina bovina, a 4o C y pH 7,3, b. añadir entre 5 y 8 mg de colagenasa tipo V a entre 6 y 10 mi de la solución del paso (a), c. colocar el páncreas, previamente extraído de un mamífero al que se le han inyectado entre 2,5 y 5 mi de la solución del paso (b), en un recipiente con entre 5 y 9 mi de colagenasa,
d. incubar a 37 °C el recipiente del paso (c) y agitarlo durante 15 segundos en los minutos 5, 7 y 9,
e. detener la incubación del paso (d) en el minuto 10 mediante la adición de entre 3 y 6 mi de la solución del paso (a),
f. centrifugar dos veces la solución obtenida en el paso (e) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante en cada centrifugado,
g. aislar los islotes pancreáticos presentes en la solución obtenida en el paso (f), mediante pesca manual con una pipeta y bajo una lupa estereoscópica, y colocarlos en un recipiente con la solución del paso (a),
h. añadir al recipiente del paso (g) una solución tampón fosfato que comprende entre 0,5% y 3% de albúmina bovina, entre 1 y 3 mM glucosa y 1 ,1 mM MgCI2,
i. centrifugar la solución del paso (h) a 50 g durante entre 1 y 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante,
j. añadir a la solución obtenida en el paso (i) entre 2 y 4 mi de una solución de disociación de células no enzimática a 37° C,
k. incubar a 37° C durante 8 minutos la solución del paso (j) y dispersar mecánicamente los islotes pancreáticos de la solución mediante 10 pipéteos en los minutos 2, 4 y 6 de dicha incubación,
I . añadir entre 0,5 y 1 ,5 mi de una solución de tripsina-EDTA a la solución del paso (k) durante el último minuto de la incubación,
m. añadir entre 3 y 6 mi de medio de cultivo DMEM a la solución obtenida en el paso (I),
n. centrifugar la solución del paso (m) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante,
o. añadir a la solución obtenida en el paso (n) entre 1 y 2 mi del medio de cultivo del paso (m),
p. filtrar la solución obtenida en el paso (o) a través de una malla de 70 μηη,
q. centrifugar el filtrado obtenido en el paso (p) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente, y
r. sembrar las células obtenidas tras la centrifugación del paso (q). En el paso (a) del protocolo de digestión de la invención se prepara una solución de aislamiento de islotes, la cual debe estar, preferiblemente, a 4o C. La composición del buffer de dicha solución es preferiblemente (en mM): 1 15 NaCI, 5 KCI, 10 NAHCO3, 1 ,1 MgCI2, 1 ,2 NaH2PO4, 1 CaCI2 y entre 0,5 y 1 glucosa, preferiblemente 0,5 mM de glucosa. A esta solución se le añade entre un 0,5% y un 3% de albúmina bovina, preferiblemente un 0,5% de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, albúmina bovina Sigma, y se ajusta su pH a 7,3. Se toman entre 6 y 10 mi, preferiblemente 8 mi, de esa solución y se le añaden entre 5 y 8 mg, preferiblemente 6,3 mg, de colagenasa tipo V, por ejemplo, aunque sin limitarnos, de Sigma (actividad de la colagenasa 533 unidades/mg). Se inyectan entre 2,5 y 5 mi, preferiblemente 3 mi, de la solución fría de colagenasa (solución del paso (b) del protocolo de digestión de la invención) en el colédoco de un mamífero y tras hincharse el páncreas, lo más rápidamente posible se extrae el mismo, removiendo el tejido graso y el tejido conectivo. Posteriormente, en el paso (c) del protocolo de digestión de la invención, el páncreas se coloca en un recipiente, preferiblemente en un tubo, con entre 5 y 9 mi, preferiblemente 7 mi, de colagenasa. A continuación, en el paso (d) de este protocolo, el tubo con el páncreas se introduce en un baño de incubación a 37° C. El páncreas se agita vigorosamente con la mano, durante 15 segundos, en los minutos 5, 7 y 9. La incubación se detiene, en el paso (e) de este protocolo, en el minuto 10 mediante la adición de entre 3 y 6 mi, preferiblemente 5 mi, de solución de aislamiento a 4o C, sin colagenasa (solución del paso (a) del protocolo de digestión de la invención). La solución resultante se centrifuga 2 veces a 200 g durante entre 3 y 5 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, a temperatura ambiente, en el paso (f) de este protocolo. En cada centrifugado, el sobrenadante se elimina. Finalmente, en el paso (g) del protocolo de digestión de la invención, los islotes pancreáticos presentes en la solución obtenida en el paso (f) se aislan mediante pesca manual usando una pipeta, bajo una lupa de disección estereoscópica, y se colocan en un recipiente, preferiblemente en una placa petri, con solución de aislamiento sin colagenasa fría (solución del paso (a) del protocolo de digestión de la invención). Los islotes pancreáticos que no estén com pletamente separados del tej ido exocri n o o e l tej i d o va sc u l a r se diseccionan manualmente, preferiblemente con dos jeringas de insulina. Tras el aislamiento de los islotes pancreáticos estos se lavan, en el paso (h) del protocolo de digestión de la invención, añadiendo una solución tampón fosfato, preferiblemente una solución tampón fosfato Dulbbeco, que comprende entre un 0,5% y un 3%, preferiblemente un 1 %, de albúmina bovina, entre 1 y 3 mM, preferiblemente 2,5 mM, de glucosa y 1 ,1 mM MgC , al recipiente del paso (g) comprendiendo los islotes. Los islotes en esta solución de lavado se centrifugan una vez a 50 g, durante entre 1 y 3 minutos, preferiblemente durante 1 minuto, a temperatura ambiente, en el paso (i) del protocolo de digestión de la invención, y se elimina el sobrenadante. Posteriormente, en el paso (j) de este protocolo, se añaden entre 2 y 4 mi, preferiblemente 3 mi, de una solución, a 37° C, de disociación de células no enzimática, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la solución de disociación de células no enzimática Sigma, n° de catálogo C5914. A continuación, la solución obtenida en el paso (j) se incuba durante 8 minutos en un baño de incubación a 37° C, en el paso (k) del protocolo de digestión de la invención. Durante el tiempo de incubación, los islotes se dispersan mecánicamente mediante pipeteo de 10 veces consecutivas, con una pipeta de preferiblemente 1 mi, en los minutos 2, 4 y 6 de dicha incubación. El pipeteo debe de ser suave y con cuidado de no ocasionar burbujas. Durante el último minuto de la incubación se añaden entre 0,5 y 1 ,5 mi, preferiblemente 1 mi, de una solución de tripsina-EDTA, como por ejemplo, aunque sin limitarnos la solución tripsina-EDTA (Gibco) 0,1 x y se continúa con la dispersión mecánica mediante el pipeteo, en el paso (I) del protocolo de digestión de la invención. Para detener el proceso de disociación de los islotes pancreáticos en células, en el paso (m) de este protocolo se añaden entre 3 y 6 mi, preferiblemente 5 mi, de medio de cultivo DMEM, por ejemplo aunque sin limitarnos, DMEM (Gibco), conteniendo 4,5 g/l de glucosa y su plementado con 1 0% de suero fetal bovino, por ejemplo, au nq ue sin limitarnos, suero fetal bovino (Hyclone). Posteriormente, en el paso (n) de este protocolo, la suspensión celular comprendida en la solución del paso (m) se centrifuga a 200 g durante entre 3 y 5 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, a temperatura ambiente, se elimina el sobrenadante y se añade, en el paso (o), entre 1 y 2 mi, preferiblemente 1 mi, del medio de cultivo anterior añadido también en el paso (m). Después, en el paso (p), la suspensión celular se filtra a través de una malla de 70 μιτι, por ejemplo, aunque sin limitarnos, una malla Becton Dickinson, preferiblemente usando una pipeta de 1 mi y a alta velocidad. Tras la filtración, la suspensión celular se centrifuga de nuevo, en el paso (q), a 200 g durante entre 3 y 5 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, a temperatura ambiente y finalmente las células se siembran en el paso (r) del protocolo de digestión de la invención. Los tiempos y cantidades de productos comprendidos en el protocolo de digestión de la invención podrán variar dentro de unos rangos experimentalmente razonables, debido a las posibles variaciones inherentes a la puesta en práctica de dicho método.
Para llevar a cabo el cultivo del paso (b) del método de la invención, las células aisladas en el paso (a) se siembran, preferiblemente a una densidad celular de entre 90.000 y 1 10.000 células/cm2, y más preferiblemente a una densidad celular de 100.000 células/cm2, en un recipiente de cultivo, como por ejemplo pero sin limitarnos, en una placa de cultivo, preferiblemente, de bajo volumen y, más preferiblemente, con superficie de plástico adherente, y en presencia del medio de cultivo celular de la invención, durante 70-74 horas y preferiblemente durante 72 horas. Transcurrido este periodo de tiempo se añaden al cultivo del paso (b) células endoteliales inactivadas. Se entiende por "células endoteliales" las células aplanadas que recubren el interior de los vasos sanguíneos y sobre todo de los capilares, formando parte de su pared, cuyo núcleo presenta una morfología aplanada y aparece elíptico en los cortes visualizados al microscopio. Las "células endoteliales inactivadas" son aquellas células endoteliales que han perdido su capacidad mitótica. Las células endoteliales del paso (c) del método de la invención proceden, preferiblemente, de la l ínea celular Mil Seven 1 (MS 1 ), conocida por un experto en la materia y disponible, por ejemplo, aunque sin l imitarnos, en la American Type Culture Collection (número de catálogo CRL-2279), cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son células beta pancreáticas. Si las células aisladas en el paso (a) son hepatocitos, entonces las células endoteliales que se empleen procederán, por ejemplo, aunque sin limitarnos, del propio hígado. Células endoteliales inactivadas pueden obtenerse mediante, por ejemplo aunque sin limitarnos, el cultivo "in vitro" de las células endoteliales con mitomicina C, preferiblemente en una cantidad de entre 2 y 3 pg/ml , y más preferiblemente en una cantidad de 2,5 pg/ml, durante preferiblemente entre 2 y 3 horas, y más preferiblemente durante 2 horas.
Las células endoteliales inactivadas se añaden en el paso (c) del método de la invención al cultivo del paso (b), preferiblemente, a una densidad de entre 50.000 y 70.000 células/cm2, y más preferiblemente a una densidad de 60.000 células/cm2. Dicha densidad celular se puede alcanzar, para el caso de las células procedentes de la l ínea celular MS 1 , cultivando dichas células, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en un medio de cultivo DMEM 4,5 g/l glucosa suplementado con entre 3-6% de suero fetal bovino, preferiblemente con 5% de suero fetal bovino.
En el paso (d) del método de la invención, las células endoteliales inactivadas y las células cultivadas en el medio de cultivo de la invención en el paso (b) se cocultivan durante 10-12 días, preferiblemente, durante 1 1 días. Como muestran los ejemplos de la presente invención, tras este periodo de cocultivo se obtienen colonias celulares que proliferan con gran rapidez y que presentan marcadores de precursores endocrinos, lo que demuestra la viabilidad del método de la invención así como el hecho de que las células obtenidas no han perdido su fenotipo.
El término "páncreas" se refiere al órgano glandular ubicado en los sistemas digestivo y endocrino de los vertebrados. Es a la vez, una glándula endocrina (produce insulina, glucagón y somatostatina), y una glándula exocrina (segrega jugo pancreático que contiene enzimas digestivas que pasan al intestino delgado). Tiene forma cónica y en la especie humana, su longitud oscila entre 20 y 30 cm, tiene una anchura de aproximadamente unos 4 cm y un grosor de aproximadamente 5 cm; con un peso de aproximadamente 30 g. Un "tejido pancreático" es cualquier tejido que forme parte de este órgano.
Por "islote de Langerhans" o "islote pancreático" se entiende los acúmulos de células que se encargan de producir preferentemente hormonas como la insulina y el glucagón, con función netamente endocrina. También secretan otras hormonas y péptidos. Forman pequeños grupos celulares de unas 1 .500 a 3.000 células, dispersos por todo el páncreas. En los cortes teñidos con hematoxilina-eosina tienen el aspecto de islotes irregulares de color rosa pálido distribuidos extensamente entre los acinos exocrinos de color más oscuro.
Las "células beta pancreáticas" son un tipo de células del páncreas localizadas en los islotes de Langerhans que sintetizan y segregan insulina.
El método de la invención permite obtener una población celular expandida "in vitro" de células beta pancreáticas a partir de células beta pancreáticas aisladas de un islote de Langerhans o a partir de islotes de Langerhans aislados obtenidos a partir de un páncreas aislado o parcialmente aislado. Además de los pasos especificados anteriormente en el método de la invención, dicho método podría comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en relación al aislamiento de células del paso (a).
Otro aspecto de la invención se refiere a una célula obtenible mediante el método de la invención, de ahora en adelante "célula endodérmica de la invención". En una realización preferida de este aspecto de la invención, la célula endodérmica de la invención es una célula beta pancreática, de ahora en adelante "célula beta pancreática de la invención". En otra realización preferida, la célula endodérmica de la invención es un hepatocito, de ahora en adelante "hepatocito de la invención".
Otro aspecto de la invención se refiere a una población celular obtenible mediante el método de la invención, de ahora en adelante "población celular endodérmica de la invención". En una realización preferida, la población celular endodérmica de la invención esta formada por células beta pancreáticas, de ahora en adelante "población celular beta pancreática de la invención". En otra realización preferida, la población celular endodérmica de la invención esta formada por hepatocitos, de ahora en adelante "población de hepatocitos de la invención".
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular endodérmicas de la invención, preferiblemente de la célula beta pancreática o de la población celular beta pancreática, del hepatocito o de la población de hepatocitos de la invención, para la elaboración de un medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular endodérmicas de la invención para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular beta pancreáticas de la invención para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades del páncreas. En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad del páncreas es la diabetes mellitus. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del hepatocito o de la población de hepatocitos de la invención para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades del hígado. La célula endodérmica de la invención es una célula beta pancreática cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son células beta pancreáticas. La población celular endodérmica de la invención esta formada por células beta pancreáticas cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son células beta pancreáticas. La célula endodérmica de la invención es un hepatocito cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son hepatocitos. La población celular endodérmica de la invención está formada por hepatocitos cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son hepatocitos. El término "medicamento", tal y como se usa en esta descripción, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, el diagnóstico, el alivio, el tratamiento o la curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una preparación que comprenda, al menos, la célula o la población celular endodérmicas obtenibles mediante el método de la invención, la célula o la población celular beta pancreáticas obtenibles mediante el método de la invención o el hepatocito o la población de hepatocitos obtenibles mediante el método de la invención. El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, supone combatir los efectos causados como consecuencia de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, preferiblemente, de lesiones o enfermedades del páncreas, más preferiblemente, de diabetes mellitus, para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores.
Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características biológicas pueden haber sido alteradas como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades fu ncionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas.
Las células, así como las poblaciones celulares, obtenibles mediante el método de la invención pueden ser empleadas para, por ejemplo, pero sin limitarnos, la prevención y/o regeneración de lesiones tisulares mediante su trasplante al órgano dañado, así como de enfermedades metabólicas o genéticas. Dichas células y poblaciones celulares pueden ser empleadas en terapia celular junto con uno o más compuestos, medicamentos o células útiles para la prevención o el tratamiento de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, de manera simultánea o secuencial.
En la presente invención se entiende por "lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo" todas aquellas lesiones o enfermedades metabólicas o genéticas que afecten o que se produzcan en tejidos derivados del endodermo.
Una de las "lesiones o enfermedades del páncreas" para la cual podrían ser útiles los medicamentos de la presente invención es, por ejemplo, aunque sin limitarnos, la diabetes mellitus.
El término "diabetes mellitus" se refiere al grupo de trastornos metabólicos que afecta a diferentes órganos y tejidos, dura toda la vida y se caracteriza por un aumento de los niveles de glucosa en la sangre: hiperglicemia. Es causada por varios trastornos, incluyendo la baja producción de la hormona insulina, secretada por las células beta pancreáticas, la ausencia o disminución significativa de la masa de células beta y/o por el aumento de la resistencia a la insulina. Los síntomas principales de la diabetes mellitus son: emisión excesiva de orina (poliuria), aumento anormal de la necesidad de comer (polifagia), incremento de la sed (polidipsia) y pérdida de peso sin razón aparente. Dentro de este término se incluyen los tipos de diabetes mellitus seleccionados de la lista que comprende: diabetes mellitus tipo 1 , diabetes mellitus tipo 2, diabetes gestacional u otros tipos de diabetes mellitus.
Las "lesiones o enfermedades del hígado" para las cuales podrían ser útiles los medicamentos de la presente invención son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cirrosis, hepatitis A, B o C, cáncer de hígado, hepatocarcinoma, carcinoma hepatocelular o hepatoma, hemocromatosis, isquemia hepática o hepatopatía o enfermedad hepática.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico, de ahora en adelante "kit de la invención", que comprende el medio de cultivo celular de la invención. En una realización preferida, el kit de la invención además comprende células endoteliales inactivadas. En una realización más preferida el kit de la invención además comprende todos los elementos necesarios para llevar a cabo el protocolo de digestión de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico.
Dicho kit puede comprender, sin ningún tipo de limitación, medios de cultivo, sueros, factores que favorezcan el crecimiento de células en cultivo, como aminoácidos, antibióticos, citoquinas, etc., tampones, reactivos, agentes para prevenir la contaminación. Puede comprender, además, cebadores, sondas, polimerasas, anticuerpos, reactivos, etc. y, en general, los medios necesarios para llevar a cabo la caracterización celular. Por otro lado el kit puede incluir métodos y medios necesarios para llevar a cabo la extracción, purificación, etc. de ácidos nucleicos y/o proteínas. También podría incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. A título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, el kit contendrá elementos necesarios para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico, por la técnica que se ha descrito anteriormente. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Muestra el enriquecimiento en el cultivo de células beta pancreáticas en presencia del medio inductor de la proliferación. Las células que aparecen en la figura son positivas para insulina. A: islotes pancreáticos murinos cultivados 72h en medio de cultivo control. B: cultivo enriquecido de células beta, cultivados 72h en el medio de cultivo inductor de la proliferación. C: gráfica mostrando el porcentaje de células alfa y beta de los cultivos para las condiciones A y B. Los controles se refieren a la condición A y el protocolo a la condición B. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. *p< 0,001 control vs protocolo. Barra= 500 μιτι.
Fig. 2. Muestra la formación de colonias de rápido crecimiento de células beta a distintos días de cultivo, tras el co-cultivo con las células endoteliales inactivadas. Se trata de una imagen de contraste de fase. A: formación de colonias tras 6 días de cultivo. B: formación de colonias tras 10 días de cultivo. C: gráfica mostrando el incremento de la proliferación en las colonias a los 6 y 10 días de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. *p< 0,001 6 días vs 10 días. Barra= 50 μηη.
Fig. 3. Muestra la formación de colonias de rápido crecimiento de hepatocitos a distintos días de cultivo, tras el co-cultivo con las células endoteliales inactivadas. Se trata de una imagen de contraste de fase. A: formación de colonias tras 6 días de cultivo. B: formación de colonias tras 10 días de cultivo. C: gráfica mostrando el incremento de la proliferación en las colonias a los 6 y 10 días de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. *p< 0,001 6 días vs 10 días. Barra= 50 μιτι.
Fig. 4. Muestra la incorporación de BrdU en islotes cultivados en medio de cultivo control (control) y en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 10 días. A: Las células que se replican incorporan BrdU. Se trata de una colonia tras 10 días de cultivo. En esta imagen hay una superposición de una imagen de fluorescencia con una en contraste de fase. B: Gráfica mostrando el nivel de incorporación de BrdU en islotes cultivados en medio de cultivo control (control) y en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 10 días. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. *p< 0.001 control vs protocolo. Barra= 50 μιτι. Fig. 5. Muestra una imagen de inmunofluorescencia en islotes cultivados en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 14 días. En la imagen se ven células positivas para insulina y células positivas para citoqueratina 19. Los núcleos aparecen marcados con DAPI. Se trata de una colonia tras 14 días de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 3 realizados. Barra= 50 μιτι.
Fig. 6. Muestra una imagen de inmunofluorescencia en islotes cultivados en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 14 días. En la imagen se ven células positivas para neurogenina 3 y células positivas para citoqueratina 19. Los núcleos aparecen marcados con DAPI. Se trata de una colonia tras 14 d ías de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 3 realizados. Barra= 50 μιτι.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico desarrollado en la invención. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1. Proliferación "in vitro" de células beta procedentes de islotes pancreáticos.
Se aislaron islotes pancreáticos mediante el protocolo de aislamiento de islotes desarrollado por Lernmark (Lernmark A., 1974, Diabetología, 10: 431 -438) con una modificación, mediante digestión con colagenasa, de la cepa de ratón OF1 , machos de 8-12 semanas de edad y de 35-40 g. En primer lugar se preparó una solución de aislamiento de islotes. Esta solución estaba a 4o C. La composición del buffer de la solución era (en mM): 1 15 NaCI, 5 KCI, 10 NAHCOs, 1 ,1 MgCI2, 1 ,2 NaH2PO4, 1 CaCI2 y 0,5 glucosa. A esta solución se le añadió un 0,5% albúmina bovina (Sigma) y se ajustó su pH a 7,3. Se tomaron 8 mi de esa solución y se le añadieron 6,3 mg de colagenasa tipo V de Sigma (actividad de la colagenasa 533 unidades/mg). Se inyectaron 3 mi de la solución fría de colagenasa en el colédoco del animal y tras hincharse el páncreas, lo más rápidamente posible se extrajo el mismo, removiendo el tejido graso y el tejido conectivo. Posteriormente, el páncreas se colocó en un tubo con 7 mi de colagenasa. A continuación, el tubo con el páncreas se introdujo en un baño de incubación a 37° C. El páncreas se agitó vigorosamente con la mano, durante 15 segundos, en los minutos 5, 7 y 9. La incubación se detuvo en el minuto 10 mediante la adición de 5 mi de solución de aislamiento a 4o C, sin colagenasa. La suspensión resultante se centrifugó 2 veces a 200 g durante 5 minutos, a temperatura ambiente. En cada centrifugado, el sobrenadante se eliminó. Finalmente, usando una pipeta, los islotes se pescaron manualmente bajo una lupa de disección y se colocaron en una placa petri, con solución de aislamiento sin colagenasa fría. Los islotes que no estaban completamente sepa rados d e l tej ido exocri no o d el tejido vascular se diseccionaron manualmente con dos jeringas de insulina. Tras el aislamiento de los islotes estos se lavaron en una solución tampón fosfato Dulbbeco que contenía 1 % de albúmina bovina, 2,5 mM glucosa y 1 ,1 mM MgCI2. Los islotes en esta solución de lavado se centrifugaron una vez a 50 g, durante 1 minuto, a temperatura ambiente. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 3 mi de una solución, a 37° C, de disociación de células no enzimática (Sigma, n° de catálogo C5914). A continuación, los islotes fueron incubados durante 8 minutos en un baño de incubación a 37° C. Durante el tiempo de incubación, los islotes se dispersaron mecánicamente mediante pipeteo de 10 veces consecutivas, con una pipeta de 1 mi, en los minutos 2, 4 y 6. El pipeteo debe de ser suave y con cuidado de no ocasionar burbujas. Durante el último minuto de la digestión se añadió 1 mi de una solución de tripsina-EDTA (Gibco) 0,1 x y se continuó con la dispersión mecánica mediante el pipeteo. Para detener el proceso de disociación de los islotes pancreáticos en células, se añadieron 5 mi de med io de cultivo DM EM (G ibco), conten iendo 4 ,5 g/l de gl ucosa y suplementado con 1 0% de suero fetal bovino (Hyclone). Posteriormente, la suspensión celular se centrifugó a 200 g durante 5 minutos, a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 mi del medio de cultivo anterior. Después, la suspensión celular se filtró a través de una malla de 70 μιτι (Becton Dickinson) usando una pipeta de 1 mi y a alta velocidad. Tras la filtración, la suspensión celular se centrifugó de nuevo a 200 g durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Finalmente, las células se sembraron en placas de cultivo de bajo volumen, con superficie de plástico adherente (Greiner, n° de catálogo 627170). Las células se sembraron en 60 μΙ por pocilio, a una densidad de 100.000 células/cm2.
Los islotes y las células disociadas se cultivaron en presencia de distintos medios, durante 72h. Los islotes se cultivaron en medio control (Figura 1 A), el cual consistía en DMEM 1 g/l glucosa (Gibco), suero fetal de ternera 5% (Hyclone), penicilina-estreptomicina 100 U/ml-100 g/ml (Gibco). Las células disociadas se cultivaron en el medio inductor de la proliferación (Figura 1 B). Este medio llevaba DMEM 1 g/l glucosa (Gibco), suero fetal de ternera 5% (Hyclone), penicilina-estreptomicina 100 U/ml-100 g/ml (Gibco), piruvato sódico 1 mM (Gibco), aminoácidos no esenciales 1 % (Gibco), 2-beta- mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco), hidrocortisona 0,1 g/ml (Sigma), insulina- transferrina-selenio 5 g-5 g-5 ng/ml (Roche), factor inhibidor de leucemia recombinante de ratón 1 .000 U/ml (Chemicon), factor de crecimiento epidermal 10 ng/ml (Sigma) y EGTA 1 mM (Sigma). Tras 72h de cultivo se realizó una inmunofluorescencia para detectar células positivas para insulina. Como anticuerpo primario se usó anti-insulina monoclonal (Sigma, número de catálogo 12018), a una dilución 1/400. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 488 (Invitrogen), a una dilución 1 /400. Los datos mostraron cómo el empleo del método de cultivo mediante el medio inductor de la proliferación aquí descrito o protocolo, permite obtener un cultivo prácticamente puro en células beta pancreáticas (Figura 1 C). Se consiguió pasar así de un cultivo en condiciones controles con un 69 ± 3% de células beta, a un cultivo en el protocolo de la invención con un 98 ± 2% de células beta (n= 10, p<0,001 ). Con respecto a las células alfa se consiguió pasar de un cultivo en condiciones control de 23 ± 3% de células alfa, a un cultivo en el protocolo de la invención con un 2 ± 1 % de células alfa (n= 10, p<0,001 ).
Posteriormente, al cultivo celular enriquecido en células beta, tras 3 días de cultivo en el medio inductor de la proliferación, se le añadieron 60.000 células/cm2 de la línea celular Mil Seven 1 (MS 1 ). Se trata de una l ínea celular de endotelio capilar que se adquirió a la American Type Culture Collection (número de catálogo CRL-2279). Previamente, esta l ínea celular se inactivo cultivándola con 2,5 g/ml de mitomicina C (Sigma) durante 2h. El medio de cultivo de la l ínea era DMEM 4,5 g/l glucosa (Gibco) suplementado con 5% suero fetal bovino (Gibco).
A continuación el cocultivo de las células beta y de las células MS 1 del endotelio capilar se mantuvo durante 1 1 días más en presencia del medio inductor de la proliferación. Se observó que a partir del día 6 de cultivo (Figura 2A) se comenzaron a formar unas colonias de células que proliferaban (n= 10). En el día 10 de cultivo (Figura 2B) aparecían numerosas colonias de unas 2.000 células que proliferaban rápidamente (n= 10). El incremento en la proliferación celular observado fue de 4,02 ± 0,3 (n= 10, p< 0,001 ) veces (Figura 2C). Además, los tres días en cultivo en el medio inductor de la proliferación produjeron una proliferación significativa de las células positivas a insulina, cuando se comparó con los islotes cultivados en el medio control (Figura 1 B, n= 10, p< 0,001 ).
Ejemplo 2. Proliferación "in vitro" de hepatocitos procedentes de tejido hepático.
Para probar este método de proliferación celular "in vitro" en otro tejido de origen endodérmico se desarrolló un protocolo muy similar para tejido hepático. Con este fin se aislaron hepatocitos mediante el protocolo tradicional de digestión con colagenasa en dos pasos, desarrollado por Seglen (Seglen, P.O., Methods in Cell Biology, vol. XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 1976; Chapter 4, pp. 29-83) y se cultivaron en presencia de células endoteliales del propio hígado. Las células se sembraron en 60 μΙ por pocilio, a una densidad de 100.000 células/cm2. Las células endoteliales procedentes del propio hígado estaban a una densidad de 60.000 células/cm2. El medio de cultivo en este caso fue: DMEM 4,5 g/l glucosa con glutamax (2 mM), piruvato sódico (1 mM) y hepes (1 0 mM) (Gibco), suero fetal de ternera 1 0% (Hyclone), pen icil ina- estreptomicina 1 00 U/ml-100 g/ml (Gibco), 2-beta-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco), hidrocortisona 0,1 g/ml (Sigma), insulina-transferrina-selenio 5 g-5 g-5 ng/ml (Roche), factor inhibidor de leucemia recombinante de ratón 1 .000 U/ml (Chemicon) y EGTA 1 ,5 mM (Sigma).
En el caso del cultivo de los hepatocitos junto con las células endoteliales hepáticas, se observó cómo a partir del día 6 de cultivo (Figura 3A) se comenzaron a formar unas agrupaciones celulares que proliferaban a gran rapidez (n= 10). En el día 10 del cultivo aparecieron colonias de unas 1 .500 células que proliferaban muy rápido (n= 10) (Figura 3B). En este caso, el incremento observado en la proliferación celular fue de 2,8 ± 0,2 (n= 10, p< 0,001 ) veces (Figura 3C).
Ejemplo 3. índice de incorporación de BrdU en las colonias celulares.
Tras 10 días de cultivo en el medio inductor de la proliferación, se llevó a cabo un estudio de incorporación de BrdU para ver el grado de replicación de las células que formaban parte de las colonias. La incorporación de BrdU a las 24h se evaluó mediante inmunofluorescencia. Como anticuerpo primario se usó anti-BrdU (Abcam, número de catálogo ab6326), a una dilución 1 /400 (Figura 4A). En la figura 4B se puede observar cómo tras 10 días de cultivo en presencia del medio inductor, la incorporación de BrdU y, por tanto, la replicación en las colonias que proliferan, fue del 96 ± 3% (n= 10). Este incremento en la replicación fue altamente significativo cuando se comparó con islotes cultivados en el medio control durante 10 días, en cuyo caso la incorporación de BrdU fue de 0,9 ± 0,3% (n= 10) (Figura 4B, n= 10, p< 0,001 ).
Ejemplo 4. Transición epitelio-mesénquima de las colonias celulares cultivadas en presencia del medio inductor.
Tras 14 días de cultivo en el medio inductor se llevó a cabo un estudio del grado de desdiferenciación celular. Para ello se hicieron dobles inmunocitoquímicas para insulina y citoqueratina 19 (Figura 5). La citoqueratina 19 es un marcador del tejido epitelial. Para la insulina se empleó como anticuerpo primario anti-insulina monoclonal (Sigma, número de catálogo 12018), a una dilución 1 /200. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 594 (Invitrogen), a una dilución 1 /300. Para la citoqueratina 19 se empleó como anticuerpo primario un anti-citoqueratina 19 policlonal (Abcam, número de catálogo ab15463), a una dilución 1 /200. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 488 (Invitrogen), a una dilución 1 /300. En la imagen se observa que las células de la periferia del clon eran positivas para insulina y citoqueratina 19 (n= 3). Estos datos señalaban que el 3 ± 1 % de las células positivas para insulina, es decir, de origen endotelial, estaban sufriendo una transición epitelio-mesénquima. Estas células de la periferia del clon eran las que dieron lugar a las colonias de células proliferantes.
Ejemplo 5. Mareaje para precursores endocrinos en las células de las colonias que proliferan.
Tras 14 días de cultivo en el medio inductor, se estudió la presencia de marcadores endocrinos o de precursores de los mismos. Para ello se hicieron dobles inmunocitoquímicas para neurogenina-3 y citoqueratina 19 (Figura 6). La neurogenina 3 es un marcador de células precursoras endocrinas. Para la neurogenina 3 se empleó como anticuerpo primario anti-neurogenina 3 monoclonal (Beta Cell Biology Consortium, número de catálogo AB2013), a una dilución 1 /50. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 488 (Invitrogen), a una dilución 1/300. Para la citoqueratina 19 se empleó como anticuerpo primario un anti-citoqueratina 19 policlonal (Abcam, número de catálogo ab15463), a una dilución 1 /200. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 594 (Invitrogen), a una dilución 1 /300. En la imagen se observa que el 95 ± 4% de las células de la colonia expresaban a la vez neurogenina 3 y citoqueratina 19 (n= 3). Esta colocalización, en todas las células de la colonia, indicó que aunque las células que se replicaban rápidamente en la colonia sufrían un proceso de desdiferenciación, tenían propiedades de células precursoras endocrinas. Es decir, se estaba obteniendo una población de células que proliferaban rápidamente con características de precursores endocrinos.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Medio de cultivo celular DMEM suplementado con: a. entre el 4% y el 10% de suero fetal de ternera,
b. entre 90 y 1 1 0 U/ml de penicil ina y entre 80 y 1 20 g/ml de estreptomicina,
c. entre 0,5 y 2 mM de piruvato sódico,
d. entre 0,05 y 0,2 mM de 2-beta-mercaptoetanol,
e. entre 0,05 y 0,2 pg/ml de hidrocortisona,
f. entre 4 g-4 g-4 n g /m l y 6 g-6 g-6 ng/m l de i nsu lina- transferrina-selenio,
g. entre 900 y 1 .100 U/ml de factor inhibidor de leucemia, h. entre 1 y 2 mM de EGTA,
i. entre el 0,5% y el 2% de aminoácidos no esenciales, y j. entre 9 y 1 1 ng/ml de factor de crecimiento epidermal.
2. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1 donde el medio DMEM comprende 1 g/l de glucosa.
3. Método para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico que comprende: a. aislar las células de una muestra biológica aislada de un tejido de origen endodérmico de un mamífero mediante un protocolo de digestión con colagenasa,
b. cultivar las células aisladas en el paso (a) en presencia de un medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 durante 70-74 horas,
c. añadir al cultivo del paso (b) células endoteliales inactivadas, y d. cocultivar el cultivo del paso (b) y las células endoteliales inactivadas añadidas en el paso (c) durante 10-12 días.
4. Método según la reivindicación 3 donde la densidad de las células cultivadas en el paso (b) es de entre 90.000 y 1 10.000 células/cm2 al inicio del cultivo.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 donde la densidad de las células endoteliales inactivadas del paso (c) es de entre 50.000 y 70.000 células/cm2 en el momento de su adición al cultivo del paso (b).
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 donde el tejido de origen endodérmico del paso (a) es tejido pancreático.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde la muestra biológica aislada del paso (a) es un islote de Langerhans.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 donde las células aisladas en el paso (a) son células beta pancreáticas.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 donde las células endoteliales inactivadas del paso (c) proceden de la l ínea celular Mil Seven 1 .
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 donde el protocolo de digestión con colagenasa del paso (a) comprende: a. preparar una solución que comprende 1 15 mM NaCI, 5 mM KCI,
10 mM NAHCOs, 1 ,1 mM MgCI2, 1 ,2 mM NaH2PO4, 1 mM CaCI2, entre 0,5 y 1 mM de glucosa y entre 0,5% y 3% de albúmina bovina, a 4o C y pH 7,3,
b. añadir entre 5 y 8 mg de colagenasa tipo V a entre 6 y 10 mi de la solución del paso (a),
c. colocar el páncreas, previamente extraído de un mamífero al que se le han inyectado entre 2,5 y 5 mi de la solución del paso (b), en un recipiente con entre 5 y 9 mi de colagenasa,
d. incubar a 37 °C el recipiente del paso (c) y agitarlo durante 15 segundos en los minutos 5, 7 y 9,
e. detener la incubación del paso (d) en el minuto 10 mediante la adición de entre 3 y 6 mi de la solución del paso (a),
f. centrifugar dos veces la solución obtenida en el paso (e) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante en cada centrifugado,
g. aislar los islotes pancreáticos presentes en la solución obtenida en el paso (f), mediante pesca manual con una pipeta y bajo una lupa estereoscópica, y colocarlos en un recipiente con la solución del paso (a),
h. añadir al recipiente del paso (g) una solución tampón fosfato que comprende entre 0,5% y 3% de albúmina bovina, entre 1 y 3 mM glucosa y 1 ,1 mM MgCI2,
i. centrifugar la solución del paso (h) a 50 g durante entre 1 y 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante, j. añadir a la solución obtenida en el paso (i) entre 2 y 4 mi de una solución de disociación de células no enzimática a 37° C, k. incubar a 37° C durante 8 minutos la solución del paso (j) y dispersar mecánicamente los islotes pancreáticos de la solución mediante 10 pipéteos en los minutos 2, 4 y 6 de dicha incubación, I . añadir entre 0,5 y 1 ,5 mi de una solución de tripsina-EDTA a la solución del paso (k) durante el último minuto de la incubación, m. añadir entre 3 y 6 mi de medio de cultivo DMEM a la solución obtenida en el paso (I),
n. centrifugar la solución del paso (m) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante, o. añadir a la solución obtenida en el paso (n) entre 1 y 2 mi del medio de cultivo del paso (m),
p. filtrar la solución obtenida en el paso (o) a través de una malla de 70 μιτι,
q. centrifugar el filtrado obtenido en el paso (p) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente, y
r. sembrar las células obtenidas tras la centrifugación del paso (q).
1 1 . Célula obtenible mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.
12. Célula según la reivindicación 1 1 que es una célula beta pancreática.
13. Población celular obtenible mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.
14. Población celular según la reivindicación 13 donde las células son beta pancreáticas.
15. Uso de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 ó 12 o de la población celular según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 para la elaboración de un medicamento.
16. Uso de la célula según la reivindicación 1 1 o de la población celular según la reivindicación 13 para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo.
17. Uso de la célula según la reivindicación 12 o de la población celular según la reivindicación 14 para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades del páncreas.
18. Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 17 donde la enfermedad del páncreas es la diabetes mellitus.
19. Kit para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico que comprende un medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
20. Kit según la reivindicación 19 que además comprende células endoteliales inactivadas.
21 . Kit según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 que además comprende todos los elementos necesarios para llevar a cabo un protocolo de digestión con colagenasa según la reivindicación 10.
22. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico.
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