WO2011101445A1 - High-affinity multivalent chelator compounds (mchs) and their use for the structural and functional analysis of target molecules - Google Patents

High-affinity multivalent chelator compounds (mchs) and their use for the structural and functional analysis of target molecules Download PDF

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WO2011101445A1
WO2011101445A1 PCT/EP2011/052451 EP2011052451W WO2011101445A1 WO 2011101445 A1 WO2011101445 A1 WO 2011101445A1 EP 2011052451 W EP2011052451 W EP 2011052451W WO 2011101445 A1 WO2011101445 A1 WO 2011101445A1
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multivalent
coupling
chelator
protein
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Robert TAMPÉ
Christoph Baldauf
Enrica Bordignon
Katrin Schulze
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Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/03—Free radicals

Definitions

  • MCHs multivalent chelator compounds
  • the present invention generally relates to multivalent chelator compounds (MCHs) having three or four nitrilotriacetic acid (NTA) groups as chelator groups and in a first aspect of a free thiol group, and to a process for producing this compound.
  • MCHs multivalent chelator compounds
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • the present invention further includes, as a second preferred aspect, novel molecules in which a stable radical is covalently bonded to the thiol group of the tris-NTA chelator molecule.
  • the present invention further encompasses the uses of the MCHs.
  • cysteine scanning mutagenesis G In magnetic resonance spectroscopy, the method of cysteine scanning mutagenesis G is currently being used to introduce paramagnetic molecules, such as stable radicals. These introduced cysteines are paramagnetically modified with thiol-specific reagents.
  • the principle of cysteine scanning mutagenesis G consists in the successive replacement of native amino acids by cysteine residues, each substitution forming its own mutant. It also follows that if a proof of analysis is to be given in a functional way, the cysteine-free protein is retained in its structure and function as a wild type by the substitution of the native cysteine residues.
  • cysteine-free protein So it has to be upfront It can be shown that the same or at least very similar properties of the cysteine-free protein to the wild type exist (Frillingos et al, FASEB Journal, 1998, 12, 1282).
  • the introduction of single cysteines must ensure the following aspects: Functionality of the mutant and above all accessibility or reactivity of the introduced cysteine with regard to thiol-specific reagents.
  • a quantitative mark can not be ensured, and in addition the paramagnetic properties can be reduced by the environment.
  • Another disadvantage is that thiols can form disulfide bridges with other thiols in the cell, which can significantly reduce the function or the quantitative labeling.
  • IMAC immobilized metal ion affinity chromatography
  • WO 2006/013042 relates to multivalent chelator compounds (MCH's) of the general formula X m -G-CL n (where G is a framework structure comprising a saturated hydrocarbon chain having 2 to 20 carbon atoms, further comprising amide, ester and X is a coupling group for a probe or functional unit F, CL is a chelator group having a metal coordination center, m is an integer and at least 1, and n is an integer and at least 2), processes for their preparation, and their use for modifying and / or immobilizing target molecules bearing an affinity tag that binds to metal-chelator complexes.
  • MCH's multivalent chelator compounds
  • WO 2006/013042 describes, together with DE 2004 038 134 Al, the use of the compounds mentioned there for magnetic resonance spectroscopy, the compounds being unsuitable for the use according to the invention for EPR and the proposed NMR experiments. As shown in Figures 4 and 5, the presence of paramagnetic Ni ions is counterproductive for EPR or corresponding NMR experiments.
  • Tinazli et al. Choemistry - Eur. Jour 2005, 11, 5249 - 5259
  • compounds are described, but these are generally not suitable for the coupling of reporter groups, since they arrange themselves as self-assembling monolayers. Furthermore, the high flexibility of the alkyl group is destructive to biophysical measurement methods.
  • Lee et al. Choemistry - Eur. Jour 2005, 11, 5249 - 5259
  • MCH multivalent chelator compound
  • G is a skeleton structure comprising a saturated hydrocarbon chain having 2 to 20 carbon atoms, furthermore comprising amide, ester and / or ether bonds, with 3 or 4 nitrilotriacetic acid (NTA) - Groups as chelator groups having a metal coordination center
  • Z is a coupling group for X
  • X is a reactive group, optionally together with a reporter group R, and tautomers, isomers, anhydrides de, acids and salts thereof.
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • the framework structures G comprise a saturated hydrocarbon chain having 2 to 25 carbon atoms, preferably 2 to 20 and more preferably 5 to 16 carbon atoms.
  • scaffold structures include amide, ester and / or ether bonds.
  • the framework structure can be linear, branched or closed.
  • a preferred closed framework structure is cyclam-ring structures.
  • Preferred framework structures include amino acid building blocks. It is preferred that the chelator groups be attached to the backbone via amide, ester or ether linkages.
  • the reactive groups of the chelator group carry protecting groups.
  • carboxyl groups such as those of NTA, can be protected by the Ot-Bu group. All customary protective groups known to those skilled in the art can be used.
  • these multivalent chelators can be characterized by linking 3 to 4 (independent) nitrilotriacetic acid (NTA) chelator groups to a molecular scaffold (backbone G) while simultaneously providing a functional group (coupling group Z) for coupling to X.
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • the coupling group Z comprises at least one optionally protected group selected from a thiol group and N 3 for the coupling of X.
  • R indicates the point of attachment for the R reporter group.
  • a multivalent chelator compound of the invention further comprising a reporter group R having at least one stable organic radical, wherein R is covalently bonded to X. Still more preferably, R is selected from
  • the stable organic radical is preferably selected from N "and O", the radical being delocalized between N and O.
  • the radical-bearing skeleton is extended by N-Y, wherein Y represents a derivatization of the oxygen and is selected from the group of derivatizations comprising acetyl (-Ac) or acetoxy (-OAc).
  • the stable organic radical is an anthracene radical.
  • a particularly preferred multivalent chelator compound of the invention has the following formula:
  • the multivalent chelator compounds of the present invention are furthermore preferably characterized in that in each case a metal ion is bonded to the chelator groups.
  • the metal ion is selected from the group consisting of Ni 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ and all lanthanide ions.
  • Preferred targeting molecules include peptides, polypeptides, proteins as well as peptide and protein mimetics and peptide-modified polymers or dendrimers.
  • Protein or polypeptide is also understood to mean a post-translationally modified protein or polypeptide.
  • Peptide and protein mimetics include compounds that contain similar side-chain functionalities as peptides or proteins, but differ in the structure of the backbone from them.
  • backbone mimetics alteration of the backbone atoms (backbone mimetics), the introduction of bicyclic dipeptide analogs, and the arrangement of the functional groups on a non-oligomeric core structure (scaffold mimetics).
  • the backbone mimetics include, for example, the oligo-N-alkylglycines (peptoids), which differ from peptides or proteins at the point of attachment of the side chain (at the N instead of C a ).
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a multivalent chelator compound of the present invention for the labeling / non-covalent functionalization of target molecules for use in magnetic resonance spectroscopy (NMR, EPR).
  • NMR magnetic resonance spectroscopy
  • the compounds of the invention can be used in numerous in vitro and in vivo test methods known in the art.
  • Preferred test methods include spectroscopic methods such as absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer (FRET), fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), reflectometric interference spectroscopy (RlfS), surface fluorescence Plasmon resonance spectroscopy (surface plasmon resonance) / BIACORE, optical grating couplers, quartz microbalance, surface acoustic waves (SAW), x / y fluorescence scanning (fluorlmaging) as well as microscopic methods such as fluorescence microscopy, confocal optical microscopy, total internal Reflection microscopy, contrast-enhanced microscopy, electron microscopy, scanning probe microscopy, but also other methods such as magnetic resonance spectroscopy, microscopy and tomography, impedance spectroscopy, field effect Transistors, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence-activated cell sorting (
  • the affinity tag is a peptide tag comprising 4 to 15 amino acids.
  • the 4 to 15 amino acids may preferably be 4 to 15 histidines.
  • 0 to 4 basic amino acids such as lysine and arginine may be included in the peptide tag.
  • a preferred affinity tag is a (His) n tag, wherein n is an integer from 4 to 15.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the compounds of the invention in the controlled and reversible dimerization or oligomerization of target molecules, in particular proteins, to supramolecular functional units. Further preferred is the use of the compounds according to the invention for the immobilization or purification of target molecules.
  • the compounds of the invention may be used to modify, immobilize, couple, purify, detect, monitor, analyze, or detect target molecules in vitro, in vivo, in situ, in fixed and living cells, or in lipid vesicles.
  • the compounds of the invention may be bound to a surface or incorporated in a lipid monolayer or bilayer.
  • the surface is preferably selected from glass type surfaces such as semimetal oxides, metal oxides and all glass types / glasses, gold, silver, DAPEG modified glass, PEG polymer modified glass or gold, GOPTS silanized glass, glass type or noble metal surfaces with lipid Mono- or bilayer, metal selenides, tellurides and sulfides.
  • a glass surface is to be understood as meaning a glass type surface which, in addition to glass, also comprises quartz, mica, metal oxides, semimetal oxides.
  • a basic idea of the present invention is to make use of the redundancy of the oligohistidine tag in order to increase the stability of the protein chelator by multivalent chelators (MCH). Binding to increase by several orders of magnitude.
  • MCH multivalent chelators
  • the binding of oligohistidine tags to metal-chelator complexes is generally achieved by coordinative bonding of the N atoms of the imidazole residues of the oligohistidine tag to free coordination sites in Ni 2+ , which is complexed by the chelator and thereby partially coordinated.
  • Ni-NTA complexes four of the six coordination sites of Ni 2+ are saturated by NTA, leaving two free coordination sites for the binding of 2 histidine residues.
  • Complex formation therefore requires two steps: (1) the activation of the chelator by binding a metal ion, such as a metal ion. Ni 2+ , and (2) the binding of histidine residues of the oligohistidine tag to the free coordination sites. Addition of free imidazole in excess can abolish the binding of the oligohistidine tag to the Ni (II) chelator complex such that the protein-chelator linkage is reversible and switchable. In addition, removal of Ni 2+ from the chelate complex using EDTA can deactivate the chelator.
  • the binding of the oligohistidine tag to metal chelate complexes via only two histidine residues is relatively unstable.
  • metal chelators are immobilized at high density, multiple histidine residues of the oligohistidine tag can bind to multiple metal chelate moieties simultaneously, resulting in stronger binding.
  • multivalent chelators containing multiple metal chelate units in one molecule stable binding to oligohistidine tags can be achieved at the molecular level.
  • proteins containing an oligohistidine tag can be modified as stably but reversibly and switchably.
  • the object of the invention is achieved by providing a method for producing the compounds of the invention.
  • the method involves the coupling of two tris-NTA-OtBu units via a disulfide bridge and subsequent cleavage of this bridge.
  • the coupling group Z may also be suitably protected.
  • the synthesis of the framework structure G preferably comprises the synthesis of one or more starting compounds, in particular from amino acids, such as lysine, ornithine, 1,3-diamino butyric acid, 1, 2-diaminopropionic acid, glutamate or aspartate and / or their protected derivatives, such as Z-Lys-OtBu, H-Glu (OtBu) -OBzl, Z-Glu-OH.
  • Further preferred starting materials are bromoacetic acid tert-butyl ester, BOC-8-aminocaproic acid and also crocyclic polyamines, such as 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane.
  • a preferred intermediate is N ⁇ , N ⁇ -bis [(tert-butyloxycarbonyl) methyl] -L-lysine tert-butyl ester ("Lys-NTA-OtBu").
  • the preparation process preferably comprises first a synthesis of the framework structure the backbone structure is then coupled to the chelator groups, with the chelator groups being able to carry appropriate protecting groups, with the backbone structure preferably being a cyclic backbone structure, such as a cyclam ring structure.
  • the functionalization group (preferably thiol) is coupled via a short linker to the MCH backbone.
  • the functionalization group is protected in a preferred embodiment via a strategic disulfide.
  • Coupling with further functional groups, such as azides, which are not described in DE 10 2004 038 134 A1, are now also possible due to the introduction of the short linker.
  • the azide group extends the range of sensitive coupling methods to include Staudinger ligation, cycloaddition, and click chemistry relevant in biological systems (see Prescher et al., Nature Chemical Biology 2005, 1, 1).
  • reporter molecules require gentle conditions and precise control of the reaction milieu during coupling to MCHs to preserve the integrity of the molecule.
  • An example of this reporter class are stable radicals, which are highly reactive due to the free electron.
  • the synthesis strategy described in this invention ensures these conditions and thus extends the range of use of MCHs.
  • compounds including primary amine or carbonyl group
  • thio-tris-NTA allows much milder reaction conditions for the coupling process, thus allowing even sensitive molecules (such as magnetic resonance spectroscopy probes) to couple to the MCHs.
  • PROXYL-tris-NTA see the following formula
  • PROXYL-tris-NTA a preferred compound in which a stable organic radical is coupled to thio-tris-NTA.
  • MCH binds to cell surface on recombinant His tagged receptor, after internalization disulfide is cleaved and released the drug.
  • the in vivo derivatization is also particularly advantageous since it opens the possibility MCHs without a time-consuming, costly and possibly reporter-damaging separation of unreactive reactive groups by means of HPLC (high performance liquid chromatography) or size exclusion chromatography to mark.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • MCHs further utilize the poly-histidine sequence for specific, stable, reversible and stoichiometric labeling with reporter groups.
  • a further functionally impairing modification of the intrinsic protein sequence is no longer necessary.
  • Figure 1 A and B shows the strategy for the synthesis of PROXYL-trisNTA (5).
  • FIG. 2 shows the results of analytical size exclusion chromatography.
  • PROXYL trisNTAs stably and reversibly bind (His) 6-labeled maltose binding protein (MBP)
  • Figure 3 shows in EPR that the tricyclic trisNTAs bear the stable radical after purification, that Ni 11 ions interfere with the stable radical, and that Zn 11 ions do not interfere with the stable radical.
  • Figure 4 shows the characterization of Proxyl-trisNTA by means of Continous Wave EPR.
  • A Effect of divalent cations on the EPR signal. Ni 2+ reduces the EPR signal, whereas Zn 2+ does not affect the radical.
  • B Proxyl-trisNTA binds stably and reversibly to His-tagged maltose binding protein.
  • Figure 5 shows the characterization of proxyl trisNTA by pulsed EPR techniques; Distance measurements by means of Proxyl-trisNTA.
  • A Intramolecular Distance Measurement: Maltose binding protein (MalE) was labeled at various positions with the spin probe RI (MTS-Proxyl). By binding of proxyl-trisNTA distances in the presence and absence of substrate (maltose) could be determined.
  • B Intermolecular Distance Measurement: The maltose transporter MALFGK2 was derivatized at position S205 with RI (MTS-Proxyl). The proxyl-trisNTA was pre-incubated stoichiometrically with MalE. Only after MalE binds to MalFGK2 can a distance between the two proteins be determined. Examples
  • Phenol (150 mg, 1.59 mmol) and triisopropylsilane (TIPS, 580 ⁇ , 3.63 mmol) were freshly dissolved in trifluoroacetic acid (5 mL) followed by addition of the protected chelator heads (2. 330 mg). The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. The volatiles were then removed under reduced pressure and the oily mass thus obtained was redissolved in trifluoroacetic acid (5 ml). The product was precipitated with cold diethyl ether, followed by thorough washing with cold diethyl ether (10 x 15 ml).
  • the resulting solid was purified using RP-HPLC (C18 column, Vydac® 218TP, Grace) with a linear gradient of 0-19% acetonitrile in MQ water, each with 0.2% trifluoroacetic acid.
  • the products were characterized by mass spectrometry (Table 1).

Abstract

The present invention relates fundamentally to multivalent chelator compounds (MCHs) having three or four nitrilotriacetic acid (NTA) groups as chelator groups and, in a first aspect, a free thiol group, and also to a process for preparing these compounds. As a second preferred aspect, the present invention further encompasses innovative molecules in which a stable radical is bonded covalently to the thiol group of the tris-NTA chelator molecule. The present invention further encompasses the uses of the MCHs.

Description

Hochaffine multivalente Chelatorverbindungen (MCHs) und deren Verwendung zur Struktur- und Funktionsanalyse von Zielmolekülen  High affinity multivalent chelator compounds (MCHs) and their use for the structural and functional analysis of target molecules
Die vorliegende Erfindung betrifft grundsätzlich multivalente Chelator- Verbindungen (MCHs) mit drei oder vier Nitrilotriessigsäure (NTA)-Gruppen als Chelator-Gruppen und in einem ersten Aspekt einer freien Thiol-Gruppe, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung. Die vorliegende Erfindung umfasst als zweiten bevorzugten Aspekt weiterhin neuartige Moleküle, in denen ein stabiles Radikal kovalent an die Thiol-Gruppe des tris-NTA- Chelatormoleküls gebunden ist. Die vorliegende Erfindung umfasst darüber hinaus die Verwendungen der MCHs. The present invention generally relates to multivalent chelator compounds (MCHs) having three or four nitrilotriacetic acid (NTA) groups as chelator groups and in a first aspect of a free thiol group, and to a process for producing this compound. The present invention further includes, as a second preferred aspect, novel molecules in which a stable radical is covalently bonded to the thiol group of the tris-NTA chelator molecule. The present invention further encompasses the uses of the MCHs.
Eine Funktionalisierung von Proteinen ist regelmäßig erforderlich, wenn man in der Proteinanalytik auf Methoden der magnetischen Resonanzspektroskopie (Nuclear Magnetic Reso- nance, NMR, und Electron Paramagnetic Resonance, EPR) zurückgreifen möchte. Diese Messmethoden erlauben es, wichtige Erkenntnisse zur molekularen Struktur und Dynamik von Proteinen unter physiologischen Bedingungen zu gewinnen, sie verlangen jedoch die ortsspezifische Einführung paramagnetischer Moleküle (wie z.B. stabiler organischer Radikale) in das untersuchte Protein. Functionalization of proteins is regularly required if protein analysis is to be used for methods of magnetic resonance spectroscopy (Nuclear Magnetic Resonance, NMR, and Electron Paramagnetic Resonance, EPR). These measurement methods allow to gain important insights into the molecular structure and dynamics of proteins under physiological conditions, but they require the site-specific introduction of paramagnetic molecules (such as stable organic radicals) into the investigated protein.
Bisher erfolgt diese Funktionalisierung von Proteinen für die magnetische Resonanzspektroskopie hauptsächlich durch kovalente Modifikation der Proteine, die jedoch eine Mutagenese des Proteins voraussetzt und damit nicht nur aufwendig ist, sondern mitunter sogar die Funktionsfähigkeit des mutierten Proteins beeinträchtigt. So far, this functionalization of proteins for magnetic resonance spectroscopy mainly by covalent modification of the proteins, which, however, requires a mutagenesis of the protein and thus not only consuming, but sometimes even impaired the functionality of the mutant protein.
In der magnetischen Resonanzspektroskopie wird derzeit zur Einführung von paramagnetischen Molekülen, wie stabilen Radikalen, die Methode der Cysteine Scanning-MutagenesG angewendet. Diese so eingeführten Cysteine werden mit Thiol-spezifischen Reagzien paramagnetisch modifiziert. Das Prinzip der Cysteine Scanning-MutagenesG besteht in dem sukzessiven Austausch nativer Aminosäuren durch Cysteinreste, wobei jeder Austausch eine eigene Mutante bildet. Daraus folgt weiterhin, dass, wenn ein Untersuchungsnachweis auf funktionelle Art erfolgen soll, das Cystein- freie Protein durch die Substitution der nativen Cysteinreste in seiner Struktur und Funktion als Wildtyp erhalten bleibt. Es muss also im Vorfeld gezeigt werden, dass gleiche oder zumindest sehr ähnliche Eigenschaften des Cy stein- freien Proteins zum Wildtyp bestehen (Frillingos et al, FASEB Journal, 1998, 12, 1282). Neben der Basis einer funktionalen Cystein- freien Mutante muss durch die Einführung von Einzel- Cysteinen folgende Aspekte gewährleistet sein: Funktionalität der Mutante und vor allem Zugänglichkeit bzw. Reaktivität des eingeführten Cysteins hinsichtlich Thiol-spezifischen Reagenzien. Zudem kann eine quantitative Markierung nicht sichergestellt werden, wobei zusätzlich die paramagnetischen Eigenschaften durch das Milieu vermindert werden können. Ein weiterer Nachteil besteht darin das Thiole mit anderen Thiolen in der Zelle Disulfidbrücken ausbilden können, welche wesentlich die Funktion bzw. die quantitative Markierung reduzieren können. In magnetic resonance spectroscopy, the method of cysteine scanning mutagenesis G is currently being used to introduce paramagnetic molecules, such as stable radicals. These introduced cysteines are paramagnetically modified with thiol-specific reagents. The principle of cysteine scanning mutagenesis G consists in the successive replacement of native amino acids by cysteine residues, each substitution forming its own mutant. It also follows that if a proof of analysis is to be given in a functional way, the cysteine-free protein is retained in its structure and function as a wild type by the substitution of the native cysteine residues. So it has to be upfront It can be shown that the same or at least very similar properties of the cysteine-free protein to the wild type exist (Frillingos et al, FASEB Journal, 1998, 12, 1282). In addition to the basis of a functional cysteine-free mutant, the introduction of single cysteines must ensure the following aspects: Functionality of the mutant and above all accessibility or reactivity of the introduced cysteine with regard to thiol-specific reagents. In addition, a quantitative mark can not be ensured, and in addition the paramagnetic properties can be reduced by the environment. Another disadvantage is that thiols can form disulfide bridges with other thiols in the cell, which can significantly reduce the function or the quantitative labeling.
Zur Einstufenreinigung von Proteinen ist die immobilisierte Metallionen- Affinitätschromatographie (IMAC) sehr beliebt (Porath, Protein Expression and Purification, 1992, 3, 263 - 281). Grundvoraussetzung für die Anwendung einer IMAC ist eine zugängliche Poly-Histidinsequenz am Zielprotein. For the one-step purification of proteins, immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) is very popular (Porath, Protein Expression and Purification, 1992, 3, 263-281). The basic requirement for using an IMAC is an accessible poly-histidine sequence on the target protein.
WO 2006/013042 betrifft multivalente Chelator- Verbindungen (MCH's) der allgemeinen Formel Xm-G-CLn (wobei G eine Gerüst- Struktur, umfassend eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 Kohlenstoff- Atomen, weiterhin umfassend Amid-, Ester- und/oder E- therbindungen; X eine Kupplungsgruppe für eine Sonde oder Funktionseinheit F; CL eine Chelator-Gruppe mit einem Metall-Koordinationszentrum; m eine ganze Zahl und mindestens 1 und n eine ganze Zahl und mindestens 2 ist), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für die Modifizierung und/oder Immobilisierung von Zielmolekülen, die einen Affi- nitäts-Tag tragen, der an Metall-Chelator-Komplexe bindet. WO 2006/013042 beschreibt zusammen mit DE 2004 038 134 AI die Verwendung der dort genannten Verbindungen für die Magnetresonanz-Spektroskopie, wobei die Verbindungen für die erfindungsgemäße Anwendung für EPR- und die vorgesehenen NMR-Experimente ungeeignet sind. Wie in Figuren 4 und 5 gezeigt, ist die Anwesenheit der paramagnetischen Ni-Ionen kontraproduktiv für EPR- oder entsprechende NMR-Experimente. WO 2006/013042 relates to multivalent chelator compounds (MCH's) of the general formula X m -G-CL n (where G is a framework structure comprising a saturated hydrocarbon chain having 2 to 20 carbon atoms, further comprising amide, ester and X is a coupling group for a probe or functional unit F, CL is a chelator group having a metal coordination center, m is an integer and at least 1, and n is an integer and at least 2), processes for their preparation, and their use for modifying and / or immobilizing target molecules bearing an affinity tag that binds to metal-chelator complexes. WO 2006/013042 describes, together with DE 2004 038 134 Al, the use of the compounds mentioned there for magnetic resonance spectroscopy, the compounds being unsuitable for the use according to the invention for EPR and the proposed NMR experiments. As shown in Figures 4 and 5, the presence of paramagnetic Ni ions is counterproductive for EPR or corresponding NMR experiments.
In Tinazli et al. (Chemistry - Eur. Jour. 2005, 11, 5249 - 5259) werden Verbindungen beschrieben, diese sind jedoch im Allgemeinen nicht für die Kopplung von Reportergruppen verwendbar, da sie sich u.a. als selbst-assemblierende Monolayers anordnen. Des Weiteren ist die hohe Flexibilität der Alkylgruppe destruktiv für biophysikalische Meßmethoden. Lee et al. (in Lee HS, Contarino M, Umashankara M, Schön A, Freire E, Smith AB 3rd, Chaiken IM, Penn LS. Use of the quartz crystal microbalance to monitor ligand-induced con- formational rearrangements in HIV-1 envelope protein gp l20. Anal Bioanal Chem. 2010 Feb;396(3): 1143-52. Epub 2009 Dec 17) beschreiben die Immobilisierung des PolyHis- markierten Proteins gpl20 an ein QCM-D mit Hilfe von NTA, welches über einen Linker an die Gold-beschichtete Oberfläche gekoppelt wird. Dabei wird NTA als monovalenter Chelator verwendet, die Verwendung von 3 oder 4 NTA's ist hier nicht erforderlich und ist auch nicht nahe gelegt. Der verwendete Linker enthält zwar eine Thiol-Gruppe, allerdings ist der Linker deutlich länger als in der vorliegenden Erfindung, so dass dieser für die vorliegende Erfindung nicht geeignet ist. Eine Veränderung oder Verkürzung des Linkers ist nicht vorgesehen oder nahe gelegt. In Tinazli et al. (Chemistry - Eur. Jour 2005, 11, 5249 - 5259) compounds are described, but these are generally not suitable for the coupling of reporter groups, since they arrange themselves as self-assembling monolayers. Furthermore, the high flexibility of the alkyl group is destructive to biophysical measurement methods. Lee et al. (in Lee HS, Contarino M, Umashankara M, Schön A, Freire E, Smith AB 3rd, Chaiken IM, Penn LS.) Use of the quartz crystal microbalance to monitor ligand-induced con- formational rearrangements in HIV-1 envelope protein gp l20 Anal Bioanal Chem., 2010 Feb; 396 (3): 1143-52, Epub 2009 Dec 17) describe the immobilization of the polyHis-tagged gpl20 protein to a QCM-D by NTA, which has a gold-coated linker Surface is coupled. It is NTA used as a monovalent chelator, the use of 3 or 4 NTA's is not required here and is not suggested. Although the linker used contains a thiol group, the linker is significantly longer than in the present invention, so that it is not suitable for the present invention. A change or shortening of the linker is not intended or suggested.
Eine ideale Lösung für die obigen Probleme wäre die nicht-kovalente Funktionalisierung von Proteinen mit Hilfe von MCHs. Dafür wäre eine Derivatisierung von MCH-Molekülen mit stabilen organischen Radikalen nötig. Das war bisher jedoch nicht möglich, da die empfindlichen Radikale den harschen Reaktionsbedingungen der Kopplungsreaktion an die freie Ami- nogruppe des MCH-Moleküls nicht standhalten können. An ideal solution to the above problems would be the non-covalent functionalization of proteins using MCHs. This would require derivatization of MCH molecules with stable organic radicals. However, this was not possible until now because the sensitive radicals can not withstand the harsh reaction conditions of the coupling reaction to the free amino group of the MCH molecule.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige MCH- Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die die obigen Probleme lösen. Weiterhin werden neue und verbesserte Synthesestrategien für diese MCHs zur Verfügung gestellt. It is therefore an object of the present invention to provide novel MCH compounds which solve the above problems. Furthermore, new and improved synthetic strategies for these MCHs are provided.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch eine multivalente Chelator- Verbindung (MCH) der allgemeinen Formel In a first aspect of the present invention, this object is achieved by a multivalent chelator compound (MCH) of the general formula
G - Z - X gelöst, worin G eine Gerüst- Struktur ist, umfassend eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 Kohlenstoff- Atomen, weiterhin umfassend Amid-, Ester- und/oder Etherbindun- gen, mit 3 oder 4 Nitrilotriessigsäure (NTA)-Gruppen als Chelator-Gruppen mit einem Metall-Koordinationszentrum, Z eine Kopplungsgruppe für X ist, und X eine Reaktivgruppe, gegebenenfalls zusammen mit einer Reportergruppe R ist, und Tautomere, Isomere, Anhydri- de, Säuren und Salze davon. Die genannten Bausteine von R und X sind im Sinne der Erfindung beliebig kombinierbar. G - Z - X in which G is a skeleton structure comprising a saturated hydrocarbon chain having 2 to 20 carbon atoms, furthermore comprising amide, ester and / or ether bonds, with 3 or 4 nitrilotriacetic acid (NTA) - Groups as chelator groups having a metal coordination center, Z is a coupling group for X, and X is a reactive group, optionally together with a reporter group R, and tautomers, isomers, anhydrides de, acids and salts thereof. The said components of R and X are arbitrarily combinable within the meaning of the invention.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Gerüst-Strukturen G eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 25 Kohlenstoff- Atomen, bevorzugt 2 bis 20 und weiter bevorzugt 5 bis 16 Kohlenstoff- Atomen. Weiterhin umfassen Gerüst- Strukturen Amid-, Esterund/oder Etherbindungen. Die Gerüst- Struktur kann linear, verzweigt oder geschlossen sein. Bei einer bevorzugten geschlossenen Gerüst-Struktur handelt es sich um Cyclam-Ring- Strukturen. Bevorzugte Gerüst- Strukturen umfassen Aminosäure-Bausteine. Es wird bevorzugt, dass die Chelator-Gruppen über Amid-, Ester- oder Etherbindungen an die Gerüst- Struktur gebunden sind. In a preferred embodiment, the framework structures G comprise a saturated hydrocarbon chain having 2 to 25 carbon atoms, preferably 2 to 20 and more preferably 5 to 16 carbon atoms. Furthermore, scaffold structures include amide, ester and / or ether bonds. The framework structure can be linear, branched or closed. A preferred closed framework structure is cyclam-ring structures. Preferred framework structures include amino acid building blocks. It is preferred that the chelator groups be attached to the backbone via amide, ester or ether linkages.
In einer bevorzugten Ausführungsform tragen die reaktiven Gruppen der Chelator-Gruppe Schutzgruppen. Beispielsweise können Carboxyl-Gruppen, wie die von NTA, durch die Ot- Bu-Gruppe geschützt werden. Es können alle üblichen, dem Fachmann bekannten Schutzgruppen verwendet werden. In a preferred embodiment, the reactive groups of the chelator group carry protecting groups. For example, carboxyl groups, such as those of NTA, can be protected by the Ot-Bu group. All customary protective groups known to those skilled in the art can be used.
Allgemein lassen sich diese multivalenten Chelatoren dadurch charakterisieren, dass 3 bis 4 (unabhängige) Nitrilotriessigsäure (NTA) Chelator-Gruppen an ein molekulares Scaffold (Gerüst G) geknüpft werden, während gleichzeitig eine funktionelle Gruppe (Kupplungsgruppe Z) für die Kupplung an X bereitgestellt wird. Bevorzugt ist weiter eine multivalente Chelator- Verbindung der Erfindung, wobei die Kopplungsgruppe Z mindestens eine gegebenenfalls geschützte Gruppe ausgewählt aus einer Thiolgruppe und N3 zur Kopplung von X umfasst. Weiter bevorzugt ist eine multivalente Chelator-Verbindung der Erfindung, wobei Z ausgewählt ist aus In general, these multivalent chelators can be characterized by linking 3 to 4 (independent) nitrilotriacetic acid (NTA) chelator groups to a molecular scaffold (backbone G) while simultaneously providing a functional group (coupling group Z) for coupling to X. , Preference is further given to a multivalent chelator compound of the invention, wherein the coupling group Z comprises at least one optionally protected group selected from a thiol group and N 3 for the coupling of X. More preferably, a multivalent chelator compound of the invention wherein Z is selected from
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mit n je nach Reaktionstyp, mit n = 1 für Staudinger Ligation und n = 3 für [3+2] Cycloaddition. Weiter bevorzugt ist eine multivalente Chelator-Verbindung der Erfindung, worin X ausgewählt ist aus Maleimid-, Haloacetylderivaten-, Pyridyldisulfid-, Alkythiosulfonat-, Tria- rylphosphin-, Alkin- und cyklischen Alkingruppen, und insbesondere den folgenden Gruppen
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with n depending on the reaction type, with n = 1 for Staudinger ligation and n = 3 for [3 + 2] cycloaddition. More preferred is a multivalent chelator compound of the invention wherein X is selected from maleimide, haloacetyl derivative, pyridyl disulfide, alkythiosulfonate, triarylphosphine, alkyne and cyclic alkyne groups, and especially the following groups
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worin R die Anknüpfungsstelle für die Reportergruppe R anzeigt.  where R indicates the point of attachment for the R reporter group.
Weiter bevorzugt ist eine multivalente Chelator-Verbindung der Erfindung, weiter umfassend eine Reportergruppe R mit mindestens einem stabilen organischem Radikal, wobei R kovalent an X gebunden ist. Noch weiter bevorzugt ist R ausgewählt aus More preferred is a multivalent chelator compound of the invention, further comprising a reporter group R having at least one stable organic radical, wherein R is covalently bonded to X. Still more preferably, R is selected from
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Das stabile organische Radikal ist bevorzugt ausgewählt aus N" und O", wobei das Radikal zwischen N und O delokalisiert ist. The stable organic radical is preferably selected from N "and O", the radical being delocalized between N and O.
Zudem ist bevorzugt, dass das radikal-tragende Grundgerüst um N-Y erweitert ist, wobei Y eine Derivatisierung des Sauerstoffs darstellt und ausgesucht wird aus der Gruppe von Deri- vatisierungen umfassend Acetyl (-Ac) oder Acetoxy (-OAc). In addition, it is preferred that the radical-bearing skeleton is extended by N-Y, wherein Y represents a derivatization of the oxygen and is selected from the group of derivatizations comprising acetyl (-Ac) or acetoxy (-OAc).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem stabilen organischen Radikal um ein Anthracen-Radikal. In another preferred embodiment, the stable organic radical is an anthracene radical.
Eine besonders bevorzugte multivalente Chelator- Verbindung der Erfindung weist die folgende Formel auf: A particularly preferred multivalent chelator compound of the invention has the following formula:
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Die multivalente Chelator- Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind weiterhin bevorzugt dadurch gekennzeichnet dass jeweils ein Metallion an den Chelator-Gruppen gebunden ist. Bevorzugt ist das Metallion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ und allen Lanthanidionen.
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The multivalent chelator compounds of the present invention are furthermore preferably characterized in that in each case a metal ion is bonded to the chelator groups. Preferably, the metal ion is selected from the group consisting of Ni 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ and all lanthanide ions.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer multivalenten Chelator- Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Kopplung von organischen Radikalen an Zielmoleküle. Bevorzugte Zielmoleküle umfassen Peptide, Polypeptide, Proteine sowie Peptid- und Protein-Mimetika und peptidmodifizierte Polymere oder Dendrimere. Dabei wird unter Protein oder Polypeptid auch ein post-translational modifiziertes Protein bzw. Polypeptid verstanden. Peptid- und Protein-Mimetika umfassen Verbindungen, die ähnliche Seitenketten-Funktionalitäten wie Peptide bzw. Proteine enthalten, sich aber im Aufbau des Rückgrates von ihnen unterscheiden. Mögliche Variationen des Rückgrates umfassen eine Veränderung der Rückgrat-Atome (Rückgrat-Mimetika), die Einführung bicyclischer Dipeptid- Analoga und die Anordnung der funktionellen Gruppen an einer nicht-oligomeren Kernstruktur (Gerüst-Mimetika). Zu den Rückgrat-Mimetika gehören beispielsweise die Oligo-N- alkylglycine (Peptoide), die sich von Peptiden bzw. Proteinen im Anknüpfungspunkt der Seitenkette unterscheiden (am N anstatt Ca). Another aspect of the present invention relates to the use of a multivalent chelator compound of the present invention for coupling organic radicals to target molecules. Preferred targeting molecules include peptides, polypeptides, proteins as well as peptide and protein mimetics and peptide-modified polymers or dendrimers. Protein or polypeptide is also understood to mean a post-translationally modified protein or polypeptide. Peptide and protein mimetics include compounds that contain similar side-chain functionalities as peptides or proteins, but differ in the structure of the backbone from them. Possible variations of the backbone include alteration of the backbone atoms (backbone mimetics), the introduction of bicyclic dipeptide analogs, and the arrangement of the functional groups on a non-oligomeric core structure (scaffold mimetics). The backbone mimetics include, for example, the oligo-N-alkylglycines (peptoids), which differ from peptides or proteins at the point of attachment of the side chain (at the N instead of C a ).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer multivalenten Chelator- Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Markierung/nicht-kovalenten Funktio- nalisierung von Zielmolekülen zur Anwendung in der magnetischen Resonanzspektroskopie (NMR, EPR). Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in zahlreichen in vitro und in vivo Testmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, angewendet werden. Bevorzugte Testmethoden umfassen spektroskopische Methoden wie Absorptionsspektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET), Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie (FCS), Fluoreszenz-Bleichen (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP), reflektometrische Interferenz-Spektroskopie (RlfS), Oberflächen-Plasmon-Resonanz- Spektroskopie (surface plasmon resonance)/BIACORE, optische Gitterkoppler, Quarz- Mikrowaage, Surface Accoustic Waves (SAW), x/y-Fluoreszenz-Scanning (Fluorlmaging) sowie mikroskopische Methoden wie Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale optische Mikroskopie, Totalinterne Reflexions-Mikroskopie, kontrastverstärkende Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, Rastersondenmikroskopie, aber auch andere Methoden wie Magnetresonanz-Spektroskopie, -Mikroskopie und -Tomographie, Impedanz-Spektroskopie, Feldeffekt- Transistoren, Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay (ELISA), Fluoreszenz-aktiviertes Zelloder Partikel-Sortieren (FACS), Radioimmunoassay (RIA), Autoradiographie, analytische Gelfiltration, stopped-fiow Technik, Kalorimetrie, Hochdurchsatz- Verfahren (high throughput Screening, HTS), Array- und Chip-Technologien, wie Protein- Arrays. A further aspect of the present invention relates to the use of a multivalent chelator compound of the present invention for the labeling / non-covalent functionalization of target molecules for use in magnetic resonance spectroscopy (NMR, EPR). The compounds of the invention can be used in numerous in vitro and in vivo test methods known in the art. Preferred test methods include spectroscopic methods such as absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer (FRET), fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), reflectometric interference spectroscopy (RlfS), surface fluorescence Plasmon resonance spectroscopy (surface plasmon resonance) / BIACORE, optical grating couplers, quartz microbalance, surface acoustic waves (SAW), x / y fluorescence scanning (fluorlmaging) as well as microscopic methods such as fluorescence microscopy, confocal optical microscopy, total internal Reflection microscopy, contrast-enhanced microscopy, electron microscopy, scanning probe microscopy, but also other methods such as magnetic resonance spectroscopy, microscopy and tomography, impedance spectroscopy, field effect Transistors, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence-activated cell sorting (FACS), radioimmunoassay (RIA), autoradiography, analytical gel filtration, stopped-fiow technique, calorimetry, high throughput screening (HTS), Array and chip technologies, such as protein arrays.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Bindung an einen Affinitäts-Tag an einem Zielmolekül gelöst, wobei der Affinitäts-Tag an Metall-Chelatoren-Komplexe bindet. Bevorzugterweise handelt es sich bei dem Affinitäts-Tag um einen Peptid-Tag, der 4 bis 15 Aminosäuren umfasst. Bei den 4 bis 15 Aminosäuren kann es sich bevorzugterweise um 4 bis 15 Histidine handeln. Außerdem können 0 bis 4 basische Aminosäuren, wie Lysin und Arginin, im Peptid-Tag enthalten sein. Ein bevorzugter Affinitäts-Tag ist ein (His)n-Tag, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 15 ist. Another aspect of the present invention relates to the use of the compounds of the invention for attachment to an affinity tag dissolved on a target molecule, wherein the affinity tag binds to metal-chelator complexes. Preferably, the affinity tag is a peptide tag comprising 4 to 15 amino acids. The 4 to 15 amino acids may preferably be 4 to 15 histidines. In addition, 0 to 4 basic amino acids such as lysine and arginine may be included in the peptide tag. A preferred affinity tag is a (His) n tag, wherein n is an integer from 4 to 15.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der kontrollierten und reversiblen Dimerisierung oder Oligomerisie- rung von Zielmolekülen, insbesondere Proteinen, zu supramolekularen Funktionseinheiten. Weiterhin bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Immobilisierung oder Reinigung von Zielmolekülen. Another aspect of the present invention relates to the use of the compounds of the invention in the controlled and reversible dimerization or oligomerization of target molecules, in particular proteins, to supramolecular functional units. Further preferred is the use of the compounds according to the invention for the immobilization or purification of target molecules.
Bevorzugterweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Modifizierung, Immobilisierung, Kopplung, Reinigung, Detektion, Beobachtung, Analyse oder zum Nachweis von Zielmolekülen in vitro, in vivo, in situ, in fixierten und lebenden Zellen oder in Lipidvesikeln verwendet werden. Dazu können die Verbindungen der Erfindung auf einer Oberfläche gebunden oder in einer Lipid-Mono- oder Doppelschicht eingefügt sind. Dabei ist die Oberfläche bevorzugterweise ausgewählt aus Glastyp-Oberflächen, wie Halbmetalloxiden, Metalloxiden und allen Glastypen/Gläsern, Gold, Silber, DAPEG-modifiziertem Glas, PEG- Polymer-modifiziertem Glas oder Gold, GOPTS-silanisiertem Glas, Glastyp oder Edelmetalloberflächen mit Lipid-Mono- oder Doppelschicht, Metall-Seleniden, -Telluriden und - Sulfiden. Unter einer Glas-Oberfläche soll eine Glastyp-Oberfläche verstanden werden, die neben Glas auch Quarz, Glimmer, Metalloxide, Halbmetalloxide umfasst. Preferably, the compounds of the invention may be used to modify, immobilize, couple, purify, detect, monitor, analyze, or detect target molecules in vitro, in vivo, in situ, in fixed and living cells, or in lipid vesicles. To this end, the compounds of the invention may be bound to a surface or incorporated in a lipid monolayer or bilayer. The surface is preferably selected from glass type surfaces such as semimetal oxides, metal oxides and all glass types / glasses, gold, silver, DAPEG modified glass, PEG polymer modified glass or gold, GOPTS silanized glass, glass type or noble metal surfaces with lipid Mono- or bilayer, metal selenides, tellurides and sulfides. A glass surface is to be understood as meaning a glass type surface which, in addition to glass, also comprises quartz, mica, metal oxides, semimetal oxides.
Eine grundlegende Idee der vorliegenden Erfindung ist es, die Redundanz des Oligohistidin- Tags zu nutzen, um durch multivalente Chelatoren (MCH) die Stabilität der Protein-Chelator- Bindung um mehrere Größenordnungen zu steigern. Die Bindung von Oligohistidin-Tags an Metall-Chelator-Komplexe erfolgt allgemein über eine koordinative Bindung der N- Atome der Imidazol-Reste des Oligohistidin-tags an freie Koordinationsstellen im Ni2+, das vom Chelator komplexiert und dadurch teilweise koordinativ abgesättigt ist. Im Fall von Ni-NTA- Komplexen sind vier der insgesamt sechs Koordinationsstellen des Ni2+ durch NTA abgesättigt, so dass zwei freie Koordinationsstellen für die Bindung von 2 Histidin-Resten verbleiben. Die Komplexbildung erfordert damit zwei Schritte: (1) die Aktivierung des Chelators durch Bindung eines Metallions, wie z. B. Ni2+, und (2) die Bindung von Histidin-Resten des Oligohistidin-Tags an die freien Koordinationsstellen. Durch Zugabe von freiem Imidazol im Überschuß kann die Bindung des Oligohistidin-Tags an den Ni(II)-Chelator-Komplex aufgehoben werden, so dass die Protein-Chelator Bindung reversibel und schaltbar ist. Außerdem kann durch Entfernen des Ni2+ aus dem Chelat-Komplex mithilfe von EDTA der Chelator deaktiviert werden. A basic idea of the present invention is to make use of the redundancy of the oligohistidine tag in order to increase the stability of the protein chelator by multivalent chelators (MCH). Binding to increase by several orders of magnitude. The binding of oligohistidine tags to metal-chelator complexes is generally achieved by coordinative bonding of the N atoms of the imidazole residues of the oligohistidine tag to free coordination sites in Ni 2+ , which is complexed by the chelator and thereby partially coordinated. In the case of Ni-NTA complexes, four of the six coordination sites of Ni 2+ are saturated by NTA, leaving two free coordination sites for the binding of 2 histidine residues. Complex formation therefore requires two steps: (1) the activation of the chelator by binding a metal ion, such as a metal ion. Ni 2+ , and (2) the binding of histidine residues of the oligohistidine tag to the free coordination sites. Addition of free imidazole in excess can abolish the binding of the oligohistidine tag to the Ni (II) chelator complex such that the protein-chelator linkage is reversible and switchable. In addition, removal of Ni 2+ from the chelate complex using EDTA can deactivate the chelator.
Die Bindung des Oligohistidin-Tags an Metallchelat-Komplexe über lediglich zwei Histidin- Reste ist relativ instabil. Werden Metallchelatoren in hoher Dichte immobilisiert, so können mehrere Histidin-Reste des Oligohistidin-Tags an mehrere Metall-Chelat-Einheiten gleichzeitig binden, was in einer stärkeren Bindung resultiert. Durch die Verwendung multivalenter Chelatoren, die mehrere Metall-Chelat-Einheiten in einem Moleküle enthalten, kann eine stabile Bindung an Oligohistidin-Tags auf molekularer Ebene erzielt werden. Durch Kopplung weiterer Funktionseinheiten an den Chelator können Proteine, die einen Oligohistidin-Tag enthalten, so stabil, jedoch reversibel und schaltbar modifiziert werden. The binding of the oligohistidine tag to metal chelate complexes via only two histidine residues is relatively unstable. When metal chelators are immobilized at high density, multiple histidine residues of the oligohistidine tag can bind to multiple metal chelate moieties simultaneously, resulting in stronger binding. By using multivalent chelators containing multiple metal chelate units in one molecule, stable binding to oligohistidine tags can be achieved at the molecular level. By coupling additional functional units to the chelator, proteins containing an oligohistidine tag can be modified as stably but reversibly and switchably.
Weiterhin wird die Aufgabe der Erfindung durch das zur Verfügung Stellen eines Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen gelöst. Das Verfahren umfasst die Kopplung von zwei tris-NTA-OtBu Einheiten über eine Disulfidbrücke und anschließende Spaltung dieser Brücke. Während des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kupplungsgruppe Z auch geeignet geschützt sein. Furthermore, the object of the invention is achieved by providing a method for producing the compounds of the invention. The method involves the coupling of two tris-NTA-OtBu units via a disulfide bridge and subsequent cleavage of this bridge. During the process according to the invention, the coupling group Z may also be suitably protected.
Die Synthese der Gerüst- Struktur G umfasst bevorzugt die Synthese aus einer oder mehreren Ausgangsverbindungen, insbesondere aus Aminosäuren, wie beispielsweise Lysin, Ornithin, 1,3-Diamino buttersäure, 1 ,2-Diaminopropionsäure, Glutamat oder Aspartat und/oder deren geschützten Derivaten, wie Z-Lys-OtBu, H-Glu(OtBu)-OBzl, Z-Glu-OH. Weitere bevorzugte Ausgangsstoffe sind Bromessigsäure-tert-Butylester, BOC-8-Aminocapronsäure sowie ma- krocyclische Polyamine, wie 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan. Ein bevorzugtes Intermediat ist Nα, Nα-Bis[(tert-butyloxycarbonyl)methyl]-L-Lysin-tert-Butylester („Lys-NTA-OtBu"). Das Herstellungsverfahren umfasst bevorzugterweise zunächst eine Synthese der Gerüst- Struktur. An die Gerüst- Struktur werden dann die Chelator-Gruppen gekuppelt. Dabei können die Chelator-Gruppen geeignete Schutzgruppen tragen. Dabei ist die Gerüst-Struktur bevorzugterweise eine cyclische Gerüst- Struktur, wie eine Cyclam-Ring-Struktur. The synthesis of the framework structure G preferably comprises the synthesis of one or more starting compounds, in particular from amino acids, such as lysine, ornithine, 1,3-diamino butyric acid, 1, 2-diaminopropionic acid, glutamate or aspartate and / or their protected derivatives, such as Z-Lys-OtBu, H-Glu (OtBu) -OBzl, Z-Glu-OH. Further preferred starting materials are bromoacetic acid tert-butyl ester, BOC-8-aminocaproic acid and also crocyclic polyamines, such as 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane. A preferred intermediate is N α , N α -bis [(tert-butyloxycarbonyl) methyl] -L-lysine tert-butyl ester ("Lys-NTA-OtBu"). The preparation process preferably comprises first a synthesis of the framework structure the backbone structure is then coupled to the chelator groups, with the chelator groups being able to carry appropriate protecting groups, with the backbone structure preferably being a cyclic backbone structure, such as a cyclam ring structure.
Bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei die Kopplung durch Umsetzung mit der Substanz Preferred is a process for the preparation of the compounds according to the invention, wherein the coupling by reaction with the substance
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erfolgt. Weiter bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, umfassend ein Verfahren wie oben und anschließende Kopplung der Reportergruppe R wie oben umfassend mindestens ein stabiles organisches Radikal wie oben, wobei R kova- lent an X gebunden ist. he follows. Further preferred is a process for preparing the compounds of the invention comprising a process as above and subsequent coupling of the reporter group R as above comprising at least one stable organic radical as above, wherein R is covalently bonded to X.
In dieser Erfindung wird die Funktionalisierungsgruppe (bevorzugt Thiol) über einen kurzen Linker an das MCH-Grundgerüst gekoppelt. Die Funktionalisierungsgruppe wird dabei in einer bevorzugten Ausführungsform über ein strategisches Disulfid geschützt. Durch die Einführung des kurzen Linkers sind nun auch Kopplungen mit weiteren funktionellen Gruppen, wie Aziden möglich, die nicht in DE 10 2004 038 134 AI beschrieben sind. Die Azidgruppe erweitert das Spektrum von sensitiven Kopp lungs verfahren um die Staudinger Ligation, die Cycloaddition und die in biologischen Systemen relevante Klick Chemie (vergl. Prescher et al. Nature Chemical Biology 2005, 1, 1). In this invention, the functionalization group (preferably thiol) is coupled via a short linker to the MCH backbone. The functionalization group is protected in a preferred embodiment via a strategic disulfide. Coupling with further functional groups, such as azides, which are not described in DE 10 2004 038 134 A1, are now also possible due to the introduction of the short linker. The azide group extends the range of sensitive coupling methods to include Staudinger ligation, cycloaddition, and click chemistry relevant in biological systems (see Prescher et al., Nature Chemical Biology 2005, 1, 1).
Eine Vielzahl von Reportermolekülen erfordern sanfte Bedingungen und eine exakte Kontrolle des Reaktionsmilieus während der Kopplung an MCHs, um die Integrität des Moleküls zu erhalten. Ein Beispiel für diese Reporterklasse sind stabile Radikale, welche aufgrund des freien Elektrons hochreaktiv sind. Die in dieser Erfindung beschriebene Synthesestrategie gewährleistet diese Bedingungen und erweitert somit das Einsatzspektrum von MCHs. Die in der Publikation von Lata et al. (JACS, 2005, 127, 10205 - 10215) beschriebenen Verbindungen (u.a. primäre Amin- bzw- Carbonylgruppe) eignen sich aufgrund der Reaktionsbedingungen nicht für diese Art von Kopplungen. A variety of reporter molecules require gentle conditions and precise control of the reaction milieu during coupling to MCHs to preserve the integrity of the molecule. An example of this reporter class are stable radicals, which are highly reactive due to the free electron. The synthesis strategy described in this invention ensures these conditions and thus extends the range of use of MCHs. In the publication by Lata et al. (JACS, 2005, 127, 10205-10215) described compounds (including primary amine or carbonyl group) are not suitable for this type of couplings due to the reaction conditions.
Das Patent DE 10 2004 038 134 AI zeigt die Möglichkeit auf, MCHs u.a. mit Thiol-, Malei- mid- und Haloacteamidgruppen zu funktionalisieren. Jedoch sind die vorgeschlagenen Verbindungen bzw. Reaktionen synthetisch nicht zu realisieren, da zum einem die erforderlichen Kopplungsedukte kommerziell nicht erhältlich sind und zum anderen die Bedingungen der Kopplungsreaktion schädigend für die Funktionalisierungsgruppe (z.B. Maleimidgruppe) sind. The patent DE 10 2004 038 134 AI shows the possibility to MCHs u.a. to functionalize with thiol, maleimide and Haloacteamidgruppen. However, the proposed compounds or reactions are not synthetically feasible because, on the one hand, the required coupling materials are not commercially available and, on the other hand, the conditions of the coupling reaction are detrimental to the functionalizing group (e.g., maleimide group).
Den Erfindern ist es nun erstmals gelungen, neuartige MCHs zu synthetisieren, die eine freie Thiol-Gruppe enthalten. Eine solche Verbindung, Thio-tris-NTA, gestattet wesentlich mildere Reaktionsbedingungen für das Kopplungsverfahren und erlaubt somit, auch empfindliche Moleküle (wie Sonden für die magnetische Resonanzspektroskopie) an die MCHs zu koppeln. Ausgehend von dieser Verbindung haben die Erfinder darüber hinaus PROXYL-tris-NTA synthetisiert (siehe folgende Formel), eine bevorzugte Verbindung, in der ein stabiles organisches Radikal an Thio-tris-NTA gekoppelt ist. The inventors have now succeeded for the first time to synthesize novel MCHs containing a free thiol group. Such a compound, thio-tris-NTA, allows much milder reaction conditions for the coupling process, thus allowing even sensitive molecules (such as magnetic resonance spectroscopy probes) to couple to the MCHs. Based on this compound, the inventors have further synthesized PROXYL-tris-NTA (see the following formula), a preferred compound in which a stable organic radical is coupled to thio-tris-NTA.
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Diese neuartige Synthesestrategie ermöglicht nun den Einsatz vom milden Kopplungen zur Funktionalisierung von MCHs mit sensiblen Reportergruppen wie stabilen Radikalen. Somit können nicht-paramagnetische Proteine über endogene Poly-Histidin-Sequenzen spezifisch, stöchiometrisch und reversibel mit einer paramagnetischen Reportergruppe konjugiert werden. Dieses Molekül ist das erste beschriebene Molekül der bioorthogonalen-chemischen Reporterklasse, die Einzug in die magnetische Resonanzspektroskopie findet. Neben der Konjugation mit sensiblen Reportergruppen sind folgende Einsatzgebiete in Betracht zu ziehen: This novel synthetic strategy now allows the use of mild couplings to functionalize MCHs with sensitive reporter groups such as stable radicals. Thus, non-paramagnetic proteins can be specifically, stoichiometrically and reversibly conjugated to a paramagnetic reporter group via endogenous poly-histidine sequences. This molecule is the first described molecule of the bioorthogonal-chemical reporter class, which finds its way into magnetic resonance spectroscopy. In addition to the conjugation with sensitive reporter groups, the following fields of application should be considered:
a) Reversible Kopplungen: a) Reversible couplings:
Kopplung von Wirkstoffen: MCH bindet auf Zelloberfläche an rekombinanten His- tagged Rezeptor, nach Internalisierung wird Disulfid gespalten und der Wirkstoff freigesetzt.  Coupling of drugs: MCH binds to cell surface on recombinant His tagged receptor, after internalization disulfide is cleaved and released the drug.
Protein-Proteininteraktionsstudien über oxidative Quervernetzung oder Verwendung von bifunktionalen Quervernetzern.  Protein-protein interaction studies on oxidative cross-linking or use of bifunctional cross-linkers.
Protein-Nukleinsäureinteraktionsstudien mittels heterofunktionalen Quernetzern. b) Die Funktionalisierung von MCHs mit reaktiven Azidgruppen ermöglicht in vivo Markierungen. Azide erlauben dabei insbesondere eine in vivo Derivatisierung mit maximaler Effizienz und Chemoselektivität. Die Reaktion zwischen der Kopplungsgruppe Azid und der Reaktivgruppe, z.B. einem Alkin-Derivat, ist synthetischen Ursprungs und wird somit von intrinsischen Reaktivgruppen innerhalb einer Zelle nicht beeinflusst. Dadurch wird eine quantitative Umsetzung des Eduktes in vivo garantiert. Azide sind daher erfindungsgemäß bevorzugt.  Protein-nucleic acid interaction studies using heterofunctional crosslinkers. b) The functionalization of MCHs with reactive azide groups allows in vivo labeling. In particular, azides allow in vivo derivatization with maximum efficiency and chemoselectivity. The reaction between the coupling group azide and the reactive group, e.g. an alkyne derivative is of synthetic origin and thus unaffected by intrinsic reactive groups within a cell. This guarantees a quantitative conversion of the educt in vivo. Azides are therefore preferred according to the invention.
Die in vivo Derivatisierung ist zudem besonders vorteilhaft, da sie die Möglichkeit eröffnet MCHs ohne eine zeitaufwändige, kostenträchtige und evtl. Reportergruppen-schädigende Abtrennung der nicht reagierenden Reaktivgruppen mittels HPLC (high Performance liquid chromatography) oder Größenausschlußchromatographie zu markieren. The in vivo derivatization is also particularly advantageous since it opens the possibility MCHs without a time-consuming, costly and possibly reporter-damaging separation of unreactive reactive groups by means of HPLC (high performance liquid chromatography) or size exclusion chromatography to mark.
MCHs nutzen weiter die Po ly-Histidin- Sequenz für die spezifische, stabile, reversible und stöchiometrische Markierung mit Reportergruppen. Somit ist eine weitere funktions- beeinträchtigende Modifikation der intrinsischen Proteinsequenz nicht mehr nötig. Am Zielprotein sind somit ohne weitere Modifikations- bzw. Reinigungsmethoden folgende Anwendungen möglich: MCHs further utilize the poly-histidine sequence for specific, stable, reversible and stoichiometric labeling with reporter groups. Thus, a further functionally impairing modification of the intrinsic protein sequence is no longer necessary. The following applications are thus possible on the target protein without further modification or purification methods:
a) EPR (Review: Hubbel et al. 2000, Nature Structural Biology, 7, 9): a) EPR (Review: Hubbel et al., 2000, Nature Structural Biology, 7, 9):
- Mobilität  - Mobility
- Umgebung  - Surroundings
Distanzen zwischen PROXYL-trisNTA und Single-Cys-Mutante oder Spin-markierten Nucleotiden bzw. Substraten/Liganden.  Distances between PROXYL trisNTA and single-cys mutant or spin-labeled nucleotides or substrates / ligands.
Distanzen zwischen zwei His-markierten („tagged") Proteinen mit PROXYL-trisNTA b) NMR: Strukturauiklärung mittels„Paramagentic enhanced effect" - Methode (vergl. Battiste et al, Biochemistry, 39, 5355 - 5365) Distances between two His-tagged proteins with PROXYL-trisNTA b) NMR: Structural Analysis by "Paramagnetic Enhanced Effect" Method (see Battiste et al, Biochemistry, 39, 5355-5355)
c) In vivo und in vitro Kontrastverstärker in Magnetic resonance imaging (MRI) oder Electron paramagnetic resonance imaging (EPRI). Zusätzlich sind Radikale Redox-sensitive Kontrastmittel (Matsumoto et al. Clin Cancer Res 2006, 12, 8). c) In vivo and in vitro contrast enhancers in Magnetic Resonance Imaging (MRI) or Electron Paramagnetic Resonance Imaging (EPRI). In addition, radicals are redox-sensitive contrast agents (Matsumoto et al., Clin Cancer Res 2006, 12, 8).
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren verdeutlicht werden, ohne jedoch auf diese Beispiele beschränkt zu sein. The present invention will be clarified by the following examples with reference to the accompanying figures, without, however, being limited to these examples.
Figur 1 A und B zeigt die Strategie zur Synthese von PROXYL-trisNTA (5). 1 trisNTA- OtBu; 2 DTP-trisNTA-OtBu; 3 DTP-trisNTA; 4 Thio-trisNTA; 5 PROXYL-trisNTA; 6 PROXYL-trisNTA x Ni2+ Figure 1 A and B shows the strategy for the synthesis of PROXYL-trisNTA (5). 1 trisNTA OtBu; 2 DTP-trisNTA-OtBu; 3 DTP trisNTA; 4 thio-trisNTA; 5 PROXYL trisNTA; 6 PROXYL-trisNTA x Ni 2+
Figur 2 zeigt die Ergebnisse der analytischen Größen-Ausschluss-Chromatographie. PROXYL-trisNTAs binden stabil und reversibel an (His)6-markiertes Maltose-bindendes Protein (MBP) Figure 2 shows the results of analytical size exclusion chromatography. PROXYL trisNTAs stably and reversibly bind (His) 6-labeled maltose binding protein (MBP)
Figur 3 zeigt im EPR, dass Proxyl-trisNTAs nach Reinigung das stabile Radikal tragen, dass Ni11 Ionen mit dem stabilen Radikal interferieren und dass Zn11 Ionen nicht mit dem stabilen Radikal interferieren. Figure 3 shows in EPR that the tricyclic trisNTAs bear the stable radical after purification, that Ni 11 ions interfere with the stable radical, and that Zn 11 ions do not interfere with the stable radical.
Figur 4 zeigt die Charakterisierung von Proxyl-trisNTA mittels Continous Wave EPR. A: Effekt von divalenten Kationen auf das EPR Signal. Ni2+ verringert das EPR Signal, wohingegen Zn2+ das Radikal nicht beeinflusst. B: Proxyl-trisNTA bindet stabil und reversible an His-markiertes Maltose Bindeprotein. Figure 4 shows the characterization of Proxyl-trisNTA by means of Continous Wave EPR. A: Effect of divalent cations on the EPR signal. Ni 2+ reduces the EPR signal, whereas Zn 2+ does not affect the radical. B: Proxyl-trisNTA binds stably and reversibly to His-tagged maltose binding protein.
Figur 5 zeigt die Charakterisierung von Proxyl-trisNTA mittel gepulster EPR Techniken; Distanzmessungen mittels Proxyl-trisNTA. A: Intramolekulare Distanzmessung: Maltose Bindeprotein (MalE) wurde an verschiedenen Positionen mit der Spinsonde Rl (MTS-Proxyl) markiert. Durch Bindung von Proxyl-trisNTA konnten Distanzen in An- und Abwesenheit von Substrat (Maltose) bestimmt werden. B: Intermolekulare Distanzmessung: der Maltose Transporter MALFGK2 wurde an der Position S205 mit Rl (MTS-Proxyl) derivatisiert. Das Proxyl-trisNTA wurde stoichiometrisch mit MalE vorinkubiert. Erst nachdem MalE an MalFGK2 bindet kann eine Distanz zwischen den beiden Proteinen bestimmt werden. Beispiele Figure 5 shows the characterization of proxyl trisNTA by pulsed EPR techniques; Distance measurements by means of Proxyl-trisNTA. A: Intramolecular Distance Measurement: Maltose binding protein (MalE) was labeled at various positions with the spin probe RI (MTS-Proxyl). By binding of proxyl-trisNTA distances in the presence and absence of substrate (maltose) could be determined. B: Intermolecular Distance Measurement: The maltose transporter MALFGK2 was derivatized at position S205 with RI (MTS-Proxyl). The proxyl-trisNTA was pre-incubated stoichiometrically with MalE. Only after MalE binds to MalFGK2 can a distance between the two proteins be determined. Examples
Synthese synthesis
I. trisNTA-OtBu (1)  I. trisNTA-OtBu (1)
1 wurde wie früher beschrieben synthetisiert (Lata, S., Reichel, A., Brock, R., Tampe, R. & Piehler, J. High-affinity adaptors for switchable recognition of histidine-tagged proteins. J. Am. Chem. Soc. 127, 10205-10215 (2005)).  1 was synthesized as previously described (Lata, S., Reichel, A., Brock, R., Tampe, R. & Piehler, J. High-affinity adaptors for switchable recognition of histidine-tagged proteins, J. Am. Chem. Soc., 127, 10205-10215 (2005)).
IL Dithiodipropionsäure trisNTA-OtBu (2, DTP-trisNTA-OtBu) IL dithiodipropionic acid trisNTA-OtBu (2, DTP-trisNTA-OtBu)
Nach Lösen von 0,5 mmol 1 und 0,18 mmol 3,3 'Dithiodipropionsäure in trockenem Dichlor- methan (30 ml) wurden 0-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafiuorborat (TBTU, 0,6 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA, 2,6 mmol) nacheinander hinzugefügt und die so erhaltene Schlämme wurde mit Argon gespült. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden dann in vacuo entfernt, und der so erhaltene Feststoff wurde zwischen Dichlormethan (60 ml) und MQ Wasser (3 x 20 ml) getrennt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, die flüchtigen Bestandteile wurden unter reduziertem Druck entfernt. Der so erhaltene Feststoff wurde über Silikagel mit Ethylacetat/Ethanol 9: 1 chromatographiert. Die Produkte wurden durch Massenspektrometrie (Tabelle 1) charakterisiert.  After dissolving 0.5 mmol of 1 and 0.18 mmol of 3,3'-dithiodipropionic acid in dry dichloromethane (30 ml), 0- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate ( TBTU, 0.6 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (DIPEA, 2.6 mmol) were added sequentially and the resulting slurry was purged with argon. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The volatiles were then removed in vacuo and the resulting solid was partitioned between dichloromethane (60 ml) and MQ water (3 x 20 ml). The organic phase was dried over magnesium sulfate, the volatiles were removed under reduced pressure. The resulting solid was chromatographed over silica gel with ethyl acetate / ethanol 9: 1. The products were characterized by mass spectrometry (Table 1).
III. DTP-trisNTA (3) III. DTP trisNTA (3)
Phenol (150 mg. 1,59 mmol) und Triisopropylsilan (TIPS, 580 μΐ, 3,63 mmol) wurden frisch in Trifiuoressigsäure (5 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe der geschützten Chelatorköpfe (2, 330 mg). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden dann unter verringertem Druck entfernt und die so erhaltene ölige Masse wurde wieder in Trifiuoressigsäure (5 ml) gelöst. Das Produkt wurde mit kaltem Diethylether gefällt, gefolgt von gründlichem Waschen mit kaltem Diethylether (10 x 15 ml). Der so erhaltene Feststoff wurde unter der Verwendung von RP-HPLC (C18 Säule, Vydac® 218TP, Gra- ce) mit einem linearen Gradient von 0-19% Acteonitril in MQ Wasser jeweils mit 0,2 % Trifiuoressigsäure gereinigt. Die Produkte wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert (Tabelle 1).  Phenol (150 mg, 1.59 mmol) and triisopropylsilane (TIPS, 580 μΐ, 3.63 mmol) were freshly dissolved in trifluoroacetic acid (5 mL) followed by addition of the protected chelator heads (2. 330 mg). The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. The volatiles were then removed under reduced pressure and the oily mass thus obtained was redissolved in trifluoroacetic acid (5 ml). The product was precipitated with cold diethyl ether, followed by thorough washing with cold diethyl ether (10 x 15 ml). The resulting solid was purified using RP-HPLC (C18 column, Vydac® 218TP, Grace) with a linear gradient of 0-19% acetonitrile in MQ water, each with 0.2% trifluoroacetic acid. The products were characterized by mass spectrometry (Table 1).
IV. Thio-trisNTA (4) Das entschützte DTP-trisNTAs (3, 150 mg, 0,07 mmol) wurde in MQ Wasser gelöst, und tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP, 280 mg, 1,10 mmol) wurde hinzugefugt. Das Reaktionsgemisch wurde für 12 h bei 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter der Verwendung von RP-HPLC (C18 Säule, Vydac® 218TP, Grace) mit einem linearen Gradient von 0-19% Acteonitril in MQ Wasser jeweils mit 0,2 % Trif uoressigsäure chromatographiert. Die Produkte wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert (Tabelle 1). IV. Thio-trisNTA (4) The deprotected DTP trisNTAs (3, 150 mg, 0.07 mmol) was dissolved in MQ water and tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, 280 mg, 1.10 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for 12 h at 40 ° C. The reaction mixture was chromatographed using RP-HPLC (C18 column, Vydac® 218TP, Grace) with a linear gradient of 0-19% acetonitrile in MQ water each with 0.2% trifluoroacetic acid. The products were characterized by mass spectrometry (Table 1).
V. Maleimid-PROXYL Konjugation und Metallionbeladung V. Maleimide-PROXYL conjugation and metal ion loading
4 (25 mg, 25 μιηοΐ) wurde in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonsäure (HEPES, pH 7.0, 250 μΐ) gelöst, gefolgt von Hinzugabe von 3-Maleimido-2,2,5,5- tetramethyl-l-pyrrolidinyloxy (Maleimido-PROXYL, 6 mg, 36 μιηοΐ). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter der Verwendung von RP-HPLC (C18 Säule, Vydac® 218TP, Grace) mit einem linearen Gradient von 0- 19% Acteonitril in Ammoniumacetat (20 mM, pH 5) chromatographiert. Die Produkte wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert (Tabelle 1). Für die Metallionbeladung wurde 4 mit einem stöchiometrischen Überschuss an divalentem Kation inkubiert. Eine anionische Austauschchromatographie (HiTrap Q, GE Healthcare, 1 ml) entfernte den Überschuss an divalentem Kationen durch Elution mit einem Gradienten an 0 - 500 mM Natriumchlorid.  4 (25 mg, 25 μιηοΐ) was dissolved in 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, pH 7.0, 250 μΐ), followed by the addition of 3-maleimido-2,2,5,5- tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (maleimido-PROXYL, 6 mg, 36 μιηοΐ). The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. The reaction mixture was chromatographed using RP-HPLC (C18 column, Vydac® 218TP, Grace) with a linear gradient of 0-19% acetonitrile in ammonium acetate (20 mM, pH 5). The products were characterized by mass spectrometry (Table 1). For metal ion loading, 4 was incubated with a stoichiometric excess of divalent cation. An anionic exchange chromatography (HiTrap Q, GE Healthcare, 1 ml) removed the excess of divalent cations by elution with a gradient of 0-500 mM sodium chloride.
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Struktur von PROXYL-trisNTA (5) Structure of PROXYL-trisNTA (5)
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Analytische Größen-Austausch-Chromatographie Analytical size-exchange chromatography
(His)6-markiertes Maltose bindendes Protein (1 μΜ) wurde mit PROXYL-trisNTA in einer 1 :1 Stöchiometrie in 20 mM tris(Hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4 für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Probe durch Größen- Austausch-Chromatographie (SEC, Superdex 200 HR10/30) in einem GE ETTAN System mit einem Probenvolumen von 50 μΐ analysiert. Die Elution wurde bei 225 und 280 nm bei einer konstanten Flussrate von 50 μΐ/min überwacht. Um die Reversibilität zu belegen wurde ein 100-facher Überschuss an Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) zu dem MBP/PROXYL-trisNTA Komplex hinzugefügt und für 30 min vor der Analyse in der SEC inkubiert.  (His) 6-labeled maltose binding protein (1 μΜ) was incubated with PROXYL-trisNTA in a 1: 1 stoichiometry in 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), 150 mM sodium chloride, pH 7.4 for 30 minutes. The sample was then analyzed by size-exchange chromatography (SEC, Superdex 200 HR10 / 30) in a GE ETTAN system with a sample volume of 50 μΐ. Elution was monitored at 225 and 280 nm at a constant flow rate of 50 μΐ / min. To demonstrate reversibility, a 100-fold excess of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was added to the MBP / PROXYL-trisNTA complex and incubated for 30 min prior to analysis in the SEC.

Claims

Patentansprüche claims
Multivalente Chelator- Verbindung (MCH) der allgemeinen Formel Multivalent chelator compound (MCH) of the general formula
G - Z - X G - Z - X
worin wherein
G eine Gerüst- Struktur ist, umfassend eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 Kohlenstoff- Atomen, weiterhin umfassend Amid-, Ester- und/oder Etherbindungen, mit 3 oder 4 Nitrilotriessigsäure (NTA)-Gruppen als Chelator-Gruppen mit einem Metall-Koordinationszentrum,  G is a backbone structure comprising a saturated hydrocarbon chain of 2 to 20 carbon atoms, further comprising amide, ester and / or ether bonds, with 3 or 4 nitrilotriacetic acid (NTA) groups as chelator groups having a metal coordination center .
Z eine Kopplungsgruppe für X ist, und Z is a coupling group for X, and
X eine Reaktivgruppe, gegebenenfalls zusammen mit einer Reportergruppe R ist, und Tautomere, Isomere, Anhydride, Säuren und Salze davon.  X is a reactive group, optionally together with a reporter group R, and tautomers, isomers, anhydrides, acids and salts thereof.
Multivalente Chelator- Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Kopplungsgruppe Z mindestens eine gegebenenfalls geschützte Gruppe ausgewählt aus einer Thiolgruppe, einer Azidgruppe und N3 zur Kopplung von X umfasst. The multivalent chelator compound of claim 1, wherein the coupling group Z comprises at least one optionally protected group selected from a thiol group, an azide group and N 3 for coupling X.
Multivalente Chelator- Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Z ausgewählt ist aus A multivalent chelator compound according to claim 1 or 2, wherein Z is selected from
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Multivalente Chelator- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X ausgewählt ist aus Maleimid-, Haloacetylderivaten-, Pyridyldusulfid-, Alkythiosulfonat-, Triarylphosphin-, Alkin- und cyklischen Alkingruppen. A multivalent chelator compound according to any one of claims 1 to 3, wherein X is selected from maleimide, haloacetyl derivative, pyridyldusulfide, alkythiosulfonate, triarylphosphine, alkyne and cyclic alkyne groups.
5. Multivalente Chelator-Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend eine Reportergruppe R mit mindestens einem stabilen organischem Radikal, wobei R kovalent an X gebunden ist. 6. Multivalente Chelator-Verbindung nach Anspruch 5, wobei R ausgewählt ist aus Pro- xyl oder Tempo und wobei das stabile Radikal ausgewählt ist aus O* und N* 7. Multivalente Chelator-Verbindung nach Anspruch 5 oder 6 der Formel The multivalent chelator compound according to any one of claims 1 to 4, further comprising a reporter group R having at least one stable organic radical, wherein R is covalently bonded to X. 6. The multivalent chelator compound of claim 5 wherein R is selected from xyl or tempo and wherein the stable radical is selected from O * and N * 7. A multivalent chelator compound according to claim 5 or 6 of the formula
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8. Multivalente Chelator-Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jeweils ein Metallion an den Chelator-Gruppen gebunden ist. The multivalent chelating compound of any one of claims 1 to 7 wherein each metal ion is attached to the chelator groups.
9. Multivalente Chelator-Verbindung nach Anspruch 8, wobei das Metallion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ni2+, Co2+, Cu2+ , Zn2+, Fe2+, Fe3+ und allen Lanthani- dionen. 10. Verwendung einer multivalenten Chelator-Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zur Kopplung von organischen Radikalen an Zielmoleküle. 11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Kopplung reversibel ist und den Transport eines Wirkstoffs für Protein-Proteininteraktionsstudien oder für Protein- Nukleinsäureinteraktionstudien in eine Zelle vermittelt. 9. The multivalent chelator compound of claim 8, wherein the metal ion is selected from the group consisting of Ni 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+, and all the lanthanide ions. 10. Use of a multivalent chelator compound according to any one of claims 5 to 9 for the coupling of organic radicals to target molecules. The use of claim 10, wherein the coupling is reversible and mediates transport of an agent for protein-protein interaction studies or for protein-nucleic acid interaction studies into a cell.
12. Verwendung einer multivalenten Che lator- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Markierung/nicht-kovalenten Funktionalisierung von Zielmolekülen zur Anwendung in der magnetischen Resonanzspektroskopie (NMR, EPR). 12. Use of a multivalent Che lator- compound according to any one of claims 1 to 9 for the marking / non-covalent functionalization of target molecules for use in magnetic resonance spectroscopy (NMR, EPR).
13. Verwendung einer multivalenten Che lator- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als in vivo und in vitro Kontrastverstärker in der magnetischen Resonanztomographie (MRI) oder in der Elektron paramagnetische Resonanztomographie (EPRI). 13. Use of a multivalent Che lator- connection according to one of claims 1 to 9 as in vivo and in vitro contrast enhancers in magnetic resonance tomography (MRI) or in the electron paramagnetic resonance tomography (EPRI).
Verwendung nach Anspruch 10 bis 12, wobei es sich bei dem Zielmolekül um ein Peptid, Polypeptid, Protein, Peptid- oder Protein- Mimetikum oder peptidmodifiziertes Polymer oder Dendrimer handelt. Use according to claim 10 to 12, wherein the target molecule is a peptide, polypeptide, protein, peptide or protein mimetic or peptide-modified polymer or dendrimer.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Kopplung von zwei tris-NTA-OtBu Einheiten über eine Disul- fidbrücke und anschließende Spaltung dieser Brücke. A process for preparing a compound according to any one of the preceding claims which comprises coupling two tris-NTA-OtBu moieties via a disulfide bridge and then cleaving this bridge.
16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kopplung durch Umsetzung mit der Substanz 16. A process for the preparation of a compound according to any one of the preceding claims, wherein the coupling by reaction with the substance
Figure imgf000020_0001
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erfolgt.  he follows.
17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, umfassend ein Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16 und anschließende Kopplung der Reportergruppe R umfassend mindestens ein stabiles organisches Radikal, wobei R kovalent an X gebunden ist. 17. A process for the preparation of a compound according to any one of claims 5 to 9, comprising a process according to any one of claims 15 or 16 and subsequent coupling of the reporter group R comprising at least one stable organic radical, wherein R is covalently bonded to X.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013160453A2 (en) 2012-04-26 2013-10-31 Iba Gmbh Adapter molecule capable of reversibly equipping a fusion protein carrying an oligohistidine affinity tag with a further affinity tag and methods of using the same
CN106732464A (en) * 2017-02-02 2017-05-31 复旦大学 A kind of hydrophilic branch and the magnetic graphene material of C18 modifications and its preparation method and application

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021100042A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-27 Technion Research & Development Foundation Limited Minimally-invasive continuous clinical monitoring of small molecules with analytical accuracy

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000047548A1 (en) * 1999-02-08 2000-08-17 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Improved compounds for protein binding
WO2006013042A2 (en) 2004-08-05 2006-02-09 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Multivalent chelators for modifying and organizing of target molecules
WO2006081631A1 (en) * 2005-02-07 2006-08-10 Lipotek Pty Ltd Adjuvanting material
WO2006116475A2 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory compositions
WO2008145609A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Novartis Ag Method of making covalent conjugates with his-tagged proteins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000047548A1 (en) * 1999-02-08 2000-08-17 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Improved compounds for protein binding
WO2006013042A2 (en) 2004-08-05 2006-02-09 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Multivalent chelators for modifying and organizing of target molecules
DE102004038134A1 (en) 2004-08-05 2006-03-16 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main New multivalent chelator compounds containing a carbohydrate scaffold structure linked to chelator groups and coupling groups useful for modification and/or immobilization of target molecules e.g. proteins that carry an affinity-tag
WO2006081631A1 (en) * 2005-02-07 2006-08-10 Lipotek Pty Ltd Adjuvanting material
WO2006116475A2 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory compositions
WO2008145609A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Novartis Ag Method of making covalent conjugates with his-tagged proteins

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BATTISTE ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 39, pages 5355 - 5365
FANUCCI G E ET AL: "Recent advances and applications of site-directed spin labeling", CURRENT OPINION IN STRUCTURAL BIOLOGY, ELSEVIER LTD, GB, vol. 16, no. 5, 1 October 2006 (2006-10-01), pages 644 - 653, XP024959959, ISSN: 0959-440X, [retrieved on 20061001], DOI: DOI:10.1016/J.SBI.2006.08.008 *
FRILLINGOS ET AL., FASEB JOURNAL, vol. 12, 1998, pages 1282
HUBBEL ET AL., NATURE STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 7, 2000, pages 9
LATA ET AL., JACS, vol. 127, 2005, pages 10205 - 10215
LATA SUMAN ET AL: "High-affinity adaptors for switchable recognition of histidine-tagged proteins.", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY 27 JUL 2005 LNKD- PUBMED:16028931, vol. 127, no. 29, 27 July 2005 (2005-07-27), pages 10205 - 10215, XP002631574, ISSN: 0002-7863 *
LATA, S.; REICHEL, A.; BROCK, R.; TAMPE, R.; PIEHLER, J.: "High-affinity adaptors for switchable recognition of histidine-tagged proteins", J. AM. CHEM. SOC., vol. 127, 2005, pages 10205 - 10215, XP002631574, DOI: doi:10.1021/JA050690C
LEE HS; CONTARINO M; UMASHANKARA M; SCHÖN A; FREIRE E; SMITH AB 3RD; CHAIKEN IM; PENN LS: "Use of the quartz crystal microbalance to monitor ligand-induced conformational rearrangements in HIV-1 envelope protein gp120", ANAL BIOANAL CHEM., vol. 396, no. 3, 17 December 2009 (2009-12-17), pages 1143 - 52, XP019777698
MATSUMOTO ET AL., CLIN CANCER RES, vol. 12, 2006, pages 8
PORATH, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 3, 1992, pages 263 - 281
PRESCHER ET AL., NATURE CHEMICAL BIOLOGY, vol. 1, 2005, pages 1
SU X -C ET AL: "Paramagnetic labelling of proteins and oligonucleotides for NMR", JOURNAL OF BIOMOLECULAR NMR 2010 SPRINGER NETHERLANDS NLD LNKD- DOI:10.1007/S10858-009-9331-1, vol. 46, no. 1, January 2010 (2010-01-01), pages 101 - 112, XP002631576, ISSN: 0925-2738 *
TANG J ET AL: "Detection of metal binding sites on functional S-layer nanoarrays using single molecule force spectroscopy", JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY, ORLANDO, US, vol. 168, no. 1, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 217 - 222, XP026542249, ISSN: 1047-8477, [retrieved on 20090220], DOI: DOI:10.1016/J.JSB.2009.02.003 *
TINAZLI ET AL., CHEMISTRY - EUR. JOUR., vol. 11, 2005, pages 5249 - 5259
VALIOKAS RAMUNAS ET AL: "Self-assembled monolayers containing terminal mono-, bis-, and tris-nitrilotriacetic acid groups: characterization and application", LANGMUIR: THE ACS JOURNAL OF SURFACES AND COLLOIDS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, DC, USA, vol. 24, no. 9, 6 May 2008 (2008-05-06), pages 4959 - 4967, XP009107942, ISSN: 0743-7463, DOI: DOI:10.1021/LA703709A *
VAN BROEKHOVEN ET AL: "The novel chelator lipid 3(nitrilotriacetic acid)-ditetradecylamine (NTA3-DTDA) promotes stable binding of His-tagged proteins to liposomal membranes: Potent anti-tumor responses induced by simultaneously targeting antigen, cytokine and costimulatory signals to T cells", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. BIOMEMBRANES, AMSTERDAM, NL, vol. 1716, no. 2, 15 October 2005 (2005-10-15), pages 104 - 116, XP005135775, ISSN: 0005-2736, DOI: DOI:10.1016/J.BBAMEM.2005.09.003 *
WRUSS JÜRGEN ET AL: "Conformation of receptor adopted upon interaction with virus revealed by site-specific fluorescence quenchers and FRET analysis.", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY 22 APR 2009 LNKD- PUBMED:19331321, vol. 131, no. 15, 22 April 2009 (2009-04-22), pages 5478 - 5482, XP002631575, ISSN: 1520-5126 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013160453A2 (en) 2012-04-26 2013-10-31 Iba Gmbh Adapter molecule capable of reversibly equipping a fusion protein carrying an oligohistidine affinity tag with a further affinity tag and methods of using the same
CN106732464A (en) * 2017-02-02 2017-05-31 复旦大学 A kind of hydrophilic branch and the magnetic graphene material of C18 modifications and its preparation method and application
CN106732464B (en) * 2017-02-02 2020-11-20 复旦大学 Magnetic graphene material modified by hydrophilic branches and C18, and preparation method and application thereof

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