WO2011087222A2 - 항암 펩타이드 서열 - Google Patents

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WO2011087222A2
WO2011087222A2 PCT/KR2010/009358 KR2010009358W WO2011087222A2 WO 2011087222 A2 WO2011087222 A2 WO 2011087222A2 KR 2010009358 W KR2010009358 W KR 2010009358W WO 2011087222 A2 WO2011087222 A2 WO 2011087222A2
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anticancer peptide
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백성희
김근일
이지민
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서울대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides effective for colorectal cancer and prostate cancer, genes encoding them, and methods for mass production of such peptides.
  • Wnt genes encode one large family of cysteine-rich secreted polypeptides that mediate various signaling processes. Abnormal activity of Wnt signaling acts as the main driving force leading to developmental defects and tumor formation (Klaus, Birchmeier, 2008; Korinek et al., 1997; Morin et al., 1997; Willert et al., 2003). Wnt signaling pathways have been divided into two categories; One is a regular Wnt / -catenin ⁇ - (catenin) signaling pathway, and the other is an irregular Wnt / Ca + 2-signaling pathway (Kuhl et al, 2000;. Liang et al, 2007;. Liu et al,. 2005).
  • CKI casein kinase I
  • GSK-3 ⁇ glycogen synthase kinase-3 ⁇ Due to the degradation of ⁇ -catenin by the proteasome, it remains low (Orford et al., 1997; Salic et al., 2000).
  • Noncanonical Wnt signaling pathways affected by Wnt ligands such as Wnt5a have various and sometimes opposite roles (Slusarski et al., 1997; Torres et al., 1996).
  • Amorphous Wnts are antagonistic or synergistic to the normal Wnt signaling pathway depending on their receptors.
  • Wnt5a -deficient mice showed increased ⁇ -catenin signaling in the distal limbs, indicating that Wnt5a is associated with negative regulation of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway (Nemeth et al. al., 2007).
  • Wnt5a has been shown to increase Wnt / ⁇ -catenin signaling in the presence of Frz4 and LRP5 (Mikels and Nusse, 2006).
  • the activity of the nonnormal Wnt signaling pathway is characterized by intracellular Ca 2+ release and Ca 2+ sensitive enzymes and protein kinases such as Ca 2+ / calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) Considering that it leads to the activity of C (PKC), it can be seen that the non-normal Wnt pathways are clearly different from the normal Wnt pathway.
  • the present invention provides a novel anticancer peptide.
  • the present invention provides a gene encoding a novel anticancer peptide.
  • the present invention provides a method for producing a novel anticancer peptide.
  • ROR ⁇ SEQ ID NO: 1
  • Biochemical purification of the ROR ⁇ -containing complex indicated that ⁇ -catenin is one component, which provides a new link between the ROR ⁇ and Wnt signaling pathways.
  • Analysis of the interaction of ROR ⁇ with ⁇ -catenin showed that ROR ⁇ -mediated inhibition of Wnt / ⁇ -catenin signaling requires Wnt5a / PKC ⁇ -induced phosphorylation at serine residue 35 of ROR ⁇ . Binding is induced and increased by phosphorylation of ROR ⁇ .
  • the present invention provides an anticancer peptide of SEQ ID NO: 1 and a gene encoding the same.
  • the present invention provides a recombinant vector containing a DNA sequence encoding the anticancer peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a method for mass production of an anticancer peptide using a recombinant vector containing a DNA sequence encoding the anticancer peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the anticancer peptide according to the present invention can be usefully used for the treatment of cancer, especially prostate cancer and colon cancer.
  • FIG. 3 shows the ratio of phosphorylated ROR ⁇ to Pan-ROR ⁇ by comparing 30 human colon cancer tissues with normal tissues.
  • Figure 5 shows the prostate cancer inhibitory effect by the anti-cancer peptide of ROR ⁇ stably expressed in PC cells.
  • A When MOCK (B) ROR ⁇ stably expressed PC cells were injected into nippled mice, (C) The left side of the prostate separated by MOCK, and the right side from nude mice injected with ROR ⁇ stably expressed PC cells Isolated prostate.
  • Figure 6 shows the anticancer effect by the ROR ⁇ of SEQ ID NO: 3 and ROR ⁇ of SEQ ID NO: 4 stably expressed in LNCap cells.
  • A MOCK
  • B When LNCap cells stably expressing ROR ⁇ 1 (SEQ ID NO: 4) were injected into the nippled mice,
  • C LNCap cells stably expressing ROR ⁇ 4 (SEQ ID NO: 5) are nippled mice Injected into (D), (E), (F) is a cancer mass extracted 10 weeks after cell line injection in LNCap Mock, LNCaP / ROR ⁇ 1 and LNCaP / ROR ⁇ 4.
  • the present invention provides an anticancer peptide of SEQ ID NO: 1 effective in prostate cancer and a gene encoding the same.
  • the present invention also provides the anticancer peptide and a method of preparing the same.
  • the manufacturing method is not limited thereto, but is preferably a manufacturing method by a genetic engineering method.
  • the invention provides an anticancer peptide comprising the amino acid sequence of 31 to 40 of SEQ ID NO: 1, wherein the 35 th serine is phosphorylated, or a functional equivalent thereof.
  • the term "functional equivalent" of the present invention includes all amino acid sequence variants in which part or all of the anticancer peptide of SEQ ID NO: 1 is substituted, or in which a part of an amino acid is deleted or added, to maintain the same function as the anticancer peptide. do.
  • Substitutions of amino acids are preferably conservative substitutions. Examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Deletion of amino acids is preferably located at portions not directly involved in the activity of the anticancer peptide.
  • the anticancer peptide may be part of a peptide consisting of the entire sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it may be a peptide of 31 to 40 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and a peptide consisting of some sequences including the same.
  • a peptide of SEQ ID NO: 2 wherein the 35th serine of SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid or a peptide of SEQ ID NO: 3 with glutamic acid.
  • Substituted aspartic acid and glutamic acid have properties similar to phosphorylated serine and are effective in anticancer effects.
  • the functional equivalent may be part of a peptide consisting of the entire sequence of SEQ ID NO: 2 or the entire sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the peptide of amino acid sequence 31 to 40 of SEQ ID NO: 2 or a partial sequence of SEQ ID NO: 2 comprising the same;
  • a peptide of amino acid sequence 31 to 40 of SEQ ID NO: 3 or a partial sequence of SEQ ID NO: 3 comprising the same.
  • nucleic acid sequence encoding the anticancer peptide and nucleic acid sequences equivalent to the sequence are provided.
  • “Equivalent nucleic acid sequences” include codon degenerate sequences of the anticancer peptide sequences.
  • cognate sequence is meant a nucleic acid sequence that encodes a peptide of the same sequence as the anticancer peptide disclosed herein but different from the naturally occurring sequence.
  • the present invention provides, in a third aspect, a recombinant vector comprising a DNA segment encoding an anticancer peptide of 1 to 3 or a functional equivalent thereof.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of binding and transferring another nucleic acid thereto.
  • expression vector includes plasmids, cosmids or phages capable of synthesizing proteins encoded by each recombinant gene carried by the vector.
  • Preferred vectors are vectors capable of self-replicating and expressing the nucleic acid to which they are bound.
  • a cell transformed with a recombinant vector comprising a DNA segment encoding an anticancer peptide of 1-3 or a functional equivalent thereof of SEQ ID NO.
  • the term 'transformation' used in the present invention means that foreign DNA or RNA is absorbed into a cell and the genotype of the cell is changed.
  • Suitable transformed cells include, but are not limited to, prokaryotes, fungi, plants, animal cells, and the like.
  • a fifth aspect of the present invention provides a method for producing an anticancer peptide using a cell transformed with a recombinant vector comprising a DNA segment encoding an anticancer peptide of 1 to 3 or a functional equivalent thereof of SEQ ID NO: 3.
  • HCT116 cells stably expressing ROR ⁇ (SEQ ID NO: 1), ROR ⁇ S35A or ROR ⁇ S35D (SEQ ID NO: 2) were used as a transwell cell migration assay.
  • Cell mobility testing was performed following the method of Kim et al. ("Roles of SUMOylation of of a reptin chromatin remodeling complex in cancer metastasis," Nat. Cell Biol. 8, 631-639).
  • the cultured cells were Wnt5a protein (100 ng). / ml) for 2.5 hours, and 2.5 x 10 4 HCT 116 cells were mounted on 24-well transwell chamber assay plates (BD Biocoat, BD Biosciences).
  • Adjusted McCoy's 5A medium containing 15% fetal calf serum was added to the bottom of the chamber as a chemoattractant. After 22 hours of incubation, the cells transferred to the lower chamber of the filter were fixed with 100% methanol, stained with DAPI, and quantified by counting the total cell count in four different fields. All experiments were performed according to the manufacturer's protocol. Values are expressed as mean ⁇ standard deviation for at least three independent tests. Treatment with Wnt5a reduced the migration of HCT116 colorectal cancer cells compared to untreated cells, and ROR ⁇ S35 expressing HCT116 colorectal cancer cells showed a significant decrease in cell mobility ( FIG. 1 ).
  • HCT116 cells stably expressing ROR ⁇ (SEQ ID NO: 1), ROR ⁇ S35A or ROR ⁇ S35D (SEQ ID NO: 2) were analyzed for cell growth in semisolid media. 10 5 cells were placed in McCoy's 5A medium containing 0.4% noble agar and 10% FCS. The cells were cultured for 3 weeks at 5% CO 2 and analyzed to form more colonies than 50 cells. Cells expressing ROR ⁇ S35D also had a greater inhibitory effect on adhering-independent growth than the control ( FIG. 2 ).
  • PC3 is a prostate tissue cell, a cell line in which cancer is active throughout metastasis.
  • PC3 cells are available from ATCC (ATCC ® Number: CRL-1435 TM).
  • ATCC ATCC ® Number: CRL-1435 TM.
  • a stable cell line was prepared to stably express the protein of ROR ⁇ in this cell line.
  • p3XFlag-CMV10 vector produced by Sigma-Aldrich
  • an expression plasmid having a DNA sequence that can be expressed as ROR ⁇ protein was prepared and then transfected into cells. Subsequently, only cells in which the ROR ⁇ DNA sequence was stably inserted into the intracellular chromosome were selected with antibiotics present in the plasmid to construct a cell line that always expresses ROR ⁇ .
  • PC3 is well arm formed, as shown in case (subcutaneous injecton) PC3 Mock ((A) and (C) in Fig. 5) to inject cells under the skin to increase the cancer active nude mice (purchased from ( ⁇ ) Orient Bio) happenss.
  • PC3 Mock ((A) and (C) in Fig. 5) to inject cells under the skin to increase the cancer active nude mice (purchased from ( ⁇ ) Orient Bio) happenss.
  • stable cell lines that stably express the ROR ⁇ in Fig. 5 (B), and (C) it is formed cancer is hardly occur by the function of the expressed ROR ⁇ protein. (C in Fig. 5) after cell injection 4 weeks after extraction of cancer masses (left MOCK, cell line stably expressed in ROR ⁇ cells on the right).
  • LNCaP like PC3, is a prostate tissue cell whose cancer has been activated through metastasis.
  • LNCaP cells are available from ATCC (ATCC® Number: CRL-1740 TM).
  • Stable cell lines were prepared to stably express the proteins of ROR ⁇ 1 (SEQ ID NO: 4) and ROR ⁇ 4 (SEQ ID NO: 5), respectively.
  • ROR ⁇ 4 unlike ROR ⁇ 1, is another isotype family of ROR ⁇ 1 that does not contain a peptide sequence that is important for functioning in cancer suppression.
  • LNCaP like PC3, also has high cancer activity, when a cell line is injected into the nude mouse (subcutaneous injecton) in a nude mouse (purchased by a 6-week-old nude mouse from Orient Bio, Inc.) ( Fig.
  • the anticancer peptide according to the present invention is ROR ⁇ or a functional equivalent thereof, wherein the 35 th serine of SEQ ID NO: 2 is phosphorylated, and specifically inhibits ⁇ -catenin transcriptional activity. Therefore, it is useful for the prevention and treatment of cancers that mediate the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway, and particularly useful for the treatment and prevention of colorectal cancer and prostate cancer.

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Abstract

본 발명은 RORα 유도체로부터 기원되는 항암 펩타이드에 관한 것으로서, 상기 항암 펩타이드를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 숙주세포를 이용한 항암제 생산 방법에 관한 것이다. 상기 항암 펩타이드는 암 특히 전립선암과 대장암의 치료 및 예방에 이용될 수 있다.

Description

항암 펩타이드 서열
본 발명은 대장암 및 전립선암에 효과적인 신규한 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자, 그리고 상기 펩타이드를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
Wnt 유전자들은 다양한 신호전달 과정을 매개하는 시스테인(cysteine)이 풍부한 분비 폴리펩티드들로 이루어진 하나의 큰 패밀리(family)를 암호화한다. Wnt 신호전달의 비정상적 활성은 발달 결함 및 종양 형성으로 연결되는 주된 원동력으로 작용한다(Klaus, Birchmeier, 2008; Korinek et al., 1997; Morin et al., 1997; Willert et al., 2003). Wnt 신호전달 경로는 두 개의 카테고리로 나뉘어져 왔다; 하나는 정규적 Wnt/β-카테닌(catenin) 신호전달 경로이고, 나머지 하나는 비정규적 Wnt/Ca2 + 신호전달 경로이다(Kuhl et al., 2000; Liang et al., 2007; Liu et al., 2005). Wnt 활성이 없는 경우, 세포질내 β-카테닌의 수준은, 카제인 키나제 I(casein kinase I, CKI) 및 글리코겐 신타제 키나제-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)를 통한 짝지워진 인산화 후 26S 프로테아솜(proteasome)에 의한 β-카테닌의 분해 때문에, 낮은 상태로 유지된다(Orford et al., 1997; Salic et al., 2000). 정규적 Wnt들은 프리즐드(Frz) 패밀리 단백질들 및 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질(LRP) 5 또는 6에 결합하며, 이 결합은 dishevelled (Dvl)를 활성화시키고 GSK-3β의 활성을 억제한다; 이 억제는 β-카테닌을 안정화시키며, TCF/LEF (T-cell factor/lymphoid enhancer factor)와 함께 표적 유전자 발현 조절을 위해 뒤이어 일어나는 핵으로의 전좌(translocation)를 일으킨다(Behrens et al., 1996; Giles et al., 2003; Molenaar et al., 1996; Moon et al., 2002).
Wnt5a와 같은 Wnt 리간드들에 의해 영향 받는 비정규적(Noncanonical) Wnt 신호전달 경로는 다양하고 때때로 반대되는 역할들을 가진다(Slusarski et al., 1997; Torres et al., 1996). 비정규적 Wnt들은 그것들의 수용체에 따라 정규적 Wnt 신호전달 경로에 대해 길항적이거나 상승적(synergistic)이다. Wnt5a-결함 마우스들은 말단지(distal limb)에서 증가된 β-카테닌 신호전달을 보였으며, 이는 Wnt5a 가 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 음성적 조절(negative regulation)과 관련이 있다는 것을 나타낸다(Nemeth et al., 2007). 반대로, Frz4 및 LRP5의 존재하에서 Wnt5a 는 Wnt/β-카테닌 신호전달을 증가시키는 것으로 나타났다(Mikels and Nusse, 2006). 비정규적 Wnt 신호전달 경로의 활성은 세포 내 Ca2+ 방출 및 Ca2+/칼모듈린(calmodulin)-의존적 키나제(kinase) II (CaMKII) 와 같은 Ca2+ 민감(sensitive) 효소들 및 단백질 키나제 C (PKC)의 활성을 가져온다는 점을 고려하면, 비정규적 Wnt 경로들은 정규적 Wnt 경로와는 명백히 다르다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 신규의 항암 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명은 신규의 항암 펩타이드를 암호화 하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명은 신규의 항암 펩타이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 세포배양, 결장암조직 및 마우스 모델 연구들을 기반으로, 대장암에서 인산화-의존적 방식으로 β-카테닌 전사활성을 약화시키는데 있어, 정규적 및 비정규적 Wnt 신호전달 경로 사이의 교차점에서 RORα(서열번호 1)가 수행하는 중요한 역할을 밝혔다. RORα-함유 복합체의 생화학적 정제는 β-카테닌이 하나의 구성요소라는 것을 나타내었고, 이는 RORα 및 Wnt 신호전달 경로 사이의 새로운 연결고리를 제공한다. RORα의 β-카테닌과의 상호작용 분석은 Wnt/β-카테닌 신호전달의 RORα-매개 억제는 RORα의 세린 잔기 35에 Wnt5a/PKCα-유발 인산화를 필요로 한다는 것을 보여주었으며, RORα의 β-카테닌에 대한 결합은 RORα의 인산화에 의해 유발 및 증가된다. 흥미롭게도, PKCα의 억제조절 (downregulation)과 함께 RORα 인산화의 감소는 Wnt 표적 유전자들의 활성 및 결장암 조직에서의 암 진전과 관련이 있다. 본 발명자들은 병태생리학적 모델에서 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하고 그로 인해 세포증식 및 암 진전을 조절하는데 있어서, 그동안 밝혀지지 않았던 RORα의 역할을 밝히고 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 10-2009-0001519호(2009.1.8)로 특허출원하였다. 상기 특허는 본 발명의 참고문헌으로 참조된다.
본 발명은 서열번호 1의 항암 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 서열번호 1의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터를 이용하여 항암 펩타이드를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항암 펩타이드는 암, 특히 전립선암 및 대장암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D를 발현하는 HCT116 세포에 대한 세포 이동성 분석 결과를 보인다.
도 2는 Wnt5a 처리시 RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D를 발현하는 HCT116 세포의 부착비의존성 성장을 보인다.
도 3 30개의 인간 대장암 조직과, 정상 조직을 비교하여 Pan-RORα에 대한 인산화된 RORα의 비율을 보인다.
도 4 30개의 인간 대장암 조직과, 정상 조직을 비교하여pan-PKCα에 대한 인산화된 PKCα의 비율을 보인다.
도 5은 PC 세포에 안정적으로 발현된 RORα의 항암 펩타이드에 의한 전립선 암 억제 효과를 보인다. (A) MOCK (B) RORα가 안정되게 발현된 PC 세포를 누두 마우스에 주입한 경우, (C) 왼쪽은 MOCK로 분리된 전립선, 오른쪽은 RORα가 안정되게 발현된 PC 세포가 주입된 누드 마우스부터 분리된 전립선.
도 6은 LNCap 세포에 안정적으로 발현된 서열번호 3의 RORα 및 서열번호 4의 RORα에 의한 항암효과를 보인다. (A) MOCK, (B) RORα 1(서열번호 4)이 안정되게 발현된 LNCap 세포를 누두 마우스에 주입한 경우, (C) RORα 4(서열번호 5)이 안정되게 발현된 LNCap 세포를 누두 마우스에 주입한 경우 (D), (E), (F)는 LNCap Mock, LNCaP/ RORα1 및 LNCaP/RORα4에서 세포주 주입 후 10주가 지나서 추출해 낸 암 덩어리의 모습이다.
본 발명은 전립선암에 효과적인 서열번호 1의 항암 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항암 펩타이드 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 유전공학적 방법에 의한 제조방법이다.
제 1 양태로, 본 발명은 서열번호 1의 31 내지 40의 아미노산 서열을 포함하고, 35번째 세린이 인산화된 항암 펩타이드 또는 이의 기능적 동등물를 제공한다.
본 발명의 "기능적 동등물"에는 서열번호 1의 항암 펩타이드의 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 상기 항암 펩타이드와 동일한 정도의 기능을 유지하는 것 모두를 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 항암 펩타이드의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.
상기 항암 펩타이드는 서열번호 1의 전체 서열로된 펩타이드의 일부분일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열 서열번호 1의 31 내지 40 의 펩타이드 및 이를 포함하는 일부 서열로 된 펩타이드일 수 있다.
상기 기능적 동등물로서 가장 바람직하는 것은 서열번호 1의 35번째 세린이 아스파트산으로 치환된 서열번호 2의 펩타이드 또는 글루탐산으로 치환된 서열번호 3의 펩타이드이다. 치환된 아스파트산과 글루탐산은 인산화된 세린과 유사한 성질을 가져 항암 효과에 효과적이다.
상기 기능적 동등물은 서열번호 2의 전체 서열 또는 서열번호 3의 전체서열로된 펩타이드의 일부분일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열 31 내지 40 의 펩타이드 또는 이를 포함하는 서열번호 2의 일부 서열로 된 펩타이드; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열 31 내지 40의 펩타이드 또는 이를 포함하는 서열번호 3의 일부 서열로된 펩타이드이다.
제 2 양태로 상기 항암 펩타이드을 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열들을 제공한다.
"등가의 핵산서열"에는 상기 항암 펩타이드 서열의 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.
"코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 항암펩타이드와 동일한 서열의 펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 의미한다.
본 발명은, 제 3 양태로는 서열 번호의 1 내지 3 또는 이의 기능적 동등물의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.
본 발명의 제 4 양태로는, 서열 번호의 1 내지 3 또는 이의 기능적 동등물의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다.
적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제 5 양태로는 서열 번호의 1 내지 3 또는 이의 기능적 동등물의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 이용하여 항암 펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.
< 실시예 1 > RORαS35D(서열번호 2)에 의한 세포 이동의 감소
RORα(서열번호 1), RORαS35A 또는 RORαS35D(서열번호 2)를 안정적으로 발현하는 HCT116 세포가 세포이동성 검사(transwell cell migration assay)dp 사용되었다. 세포 이동성 검사는 김 등("Roles of SUMOylation of of a reptin chromatin remodeling complex in cancer metastasis," Nat. Cell Biol. 8, 631-639)의 방법을 따라서 수행되었다.배양된 세포는 Wnt5a 단백질(100 ng/ml)로 2시간 동안 전처리 되었고, 2.5 x 104 HCT 116 세포가 24-웰 트랜스웰 챔버 분석 플레이트(BD Biocoat, BD Biosciences) 위에 올려졌다. 15%의 우태혈청을 포함하는 조정된 맥코이스 5A 배지가 화학주구성물질(chemoattractant)로 챔버의 아래에 첨가되었다. 22시간의 항온반응후에, 필터의 아래 챔버로 이동된 상기 세포를 100% 메탄올로 고정하고, DAPI로 염색하고, 4개의 다른 필드에서 전체 세포 수를 세어서 정량하였다. 모든 실험은 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다. 수치는 적어도 3번의 독립적 시험에 대하여 평균±표준편차로서 나타내었다. 세포이동성 검사에서 Wnt5a의 처리는 비처리 세포에 비하여 HCT116 대장암 세포의 이동을 감소시켰고, RORαS35 발현 HCT116 대장암 세포는 상당한 정도의 세포 이동성 감소를 보였다(도 1).
<실시예 2> RORαS35D(서열번호 2)에 의한 콜로니 형성 능력의 감소
부착비의존성 성장(anchorage independent growth)을 측정하기 위하여, RORα(서열번호 1), RORαS35A 또는 RORαS35D(서열번호 2)를 안정적으로 발현하는 HCT116 세포를 반고체 배지에서 세포 성장을 분석하였다. 105 세포를 0.4% 노블 아가(noble agar) 및 10% FCS를 포함하는 맥코이스 5A 배지에 놓았다. 상기 세포는 5%의 CO2에서 3주간 배양되고, 50세포보다 많는 콜로니가 형성되는 것을 분석하였다. RORαS35D를 발현하는 세포는 대조구에 비하여부착비의존성 성장의 억제 효과도 컸다(도 2)
<실시예 3> 인간의 대장암에서 RORα인산화의 감소
RORα의 임상적인 의미를 발견하기 위하여 30개의 인간 대장암 조직에서 인산화된 RORα의 발현을 조사하여, 정상의 점막 시료와 대비하였다. 항-인산- RORα S35D IgG에 대한 면역분석에서 대장암 경우에 30개에서 22개(>70%) RORα인산화가 감소되었다. 반면에 pan- RORα의 발현은 거의 변화가 없었다(표 1).
<표 1> 대장암 조직과 정상 점막 시료에서 항-인산- ROR 면역학적 분석
Figure PCTKR2010009358-appb-I000001
통계학적 분석에서 정상세포에 비하여 암 조직 시료에서 인산화된 RORα 및 인산화된 PKCα의 의미 있는 감소를 보였다(도 3 및 도 4)). 이 데이타는 인간의 대장암에서 RORα의 인산화 감소가 빈번한 것임을 보인다.
<실시예 4> RORα를 안정적으로 발현하는 PC3 세포주를 이용한 전립선 암세포 성장 억제
PC3는 전립선 조직 세포로 암이 전이과정으로까지 활성화되어 있는 세포주이다. PC3 세포는 ATCC회사에서 구입(ATCC® Number: CRL-1435™ )이 가능하다. 이 세포주에 RORα의 단백질을 안정적으로 발현할 수 있도록 안정적인 세포주를 제작하였다. p3XFlag-CMV10 벡터(Sigma-Aldrich 회사에서 생산)를 이용하여 RORα단백질로 발현될 수 있는 DNA 서열을 가진 발현 플라스미드를 제작한 후 이를 세포에 주입(transfection)하였다. 이 후에 RORα DNA 서열이 세포 내 염색체에 안정적으로 삽입 된 세포만을 플라스미드 내에 존재하는 항생제로 골라내어 항상 RORα를 발현하는 세포주를 구축하였다. PC3는 암 활성이 높아 누드 마우스(㈜ 오리엔트 바이오 에서 구입)에 피부 밑으로 세포주를 주입할 경우 (subcutaneous injecton) PC3 Mock(도 5의 (A) 및 (C))에서 보는 것과 같이 암 형성이 잘 일어난다. 그러나 RORα를 안정적으로 발현하는 안정적인 세포주(도 5의 (B), 및 (C)의 경우는 발현된 RORα 단백질의 기능에 의해 암 형성이 거의 일어나지 않게 된다. 도 5 의 (C) 는 세포주 주입 후 4주가 지나서 추출해 낸 암 덩어리의 모습이다(왼쪽 MOCK, 오른쪽 ROR α 세포내에서 안정적으로 발현된 세포주) .
< 실시예 5 > RORα를 안정적으로 발현하는 LNCaP 세포주를 이용한 전립선 암세포 성장 억제
LNCaP 역시 PC3와 마찬가지로 전립선 조직 세포로 암이 전이과정으로까지 활성화되어 있는 세포주이다. LNCaP 세포는 ATCC회사에서 구입(ATCC® Number: CRL-1740 ™ )이 가능하다. 이 세포주에 RORα 1 (서열번호 4) 및 RORα4(서열번호 5)의 단백질을 각각 안정적으로 발현할 수 있도록 안정적인 세포주를 제작하였다. RORα4는 RORα 1과는 달리 암 억제과정에 기능하는 데 중요한 펩타이드 서열을 포함하고 있지 않는 RORα 1의 다른 이소타입 패밀리 단백질이다. p3XFlag-CMV10 벡터(Sigma-Aldrich 회사에서 생산)을 이용하여 RORα 1 및 RORα4 단백질로 각각 발현될 수 있는 DNA 서열을 가진 발현 플라스미드를 제작한 후 이를 세포에 주입(transfection)하였다. 이 후에 RORα 1 및 RORα4 DNA 서열이 세포 내 염색체에 안정적으로 삽입 된 세포만을 플라스미드 내에 존재하는 항생제로 골라내어 항상 RORα를 발현하는 세포주를 구축하였다. LNCaP 역시 PC3와 마찬가지로 암 활성이 높아 누드 마우스(㈜ 오리엔트 바이오 에서 6주령 누드 마우스를 구입하여 사용)에 피부 밑으로 세포주를 주입할 경우 (subcutaneous injecton) LNCaP Mock(도 6의 (A) 및(C)))에서 보는 것과 같이 암 형성이 잘 일어난다. 그러나 RORα 1을 안정적으로 발현하는 안정적인 세포주 LNCaP/ RORα1의 경우는 발현된 암 억제에 기능하는 펩타이드 서열을 가진 RORα 1 단백질의 기능에 의해 암 형성이 거의 일어나지 않았다(도 6의 (B) 및 (E)). 그러나 이와는 달리 RORα 1의 N-말단 부분이 다르고, 인산화되기 위한 35번째 세린이 없는 RORα4를 안정적으로 발현되는 안정적인 세포주 LNCaP/RORα4의 경우에는 이러한 억제가 잘 관찰되지 않는다(도 6의 (C) 및 (F)). 도 6의 (D), (E), (F)는 LNCap Mock, LNCaP/ RORα1 및 LNCaP/RORα4에서 세포주 주입 후 10주가 지나서 추출해 낸 암 덩어리의 모습이다.
본 발명에 따른 항암 펩타이드는 서열번호 2의 35번째 세린이 인산화된 RORα 또는 이의 기능적 동등물로서, β-카테닌 전사 활성을 특이적으로 방해한다. 따라서 Wnt/β-카테닌 신호 경로를 중재하는 암의 예방 및 치료에 유용하며, 특히 대장암 및 전립선암의 치료 및 예방에 유용하게 사용이 가능하다.

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 31 내지 40의 아미노산 서열을 포함하고, 35번째 세린이 인산화된항암 펩타이드 또는 이의 기능적 동등물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 기능적 동등물은 서열번호 2 또는 서열번호 3인 것을 특징으로 하는 항암 펩타이드.
  3. 서열 번호 2 또는 서열번호 3 중 어느 하나의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 유전자.
  4. 서열 번호 2 또는 서열번호 3 중 어느 하나의 항암 펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합벡터.
  5. 제 4 항에 따른 재조합벡터로 형질전환된 세포.
  6. 제 5 항에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 항암 펩타이드를 분리하는 것을 특징으로하는 항암 펩타이드 생산 방법.
  7. 서열번호 1의 31 내지 40의 아미노산 서열을 가지고, 35번째 세린이 인산화된 항암 펩타이드.
  8. 서열번호 2의 31 내지 40의 아미노산 서열을 가지는 항암 펩타이드.
  9. 서열번호 3의 31 내지 40의 아미노산 서열을 가지는 항암 펩타이드.
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