WO2011090349A2 - 피부투과도, 세포유입 및 종양전달성이 증가된 나노운반체 - Google Patents

피부투과도, 세포유입 및 종양전달성이 증가된 나노운반체 Download PDF

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최원일
김영하
김자영
이종현
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • Nanocarriers with increased skin permeability, cell influx, and tumor transfer are also useful as therapeutically active agents.
  • the present invention relates to a nanocarrier with increased skin permeability, cell influx, and cancer delivery during vascular administration.
  • U.S. Patent No. 5,019,400 also prepared microparticles for protein drug delivery by injecting a biocompatible polymer poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) (hereinafter referred to as 'PLGA') into a cryogenic refrigerant. Problems arise due to the hydrophobicity of the organic solvent used to dissolve.
  • US Patent No. 6,586,011 was also prepared by spraying the nanoparticle system for protein delivery to cryogenic solvents, due to the cross-linking agent used in the production of nanoparticles caused serious problems in the stability of the protein.
  • solvent evaporation is used as a method for preparing nanoparticles, but this method also causes various problems due to the use of organic solvents.
  • a salt leaching method is used to prepare poly (D, L-lactic acid) (hereinafter 'PLA') nanoparticles using an organic solvent (such as acetone) that mixes well with water. -out) has also been developed, but problems with deactivation and stability of protein drugs have not been resolved (E. Allemann et al., Pharm. Res. 10 (1993) 1732-1737).
  • Korean Patent No. 766820 is to improve the transmucosal transport of proteins by functionalizing chitosan to a kind of polymer protein
  • the invention is disclosed.
  • WO 2008/136773 discloses nanoparticles surface-modified with chitosan, and the nanoparticles can be used as molecular imaging agents, biosensing agents and drug delivery systems (DDS).
  • percutaneous administration of the drug can provide continuous drug delivery at a constant rate, reduce the likelihood of side effects, enhance the therapeutic effect, overcome the low bioavailability of oral administration, and reduce the frequency of administration. It is advantageous in that the drug can be easily stopped when necessary.
  • transdermal dosage forms especially in the development of biomedical transdermal dosage forms such as proteins having high molecular weight, satisfactory transdermal dosage forms have not been developed.
  • Photothermal treatment of solid tumors also referred to as photothermal ablation
  • photothermal dissipation or optical warming phenomena is an interesting method of treating solid tumors in a minimally invasive manner (1-6).
  • This technique which typically involves converting absorbed light into localized heat through a non-radioactive mechanism, is relatively simple to use for cancer cell ablation and has several advantages, such as fast recovery, low complications, and short hospital stays. Will have them (7).
  • the near-infrared (NIR) used in this method is due to the absorption of low-infrared infrared rays of general tissues, so that deep tissue penetration can be achieved with high spatial precision without damaging general biological tissues (8-10).
  • nanostructures such as collective gold nanoparticles (11), gold nanoshells (12-14), gold nanocages (15), empty AuAg dendrites (7), gold nanorods, (gold Nanorods) (16-18) and carbon nanotubes have been investigated for NIR photoactive cancer treatment.
  • the plasmon-resonant gold nanorods were of considerable interest because they can be fine-tuned using the aspect rat io, which is the plasmon-resonant gold nanorods. This is because it has the advantages of effective large-scale synthesis, easy functionalization, high photothermal conversion and colloidal stability (20 "21). In spite of these advantages, they are used as templates during synthesis and enclosing on the surface of gold nanorods.
  • the present inventors have tried to produce nano-carriers that exhibit temperature sensitivity and greatly improve skin permeability for transdermal administration, and are advantageous for cell influx, selective delivery to cancer tissue, and photothermal therapy.
  • the present invention was completed by confirming that the nanocarrier having the above improved properties can be produced when the nanocarrier is manufactured from a water-soluble biocompatible polymer having chirosan and a photocrosslinkable functional group.
  • nanocarrier which is advantageous for photothermal treatment and increased skin permeability, cel lu ar uptake and delivery to cancer tissues.
  • Another object of the present invention to provide a composition for transdermal administration.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for imaging tumors or cancers in vivo.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for treating photothermal cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a chitosan-modified nanocarrier, characterized in that the skin permeability, eel hilar uptake, or delivery to cancer tissues is increased.
  • the present invention provides a chitosan-modified nanocarrier in which chitosan is bonded to a water-soluble biocompatible polymer which is crosslinked through a photo-crossl inkabl e functional group at the terminal.
  • Chitosan-modified nanocarriers vary in diameter with temperature changes, compared to bare nanocarriers with no chitosan bonds (eel hil ar uptake), cancer Selective transfer to tissue or photothermal effect provides increased nano-carrier.
  • the present inventors have tried to produce nano-carriers that exhibit temperature sensitivity and greatly improve skin permeability for transdermal administration, and are advantageous for cell influx, selective delivery to cancer tissue, and photothermal therapy. As a result, it was confirmed that the nanocarrier having the above improved properties may be prepared when the nanocarrier was manufactured from a water-soluble biocompatible polymer having chirosan and a photocrosslinkable functional group.
  • biocompatible polymer has a tissue compatibility and a blood compat ibi 1 i ty that do not necrosis or dissolve the tissue in contact with living tissue or blood. It means a polymer.
  • water soluble biocompatible polymer is dissolved in water or water-miscible solvents (e.g., methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, ⁇ , ⁇ - dimethylformamide and dimethylsulfoxide).
  • biocompatible polymer it is meant a biocompatible polymer, preferably dissolved in water.
  • the water-soluble biocompatible polymer that can be used in the present invention is polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide-polypropylene oxide block copolymer, alkyl salose, hydride Hydroxyalkyl salose, heparin, hyaluronic acid, dextran, or a polymer having an alginate structure.
  • the water-soluble biocompatible polymers in the case of using a polymer having hydrophobic and hydrophilic moieties and exhibiting a similar pattern to the surfactant, it is preferable to additionally introduce a hydrophobic moiety into the polymer, which is suitable for the technical purpose to be achieved in the present invention. .
  • the water soluble biocompatible polymer that can be used in the present invention is a poloxamer-based polymer.
  • the water-soluble biocompatible polymer that can be used in the present invention is a polymer represented by the following Chemical Formula 1:
  • PE represents ethylene oxide
  • PP0 represents propylene oxide
  • PC1 and PC2 represent photocrosslinkable functional groups
  • X, y and z each independently represent an integer of 1 to 10,000.
  • Photo-crossl inkable functional groups are preferably bonded to both ends of the biocompatible polymer.
  • the photocrosslinkable functional group is an acrylate, diacrylate, oligoacrylate, methacrylate, dimethacrylate, oligomethacrylate, coumarin, thymine or cinnamate, more preferably acryl Acrylate, diacrylate, oligoacrylate, methacrylate, dimethacrylate or oligomethacrylate, most preferably acrylate.
  • the water-soluble biocompatible polymer crosslinked with the photocrosslinkable functional group used in the present invention is modified with suitable chitosan (modi f i cat ion).
  • Chitosan used for modifying the water-soluble biocompatible polymer in the present invention includes any chitosan known in the art, preferably chitosan, heparin, alginate, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan 5-sulfate (dermatan 5 -sul fate), keratan sulfate, salulose, hemi salulose, carboxymethyl cellulose, textane and textan sulfate, or one or more combinations of two or more thereof, most preferably chitosan.
  • any chitosan known in the art preferably chitosan, heparin, alginate, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan 5-sulfate (dermatan 5 -sul fate), keratan sulfate, salulose, hemi salulose, carboxymethyl cellulose, textane and textan sulfate, or one or more
  • chitosan is bound to the water soluble biocompatible polymer through a photo-cross l inkabl e functional group.
  • Photocrosslinkable functional groups in chitosan are as described above.
  • chitosan as the most preferred example of chitosan used for modifying the biocompatible polymer in the present invention is the natural organic polymer most present next to salose in nature, and is produced more than 100 billion tons annually. It is produced from chitin, and is obtained by deacetylating chitin in crustaceans such as crabs and shrimps, tortillas such as grasshoppers and dragonflies, mushrooms such as enoki mushrooms and shiitake mushrooms, and cell membranes of bacteria.
  • N-acetyl -D_ Chitosan is formed by the removal of the acetyl group present in the amine group from chitin in which the glucosamine (N-acetyl-D to glucosamine) monomer is connected to a straight chain of ⁇ -1,4 bond (Errington N, et al., Hydrodynamic character izat ion of chi tosan varing in molecular weight and degree of acetyl at ion.Int J Biol Macro / no 1. 15: 1123-7 (1993)).
  • Chitosan is present as a polycation in acidic solution because the acetyl group that was present in the amine group was removed compared to the chitin.
  • Chitosan is divided into oligomers of about 12 monomers and polymers belonging to polymers, depending on the number of monomers connected. It is divided into the middle molecule chitosan which has a range. Chitosan is widely used in various industrial and medical fields because of its excellent stability, environmental friendliness, biodegradability and biocompatibility. Chitosan is also known to be safe and free of immunostimulating side effects.
  • the present invention is characterized in that chitosan, which is excellent in biocompatibility, is used as a carrier together with other biocompatible polymers, and exhibits excellent efficacy when chitosan-modified nanocarriers are used as transdermal or cancer targeting molecules.
  • chitosan used by this invention is chitosan of the molecular weight 500-20000.
  • the molecular weight of chitosan used in the present invention is less than 500, there is a problem that the function of the chitosan as a carrier is weak, and when the molecular weight of chitosan exceeds 20000, there is a problem of forming a self-assembly in an aqueous solution.
  • Preferred chitosans used in the present invention are oligomeric levels of chitosan.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention increase in diameter as the temperature decreases, and conversely, as the temperature increases, the diameter decreases.
  • the chitosan-modified nanocarrier at 4 ° C.
  • the diameter is increased 3-20 times, more preferably 4-15 times, even more preferably 5-12 times, and most preferably 7-10 times compared to the diameter at 40 ° C.
  • this diameter of the chitosan-modified nanocarriers of the present invention is reversible.
  • the size of the pupil formed in the chitosan-modified nanocarrier changes. For example, encapsul at ion of a drug to be transported to a chitosan-modified nanocarrier with an increased pore size at low temperatures (eg 4 ° C) and then applied to the human body reduces the pore size. Sustained rel ease of the captured drug is achieved.
  • the temperature sensitive chitosan-modified nanocarriers of the present invention have a pore size of 3-20 ran at 37 ° C., more preferably 3-15 nm, most preferably 5-10. nm.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention are dispersed in an aqueous solution dispersion phase.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention have a pore size of 3-20 nm at 37 ° C.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention are nanoparticulates which are not hydrogels.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention have a nanoparticle form with equilateral shape.
  • the nanocarriers of the present invention have a diameter of 50-500 nm, more preferably 100-400 nm, most preferably 120-300 nm.
  • the chitosan-modified nanocarriers according to the present invention preferably have a diameter of 200 nm or less in that the sterilization process can be easily processed using a sterilization filter.
  • the polydi spersi ty index of the chitosan-modified nanocarrier is advantageously 0.1 or less, since it is generally regarded as a nanoparticle having a stable monodispersion distribution when the polydispersity index is 0.1 or less.
  • the preferred polydispersity index of chitosan-modified nanocarriers is 0.01-0. 1
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention are not limited and include various materials that exhibit therapeutic efficacy.
  • the substance to be transported is a protein, peptide, nucleic acid molecule, sugar, lipid, nanoparticle, compound, inorganic substance or fluorescent substance.
  • Proteins or peptides carried by the chitosan-modified nanocarriers of the present invention are not particularly limited and include hormones, hormonal analogs, enzymes, inhibitors, signaling proteins or parts thereof, antibodies or parts thereof, short chain antibodies, binding proteins or Its binding domains, antigens, adhesion proteins, structural proteins, regulatory proteins, toxin proteins, cytokines, transcriptional regulators, blood coagulation factors and vaccines, and the like.
  • the protein or peptide carried by the drug carrier of the present invention is insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF-1), growth hormone, erythropoietin, Gg CSFs (granulocyte-colony stimulating factors) ), GM-CSFs (granulocyte / macrophage—colony -stimulating factors), interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, EGFs ( epidermal growth factors (calcitonin), VEGFCvascular endothelial eel 1 growth factor (FGF), fibroblast growth factor (FGF), p late let-derived growth factor (PDGF), and adrenocorticotropic hormone (ACTH) TGF- ⁇ (transforming growth factor beta) , Bone morphogenetic ic protein (TMP), tumor necrosis factor (TNF), atobisban, busere
  • Nucleic acid molecules that can be carried by the chitosan-modified nanocarriers of the present invention are, for example, DNA, DNA aptamers, RNA aptamers, ribozymes, miRNAs, antisense Oligonucleotides, siRNAs, shRNAs, plasmids and vectors (eg, adenovirus vectors, retrovirus vectors), including but not limited to.
  • the material carried by the chitosan-modified nanocarriers of the present invention is preferably a drug, for example, anti-inflammatory drugs, analgesics, anti-arthritis agents, antispasmodics, antidepressants, antipsychotics, neurostabilizers, anti-anxiety agents, drug antagonists, Anti-Parkin's disease drugs, cholinergic agonists, anticancer agents, antiangiogenic agents, immunosuppressants, antiviral agents, antibiotics, appetite suppressants, analgesics, anticholinergic agents, antihistamines, antimigraine agents, hormones, coronary vessels, cerebrovascular or peripheral vessels Dilators, contraceptives, antithrombicides, diuretics, antihypertensives, cardiovascular diseases treatment agents, cosmetic ingredients (eg, wrinkle improvement agents, skin aging inhibitors and skin lightening agents) and the like, but are not limited thereto.
  • a drug for example, anti-inflammatory drugs, analgesics, anti-arthritis agents
  • the material carried by the chitosan-modified nanocarriers of the present invention is an anticancer agent.
  • Anticancer agents that can be applied to the present invention include any anticancer agent known in the art, for example cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclo Phosphamide, ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, dact inomycin, daunoru Daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transflag This includes, but is not limited to, transplatinum, 5-fluorouracil, adriamycin, vincristin, vinblastin, and methotrexate.
  • Nanoparticles that can be carried by the chitosan-modified nanocarriers of the invention include, for example, gold nanoparticles, silver nanoparticles, iron nanoparticles, transition metal nanoparticles and metal oxide nanoparticles (eg, ferrite nanoparticles).
  • the chitosan-modified nanocarrier of the present invention can be used as a magnetic resonance (MR) imaging agent when carrying ferrite nanoparticles.
  • MR magnetic resonance
  • the fluorescent material is transported using the chitosan-modified nanocarrier of the present invention, the fluorescent material is preferably bonded to the surface of the chitosan-modified nanocarrier.
  • the fluorescent material may be used by binding to protein or metal nanoparticles (eg, magnetic nanoparticles).
  • the fluorescent substance include fluorosane and its derivatives, rhodamine and its derivatives, lucifer yellow, B-phytoerythrin, 9-acridine isothiocyanate, lucifer yellow VS, 4-acetamido-4 '-Isothio-cyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid, 7-diethylamino_3- (4'-isothiocyatophenyl) -4-methylcoumarin, succinimidyl-pyrenebutyrate, 4 -Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonic acid derivative, LC TM -Red 640, LC TM -Red 705, Cy5, Cy5.5, lysamine, isothiocyanate , Erythrosine isothiocyanate, di
  • proteins, peptides, nucleic acid molecules, sugars, lipids, compounds, inorganic substances or fluorescent substances included in the nanocarriers of the present invention have a high molecular weight.
  • One of the greatest features of the present invention is that spontaneous encapsulat ions are naturally collected when the two substances are simply mixed in the process of collecting the material to be transported in the chitosan-modified nanocarrier. In other words, if the nanocarrier and the material to be transported are only contacted without any additional treatment, the material to be transported is naturally contained in the chitosan-modified nanocarrier.
  • the drug is encapsulated in the chitosan-modified nanocarrier, which is carried out in an aqueous dispersion phase without using an organic dispersed phase.
  • the collecting step is carried out at a temperature condition of 0-20 ° C, more preferably 4-10 ° C, most preferably 4-6 ° C.
  • the natural capture in aqueous solution by the chitosan-modified nanocarriers of the present invention has the advantage of greatly increasing the stability of the drug contained, in particular the protein drug.
  • the drug is contained in the chitosan-modified nanocarrier of the present invention by natural capture,
  • the encapsulation efficiency is very high, above 90%.
  • the method of the present invention can avoid denaturation or aggregation of the drug contained.
  • a targeting ligand may be bound to the surface of the chitosan-modified nanocarrier of the present invention.
  • targeting ligands include, but are not limited to, hormones, antibodies, cell-adhesive proteins, sugars, and neurotransmitters.
  • the present invention provides a method of transporting a cargo, comprising contacting the above-described chitosan-modified nanocarrier comprising a material of transport with a subject.
  • the present invention comprises a skin change, cellular uptake or cancer tissue in comparison with the bare nano-carrier, the diameter of which changes according to the temperature change, which comprises the following steps. It provides a process for the preparation of chitosan-modified nanocarriers characterized by increased furnace transferability:
  • Initiators suitable for the method of the present invention are not particularly limited.
  • the initiator that can be used in the present invention is a radical photoinitiator capable of causing a radical reaction by irradiation of ultraviolet or visible light.
  • photoinitiators that can be used in the present invention include ethyl eosin, 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone, 2-methoxy-2-phenylacetophenone, 2-hydroxy-1- [4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] -2-methyl- 1-propanone (Irgacure 2959 or Darocur 2959), camphorquinone 0; 311113110 11 ⁇ 1006), acetophenone, acetophenone benzyl ketal, 1-hydroxycyclonucleophenylphenyl ketone, 2, 2-dimethoxy-2 -Phenylacetophenone, xanthone, fluorenone, benzaldehyde, fluorene,
  • Irgacure 2959 was used in one specific embodiment of the present invention, which is known to be a very low initiator in vivo (Kristi S. Anseth, et al-, Cytocompat ibi 1ity of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH / 3T3 fibroblasts in vitro.J. Biomater.Sci.Polymer Edn., 2000.11 (5): P.439-457).
  • the nanocarrier is prepared by crosslinking the polymer and chitosan through the photocrosslinkable functional group of the polymer and chitosan by irradiating visible or ultraviolet rays in step (e).
  • ultraviolet light is used for crosslinking.
  • an ultraviolet lamp for thin layer chromatography may be used for ultraviolet irradiation, which is inexpensive compared to other curing ultraviolet lamps and has an advantage of being easily obtained. It is also suitable for initiators (e.g. Irgacure 2959) which generate free radicals by ultraviolet irradiation at a particular 365 nm wavelength.
  • the steps (a)-(e) are performed in the aqueous dispersion phase alone without using an organic dispersed phase. That is, the nanocarriers are all manufactured in a single phase. More specifically, the light is irradiated to the aqueous solution in which the biocompatible polymer, chitosan and the initiator are dispersed, so that the nanocarrier is completely manufactured. Moreover, the reaction of the present invention can be carried out with a one-pot reaction. have. In this respect, the method of the present invention may be referred to as "one-pot, single e phase synthes is”.
  • the method of the present invention it is possible to solve the problems of the prior art, such as the use of harmful organic solvents, complicated processes, high production cost and low containing capacity.
  • the method of the present invention can avoid denaturation or congestion of the drug contained.
  • the present invention provides a composition for transdermal administration comprising the chitosan-modified nanocarrier described above.
  • the present invention provides a method for transdermal delivery of a subject, comprising contacting the above-described chitosan-modified nanocarrier comprising the substance of subject to the subject's skin.
  • the present invention provides a composition for in vivo tumor or cancer imaging comprising the chitosan-modified nanocarrier described above.
  • the present invention provides a method for imaging an in vivo tumor or cancer of a subject comprising the following steps: (a) of the chitosan-modified nanocarrier described above comprising a substance of interest Administering a diagnostically effective amount to the subject; And (b) scanning the object to obtain a vi sible image.
  • the present invention provides a composition for treating light-heat cancer comprising the chitosan-modified nanocarrier described above.
  • the invention provides a method of treating photothermal cancer comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of a chitosan-modified nanocarrier as described above comprising a substance of interest.
  • compositions of the present invention include the above-described chitosan-modified nanocarriers as active ingredients, the common content between them is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification according to the repeated description.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention exhibit very good skin permeability compared to nanocarriers to which chitosan is not bound.
  • the chitosan-modified nanocarrier of the present invention has a very high cell influx of tumor cells or cancer cells as compared to the nanocarrier to which chitosan is not bound, and this characteristic of the chitosan-modified nanocarrier is in vivo.
  • composition for transdermal administration of the present invention is basically a pharmaceutical composition, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the material carried by the chitosan-modified nanocarriers used in the composition for transdermal administration of the present invention is not particularly limited, and is preferably an anti-wrinkle agent, moisturizer, acne treatment agent, scab mushroom remover, skin that is effective in the skin or scalp. It is an elasticity improver, hair promoter, anti-aging agent or skin epidermal stem cell proliferative agent.
  • the nanocarrier in the composition for transdermal administration includes high molecular weight proteins, peptides, nucleic acid molecules, sugars, lipids, compounds or inorganic substances.
  • high molecular weight refers to a molecular weight of a size that can not penetrate the skin (preferably human skin), preferably high molecular weight means a material having a molecular weight of 500 Da or more. In general, it is known that substances having a molecular weight of less than 500 Da can penetrate the skin (Bos JD, et al., Exp. Dermatol 9: 165-169 (2000)).
  • the nanocarrier of the present invention greatly improves the skin permeability, and enables the transdermal delivery by capturing a high molecular weight substance (eg, a protein drug) determined to be impossible to permeate the skin.
  • a high molecular weight substance eg, a protein drug
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, textose, sucrose, sorbetle, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including, but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, Preservatives and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • compositions for transdermal administration of the invention are administered in a transdermal manner of administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response to response of the patient. Ordinarily, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prevention.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-100 mg / kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a unit dose form by using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be made or prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or accelerators, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition for transdermal administration of the present invention transdermally delivers a substance to be delivered by contacting the skin of various subjects (preferably mammals, most preferably humans).
  • the photothermal cancer treatment composition of the present invention uses the chitosan-modified nanocarrier of the present invention having a very high tumor cell or cancer cell influx.
  • composition for treating photothermal cancer of the present invention a pharmaceutically acceptable carrier and formulation method which can be used can be described by citing the description in the composition for transdermal administration.
  • the chitosan-modified nanocarriers used in the composition for treating photothermal cancer of the present invention include a material suitable as a photosensitizer or a heat generating material, preferably metal particles.
  • the metal particles include, but are not limited to, gold particles, silicon particles, and magnetic nanoparticles (eg, iron oxide nanoparticles, ferrite, magnetite or permalloy).
  • the composition for treating photothermal cancer of the present invention preferably generates heat by electromagnetic radiation (el ectromagnet ic radi at ion). For example, when gold particles are used, infrared lasers are irradiated to generate heat to kill tumors or cancer cells. When magnetic nanoparticles are used, a high frequency magnetic field is added to generate heat.
  • the photothermal cancer treatment composition of the present invention is preferably administered parenterally.
  • parenteral administration it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intratumoral injection or intralesional injection.
  • Suitable dosages of the compositions of the present invention may be prescribed in various ways, such as by the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the patient. have.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • composition for treating photothermal cancer of the present invention is gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer It can effectively induce the death of cancer cells in various cancer diseases such as parathyroid cancer and ureter cancer.
  • the present invention provides a composition for imaging an in vivo tumor or cancer comprising the chitosan-modified nanocarrier described above.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention can be used as tumor tumors or cancer imaging agents because of high tumor cell or cancer cell influx.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention include suitable contrast agents or imaging agents.
  • suitable contrast agents or imaging agents For example, in the case of optical fluorescence of a living tumor or cancer image, a suitable fluorescent substance can be collected inside the chitosan-modified nanocarrier or bound to the surface of the chitosan-modified nanocarrier. have. Examples of fluorescent materials that can be used are as described above.
  • paramagnetic, superparamagnetic, or proton density signal generating particles may be produced by chitosan for proper T1 or T2 imaging. It can be included in modified nanocarriers.
  • Gd (in), ⁇ ( ⁇ ), Cu (n), Cr (in), Fe ( ⁇ ), Fe (m), Co ( ⁇ ), ⁇ ( ⁇ ), ⁇ ( ⁇ ), Eu (IE), Dy (in), pure iron, magnetic iron oxides (eg magnetite, Fe 3 0 4 ), Y-Fe 2 0 3 , manganese ferrite, cobalt ferrite, nickel ferrite and perfluorocarbons may be included as contrast agents. have.
  • the chitosan-modified nanocarrier of the present invention is a positron Emitting isotopes, such as n C, 13 0, 14 0, 15 0, 12 N, 13 N, 15 F, 17 F, 18 F, 32 C1, CI, ⁇ Cl, 43 Sc, "Sc , 45 Ti, 51 Mn, 52 Mn, 52 Fe, 3 ⁇ 4, 56 Co, 3 ⁇ 4, 61 Cu, 62 Cu, 62 Zn, 3 ⁇ 4, 66 Ga, 66 Ge, 67 Ge, a, 69 Ge, 69 As,
  • SPECT single photon emission computed tomography
  • PET positron emission tomography
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention may include CT contrast agents such as iodine or gold particles.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention have improved skin permeability to a very surprising level compared to bare nanocarriers without chitosan, and exhibit very good efficacy as transdermal carriers.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention have greatly improved cell influx into tumor cells and cancer cells, and can be very useful for imaging and photothermal treatment of tumor cells and cancer cells.
  • Silver has sensitivity, and diameter and pupil size change reversibly in response to temperature change.
  • chitosan-modified nanocarriers can be prepared in one-pot single phase.
  • Drugs may be naturally collected in the nanocarriers of the present invention.
  • the nanocarrier of the present invention can be used as a sustained-release drug carrier because the size of the pupil is reduced in the human body temperature conditions.
  • the present invention can ensure the stability of the drug contained therein.
  • La is a schematic diagram of the manufacturing process of the glycidyl methacrylated chitotooligosaccharide (GMA-COS) for the production of chitosan-modified nanocarriers of the present invention.
  • GMA-COS glycidyl methacrylated chitotooligosaccharide
  • FIG. Lb is -NMR spectroscopy results confirming the synthesis of GMA-C0S in FIG.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the manufacturing process of the chitosan-modified nanocarrier of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of size and zeta potential measurements for chitosan-modified nanocarriers.
  • 4A is a schematic diagram of a static franc-type diffusion cell for measuring skin permeability.
  • 4B shows in vitro skin permeability measurement results of chitosan-modified nanocarriers containing FITC-BSA.
  • Figure 4c is the result of measuring the skin permeation distribution of chitosan-modified nanocarriers containing FTTC-BSA by fluorescence microscope.
  • 4D shows the results of in vitro skin permeability measurement of chitosan-modified nanocarriers containing Cy5.5.
  • FIG. 5A is a flow cytometry measurement result of in vitro cell influx of chitosan-modified nanocarriers for SCC7 cell line.
  • 5B is an in vivo NIR fluorescence image showing real time tumor targeting of chitosan-modified nanocarriers (Cy5.5 inclusions) in a tumor mouse model implanted with SCC7 cells.
  • 5C is a quantitative and kinetic result for in vivo tumor targeting of chitosan-modified nanocarriers (Cy5.5 inclusion).
  • 5D is a graph quantifying the tissue distribution and tumor accumulation results of chitosan-modified nanocarriers (Cy5.5 inclusions).
  • FIG. 5E is axonbo NIR fluorescence images of organs and tumors as a result of confirming tissue distribution and tumor accumulation of chitosan-modified nanocarriers (Cy5.5 inclusions).
  • FIG. 6A is a TEM image and NIR spectral profile of a gold nanorod of chitosan-modified nanocarriers used for bioimaging or in vivo imaging.
  • FIG. 6A is a TEM image and NIR spectral profile of a gold nanorod of chitosan-modified nanocarriers used for bioimaging or in vivo imaging.
  • Figure 6b is a result of analyzing the stability of the chitosan-modified nanocarriers containing gold nanorods.
  • 6C is an image showing cell influx of gold nanorods and gold nanorods-containing chitosan-modified nanocarriers.
  • 6D is an image showing in vitro photothermal treatment results using chitosan-modified nanocarriers containing gold nanorods.
  • a cw laser a diode cont inuous-wave laser
  • FIG. 6E is an image showing in vitro photothermal treatment results using chitosan-modified nanocarriers containing gold nanorods.
  • FIG. 7A is a TEM image of a wavelength absorbed by a gold nanorod, a gold nanorod contained in a nanocarrier, and a gold nanorod contained in a chitosan-bonded nanocarrier.
  • 7B is a result of measuring the size (diameter) and the zeta potential of the nanocarrier and the gold nanorod-containing nanocarrier.
  • FIG. 8 is a graph of gold nanorods contained in nanocarriers and chitosan-bonded nanocarriers in PBS, respectively.
  • FIG. 9 is a cell image of a gold nanorod, a gold nanorod-containing nanocarrier, and a chitosan-binding gold nanorod-containing nanocarrier injected into a cell and observed whether the cell is introduced in a dark place under a microscope.
  • FIG. 10 shows two intensity intensity (41.5 and 26.4 W / cm 2 ) lasers at 780 nm wavelength to examine the selective near infrared photothermal treatment effect on SCC7 cancer cells (panel a) and NIH / 3T3 fibroblasts (panel b). This is an image to determine the cytotoxicity when examined.
  • FIG. 11 is a silver staining method for intravenous injection of gold nanorods, gold nanorods-containing nanocarriers, chitosan-bound gold nanorods-containing nanocarriers, and their absorption into tumor cells and liver cells.
  • FIG. 12A is a graph showing changes in tumor size during near-infrared laser irradiation 24 hours after intravenous injection of gold nanorods, gold nanorods-containing nanocarriers, chitosan-bound gold nanorods-containing nanocarriers.
  • FIG. 12B is a mouse tumor image showing changes in tumor size upon near-infrared laser irradiation 24 hours after intravenous injection of gold nanorods, gold nanorods-containing nanocarriers, and chitosan-bound gold nanorods-containing nanocarriers.
  • Figure 12c shows the change in tumor size after one to two times of near-infrared laser irradiation 24 hours after intravenous injection of gold nanorods, gold nanorods containing gold nanorods, and chitosan-bound gold nanorods. Is a graph showing
  • FIG. 12D shows the change in tumor size after one or two treatments of near-infrared laser irradiation 24 hours and 48 hours after intravenous injection of gold nanorod, gold nanorod containing nanocarrier, chitosan-bound gold nanorod containing nanocarrier Showing the mouse tumor.
  • FIG. 13 is a photograph comparing the amounts accumulated in tumor cells up to 72 hours after intravenous injection of Pluronic-based nanocarriers and chitosan-binding Pluronic-based nanocarriers into nude mice, respectively (A is an image of the whole body of the mouse) , B is an enlarged image of the tumor site.
  • FIG. 14 is a graphical illustration of a pluronic based nanocarrier and a manufacturing method in which a gold nanorod is contained into the nanocarrier.
  • Figure 15 shows the differences in cell viability when the gold nanorods, gold nanorods-containing nanocarriers, chitosan-binding gold nanorods-containing nanocarriers were injected into cells by varying the concentration of gold nanorods for cancer cells and fibroblasts, respectively. This is a graph that judges
  • FIG. 16 is a graph showing the amount of nanocarriers absorbed by SCC7 cancer cells (a) and NIH / 3T3 fibroblasts (b) when cultured for 2 hours, 12 hours, and 24 hours.
  • Glycidyl metaacrylated chiotool iogosacchar ide (GMA-C0S) was prepared using chitooligosaccharide and glycidyl methacrylate according to the method described in FIG. La.
  • FIG. Lb shows -NMR spectroscopy (JNM-LA300WB FT-NMR Spectrometer, JE0L, Japan) analysis of the finally prepared GMA-C0S, indicating that GMA-C0S was successfully prepared.
  • Example 2 Preparation of Chitosan-Modified Nanocarriers
  • Example 3 Analysis of Percutaneous Permeability of Chitosan "Modified Nanocarriers (using FITC-BSA)
  • the model protein FITC-BSA (Fluorescein i sot hiocyanate-labeled led bovine serum albumin, Sigma) was filled.
  • the model protein FITC-BSA was added to the chitosan-modified nanocarrier solution, and left at 4 ° C. for 12 hours to allow the model protein to spontaneously fill into the expanded nanocarrier. Unfilled model proteins were removed using a spin filter at room temperature.
  • the FITC-BSA capture efficiency and amount of chitosan-modified nanocarriers were spin filtered for 10 min at 14 000 rpm at room temperature followed by FQ Li, et al., Int. J. Pharm. , 2008, 349, 274.
  • Percutaneous permeability of FTTC-BSA-containing nanocarriers was measured using a static Francis-type diffusion cell (see FIG. 4A).
  • the experimental group was only FITC-BSA (200 ug), NCCF127) + FITC-BSA, NC (F68) + FITC-BSA, Chito-NC (F127) + FITC-BSA, Chito- NC (F68) + FITC-BSA, Only chitosan and Chit F127.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention showed very good skin permeability compared to nanocarriers [NC (F127) and NCXF68) without chitosan conjugated.
  • the chitosan-modified nanocarriers of the present invention showed very good skin permeability compared to Chito-F127, in which chitosan was conjugated to a fluoropolymer but not photocrosslinked.
  • 4C is a fluorescence image obtained by applying a FITC-BSA-containing chitosan-modified nanocarrier to human skin.
  • squamous cell carcinoma SCC7 was cultured in vitro to examine cell influx.
  • SCC7 squamous cell carcinoma
  • chitosan-modified nanocarriers were very high cell influx compared to bare nanocarriers. This increased in vitro cell influx is closely associated with in vivo tumor accumulation in tumor mouse models into which SCC7 cells have been implanted (FIGS. 5B, 5C and 5D).
  • Figure 5b Time-dependent emission profiles and tumor accumulation of the nanocarriers were clearly visualized by monitoring real-time near infrared fluorescence intensities.
  • bare nanocarriers [NC (F68) and! (F127)]
  • the fluorescence intensity at the tumor site decreased rapidly within 16 hours after injection.
  • the high fluorescence intensity of the chitosan-modified nanocarriers of the present invention was maintained for up to 72 hours at the tumor site.
  • the ability of the chitosan-modified nanocarrier to increase tumor cell influx and the ability to accumulate tumor tissue suggests that the chitosan-modified nanocarrier can be used as a therapeutic agent for photothermal cancer.
  • the photothermal cancer treatment of chitosan-modified nanocarriers was investigated.
  • gold nanorods were synthesized in aqueous CTAB solution using a seed-mediated growth method (36).
  • HAuC14 0.5 mM, 5 mL, ojima chemical Co. LTD (Ksashiwabara, Japan) was added to CTAB (0.2 M, 5 mL) and then thoroughly mixed to prepare a gold seed.
  • freshly prepared ice-cold NaBH 4 (0.01 M, 600 pL, Sigma-Aldr ich Corp, USA) under vigorous stirring conditions was added to form a brownish yellow solution. The solution was stored at room temperature for 1-3 hours and used as a seed solution for synthesizing the gold nanorods.
  • HAuC14 (l mM, 5 mL) was added to CTAB solution (0.2 M, 5 mL, Sigma-Aldr ich Corp, USA) under vigorous stirring to prepare a growth solution, and 4 mM AgN03 (silver nitrate).
  • 400 yL and 0.0788 M ascorbic acid (Sigma-Aldr ich Corp, USA) 70 11 L were added to the solution, followed by gentle mixing. During this process the color of the mixture (growing solution) changed from yellow to colorless.
  • 12 seed solution was injected into the growth solution, stirred vigorously, and then continued For 3 hours was placed in the 37 ° C, 100 rpm shaking rocker. The gold nanorod solution was bright purple.
  • the gold nanorod solution was sufficiently purified at least 5 times at 11,000 rpm for 10 minutes in a centrifuge and redispersed in deionized water. Finally, the UV-visible absorption spectrum of the gold nanorods was measured using a UV-spectroportometer (Agi lent 8453, Santa Clara, CA, USA), and the size and aspect ratio of the gold nanorods were measured by transmission electron microscopy (TEM). ; JEM-2100, JEOL, Japan).
  • TEM transmission electron microscopy
  • gold nanorod-containing Pluronic-based nanocarriers were prepared and characterized as follows. To load gold nanorods into Pluronic-based nanocarriers, add gold nanorod solution (50 pg / 100 y L) to powdered nanocarriers (750 ii g) and incubate at 4 ° C for at least 12 hours. Thus, gold nanorods were induced to enter spontaneously into the nanocarrier. Encapsulation efficiency (90% or more) and the amount of gold nanorods contained in the nanocarrier were measured by rotating filtration for 10 minutes at 11,000 rpm at room temperature to remove the unloaded gold nanorods as in the previous studies. (44).
  • Morphology of gold nanorods and gold nanorods containing nanorods were imaged after negative staining with phosphotungst ic acid using TEM (insert of FIG. 7A). Gold nanorods were properly contained in both forms without changing the spheres of the nanocarriers. The particle diameter (hydrodynami c di ameters) and surface charge (zeta potential) of the nanocarriers at 37 ° C were not affected by the inclusion of gold nanorods. As shown in FIG. 7B, the nanocarriers themselves and the gold nanorod-containing nanocarriers have similar average sizes.
  • the zeta potential of the stabilized gold nanorods in the CTAB solution shows a high-positive surface state (+ 36.5 ⁇ 2.4 mV), whereas the gold nanorod-containing nanocarriers exhibit the nanocarriers themselves. It has been shown to have a surface charge similar to the zeta potential, confirming that it is effective in containing gold nanorods in nanocarriers.
  • a nanocarrier solution (100 UL) containing gold nanorods was placed in a dialysis bag (Cellulose ester, 300 kDa MWC0).
  • the dialysis bag was immersed in 5 mL PBS containing 10% fetal bovine serum (Gibco (Grand Is l and, NY, USA)) and the shaking lacquer was operated at 100 rpm at 37 ° C. All released media were refreshed at each time point to maintain maximum sync conditions.
  • the amount of gold nanorods leaking at each time point was analyzed using a UV-spectrophotometer and the concentration was measured by a standard cal ibrat ion curve. As a control, gold nanorods released under the same dialysis bag setup conditions were also analyzed.
  • SCC7 Squamous cel l carcinoma (SCC7) tumor cell line and NIH / 3T3 fibroblasts
  • SCC7 Squamous cel l carcinoma (SCC7) tumor cell line and NIH / 3T3 fibroblasts
  • Both cell types were seeded in 24-well plates at a 5 ⁇ 10 4 cell density and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • Gold nanorods or gold nanorods containing nanocarriers (containing 6.7 wt% gold nanorods) were then added to the plate wells in the range of 1-250 yg / mL (based on the gold nanorods). The cells were further incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • the medium was then replaced with 825 pL of fresh medium containing 10-fold diluted WST-l (Biovision Inc., Mountain View, USA), and the cells were incubated for another 2 hours at 37 ° C.
  • a scanning multiwell spectrophotometer FL600, Bio-Tek ® ' Vermont, USA
  • cytotoxicity of the Pluronic-based nanocarrier itself in SCC7 cells was applied (33), and cytotoxicity to NIH / 3T3 fibroblasts was specified using the same protocol.
  • Cells containing gold nanorods or gold nanorods-containing nanocarriers were incubated for 2 hours to allow cell influx in the culture medium. After incubation, the cells were washed with PBS solution and fixed in PBS containing 4% formalin solution for 30 days; Fixed cells were washed with PBS and then again with deionized water. Washed. Light scattering images were recorded using a dark field microscope (ECLIPSE L150, Nikon, Tokyo, Japan) with a TV lens C-0.45 camera.
  • ca CW Ti-sapphire l aser (MIRA 900, Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA) A laser light of 780 ran with a 1.3-hole diameter-size and different power densities (41.5 and 26.4 W / cm 2 ) was irradiated for 4 minutes per well.Cell viability was measured by acridine orange (AO, Sigma-Aldrich Corp.). , St. Loui s, M0, USA) and propidium iodide (PI, Sigma-Aldrich Corp., St.
  • A0 to green Fluorescence refers to living cells
  • PI red fluorescence
  • 1 mL of medium containing 0.67 ⁇ A0 and 75 ⁇ PI was added to each well and incubated in the dark for 30 minutes at 37 ° C. After washing, live and dead cells were visualized using an inverted fluorescence microscope (TE2000-U, Nikon, Melville, NY, USA).
  • Gold nanorods or gold nanorods containing gold nanorods were treated with tumor cells and fibroblasts, followed by 780 at different power densities (41.5 and 26.4 W / cm 2 ). A laser of nm wavelength was irradiated for 4 minutes. Cells were then stained with acridine orange and propidium iodide to determine cell viability.
  • SCC7 cells (lxlO 6 in 50 pL PBS) were injected into the subcutaneous layer on both the left and right sides of the mammary gland nude mouse (CAnN.Cg-Foxn) at 6-7 weeks of age. If the tumors were approximately 5 mm in diameter, the gold nanorods or gold nanorods containing nanocarriers (100 P g for gold nanorods) suspended in 85% physiological saline (100 iiL) were excreted through the vein. Injected intravenously; Physiological saline is used as a control.
  • liver and tumor tissues were obtained from mice 24 hours after iv injection. Tumor and liver tissues were dissected and fixed in 4% formalin solution for 24 hours and inserted into optimal cleavage temperature (OCT) compounds (Tissue-Teks; Sakura Finetek, Kyoto, Japan). To freeze sections, the blocks were frozen and sectioned at -20 ° C. Tissue sections were then stained for 10 minutes using a silver enhancer kit (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Mo., USA) according to the manufacturer's instructions. Stained tissue Sections were examined by inverted fluorescence microscopy.
  • OCT cleavage temperature
  • mice left tumor: no laser irradiation vs. right tumor: laser irradiation.
  • near-infrared light 808 nm diode laser, 900 mW, 5 ⁇ m diameter at ca 4 W / cm 2 , Power Technologies, Alexander, AR, USA
  • the mouse contained ⁇ . ⁇ .
  • Near infrared was irradiated for 4 minutes after 24 hours and after 48 hours of injection.
  • tumor size was measured with a digital caliper after treatment and pictures were taken with a digital camera. All measurements were taken three times.
  • Statistical analysis was performed by Student t-test, and all comparison experiments were set to the minimum significance level of p ⁇ 0.05.
  • FIG. 11 is a silver-stained image of representative regions of tumors and livers from mice treated with gold nanorod samples or physiological saline as negative controls.
  • Chitosan-modified nanocarriers containing gold nanorods showed very high intensity (dark color) in tumor cells, indicating that selective delivery to tumor cells occurs more effectively.
  • the gold nanorods were processed directly, the silver-stained images were the strongest in the liver, indicating that the gold nanorods themselves had a great influx into the liver.
  • the influx into tumor cells was slightly increased, and the influx into hepatocytes was slightly decreased.
  • the treatment of chitosan-modified nanocarriers shows that the influx of tumor cells to the staining assay increases significantly.
  • mice were exposed to near-infrared laser irradiation (808 nm, 4 W / cm 2 ) for 4 minutes after intravenous infusion ( Left tumors: no laser irradiation vs. right tumors: laser irradiation).
  • laser irradiation 808 nm, 4 W / cm 2
  • gold nanorod-containing nanocarriers showed strong inhibition of tumor growth, whereas there was no statistical difference in tumor regression compared to the results of the salt-treated group when gold nanorods were directly treated. .
  • chitosan-modified nanocarriers showed significant inhibition of tumor growth compared to bare morphology; There was no growth of tumor volume for 1 week, and a slow increase in tumor volume was observed after one laser irradiation, which was chitosan-modified. It has clearly demonstrated the effective tumor accumulation and very effective photothermal effects of nanocarriers.

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Abstract

본 발명은 말단에 있는 광가교결합 가능한(photo-crosslinkable) 작용기를 통하여 가교결합되어 있는 수용성의 생체적합성 중합체에 키토산이 결합된 생체중합체-개질 나노운반체로서, 상기 키토산-개질 나노운반체는 온도 변화에 따라 직경이 변화되며 키토산이 결합되지 않은 bare 나노운반체와 비교하여 피부 투과도 또는 세포 유입도(cellular uptake) 및 암조직으로의 선택적 전달이 증가되고, 광열치료에 유리한 특성을 나타낸다. 본 발명의 키토산-개질 나노운반체는 키토산이 없는 bare 나노운반체와 비교하여 매우 놀라운 수준으로 피부 투과도가 개선되어, 경피 운반체로서 매우 우수한 효능을 발휘한다. 본 발명의 키토산-개질 나노운반체는 종양세포 및 암세포로의 세포 유입도가 크게 개선되어, 종양세포 및 암세포의 이미징 및 광열 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
피부투과도， 세포유입 및 종양전달성 이 증가된 나노운반체 【기술분야】
본 발명은 피부투과도, 세포유입 , 그리고 혈관 투여 시 암전달성이 증가된 나노운반체에 관한 것이다.
【배경기술】
치료용 단백질이나 약물들을 생체 내로 전달하기 위해 사용되는 대부분의 나노입자들은 유기 용매를 사용하는 유제증발 (emul sion evaporat ion) 방법을 통하여 제조되기 때문에， 제조부터 건조 시까지의 제조 공정의 복잡성과 시간이 많이 걸리고 유기 용매의 사용에 따른 비용도 증가하며 또한 유기 용매의 사용에 따른 생체 내에 문제점을 야기시킬 수 있다 (T. G. Park, et al . , Biomacromolecules 8 (2007) 650-656； T. G. Park, et al . , Biomacromolecules 7 (2006) 1864-1870； D. T. Bi rnbaum, et al . , J. Control. Rel . 65 (2000) 375-387) . 이 러한 이유로 많은 연구자들은 나노입자에 충진되는 약물의 변성 및 그들의 안정성 확보를 위하여 새로운 나노입자 제조기술 개발에 많은 시간을 투자하고 있다.
유제증발 방법의 문제점들을 해결하기 위해서 다른 연구자들은 초임계 유체를 사용하여 나노입자를 제조하였다. 그러나 이 공정은 대부분의 의료용 고분자들이 초임계 유체에 용해성이 제한적이어서 널리 사용되지 못하고 있다 (K. S. Soppimath et al . , J. Control. Rel. 70 (2001) 1-20) .
또한 미국특허 제 5,019 ,400 호에서도 생체적합성 고분자인 폴리 (D,L- 락트산 -co-글리콜산) (이하 'PLGA' )를 초저온 냉매에 분사하여 단백질 약물 전달용 마이크로 입자를 제조하였지만， PLGA 를 용해하기 위해 사용되는 유기용매의 소수성으로 인하여 문제점이 발생하였다. 또한 미국특허 제 6 , 586， 011 호에서도 단백질 전달용 나노입자 시스템을 초저온 넁매에 분사하는 방식으로 제조하였는데 , 나노입자 제조 시에 사용되는 가교제로 인하여 단백질의 안정성에 심각한 문제점이 야기되었다. 또한 나노입자를 제조하는 방법으로 용매 증발법 (solvent evaporation)이 사용되지만 이 방법 역시 유기 용매의 사용으로 인하여 여러 문제점들을 야기시켰다. 한편, 소수성과 독성이 강한 유기 용매의 사용 대신 물과 잘 섞이는 유기 용매 (아세톤 등)를 사용하여 폴리 (D,L-락트산) (이하 'PLA' ) 나노입자를 제조하는 염 침출법 (sal ting-out)도 개발 되었었지만 단백질 약물의 활성저하 및 안정성 문제는 해결되지 못하였다 (E. Allemann et al .， Pharm. Res. 10 (1993) 1732-1737).
한편， 대표적인 천연 중합체 중에 하나인 키토산에 의한 변형 (modification) 또는 기능화 (funct ionalizat ion)관 관련하여， 대한민국 특허 제 766820 호는 폴리머의 일종인 단백질에 키토산을 기능화시켜 단백질의 경점막 운반을 개선한 발명을 개시하고 있다. 또한， W0 2008/136773 은 키토산으로 표면변형된 나노입자를 개시하고 있으며， 이러한 나노입자의 경우 분자이미징제， 바이오센싱제 및 DDS(drug delivery system)로사용될 수 있음을 개시하고 있다.
한편， 약물의 경피 투여는 일정속도로 지속적인 약물 전달이 가능하고， 부작용 가능성을 감소시킬 수 있으며， 치료효과를 증진할 수 있고, 경구투여시의 낮은 생체이용를을 극복할 수 있으며, 투여횟수를 줄일 수 있고, 필요시 약물투여 중단이 용이하다는 장점이 있다.
그러나, 경피 투여제의 개발에 있어서 특히 분자량이 큰 단백질과 같은 바이오의약의 경피 투여제를 개발하는 데 있어서 아직까지는 만족할만한 경피 투여제가개발되어 있지 않다.
고형 종양들의 광열 치료 (또한광열 어블래이션 (ablation)로도 언급된다), 광열방산 또는 광학적 온열 현상)는 최소한의 침습적인 방식으로 고형 종양을 치료하는 관심을 끄는 방식이다 (1-6). 전형적으로 비 방사성 메커니즘을 통하여 흡수된 빛을 국부적인 열로 전환시키는 단계를 포함하는 이 기술은 상대적으로 암세포 어블래이션을 위한사용이 간단하며 빠른 회복, 낮은 합병 증세들 및 짧은 입원기간과 같은 여러 장점들을 가지고 있을 것이다 (7). 특히 이러한 방법에 쓰이는 근적외선 (NIR)은 일반 조직의 낮은 근적외선의 흡수로 기인하여 일반적인 생체 조직의 손상 없이 높은 공간적인 정밀성을 갖고 깊숙한 조직 침투가 가능하다 (8-10). 몇 가지 나노구조체들， 예컨대 집합적 금 나노입자 (11)， 금 나노껍질 (12- 14) , 금 나노캐이지 (15) , 빈 AuAg 덴드라이트 (7)， 금나노막대기 (Gold Nanorod, (금나노막대 ) )(16-18) 및 탄소 나노튜브 등이 NIR 광 활성적 암 치료를 위해 조사되었다. 이들 중에서 플라스몬 -공진 금나노막대는 상당한 흥미를 불러일으켰는데， 그 이유는 빛의 흡수 영 역을 가로세로비 (aspect rat io)를 이용하여 미세조정이 가능한데， 이는 플라스몬 -공진 금나노막대가 효과적인 대규모 합성의 장점， 쉬운 기능화， 높은 광열 전환성 및 콜로이드 안정성을 가지고 있기 때문이다 (20"21) . 이러한 장점들에도 불구하고， 금나노막대의 표면에서 합성과 둘러싸는 동안에 주형으로 이용되는 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)의 과다 잔류로 인한 약간의 세포독성로 인하여， 임상적 적용은 제한적일 수 있다 (18) . 그래서 , 금나노막대의 표면 치환으로 세포 독성 효과를 줄이기 위한 보고들이 있어왔다: 예를 들어， 포스파티딜콜린 (PC)이 처리된 금나노막대， {폴리 (4- 스타이렌술폰산) (PSS)}이 코팅된 나노 막대기 , 금나노막대가 끼워진 중합체적인 나노입자 및 PEG 가 처리된 금나노막대들은 CTAB 로 덮은 금나노막대보다 낮은 세포 독성을 보인다.
게다가, 금나노막대를 목적종양에 선택적으로 전달하는 것은 효과적인 광열 암 치료를 위한 또 다른 중요한 문제이다. 앱타머 (Aptamer)-결합 금나노막대 및 RGD 결합 덴드라이머로 처리된 금나노막대들은 선택적이고 효율적 인 목적종양 세포들의 광열 치료를 증명하였다. 비록 이러한 특이기질과 결합한 금나노막대가 세포실험 ( / ? 에서는 암 세포들의 광열적 치료가 효과적이지만， 동물실험 인 에서 광열 치료 효과는 혈관 순환 시 간으로의 많은 축적으로 인하여 제한적이었다. 금나노막대의 딱딱하고 굳은 특성에 의해서 정맥 내 주입 후 0.5 시간 후 CTAB-안정화된 금나노막대의 간에서 높은 수준의 국부화가 보고되었다 (27) . 이러한 동물실험에서의 광열 암 치료시 금나노막대의 제한적인 효과를 극복하기 위해， 금나노막대의 페그화 (PEGyl at ion)기술이 도입되었으나 (27)， 아마도 빠른 체외 배출에 의해서 (1 시간의 반감기 )， 광열 암치료 효과가 제한적이었다. 그래서 종양 부위 안으로 금나노막대의 효율적인 전달을 위한 새로운 방법이 고안될 필요가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 온도 민감성을 나타내면서 경피투여를 위한 피부 투과도가 크게 개선되고， 세포 유입도， 암 조직으로의 선택적 전달성 및 광열치료에 유리한 나노운반체를 제조하고자 노력하였다. 그 결과， 광가교결합 가능한 작용기를 갖는 수용성의 생체적합성 중합체 및 키토산으로 나노운반체를 제작하는 경우에는 상기 개선된 특성을 가지는 나노운반체가 제조될 수 있음을 확인함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 피부 투과도, 세포 유입도 (cel lul ar uptake) 및 암조직로의 전달성이 증가되고 광열 치료에 유리한 나노운반체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경피 투여용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체적용시 (Jn vivo) 종양 또는 암의 영상용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 광열 암 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부 투과도， 세포 유입도 (eel hilar uptake) , 또는 암조직의로의 전달성 이 증가된 것을 특징으로 하는 키토산 -개질 나노운반체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 말단에 있는 광가교결합 가능한 (photo-crossl inkabl e) 작용기를 통하여 가교결합되어 있는 수용성의 생체적합성 중합체에 키토산이 결합된 키토산 -개질 나노운반체로서， 상기 키토산- 개질 나노운반체는 온도 변화에 따라 직경이 변화되며 키토산이 결합되지 않은 bare 나노운반체와 비교하여 피부 투과도， 세포 유입도 (eel hil ar uptake) , 암 조직으로의 선택적 전달성 또는 광열효과 (photothermal effect )가 증가된 나노운반체 (nano-carr ier)를 제공한다. 본 발명자들은 온도 민감성을 나타내면서 경피투여를 위한 피부 투과도가 크게 개선되고， 세포 유입도， 암 조직으로의 선택적 전달성 및 광열치료에 유리한 나노운반체를 제조하고자 노력하였다. 그 결과， 광가교결합 가능한 작용기를 갖는 수용성의 생체적합성 중합체 및 키토산으로 나노운반체를 제작하는 경우에는 상기 개선된 특성을 가지는 나노운반체가 제조될 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 "생체적합성 중합체" 는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직올 괴사시키거나 혈액을 웅고시키지 않는 조직적합성 (t i ssue compat ibi l ity) 및 항웅혈성 (blood compat ibi 1 i ty)을 가지고 있는 고분자를 의미한다. 용어 "수용성의 생체적합성 중합체" 는 물 또는 물—혼합성 용매 (water- miscible solvent : 예컨대， 메탄올， 에탄올 , 아세톤， 아세토니트릴， Ν,Ν- 다이메틸프름아마이드 및 다이메틸설폭사이드)에 용해되는 생체적합성 중합체， 바람직하게는 물에 용해되는 생체적합성 중합체를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 이용될 수 있는 수용성의 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드， 폴리비닐알코올， 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체， 알킬샐를로오스， 하이드록시알킬 샐를로오스， 해파린 , 히아루론산， 덱스트란 또는 알지네이트 구조를 갖는 중합체이다. 상기 수용성 생체적합성 중합체 중에서， 소수성 및 친수성 부분을 가지고 있어서 계면활성제와 유사한 양상을 나타내는 중합체를 이용하는 경우， 바람직하게는 이 중합체에 소수성 부분을 추가적으로 도입시키는 것이 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 목적에 적합하다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용될 수 있는 수용성의 생체적합성 중합체는 폴락사머 계열의 중합체이다.
가장 바람직하게는， 본 발명에서 이용될 수 있는 수용성의 생체적합성 중합체는 하기 화학식 1 로 표시되는 중합체이다:
화학식 1
(PC1)-(PE)X-(PP0)V-(PE)2-(PC2) 상기 화학식에서， PE 는 에틸렌옥사이드， PP0 는 프로필렌옥사이드， PC1 및 PC2 는 광가교결합 가능한 작용기를 나타내고, X , y 및 z 는 각각 독립적으로 1- 10,000 의 정수이다.
광가교결합 가능한 (photo-crossl inkable) 작용기는 생체적합성 중합체의 양 말단에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 상기 광가교결합 가능한 작용기는 c=c 이중결합을 갖는 작용기 이다.
보다 바람직하게는， 광가교결합 가능한 작용기는 아크릴레이트, 다이아크릴레이트， 올리고아크릴레이트， 메타크릴레이트， 다이메타크릴레이트， 올리고메타크릴레이트, 쿠마린， 타이민 또는 시나메이트이고， 보다 바람직하게는 아크릴레이트, 다이아크릴레이트, 올리고아크릴레이트， 메타크릴레이트， 다이메타크릴레이트 또는 올리고메타크릴레이트이며， 가장 바람직하게는 아크릴레이트이다.
본 발명에서 이용되는 광가교결합 가능한 작용기로 가교결합 된 수용성의 생체적합성 중합체는 적합한 키토산으로 개질 (modi f i cat ion) 되어 있다.
본 발명에서 수용성의 생체적합성 중합체를 개질하기 위하여 사용되는 키토산은 당업계에 공지된 어떠한 키토산도 포함하며 , 바람직하게는 키토산， 해파린， 알지네이트， 히아루론산， 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 5- 설페이트 (dermatan 5-sul fate) , 케라탄 설페이트， 샐를로오스， 헤미 샐를로오스， 카복시메틸 셀를로오스， 텍스트란 및 텍스트란 설페이트 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합이며， 가장 바람직하게는 키토산이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 키토산은 광가교결합 가능한 (photo- cross l inkabl e) 작용기를 통하여 상기 수용성 생체적합성 중합체에 결합되어 있다. 키토산에 있는 광가교결합 가능한 작용기는 위에 기재된 바와 같다.
한편， 본 발명에서 생체적합성 중합체를 개질하기 위하여 사용되는 키토산의 가장 바람직한 예로서의 키토산 (chi tosan)은 자연계에 샐를로오스 다음으로 가장 많이 존재하는 천연 유기 고분자이며， 해마다 1 ,000 억 톤 이상 생산되는 키틴으로부터 제조되는데， 게 , 새우 등의 갑각류， 메뚜기 , 잠자리 등 곤층류 , 팽이버섯， 표고버섯 등의 버섯류， 세균의 세포막 등에 분포하고 있는 키틴을 탈아세틸화 시켜 얻는다. 화학적 구조면에서 보면， N-아세틸 -D_ 글루코사민 (N-acetyl-D~glucosamine) 단량체가 β-1,4 결합의 직쇄상으로 연결된 키틴에서 아민기에 존재하던 아세틸기가 제거되어 키토산이 형성된다 (Errington N, et al . , Hydrodynamic character izat ion of chi tosan varing in molecular weight and degree of acetyl at ion. Int J Biol Macro/no 1. 15:1123-7(1993)). 키토산은, 키틴과 비교할 때 아민기에 존재하던 아세틸기가 제거되었으므로 산성 용액에서 다중양이온 (polycation)으로 존재하게 된다. 따라서 산성 수용액에서 물에 대한 용해성이 좋아지므로 가공성이 우수하고 건조후의 기계적 강도가 비교적 우수하므로 분말， 섬유, 박막, 겔， 구슬 등의 형태로 성형되어 사용된다 (E. Guibal, et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37:1454-1463(1998)). 키토산은 연결되어 있는 단량체의 개수에 따라 단량체 12 개 정도 내외의 올리고머와 고분자에 속하는 폴리머로 나뉘고, 폴리머는 분자량 15 만 미만의 저분자 키토산， 분자량 70 만에서 100 만에 이르는 고분자 키토산， 그리고 그 사이의 범위를 가지는 중분자 키토산으로 나뉘어진다. 키토산은 안정성과 환경 친화성， 생분해성 및 생체적합성이 우수하여 여러 산업과 의료용 분야에 많이 활용되고 있다. 또한, 키토산은 안전하고 면역촉진 부작용도 없는 것으로 알려졌다. 생체 내에서는 라이소자임 (lysozyme)에 의해 세틸글루코사민으로 분해되고， 이는 당단백질 합성에 사용된 후 이산화탄소의 형태로 배출된다 (Chandy T, Sharma CP. Chi tosan as a biomaterial - Biomat Art Cells Art Org. 18： 1-24(1990)) .
본 발명은 생체적합성이 우수한 키토산을 다른 생체적합성 중합체와 함께 운반체로 이용한 점에 특징이 있으며， 키토산 -개질 나노운반체가 경피투여제 또는 암 타겟팅 분자로 이용되는 경우 매우 우수한 효능을 발휘한다.
본 발명에서 이용되는 키토산로서， 통상의 어떠한 키토산도 이용 가능하지만， 바람직하게는 분자량 500-20000 의 키토산이다. 본 발명에서 이용되는 키토산의 분자량이 500 미만인 경우에는, 키토산의 전달체로서의 기능이 미약한 문제점이 있고, 키토산의 분자량이 20000 을 초과하는 경우에는， 수용액 상에서 자기집합체를 형성하는 문제점이 있다. 본 발명에서 이용되는 바람직한 키토산은 올리고머 수준의 키토산이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 온도가 감소함에 따라 그 직경이 증가하며， 반대로 온도가 증가하면 그 직경이 감소한다. 바람직하게는, 4°C 조건에서의 키토산 -개질 나노운반체의 직경은 40°C에서의 직경과 비교하여 3-20 배， 보다 바람직하게는 4-15 배， 보다 더 바람직하게는 5-12 배， 가장 바람직하게는 7-10 배 증가된다.
본 발명의 키토산 -개질 나노운반체의 이러한 직경의 증감은 가역적이다. 직경의 증감에 따라 키토산 -개질 나노운반체에 형성된 동공의 크기가 변하게 된다. 예를 들어， 저온 (예컨대， 4°C )에서 동공의 크기가 증가된 키토산- 개질 나노운반체에 운반하고자 하는 약물을 포집 (encapsul at ion)시킨 다음 이를 인체에 적용하게 되면 동공의 크기가 감소되어 포집된 약물의 서방 (sustained rel ease)이 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 온도 민감성 키토산 -개질 나노운반체는 37°C에서의 동공 크기가 3-20 ran 이며， 보다 바람직하게는 3-15 nm, 가장 바람직하게는 5-10 nm 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 수용액 분산상에 분산되어 있는 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 37°C에서의 동공 크기가 3- 20 nm 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 수화젤이 아닌 나노입자 (nanopart i cul ate)이다. 본 발명의 키토산- 개질 나노운반체는 등근 형상을 갖는 나노입자 형 태를 갖는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 나노운반체는 50—500 nm 의 직경， 보다 바람직하게는 100-400 nm, 가장 바람직하게는 120—300 nm 의 직경을 갖는다. 본 발명에 따른 키토산 -개질 나노운반체는 멸균과정을 멸균필터를 사용하여 간단하게 처리할 수 있다는 측면에서 직경이 200 nm 이하인 것이 바람직하다. 또한 키토산 -개질 나노운반체의 다분산 (polydi spersi ty) 지수는 0. 1 이하인 것이 유리하며， 이는 일반적으로 다분산 지수가 0. 1 이하인 경우 안정적인 단분산 분포를 갖는 나노입자로 간주하기 때문이다. 키토산 -개질 나노운반체의 바람직한 다분산 지수는 0.01-0. 1 이다.
본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반될 수 있는 물질은 제한되지 않으며， 치료학적 효능을 나타내는 다양한 물질을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 운반대상의 물질은 단백질， 펩타이드, 핵산분자， 당류， 지 질 , 나노입자， 화합물， 무기물 또는 형광물질이다. 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는특별하게 제한되지 않으며， 호르몬， 호르몬유사체， 효소， 효소저해제， 신호전달단백질 또는 그 일부분， 항체 또는 그 일부분， 단쇄항체， 결합단백질 또는 그 결합도메인， 항원, 부착단백질， 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질， 사이토카인， 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다상세하게는， 본 발명의 약물전달체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 인슐린， IGF-1( insulin-like growth factor 1), 성장호르몬， 에리쓰로포이에틴， Gᅳ CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage—colony -stimulating factors) , 인터페론 알파, 인터페론 베타， 인터페론 감마， 인터루킨 -1 알파 및 베타， 인터루킨 -3， 인터루킨 -4， 인터루킨 -6， 인터루킨 -2， EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌 (calcitonin)， VEGFCvascular endothelial eel 1 growth factor) , FGF(f ibroblast growth factor) PDGF(p late let—derived growth factor) , ACTH (adrenocorticotropic hormone) TGF-β (transforming growth factor beta) , BMP (bone morphogenet i c protein) TNF( tumor necrosis factor), 아토비스반 (atobisban)， 부세레린 (buserel in) 세트로렉릭스 (cetrorelix), 데스로레린 (deslorelin)， 데스모프레신 (desmopressin) 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌 (elcatonin)， 엘레이도신 (eleidosin) 엡티피바타이드 (eptif ibatide), GHRH-I I (growth hormone releasing hormone-II) 고나도레린 (gonadorelin), 고세레린 (goserelin) , 히스트레린 (histrelin) 류프로레린 (leuprorelin), 라이프레신 (lypressin) , 옥트레오타이드 (octreotide) 옥시토신 (oxytocin), 피트레신 (pitressin) , 세크레틴 (secret in) 신칼라이드 (sincalide), 테르리프레신 (terl ipressin)， 티모펜틴 (thymopentin) 티모신 (thymosine) αΐ, 트리프토레린 (triptorelin) , 바이발리루딘 (bival irudin) 카르베토신 (carbetocin), 사이클로스포린， 엑세딘 (exedine) 란레오타이드 (lanreotide), LHRH( luteinizing hormone一 re leasing hormone) 나파레린 (nafarelin), 부갑상선 호르몬， 프람린타이드 (praml int ide) , T-20 (enfuvirtide), 타이말파신 (thymal fasin) 및 지코노타이드를 포함하나， 이에 한정되는 것은아니다.
본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반될 수 있는 핵산분자는， 예를 들어 DNA, DNA 앱타머， RNA 앱타머, 라이보자임, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드， siRNA, shRNA, 플라스미드 및 백터 (예컨대， 아데노바이러스 백터， 리트로바이러스 백터)를포함하나， 이에 한정되는 것은아니다.
본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반되는 물질은 바람직하게는 약물이며, 예를 들어， 항염증제， 진통제， 항관절염제， 진경제, 항우울증제， 항정신병약물, 신경안정제， 항불안제, 마약길항제， 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트， 항암제， 항혈관신생억제제， 면역억제제, 항바이러스제， 항생제， 식욕억제제， 진통제， 항콜린제， 항히스타민제， 항편두통제， 호르몬제， 관상혈관, 뇌혈관또는 말초혈관 확장제 , 피임약， 항혈전제， 이뇨제 , 항고혈압제 , 심혈관질환 치료제, 미용성분 (예컨대， 주름개선제， 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
가장 바람직하게는， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반되는 물질은 항암제이다. 본 발명에 적용될 수 있는 항암제는 당업계의 공지된 어떠한 항암제도 포함하며， 예를 들어 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine) , 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란 (melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dact inomycin)， 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin) , 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5- 플루오로우라실 (5-fluorouracil), 아드리아마이신 (adriamycin) , 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate)를 포함하나， 이에 한정되는 것은아니다.
본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반될 수 있는 나노입자는， 예를 들어 금 나노입자， 은 나노입자, 철 나노입자， 전이금속 나노입자 및 금속 산화물 나노입자 (예컨대, 페라이트 나노입자)를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다ᅳ 예컨대， 본 발명의 키토산—개질 나노운반체가 페라이트 나노입자를 운반하는 경우에는 MR(magnetic resonance) 조영제 (imaging agent)로 이용될 수 있다. 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체를 이용하여 형광물질을 운반하는 경우， 바람직하게는 형광물질은 키토산 -개질 나노운반체의 표면에 결합되어 있다. 예를 들어， 형광물질을 단백질 또는 금속 나노입자 (예컨대， 자성 나노입자)에 결합시켜 이용할 수 있다. 상기 형광물질의 예는 플루오로세인과 그 유도체， 로다민과 그 유도체， 루시퍼 엘로우， B-파이토에리쓰린， 9-아크리딘이소티오시아네이트， 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도 -4 ' -이소티오-시아나토스틸벤 -2，2 '-다이설폰산, 7- 다이에틸아미노 _3-(4 ' -이소티오시아토페닐 )-4-메틸쿠마린， 석시니미딜- 파이 렌부티레이트， 4-아세트아미도 -4 ' -이소티오시아나토스틸벤 -2 , 2 ' -다이설폰산 유도체， LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5 , Cy5.5, 리사민 , 이소티오시아네이트， 에리쓰로신 이소티오시아네이트， 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1- 다이메틸아미노나프틸— 5-설포네이트， 1-아닐리노 -8-나프탈렌 설포네이트， 2-p- 토우이디닐 -6-나프탈렌설포네이트， 3—페닐 -7-이소시아나토쿠마린， 9- 이소티오시아나토아크리딘 , 아크리딘 오렌지， N-(p-(2- 벤족사조일릴 )페닐 )멜레이미드， 벤족사디아졸， 스틸벤 및 파이 렌을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 나노운반체에 포함되는 단백질， 펩타이드, 핵산분자， 당류， 지질， 화합물， 무기물 또는 형광물질은 고분자량을 갖는다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 키토산 -개질 나노운반체에 운반대상의 물질을 포집하는 과정에서 단순하게 상기 두 물질을 흔합하면 자연적으로 포집 (spontaneous encapsulat ion)된다는 것이다. 즉, 어떠한 추가적인 처리 없이 나노운반체와 운반대상의 물질이 만날 (contact ing) 수 있는 이벤트만을 주면 운반대상의 물질이 자연적으로 키토산—개질 나노운반체에 함유되는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 약물을 키토산 -개질 나노운반체에 포집시키는 경우 유기 분산상을 사용하지 않으며 수용액 분산상에서 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 포집시키는 단계는 0-20 °C , 보다 바람직하게는 4-10°C , 가장 바람직하게는 4-6°C의 온도 조건에서 실시한다.
본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 의한 수용액상에서의 자연적 포집은 함유되는 약물 , 특히 단백질 의약의 안정성을 크게 증가시킬 수 있는 이 점이 있다. 자연적 포집에 의해 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체에 약물이 함유 되지만， 포집 효을 ( encapsulation efficiency)은 90% 이상으로 매우 높다. 또한， 약물이 함유되는 과정에서 유기용매가 이용되지 않고, 고속균질화과정 또는초음파처리 과정을 필요로 하지 않기 때문에， 본 발명의 방법은 함유되는 약물의 변성 또는 응집을피할수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체의 표면에는 타겟팅 리간드가 결합될 수 있다. 상기 타겟팅 리간드의 예는 호르몬， 항체， 세포 -접착 단백질 (eel卜 adhesion molecules), 당류 및 신경전달자를포함하나， 이에 한정되는 것은아니다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 운반 대상의 물질을 포함하는 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 대상 (subject)에 접촉시키는 단계를 포함하는 운반대상 (cargo)의 운반방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 온도 변화에 따라직경이 변화되며 키토산이 결합되지 않은 bare나노운반체와비교하여 피부 투과도， 세포 유입도 (cellular uptake) 또는 암조직의로의 전달성이 증가된 것을특징으로하는 키토산 -개질 나노운반체의 제조방법을 제공한다:
(a) 광가교결합 가능한 (photo-crosslinkable) 작용기를 갖는 수용성의 생체적합성 중합체의 분산액을준비하는단계;
(b) 광가교결합 가능한 (photo-crosslinkable) 작용기를 갖는 수용성의 키토산분산액을준비하는단계;
(c) 상기 생체적합성 중합체의 분산액과 키토산 분산액의 혼합물을 준비하는단계 ;
(d) 상기 흔합물에 개시제를 첨가하는 단계; 및
(e) 상기 (d)의 결과물에 광을 조사하여 상기 중합체와 키토산을 가교결합시켜 키토산 -개질 나노운반체를 제조하는단계.
본 발명의 방법에 적합한 개시제는 특별하게 제한되지 않는다. 바람직하게는， 본 발명에 이용될 수 있는 개시제는자외선 또는 가시광선의 조사에 의해 라디칼 (radical) 반응을 유발 할 수 있는 라디칼 광개시제 (radical photoinitiator)이다. 본 발명에 이용될 수 있는 광개시제의 예는 에틸 에오신, 2 ,2-다이메톡시 -2—페닐 아세토페논， 2—메특시 -2-페닐아세토페논, 2-하이드록시 -1- [4-(2-하이드록시에톡시)페닐] -2-메틸 -1-프로판온 (Irgacure 2959 또는 Darocur 2959) , 캠포르퀴논0；311113110 11^1006)， 아세토페논， 아세토페논 벤질 케탈, 1- 하이드록시사이클로핵시 페닐 케톤, 2, 2-다이메톡시 -2-페닐아세토페논, 잔톤, 플루오레논， 벤즈알데하이드， 플루오렌， 안트라퀴논， 트리페닐아민, 카르바졸， 3- 메틸아세토페논， 4-클로로벤조페논， 4，4'-다이메특시벤조페논， 4，4'- 다이아미노벤조페논， 벤조인 프로필 에테르, 벤조인 에틸에테르， 벤질 다이메틸 케탈， , 1-(4-이소프로필페닐) -2-하이드톡시 -2-메틸프로판 -1-온, 2-하이드록시 -2- 메틸 -1-페닐프로판 -1-온， 티옥산톤， 다이에틸티옥산톤， 2-이소프로필티옥산톤， 2— 클로로티오티옥산톤, 2-메틸 -1-[4- (메틸티오)페닐] -2-모르포리노-프로판 -1-온， 2, 4,6-트리메틸벤조일 다이페닐포스핀 옥사이드 및 bis-(2,6-다이메톡시벤조일) - 2,4, 4-트리메틸펜틸포스핀 옥사이드를포함한다.
하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 Irgacure 2959 를 사용하였으며 이는 생체 내 독성이 매우 적은 개시제로 알려져 있다 (Kristi S. Anseth, et al - , Cytocompat ibi 1 ity of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. , 2000. 11(5) :P.439-457) .
단계 (e)에서 가시광선 또는 자외선을 조사함으로써 중합체 및 키토산의 광가교결합 가능한 작용기를 통하여 중합체 및 키토산을 가교결합시켜 나노운반체를 제조한다. 바람직하게는, 가교결합을 위하여 자외선이 이용된다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면， 자외선 조사를 위하여 박층 크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)용자외선 램프가 이용될 수 있으며， 이는다른 경화용자외선 램프에 비해 가격이 저렴하고， 쉽게 구할수 있는 장점을 가지고 있으며 , 특정 365 nm 파장의 자외선 조사에 의해 자유 라디칼을 발생 시키는 개시제 (예컨대， Irgacure 2959)에도 적합하다.
본 발명의 바람직한구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(e)는유기 분산상을 사용하지 않으며 수용액 분산상 단독에서 실시되는 것이다. 즉， 단일상 (single phase)에서 나노운반체의 제조가 모두 이루어진다. 보다 상세하게는, 생체적합성 중합체, 키토산 및 개시제가 분산된 수용액에 광을 조사함으로써， 나노운반체의 완전한 제조가이루어진다. 더욱이， 본 발명의 반응은 one-pot 반웅으로실시될 수 있다. 이러한 측면에서， 본 발명의 방법은 "원 -팟， 단일상 합성방법 (one-pot , singl e phase synthes i s) " 이라 할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면， 종래 기술의 문제점 , 예컨대 유해한 유기용매의 이용, 복잡한 과정， 높은 생산 단가 및 낮은 함유 능력 등을 해결할 수 있다. 또한 종래기술에서 통상적으로 이용되는 고속 균질화 과정 또는 초음파 처리 과정을 필요로 하지 않기 때문에 , 본 발명의 방법은 함유되는 약물의 변성 또는 웅집을 피할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 포함하는 경피 투여용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 운반 대상의 물질을 포함하는 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 대상 (subject )의 피부에 접촉시키는 단계를 포함하는 운반 대상의 경피 운반 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 , 본 발명은 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 포함하는 인 비보 종양 또는 암 이미징용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 대상 (subject )의 인 비보 종양 또는 암 이미징 방법을 제공한다: (a) 운반 대상의 물질을 포함하는 상술한 키토산 -개질 나노운반체의 진단학적 유효량을 상기 대상 (subject )에 투여하는 단계 ; 및 (b) 상기 대상을 스캐닝 하여 가시적 (vi sible) 이미지를 얻는 단계를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 포함하는 광열 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 , 본 발명은 운반 대상의 물질을 포함하는 상술한 키토산 -개질 나노운반체의 치료학적 유효량을 대상 (subject )에 투여하는 단계를 포함하는 광열 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물들은 유효성분으로서 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 포함하기 때문에， 이들 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 결합되지 않은 나노운반체와 비교하여 매우 우수한 피부 투과도를 나타낸다. 또한， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 결합되지 않은 나노운반체와 비교하여 종양세포 또는 암세포의 세포유입도가 매우 크며 , 이 러한 특성은 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체가 생체 ( in vivo) 종양 또는 암의 영상화용 조성물 및 광열 암 치료용 조성물로 이용될 수 있음을 보여준다.
본 발명의 경피 투여용 조성물은 기본적으로 약제학적 조성물이며， 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 경피 투여용 조성물에 이용되는 키토산 -개질 나노운반체에 의해 운반되는 물질은 특별하게 제한되지 않으며， 바람직하게는 피부 또는 두피에서 효능을 발휘하는 주름개선제 , 보습제， 여드름 치료제， 검버섯 제거제， 피부탄력 개선제， 발모촉진제 , 피부노화 방지제 또는 피부표피 줄기세포 증식제이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 경피 투여용 조성물에서 나노운반체는 고분자량의 단백질， 펩타이드， 핵산분자， 당류， 지질 , 화합물 또는 무기물을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "고분자량" 은 피부 (바람직하게는 인간 피부)를 투과할 수 없는 크기의 분자량을 의미하며， 바람직하게는 고분자량은 500 Da 이상의 분자량을 가지는 물질을 의미한다. 일반적으로， 500 Da 이하의 분자량을 가지는 물질이 피부투과를 할 수 있다고 알려져 있다 (Bos JD, et al . , Exp. Dermatol 9： 165-169(2000) ) .
상술한 바와 같이， 본 발명의 나노운반체는 피부투과도가 크게 향상되어， 피부투과가 불가능하다고 판단되는 고분자량의 물질 (예컨대， 단백질 약물)을 포집하여 경피 전달을 가능하게 한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서 , 락토스, 텍스트로스， 수크로스, 솔비틀， 만니를, 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈， 샐를로스, 물， 시 럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제 , 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제 , 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington 's Pharmaceutical Sciences ( 19th ed. , 1995)에 상세히 기 재되어 있다.
본 발명의 경피 투여용 약제학적 조성물은 경피 투여 방식으로 투여된다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법 , 투여 방식， 환자의 연령， 체중 , 성， 병 적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적 인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 약제학적 조성물의 1 일 투여량은 0.001-100 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명 이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형 제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형 태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형 태이거나 엑스제， 분말제， 과립제， 정제 또는 갑셀제 형 태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 경피 투여용 약제학적 조성물은 다양한 대상 (바람직하게는， 포유동물， 가장 바람직하게는 인간)의 피부에 접촉시켜 운반 대상의 물질을 경피 운반한다.
본 발명의 광열 암 치료용 조성물은 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체가 종양 세포 또는 암 세포 유입도가 매우 높은 특성을 이용한 것이다.
본 발명의 광열 암 치료용 조성물에 있어서， 이용될 수 있는 약제학적 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화 방법은 상기 경피 투여용 조성물에서의 기재를 인용하여 설명될 수 있다.
본 발명의 광열 암 치료용 조성물에 이용되는 키토산 -개질 나노캐리어는 광민감제 (photosensi t izer ) 또는 열 발생물질로서 적합한 물질， 바람직하게는 금속 입자를 포함한다. 상기 금속 입자는 예를 들어 , 금 입자, 실리콘 입자 및 자성나노입자 (예컨대 , 산화철 나노입자， 페라이트 , 마그네타이트 혹은 퍼멀로이 (permal loy) )를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 광열 암 치료용 조성물은 바람직하게는 전자기 조사 (el ectromagnet ic radi at ion)에 의해 열을 발생시킨다. 예를 들어 , 금 입자가 이용되는 경우에는 적외선 ( infrared) 레이저를 조사하여 열을 발생시켜 종양 또는 암 세포를 사멸시킨다. 자성나노입자가 이용되는 경우에는， 고주파의 자기장이 부가하여 열을 발생시킨다.
본 발명의 광열 암 치료용 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우， 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 종양내 주입 또는 병변내 ( intralesional ) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법 , 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성 , 병적 상태， 음식 , 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 본 발명의 약제학적 조성물의 1 일 투여량은 0.001-100 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제 , 분말제， 과립제， 정제 또는 캅샐제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 광열 암 치료용 조성물은 위암， 폐암， 유방암, 난소암, 간암， 기관지암， 비인두암， 후두암， 췌장암, 두경부암， 방광암, 결장암, 자궁경부암， 뇌암, 전립선암， 골암， 피부암, 갑상선암， 부갑상선암 및 요관암 등과 같은 다양한 암 질환에서 암 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 , 본 발명은 상술한 키토산 -개질 나노운반체를 포함하는 생체 vivo) 종양 또는 암 영상용 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증한 바와 같이， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 종양 세포 또는 암 세포 유입도가 매우 높기 때문에 생체 ( //? vivo) 종양 또는 암 영상제로 이용될 수 있다.
이 경우， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 적합한 조영제 또는 이미징제를 포함한다. 예를 들어， 생체 (//? vivo) 종양 또는 암 영상을 광학적 형광으로 하는 경우에는 적합한 형광물질을 키토산 -개질 나노운반체의 내부에 포집시키거나 혹은 키토산 -개질 나노운반체의 표면에 결합시켜 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 형광물질의 예는상술한바와같다.
생체 vivo) 종양 또는 암 영상을 자기공명영상 (MRI) 방식으로 하는 경우에는 적합한 T1 또는 T2 조영을 위하여， 상자성 (paramagnetic), 초상자성 (superparamagnetic) 또는 양성자밀도 (proton density) 신호 발생 입자를 키토산 -개질 나노운반체에 포함시킬 수 있다. 예를들어, Gd(in), Μη(Π), Cu(n), Cr(in), Fe( Π ) , Fe(m), Co( Π ) , ΕΓ(Π), Νί(Π ) , Eu(IE), Dy(in), 순수 철, 자성 산화철 (예컨대， 마그네타이트, Fe304), Y-Fe203, 망간 페라이트, 코발트 페라이트， 니켈 페라이트 및 퍼플루오로카본이 조영제로포함될 수 있다.
본 발명의 이미징 조성물을 이용하여 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자방출 단층촬영 (PET, Positron Emission Tomography) 이미지를 얻는 경우, 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 양전자방출동위원소를 포함할 수 있으며， 예컨대 nC, 130， 140， 150， 12N, 13N, 15F, 17F, 18F, 32C1, CI, ^Cl , 43Sc, "Sc, 45Ti , 51Mn, 52Mn, 52Fe, ¾, 56Co, ¾, 61Cu, 62Cu, 62Zn, ¾, 66Ga, 66Ge, 67Ge, a, 69Ge, 69As,
70As, 70Se, 71Se, 71As, 72As 73Se, 74 r, 74Br, 75Br, 76Br, 77Br, " r, 78Br, 78Rb, 79Rb, 7¾r ,81Rb, 82Rb, MRb, MZr, ffiY, 86Y, 87Y, 87Zr, ^Y, 89Zr, 92Tc, 93Tc, ^c, 95Tc, 95Ru, 95Rh, ¾, 97Rh, 98Rh, "Rh, 100Rh, 101Ag, 102Ag, 102Rh, 103Ag, 104Ag, 105Ag, 106Ag, 108In, 109In, 110In, 115Sb, 116Sb, n7Sb, u5Te, 117Te, 117I, 118I, 118Xe, n¾e,
1191， 119Te, 120I, 120Xe, 121Xe, 1211, 122I, 123Xe, 1241， 1261， 128I, 129La, 130La, 131La, 132La, 133La, 135La, 136La, 140Sm, 1 1Sm, 142Sm, 144Gd, 145Gd, 15Eu, 146Gd, 146Eu, 147Eu, 147Gd, 148Eu, 150Eu, 190Au, 191Au, 192Au, 193Au, 193T1 , 194T1 , 194Au, 195T1 , 19&Γ1， 197T1 , 19&Γ1 , 200Τ1, 200Bi, 202Bi , 203Bi , 20¾i, 206Bi 혹은그의 유도체를포함한다.
본 발명의 이미징 조성물을 이용하여 CT(computed tomography, 전산화 단층촬영) 이미징을 얻은 경우， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 요오드 또는 금 입자등과 같은 CT조영제를포함할수 있다. 【유리한효과】 본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 없는 bare 나노운반체와 비교하여 매우 놀라운 수준으로 피부 투과도가 개선되어， 경피 운반체로서 매우 우수한 효능을 발휘한다.
(b) 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 종양세포 및 암세포로의 세포 유입도가 크게 개선되어， 종양세포 및 암세포의 이미징 및 광열 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 은도 민감성을 가지며， 온도 변화에 대응하여 가역적으로 직경 및 동공의 크기가 변화된다.
(d) 본 발명의 방법에 따르면， 키토산 -개질 나노운반체를 원-팟 단일상으로 제조할 수 있다.
(e) 본 발명의 나노운반체에 약물이 자연적으로 포집될 수 있다.
(f ) 본 발명의 나노운반체는 인체 내 온도 조건에서 동공의 크기가 감소되어 서방성 약물전달체로 이용될 수 있다.
(g) 본 발명에 따르면， 종래 기술의 문제점， 예컨대 유해한 유기용매의 이용， 복잡한 과정， 높은 생산 단가 및 낮은 함유 능력 등을 해결할 수 있다.
(h) 또한, 종래기술에서 통상적으로 이용되는 고속 균질화 과정 또는 초음파 처리 과정을 필요로 하지 않기 때문에， 본 발명은 함유되는 약물의 안정성을 담보할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la 는 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체를 제조하기 위한 글라시딜메타크릴레이티드 키토올리고사카라이드 (glycidyl metaacryl ated chiotool iogosacchar ide: GMA—COS)의 제조과정에 대한 모식도이다.
도 lb 는 도 la 의 GMA-C0S 의 합성을 확인한 -NMR 스펙트로스코피 결과이다.
도 2 는 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체의 제조 과정에 대한 모식도이다.
도 3 은 키토산 -개질 나노운반체에 대한 크기 및 제타 포텐셜 측정 결과이다. 도 4a 는 피부 투과도 측정용 스태틱 프란쓰 -타입 확산 셀의 모식도이다. 도 4b 는 FITC-BSA 가 내포된 키토산 -개질 나노운반체의 인 비트로 피부 투과도 측정 결과이다.
도 4c 는 FTTC-BSA 가 내포된 키토산 -개질 나노운반체의 피부 투과 분포를 형광현미경으로 측정한 결과이다.
도 4d 는 Cy5.5 가 내포된 키토산 -개질 나노운반체의 인 비트로 피부 투과도 측정 결과이다.
도 5a 는 SCC7 세포주에 대한 키토산 -개질 나노운반체의 인 비트로 세포 유입을 Flow Cytometry를 측정한 결과이다.
도 5b 는 SCC7 세포가 이식된 종양 마우스 모델에서 키토산 -개질 나노운반체 (Cy5.5 내포)의 실시간 종양 타겟팅을 보여주는 인 비보 NIR 형광 이미지이다 .
도 5c 는 키토산 -개질 나노운반체 (Cy5.5 내포)의 인 비보 종양 타겟팅에 대한 정량 결과 및 속도론적 결과이다.
도 5d 는 키토산 -개질 나노운반체 (Cy5.5 내포)의 조직 분포 및 종양 축적 결과를 정량화한 그래프이다.
도 5e 는 키토산 -개질 나노운반체 (Cy5.5 내포)의 조직 분포 및 종양 축적을 확인할 결과로서 기관 및 종양의 액스 비보 NIR 형광 이미지이다.
도 6a 는 바이오 이미징 또는 인 비보 이미징에 이용되는 키토산 -개질 나노운반체의 금나노막대에 대한 TEM 이미지 및 NIR 스펙트럼 프라파일이다.
도 6b 는 금나노막대 함유된 키토산 -개질 나노운반체의 안정성을 분석한 결과이다.
도 6c 는 금나노막대 및 금나노막대 함유 키토산 -개질 나노운반체의 세포 유입을 보여주는 이미지이다.
도 6d 는 금나노막대 함유 키토산 -개질 나노운반체를 이용한 인 비트로 광열 치료 결과를 보여주는 이미지이다. 41.5 W/cm2 의 cw laser(a diode cont inuous-wave laser) 이용 .
도 6e 는 금나노막대 함유 키토산 -개질 나노운반체를 이용한 인 비트로 광열 치료 결과를 보여주는 이미지이다. 26.4 W/cm2 의 cw laser (a diode cont inuous一 wave laser) 이용. 도 7a 는 금나노막대， 나노운반체에 함유 금나노막대， 키토산 결합 나노운반체에 함유된 금나노막대가 흡수하는 파장을 분석한 TEM 이미지이다.
도 7b 는 나노운반체 및 금나노막대 함유 나노운반체에 대한 크기 (직경 ) 및 제타 포텐셜을 측정한 결과이다.
도 8 은 PBS 에서 나노운반체에 함유된 금나노막대 , 키토산 결합 나노운반체 각각이 운반체 내부에서 밖으로 누수되는 금나노막대값을 측정한 그래프이다.
도 9 는 금나노막대， 금나노막대 함유 나노운반체， 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를 세포에 주입 후 세포 유입여부를 어두운 곳에서 현미경으로 관찰한 세포 이미지이다.
도 10 은 SCC7 암세포 (패널 a) 및 NIH/3T3 섬유아세포 (패널 b)에 대한 선택적 근적외선 광열 치료 효과를 살피기 위해 , 780 nm 파장에서 두 가지 세기의 전력 밀도 (41.5 및 26.4 W/cm2) 레이저를 조사하였을 때 세포독성 여부를 판단하는 이미지이다.
도 11 은 금나노막대 , 금나노막대 함유 나노운반체， 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를 정맥 내 주사하여 종양 세포 및 간 세포에 흡수여부를 살피기 위한 은 염색 법 사진이다.
도 12a 는 금나노막대， 금나노막대 함유 나노운반체， 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를 정맥내 주사 후 24 시간이 지나 근적외선 레이저 조사시 종양 크기의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 12b 는 금나노막대， 금나노막대 함유 나노운반체 , 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를를 정맥내 주사 후 24 시간이 지나 근적외선 레이저 조사시 종양 크기의 변화를 보여주는 마우스 종양 사진이다.
도 12c 는 금나노막대 , 금나노막대 함유 나노운반체， 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를를 정맥내 주사 후 24 시간， 48 시간이 지나 근적외선 레이저 조사를 1 회 내지 2 회 처 리시 종양 크기의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 12d 는 금나노막대， 금나노막대 함유 나노운반체， 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를 정맥내 주사 후 24 시간, 48 시간이 지나 근적외선 레이저 조사를 1 회 내지 2 회 처리시 종양 크기의 변화를 보여주는 마우스 종양 사진이다. 도 13 은 플루로닉 기반 나노운반체 및 키토산 -결합 플루로닉 기반 나노운반체를 각각 누드 마우스에 정맥 주사 후 72 시간까지 종양 세포에 축적되는 양을 비교한 사진 (A 는 마우스의 신체 전부를 찍은 이미지， B 는 종양 부위를 확대한 이미지 )이다.
도 14 는 플루로닉 기반 나노운반체 및 나노운반체 안으로 금나노막대가 함유되는 제법의 도표 그림이다.
도 15 는 암 세포 및 섬유아세포 각각에 대하여 금나노막대의 농도를 달리하여 금나노막대 , 금나노막대 함유 나노운반체， 키토산 -결합 금나노막대 함유 나노운반체를 세포 내로 주입할 때 세포 생존도의 차이를 판단한 그래프이다.
도 16 은 2 시간， 12 시간， 24 시간동안 배양시 SCC7 암세포 (a) 및 NIH/3T3 섬유아세포 (b)에 의해 흡수된 나노운반체 양을 나타내는 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1 : GMA-chitool igosaccharide ( IA-COS)의 제조
도 la 에 기재된 방법에 따라 키토올리고사카라이드 및 글라이시딜 메타크릴레이트를 이용하여 글라시딜메타크릴레이티드 기토올리고入 ]·카라이드 (glycidyl metaacrylated chiotool iogosacchar ide: GMA- C0S)를 제조하였다. 도 lb 는 최종적으로 제조된 GMA-C0S 에 대한 -NMR 스펙트로스코피 (JNM-LA300WB FT-NMR Spectrometer , JE0L, Japan) 분석 결과로서 , GMA-C0S 가 성공적으로 제조되었음을 알 수 있다. 실시예 2: 키토산 -개질 나노운반체의 제조
본 발명자들에 의해 종전에 보고되었던 방법 (32， 33)에 따라， 다이아크릴레이트화 플루로닉 (DA-Pluroni c) 및 아크릴레이트화 키토산을 광 -중합 하여， 플루로닉 기반 나노운반체의 bare 형 (NC(PF 68) 및 키토산 -개질 형 (Chito- NCCPF 68))을 제조하였다. 간략하게 설명하면， bare 형의 경우， 다이 아크릴레이트화플루로닉 용액 (0.5 wt ¾)의 회석된 수용액 (2 mL)을 광 개시제 [0.05 wt %, Irgacure 2959， 4-(2-하이드록시에톡시) 페닐 -(2-하이드록시 -2—프로필) 케톤 Ciba Specialty Chemicals Inc]와부드럽게 믹싱하고, 언필더 자외선 램프 (VL-4丄 C 8 W, Vilber Lourmat , France)을 이용하여 15 분간 1.3 mW/cm2 강도에서 UV- 조사시켰다. 키토산 -개질 형의 경우， 수용성 글라이시딜 -메타아크릴레이트 (GMA)- 결합 키토산 (2.8 mg, 0.2 μπιοΐ)을 탈이온수에 용해시키고， DA-플루로닉 용액에 첨가하여 0.5 wt %의 DA-플루로닉을 제조하였다. 상기 bare 형에 이용되는 조건과 동일한조건에서 상기 혼합물을 광-중합하여 GMA-결합 키토산의 비닐기를가교결합 나노운반체 내로 결합시켰다. 미반응 물질들을 제거하기 위해， 전체 용액을 투석 주머니 (cellulose ester, MWC0, 300 kDa)를 이용하여 투석하되 처음은 0.1 M NaCl 에서 투석하고， 이어 탈이온수에서 투석하였다. 그 이후， 나노운반체들의 크기 및 표면 전하를 레이저 다이오드 광 (638 nm) 및 광전자 증폭 류브 검출기 (165° scattering angle)가 장착된 전기영동 광 산란 측정기 (ELS—Z2, Otsuka Electronics Co., Japan)를 이용하여 분석하였다. 키토산 -개질 형의 경우, 키토산결합 양은 16 wt %이었고， 이는 Ninhydrin분석을 이용하여 측정하였다. 실시예 3: 키토산 "개질 나노운반체의 경피 투과도의 분석 (FITC-BSA이용)
상기 실시예에서 제조한 키토산 -개질 나노운반체들 이용하여 모델 단백질인 FITC-BSA(Fluorescein i sot hiocyanate- label led bovine serum albumin, Sigma)를 충진하였다. 키토산 -개질 나노운반체 용액에 모델 단백질인 FITC-BSA 을 첨가하고， 4°C에 12 시간 동안 방치하면서, 모델 단백질이 자발적으로 팽창된 나노운반체 안으로 충진 되도록 하였다. 충진 되지 않은모델 단백질들을상온에서 스핀필터를 사용하여 제거하였다. 키토산 -개질 나노운반체의 FITC-BSA 포집 효율 및 함유 양은， 실온에서 14 000 rpm 으로 10 분 동안스핀 여과한 다음 F. Q. Li, et al., Int. J. Pharm. , 2008， 349 , 274에 기재된 방법에 따라 계산하였다.
FTTC-BSA-함유된 나노운반체의 경피 투과도는 스태틱 프란쓰 -타입 확산 셀을 이용하여 측정하였다 (참조: 도 4a). 실험군은 Only FITC-BSA (200 ug), NCCF127) + FITC-BSA, NC(F68) + FITC-BSA, Chito-NC(F127) + FITC-BSA, Chito- NC(F68) + FITC-BSA, Only chitosan 및 Chit으 F127 이다. 실험 조건은 다음과 같다: Donor chamber: 1-5 groups in DIW (200 uL)； Membrane: Epidermis&dermis (Human cadaverc skin, M/58, back or thigh) (from HANS Biomed)； Receptor chamber： PBS(pH 7.4) (5 mL); 37 °C, 600 rpm, time point(0.5, 1, 2, 4， 8， 12, 18， and 24 hrs); Sampling: 500 uL at given time. 형광 세기는 형광 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였고, 형광 이미지는 형광현미경으로 얻었다.
도 4b 에서 확인할 수 있듯이， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 컨쥬게이션되지 않은 나노운반체 [NC(F127) 및 NCXF68)]과 비교하여 매우 우수한 피부 투과도를 나타내었다. 또한， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 플루오닉 중합체에 컨쥬게이션 되었지만 광가교결합 되지 않은 Chito- F127 과 비교하여도 매우 우수한 피부 투과도를 나타내었다. 도 4c 는 FITC-BSA- 함유된 키토산 -개질 나노운반체를 인간 피부에 적용하여 얻은 형광 이미지이다. 이 경우에도, 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 컨쥬게이션되지 않은 나노운반체 [NC(F127) 및 NC(F68)]과 비교하여 매우우수한피부투과도를 나타냄을 확인할수 있다. 실시예 4: 키토산 "개질 나노운반체의 경피 투과도의 분석 (Cy5.5 이용)
Cy5.5 형광물질이 컨쥬게이션된 나노운반체에 대하여， 실시예 3 과 유사하게 피부 투과도를 분석하였다. 도 4d 에서 확인 할 수 있듯이, 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 키토산이 컨쥬게이션되지 않은 나노운반체 [NCXF127) 및 NC(F68)]과비교하여 매우우수한피부투과도를나타냄을 확인할수 있다. 실시예 5: 키토산 -개질 나노운반체를 이용한 인 비보이미징
Cy5.5 형광물질이 컨쥬게이션된 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체의 생체 (in vivo) 영상응용성을평가하였다.
우선， squamous cell carcinoma(SCC7)를 세포배양하여 (in vitro) 세포 유입을조사하였다. 도 5a에서 확인할수 있듯이， 키토산 -개질 나노운반체는 bare 나노운반체와 비교하여 세포 유입이 매우 높게 나타났다. 이와 같은 증가된 인 비트로 세포 유입은 SCC7 세포가 이식된 종양 마우스 모델에서의 생체 (in vivo) 종양축적과밀접하게 연관되어 있다 (도 5b, 5c 및 5d). 도 5b에서 볼수 있듯이, 나노운반체의 시간-의존성 배출 프로파일 및 종양 축적은 실시간 근적외선 형광 세기를 모니터링 하여 명확하게 가시화 되었다. bare 나노운반체 [NC(F68) 및 ! (F127)]의 경우, 종양 부위의 형광 세기가 주입 후 16 시간 이내에 빠르게 감소하였다. 그러나， 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체의 높은 형광 세기는 종양 부위에서 72시간까지 유지되었다.
주입 72 시간째에서의 액스 비보 (ex vivo) NIR 형광 이미지에서 확인할 수 있듯이 (도 5d 및 5e), 조직 분포 (간, 폐， 신장, 비장 및 심장) 및 종양 축적 분석 결과, 본 발명의 키토산 -개질 나노운반체는 bare 나노운반체와 비교하여 종양 위치에서 높은 형광세기를 나타내었으며， 이는 키토산 -개질 나노운반체가 보다 연장된 혈류시간 및 보다 증가된 종양 축적 능력을 가지고 있음을 보여주는 것이다. 실시예 6: 키토산 -개질 나노운반체를 이용한 세포배양 (7/7 에서의 광열 암 치료 (photothermal cancer therapy)
상기 실시예 5 에서 규명된， 키토산 -개질 나노운반체의 종양세포 유입 증가 능력 및 종양 조직 축적 능력은 키토산 -개질 나노운반체가 광열 암 치료제로서 이용될 수 있음을 암시한다. 키토산 -개질 나노운반체의 광열 암 치료능을 조사하였다.
우선， 금나노막대를 시드—매개 성장 방식 (seed— mediated growth method)을 이용하여 수용성 CTAB 용액에서 합성하였다 (36). HAuC14(0.5 mM, 5 mL, ojima chemical Co. LTD(Ksashiwabara, Japan))를 CTAB(0.2 M, 5 mL)에 첨가하고 이어 충분히 믹싱하여 금 시드를 제조하였다. 이어， 격렬히 교반되는 조건 하에서 새로이 만들어진 아이스 -콜드 NaBH4(0.01 M, 600 pL, Sigma-Aldr ich Corp, USA)를 첨가하여， 갈색을 띠는 황색 용액을 형성시켰다. 상기 용액을 실온에서 1-3 시간 보관하고， 금나노막대를 합성하기 위한 시드 용액으로 사용하였다. 그런 다음， 격렬히 교반되는 조건 하에서 HAuC14(l mM, 5 mL)를 CTAB 용액 (0.2 M, 5 mL, Sigma-Aldr ich Corp, USA)에 첨가하여 성장 용액을 제조하고, 4 mM 의 AgN03(silver nitrate) 400 yL 및 0.0788 M 아스코브산 (Sigma-Aldr ich Corp, USA) 70 11 L 을 상기 용액에 첨가한 다음, 부드럽게 믹싱하였다. 이 과정 동안 혼합물 (성장 용액)의 색은 황색에서 무색으로 변하였다. 그러고 나서， 12 시드 용액을 성장 용액 내로 주입하고, 격렬하게 교반하였으며， 그 뒤에 계속 3 시간동안 37°C , 100 rpm 쉐이킹 락커에 두었다. 금나노막대 용액은 밝은 자주 색을 띠었다. 과량의 CTAB 를 제거하기 위해， 금나노막대 용액을 원심분리기에서 10 분간 11 ,000 rpm 으로 최소 5 배 충분히 정제하고， 탈이온수에 재분산 시켰다. 최종적으로， 금나노막대들의 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 UV- 스펙트로포터미터 (Agi lent 8453 , Santa Clara , CA, USA)를 이용하여 측정하였고， 금나노막대들의 크기 및 종횡비를 투과 전자현미경 (TEM; JEM-2100, JEOL, Japan)을 이용하여 축정하였다.
한편 , 금나노막대 함유 플루로닉 -기반 나노운반체를 다음과 같이 제조하고 특성을 조사하였다. 금나노 막대를 플루로닉 기반 나노운반체 안으로 로딩하기 위해 , 파우더 상태인 나노운반체 (750 ii g)에 금나노막대 용액 (50 p g/100 y L)을 첨가하고， 12 시간 이상 4°C에서 배양하여， 금나노막대가 나노운반체 안에 자발적으로 들어가도록 유도하였다. 캡슐화 효율 (90% 이상) 및 나노운반체 안에 함유된 금나노막대의 양은 이전 연구와 마찬가지로 상온에서 11 ,000 rpm 속도로 10 분 동안 회전 여과시켜 로딩 안된 금나노막대를 분리하고， 이를 계산하여 측정하였다 (44) . 금나노막대만의 흡수 스펙트럼 및 금나노막대 함유 나노운반체들의 흡수 스펙트럼을 UV-분광 광도계를 이용하여 가시영 역-근적외선 파장의 영 역대 안에서 측정하였다. 금나노막대 및 금나노막대 함유 나노운반체들의 형 태학을 2%(w/v) 포스포텅스텐 산 (Sigma-Aldr i ch Corp, USA) 용액에서 음성 염색하고 TEM 을 이용하여 측정하였다. 37°C의 탈이온수에서 전기영동 광 산란 측정기 (ELS-Z2)로 금나노막대 및 금나노막대 함유 나노운반체의 입자 직경 및 표면 전하 (제타 포텐셜)을 분석하였다. 모든 측정은 세 번씩 실시되었다.
금나노막대 및 금나노막대 함유된 나노운반체들의 형태학은 TEM (도 7a 의 삽입물)을 이용하여 포스포텅스텐 산 (phosphotungst i c acid)로 음성 염색 (negat ive staining) 후에 영상화하였다. 금나노막대는 나노운반체들의 구형의 변화 없이 두 형 태 모두에 적절하게 함유되었다. 37°C에서 나노운반체들의 입자의 직경 (hydrodynami c di ameters) 및 표면 전하 (제타 포텐셜)는 금나노막대의 함유에 의해 영향을 받지 않았다. 도 7b 에서 보여지듯 , 나노운반체 그 자체 및 금나노막대 함유된 나노운반체들은 비슷한 평균 사이즈를 가진다. CTAB 용액에서 안정화된 금나노막대의 제타 포텐셜이 높은-양전하를 띠는 표면 상태 (+ 36.5 士 2.4 mV)를 보여주는 반면， 금나노막대 함유 나노운반체들은 나노운반체들 자체의 제타 포텐셜과 유사한 표면 전하를 띠고 있음을 보여주고 있어， 나노운반체 안으로 금나노막대가 함유되는데 효과적이라는 사실이 확인되었다.
특정 시점 (t ime point )들에서 또한 수용액에서 분산된 금나노막대 및 금나노막대 함유 나노운반체들의 광학 안정성을 조사하였다 (도 7a) . 금나노막대 자체는 블루 시프트 (짧은 파장) 스펙트럼을 보이는데， 이는 이미 지난 연구에서 수용상에서는 금나노막대가 재조형 (reshaping)되는 것으로 발표된바 (37, 38)， 수용상에서는 금나노막대 이용이 제한적인 것으로 확인된다. 반면에， 나노운반체들에 금나노막대가 함유된 경우에는 7 일차에도 불구하고 흡수 스펙트라의 변화가 없어， 나노운반체들과 금나노막대 사이의 상호 작용으로 나노운반체 안으로 함유되고 금나노막대의 불안정한 재조형화가 방지된다고 확인되었다 (38) .
금나노막대 함유 나노운반체의 인 비트로 안정성을 분석하였다. 나노운반체들 안에 함유된 금나노막대의 광학 안정성을 분석하기 위해， 탈이온수 ( 1 mL) 안에 있는 금나노막대 (컨트를로서 ) 및 금나노막대 함유 나노운반체 용액을 쉐이킹 로커에서 27°C , 100 rpm 에서 1 주일 동안 배양시키고， 일정 시점들에서 350 nm 에서 1000 nm 영역의 UV_Vi s 스펙트럼를 모니터링하여 분석하였다. 나노운반체 안으로 금나노막대가 안정하게 저장되었는지 확인하기 위해 나노운반체에서부터 누출되는 금나노막대를 측정하였다. 금나노막대가 함유된 나노운반체 용액 ( 100 U L)을 투석 주머니 (셀를로오스 에스터， 300 kDa 의 MWC0)에 두었다. 투석 주머니를 10% 소태아혈청 (Gibco(Grand Is l and, NY, USA) )이 포함된 PBS 5 mL 에 담그고， 37°C에서 쉐이킹 라커를 100 rpm 로 작동시켰다. 모두 릴리즈된 배지는 최대의 싱크 조건을 유지시키기 위하여 각 시점마다 새롭게 갈아주었다. 각 시간 포인트에서 누출되는 금나노막대 양은 UV-분광 광도계를 이용하여 분석하였고, 그 농도는 스탠다드 검량선 (cal ibrat ion curve)으로 측정하였다. 컨트를로서 , 동일한 투석 주머니 셋업 조건에서 방출된 금나노막대양도 분석하였다.
80% 가까이 누출되는 컨트를과 비교하여 나노운반체에 들어 있는 금나노막대는 15% 내외의 양만 누출되고 있어 나노 운반체가 금나노막대를 내부에서 효과적으로 포획할 수 있음을 확인하였다 (도 8) .
금나노막대 함유 나노운반체의 인 비트로 세포 독성을 분석하였다. 편평 상피암 (squamous cel l carcinoma, SCC7) 종양 세포주 및 NIH/3T3 섬유아세포 세포주를 이용하여 금나노막대 및 금나노막대 함유 나노운반체들의 세포 독성을 분석하였다. 두 세포 타입 모두 24-웰 플래이트에 5 x l04 세포 밀도로 접종하였고， 37°C에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어 , 금나노막대 또는 금나노막대 함유 나노운반체들 (6.7 wt %의 금나노막대를 함유)을 1-250 y g/mL (금나노막대양에 기초하여 )의 범위에서 플레이트 웰에 첨가하였다. 37°C에서 2 시간 더 세포들은 배양하였다. 이후, 배지를 10 배 묽힌 WST-l(Biovision Inc . , Mountain View, USA)이 포함된 825 pL 의 새로운 배지로 교체하였고， 37°C에서 다시 2 시간 더 세포들을 배양하였다. 스캐닝 멀티웰 분광광도계 (FL600, Bio-Tek®' Vermont , USA)를 이용하여， 컬러 배지가 450 nm 파장을 흡수하는 것을 관찰하였다. 이전 연구로부터 SCC7 세포에서 플루로닉 기반 나노운반체 자체의 세포 독성을 적용하였고 (33)， NIH/3T3 섬유아세포로의 세포 독성은 같은 프로토콜을 사용하여 특정하였다.
SCC7 및 NIH/3T3 두 가지 타입에서 금나노막대가 고농도인 경우에는 세포 생존도가 금나노 막대 함유 나노운반체들의 생존도보다 매우 낮은 것으로 나타난 반면， 금나노막대가 100 y g/mL (금나노막대 양에 기초)까지는 금나노막대 및 금나노막대 함유 나노운반체들 모두 세포들의 두 가지 타입의 신진대사의 활성에 아무런 영향을 주지 않았다 (도 15a 및 도 15b) . 250 μ g/mL 에서는 금나노막대 함유 나노운반체에서 상당히 높은 세포 생존도를 보여주고 있어 나노운반체의 세포 독성 효과에 미치는 긍정적인 영향을 확인할 수 있었다.
금나노막대 함유 나노운반체의 인 비트로 세포 유입 정도를 분석하였다. 트립신 EDTA(Gibco(Grand Island, NY, USA))를 이용하여 SSC7 또는 NIH/3T3 섬유아세포 세포를 뽑아내고， 24-웰 조직 배양 플래이트 안에 5 x l04 세포를 젤라틴 -코팅 덮개 유리 (12 隱)위에 접종하여 , 371C에서 24 시간동안 키웠다. 덮개유리는 70% 에탄올에 집어넣어 미리 소독시켰고， UV 에 밤새도록 노출시키고， 최적의 세포 생장을 위하여 2%의 젤라틴을 함께 코팅하였다. 금나노막대 또는 금나노막대 함유 나노운반체들 (금나노막대 양에 대해 50 u g/mL)가 들어 있는 세포들을 배양 배지에서 세포 유입이 일어나도록 2 시간 동안 배양시켰다. 배양 후， 세포들은 PBS 용액을 이용하여 세척하고， 4% 포르말린 용액이 들어 있는 PBS 에서 30 동안 고정시키고; 고정된 세포들은 PBS 로 세척하고， 이후 다시 탈이온수로 세척하였다. 광 산란 이미지들은 TV 렌즈 C-0.45 카메라가 달린 암 시야 현미경 (ECLIPSE L150, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 기록하였다.
광 산란 영상 (금나노막대 양에 대하여 50 u g/mL, 도 9)을 통해 금나노막대의 세포 유입을 구분화했다. 금나노막대가 나노운반체 안으로 함유되는 것에 의해 금나노막대의 세포 유입이 크게 향상하였다. 금나노막대를 직접 처리한 경우에서 아무런 신호가 나타나지 않은 것에 비해 , 금나노막대로부터 나온 밝은 스팟들이 세포질에서 관찰되었고， 동일한 나노운반체에 대해， 정상 섬유아세포에서보다 종양 세포들에서부터 높은 세포 유입이 관찰된 것으로 보아 정상 세포 세포들보다 종양 세포들로의 금나노막대의 세포 유입이 보다 효과적 임을 확인하였다. 게다가， bare 나노운반체에 비해 키토산—개질 나노운반체들에서 금나노막대의 세포 유입이 높게 나타났다. Cy5.5-레이블된 나노운반체를 사용하여 특정화된 나노운반체 자체의 세포유입은 또한 광 산란 영상들에서 비슷한 결과를 보여주었다 (도 16a 및 16b)(33) . 예상한대로， 각 배양 시간에서 키토산 -개질 나노운반체들의 세포 유입 정도가 bare 나노운반체들의 세포 유입 정도와 비교하여 훨씬 높았다.
금나노막대 함유 나노운반체의 인 비트로 광열 효과를 분석하였다. 24-웰 조직 배양 플래이트에 SCC7 또는 NIH/3T3 섬유아세포들을 8 x l04 밀도로 접종시키고， 37°C에서 24 시간 동안 거의 배지 전면에 걸쳐 배양시켰다. 이어， 배지는 1 mL 의 금나노막대 또는 금나노막대 함유 나노운반체 (금나노막대에 대하여 50 y g/mU들을 포함하는 배지로 교체하였다. 배양 2 시간 후， 세포들은 비 -특이적으로 흡수되거나 배지에 남아 있는 나노 물질들을 제거하기 위해， PBS 완층용액으로 세 번 세척하였다. 새로운 배지를 첨가한 후， c. a. CW Ti-sapphire l aser (MIRA 900, Coherent Inc. , Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 직경 1.3圆구멍 -크기 및 다른 출력 밀도 (41.5 및 26.4 W/cm2)의 780 ran 의 레이저 광을 각 웰마다 4 분간 조사하였다. 세포 생존도는 아크리딘 오랜지 (AO, Sigma-Aldrich Corp. , St . Loui s , M0, USA) 및 프로피듐 아이오다이드 (PI , Sigma-Aldrich Corp. , St . Loui s , M0, USA)를 이용한 이중 염색 과정을 이용하여 판단하였는데 , 여기서 A0 에서 녹색 형광은 살아 있는 세포들을 가리키며， PI 에서는 빨강 형광은 죽은 세포들을 가리킨다. 간략히 말해서 , 각 웰에 0.67 μ Μ 의 A0 및 75 μ Μ 의 PI 를 포함하는 배지 1 mL 를 첨가하였으며 , 37°C에서 30 분간 어둠 속에서 배양하였다. PBS 로 세척한 후， 살아있는 세포들 및 죽은 세포들은 도립 형광현미경 (TE2000-U, Nikon, Melville, NY, USA)을 이용하여 시각화하였다.
금나노막대들 또는 금나노막대 함유 나노운반체들 (50 pg/mL 의 금나노막대 양)은 종양 세포들 및 섬유아세포와 함께 처리하였고， 이어 다른 전력 밀도 (41.5 및 26.4 W/cm2)로 780 nm 의 파장인 레이저를 4 분간 조사하였다. 이후 세포들은 아크리딘 오랜지 및 프로피듐 아이오다이드로 염색하여 세포 생존도를 파악하였다. 도 10a및 10b에서 보듯, 1) 금나노막대 함유 나노운반체들을 이용한 광열 분해 효과는 금나노막대들을 직접 이용한 경우와 비교하였을 때 보다 향상된 결과를 얻었으며, 그 결과 대부분의 세포가 죽지 않았고， 2) 금나노막대 함유 나노운반체들은 정상 세포들 (NIH/3T3)에서보다 암 세포들 (SCC7)에서 더 나은 광열 효과를 얻었고, 3) 키토산 -개질 나노운반체들은 bare 나노운반체들보다 보다 강한 광열 분해를 보였다. 이러한 결과들 모두는 예상했던 대로 세포 유입 결과들과 잘 일치하였으며， 레이저 강도가 셀수록좋은 결과들을 얻었다. 실시예 7: 키토산ᅳ개질 나노운반체를 이용한 실험동물 (/7 wVo)에서의 광열 암 치료 (photothermal cancer therapy)
모든 동물들을 Orient Bio Inc. (Seoul, Korea)에서 구입 하였으며， 광주 과학기술원 (GIST)의 실험 동물 운영 위원회의 지침에 따라 취급하였다. 고형 종양을 유발하기 위하여 , 생후 6-7 주의 가슴샘 없는 누드마우스 (CAnN.Cg-Foxn)의 뒤옆구리 좌우 부위 모두 피하층에 SCC7 세포들 (lxlO6 in 50 pL PBS)을 주입하였다. 종양들이 대략 직경 5圆에 이르도톡자라면， 85%의 생리 식염수 (100 iiL)에서 현탁되어 있는 금나노막대 또는 금나노막대 함유 나노운반체들 (금나노막대에 대하여 100 Pg)을 미정맥을 통해 정맥 내로 주입하였다; 생리 식염수는 컨트를로사용한다. 첫 째， 간또는종양에서 축적되는 나노 물질을 비교하기 위해， i.v. injection 후 24 시간이 지나 마우스에서 간과 종양 조직을 얻었다. 종양과 간 조직들을 절개하여， 24 시간동안 4% 포르말린 용액에서 고정시키고, 최적 절단 온도 (OCT) 화합물 (Tissue-Teks; Sakura Finetek, Kyoto, Japan)에 끼워 넣었다. 동결 절편을하기 위해， 블록들은 -20°C에서 얼리고 절개하였다. 이어, 조직 절편들은 실버 인핸서 키트 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 10분간 염색했다. 염색된 조직 절편들은 도립 형광 현미경으로 검사하였다. 그런 다음， 고형 종양의 광열 소멸 효과를 비교하기 위하여 , 마우스 (왼쪽 종양: 레이저 조사 없음 VS . 오른쪽 종양: 레이저 조사)에 나노물질을 i .v. 주입 24 시간 후， 근적외선 광 (808 nm 다이오드 레이저， 900 mW, c. a. 4 W/cm2 에서 5圆범 직경， Power Technologies, Alexander , AR, USA)을 4 분 동안 조사하였다. 또한， 후속의 실험을 위하여， 마우스에 ί .ν. 주입 24 시간 후 및 48 시간 후에 근적외선을 4 분 동안 조사하였다. 일정 시 점에서 , 치료 후 종양 크기를 디지털 캘리퍼스로 측정하였고 디지털 카메라로 사진을 촬영하였다. 모든 측정들은 세 번씩 실시하였다. 통계 분석을 Student t-test 로 실시하였고， 모든 비교실험에서는 p<0.05 의 최소 유의수준으로 세팅하였다.
그 결과 인 비보 모델 동물에서 광열 치료 효과를 시각화하기 위해 은으로 염색하였다. 도 11 은 음성 컨트를로서 금나노막대 샘플 또는 생리 식염수로 처리한 마우스로부터 종양들 및 간의 대표적인 영 역의 은 -염색 영상이다. 금나노막대 함유된 키토산 -개질 나노운반체들은 종양세포에서 매우 높은 강도 (어두운 색 )을 보였는데， 이는 보다 효과적으로 종양세포로의 선택적 전달이 일어남을 보여준다. 반면에 금나노막대를 직접 처리하였을 때， 은 -염색 영상은 간에서 가장 강하게 나타났는데， 금나노막대 자체가 간으로의 유입이 매우 크다는 것을 보여준다. 금나노막대 함유 나노운반체의 경우 종양세포로의 유입은 약간 증가하였고, 간세포로의 유입은 다소 감소하였다. 하지만 키토산 -개질 나노운반체를 처리할 경우 은 염색분석 시 종양세포로의 유입이 탁월하게 증가하는 것을 보여주고 있다.
고형 종양들의 광열 어블래이션에서 금나노막대 함유 나노운반체들의 치료적인 효과를 분석하기 위해， 마우스를 정맥 내 주입 24 시간 후 4 분간 근적외선 레이저 조사 (808 nm, 4 W/cm2)로 노출시켰다 (좌측 종양들 : 레이저 조사 없음 vs . 우측 종양들: 레이저 조사) . 도 12a-d 에서 보듯， 금나노막대 함유 나노운반체들은 종양 성장의 강력한 억제가 나타난 반면， 금나노막대를 직접적으로 처리 시 염분-처리한 그룹의 결과와 비교하여 종양 퇴 행에서 통계적 차이를 보이지 않았다. 예상한대로, bare 형태와 비교하여 키토산 -개질 나노운반체들에서 현저한 종양 성장의 억제를 보였고; 1 주 동안 종양 부피의 성장이 없었으며， 한 차례 레이저 조사 후에 종양 부피의 느린 증가가 관찰되었는데， 이는 키토산 -개질 나노운반체들의 효과적인 종양 축적 및 매우 효과적인 광열 효과를 명백히 보여주었다.
본 발명자들은 근적외선 레이저를 4 분 간 두 번 조사하는 추가적 테스트로 보다 더 광열 암 치료에 도전하였고， 금나노막대 함유 나노운반체들의 정맥 내 주입 후 첫 번째는 24 시간 후 및 48 시간 후에 레이저를 조사하였다. 둘 째 날에 한 번 더 레이저를 조사했을 때， 키토산 -개질 형태인 경우에 종양이 완전히 제거된 결과를 얻을 수 있었다. 다른 실험군도 레이저를 다시 조사하였을 때 약간의 종양크기의 변화가 있었지만， 금나노막대를 직접적으로 적용한 사례에서는 종양이 충분히 억제되지 않았으며 (도 12c 및 12d), 그 크기도 크게 달라지지 않았다 (통계적 차이점이 없음). 홍미로운 것은, 키토산 -개질 형태 (Chito- NC(PF 68)) (도 12c 의 확대된 사진 참고)의 경우에서 광열 치료 후 초기 시점에서 6일 이내에 종양들이 완벽하게 제거되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참조문헌
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Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
말단에 있는 광가교결합 가능한 (photo-crossl inkabl e) 작용기를 통하여 가교결합되어 있는 수용성의 생체적합성 중합체에 키토산이 결합된 키토산 -개질 나노운반체로서 , 상기 키토산 -개질 나노운반체는 온도 변화에 따라 직경이 변화되며 키토산이 결합되지 않은 bare 나노운반체와 비교하여 피부 투과도, 세포 유입도 (eel hil ar uptake) , 암 조직으로의 선택적 전달성 또는 광열효과 (photothermal effect )가 증가된 나노운반체 (nano-carr i er ) .
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 광가교결합 가능한 작용기는 아크릴레이트, 다이아크릴레이트， 올리고아크릴레이트， 메타크릴레이트, 다이메타크릴레이트， 올리고메타크릴레이트 , 쿠마린， 타이민 또는 시나메이트인 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 3】
제 1 항에 있어서 , 상기 광가교결합 가능한 작용기는 C=C 이중결합을 갖는 그룹인 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 수용성의 생체적합성 중합체는 녹말， 글리코겐 , 키틴， 펩티도글리칸， 리그노 설포네이트， 탄닌산， 리그닌 , 펙틴 , 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드， 폴리비닐알코올， 폴리에틸렌옥사이드- 폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체， 샐를로오스， 헤미 셀를로오스， 카복시메틸 셀를로오스， 헤파린， 히아루론산， 덱스트란 또는 알지네이트 구조를 갖는 중합체인 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 5]
제 4 항에 있어서， 상기 수용성의 생체적합성 중합체는 하기 화학식 1 로 표시되는 중합체인 것을 특징으로 하는 나노운반체 : 화학식 1
(PCl)-(PE)x-(PP0)y-(PE)z-(PC2)
상기 화학식에서， PE 는 에틸렌옥사이드， PP0 는 프로필렌옥사이드， PC1 및 PC2 는 광가교결합 가능한 작용기를 나타내고 , X , y 및 z 는 각각 독립적으로 1- 10,000 의 정수이다.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서 , 상기 나노운반체는 온도가 감소함에 따라 그 직경이 증가되는 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 7】
제 1 항에 있어서， 상기 키토산은 광가교결합 가능한 (photo- crossl inkable) 작용기를 통하여 상기 수용성 생체적합성 중합체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 8】
제 1 항에 있어서， 상기 나노운반체는 그 내부에 단백질， 펩타이드， 핵산분자， 당류， 지질， 나노물질， 화합물， 무기물 또는 형광물질을 포함하거나 또는 그 표면에 화합물, 무기물 또는 형광물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 9】
제 8 항에 있어서 , 상기 단백질 , 펩타이드， 핵산분자， 당류， 지질， 나노물질 , 화합물 또는 무기물은 약물인 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 10】
제 9 항에 있어서， 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 11】 제 8 항에 있어서， 상기 단백질， 펩타이드， 핵산분자， 당류， 지질 , 화합물 , 무기물 또는 형광물질은 고분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 나노운반체 .
【청구항 12]
상기 제 1 항 내지 제 11 항 어느 한 항의 나노운반체를 포함하는 경피 투여용 조성물.
【청구항 13]
제 12 항에 있어서， 상기 나노운반체는 고분자량의 단백질， 펩타이드， 핵산분자， 당류, 지질 , 화합물 또는 무기물을 포함하거나 또는 그 표면에 고분자량의 화합물 또는 무기물이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 경피 투여용 조성물 .
【청구항 14】
제 13 항에 있어서 , 상기 나노운반체가 포함하는 고분자량의 단백질， 펩타이드， 핵산분자， 당류 , 지질， 화합물 또는 무기물은 약물인 것을 특징으로 하는 경피 투여용 조성물 .
【청구항 15】
상기 제 1 항 내지 제 11 항 어느 한 항의 나노운반체를 포함하는 인 비보 종양 또는 암 이미징용 조성물 .
【청구항 16】
상기 제 1 항 내지 제 11 항 어느 한 항의 나노운반체를 포함하는 광열 암 치료용 조성물 .
【청구항 17】
운반 대상의 물질을 포함하는 상기 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 나노운반체를 대상 (subject )에 접촉시키는 단계를 포함하는 운반 대상 (cargo)의 운반 방법 .
【청구항 18】
운반 대상의 물질을 포함하는 상기 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 나노운반체를 대상 (subject )의 피부에 접촉시키는 단계를 포함하는 운반 대상의 경피 운반 방법 .
【청구항 19】
제 18 항에 있어서， 상기 운반 대상의 물질은 고분자량의 단백질 , 펩타이드, 핵산분자， 당류, 지질， 화합물 또는 무기물을 포함하거나 또는 그 표면에 고분자량의 화합물 또는 무기물이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 20】
제 19 항에 있어서， 상기 고분자량의 단백질， 펩타이드, 핵산분자， 당류， 지질， 화합물 또는 무기물은 약물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 21】
다음 단계를 포함하는 대상 (subject )의 인 비보 종양 또는 암 이미징 방법 :
(a) 운반 대상의 물질을 포함하는 상기 제 1 항 내지 제 11 항 어느 한 항의 나노운반체의 진단학적 유효량을 상기 대상 (subject )에 투여하는 단계 ; 및
(b) 상기 대상을 스캐닝 하여 가시적 (vi sible) 이미지를 얻는 단계 .
【청구항 22】
운반 대상의 물질을 포함하는 상기 제 1 항 내지 제 11 항 어느 한 항의 나노운반체의 치료학적 유효량을 대상 (subject )에 투여하는 단계를 포함하는 광열 암 치료 방법 .
【청구항 23】
(a) 광가교결합 가능한 (phot으 crossl inkable) 작용기를 갖는 수용성의 생체적합성 중합체의 분산액을 준비하는 단계 ; (b) 광가교결합 가능한 (photo-cross l inkable) 작용기를 갖는 수용성의 천연 중합체 분산액을 준비하는 단계 ;
(c) 상기 생체적합성 중합체의 분산액과 키토산 분산액의 혼합물을 준비하는 단계 ;
(d) 상기 혼합물에 개시제를 첨가하는 단계 ; 및
(e) 상기 (d)의 결과물에 광을 조사하여 상기 중합체와 키토산을 가교결합시켜 키토산 -개질 나노운반체를 제조하는 단계를 포함하며 , 상기 키토산- 개질 나노운반체는 온도 변화에 따라 직경이 변화되며 키토산이 결합되지 않은 bare 나노운반체와 비교하여 피부 투과도 또는 세포 유입도 (eel hilar uptake)가 증가된 것을 특징으로 하는 키토산 -개질 나노운반체의 제조방법 .
【청구항 18】
제 17 항에 있어서， 상기 광가교결합 가능한 작용기는 아크릴레이트, 다이아크릴레이트， 올리고아크릴레이트, 메타크릴레이트， 다이메타크릴레이트， 올리고메타크릴레이트， 쿠마린， 타이민 또는 시나메이트인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 19】
제 17 항에 있어서 , 상기 광가교결합 가능한 작용기는 C=C 이중결합을 갖는 작용기인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 20】
제 17 항에 있어서， 상기 수용성의 생체적합성 중합체는 녹말， 글리코겐 , 키틴， 펩티도글리칸， 리그노 설포네이트， 탄닌산， 리그닌， 펙틴， 폴리에틸렌글라이콜， 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올， 폴리에틸렌옥사이드ᅳ 폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체， 샐를로오스， 헤미 샐를로오스， 해파린， 히아루론산， 텍스트란 또는 알지네이트 구조를 갖는 중합체인 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 21】 제 20 항에 있어서， 상기 수용성의 생체적합성 중합체는 하기 화학식 1 로 표시되는 중합체인 것을 특징으로 하는 방법 :
화학식 1
(PCl)-(PE)x-(PP0)y-(PE)z-(PC2)
상기 화학식에서 , PE 는 에틸렌옥사이드， PP0 는 프로필렌옥사이드， PC1 및 PC2 는 광가교결합 가능한 작용기를 나타내고， X， y 및 z 는 각각 독립적으로 1- 10,000 의 정수이다.
【청구항 22]
제 17 항에 있어서， 상기 단계 (e)의 광은 자외선인 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 23]
제 17 항에 있어서， 상기 키토산 -개질 나노운반체는 온도가 감소함에 따라 그 직경 이 증가되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 24】
제 17 항에 있어서， 상기 단계 (a)-(e)는 유기 분산상을 사용하지 않으며 수용액 분산상 단독에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 25】
제 17 항에 있어서， 상기 키토산 -개질 나노운반체는 37°C에서의 동공 크기가 3-20 nm 인 것을 특징으로 하는 방법 .
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