WO2011042872A1 - Use of a dna replication inhibitor for treating neurodegenerative diseases caused by polyglutamine expansion - Google Patents

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WO2011042872A1
WO2011042872A1 PCT/IB2010/054522 IB2010054522W WO2011042872A1 WO 2011042872 A1 WO2011042872 A1 WO 2011042872A1 IB 2010054522 W IB2010054522 W IB 2010054522W WO 2011042872 A1 WO2011042872 A1 WO 2011042872A1
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atxn3
elavgs
replication
dna
inhibitor
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Hervé Tricoire
Véronique Monnier
Anita Reinhardt
Michael Rera
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Universite Paris Diderot - Paris 7
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicaments for the treatment of neurodegenerative diseases by polyglutamine expansion, more particularly dominant spinocerebellar ataxias.
  • Human neurodegenerative diseases represent a major public health problem given the aging of the population. Indeed, many of these diseases have an increased incidence with age. This could be related to the failure, with age, of adaptive mechanisms capable of containing the cellular dysfunctions at the origin of these pathologies.
  • ADCA autosomal spinocerebellar ataxias
  • SCA1 the dominant autosomal spinocerebellar ataxias
  • DRPLA dentato-rubro-pallido-luysian atrophy
  • SBMA spino-bulbar muscular atrophy
  • invertebrate models (Drosophila and nematode) have been used to study polyglutamine expansion diseases and Parkinson's and Alzheimer's diseases.
  • these models reproduce the main characteristics of human pathologies and make it possible to carry out rapid genetic screens (Bilen and Bonini 2005, Zoghbi and Botas 2002, Bonini and Fortini, 2003).
  • the functional conservation of the different regulatory pathways between invertebrates and vertebrates makes it possible to use the results obtained to develop treatments for human pathologies.
  • several compounds that have been shown to be effective in Drosophila are in clinical trials in humans (Shulman et al, 2003).
  • Khurana et al. Showed in a Drosophila model of tauopathy that the cell cycle is reactivated in post-mitotic neurons of adult flies, and that inhibition of certain cell cycle proteins is able to suppress the phenomenon. observed neurodegeneration of the eye in this pathology (Khurana et al, 2006 and 2007).
  • Copani et al. Have shown, in vitro, using a model of cells expressing amyloid peptide ⁇ 42, that the toxicity of this peptide is reduced in cells where the DNA polymerase beta is inactivated (Copani et al, 2002, 2006, 2007 and 2008).
  • Khurana et al (2006) have shown using a Drosophila model of tauopathy that the expression of the MJD- 78Q (MJD protein, also called ATXN3, having an expansion of 78 glutamines) induced apoptotic neurodegeneration, without the authors being able to observe the presence of certain markers of replication and mitosis (PCNA, PH3) or have managed to modulate the pathology by inhibiting the proteins involved in the cell cycle in this model.
  • MJD- 78Q MJD protein, also called ATXN3, having an expansion of 78 glutamines
  • HDAC8 histone deacetylase 8
  • Hsp90 chapperone protein
  • the inventors have established three Drosophila models of dominant spinocerebellar ataxias (SCA1, SCA3 and SCA7).
  • the principle of these models is shown in Figure 1: the polyglutaminic pathological forms of the ATXN1, ATXN3 and ATXN7T proteins involved in human ADCA are induced in adult Drosophila (in the eye, neurons or glial cells) using the two-component system GAL4-UAS (Brand and Perrimon, 1993, Latouche et al, 2007).
  • the protein Ataxin 1 (ATXN1) comprising an expansion of 82 glutamines (ATXN1-82Q) was expressed.
  • the protein Ataxin 3 (ATXN3) comprising an expansion of 70 glutamines (ATXN3-70Q) was expressed.
  • the truncated Ataxin 7 protein (ATXN7T) comprising an expansion of 102 glutamines (ATXN7T-102Q, Latouche et al., 2007) was expressed.
  • the inventors have used an elav-GAL4GS line for which the transcriptional activity of GAL4 is under the control of an inducer, RU486 (mifepristone), which can be ingested in adult flies.
  • the inventors have surprisingly identified the gene DNA-pol-alpha50, orthologue of the human prim1 gene (coding for primase, a protein that plays a major role in the replication of DNA) as a major modulator. of these 3 ataxies.
  • the inventors have shown that the reduction of the level of the DNApol-alpha50 protein by RNA interference makes it possible to largely eliminate the toxic effects of the pathological proteins in the 3 Drosophila models SCA1, SCA3 and SCA7 studied.
  • the observed cell protection concerns both neurons and glial cells.
  • Rescue of neurodegeneration in the eye has also been observed by the inventors on a Drosophila model of Huntington's disease in which the level of the DNApol-alpha50 protein is reduced by RNA interference.
  • DNA replication complexes comprising the ORC and MCM proteins, which are put in place during the pre-replication phase preceding the replication of the DNA proper. Activation of these complexes induces replication, in which the primase synthesizes the RNA primers required for DNA polymerases (polalpha and epsilon) to effect the synthesis of a complementary DNA strand;
  • proteins controlling the course of the cell cycle such as cdk kinases and cyclins (Sclafani and Holzen, 2007);
  • DNA polymerases such as the subunit B of DNA polymerase alpha (POLA2) (Takahashi et al., 1996).
  • the subject of the present invention is therefore the use of an inhibitor of DNA replication, which DNA replication inhibitor is an inhibitor of a protein selected from primases, replication, helicases, DNA polymerases, DNA ligases, topoisomerases, kinases, nuclear proliferation nuclear antigens (PCNA), replication factors A and C, preferably a primase, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion.
  • DNA replication inhibitor is an inhibitor of a protein selected from primases, replication, helicases, DNA polymerases, DNA ligases, topoisomerases, kinases, nuclear proliferation nuclear antigens (PCNA), replication factors A and C, preferably a primase, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion.
  • PCNA nuclear proliferation nuclear antigens
  • DNA replication inhibitor is meant a compound which, when administered to a subject, inhibits totally or by at least 20%, and in order of increasing preference by at least 50%, % and 95%, the replication of DNA in the tissues, preferably the neuronal and / or glial cells, of said subject compared to a level of replication of the measured DNA in the absence of the administration. without treatment) of said inhibitory agent.
  • Inhibition of DNA replication can be determined by techniques known to those skilled in the art, such as, for example, in vitro, by the incorporation of 3 H-labeled thymidine or bromodeoxyuridine (BrdU; thymidine) or, flow cytometric analysis or, in vivo, through the analysis of the final size of rapidly growing organs (Shibutani et al., 2008).
  • the DNA replication inhibitor can act by preventing the attachment of a ligand (e.g., substrate) to the active site of the protein, or cause conformational deformation of the protein that renders it inactive.
  • a ligand e.g., substrate
  • the DNA replication inhibitor can be a chemical or biological compound of natural or synthetic origin. It can be chosen from an antibody, a nucleic acid (such as an interfering RNA, an antisense RNA or a ribozyme), a peptide, a protein, preferably an interfering RNA.
  • a nucleic acid such as an interfering RNA, an antisense RNA or a ribozyme
  • a peptide such as an interfering RNA, an antisense RNA or a ribozyme
  • a protein preferably an interfering RNA.
  • Inhibition of DNA replication is of course dependent upon the doses at which the inhibitor is used.
  • the DNA replication inhibitor may also have one or more other actions that are not inhibiting the replication of the DNA.
  • the inhibitory action of the replication of the DNA of said compound must be preponderant at the dose (or concentration) used compared to its other actions.
  • said inhibitor of DNA replication is an inhibitor of DNA replication of post-mitotic cells, such as neurons.
  • said inhibitor of DNA replication inhibits the expression of a gene selected from prim1 genes (coding for primase DNA), mcm2 (coding for protein "minichromosome maintenance complex component 2"), Cdtl (coding for the "chromatin licensing and DNA replication factor 1" protein), PLOA2 (encoding the DNA polymerase alpha subunit B), Timeless (encoding the protein TIM) and the orthologous genes of these genes, preferably the prim1 gene.
  • prim1 genes coding for primase DNA
  • mcm2 coding for protein "minichromosome maintenance complex component 2"
  • Cdtl coding for the "chromatin licensing and DNA replication factor 1" protein
  • PLOA2 encoding the DNA polymerase alpha subunit B
  • Timeless encoding the protein TIM
  • orthologous genes of these genes preferably the prim1 gene.
  • said inhibitor of DNA replication activates or increases the expression of a DNA replication inhibiting gene selected from the Huwel genes (coding for the HECT protein, UBA and WE containing domain 1, Chk1 (coding for CHK1 kinase) and the orthologous genes of these genes.
  • Inhibition of DNA replication can also be achieved with an alkylating agent (e.g., cyclophosphamide, platinum salts), an intercalating agent (e.g., anthracyclines) or a nucleic acid analogue (e.g., 5-FU).
  • an alkylating agent e.g., cyclophosphamide, platinum salts
  • an intercalating agent e.g., anthracyclines
  • a nucleic acid analogue e.g., 5-FU
  • subject is meant a mammal, preferably a human.
  • said neurodegenerative polyglutamine expansion disorder is selected from Huntington's disease, autosomal dominant spinocerebellar ataxias 1, 2, 3, 6, 7 and 17, dentato-rubro atrophy. -pallido-luysian and Kennedy's disease (or spino-bulbar muscular atrophy), preferably autosomal dominant spinocerebellar ataxias and Huntington's disease, and more preferably autosomal dominant spinocerebellar ataxias 1, 3 and 7.
  • the modes and routes of administration of the pharmaceutical composition may be adapted by those skilled in the art depending on the subject, the pathology to be treated and the inhibitor of the replication of the DNA used.
  • the pharmaceutical composition prepared according to the invention can be formulated for oral or nasal administration, or by intravenous, intramuscular, subcutaneous, nasal or intracranial injection.
  • Determination of the dose at which said inhibitor of DNA replication is used can be carried out by techniques known to those skilled in the art, for example in clinical trials.
  • This dose will depend on various factors including DNA replication inhibitor activity, mode of administration, duration of administration, level of DNA, duration of treatment, other drugs or compounds used in combination with the DNA replication inhibitor, age, sex, weight, general health status and of the prior medical history of the subject being treated.
  • this dose may be between 5 mg / kg and 60 mg / kg, preferably between 10 mg / kg and 30 mg / kg.
  • the pharmaceutical composition may comprise at least one pharmaceutically acceptable excipient which may be any excipient known to the skilled person.
  • the pharmaceutically acceptable excipients vary depending on the DNA replication inhibitor and the mode of administration chosen.
  • DNA replication inhibitors used in accordance with the present invention may be used in a subject with a reported polyglutamine expansion neurodegenerative disease, including the early and / or late stages of the disease. These DNA replication inhibitors do not necessarily cure the subject with the disease, but may delay or slow progression or prevent further progression of the disease, thereby improving the subject's condition. These DNA replication inhibitors may also be administered to a subject who does not have symptoms of a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion, but who may develop the disease, or who has a significant risk of developing the disease.
  • the present invention also relates to a method for treating a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion, comprising the administration of an effective amount of at least one inhibitor of the replication of the DNA as defined above, to a subject in need of this treatment.
  • a method for treating a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion comprising the administration of an effective amount of at least one inhibitor of the replication of the DNA as defined above, to a subject in need of this treatment.
  • an effective amount is meant an amount of DNA replication inhibitor to produce the desired biological result.
  • FIG. 1 represents the principle of establishing a Drosophila model expressing a human pathological ATXN protein under the control of an inducible promoter (elav).
  • Drosophila carrying a transposon containing mutated human ATXN protein under the control of UAS regulatory sequences are crossed with individuals carrying a transposon containing the GAL4GS regulatory protein under the control of an inducible specific tissue promoter (here the neuronal promoter elav).
  • the GAL4GS protein is produced in the tissue under consideration. It only becomes active in the presence of RU486 which is brought into the animals' food.
  • GAL4GS binds to the UAS sequences and activates the transcription of the adjacent gene and the production of the pathological human protein. The phenotypes of these individuals can then be studied;
  • FIG. 2 represents the principle of a genetic screen by interfering RNA inactivation.
  • Drosophila expressing a pathological protein eg, Ataxin 3
  • a specific tissue eg, neurons
  • a gene modifying interest rated GM
  • Drosophila express the pathological protein and a double-stranded RNA corresponding to the GM sequences.
  • RNAi GM-specific double-stranded RNA
  • FIG. 3 represents the distribution of average lifetimes observed in the sieve of the lines from the VDRC storage center corresponding to Table II below (solid bars). The normal distribution corresponding to the same average value and the same standard deviation is represented in empty bars. The position of individuals of genotype elavGS> ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 ⁇ v43870 ⁇ is indicated by an arrow;
  • 102Q (b) or ATXN1 -82Q (c) is strongly reduced (closed circles) compared to control individuals with the same genotype but not expressing the pathological protein (open circles) or expressing a non-pathological protein such as EGFP or luciferase (open squares).
  • FIG. 6 represents a Western blot analysis of male Drosophila expressing the ATXN3-70Q pathological protein in neurons. This analysis shows that the expression of TATXN3-70Q is not modified by the presence of the transposon DNApol-a50- ⁇ v43870 ⁇ .
  • Genotypes elav-GAL4GS, UAS-ATXN3- 70Q / UAS-EGFP (left track); elav-GAL4GS, UAS-ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 ⁇ v43870 ⁇ (right track);
  • FIG. 7 is a graph showing that the survival of Drosophila expressing in a subset of glial cells ATXN7T-102Q pathological protein is greatly reduced (closed circles) with a lifetime not exceeding 16 days. Simultaneous reduction of the level of primase (DNApolalpha50) (solid triangles) improves survival in this glial model of ataxia;
  • FIG. 8 photographs showing, in Drosophila, the neurodegeneration induced by the expression in the eye of the truncated pathological human Huntingtin protein (photo A) compared to the phenotype restored by the decrease in the expression of primase induced by Interfering RNA (photo B).
  • Three neuronal models of different spinocerebellar ataxias were generated by combining a pilot line expressing the GAL4 protein under the control of the specific promoter of the differentiated neurons elavGS (Latouche et al, 2007) and lines containing a transposon (pUAS; Brand and Perrimon, 1993) comprising a sequence coding for a pathological ATXN protein (pUAST-ATXN).
  • the lines thus generated are noted elavGS> ATXn.
  • the principle of establishing a Drosophila model expressing a human pathological ATXN protein under the control of an inducible promoter is shown in Figure 1.
  • the pUAST-ATXN1-82Q line (Fernando-Funez et al., 2000) expresses Ataxin 1 containing 82 glutamine repeats.
  • the pUAST-ATXN3-70Q line was produced by transgenesis after cloning into a pUAST vector of a cDNA coding for Ataxin 3 and containing 70 repeats of the CAG triplet (Mueller et al, 2009).
  • the pUAST-ATXN7T-102Q line is described in Latouche et al, 2007.
  • the pUAST-ATXN7T-102Q line was recombined with the EAAT1-GAL4 line (Rival et al., 2004), expressing the protein of interest in a subset of glial cells, to establish a glial model of spinocerebellar ataxia.
  • the resulting line is denoted ATQN7T-102Q.
  • the pUAST-ATXN3T-78Q line (Warrick et al, 1998) was crossed with the GMR-GAL4 line (accession number FBrf0091569 in the FlyBase database), expressing the protein of interest in the cells of the eye , to establish a model of spinocerebellar ataxia eye.
  • the resulting line is noted GMR> ATXN3T-78Q.
  • RNAi lines (expressing an interference-specific RNA of a modifier gene of interest) used for genetic screens were obtained from the Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC, Vienna, Austria).
  • VDRC Vienna Drosophila RNAi Center
  • the other mutant lines used for genetic screens were obtained from the Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana University, Bloomington, USA).
  • Figure 2 represents the principle of a genetic screen by interfering RNA inactivation.
  • the UAS-GFP-IR line has been described by Roignant et al, 2003.
  • Drosophila were raised on a nutrient medium containing 8.2% yeast, 3.4% corn flour, 5% sucrose, 1.1% agarose and 2.5% methyl benzoate (an antifungal) .
  • the inducer, RU486 diluted in 100% ethanol
  • the control medium without inductor was supplemented with the same volume of 100% ethanol.
  • Female Drosophila elavGS> ATXN were crossed with males of lines bearing the mutations or transposons to be tested as well as possibly with control lines (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR and UAS-Luci) whose expression does not does not change longevity.
  • the resulting individuals were separated in groups of 30 into tubes containing an inducible nutrient medium (RU200) or containing a non-inducible medium (RU0). The screen was held at a constant temperature (26 ° C). Unless otherwise specified, the animals analyzed are males.
  • mice of genotype GMR> ATXN3-78Q and males of genotype DNApol-alpha50 ⁇ v43870 ⁇ and UAS-GFP-IR were cultured at a temperature of 23 ° C and crossed together. Optical examination of the structure of the eye was performed on males obtained, aged 3 days, with a Leica M205FA stereomicroscope.
  • Ataxin 3 in Drosophila genotype elavGS> ATXN3-70Q / UAS-EGFP and elavGS> ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 ⁇ v43870 ⁇ grown for 4 days on inducible medium was analyzed by Western blot. 10 flies of each condition (induction or not of the expression of the pathological protein) were crushed in ⁇ of urea buffer supplemented with antiproteases. After centrifugation for 10 minutes at 12000 rpm at 4 ° C., the supernatants were denatured for 5 minutes at 95 ° C. in Laemmli buffer before being deposited on a 12% polyacrylamide gel, for analysis by electrophoresis.
  • Drosophila models of spinocerebellar ataxia type SCA1, SCA3 and SCA7 have been generated and characterized by various studies: phenotype analysis induced by different pilot lines ("drivers") GAL4, reduction of longevity caused by the expression of the pathological protein in the brain, labeling of brains in toto or cryostat frozen brain sections with antibodies directed against proteins of interest (ubiquitin, proteasome subunits, transcription factors) identified in mammals aggregates containing pathological proteins (Sang and Jackson, 2005), kinetic study of aggregate formation (Latouche et al., 2007), quantification of locomotor activity.
  • Drosophila models reproduce the characteristics of human pathologies, including a sharp reduction in life span and a progressive motor deficit.
  • Table I Drosophila males of several control lines (wild (w), UAS-EGFP, UAS-GFP-IR and UAS-Luci) were crossed with females of genotype elavGS> ATXN3-70Q or elavGS (controls). The descendants of these crosses, the genotype of which is indicated in column 1, were placed under induced conditions (the flies are placed on medium containing 200 of RU486, medium RU200) or in uninduced condition (column 2). The average lifetimes in days (column 4) were compared. A 35% decrease in life is observed when pathological Ataxin 3 is expressed, with highly significant statistical differences between the longevity curves analyzed by LogRank test (column 6). Drosophila controls not expressing Ataxin 3 are not sensitive to RU486 treatment. The numbers analyzed (N) for each condition (induced or uninduced expression) are shown in column 3.
  • Table II Screening results of genes modifying the toxicity of Ataxin 3 on the Drosophila SCA3 model after induction (on RU200 medium).
  • the genotypes are carried in column 2, the numbers (N) in column 3 and the lifespan in column 4.
  • the control curve corresponds to the average of the lines after elimination of the extremes of the life distribution (deciles 3 to 8 ).
  • the ratio of average life time to that of the control curve is reported in column 5 and the probability of a significant difference between the 2 survival curves by a LogRank test is given in column 6
  • An increase in the lifetime of 44% is observed when the DNApol-alpha50 is inactivated (second last line of the table).
  • Table III presents the results obtained in the various experiments carried out on the 3 Drosophila models of ataxies (SCA1, SCA3 and SCA7) expressing an RNAi specific for the DNApol-alpha50 gene.
  • SCA1 Drosophila model of ataxies
  • SCA7 Drosophila model of ataxies
  • ATXN3-70Q protein has been expressed either in neuronal cells or in glial cells.
  • the ratings are the same as in Table II.
  • the genotypes used for the different experiments for the calculations of the average life ratio and the analysis of the survival curves are indicated in bold type.
  • Table III Screening Results of the Ataxin 1, 3 and 7 Toxicity Modifying Genetic Screens on Drosophila Models SCA1, SCA3 and SCA7 respectively
  • the improved survival is also accompanied by an increase in locomotor performance of SCA3 flies that are similar to the wild (unquantified) line.
  • GMR-GAL4 was used to express a truncated ATXN3T-78Q pathological protein in the eye. Under these conditions, a strong degeneration of the eye has been observed ( Figure 5). This phenotype is suppressed in the GMR-GAL4, UAS-ATXN3T-78Q / UAS-DNApol-alpha50 (v43870) flies where DNApol-alpha50 is inactivated by RNA interference ( Figure 5).
  • DNApol-alpha50 is very strongly conserved in humans (orthologue of PRIM1) and plays a major role in the replication of DNA.
  • pre-RC pre-replication
  • pre-RC DDB1 ddbl Origin of pre-replication (pre-RC) dup Cdtl Origin of pre-replication (pre-RC)
  • Table V Results of the screen of modifying genes using the Drosophila model SCA3 (after induction of the expression of the ATXN3-70Q protein in RU200 medium). The ratings are the same as for Table II above.
  • the reference genotypes used for the different experiments for the calculations of the average life ratio and the survival curve analysis are indicated by an asterisk. Some experiments (represented in bold type) were performed on female flies for reasons of chromosomal location of the insertions.
  • EXAMPLE 2 DEMONSTRATING THE EFFECT OF REDUCING THE EXPRESSION OF PRIMASE ON HUNTINGTON'S DISEASE IN DROOSOPHILE
  • the GMR-UAS-Htt-93Q line was created from a pUAS-Htt 93Q line (Steffan et al, 2001).
  • the culture conditions are identical to those described in Example 1.
  • GMR-GAL4 was used to express the truncated human pathogenic Huntingtin protein Htt-93Q (intron 1) in the eye. Under these conditions, a strong degeneration of the eye has been observed (FIG. 8A). This phenotype is suppressed in UAS-Htt-93Q / UAS-DNApol-alpha50 ⁇ v43870 ⁇ flies where DNApol-alpha50 is inactivated by RNA interference ( Figure 8B).

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Abstract

The present invention relates to the use of a DNA replication inhibitor for treating a neurodegenerative disease caused by polyglutamine expansion.

Description

UTILISATION D'UN INHIBITEUR DE LA REPLICATION DE L'ADN POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES NEURODEGENERATIVES PAR EXPANSION USE OF A DNA REPLICATION INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES BY EXPANSION
DE POLYGLUTAMINE POLYGLUTAMINE
La présente invention concerne le domaine des médicaments destinés au traitement des maladies neurodégénératives par expansion de polyglutamine, plus particulièrement des ataxies spinocérébelleuses dominantes.  The present invention relates to the field of medicaments for the treatment of neurodegenerative diseases by polyglutamine expansion, more particularly dominant spinocerebellar ataxias.
Les maladies neurodégénératives humaines représentent un problème majeur de santé publique compte tenu du vieillissement de la population. En effet, un grand nombre de ces maladies voit leur incidence augmenter fortement avec l'âge. Ceci pourrait être lié à la défaillance, avec l'âge, de mécanismes adaptatifs capables de contenir les dysfonctionnements cellulaires à l'origine de ces pathologies.  Human neurodegenerative diseases represent a major public health problem given the aging of the population. Indeed, many of these diseases have an increased incidence with age. This could be related to the failure, with age, of adaptive mechanisms capable of containing the cellular dysfunctions at the origin of these pathologies.
Parmi les maladies neurodégénératives, les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes (ADCA, dénommées aussi ataxies spinocérébelleuses dominantes) représentent un groupe de plus d'une vingtaine de maladies rares (1 personne sur 10 000 est affectée), caractérisées par des troubles moteurs liés à une dégénérescence du cervelet. Les ataxies spinocérébelleuses dominantes les plus répandues (SCA1 , 2, 3, 6, 7, 17) appartiennent à la classe des maladies par expansion de polyglutamine dont font aussi partie la maladie de Huntington, l'atrophie dentato-rubro-pallido-luysienne (DRPLA) et la maladie de Kennedy (ou amyotrophie spino-bulbaire ; SBMA) (Soong and Paulson, 2007 ; Gatchel and Zoghbi 2005). Ces maladies sont dues à une mutation par expansion du codon CAG (codant pour la glutamine) dans la séquence du gène codant pour la protéine responsable de la maladie (e.g., Huntingtine, Atrophine-1 , Ataxine-1 , 2, 3 ou 7). Au delà d'un certain nombre de répétitions de la glutamine, la protéine devient toxique pour la cellule et l'organisme, selon des mécanismes encore mal compris.  Among the neurodegenerative diseases, the dominant autosomal spinocerebellar ataxias (ADCA, also known as spinocerebellar dominant ataxias) represent a group of more than twenty rare diseases (1 in 10 000 is affected), characterized by motor disorders related to degeneration of the cerebellum. The most common dominant spinocerebellar ataxias (SCA1, 2, 3, 6, 7, 17) belong to the class of polyglutamine expansion diseases, which also include Huntington's disease, dentato-rubro-pallido-luysian atrophy ( DRPLA) and Kennedy's disease (or spino-bulbar muscular atrophy, SBMA) (Soong and Paulson 2007, Gatchel and Zoghbi 2005). These diseases are due to an expansion mutation of the CAG codon (coding for glutamine) in the gene sequence coding for the protein responsible for the disease (eg, Huntingtin, Atrophin-1, Ataxin-1, 2, 3 or 7). . Beyond a number of repetitions of glutamine, the protein becomes toxic to the cell and the body, according to mechanisms still poorly understood.
De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier ces pathologies humaines. Parmi ceux-ci, les modèles invertébrés (drosophile et nématode) ont été utilisés pour étudier les maladies par expansion de polyglutamine et les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. En effet, ces modèles reproduisent les principales caractéristiques des pathologies humaines et permettent de réaliser des cribles génétiques rapides (Bilen and Bonini, 2005 ; Zoghbi and Botas, 2002 ; Bonini and Fortini, 2003). La conservation fonctionnelle des différentes voies de régulation entre invertébrés et vertébrés, permet d'utiliser les résultats obtenus pour développer des traitements des pathologies humaines. Ainsi, plusieurs composés ayant montré leur efficacité chez la Drosophile sont en cours d'essais cliniques chez l'homme (Shulman et al, 2003). Many animal models have been developed to study these human pathologies. Of these, invertebrate models (Drosophila and nematode) have been used to study polyglutamine expansion diseases and Parkinson's and Alzheimer's diseases. In fact, these models reproduce the main characteristics of human pathologies and make it possible to carry out rapid genetic screens (Bilen and Bonini 2005, Zoghbi and Botas 2002, Bonini and Fortini, 2003). The functional conservation of the different regulatory pathways between invertebrates and vertebrates makes it possible to use the results obtained to develop treatments for human pathologies. Thus, several compounds that have been shown to be effective in Drosophila are in clinical trials in humans (Shulman et al, 2003).
La plupart des neurones ne se divisant pas dans le cerveau adulte, les marqueurs de cycle cellulaire caractéristiques de la phase de réplication de l'ADN ne sont normalement pas activés. Or, il a été montré dans des modèles de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la sclérose amyotrophique latérale, les tauopathies et la maladie d'Alzheimer, qui ne sont pas des maladies par expansion de polyglutamine, que les neurones post-mitotiques ré-expriment de façon anormale de nombreux marqueurs du cycle cellulaire, tels que les ADN polymérases α, δ, β et la primase, et répliquent leur ADN (Herrup et al. , 2004 ; Lee et al. , 2003 ; Ranganathan and Bowser, 2003 ; Ueberham and Arendt, 2005 ; Andorfer et al. , 2005 ; Copani et al, 2002).  Since most neurons do not divide in the adult brain, the cell cycle markers characteristic of the DNA replication phase are not normally activated. However, it has been shown in models of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, tauopathies and Alzheimer's disease, which are not polyglutamine expansion diseases, that post-mitotic neurons. abnormally re-express many markers of the cell cycle, such as α, δ, β, and primase DNA polymerases, and replicate their DNA (Herrup et al., 2004, Ranganathan and Bowser, Lee et al., 2003; 2003, Ueberham and Arendt, 2005, Andorfer et al., 2005, Copani et al, 2002).
Par exemple, Khurana et ses collaborateurs ont montré, dans un modèle Drosophile de tauopathie, que le cycle cellulaire est réactivé dans les neurones post-mitotiques des mouches adultes, et que l'inhibition de certaines protéines du cycle cellulaire est capable de supprimer le phénomène de neurodégénerescence de l'œil observé dans cette pathologie (Khurana et al, 2006 et 2007). En ce qui concerne la maladie d'Alzheimer, Copani et ses collaborateurs ont montré, in vitro, à l'aide d'un modèle de cellules exprimant le peptide amyloide Αβ42, que la toxicité de ce peptide est réduite dans des cellules où l'ADN polymérase bêta est inactivée (Copani et al, 2002, 2006, 2007 et 2008).  For example, Khurana et al. Showed in a Drosophila model of tauopathy that the cell cycle is reactivated in post-mitotic neurons of adult flies, and that inhibition of certain cell cycle proteins is able to suppress the phenomenon. observed neurodegeneration of the eye in this pathology (Khurana et al, 2006 and 2007). With regard to Alzheimer's disease, Copani et al. Have shown, in vitro, using a model of cells expressing amyloid peptide Αβ42, that the toxicity of this peptide is reduced in cells where the DNA polymerase beta is inactivated (Copani et al, 2002, 2006, 2007 and 2008).
En revanche, en ce qui concerne les maladies neurodégénératives par expansion de polyglutamine, notamment des ataxies spinocérébelleuses dominantes, Khurana et al (2006) ont montré à l'aide d'un modèle Drosophile de tauopathie, que l'expression de la protéine MJD-78Q (protéine MJD, appelée aussi ATXN3, possédant une expansion de 78 glutamines) induisait une neurodégénérescence apoptotique, sans que les auteurs aient pu observer la présence de certains marqueurs de réplication et de mitose (PCNA, PH3) ou aient réussi à moduler la pathologie par l'inhibition des protéines impliquées dans le cycle cellulaire dans ce modèle. In contrast, with respect to neurodegenerative diseases by polyglutamine expansion, including dominant spinocerebellar ataxias, Khurana et al (2006) have shown using a Drosophila model of tauopathy that the expression of the MJD- 78Q (MJD protein, also called ATXN3, having an expansion of 78 glutamines) induced apoptotic neurodegeneration, without the authors being able to observe the presence of certain markers of replication and mitosis (PCNA, PH3) or have managed to modulate the pathology by inhibiting the proteins involved in the cell cycle in this model.
Il n'existe actuellement aucun traitement guérissant les maladies par expansion de polyglutamine. Des essais cliniques sont cependant en cours avec, dans certains cas, des molécules ayant montré leur efficacité sur les modèles Drosophile. On peut citer par exemple les inhibiteurs de l'histone désacétylase 8 (HDAC8, qui joue un rôle dans la régulation de l'expression des gènes et la réparation de l'ADN ; Demande Internationale WO 2007/130419) et les inhibiteurs de la protéine Hsp90 (protéine « chaperon » jouant notamment un rôle dans la protection du repliement tridimensionnelle des protéines) comme les dérivés de la geldanamycine. A la connaissance des Inventeurs, aucune donnée concernant une possible influence des désacétylases sur la transcription des gènes liés à la réplication de l'ADN n'a été documentée dans des cellules post-mitotiques telles que les neurones.  There is currently no cure for polyglutamine expansion diseases. However, clinical trials are ongoing with, in some cases, molecules that have shown efficacy on Drosophila models. For example, inhibitors of histone deacetylase 8 (HDAC8, which plays a role in the regulation of gene expression and DNA repair, International Application WO 2007/130419) and inhibitors of the protein Hsp90 ("chaperone" protein, which plays a role in protecting the three-dimensional folding of proteins), such as derivatives of geldanamycin. To the knowledge of the inventors, no data concerning a possible influence of deacetylases on the transcription of genes related to DNA replication has been documented in post-mitotic cells such as neurons.
Il existe donc un besoin de disposer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de nouvelles compositions pharmaceutiques utilisables pour le traitement des maladies par expansion de polyglutamine.  There is therefore a need for novel therapeutic targets as well as new pharmaceutical compositions useful for the treatment of polyglutamine expansion diseases.
Les Inventeurs ont établi trois modèles Drosophile d'ataxies spinocérébelleuses dominantes (SCA1, SCA3 et SCA7). Le principe de ces modèles est représenté à la Figure 1 : les formes pathologiques polyglutaminées des protéines ATXN1, ATXN3 et ATXN7T impliquées dans les ADCA humaines sont induites chez la Drosophile adulte (dans l'œil, les neurones ou les cellules gliales) en utilisant le système à deux composants GAL4-UAS (Brand and Perrimon, 1993 ; Latouche et al, 2007). Dans le modèle SCA1, la protéine Ataxine 1 (ATXN1) comprenant une expansion de 82 glutamines (ATXN1-82Q) a été exprimée. Dans le modèle SCA3, la protéine Ataxine 3 (ATXN3) comprenant une expansion de 70 glutamines (ATXN3- 70Q) a été exprimée. Dans le modèle SCA7, la protéine Ataxine 7 tronquée (ATXN7T) comprenant une expansion de 102 glutamines (ATXN7T-102Q ; Latouche et al., 2007) a été exprimée. Pour l'expression neuronale des protéines pathologiques, les Inventeurs ont utilisé une lignée elav-GAL4GS pour laquelle l'activité transcriptionnelle de GAL4 est sous contrôle d'un inducteur, le RU486 (mifépristone), que l'on peut faire ingérer aux mouches adultes (Latouche et al, 2007) ; ceci permet de s'affranchir des effets sur le développement des Drosophiles que pourraient avoir ces protéines ou les différents produits testés lors des cribles, et de suivre précisément chez la mouche adulte le développement de la pathologie. Ces modèles Drosophile ont ensuite été utilisés pour identifier (cribler), par inactivation par ARN interfèrent, des gènes capables de moduler ces pathologies. The inventors have established three Drosophila models of dominant spinocerebellar ataxias (SCA1, SCA3 and SCA7). The principle of these models is shown in Figure 1: the polyglutaminic pathological forms of the ATXN1, ATXN3 and ATXN7T proteins involved in human ADCA are induced in adult Drosophila (in the eye, neurons or glial cells) using the two-component system GAL4-UAS (Brand and Perrimon, 1993, Latouche et al, 2007). In the SCA1 model, the protein Ataxin 1 (ATXN1) comprising an expansion of 82 glutamines (ATXN1-82Q) was expressed. In the SCA3 model, the protein Ataxin 3 (ATXN3) comprising an expansion of 70 glutamines (ATXN3-70Q) was expressed. In the SCA7 model, the truncated Ataxin 7 protein (ATXN7T) comprising an expansion of 102 glutamines (ATXN7T-102Q, Latouche et al., 2007) was expressed. For the neuronal expression of pathological proteins, the inventors have used an elav-GAL4GS line for which the transcriptional activity of GAL4 is under the control of an inducer, RU486 (mifepristone), which can be ingested in adult flies. (Latouche et al, 2007); this allows to overcome the effects on the development of Drosophila that could have these proteins or the different products tested in the sieves, and to follow precisely in the adult fly the development of the pathology. These Drosophila models were then used to identify, by inactivation by interfering RNA, genes capable of modulating these pathologies.
Au cours de ces cribles, les Inventeurs ont identifié de manière surprenante le gène DNA-pol-alpha50, orthologue du gène humain priml (codant pour la primase, protéine qui joue un rôle majeur dans la réplication de l'ADN) comme un modulateur majeur de ces 3 ataxies. En effet, les Inventeurs ont montré que la réduction du niveau de la protéine DNApol-alpha50 par ARN interférence permet de supprimer en grande partie les effets toxiques des protéines pathologiques dans les 3 modèles drosophile SCA1, SCA3 et SCA7 étudiés. La protection observée des cellules concerne à la fois les neurones et les cellules gliales. Un sauvetage de la neurodégénération dans l'œil a aussi été observé par les Inventeurs sur un modèle drosophile de maladie de Huntington dans lequel le niveau de la protéine DNApol- alpha50 est réduit par ARN interférence.  During these screens, the inventors have surprisingly identified the gene DNA-pol-alpha50, orthologue of the human prim1 gene (coding for primase, a protein that plays a major role in the replication of DNA) as a major modulator. of these 3 ataxies. In fact, the inventors have shown that the reduction of the level of the DNApol-alpha50 protein by RNA interference makes it possible to largely eliminate the toxic effects of the pathological proteins in the 3 Drosophila models SCA1, SCA3 and SCA7 studied. The observed cell protection concerns both neurons and glial cells. Rescue of neurodegeneration in the eye has also been observed by the inventors on a Drosophila model of Huntington's disease in which the level of the DNApol-alpha50 protein is reduced by RNA interference.
D'autres cribles génétiques sur le modèle Drosophile SCA3 ont permis aux Inventeurs d'identifier plusieurs autres acteurs de la réplication de l'ADN susceptibles de moduler la pathologie SCA3 : il s'agit des gènes mcm2, dup/Cdtl, DNApol-alpha73IPOLA2 et timeoutlTimeless nécessaires à la réplication de l'ADN et dont l'inactivation sauve le phénotype pathologique, du gène Huwel, un inhibiteur de réplication de l'ADN, dont le gain de fonction a un effet protecteur dans la pathologie SCA3, ainsi que du gène grp/Chkl, codant pour une kinase majeure de la voie ATR (« Ataxia Telangiectasia and RadS-related ») impliquée dans le contrôle de la réplication de l'ADN, dont le gain de fonction sauve aussi le phénotype pathologique.  Other genetic screens on the Drosophila SCA3 model have enabled the inventors to identify several other actors of DNA replication capable of modulating the SCA3 pathology: these are the mcm2, dup / Cdtl, DNApol-alpha73IPOLA2 and timeoutlTimeless necessary for the replication of the DNA and whose inactivation saves the pathological phenotype, the gene Huwel, a DNA replication inhibitor, whose gain of function has a protective effect in the pathology SCA3, as well as the gene grp / Chkl, coding for a major kinase of the ATR pathway ("Ataxia Telangiectasia and RadS-related") involved in the control of DNA replication, whose gain of function also saves the pathological phenotype.
Il ressort de ces résultats que plusieurs acteurs (gènes, protéines) jouant un rôle dans la réplication de l'ADN et son contrôle apparaissent comme des cibles thérapeutiques potentielles dans les maladies neurodégénératives par expansion de polyglutamine :  These results show that several actors (genes, proteins) playing a role in DNA replication and its control appear as potential therapeutic targets in neurodegenerative diseases by polyglutamine expansion:
- la primase (DNApolalpha50/PRIMl) (Arezi and Kuchta, 2000 ; Lao-Sirieix et al., 2005 et Muzi-Falconi et al., 2003), qui intervient lors de la phase S du cycle cellulaire qui précède les phases ultérieures du cycle (G2, M, Gl) (Sclafani and Holzen, 2007) ; - the primase (DNApolalpha50 / PRIM1) (Arezi and Kuchta, 2000, Lao-Sirieix et al., 2005 and Muzi-Falconi et al., 2003), which intervenes during phase S the cell cycle that precedes the later phases of the cycle (G2, M, Gl) (Sclafani and Holzen, 2007);
- les complexes de réplication de l'ADN comprenant les protéines ORC et MCM, qui se mettent en place au cours de la phase de pré-réplication précédant la réplication de l'ADN proprement dite. L'activation de ces complexes induit la réplication, lors de laquelle la primase synthétise les amorces ARN nécessaires aux ADN polymérases (polalpha et epsilon) pour effectuer la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire ;  the DNA replication complexes comprising the ORC and MCM proteins, which are put in place during the pre-replication phase preceding the replication of the DNA proper. Activation of these complexes induces replication, in which the primase synthesizes the RNA primers required for DNA polymerases (polalpha and epsilon) to effect the synthesis of a complementary DNA strand;
- les protéines intervenant dans les mécanismes de réparation de l'ADN lorsque la réplication de l'ADN se bloque, telles que les kinases ATM (« ataxia telangiectasia mutated ») et ATR (« ATM and Rad3-related ») (Cimprich and Cortez, 2008), et la protéine TIM (« Timeless ») (Benna et al, 2010) ;  proteins involved in DNA repair mechanisms when DNA replication is blocked, such as ATM ("ataxia telangiectasia mutated") and ATR ("ATM and Rad3-related") kinases (Cimprich and Cortez , 2008), and TIM protein ("Timeless") (Benna et al, 2010);
- les protéines contrôlant le déroulement du cycle cellulaire, telles que les kinases cdk et les cyclines (Sclafani and Holzen, 2007) ;  proteins controlling the course of the cell cycle, such as cdk kinases and cyclins (Sclafani and Holzen, 2007);
- les ADN polymérases telles que la sous-unité B de l'ADN polymérase alpha (POLA2) (Takahashi et al, 1996).  DNA polymerases such as the subunit B of DNA polymerase alpha (POLA2) (Takahashi et al., 1996).
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de la réplication de l'ADN, lequel inhibiteur de la réplication de l'ADN est un inhibiteur d'une protéine choisie parmi les primases, les facteurs d'initiation de la réplication, les hélicases, les ADN polymérases, les ADN ligases, les topoisomérases, les kinases, les antigènes nucléaires de la prolifération nucléaire (PCNA), les facteurs de réplication A et C, de préférence une primase, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine.  The subject of the present invention is therefore the use of an inhibitor of DNA replication, which DNA replication inhibitor is an inhibitor of a protein selected from primases, replication, helicases, DNA polymerases, DNA ligases, topoisomerases, kinases, nuclear proliferation nuclear antigens (PCNA), replication factors A and C, preferably a primase, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion.
On entend par inhibiteur de la réplication de l'ADN, un composé, qui, lorsqu'il est administré à un sujet, inhibe totalement ou d'au moins 20%, et par ordre de préférence croissant d'au moins 50%, 75% et 95%, la réplication de l'ADN dans les tissus, de préférence les cellules neuronales et/ou gliales, dudit sujet comparé à un niveau de réplication de l'ADN mesuré en l'absence de l'administration {le., sans traitement) dudit agent inhibiteur. L'inhibition de la réplication de l'ADN peut être déterminée par des techniques connues de l'Homme du métier, telles que par exemple, in vitro, par l'incorporation de thymidine marquée au 3H ou de bromodésoxyuridine (BrdU ; un analogue de la thymidine) ou, l'analyse par cytométrie de flux ou, in vivo, par l'analyse de la taille finale d'organes en croissance rapide (Shibutani et al., 2008). By DNA replication inhibitor is meant a compound which, when administered to a subject, inhibits totally or by at least 20%, and in order of increasing preference by at least 50%, % and 95%, the replication of DNA in the tissues, preferably the neuronal and / or glial cells, of said subject compared to a level of replication of the measured DNA in the absence of the administration. without treatment) of said inhibitory agent. Inhibition of DNA replication can be determined by techniques known to those skilled in the art, such as, for example, in vitro, by the incorporation of 3 H-labeled thymidine or bromodeoxyuridine (BrdU; thymidine) or, flow cytometric analysis or, in vivo, through the analysis of the final size of rapidly growing organs (Shibutani et al., 2008).
L'inhibiteur de la réplication de l'ADN peut agir en empêchant la fixation d'un ligand (e.g., substrat) sur le site actif de la protéine, ou provoquer une déformation conformationnelle de la protéine qui rend celle-ci inactive.  The DNA replication inhibitor can act by preventing the attachment of a ligand (e.g., substrate) to the active site of the protein, or cause conformational deformation of the protein that renders it inactive.
L'inhibiteur de la réplication de l'ADN peut être un composé chimique ou biologique, d'origine naturelle ou synthétique. Il peut être choisi parmi un anticorps, un acide nucléique (tel qu'un ARN interfèrent, un ARN antisens ou un ribozyme), un peptide, une protéine, de préférence un ARN interfèrent.  The DNA replication inhibitor can be a chemical or biological compound of natural or synthetic origin. It can be chosen from an antibody, a nucleic acid (such as an interfering RNA, an antisense RNA or a ribozyme), a peptide, a protein, preferably an interfering RNA.
L'inhibition de la réplication de l'ADN est bien entendu fonction des doses auxquelles ledit inhibiteur est utilisé. L'inhibiteur de la réplication de l'ADN peut aussi avoir une ou plusieurs autres actions qui ne sont pas l'inhibition de la réplication de l'ADN. Toutefois, l'action inhibitrice de la réplication de l'ADN dudit composé doit être prépondérante à la dose (ou concentration) utilisée par rapport à ses autres actions.  Inhibition of DNA replication is of course dependent upon the doses at which the inhibitor is used. The DNA replication inhibitor may also have one or more other actions that are not inhibiting the replication of the DNA. However, the inhibitory action of the replication of the DNA of said compound must be preponderant at the dose (or concentration) used compared to its other actions.
Selon un mode de mise en œuvre préféré de l'invention, ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est un inhibiteur de la réplication de l'ADN des cellules post-mitotiques, telles que les neurones.  According to a preferred embodiment of the invention, said inhibitor of DNA replication is an inhibitor of DNA replication of post-mitotic cells, such as neurons.
Selon un autre mode de mise en œuvre préféré de l'invention, ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN inhibe l'expression d'un gène choisi parmi les gènes priml (codant pour l'ADN primase), mcm2 (codant pour la protéine « minichromosome maintenance complex component 2 »), Cdtl (codant pour la protéine « chromatin licensing and DNA réplication factor 1 »), PLOA2 (codant pour la sous-unité B de l'ADN polymérase alpha), Timeless (codant pour la protéine TIM) et les gènes orthologues de ces gènes, de préférence le gène priml.  According to another preferred embodiment of the invention, said inhibitor of DNA replication inhibits the expression of a gene selected from prim1 genes (coding for primase DNA), mcm2 (coding for protein "minichromosome maintenance complex component 2"), Cdtl (coding for the "chromatin licensing and DNA replication factor 1" protein), PLOA2 (encoding the DNA polymerase alpha subunit B), Timeless (encoding the protein TIM) and the orthologous genes of these genes, preferably the prim1 gene.
Selon un autre mode de mise en œuvre préféré de l'invention, ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN active ou augmente l'expression d'un gène inhibiteur de la réplication de l'ADN choisi parmi les gènes Huwel (codant pour la protéine « HECT, UBA and WWE domain containing 1 », Chkl (codant pour la kinase CHK1) et les gènes orthologues de ces gènes. According to another preferred embodiment of the invention, said inhibitor of DNA replication activates or increases the expression of a DNA replication inhibiting gene selected from the Huwel genes (coding for the HECT protein, UBA and WWE containing domain 1, Chk1 (coding for CHK1 kinase) and the orthologous genes of these genes.
L'inhibition de la réplication de l'ADN peut aussi être obtenue avec un agent alkylant (e.g., cyclophosphamide, sels de platine), un agent intercalant (e.g. , anthracyclines) ou un analogue des bases nucléiques (e.g., 5-FU).  Inhibition of DNA replication can also be achieved with an alkylating agent (e.g., cyclophosphamide, platinum salts), an intercalating agent (e.g., anthracyclines) or a nucleic acid analogue (e.g., 5-FU).
On entend par sujet, un mammifère, de préférence un humain.  By subject is meant a mammal, preferably a human.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine est choisie parmi la maladie de Huntington, les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes 1, 2, 3, 6, 7 et 17, l'atrophie dentato-rubro-pallido-luysienne et la maladie de Kennedy (ou amyotrophie spino-bulbaire), de préférence les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes et la maladie de Huntington, et de préférence encore les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes 1, 3 et 7.  According to another preferred embodiment of the invention, said neurodegenerative polyglutamine expansion disorder is selected from Huntington's disease, autosomal dominant spinocerebellar ataxias 1, 2, 3, 6, 7 and 17, dentato-rubro atrophy. -pallido-luysian and Kennedy's disease (or spino-bulbar muscular atrophy), preferably autosomal dominant spinocerebellar ataxias and Huntington's disease, and more preferably autosomal dominant spinocerebellar ataxias 1, 3 and 7.
Les modes et voies d'administration de la composition pharmaceutique peuvent être adaptés par l'Homme du métier en fonction du sujet, de la pathologie à traiter et l'inhibiteur de la réplication de l'ADN utilisé. A titre d'exemple, la composition pharmaceutique préparée selon l'invention peut être formulée pour une administration par voie orale ou nasale, ou par injection par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, nasale ou intracraniale.  The modes and routes of administration of the pharmaceutical composition may be adapted by those skilled in the art depending on the subject, the pathology to be treated and the inhibitor of the replication of the DNA used. By way of example, the pharmaceutical composition prepared according to the invention can be formulated for oral or nasal administration, or by intravenous, intramuscular, subcutaneous, nasal or intracranial injection.
La détermination de la dose à laquelle ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est utilisé peut s'effectuer par des techniques connues de l'Homme du métier, par exemple lors d'essais cliniques. Cette dose dépendra de divers facteurs comprenant notamment l'activité de l'inhibiteur de la réplication de l'ADN, du mode d'administration, de la durée de l'administration, du taux d'excrétion de l'inhibiteur de la réplication de l'ADN, de la durée du traitement, d'autres médicaments ou composés utilisés en combinaison avec l'inhibiteur de la réplication de l'ADN, de l'âge, du sexe, du poids, de l'état de santé générale et de l'histoire médicale antérieure du sujet qui est traité. A titre d'exemple, cette dose peut être comprise entre 5 mg/kg et 60 mg/kg, de préférence entre 10 mg/kg et 30 mg/kg.  Determination of the dose at which said inhibitor of DNA replication is used can be carried out by techniques known to those skilled in the art, for example in clinical trials. This dose will depend on various factors including DNA replication inhibitor activity, mode of administration, duration of administration, level of DNA, duration of treatment, other drugs or compounds used in combination with the DNA replication inhibitor, age, sex, weight, general health status and of the prior medical history of the subject being treated. By way of example, this dose may be between 5 mg / kg and 60 mg / kg, preferably between 10 mg / kg and 30 mg / kg.
La composition pharmaceutique peut comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable qui peut être tout excipient connu de l'Homme du métier. Les excipients pharmaceutiquement acceptables varient en fonction de l'inhibiteur de la réplication de l'ADN et du mode d'administration choisis. The pharmaceutical composition may comprise at least one pharmaceutically acceptable excipient which may be any excipient known to the skilled person. The pharmaceutically acceptable excipients vary depending on the DNA replication inhibitor and the mode of administration chosen.
On entend par traitement, le traitement curatif, symptomatique ou préventif. Les inhibiteurs de la réplication de l'ADN utilisés conformément à la présente invention peuvent être utilisés chez un sujet atteint d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine déclarée, comprenant les stades précoces et/ou tardifs de la maladie. Ces inhibiteurs de la réplication de l'ADN ne permettent pas nécessairement de guérir le sujet atteint de la maladie, mais peuvent retarder ou ralentir la progression ou prévenir une progression plus en avant de la maladie, améliorant ainsi la condition du sujet. Ces inhibiteurs de la réplication de l'ADN peuvent aussi être administrés à un sujet ne présentant pas de symptôme d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine, mais qui pourrait développer la maladie, ou qui a un risque important de développer la maladie.  By treatment is meant curative, symptomatic or preventive treatment. The DNA replication inhibitors used in accordance with the present invention may be used in a subject with a reported polyglutamine expansion neurodegenerative disease, including the early and / or late stages of the disease. These DNA replication inhibitors do not necessarily cure the subject with the disease, but may delay or slow progression or prevent further progression of the disease, thereby improving the subject's condition. These DNA replication inhibitors may also be administered to a subject who does not have symptoms of a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion, but who may develop the disease, or who has a significant risk of developing the disease.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de la réplication de l'ADN tel que défini ci-dessus, à un sujet ayant besoin de ce traitement. Bien entendu, les spécifications décrites plus haut s'appliquent également à cet aspect de l'invention.  The present invention also relates to a method for treating a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion, comprising the administration of an effective amount of at least one inhibitor of the replication of the DNA as defined above, to a subject in need of this treatment. Of course, the specifications described above also apply to this aspect of the invention.
On entend par une quantité efficace, une quantité d'inhibiteur de la réplication de l'ADN pour produire le résultat biologique désiré.  By an effective amount is meant an amount of DNA replication inhibitor to produce the desired biological result.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :  In addition to the foregoing, the invention further comprises other arrangements, which will become apparent from the experimental examples below, as well as to the accompanying drawings, in which:
- la Figure 1 représente le principe de l'établissement d'un modèle Drosophile exprimant une protéine ATXN pathologique humaine sous le contrôle d'un promoteur inductible (elav). Des Drosophiles portant un transposon contenant la protéine ATXN humaine mutée sous la dépendance de séquences de régulation UAS sont croisées avec des individus portant un transposon contenant la protéine de régulation GAL4GS sous la dépendance d'un promoteur tissus spécifique inductible (ici le promoteur neuronal elav). Dans la descendance, la protéine GAL4GS est produite dans le tissu considéré. Elle ne devient active qu'en présence de RU486 qui est apporté dans la nourriture des animaux. Dans ce cas, GAL4GS se fixe sur les séquences UAS et active la transcription du gène adjacent et la production de la protéine humaine pathologique. Les phénotypes de ces individus peuvent alors être étudiés ; FIG. 1 represents the principle of establishing a Drosophila model expressing a human pathological ATXN protein under the control of an inducible promoter (elav). Drosophila carrying a transposon containing mutated human ATXN protein under the control of UAS regulatory sequences are crossed with individuals carrying a transposon containing the GAL4GS regulatory protein under the control of an inducible specific tissue promoter (here the neuronal promoter elav). In the offspring, the GAL4GS protein is produced in the tissue under consideration. It only becomes active in the presence of RU486 which is brought into the animals' food. In this case, GAL4GS binds to the UAS sequences and activates the transcription of the adjacent gene and the production of the pathological human protein. The phenotypes of these individuals can then be studied;
- la Figure 2 représente le principe d'un crible génétique par inactivation par ARN interfèrent. Des drosophiles exprimant une protéine pathologique (e.g., l'Ataxine 3) dans un tissu spécifique (e.g., les neurones) sont croisées avec des individus portant une répétition en tandem inversée d'une portion de l'ADNc d'un gène modificateur d'intérêt (noté GM). Dans la descendance, en présence de RU486, les drosophiles expriment la protéine pathologique et un ARN double brin correspondant aux séquences de GM. Par phénomène d' ARN interférence, cet ARN double brin (ARNi) spécifique de GM, qui entraine la dégradation de Γ ARN endogène de GM et donc la diminution de la protéine correspondante codée par GM. On peut alors étudier dans ces individus si la diminution de l'expression de GM modifie le phénotype causé par l'expression de la protéine pathologique ;  FIG. 2 represents the principle of a genetic screen by interfering RNA inactivation. Drosophila expressing a pathological protein (eg, Ataxin 3) in a specific tissue (eg, neurons) are crossed with individuals carrying an inverted tandem repeat of a portion of the cDNA of a gene modifying interest (rated GM). In the offspring, in the presence of RU486, Drosophila express the pathological protein and a double-stranded RNA corresponding to the GM sequences. By RNA interference, this GM-specific double-stranded RNA (RNAi), which causes the degradation of endogenous GM RNA and therefore the decrease of the corresponding protein encoded by GM. We can then study in these individuals if the decrease in the expression of GM modifies the phenotype caused by the expression of the pathological protein;
- la Figure 3 représente la distribution des durées de vie moyennes observées dans le crible des lignées provenant du centre de stockage VDRC correspondant au Tableau II ci-après (barres pleines). La distribution normale correspondant à la même valeur moyenne et au même écart-type est représentée en barres vides. La position des individus de génotype elavGS>ATXN3-70Q/DNApol- alpha50{v43870} est indiquée par une flèche ;  - Figure 3 represents the distribution of average lifetimes observed in the sieve of the lines from the VDRC storage center corresponding to Table II below (solid bars). The normal distribution corresponding to the same average value and the same standard deviation is represented in empty bars. The position of individuals of genotype elavGS> ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 {v43870} is indicated by an arrow;
- la Figure 4 : graphiques montrant la survie de Drosophiles exprimant dans les neurones les protéines pathologiques ATXN3-70Q (a), ATXN7T- 4: graphs showing the survival of Drosophila expressing in the neurons the pathological proteins ATXN3-70Q (a), ATXN7T-
102Q (b) ou ATXN1 -82Q (c) est fortement réduite (cercles pleins) comparée à celle des individus contrôles possédant le même génotype mais n'exprimant pas la protéine pathologique (cercles ouverts) ou exprimant une protéine non-pathologique comme la EGFP ou la luciférase (carrés ouverts). La réduction simultanée du niveau de la primase (DNApolalpha50) (triangles pleins) améliore considérablement la survie dans ces trois modèles d'ataxie ; - la Figure 5 : photographies montrant, chez la Drosophile, la neurodégénérescence induite par l'expression dans l'œil de la protéine Atxn3 pathologique tronquée (photo du milieu) comparée au phénotype d'un œil normal (photo de gauche) et au phénotype restauré par la diminution de l'expression de la primase induite par ARN interférant (photo de droite) ; 102Q (b) or ATXN1 -82Q (c) is strongly reduced (closed circles) compared to control individuals with the same genotype but not expressing the pathological protein (open circles) or expressing a non-pathological protein such as EGFP or luciferase (open squares). The simultaneous reduction of the level of the primase (DNApolalpha50) (solid triangles) significantly improves survival in these three models of ataxia; - Figure 5: photographs showing, in Drosophila, the neurodegeneration induced by the expression in the eye of the truncated pathological Atxn3 protein (photo of the medium) compared to the phenotype of a normal eye (left-hand picture) and to the phenotype restored by decreasing the expression of primase induced by interfering RNA (photo right);
- la Figure 6 représente une analyse par Western blot de Drosophiles mâles exprimant la protéine pathologique ATXN3-70Q dans les neurones. Cette analyse montre que l'expression de TATXN3-70Q n'est pas modifiée par la présence du transposon DNApol-a50-{v43870}. Génotypes: elav-GAL4GS, UAS-ATXN3- 70Q/UAS-EGFP (piste gauche) ; elav-GAL4GS, UAS-ATXN3-70Q/DNApol-alpha50 {v43870} (piste droite) ;  - Figure 6 represents a Western blot analysis of male Drosophila expressing the ATXN3-70Q pathological protein in neurons. This analysis shows that the expression of TATXN3-70Q is not modified by the presence of the transposon DNApol-a50- {v43870}. Genotypes: elav-GAL4GS, UAS-ATXN3- 70Q / UAS-EGFP (left track); elav-GAL4GS, UAS-ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 {v43870} (right track);
- la Figure 7 est un graphique montrant que la survie de Drosophiles exprimant dans un sous ensemble de cellules gliales la protéine pathologique ATXN7T-102Q est fortement réduite (cercles pleins) avec une durée de vie ne dépassant pas 16 jours. La réduction simultanée du niveau de la primase (DNApolalpha50) (triangles pleins) améliore la survie dans ce modèle glial d'ataxie ;  - Figure 7 is a graph showing that the survival of Drosophila expressing in a subset of glial cells ATXN7T-102Q pathological protein is greatly reduced (closed circles) with a lifetime not exceeding 16 days. Simultaneous reduction of the level of primase (DNApolalpha50) (solid triangles) improves survival in this glial model of ataxia;
- la Figure 8 : photographies montrant, chez la Drosophile, la neurodégénérescence induite par l'expression dans l'œil de la protéine Huntingtine humaine pathologique tronquée (photo A) comparée au phénotype restauré par la diminution de l'expression de la primase induite par ARN interférant (photo B).  FIG. 8: photographs showing, in Drosophila, the neurodegeneration induced by the expression in the eye of the truncated pathological human Huntingtin protein (photo A) compared to the phenotype restored by the decrease in the expression of primase induced by Interfering RNA (photo B).
EXEMPLES 1 : IDENTIFICATION DES GENES IMPLIQUES DANS LA REPLICATION DE L'ADN SUSCEPTIBLES DE MODULER LES ATAXIES SPINOCEREBELLEUSES DOMINANTES SCA1, SCA3 ET SCA7 EXAMPLES 1: IDENTIFICATION OF GENES INVOLVED IN DNA REPLICATION LIKELY TO MODULATE DOMINANT SPINOCEREBELLAR ATAXIA SCA1, SCA3 AND SCA7
1) Matériels et Méthodes  1) Materials and Methods
Souches de Drosophile et culture  Drosophila strains and culture
Trois modèles neuronaux d'ataxies spinocérébelleuses différents (SCA1, SCA3 et SCA7) ont été générés en combinant une lignée pilote (driver) exprimant la protéine GAL4 sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones différentiés elavGS (Latouche et al, 2007) et des lignées contenant un transposon (pUAS ; Brand and Perrimon, 1993) comprenant une séquence codant pour une protéine ATXN pathologique (pUAST-ATXN). Les lignées ainsi générées sont notées elavGS>ATXN. Le principe de l'établissement d'un modèle Drosophile exprimant une protéine ATXN pathologique humaine sous le contrôle d'un promoteur inductible est représenté à la Figure 1. Three neuronal models of different spinocerebellar ataxias (SCA1, SCA3 and SCA7) were generated by combining a pilot line expressing the GAL4 protein under the control of the specific promoter of the differentiated neurons elavGS (Latouche et al, 2007) and lines containing a transposon (pUAS; Brand and Perrimon, 1993) comprising a sequence coding for a pathological ATXN protein (pUAST-ATXN). The lines thus generated are noted elavGS> ATXn. The principle of establishing a Drosophila model expressing a human pathological ATXN protein under the control of an inducible promoter is shown in Figure 1.
La lignée pUAST-ATXNl-82Q (Fernando-Funez et al, 2000) exprime l'Ataxine 1 contenant 82 répétitions de glutamine.  The pUAST-ATXN1-82Q line (Fernando-Funez et al., 2000) expresses Ataxin 1 containing 82 glutamine repeats.
La lignée pUAST-ATXN3-70Q a été réalisée par transgénèse après clonage dans un vecteur pUAST d'un cDNA codant pour l'Ataxine 3 et contenant 70 répétitions du triplet CAG (Mueller et al, 2009).  The pUAST-ATXN3-70Q line was produced by transgenesis after cloning into a pUAST vector of a cDNA coding for Ataxin 3 and containing 70 repeats of the CAG triplet (Mueller et al, 2009).
La lignée pUAST-ATXN7T-102Q est décrite dans Latouche et al, 2007.  The pUAST-ATXN7T-102Q line is described in Latouche et al, 2007.
La lignée pUAST-ATXN7T-102Q a été recombinée avec la lignée dEaatl-GAL4 (Rival et al, 2004), exprimant la protéine d'intérêt dans un sous- ensemble de cellules gliales, pour établir un modèle glial d'ataxie spinocérébelleuse. La lignée résultante est notée dEaatl>ATXN7T-102Q.  The pUAST-ATXN7T-102Q line was recombined with the EAAT1-GAL4 line (Rival et al., 2004), expressing the protein of interest in a subset of glial cells, to establish a glial model of spinocerebellar ataxia. The resulting line is denoted ATQN7T-102Q.
La lignée pUAST-ATXN3T-78Q (Warrick et al , 1998) a été croisée avec la lignée GMR-GAL4 (numéro d'accession FBrf0091569 dans la base de données FlyBase), exprimant la protéine d'intérêt dans les cellules de l'œil, pour établir un modèle d'œil d'ataxie spinocérébelleuse. La lignée résultante est notée GMR>ATXN3T-78Q.  The pUAST-ATXN3T-78Q line (Warrick et al, 1998) was crossed with the GMR-GAL4 line (accession number FBrf0091569 in the FlyBase database), expressing the protein of interest in the cells of the eye , to establish a model of spinocerebellar ataxia eye. The resulting line is noted GMR> ATXN3T-78Q.
Les lignées RNAi (exprimant un ARN interfèrent spécifique d'un gène modificateur d'intérêt) utilisées pour les cribles génétiques ont été obtenues auprès du Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC ; Vienne, Autriche). Les autres lignées mutantes utilisées pour les cribles génétiques ont été obtenues auprès du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC ; Indiana University ; Bloomington, USA). La Figure 2 représente le principe d'un crible génétique par inactivation par ARN interfèrent.  The RNAi lines (expressing an interference-specific RNA of a modifier gene of interest) used for genetic screens were obtained from the Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC, Vienna, Austria). The other mutant lines used for genetic screens were obtained from the Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana University, Bloomington, USA). Figure 2 represents the principle of a genetic screen by interfering RNA inactivation.
La lignée UAS-GFP-IR a été décrite par Roignant et al, 2003.  The UAS-GFP-IR line has been described by Roignant et al, 2003.
Les drosophiles ont été élevées sur un milieu nutritif contenant 8,2% de levure, 3,4% de farine de maïs, 5% de saccharose, 1,1% d'agarose et 2,5% de méthyl benzoate (un antifongique). Afin de permettre l'expression des transgènes par les lignées inductibles elavGS>ATXN, l'inducteur, le RU486 (dilué dans l'éthanol 100%), a été ajouté à 200μg/mL de milieu (le milieu supplémenté en RU486 est dénommé RU200). Le milieu contrôle sans inducteur a été complémenté avec le même volume d'éthanol 100%. Drosophila were raised on a nutrient medium containing 8.2% yeast, 3.4% corn flour, 5% sucrose, 1.1% agarose and 2.5% methyl benzoate (an antifungal) . In order to allow the expression of the transgenes by the inducible elavGS> ATXN lines, the inducer, RU486 (diluted in 100% ethanol), was added to 200 μg / ml of medium (the medium supplemented with RU486 is called RU200 ). The control medium without inductor was supplemented with the same volume of 100% ethanol.
Cribles de longévité  Longevity screens
Des drosophiles femelles elavGS>ATXN ont été croisées avec des mâles de lignées portant les mutations ou les transposons à tester ainsi qu'éventuellement avec des lignées témoins (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR et UAS-Luci) dont l'expression ne modifie pas la longévité. Les individus résultants ont été séparés par groupes de 30 dans des tubes contenant un milieu nutritif inductible (RU200) ou contenant un milieu non inductible (RU0). Le crible a eu lieu à température constante (26°C). Sauf spécification contraire, les animaux analysés sont des mâles.  Female Drosophila elavGS> ATXN were crossed with males of lines bearing the mutations or transposons to be tested as well as possibly with control lines (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR and UAS-Luci) whose expression does not does not change longevity. The resulting individuals were separated in groups of 30 into tubes containing an inducible nutrient medium (RU200) or containing a non-inducible medium (RU0). The screen was held at a constant temperature (26 ° C). Unless otherwise specified, the animals analyzed are males.
Les individus ont été transférés sur un milieu frais tous les 2 jours et les individus morts ont été comptés. Les courbes de longévité ont été comparées à une courbe témoin par une analyse de Log-Rank (Peto and Peto, 1972). La courbe témoin correspond à la moyenne des longévités des lignées après élimination des extrêmes de la distribution de durée de vie (déciles 3 à 8) lorsqu'un grand nombre de lignées de fond génétique identique sont analysées simultanément (comme pour les tests de lignées RNAi issues du VDRC). Alternativement, les courbes correspondant à la survie des lignées témoins (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR et UAS-Luci) mesurées dans les mêmes conditions ont été utilisées.  Individuals were transferred to a fresh medium every 2 days and dead individuals were counted. Longevity curves were compared to a control curve by Log-Rank analysis (Peto and Peto, 1972). The control curve corresponds to the average of the longevities of the lines after elimination of the extremes of the life distribution (deciles 3 to 8) when a large number of identical genetic background lines are analyzed simultaneously (as for the RNAi line tests). from the VDRC). Alternatively, the curves corresponding to the survival of the control lines (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR and UAS-Luci) measured under the same conditions were used.
Analyse du phénotype de l'œil  Analysis of the phenotype of the eye
Des femelles de génotype GMR>ATXN3-78Q et des mâles de génotype DNApol-alpha50{v43870} et UAS-GFP-IR ont été élevés à une température de 23°C et croisées ensemble. L'examen optique de la structure de l'œil a été réalisé sur les mâles obtenus, âgés de 3 jours, avec un stéréomicroscope Leica M205FA.  Females of genotype GMR> ATXN3-78Q and males of genotype DNApol-alpha50 {v43870} and UAS-GFP-IR were cultured at a temperature of 23 ° C and crossed together. Optical examination of the structure of the eye was performed on males obtained, aged 3 days, with a Leica M205FA stereomicroscope.
Western Mot et immunodétection de l'Ataxine 3  Western Mot and Immunodetection of Ataxin 3
L'expression de l'Ataxine 3 dans les drosophiles de génotype elavGS>ATXN3-70Q/UAS-EGFP et elavGS>ATXN3-70Q/DNApol- alpha50{v43870} élevées pendant 4 jours sur milieu inductible a été analysée par Western blot. 10 mouches de chaque condition (induction ou non de l'expression de la protéine pathologique) ont été broyées dans ΙΟΟμί de tampon urée supplémenté en antiprotéases. Après centrifugation pendant 10 mn à 12000 rpm à 4°C, les surnageants ont été dénaturés 5 minutes à 95 °C dans le tampon Laemmli avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide 12%, pour analyse par électrophorèse. Après transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose, celle-ci a été incubée pendant la nuit à 4°C dans du TBS-tween 0,1% et 5% de lait avec l'anticorps primaire (Chemicon- MAB5360) dirigé contre l'Ataxine 3, dilué à 1/2000. L'incubation avec l'anticorps secondaire anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase (HRP) a été effectuée pendant lh à température ambiante. La révélation a été réalisée avec un substrat luminescent (Millipore). Le signal a été détecté et quantifié en utilisant une caméra LAS-400 (Fujifilm). The expression of Ataxin 3 in Drosophila genotype elavGS> ATXN3-70Q / UAS-EGFP and elavGS> ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 {v43870} grown for 4 days on inducible medium was analyzed by Western blot. 10 flies of each condition (induction or not of the expression of the pathological protein) were crushed in ΙΟΟμί of urea buffer supplemented with antiproteases. After centrifugation for 10 minutes at 12000 rpm at 4 ° C., the supernatants were denatured for 5 minutes at 95 ° C. in Laemmli buffer before being deposited on a 12% polyacrylamide gel, for analysis by electrophoresis. After transfer of the proteins to a nitrocellulose membrane, it was incubated overnight at 4 ° C in 0.1% TBS-tween and 5% milk with the primary antibody (Chemicon-MAB5360) against Ataxine 3, diluted to 1/2000. Incubation with the secondary anti-mouse antibody antibody coupled to peroxidase (HRP) was carried out for 1h at room temperature. The revelation was performed with a luminescent substrate (Millipore). The signal was detected and quantified using a LAS-400 (Fujifilm) camera.
2) Résultats  2) Results
2.1) Caractérisation des modèles Drosophile d'ataxie spinocérébelleuse de type SCA1, SCA3 et SCA 7.  2.1) Characterization of Drosophila models of spinocerebellar ataxia SCA1, SCA3 and SCA 7.
Des modèles Drosophile d'ataxie spinocérébelleuse de type SCA1, SCA3 et SCA7 ont été générés et caractérisés par diverses études : analyse des phénotypes induits par différente lignées pilotes (« drivers ») GAL4, réduction de longévité provoquée par l'expression de la protéine pathologique dans le cerveau, marquage des cerveaux in toto ou de coupes de cerveaux congelés par cryostat à l'aide d'anticorps dirigés contres des protéines d'intérêt (ubiquitine, sous-unités du protéasome, facteurs de transcription) identifiés chez les mammifère dans les agrégats contenant les protéines pathologiques (Sang and Jackson, 2005), étude cinétique de la formation des agrégats (Latouche et al. 2007), quantification de l'activité locomotrice.  Drosophila models of spinocerebellar ataxia type SCA1, SCA3 and SCA7 have been generated and characterized by various studies: phenotype analysis induced by different pilot lines ("drivers") GAL4, reduction of longevity caused by the expression of the pathological protein in the brain, labeling of brains in toto or cryostat frozen brain sections with antibodies directed against proteins of interest (ubiquitin, proteasome subunits, transcription factors) identified in mammals aggregates containing pathological proteins (Sang and Jackson, 2005), kinetic study of aggregate formation (Latouche et al., 2007), quantification of locomotor activity.
De façon significative, les modèles Drosophile reproduisent les caractéristiques des pathologies humaines, y compris une forte réduction de la durée de vie et un déficit moteur progressif.  Significantly, Drosophila models reproduce the characteristics of human pathologies, including a sharp reduction in life span and a progressive motor deficit.
L'effet sur la durée de vie des drosophiles obtenues après croisement avec différentes lignées témoins et exprimant l'Ataxine 3 pathologique est donné dans le Tableau I ci-dessous. Une diminution de l'ordre de 35% de la longévité des individus exprimant l'Ataxine 3 pathologique par rapport à des individus de même génotype non induits (avec le RU486), n'exprimant pas l'Ataxine 3 pathologique, a été observée. The effect on the lifespan of Drosophila obtained after crossing with different control lines and expressing pathological Ataxin 3 is given in Table I below. A 35% decrease in the longevity of individuals expressing pathological Ataxin 3 compared with individuals similarly uninduced genotype (with RU486), not expressing pathological Ataxin 3, was observed.
Tableau I : Des drosophiles mâles de plusieurs lignées témoins (sauvage (w), UAS-EGFP, UAS-GFP-IR et UAS-Luci) ont été croisées avec des femelles de génotype elavGS>ATXN3-70Q ou elavGS (contrôles). Les descendants de ces croisements dont le génotype est indiqué en colonne 1, ont été placés en condition induite (les mouches sont placées sur milieu contenant 200 de RU486 ; milieu RU200) ou en condition non induite (colonne 2). Les durées de vie moyenne en jours (colonne 4) ont été comparées. On observe une diminution de la durée de vie de l'ordre de 35% lorsque l'Ataxine 3 pathologique est exprimée, avec des différences statistiques hautement significatives entre les courbes de longévité analysées par test du LogRank (colonne 6). Les drosophiles contrôles n'exprimant pas l'Ataxine 3 ne sont pas sensibles au traitement par le RU486. Les effectifs analysés (N) pour chaque condition (expression induite ou non induite) sont représentés à la colonne 3.  Table I: Drosophila males of several control lines (wild (w), UAS-EGFP, UAS-GFP-IR and UAS-Luci) were crossed with females of genotype elavGS> ATXN3-70Q or elavGS (controls). The descendants of these crosses, the genotype of which is indicated in column 1, were placed under induced conditions (the flies are placed on medium containing 200 of RU486, medium RU200) or in uninduced condition (column 2). The average lifetimes in days (column 4) were compared. A 35% decrease in life is observed when pathological Ataxin 3 is expressed, with highly significant statistical differences between the longevity curves analyzed by LogRank test (column 6). Drosophila controls not expressing Ataxin 3 are not sensitive to RU486 treatment. The numbers analyzed (N) for each condition (induced or uninduced expression) are shown in column 3.
Tableau I : Effet sur la durée de vie des drosophiles obtenues après croisement avec différentes lignées témoins et exprimant l'Ataxine 3 pathologique  Table I: Effect on the lifespan of Drosophila obtained after crossing with different control lines and expressing the pathological Ataxin 3
Figure imgf000015_0001
GFP IR / elavGS>ATXN3-70Q Non Induit 27 44,1
Figure imgf000015_0001
GFP IR / elavGS> ATXN3-70Q No Induced 27 44.1
0,62 -3/7E-17 0.62 -3 / 7E-17
GFP IR / elavGS>ATXN3-70Q Induit 119 27,3 GFP IR / elavGS> ATXN3-70Q Induced 119 27.3
UAS-luci / elavGS>ATXN3-70Q Non Induit 24 48,8  UAS-luci / elavGS> ATXN3-70Q No Induced 24 48.8
0,46 -2,6E-15 0.46 -2.6E-15
UAS-luci / elavGS>ATXN3-70Q Induit 52 22,4 UAS-luci / elavGS> ATXN3-70Q Induced 52 22.4
2.2) Suppression de la toxicité dans des modèles Drosophiles d'ataxies spinocérébelleuses (SCA1, SCA3 etSCA 7) par inactivation de la primase 2.2) Suppression of Toxicity in Drosophila Models of Spinocerebellar Ataxia (SCA1, SCA3 and SCA 7) by Primase Inactivation
98 lignées exprimant un ARN interfèrent, provenant du centre de stockage du VDRC, ont été analysées pour leur capacité à modifier la durée de vie de Drosophiles co-exprimant l'Ataxine 1, 3 ou 7 pathologique respectivement et l'ARM. Pour cela des femelles de génotype elavGS UAS-ATXN1-82Q, elavGS UAS- ATXN3-70Q et elavGS UAS- ATXN7T- 102 Q ont respectivement été croisées avec des mâles de différents génotypes et la descendance a été analysée (selon le principe de crible génétique représenté à la Figure 2).  98 lines expressing an interfering RNA, from the VDRC storage center, were analyzed for their ability to modify the lifespan of Drosophila co-expressing pathological Ataxin 1, 3 or 7 respectively and MRA. For this, females of the genotype elavGS UAS-ATXN1-82Q, elavGS UAS-ATXN3-70Q and elavGS UAS-ATXN7T-102 Q were respectively crossed with males of different genotypes and the offspring was analyzed (according to the principle of genetic screen shown in Figure 2).
Les résultats concernant le modèle Drosophile SCA3 sont représentés au Tableau II ci-dessous et à la Figure 3 : il a été observé une durée de vie réduite de la plupart des individus exprimant l'Ataxine 3 pathologique (Tableau II), avec une distribution de cette durée de vie proche d'une distribution normale (Figure 3).  The results for the Drosophila SCA3 model are shown in Table II below and in Figure 3: a shorter life span was observed for most individuals expressing pathological Ataxin 3 (Table II), with a distribution of this life close to a normal distribution (Figure 3).
Tableau II : Résultats du crible de gènes modificateurs de la toxicité de l'Ataxine 3 sur le modèle Drosophile SCA3 après induction (sur milieu RU200). Les génotypes sont portés en colonne 2, les effectifs (N) en colonne 3 et la durée de vie en colonne 4. La courbe témoin correspond à la moyenne des lignées après élimination des extrêmes de la distribution de durée de vie (déciles 3 à 8). Pour chaque génotype le rapport de la durée de vie moyenne par rapport à celle de la courbe témoin est portée en colonne 5 et la probabilité d'un écart significatif des 2 courbes de survie par une analyse par le test du LogRank est indiquée en colonne 6. Une augmentation de la durée de vie de 44% est observée lorsque la DNApol-alpha50 est inactivée (avant dernière ligne du tableau). Tableau II Table II: Screening results of genes modifying the toxicity of Ataxin 3 on the Drosophila SCA3 model after induction (on RU200 medium). The genotypes are carried in column 2, the numbers (N) in column 3 and the lifespan in column 4. The control curve corresponds to the average of the lines after elimination of the extremes of the life distribution (deciles 3 to 8 ). For each genotype, the ratio of average life time to that of the control curve is reported in column 5 and the probability of a significant difference between the 2 survival curves by a LogRank test is given in column 6 An increase in the lifetime of 44% is observed when the DNApol-alpha50 is inactivated (second last line of the table). Table II
Gène Génotype N durée de Ratio Test du vie durée de LogRank moyenne vie après moyenne élimination Gene Genotype N Duration of Ratio Life Test Duration of LogRank Mean Life after Average Elimination
/ courbe des déciles témoin 3 à 8/ curve of the control deciles 3 to 8
T-cpl T-cpl {v34070}/elavGS>ATXN3-70Q 93 13,5 0,54 -6,4E-73T-cpl T-cpl {v34070} / elavGS> ATXN3-70Q 93 13.5 0.54 -6.4E-73
1(2)05070 1(2)05070 {v35923 }/elavGS>ATXN3-70Q 91 20,0 0,80 -1,4E-211 (2) 05070 1 (2) 05070 {v35923} / elavGS> ATXN3-70Q 91 20.0 0.80 -1.4E-21
CG14542 CG14542{v24869}/elavGS>ATXN3-70Q 92 20,8 0,83 -1/7E-13 eIF5 eIF5 {v29070}/elavGS>ATXN3-70Q 104 21,0 0,84 -2.7E-12 ashl ashl {v28982}/elavGS>ATXN3-70Q 99 21,5 0,86 -3.7E-11## EQU1 ## v28982} / elavGS> ATXN3-70Q 99 21.5 0.86 -3.7E-11
Rpn6 pn6 {vl 8022}/elavGS>ATXN3-70Q 96 21,5 0,86 -2,9E-22Rpn6 pn6 {vl 8022} / elavGS> ATXN3-70Q 96 21.5 0.86 -2.9E-22
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E(z) E(z) {v27645 }/elavGS>ATXN3-70Q 85 26,6 1,06 6,3E-03 atms atms {v20876}/elavGS>ATXN3-70Q 91 26,8 1,07 7,9E-03E (z) E (z) {v27645} / elavGS> ATXN3-70Q 85 26.6 1.06 6.3E-03 atms atms {v20876} / elavGS> ATXN3-70Q 91 26.8 1.07 7.9E -03
Parg Parg{v23962}/elavGS>ATXN3-70Q 89 26,8 1,07 7,0E-02Parg Parg {v23962} / elavGS> ATXN3-70Q 89 26.8 1.07 7.0E-02
Pros45 Pros45 {v24937}/elavGS>ATXN3-70Q 83 26,8 1,07 1,1E-01Pros45 Pros45 {v24937} / elavGS> ATXN3-70Q 83 26.8 1.07 1.1E-01
Sir2 Sir2 {v23201 }/elavGS>ATXN3-70Q 32 27,0 1,08 l,2E-02Sir2 Sir2 {v23201} / elavGS> ATXN3-70Q 32 27.0 1.08 l, 2E-02
TER94 TER94 {v24354}/elavGS>ATXN3-70Q 93 27,0 1,08 6,2E-02TER94 TER94 {v24354} / elavGS> ATXN3-70Q 93 27.0 1.08 6.2E-02
CG4706 CG4706 {v34888}/elavGS>ATXN3-70Q 92 27,0 1,08 l,2E-02CG4706 CG4706 {v34888} / elavGS> ATXN3-70Q 92 27.0 1.08 l, 2E-02
Mes-4 Mes-4 {vl0836}/elavGS>ATXN3-70Q 87 27,0 1,08 2,7E-03Mes-4 Mes-4 {vl0836} / elavGS> ATXN3-70Q 87 27.0 1.08 2.7E-03
Brel Brel {vl5620}/elavGS>ATXN3-70Q 90 27,0 1,08 3,6E-03 wda wda { v34847 }/elavGS> ATXN3 -70Q 78 27,2 1,09 l,5E-02Brel Brel {vl5620} / elavGS> ATXN3-70Q 90 27.0 1.08 3.6E-03 wda wda {v34847} / elavGS> ATXN3 -70Q 78 27.2 1.09 l, 5E-02
CG14619 CG14619 {v37929}/elavGS>ATXN3-70Q 85 27,3 1,09 7,5E-03CG14619 CG14619 {v37929} / elavGS> ATXN3-70Q 85 27.3 1.09 7.5E-03
Hsc70-5 Hsc70-5 {v47745 }/elavGS>ATXN3-70Q 103 27,5 1 ,10 8,2E-03 trr trr{vl 0749}/elavGS>ATXN3-70Q 84 27,7 1,11 Ι,ΙΕ-05Hsc70-5 Hsc70-5 {v47745} / elavGS> ATXN3-70Q 103 27.5 1, 10 8.2E-03 trr trr {vl 0749} / elavGS> ATXN3-70Q 84 27.7 1.11 Ι, ΙΕ- 05
Luci UAS-Luci/elavGS>ATXN3-70Q 82 27,9 1,11 1.4E-03Luci UAS-Luci / elavGS> ATXN3-70Q 82 27.9 1.11 1.4E-03
GFP UAS-GFP/elavGS>ATXN3-70Q 143 28,0 1,12 3,5E-10GFP UAS-GFP / elavGS> ATXN3-70Q 143 28.0 1.12 3.5E-10
Pcaf Pcaf{v21787}/elavGS>ATXN3-70Q 89 28,1 1,12 5,lE-06Pcaf Pcaf {v21787} / elavGS> ATXN3-70Q 89 28.1 1.12 5, lE-06
UbcD6 UbcD6{v23229}/elavGS>ATXN3-70Q 81 28,6 1,14 2,4E-06UbcD6 UbcD6 {v23229} / elavGS> ATXN3-70Q 81 28.6 1.14 2.4E-06
Cdk9 Cdk9{v30449}/elavGS>ATXN3-70Q 62 29,3 1,17 3,1E-12Cdk9 Cdk9 {v30449} / elavGS> ATXN3-70Q 62 29.3 1.17 3.1E-12
Acfl Acfl {v33447}/elavGS>ATXN3-70Q 13 29,5 1,18 3,3E-02Acfl Acfl {v33447} / elavGS> ATXN3-70Q 13 29.5 1,18 3,3E-02
CG17293 CG17293 {v25248}/elavGS>ATXN3-70Q 86 29,8 1,19 7.3E-13CG17293 CG17293 {v25248} / elavGS> ATXN3-70Q 86 29.8 1.19 7.3E-13
CG7597 CG7597{v25508}/elavGS>ATXN3-70Q 86 30,3 1 ,21 5,5E-15CG7597 CG7597 {v25508} / elavGS> ATXN3-70Q 86 30.3 1, 21 5.5E-15
DNApol- DN Apol-alpha50 { v43870 } /elavGS> ATXN3 -70Q 82 36,0 1 ,44 l,2E-30 alpha50 DNApol- DN Apol-alpha50 {v43870} / elavGS> ATXN3 -70Q 82 36.0 1, 44 l, 2E-30 alpha50
tous les mâles mâles/elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 300 25,1 1 ,00 l ,0E+00 La durée de vie des individus elavGS>ATXN3-70Q/DNApol- alpha50{v43870}, dans lesquels le niveau d'expression du gène DNApol-alpha50 est réduit in vivo par ARN interférence (ARNi), s'écarte significativement de la distribution normale des durées de vie (Figure 3). all male males / elavGS> ATXN3-70Q deciles 3-8 300 25.1 1, 00 l, 0E + 00 The lifespan of elavGS> ATXN3-70Q / DNApol-alpha50 {v43870} individuals, in which the expression level of the DNApol-alpha50 gene is reduced in vivo by RNA interference (RNAi), deviates significantly from the normal distribution. lifetimes (Figure 3).
Ainsi, l'inactivation de ce gène (DNApol-alpha50) chez des mouches exprimant dans les neurones l'Ataxine 3 pathologique est capable de restaurer une durée de vie similaire à celle de Drosophiles sauvages avec 44% d'augmentation de la durée de vie moyenne (Figure 4a).  Thus, the inactivation of this gene (DNApol-alpha50) in flies expressing in the neurons the pathological Ataxin 3 is able to restore a lifespan similar to that of wild Drosophila with 44% increase in life span average (Figure 4a).
De même, un phénomène semblable de restauration de la durée de vie a pu être observé pour l'ataxie SCA7, avec 28% d'augmentation de la durée de vie moyenne (Figure 4b) et pour l'ataxie SCA1, avec 60% d'augmentation de la durée de vie moyenne (Figure 4c).  Similarly, a similar lifespan restoration phenomenon was observed for SCA7 ataxia, with 28% increase in mean lifespan (Figure 4b) and for SCA1 ataxia, with 60% d increase in average life (Figure 4c).
Le Tableau III ci-dessous présente les résultats obtenus dans les différentes expériences menées sur les 3 modèles Drosophile d'ataxies (SCA1, SCA3 et SCA7) exprimant un ARNi spécifique du gène DNApol-alpha50. En ce qui concerne le modèle Drosophile SCA3, la protéine ATXN3-70Q a été exprimée soit dans les cellules neuronales soit dans les cellules gliales. Les notations sont les mêmes que celles du Tableau II. Les génotypes utilisés pour les différentes expériences pour les calculs des rapports de durée de vie moyenne et l'analyse des courbes de survie sont indiqués en caractères gras.  Table III below presents the results obtained in the various experiments carried out on the 3 Drosophila models of ataxies (SCA1, SCA3 and SCA7) expressing an RNAi specific for the DNApol-alpha50 gene. With respect to the Drosophila SCA3 model, the ATXN3-70Q protein has been expressed either in neuronal cells or in glial cells. The ratings are the same as in Table II. The genotypes used for the different experiments for the calculations of the average life ratio and the analysis of the survival curves are indicated in bold type.
Tableau III : Résultats du crible de gènes modificateurs de la toxicité des Ataxines 1, 3 et7 sur les modèles Drosophile SCA1, SCA3 et SCA7 respectivement  Table III: Screening Results of the Ataxin 1, 3 and 7 Toxicity Modifying Genetic Screens on Drosophila Models SCA1, SCA3 and SCA7 respectively
Génotype Condition N Durée de Ratio durée Test du vie de vie LogRank moyenne moyenne  Genotype Condition N Duration of Ratio Duration Average Life Test LogRank average
DNApol- alpha50  DNApol-alpha50
induit /  induced /
contrôle  control
Modèle neuronal SCA3  SCA3 neuronal model
DNApol-alpha50 {v43870}/ elavGS>ATXN3-70Q Induit 82 36,0 1,44 l ,2E-30 ail maies/ elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 Induit 300 25,1 1,00 l,0E+00 DNApol-alpha50 {v43870} / elavGS> ATXN3-70Q Induced 82 36.0 1.44 l, 2E-30 maize garlic / elavGS> ATXN3-70Q deciles 3-8 Induced 300 25,1 1,00 l, 0E + 00
DNApol-alpha50{v43870} / elavGS>ATXN3-70Q Induit 1 19 46,7 1,38 7,l E-44DNApol-alpha50 {v43870} / elavGS> ATXN3-70Q Induced 1 19 46.7 1.38 7, l E-44
UAS-EGFP{AH2} /elavGS>ATXN3-70Q Induit 182 33,8 1,00 l,0E+00UAS-EGFP {AH2} / elavGS> ATXN3-70Q Induced 182 33.8 1.00 l, 0E + 00
DNApol-alpha50{v43870}/ elavGS>ATXN3-70Q Induit 92 31,7 1,33 8.7E-17DNApol-alpha50 {v43870} / elavGS> ATXN3-70Q Induced 92 31.7 1.33 8.7E-17
UAS-GFP-IR maie/ elavGS>ATXN3-70Q Induit 90 23,8 1,00 l,0E+00UAS-GFP-IR maie / elavGS> ATXN3-70Q Induced 90 23.8 1.00 l, 0E + 00
DNApol-alpha50 {v43870}/ elavGS Induit 1 18 38,6 1 ,02 -5.9E-01DNApol-alpha50 {v43870} / elavGS Induced 1 18 38.6 1, 02 -5.9E-01
DNApol-aIpha50{v43870}/ elavGS Non 30 37,9 1,00 l,0E+00 Induit DNApol-aIpha50 {v43870} / elavGS No 30 37.9 1,00 l, 0E + 00 armature
Modèle neuronal SCA7  Neural model SCA7
DN Apol-alpha50 { v43870 } /elavGS>SC A7- 102Q Induit 195 32,7 1,28 9,7E-32 DN Apol-alpha50 {v43870} / elavGS> SC A7- 102Q Induced 195 32.7 1.28 9.7E-32
UAS-Luci /elavGS>SCA7-102Q Induit 184 25,5 1,00 l,0E+00UAS-Luci / elavGS> SCA7-102Q Induced 184 25.5 1.00 l, 0E + 00
Modèle neuronal SCAl SCAl neuronal model
DNApol-alpha50{v43870}/ elavGS>UAS-SCAl-82Q Induit 277 44,9 1,60 3,4E-72 DNApol-alpha50 {v43870} / elavGS> UAS-SCAl-82Q Induced 277 44.9 1.60 3.4E-72
UAS-Luci elavGS>UAS-SCAl-82Q Induit 267 28,0 1,00 l,0E+O0UAS-Luci elavGS> UAS-SCAl-82Q Induced 267 28,0 1,00 l, 0E + O0
Modèle glial SCA7 SCA7 glial model
DNApol-alpha50 {v43870} /dEaatl >SCA7- 102Q Non Induit 171 20,0 1,25 5,5E-44  DNApol-alpha50 {v43870} / dEaatl> SCA7-102Q Not Induced 171 20.0 1.25 5.5E-44
Non  No
UAS-Luci /dEaatl>SCA7-102Q 103 16,0 1,00 l,0E+00  UAS-Luci / dEaatl> SCA7-102Q 103 16.0 1.00 l, 0E + 00
Induit  armature
DNApol-alpha50 { v43870 } /dEaat 1 >SC A7- 102Q Non Induit 125 12,5 1,22 l,3E-37 dup{V23131 } /dEaatl>SCA7-102Q Non Induit 152 12,0 1 ,17 4,0E-26 DNApol-alpha50 {v43870} / dEaat 1> SC A7- 102Q No Induced 125 12.5 1.22 l, 3E-37 dup {V23131} / dEaatl> SCA7-102Q No Induced 152 12.0 1, 17 4.0E -26
GFP-IR /dEaatl>SCA7-102Q Non Induit 235 9,2 0,89 -3,1E-21 GFP-IR / dEaatl> SCA7-102Q No Induced 235 9.2 0.89 -3.1E-21
Non  No
UAS-Luci /dEaatl>SCA7-102Q 216 10,3 1,00 l,0E+00  UAS-Luci / dEaatl> SCA7-102Q 216 10.3 1.00 l, 0E + 00
Induit  armature
L'amélioration de la survie s'accompagne aussi d'une augmentation des performances locomotrices des mouches SCA3 qui sont similaires à la lignée sauvage (non quantifié). The improved survival is also accompanied by an increase in locomotor performance of SCA3 flies that are similar to the wild (unquantified) line.
La souche GMR-GAL4 a été utilisée pour exprimer une protéine pathologique tronquée ATXN3T-78Q dans l'œil. Dans ces conditions il a été observé une forte dégénérescence de l'œil (Figure 5). Ce phénotype est supprimé dans les mouches GMR-GAL4, UAS-ATXN3T-78Q/UAS-DNApol-alpha50{v43870} où la DNApol-alpha50 est inactivée par ARN interférence (Figure 5).  GMR-GAL4 was used to express a truncated ATXN3T-78Q pathological protein in the eye. Under these conditions, a strong degeneration of the eye has been observed (Figure 5). This phenotype is suppressed in the GMR-GAL4, UAS-ATXN3T-78Q / UAS-DNApol-alpha50 (v43870) flies where DNApol-alpha50 is inactivated by RNA interference (Figure 5).
Enfin, les résultats montrent que la protection apportée par l'inhibition de la primase (DNApol-alpha50) s'applique aussi lorsque la protéine pathologique ATXN7T-102Q est exprimée dans une sous population de cellules gliales (celles dans lesquelles le transporteur du glutamate dEaatl est exprimé). On observe dans ces conditions une augmentation de la durée de vie d'environ 25% (Tableau III et Figure 7). Ces résultats démontrent donc une protection des cellules gliales par inhibition de la réplication de Γ ADN.  Finally, the results show that the protection afforded by the primase inhibition (DNApol-alpha50) also applies when the pathological protein ATXN7T-102Q is expressed in a subpopulation of glial cells (those in which the glutamate transporter dEaatl is expressed). Under these conditions, an increase in the service life of approximately 25% is observed (Table III and Figure 7). These results therefore demonstrate protection of glial cells by inhibition of DNA replication.
2.3) Crible génétique de nouveaux gènes modificateurs liés à la réplication dans le modèle Drosophile d'ataxie spinocérébelleuse SCA3  2.3) Genetic Screening of New Replication-related Modifier Genes in the Drosophila Model of Spinocerebellar Ataxia SCA3
Les résultats précédents montrent que la réduction du niveau de la DNApol-alpha50 par ARN interfèrent spécifique de DNApol-alpha50 permet de supprimer tous les effets toxiques de 3 ataxies spinocérébelleuses par expansion de polyglutamine, SCAl, SCA3 et SCA7 dans un modèle Drosophile. La protection observée concerne à la fois les neurones et les cellules gliales qui sont tous deux des acteurs critiques des processus dégénératifs. The previous results show that the reduction of the level of DNApol-alpha50 by DNApol-alpha50-specific interfering RNA makes it possible to eliminate all the toxic effects of 3 spinocerebellar ataxias by polyglutamine, SCA1, SCA3 and SCA7 expansion in a Drosophila model. Protection observed involves both neurons and glial cells which are both critical players in degenerative processes.
La DNApol-alpha50 est très fortement conservée chez l'homme (orthologue de PRIM1) et joue un rôle majeur dans la réplication de l'ADN.  DNApol-alpha50 is very strongly conserved in humans (orthologue of PRIM1) and plays a major role in the replication of DNA.
Les données obtenues ci-dessus suggèrent que, dans les pathologies neurodégénératives à amplification de polyglutamine, une réactivation de la réplication dans les neurones post-mitotiques est un facteur majeur de toxicité conduisant aux phénotypes délétères associés.  The data obtained above suggest that, in neurodegenerative pathologies with polyglutamine amplification, reactivation of replication in post-mitotic neurons is a major factor of toxicity leading to associated deleterious phenotypes.
Il a donc été cherché si d'autres modifications génétiques affectant des gènes liées à la réplication de l'ADN ou à des voies de contrôle de la réplication de l'ADN peuvent supprimer la toxicité de la protéine ATXN3 pathologique. Pour cela des femelles de génotype elavGS>ATXN3-70Q ont été croisées avec des mâles de différents génotypes et la durée de vie moyenne de la descendance analysée. Les gènes étudiés sont indiqués dans le Tableau IV ci-dessous et les résultats sont représentés dans le Tableau V ci-dessous.  It has therefore been investigated whether other genetic modifications affecting genes related to DNA replication or DNA replication control pathways can suppress the toxicity of the pathological ATXN3 protein. For this, females of genotype elavGS> ATXN3-70Q were crossed with males of different genotypes and the average life of the offspring analyzed. The genes studied are shown in Table IV below and the results are shown in Table V below.
Tableau IV : Gènes analysés  Table IV: Genes Analyzed
Gène Gène orthologue Rôle  Gene Gene orthologue Role
(humain ou levure)  (human or yeast)
cdc6 Cdc6 Origine de pré-réplication (pre-RC) cdc6 Cdc6 Origin of pre-replication (pre-RC)
DDB1 ddbl Origine de pré-réplication (pre-RC) dup Cdtl Origine de pré-réplication (pre-RC)DDB1 ddbl Origin of pre-replication (pre-RC) dup Cdtl Origin of pre-replication (pre-RC)
Huwel Huwel Origine de pré-réplication (pre-RC) mcm2 MCM2 Origine de pré-réplication (pre-RC) orcl Orcl Origine de pré-réplication (pre-RC) orc2 Orc2 Origine de pré-réplication (pre-RC) cdc45L Cdc45 Formation de la fourche de réplication l(l)G0148 Cdc7 Formation de la fourche de réplicationHuwel Huwel Origin of pre-replication (pre-RC) mcm2 MCM2 Origin of pre-replication (pre-RC) orcl Orcl Origin of pre-replication (pre-RC) orc2 Orc2 Origin of pre-replication (pre-RC) cdc45L Cdc45 Formation of the replication fork l (l) G0148 Cdc7 Formation of the replication fork
DNApol-alpha50 priml Etape de Réplication 1 DNApol-alpha50 priml Replication Step 1
DNApol-delta POLD1 Etape de Réplication 2  DNApol-delta POLD1 Replication Step 2
DNApol-epsilon POLE Etape de Réplication 2  DNApol-epsilon POLE Replication Step 2
cdk4 cdk4 Cycle cellulaire  cdk4 cdk4 Cell Cycle
cycA cycA Cycle cellulaire  cycA cycA Cell cycle
cycB cycB Cycle cellulaire  cycB cycB Cell cycle
cycE cycE Cycle cellulaire  cycE cycE Cell cycle
E2f E2fl Cycle cellulaire  E2f E2fl Cell cycle
E2f2 E2J2 Cycle cellulaire  E2f2 E2J2 Cell cycle
polo PLK1 Cycle cellulaire  polo PLK1 Cell cycle
string cdc25 Cycle cellulaire tefu ATM Voie de signalisation ATM lok CHK2 Voie de signalisation ATM nbs NBS1 Voie de signalisation-recrutement ATM rad50 RAD50 Voie de signalisation-recrutement ATM cdc2c cdk2 Voie de signalisation ATR string cdc25 Cell cycle tefu ATM ATM lok signaling channel CHK2 ATM nbs1 signaling channel NBS1 ATM50 signaling-recruiting path RAD50 ATM signaling-recruiting pathway cdc2c cdk2 ATR signaling pathway
CG32251 claspin Voie de signalisation ATR  CG32251 claspin ATR signaling channel
grp CHK1 Voie de signalisation ATR p53 p53 Voie de signalisation ATR p53 p53 Voie de signalisation ATR p53 p53 Voie de signalisation ATR stg CDC25 Voie de signalisation ATR muslOl TOPBP1 Voie de signalisation-activation ATR mei-41 ATR Voie de signalisation-activation ATR mus 304 ATRIP Voie de signalisation-activation ATR grp CHK1 ATR p53 p53 signaling pathway ATR p53 p53 signaling pathway ATR p53 p53 signaling pathway ATR stg CDC25 signaling pathway ATR muslOl signaling pathway TOPBP1 ATR signaling-activation pathway mei-41 ATR ATR signaling-activation channel 304 ATRIP ATR signaling-activation pathway
DNApol-alpha 73 POLA2 Etape de Réplication 1 DNApol-alpha 73 POLA2 Replication Step 1
timeout Timeless (TIM) Cycle cellulaire  Timeout Timeless (TIM) Cell Cycle
Tableau V : Résultats du crible de gènes modificateurs à l'aide du modèle Drosophile SCA3 (après induction de l'expression de la protéine ATXN3-70Q en milieu RU200). Les notations sont les mêmes que pour le Tableau II ci-dessus. Les génotypes de références utilisés pour les différentes expériences pour les calculs des rapports de durée de vie moyenne et l'analyse des courbes de survie sont indiqués par un astérisque. Certaines expériences (représentées en caractères gras) ont été réalisées sur des mouches femelles pour des raisons de localisation chromosomique des insertions. Table V: Results of the screen of modifying genes using the Drosophila model SCA3 (after induction of the expression of the ATXN3-70Q protein in RU200 medium). The ratings are the same as for Table II above. The reference genotypes used for the different experiments for the calculations of the average life ratio and the survival curve analysis are indicated by an asterisk. Some experiments (represented in bold type) were performed on female flies for reasons of chromosomal location of the insertions.
Tableau V  Table V
Génotype N Durée de Ratio durée Test du vie de vie LogRank moyenne moyenne /  Genotype N Ratio Duration Duration LogRank Average Life Lifespan Test /
courbe  curve
témoin  witness
*GFP IR femelles/elavGS>ATXN3-70Q 118 29,3 1,00 l,0E+00 muslOl [Dl]/elavGS>ATXN3-70Q 117 26,5 0,90 -2,8E-08 mei-41 [e02381]/elavGS>ATXN3-70Q 122 28,0 0,95 -l,5E-08 * GFP IR females / elavGS> ATXN3-70Q 118 29.3 1.00 l, 0E + 00 muslOl [Dl] / elavGS> ATXN3-70Q 117 26.5 0.90 -2.8E-08 mei-41 [e02381 ] / elavGS> ATXN3-70Q 122 28.0 0.95 -L, 5E-08
*GFP IR mâles/elavGS>ATXN3-70Q 119 27,3 1,00 Ι,ΟΕ+00* GFP IR male / elavGS> ATXN3-70Q 119 27.3 1.00 Ι, ΟΕ + 00
1( 1 )G0148 [EY07177]/elavGS>ATXN3-70Q 117 24,2 0,89 -2.5E-16 rad50[EPl]/elavGS>ATXN3-70Q 120 24,4 0,89 -3,8E-041 (1) G0148 [EY07177] / elavGS> ATXN3-70Q 117 24.2 0.89 -2.5E-16 rad50 [EP1] / elavGS> ATXN3-70Q 120 24.4 0.89 -3.8E-04
E2f2[KG07098]/elavGS>ATXN3-70Q 116 24,4 0,89 -l,6E-09E2f2 [KG07098] / elavGS> ATXN3-70Q 116 24.4 0.89 -L, 6E-09
E2f[EY14408]/elavGS>ATXN3-70Q 115 24,5 0,90 -3,lE-04 Rpd3[04556] ry[506]/elavGS>ATXN3-70Q 120 24,5 0,90 -l,5E-03 polo[DG 12705]/elavGS>ATXN3-70Q 116 24,6 0,90 -l,9E-06E2f [EY14408] / elavGS> ATXN3-70Q 115 24.5 0.90 -3, IE-04 Rpd3 [04556] ry [506] / elavGS> ATXN3-70Q 120 24.5 0.90 -l, 5E-03 polo [DG 12705] / elavGS> ATXN3-70Q 116 24.6 0.90 -1, 9E- 06
CG32251 [EY11302]/elavGS>ATXN3-70Q 119 24,7 0,91 -5,4E-09 nbs[EY 15506]/elavGS>ATXN3-70Q 114 25,1 0,92 -l,8E-08CG32251 [EY11302] / elavGS> ATXN3-70Q 119 24.7 0.91 -5.4E-09 nbs [EY 15506] / elavGS> ATXN3-70Q 114 25.1 0.92 -L, 8E-08
E2f2[EY02995]/elavGS>ATXN3-70Q 120 26,1 0,95 -2,3E-05 p53 [5 A- 1 -4]/elavGS>ATXN3-70Q 118 26,3 0,96 -l,3E-04 stg[EY12388]/elavGS>ATXN3-70Q 119 26,6 0,98 -l,6E-02 cdc2c[2]/elavGS>ATXN3-70Q 116 29,8 1,09 2,6E-06 grp[EY09600]/elavGS>ATXN3-70Q 121 30,0 1,10 l,3E-05 mus304[D 1 ]/elavGS>ATXN3-70Q 120 32,4 1,18 6,2E-14 grp[EY00450]/elavGS>ATXN3-70Q 121 32,9 1,20 1,4E-16 mâles/elavGS>ATXN3-70Q 300 26,8 0,98 -6,2E-01E2f2 [EY02995] / elavGS> ATXN3-70Q 120 26.1 0.95 -2.3E-05 p53 [5A-1 -4] / elavGS> ATXN3-70Q 118 26.3 0.96 -l, 3E- ## STR1 ## ## EQU1 ## 70Q 121 32.9 1.20 1.4E-16 males / elavGS> ATXN3-70Q 300 26.8 0.98 -6.2E-01
*GFP IR femelles/elavGS>ATXN3-70Q 93 26,4 1,00 l,0E+00* GFP IR females / elavGS> ATXN3-70Q 93 26.4 1.00 l, 0E + 00
DNApol-delta{V41028} femelles/eIavGS>ATXN3-70Q 15 21,2 0,80 -7,0E-09 mus304{V46012} femeUes/elavGS>ATXN3-70Q 132 15,7 0,59 -l,9E-27DNApol-delta {V41028} females / eIavGS> ATXN3-70Q 15 21.2 0.80 -7.0E-09 mus304 {V46012} females / elavGS> ATXN3-70Q 132 15.7 0.59 -l, 9E-27
*GFP IR mâles/elavGS>ATXN3-70Q 119 24,7 1,00 l,0E+00 cdk4 {V40576}/elavGS>ATXN3-70Q 120 19,5 0,79 -2,9E-20 mei 41 {VI 1251 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 20,6 0,83 -4,8E-12 muslOl {V31431 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 21,6 0,88 -9,4E-07 cycA{V32421 }/elavGS>ATXN3-70Q 122 22,0 0,89 -2,6E-12* GFP IR males / elavGS> ATXN3-70Q 119 24.7 1.00 l, 0E + 00 cdk4 {V40576} / elavGS> ATXN3-70Q 120 19.5 0.79 -2.9E-20 mei 41 {VI 1251 } / elavGS> ATXN3-70Q 119 20.6 0.83 -4.8E-12 muslOl {V31431} / elavGS> ATXN3-70Q 119 21.6 0.88 -9.4E-07 cycA {V32421} / elavGS> ATXN3-70Q 122 22.0 0.89 -2.6E-12
1( 1 )GO 148 { V40715 } /elavGS>ATXN3-70Q 118 22,0 0,89 -8,lE-07 grp{V12680}/elavGS>ATXN3-70Q 123 22,3 0,91 -8,0E-05 tefii{V22502}/elavGS>ATXN3-70Q 90 22,6 0,92 -l,0E-04 cdc6{V46927}/elavGS>ATXN3-70Q 31 23,4 0,95 -2,1E-01 orcl {V46522}/elavGS>ATXN3-70Q 118 24,4 0,99 3,9E-02 p53 {V45138}/elavGS>ATXN3-70Q 115 24,4 0,99 3,0E-01 cdc45L {V41084}/elavGS>ATXN3-70Q 117 24,8 1,00 4JE-04 lok{V44980}/elavGS>ATXN3-70Q 122 24,8 1,01 6,9E-01 orc2 { V47603 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 25,5 1,04 4,lE-03 p53 {V10692}/elavGS>ATXN3-70Q 117 25,6 1,04 6,3E-06 cycB {V43772}/elavGS>ATXN3-70Q 122 25,7 1,04 4,lE-03 cycE{V52662}/elavGS>ATXN3-70Q 123 25,8 1,05 7,6E-051 (1) GO 148 (V40715) / elavGS> ATXN3-70Q 118 22.0 0.89 -8, 1E-07 grp {V12680} / elavGS> ATXN3-70Q 123 22.3 0.91 -8.0E- 05 tefii {V22502} / elavGS> ATXN3-70Q 90 22.6 0.92 -l, 0E-04 cdc6 {V46927} / elavGS> ATXN3-70Q 31 23.4 0.95 -2.1E-01 orcl {V46522 } / elavGS> ATXN3-70Q 118 24.4 0.99 3.9E-02 p53 {V45138} / elavGS> ATXN3-70Q 115 24.4 0.99 3.0E-01 cdc45L {V41084} / elavGS> ATXN3- 70Q 117 24.8 1.00 4JE-04 lok {V44980} / elavGS> ATXN3-70Q 122 24.8 1.01 6.9E-01 orc2 {V47603} / elavGS> ATXN3-70Q 119 25.5 1.04 4, 1E-03 p53 {V10692} / elavGS> ATXN3-70Q 117 25.6 1.04 6.3E-06 cycB {V43772} / elavGS> ATXN3-70Q 122 25.7 1.04 4, lE-03 cycE {V52662} / elavGS> ATXN3-70Q 123 25.8 1.05 7.6E-05
DNA pol epsilon{V13647}/elavGS>ATXN3-70Q 116 25,8 1,05 l,8E-04 l(l)G0148 {V24186}/elavGS>ATXN3-70Q 118 27,1 1,10 1,8E-12 mcm2{V10967}/elavGS>ATXN3-70Q 30 27,3 1,11 7,5E-07 dup { V23131 } /elavGS>ATXN3-70Q 117 27,7 1,12 2,3E-19 * mâles/elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 300 24,4 0,99 2,3E-01## STR1 ## mcm2 {V10967} / elavGS> ATXN3-70Q 30 27.3 1.17 7.5E-07 dup {V23131} / elavGS> ATXN3-70Q 117 27.7 1.12 2.3E-19 * males / elavGS> ATXN3-70Q deciles 3-8 300 24.4 0.99 2.3E-01
*UAS-GFP-IR femelIe/elavGS>ATXN3-70Q 110 22,8 1,00 l,0E+00* UAS-GFP-IR FEMALE / ELAVGS> ATXN3-70Q 110 22,8 1,00 l, 0E + 00
1(1)G0148[EY07177] femelles NV/elavGS>ATXN3-70Q 25 22,1 0,97 -l,7E-04 mei-41 [e02381] femelles/elavGS>ATXN3-70Q 13 22,4 0,98 -1,6E-011 (1) G0148 [EY07177] females NV / elavGS> ATXN3-70Q 25 22.1 0.97 -l, 7E-04 mei-41 [e02381] females / elavGS> ATXN3-70Q 13 22.4 0.98 - 1.6E-01
UAS-luci femelle/elavGS>ATXN3-70Q 20 23,3 1,02 -6,5E-02UAS-luci female / elavGS> ATXN3-70Q 20 23.3 1.02 -6.5E-02
1(1)G0148[EY07177] femelles/elavGS>ATXN3-70Q 98 24,4 1,07 -5,8E-021 (1) G0148 [EY07177] females / elavGS> ATXN3-70Q 98 24.4 1.07 -5.8E-02
Huwel {EY01689} femelles/elavGS>ATXN3-70Q 31 36,3 1,59 2,6E-20Huwel {EY01689} females / elavGS> ATXN3-70Q 31 36.3 1.59 2,6E-20
*UAS-GFP-IR mâle/elavGS>ATXN3-70Q 90 23,8 1,00 l,0E+00 cdc6 {v46927}/elavGS>ATXN3-70Q 29 15,7 0,66 -8,6E-13* UAS-GFP-IR male / elavGS> ATXN3-70Q 90 23.8 1.00 l, 0E + 00 cdc6 {v46927} / elavGS> ATXN3-70Q 29 15.7 0.66 -8.6E-13
UAS-S6K/elavGS>ATXN3-70Q 31 16,1 0,68 -1JE-13 cdk4 {v40576}/elavGS>ATXN3-70Q 80 17,6 0,74 -2,0E-08 cdc2c[2]/elavGS>ATXN3-70Q 58 21,1 0,89 2,1E-01 mei-41 {vl 1251 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 21,9 0,92 -4,3E-02UAS-S6K / elavGS> ATXN3-70Q 31 16.1 0.68 -1JE-13 cdk4 {v40576} / elavGS> ATXN3-70Q 80 17.6 0.74 -2.0E-08 cdc2c [2] / elavGS> ATXN3-70Q 58 21.1 0.89 2.1E-01 mei-41 {vl 1251} / elavGS> ATXN3-70Q 119 21.9 0.92 -4.3E-02
E2F2 {KG07098}/elavGS>ATXN3-70Q 60 22,1 0,93 -5,6E-01E2F2 {KG07098} / elavGS> ATXN3-70Q 60 22.1 0.93 -5.6E-01
CG32251 [EY11302]/elavGS>ATXN3-70Q 111 22,3 0,94 -5,6E-02CG32251 [EY11302] / elavGS> ATXN3-70Q 111 22.3 0.94 -5.6E-02
UAS-luci mâle/elavGS>ATXN3-70Q 52 22,4 0,94 8,9E-02 muslOl {v31431 }/elavGS>ATXN3-70Q 120 22,4 0,94 -2,4E-02 cycA{v32421 }/elavGS>ATXN3-70Q 57 22,8 0,96 -7,2E-01 mei-41 [e02381] mâles (témoins)/elavGS>ATXN3-70Q 37 22,9 0,96 -l,7E-02 l(l)G0148 {v40715}/elavGS>ATXN3-70Q 120 23,0 0,97 -7,1E-01UAS-luci male / elavGS> ATXN3-70Q 52 22.4 0.94 8.9E-02 muslOl {v31431} / elavGS> ATXN3-70Q 120 22.4 0.94 -2.4E-02 cycA {v32421} / ## EQU1 ## ) G0148 {v40715} / elavGS> ATXN3-70Q 120 23.0 0.97 -7.1E-01
UAS-cycE/elavGS>ATXN3-70Q 81 23,1 0,97 3,6E-02UAS-cycE / elavGS> ATXN3-70Q 81 23.1 0.97 3.6E-02
UAS-E2F nul pl717/elavGS>ATXN3-70Q 90 23,2 0,98 8,1E-01UAS-E2F void pl717 / elavGS> ATXN3-70Q 90 23.2 0.98 8.1E-01
UAS-cycE P1396/elavGS>ATXN3-70Q 65 23,3 0,98 -l,2E-02 dup {v23131 } /elavGS>ATXN3-70Q 88 24,0 1,01 7,7E-01 grp[DG25208]/elavGS>ATXN3-70Q 51 24,2 1,02 -6,3E-02UAS-cycE P 1396 / elavGS> ATXN3-70Q 65 23.3 0.98 -l, 2E-02 dup {v23131} / elavGS> ATXN3-70Q 88 24.0 1.01 7.7E-01 grp [DG25208] / elavGS> ATXN3-70Q 51 24.2 1.02 -6.3E-02
UAS-cycA/elavGS>ATXN3-70Q 48 24,8 1,04 5,9E-01 muslOl [Dl]/elavGS>ATXN3-70Q 123 24,8 1,04 5,5E-02 grp{vl2680}/elavGS>ATXN3-70Q 47 25,4 1,07 2,9E-02 nbs[EY15506]/elavGS>ATXN3-70Q 116 25,4 1,07 8,2E-02 w/elavGS>ATXN3-70Q 116 25,8 1,09 l,4E-03UAS-cycA / elavGS> ATXN3-70Q 48 24.8 1.04 5.9E-01 muslOl [Dl] / elavGS> ATXN3-70Q 123 24.8 1.04 5.5E-02 grp {vl2680} / elavGS> ATXN3-70Q 47 25.4 1.07 2.9E-02 nbs [EY15506] / elavGS> ATXN3-70Q 116 25.4 1.07 8.2E-02 w / elavGS> ATXN3-70Q 116 25.8 1, 09 l, 4E-03
DDBl[EY01408]/elavGS>ATXN3-70Q 55 25,9 1,09 9,4E-03 grp[06034]/elavGS>ATXN3-70Q 80 26,3 1,11 3,0E-02DDBl [EY01408] / elavGS> ATXN3-70Q 55 25.9 1.09 9.4E-03 grp [06034] / elavGS> ATXN3-70Q 80 26.3 1.13 3.0E-02
UAS-string/elavGS>ATXN3-70Q 79 26,8 1,13 l,4E-06 timeout { v22592 }/elavGS>ATXN3-70Q 113 30,4 1,12 1,1Ε-02UAS-string / elavGS> ATXN3-70Q 79 26.8 1.13 l, 4E-06 timeout {v22592} / elavGS> ATXN3-70Q 113 30.4 1.12 1.11-02
DNApol-alpha73 {vl08579}/elavGS>ATXN3-70Q 125 30,6 1,13 2,2E-02DNApol-alpha73 {vl08579} / elavGS> ATXN3-70Q 125 30.6 1.12 2.2E-02
DNApol-alpha73 {vl08579}/elavGS>ATXN3-70Q 121 31,6 1 ,22 l,8E-08 DNApol-alpha50{v43870}/elavGS>ATXN3-70Q 92 31,7 1,33 8/7E-17 timeout[c06976]/elavGS>ATXN3-70Q 114 31,8 1,12 1,2Ε-06 timeout {v22592 }/elavGS>ATXN3-70Q 149 32,6 1,25 5,7E-20 grp[EY00450]/elavGS>ATXN3-70Q 116 32,8 1,38 l,3E-27DNApol-alpha73 {vl08579} / elavGS> ATXN3-70Q 121 31.6 1, 22 l, 8E-08 DNApol-alpha50 {v43870} / elavGS> ATXN3-70Q 92 31.7 1.33 8 / 7E-17 timeout [c06976] / elavGS> ATXN3-70Q 114 31.8 1.12 1.2Ε-06 timeout {v22592} / elavGS> ATXN3-70Q 149 32.6 1.25 5.7E-20 grp [EY00450] / elavGS> ATXN3-70Q 116 32.8 1.38 l, 3E-27
*mâles/elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 300 23,6 * males / elavGS> ATXN3-70Q deciles 3-8 300 23.6
Ces cribles génétiques ont permis d'identifier plusieurs autres gènes impliqués dans la réplication de l'ADN susceptibles de moduler la pathologie SCA3. Il s'agit des gènes mcm2 et dup/Cdtl, nécessaires à la réplication et dont l'inactivation sauve le phénotype pathologique, ainsi que du gène Huwel, un inhibiteur de la réplication dont le gain de fonction a un effet protecteur dans la pathologie SCA3. D'autre part, le gain de fonction de la kinase grp/Chkl, un effecteur majeur de la voie ATR impliquée dans le contrôle de la réplication de l'ADN, sauve aussi le phénotype pathologique. Ces cribles ont aussi permis d'identifier les gènes dPOLA2 et dTimeless nécessaires à la réplication et dont l'inactivation restaure partiellement le phénotype sauvage. Ainsi plusieurs gènes jouant un rôle dans le processus de la réplication de l'ADN et son contrôle apparaissent comme des cibles thérapeutiques potentielles. These genetic screens have identified several other genes involved in DNA replication that may modulate SCA3 pathology. These are the mcm2 and dup / Cdtl genes required for replication and whose inactivation saves the pathological phenotype, as well as the Huwel gene, a replication inhibitor whose gain of function has a protective effect in SCA3 pathology. . On the other hand, the gain in function of the grp / Chkl kinase, a major effector of the ATR pathway involved in the control of DNA replication, also saves the pathological phenotype. These screens also made it possible to identify the genes dPOLA2 and Tequeless that are necessary for replication and whose inactivation partially restores the wild-type phenotype. Thus, several genes that play a role in the process of DNA replication and its control appear as potential therapeutic targets.
EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE CHEZ LA DROSOPHILE DE L'EFFET DE LA DIMINUTION DE L'EXPRESSION DE LA PRIMASE SUR LA MALADIE DE HUNTINGTON EXAMPLE 2: DEMONSTRATING THE EFFECT OF REDUCING THE EXPRESSION OF PRIMASE ON HUNTINGTON'S DISEASE IN DROOSOPHILE
1) Matériels et Méthodes  1) Materials and Methods
Souches de Drosophile et culture  Drosophila strains and culture
Pour l'étude sur un modèle de la maladie de Huntington, la lignée GMR-UAS-Htt-93Q a été créée à partir d'une lignée pUAS-Htt 93Q (Steffan et al, 2001).  For the Huntington's disease model study, the GMR-UAS-Htt-93Q line was created from a pUAS-Htt 93Q line (Steffan et al, 2001).
Les conditions de cultures sont identiques à celles décrites dans l'Exemple 1.  The culture conditions are identical to those described in Example 1.
Analyse du phénotype de l'œil  Analysis of the phenotype of the eye
Des femelles de génotype GMR>Htt-93Q et des mâles de génotype DNApol-alpha50{v43870} et UAS-GFP-IR ont été élevés à une température de 23°C et croisées ensemble. L'examen optique de la structure de l'œil a été réalisé sur les mâles obtenus, âgés de 3 jours, avec un stéréomicroscope Leica M205FA. 2) Résultats Females of genotype GMR> Htt-93Q and males of genotype DNApol-alpha50 {v43870} and UAS-GFP-IR were raised to a temperature of 23 ° C and crossed together. Optical examination of the structure of the eye was performed on males obtained, aged 3 days, with a Leica M205FA stereomicroscope. 2) Results
La souche GMR-GAL4 a été utilisée pour exprimer la protéine Huntingtine humaine pathologique tronquée Htt-93Q (intron 1) dans l'œil. Dans ces conditions il a été observé une forte dégénérescence de l'œil (Figure 8A). Ce phénotype est supprimé dans les mouches UAS-Htt-93Q/UAS-DNApol- alpha50{v43870} où la DNApol-alpha50 est inactivée par ARN interférence (Figure 8B).  GMR-GAL4 was used to express the truncated human pathogenic Huntingtin protein Htt-93Q (intron 1) in the eye. Under these conditions, a strong degeneration of the eye has been observed (FIG. 8A). This phenotype is suppressed in UAS-Htt-93Q / UAS-DNApol-alpha50 {v43870} flies where DNApol-alpha50 is inactivated by RNA interference (Figure 8B).
REFERENCES REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1.Utilisation d'un inhibiteur de la réplication de l'ADN, lequel inhibiteur de la réplication de l'ADN est un inhibiteur d'une protéine choisie parmi les primases, les facteurs d'initiation de la réplication, les hélicases, les ADN polymérases, les ADN ligases, les topoisomérases, les antigènes nucléaires de la prolifération nucléaire (PCNA), les facteurs de réplication A et C, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine. 1.Use of an inhibitor of DNA replication, which DNA replication inhibitor is an inhibitor of a protein selected from primases, replication initiation factors, helicases, DNAs polymerases, DNA ligases, topoisomerases, nuclear nuclear proliferation antigens (PCNAs), replication factors A and C, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a neurodegenerative disease by polyglutamine expansion.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est un inhibiteur de la réplication de l'ADN dans les cellules neuronales.  2. Use according to claim 1, characterized in that said inhibitor of the replication of the DNA is an inhibitor of the replication of the DNA in the neuronal cells.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN inhibe l'expression d'un gène choisi parmi les gènes priml, mcm2, Cdtl, PLOA2, Timeless et les gènes orthologues de ceux-ci.  3. Use according to claim 1 or claim 2, characterized in that said inhibitor of DNA replication inhibits the expression of a gene selected from priml, mcm2, Cdtl, PLOA2, Timeless genes and orthologous genes. of these.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN active ou augmente l'expression d'un gène choisi parmi les gènes Huwel et Chkl et les gènes orthologues de ceux-ci.  4. Use according to claim 1 or claim 2, characterized in that said inhibitor of DNA replication activates or increases the expression of a gene selected from the Huwel and Chkl genes and the orthologous genes thereof .
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est choisi parmi un anticorps, un acide nucléique, un peptide, une protéine.  5. Use according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said inhibitor of DNA replication is selected from an antibody, a nucleic acid, a peptide, a protein.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est un ARN interfèrent.  6. Use according to claim 5, characterized in that said inhibitor of the replication of the DNA is an interfering RNA.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine est choisie parmi la maladie de Huntington, les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes 1, 2, 3, 6, 7 et 17, l'atrophie dentato- rubro-pallido-luysienne et la maladie de Kennedy. 7. Use according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said neurodegenerative disease by expansion of polyglutamine is selected from Huntington's disease, autosomal dominant spinocerebellar ataxias 1, 2, 3, 6, 7 and 17, dentato-rubro-pallido-luysian atrophy and Kennedy's disease.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite maladie neurodégénératives par expansion de polyglutamine est choisie parmi les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes 1, 2, 3, 6, 7 et 17 et la maladie de Huntington. 8. Use according to claim 7, characterized in that said neurodegenerative disease by expansion of polyglutamine is selected from autosomal dominant spinocerebellar ataxias 1, 2, 3, 6, 7 and 17 and Huntington's disease.
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