WO2011009974A2 - Método y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo - Google Patents

Método y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo Download PDF

Info

Publication number
WO2011009974A2
WO2011009974A2 PCT/ES2010/000310 ES2010000310W WO2011009974A2 WO 2011009974 A2 WO2011009974 A2 WO 2011009974A2 ES 2010000310 W ES2010000310 W ES 2010000310W WO 2011009974 A2 WO2011009974 A2 WO 2011009974A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
signal
measurement
calibration
excitation
frequency
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2010/000310
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011009974A3 (es
Inventor
Álvaro NAVARRO TOBAR
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidad Politecnica de Madrid
Original Assignee
Universidad Politecnica de Madrid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad Politecnica de Madrid filed Critical Universidad Politecnica de Madrid
Publication of WO2011009974A2 publication Critical patent/WO2011009974A2/es
Publication of WO2011009974A3 publication Critical patent/WO2011009974A3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/88—Investigating the presence of flaws or contamination
    • G01N21/94—Investigating contamination, e.g. dust
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food

Definitions

  • the invention falls within the field of analytical chemistry.
  • the detection of the life time of fluorescent substances is applicable in different sectors such as clinical analysis, the detection of contaminants in water, control processes in the food industry, the measurement of various environmental quantities, etc.
  • fluorescence when lighting with light of a certain wavelength within the absorption range of the substance, fluorescence can be observed as a light emission in a range of wavelengths greater than those of the excitation signal. This phenomenon can be characterized with different magnitudes, such as the ranges of excitation and emission wavelengths, the intensity of these signals, or the average lifetime of the emission.
  • the decay profile of the fluorescent emission is characterized by the decrease in intensity over time once the excitation source is suppressed.
  • FIG. 1 shows an example of the typical pattern of decay of a fluorescent emission
  • the excitation pulse (1) activates the fluorescent emission (2 and 3) of different fluorophores.
  • the composite fall signal in this example would be a biexponential drop (4).
  • the information provided by the measure of the half-life time (s) is often useful as it is modified by various factors that are affecting the fluorescent substance.
  • Those based on the time domain are based on the direct measurement of fall time with often complex and sophisticated instrumentation, such as the method of counting individual photons correlated in time (time-correlated single photon counting).
  • the methods based on the frequency domain, to which this invention relates are based on the excitation of the sample with a light intensity modulated at a certain frequency, and the detection of the phase and amplitude information of the fluorescent signal issued.
  • the response of a substance, fluorescent to an excitation modulated at a certain frequency / is a signal also modulated at that same frequency and characterized by a certain amplitude and a lag with respect to the excitation signal. Since the excitation and fluorescence signals share the same frequency and differ in their amplitude and phase, it is common to represent both by a complex vector called fasor, whose module and phase correspond to the amplitude and offset of the corresponding sinusoidal, respectively. Since the fasor is a complex number, it is also completely defined by expressing it in its Cartesian form (a + jb), referring to it then by its real part and its imaginary part.
  • an exhaustive frequency sweep is performed recording the amplitude of the modulation and the offset, and an adjustment of the results is made to a uni- or muiti-exponential model, obtaining as a result the life time values ⁇ , and relative intensities ⁇ , desired.
  • the amplitude information is often ignored, since it is subject to drifts, such as by the decrease of fluorophore molecules or long-term variations in the intensity of the excitation source, and work only with the phase, providing a more robust measure against this type of variation.
  • the measurement is obtained only from the measurement of the phase at a single modulation frequency, since this is sufficient to obtain the information that is desired in the application for which they are designed .
  • the amplitude of the modulation and / or the phase is obtained through a cross-correlation or heterodine demodulation scheme of the signal (the excitation modulation frequency being ⁇ , the signal is multiplied by a carrier of a frequency ⁇ + / > with the result of obtaining a signal at an intermediate frequency f , which contains the amplitude information and the initial phase).
  • the measured signal is contaminated by a background (background) due to a series of signals that hinder the correct measurement of amplitude and phase information.
  • interfering signals h (f) we can count, among others: - Light from the excitation source that reaches the detector. This can happen for several reasons, and, in general, an attempt is made to avoid as much as possible when designing the system, with the use of optical filters and geometric arrangements that minimize this effect.
  • This light can be of the wavelength range used for excitation (which is usually solved with a fluorescence filter that eliminates it between the sample and the photodetector) or in the range of fluorescence wavelengths (which is usually solve with an excitation filter between the sample and the excitation source).
  • This background signal always has phase 0 with respect to the excitation signal and its amplitude will suffer very little or no variations with the frequency.
  • Figure 4 shows the effect of the presence of radiation from the excitation source in the measure of fluorescence in the frequency domain, on the amplitude (7) and the phase (8) of the signal, for values of the quotient of 0, 0.5, 1, 2 and 5.
  • the sample to be characterized may contain other fluorescent substances that are not of interest.
  • the differences between the fluorescence and the autofluorescence signal can be, mainly, of excitation and fluorescence wavelength ranges (in which case it can be eliminated or reduced by optical filtration), and separation of its time (s) ( s) of characteristic life (s) with the substance (s) of interest (if they are much higher they will be of little interest because the signal will be extinguished at the frequency of exploration, while if they are much less their effect on
  • the measurement will be similar to that of the light coming from the excitation).
  • Electromagnetic interference between the excitation intensity modulation subsystem and the fluorescent signal amplification subsystem Since the operating frequencies of these systems are usually between 10 kHz and 1
  • the background signal is larger than the fluorescent signal itself, a small indeterminacy in its measurement will become an error of magnitude comparable to the fluorescence signal itself.
  • the way to alleviate this problem is the best determination of the background signal.
  • the presence of these background signals is precisely one of the major drawbacks when it comes to achieving a low cost system and a high degree of miniaturization, since its cancellation often requires the design of a system with greater optical complexity, with filters, lenses , with optoelectronic components away from each other and with high sensitivity photodetectors (avalanche photomultipliers and photodiodes).
  • the purpose of this invention is the recovery of the signal of interest from a measurement of the fluorescence lifetime in the frequency domain, in which said signal may be much less than the background signal present in the measurement, without the need to perform a calibration of said fund previously or in parallel with a known sample.
  • the recovery is based on the inspection of the amplitude and / or the modulation phase of the measured signal, and the sequential scanning through several states in which the background signal is kept constant, in order to recover the signal of interest by the extraction of the signal whose variation is synchronous with the control of the variation between states.
  • This method allows the recovery of a fluorescence signal much lower than the background level, which makes the design of the optical system more flexible, allowing it to be cheaper and more miniaturized, since greater spatial integration can be achieved without increasing the effect the interfering signals on the measurement.
  • the variation between the different states will be repeated periodically, so that the robustness against drifts of different opto-electronic components or other environmental factors that can modify the measure will be improved, and that change in time ranges slower than the repetition frequency
  • a periodic scan allows the integration time of the measurement to be increased in real time in case it is necessary to reduce the noise present in the measurement, or to recover a smaller signal than usual.
  • This embodiment scheme is more robust to noise, external interference, and component drifts, since only the signal components that vary synchronously with the change of state are detected.
  • the state measurement sequence is performed only once and not repetitively.
  • the optoelectronic system will consist of:
  • a modulation excitation light subsystem typically a light emitting diode (LED) or laser diode (LD), although other embodiments are not excluded, such as an unmodulated light source followed by an electromodulator, or any other means present or future
  • a light detection subsystem typically composed of a photodetector and an appropriate amplification and / or demodulation subsystem, although other embodiments, both present and future, are not excluded.
  • a common signal cancellation subsystem typically this task will be performed by a digital subsystem, although other embodiments are not excluded.
  • the corresponding equations will be used in this description in case the fluorescence exhibits a mono-exponential fall.
  • the cross-correlation method or heterodyne demodulation.
  • the conversion will be carried out by any of the usual methods, such as modulation of the gain of the photodetector (photomultiplier or avalanche photodiode) or analogical multiplication of the electrical signal by the demodulation carrier.
  • the signal at the output of this system which will contain information on the amplitude and the phase of the signal captured by the photodetector, will be analyzed to recover the component whose variation is synchronous with the change of state of the system, and eliminate the common component.
  • the specific way in which this cancellation is made will depend on the specific case. In a simpler approach, it could be considered that the variation occurs between two states and the measured signal is a quasi-continuous electrical signal that varies with said parameter. Applying a lock-in demodulation technique, the signal of interest could be extracted by canceling the continuous value that remains constant throughout the measurement, which would correspond to the background signal.
  • this parasitic fluorescence to be eliminated is either greater or less than that of the sample to be measured, but with a sufficient spectral separation so that its effect can be separated and be considered a signal of constant amplitude and phase (if its life time is much less than that of the sample) or negligible amplitude and irrelevant phase (if its life time is much greater than that of the sample).
  • This method is also applicable to eliminate the possible fluorescence of the long-pass optical filter used to prevent the arrival of light at excitation wavelengths to the photodetector (it is known that colored glass filters have a certain degree of photoluminescence).
  • This method is based on the fact that the optical excitation signal remains constant when performing a frequency scan, while the fluorescent signal decreases in amplitude and is offset from that of the excitation as the modulation frequency increases. If, due to the system architecture, it is not true that this excitation signal is constant (and therefore that the fluorescence signal of interest is also modified by this same pattern), a correction should be made on the measured signal (which includes the fluorescence signal of interest and the background signal) to correct this deviation, and can cancel the effect of the background signal and make the fluorescence measurement significant.
  • the signal that reaches the photodetector can be expressed by the complex phasor (it has been assumed , for simplicity and without loss of generality, that all contributions are monoexponential):
  • Ao represents the invariant signal with the frequency and in phase 0, which would correspond to the excitation
  • the second term groups the fluorescent contributions with a long lifetime ( ⁇ / »TJ)
  • the third term corresponds to the fluorescent signal of interest
  • the fourth term represents the fluorescent contributions with a short lifetime (% • « ⁇ ).
  • the second term corresponding to signals with a long lifetime, can be neglected, since at the scanning frequencies its amplitude will have greatly decreased, and will not affect the measurement.
  • a sweep is made by a certain set of frequencies that is repeated periodically, and the value of the measured phasor measured in a digital system is recorded. In said digital system a set of variables is maintained that correspond to the frequencies of the scan and we will call "accumulated value", in which the complete information (real and imaginary) of the measured phasor is recorded.
  • the measured value of the corresponding frequency is added to the accumulated value of each frequency, and the measured value corresponding to the frequency of higher value (or any other) is subtracted.
  • the accumulated values corresponding to each one of the frequencies, free of noise and free of the influence of the background signal are obtained.
  • These values can be adjusted with the corresponding formula or perform some other type of processing that allows to deduce the desired useful information from the measurement.
  • the great advantage of this method is that the cancellation of the background signal corresponding to the excitation and autofluorescence is eliminated during the measurement itself without the need for any previous measurement or calibration with a standard sample.
  • the cancellation is based precisely on the fact that on its own In nature, the ⁇ e signal of interest has variable characteristics with frequency, while the background signal remains constant.
  • the cancellation of this signal is always carried out by means of a real cancellation (by means of optical elements) or by the subtraction of the background signal, characterized in another measure with a standard sample.
  • AQ (J) is not considered a constant real value but a complex number that varies with frequency. If it is possible to measure the response of the system in conditions where the fluorescence intensity is 0 (or its temporal response is perfectly known), it is possible to measure the variation characteristic Ao ⁇ - Once this is done, it will be sufficient to divide each measurement by the calibration pattern A 0 (/ i), thus obtaining a corrected value of the measured phasor, in which the signal corresponding to the excitation is kept constant with the frequency.
  • Variation of the autofluorescent signal caused, for example, because the sample under analysis has a higher concentration of parasitic fluorescent substances than was used in the calibration. With the proposed method the variation of the autofluorescent signal will be eliminated, whatever its amplitude, being approximately constant with the frequency in the range of interest.
  • the modulated excitation source (20) emits light in the excitation band (26) and in the fluorescence band (27). The light reaches the fluorescent sample (21), producing the fluorescent signal (28). After passing through a long-pass filter (22), the fluorescence band excitation light (27) and the fluorescence band (28) reach the main photodetector (23).
  • the excitation signal (26) reaches the second photodetector (25) after being filtered, optionally, by a filter short or neutral step (24).
  • the signal ⁇ e this second photodetector (25) would serve as an amplitude and phase reference to correct that of the main photodetector (23).
  • the modulated excitation source (30) emits light in the excitation band (37) and in the band fluorescence (38). The light reaches the fluorescent sample (31), producing the fluorescent signal (39).
  • the light from the sample (31) can reach the photodetector (36) by two alternative paths, which will be selected by changing the optical transmission characteristics of two elements (33 and 35) modulating the intensity of the light. It is proposed that these elements (33 and 35) be LCD sheets, although other embodiments are possible.
  • the light coming from the sample passes through a long-pass filter (34), the photodetector (36) reaching the light of the emitter in the fluorescence band (37) and the fluorescent signal of interest (39).
  • it passes through a short or neutral pass filter (32) before hitting the photodetector (36).
  • the signal obtained in the periods in which the LCD (33) transmits the light and the LCD (35) blocks it can be used as a phase and amplitude reference, since the ratio of background signal to fluorescent signal in this measure is much larger than that corresponding to the situation in which the LCD (33) blocks the light and the LCD (35) transmits it.
  • a calibration signal of suitable characteristics could also be obtained with the use of a single modulator element that blocks or lets part of the excitation light pass to the photodetector.
  • the calibration signal Before performing normalization it will be necessary for the calibration signal to be greater than the noise present in the measurement. In a signal processing scheme simply additive, the presence of noise values greater than the signal itself is not problematic since by integrating successive measurement cycles the noise is eliminated and it is possible to recover the signal. However, by using this method the division of a signal by another that is also subject to noise, the convergence time would increase excessively if the noise were greater than the normalization signal. Therefore it would be preferable that at the time of normalization, the reference signal had a noise level lower than the signal by at least a factor 5. However, the integration time prior to normalization should not be increased too much, because in that case would lose part of the advantage of the cyclic measurement scheme that eliminates better drifts and low frequency inferential signals.
  • this proposed scheme is different from the scheme commonly used in the state of the art.
  • a reference signal is commonly taken that serves to calibrate the phase of the measured fluorescent signal and make it independent of the circuit delays.
  • the fluorescent signal is considered eminently free of background signal due to the contribution of excitation or autofluorescence, since if it were present, the phase measurement would be unusable (see Figure 4), or subtraction of a previously acquired fund.
  • this reference signal serves to normalize the measurement with the phase and amplitude of the excitation source, and this allows the elimination of an arbitrarily large background signal, since this constant is maintained in amplitude and phase for the different frequencies of measure.
  • the axis of abscissa corresponds to the modulation frequency normalized to the characteristic frequency of the autofluorescent emission, and in the ordinate axis the value of the real part and the normalized imaginary part to the maximum value of the phasor module (the value for low frequencies).
  • the curve of the real part of the fasor of the autofluorescent emission (9), the imaginary part of said fasor (10), and the complementary value of the real part, 1 - Re ⁇ / ⁇ / ⁇ (11) have been represented.
  • both the real (9) and the imaginary part (10) will approach 0.
  • the value of the imaginary part that is, the error made by assuming it null
  • a method based on the analysis of the real part will always be reliable when eliminating autofluorescence than one that uses the information of the imaginary part.
  • the value of the real part is much less sensitive to small errors in determining the reference phase as far as that of the imaginary part.
  • this operation can be performed, in addition to a digital method similar to the one explained above, by a purely analogical method, consisting of demodulation lock-in of the signal that varies when the amplitude modulator changes state, synchronous with the signal that controls this switching.
  • Fig 1 pattern of fall in the time domain of the intensity of a fluorescent emission with biexponential fall, excited with a narrow pulse of radiation.
  • Fig 2 temporal representation of the phase shift and loss of modulation of a fluorescent signal as the oscillation period approaches its half-life.
  • Fig 3 variation of the normalized amplitude and the modulation phase of a monoexponential fluorescent signal versus the normalized frequency.
  • Fig 4 variation of the normalized amplitude and the phase of a monoexponential fluorescent signal against the normalized frequency with the presence of different background signal levels corresponding to the excitation.
  • Fig 5 representation of the influence of an autofluorescent signal on the real part and the imaginary part of a measurement, for frequencies far from its characteristic frequency.
  • Fig 6 schematic representation of the real-time excitation phase and amplitude calibration system with two separate photodetectors located on different optical paths, where:
  • (20) is a source of modulated excitation
  • (22) is a long step filter
  • (24) is a short or neutral step filter
  • (27) is the fluorescence band excitation light
  • Fig 7 schematic representation of the real-time excitation phase and amplitude calibration system with a single photodetector and two different optical paths, where:
  • (32) is a short or neutral step filter
  • (33) is a sheet of liquid crystal
  • (34) is a long step filter
  • (35) is a sheet of liquid crystal
  • Fig 8 representation of the drop in the amplitude of the measured signal minus its constant part with the frequency for different values of the background / fluorescence ratio.
  • Fig. 9 representation of the elasticity of the estimation of the characteristic frequency of a fluorescent emission with respect to the background / fluorescence ratio.
  • Fig 10 schematic representation of the preferred embodiment, where:
  • (51) is the signal that modulates the excitation source
  • (52) is a microcontroller
  • the described embodiment aims to measure the life time of a fluorescent signal with excitation in blue and emission in red, with a monoexponential drop whose life time can vary between 100 ns and 1 ⁇ s.
  • a schematic diagram of the system can be observed, in which some elements necessary for its realization (sefla ⁇ conditioners, food, human interface for the presentation of results or selection of measurement options, etc.) have been overlooked. , because it has been preferred to place special emphasis on aspects that are specific to this invention.
  • a light emitting diode or LED (50) frequency modulated by a signal (51) is used as the light source for excitation, which is in turn generated by a microcontroller (52).
  • the LED (50) despite being blue, has a small emission (53) in the red band in addition to the main blue emission (54).
  • the light from the LED (50) reaches the sample (55) causing the fluorescent emission (56).
  • the light from the sample (55) can reach the photodiode (57) by two different paths. In the first path it crosses a fluorescence filter (58) that blocks the blue light and an LCD (59), while in the second path it crosses a neutral filter (60) and another LCD (61). Both LCDs are controlled by the microcontroller (52), the first LCD (59) through the signal (62) and the second LCD (61) through the signal (63).
  • the electrical signal (64) produced by the photodiode (57) is amplified by an amplifier (65) and multiplied by a signal (67) generated by the microcontroller (52). After a low-pass filtering (69) the serial (50) is digitized and processed by the microcontroller (52).
  • the signal (67) by which the amplified signal (66) is multiplied is a sinusoidal signal whose frequency is 1 kHz higher than the frequency of the signal (51) that excites e] LED (50). Therefore the signal (68) will consist of a 1 kHz frequency signal that contains all the information and the phase of the signal (64) (cross correlation or heterodyne).
  • the high frequency unusable components of this signal are eliminated by the low pass filter (69) and the resulting signal (70) is digitized and analyzed by the microcontroller (52) to extract amplitude and phase information. This information is recorded in the form of a complex fasor.
  • the first thing that is done is to go through an initialization state (80) in which the values of all the variables to be used are reset.
  • the microcontroller switches the LCDs (59 and 61) between three possible states:
  • State A (81) both LCDs (59 and 61) opaque (state A).
  • the registered signal corresponds to the background signal of electromagnetic interference, since no light reaches the detector.
  • the recorded signal corresponds to the phase and amplitude reference that will be used to calibrate the measured signal, contaminated by the background signal of electromagnetic interference.
  • Status C (83) LCD (59) transparent and LCD (61) opaque.
  • the recorded signal corresponds to the measured fluorescence signal, contaminated by the background signals of excitation, autofluorescence and electromagnetic interference.
  • the microcontroller varies the system sequentially by the states A (81), B (82) and C (83), performing in each of them a complete sweep by the set of excitation frequencies ⁇ f, ⁇ . 10 ms are used to measure each frequency, and 100 ms to measure each state (all possible frequencies of the same LCD status). For each state (A, B, or C) the set of complex phasors measured for each frequency, ⁇ , ⁇ , ⁇ b, ⁇ , ⁇ c, ⁇ is recorded.
  • the parameters ⁇ and ⁇ that characterize the fluorescent emission will be obtained, and a parameter K corresponding to a continuous value not eliminated. If the adjustment is not good enough, the signal is still considered to be too weak or the noise is too high, so another complete cycle will be carried out through states A, B and C, and a new adjustment will be made. If the adjustment were good enough, the results will be presented (87).
  • the fluorescence technique is used for a multitude of analyzes in analytical chemistry, for environmental measurements, detection of hazardous substances, and for all types of clinical, medical, biological analyzes that use fluorescent markers to measure any variable.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

La medida del tiempo de vida medio de la emisión fluorescente en el dominio de la frecuencia se ve dificultada por la presencia de señales de fondo. Se propone un método y un aparato para detectar dicho tiempo de vida incluso cuando la fluorescencia es mucho menor que el fondo, sin necesidad de una muestra de calibración, basado en una exploración sucesiva de estados en el sistema. Lo característico de estos estados es que la señal de fondo se mantiene constante, mientras que la señal de interés cambia. La señal de interés se podrá recuperar realizando una cancelación de la señal común. Esta técnica se puede utilizar para eliminar el efecto de la luz dispersada de excitación, de la autofluorescencia, y de la interferencia electromagnética.

Description

TÍTULO
Método y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo SECTOR TÉCNICO
La invención se encuadra en el sector de la química analítica. La detección del tiempo de vida de sustancias fluorescentes encuentra aplicación en diferentes sectores como los análisis clínicos, la detección de contaminantes en agua, procesos de control en la industria alimentaria, la medida de diversas magnitudes ambientales, etc.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Dado que la técnica de la medida del tiempo de vida de la fluorescencia en el dominio de la frecuencia se conoce y se utiliza desde hace varias décadas, está profundamente documentada en una gran cantidad de textos, artículos y patentes. Una excelente explicación de la técnica en sí, sus principios, su evolución histórica, y los avances recientes se puede encontrar en el libro "Principies of Fluorescence Spectroscopy", de Joseph R. Lakowicz, ed. Springer, Cap. 5.
Una gran cantidad de sustancias presenta emisión fluorescente y/o fosforescente. De aquí en adelante se empleará el término fluorescencia aunque todo lo dicho es aplicable también a la fosforescencia o cualquier otro tipo de fotoluminiscencia. Típicamente, al iluminar con luz de determinada longitud de onda dentro del rango de absorción de la sustancia, la fluorescencia puede ser observada como una emisión de luz en un rango de longitudes de onda mayores que las de la señal de excitación. Este fenómeno se puede caracterizar con diferentes magnitudes, como los rangos de longitudes de onda de excitación y emisión, la intensidad de dichas señales, o el tiempo de vida medio de la emisión. El perfil de decaimiento de la emisión fluorescente viene caracterizado por la caída de la intensidad con el tiempo una vez suprimida la fuente de excitación. Dicha caída toma a menudo una forma de caída monoexponencial, aunque diferentes circunstancias, como la presencia de varios fluoróforos o la inhomogeneidad de Ia muestra, hacen que dicho perfil se aproxime a menudo a una caída multiexponencial. En la figura 1 se puede observar un ejemplo del típico patrón de decaimiento de una emisión fluorescente. El pulso de excitación (1) activa la emisión fluorescente (2 y 3) de distintos fluoróforos. La señal compuesta de caída en este ejemplo sería una caída biexponencial (4). La información que proporciona la medida de el (los) tiempo(s) de vida medio(s) es a menudo de utilidad dado que se ve modificado por diversos factores que estén afectando a la sustancia fluorescente.
Para medir dicho tiempo de vida, existen dos tipos fundamentales de métodos, los basados en medidas en el dominio del tiempo y aquellos basados en medidas en el dominio de la frecuencia, ambos de uso muy extendido. Los basados en el dominio del tiempo se basan en la medida directa del tiempo de caída con instrumentación a menudo compleja y sofisticada, como es el método de conteo de fotones individuales correlado en el tiempo (time-correlated single photon counting). Los métodos basados en el dominio de la frecuencia, a los que esta invención se refiere, se basan en la excitación de la muestra con una intensidad de luz modulada a determinada frecuencia, y la detección de la información de fase y amplitud de la señal fluorescente emitida.
La respuesta de una sustancia, fluorescente ante una excitación modulada a una frecuencia determinada / es una señal también modulada a esa misma frecuencia y caracterizada por una determinada amplitud y un desfase con respecto a la señal de excitación. Dado que las señales de excitación y de fluorescencia comparten la misma frecuencia y se diferencian en su amplitud y fase, es común representar ambas por un vector complejo llamado fasor, cuyo módulo y fase se corresponden con la amplitud y el desfase de la sinusoidal correspondiente, respectivamente. Dado que el fasor es un número complejo, queda también completamente definido expresándolo en su forma cartesiana (a +j-b), refiriéndonos a él entonces por su parte real y su parte imaginaria. A lo largo de este documento se usará la referencia al módulo, fase, parte o componente real o imaginaria de una señal para referirse a la característica correspondiente del fasor asociado. Para una sustancia cuya fluorescencia presenta una evolución temporal que se aproxima a una caída multi-exponencial, de acuerdo con la siguiente expresión:
Figure imgf000005_0001
La dependencia de la amplitud (normalizada al valor de bajas frecuencias) y la fase de la señal fluorescente (con respecto a la señal de excitación) viene determinada por el módulo y la fase del fasor complejo Ijφ (siendo j = V^-T la unidad imaginaria):
Figure imgf000005_0002
Que, para el caso de una caída mono-exponencial, se simplifica a:
Figure imgf000005_0003
Siendo A(f) el módulo del fasor y φ(f) la fase del mismo. De estas ecuaciones se deduce que al excitar la sustancia fluorescente con luz modulada sinusoidalmente, la emisión será también una serial modulada sinusoidalmente, cuya amplitud de modulación disminuirá, y cuya fase crecerá con la frecuencia. Este efecto se ilustra en la figura 2 en el dominio del tiempo, y en la figura 3 en el dominio de la frecuencia para una caída monoexponencial. En la figura 2 se representa la amplitud de modulación normalizada de la señal de excitación (5) y la señal fluorescente (6) para el caso de/ = l/2πτ. Se puede observar que la señal fluorescente (6) se ha desfasado con respecto de la de excitación (5). En la figura 3 se representa la amplitud (7) y la fase (8) en función de la frecuencia (normalizada al valor l/2πτ). Como se puede observar, Ia amplitud (7) decrece al aumentar la frecuencia, mientras que la fase (8) aumenta de 0o a 90°.
A partir de datos sobre la amplitud y la fase de modulación de la señal fluorescente en el dominio de la frecuencia se puede, por tanto, obtener información sobre las constantes que caracterizan la caída temporal de la fluorescencia. Según la cantidad de datos aportados, sean estos una exploración continua del espectro de frecuencias en amplitud y fase, o incluso la simple medida de la fase a una frecuencia determinada, será mayor o menor la información que se pueda deducir. Según la información que se desee obtener en cada experimento y los límites en los que se conoce a priori que puede variar dicha información, será necesario realizar un barrido más o menos exhaustivo.
En los sistemas más completos, se realiza un barrido exhaustivo de frecuencias registrando la amplitud de la modulación y el desfase, y se hace un ajuste de los resultados a un modelo uní- o muíti-exponencial, obteniendo como resultado los valores de tiempos de vida τ, e intensidades relativas α, deseados. En equipos para aplicaciones más específicas o con mayores requisitos de portabílidad, a menudo no es necesario obtener información tan completa o tan robusta sobre los tiempos de vida. En estas aplicaciones a menudo se ignora la información de amplitud, ya que esta está sujeta a derivas, como por ejemplo por la disminución de moléculas de fluoróforo o las variaciones a largo plazo de intensidad de la fuente de excitación, y se trabaja únicamente con la fase, proporcionando una medida más robusta frente a este tipo de variaciones. Existen aparatos en el mercado, de hecho, en los que la medida se obtiene únicamente de la medida de la fase a una única frecuencia de modulación, ya que esto es suficiente para obtener la información que se desea en la aplicación para la que están diseñados. Habitualmente se obtiene la amplitud de la modulación y/o la fase a través de un esquema de correlación cruzada o demodulación heterodina de la señal (siendo la frecuencia de modulación de la excitación^, se multiplica la señal por una portadora de una frecuencia^+/> con el resultado de obtener una señal en una frecuencia intermedia f,, que contiene la información de la amplitud y la fase inicial).
En un sistema real la señal medida se encuentra contaminada por un fondo de medida (background) debido a una serie de señales que dificultan la correcta medida de la información de amplitud y fase.
) = )+ )
Entre estas señales interferentes h(f) podemos contar, entre otras: - Luz procedente de Ja fuente de excitación que alcanza el detector. Esto puede suceder por varios motivos, y, por lo general, se intenta evitar en el mayor grado posible a la hora de diseñar el sistema, con la utilización de filtros ópticos y disposiciones geométricas que minimicen este efecto. Esta luz puede ser del rango de longitudes de onda usado para excitación (lo cual se suele solucionar con un filtro de fluorescencia que la elimina entre la muestra y el fotodetector) o en el rango de longitudes de onda de la fluorescencia (lo que se suele solucionar con un filtro de excitación entre la muestra y la fuente de excitación). Esta señal de fondo tiene siempre fase 0 con respecto a la señal de excitación y su amplitud sufrirá muy pequeñas o nulas variaciones con la frecuencia. En la figura 4 se representa el efecto de la presencia de radiación procedente de la fuente de excitación en la medida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia, sobre la amplitud (7) y Ia fase (8) de Ia señal, para valores del cociente de 0, 0.5, 1, 2 y 5. Cuanto mayor es la proporción de señal de fondo, más se aleja el comportamiento en frecuencia del ideal, ilustrado en Ia figura 3.
- Luz procedente de autofluorescencia: la muestra a caracterizar puede contener otras sustancias fluorescentes que no sean de interés. Cuanto más similares sean estas señales a la de interés, más difícil será separar su efecto del de la señal. Las diferencias entre la señal de fluorescencia y la de autofluorescencia pueden ser, principalmente, de rangos de longitud de onda de excitación y fluorescencia (en cuyo caso se podrá eliminar o reducir mediante filtrado óptico), y de separación de su(s) tiempo(s) de vida característico(s) con el (los) de la sustancia de interés (si son mucho mayores serán de poco interés pues la señal se habrá extinguido a la frecuencia de exploración, mientras que si son mucho menores su efecto sobre
Ia medida será similar al de la luz procedente de la excitación).
- Interferencia electromagnética entre el subsistema de modulación de intensidad de la excitación y el de amplificación de la señal fluorescente. Dado que las frecuencias de funcionamiento de estos sistemas suelen estar entre 10 kHz y 1
GHz, existe la posibilidad que en un sistema en el que la fuente de excitación y el fotodetector están físicamente cerca y no lo suficientemente bien apantallados, se produzca un acoplo de esta señal en el circuito de amplificación de la señal medida. Una señal de esta naturaleza tendrá una fase y una amplitud fuertemente dependientes de la frecuencia de modulación. La presencia de estas señales de fondo dificulta la extracción de información útil de la medida de fluorescencia. En la medida de lo posible, y en función de la naturaleza de esta serial de fondo, se podrá intentar eliminar por diversas técnicas, atacando la causa del problema o intentando caracterizarla para poder restarla de la medida a posteriori. La sustracción de la señal de fondo, sin embargo, presenta eí problema de Ia propagación de errores. Si la señal de fondo es mayor que la propia señal fluorescente, una pequeña indeterminación en su medida se transformará en un error de magnitud comparable a la propia señal de fluorescencia. La manera de aliviar este problema es la mejor determinación de la señal de fondo. La presencia de estas señales de fondo es precisamente uno de los mayores inconvenientes a la hora de conseguir un sistema de bajo coste y alto grado de miniaturización, dado que su cancelación requiere frecuentemente el diseño de un sistema con mayor complejidad óptica, con filtros, lentes, con componentes optoelectrónicos alejados entre sí y con fotodetectores de alta sensibilidad (fotomultiplicadores y fotodiodos de avalancha).
El desarrollo de técnicas que permitan eliminar o reducir la influencia de las señales de fondo en la medida ha despertado y despierta un gran interés en la comunidad científica internacional.
Joseph R. Lakowicz, en el artículo "Correction for Contaminant Fluorescence in Frequency-Domain Fluorometry", publicado en la revista Analytical Biochemistry (año 1987), describe las bases de la substracción de la señal de fondo, prestando atención especial a la propagación de errores. Sin embargo, su método requiere una medida previa de las características de la señal de fondo con una muestra que no presente fluorescencia. Gregory D. Reinhart, en el artículo "A Meted for On-Line Background Subtraction in Frequency Domain Fluorometry", publicado en la revista Journal of Flourescence (año 1991), describe un método en el que no es relevante la complejidad de la caída de la amplitud de fluorescencia. Sin embargo, nuevamente, es necesaria una medida en la que sólo se encuentra presente la señal atribuida al fondo.
Joseph R. Lakowicz, en el artículo "Background Suppression in Frequency-Domain Fluorometry", publicado en Analytical Biochemistry (año 2000) propone un método para eliminar la influencia de Jas seflaí de autofluorescencia cuando esta es de un tiempo de vida mucho menor que el de la señal de interés, y en el que no requiere la medida de una muestra "en blanco", gracias a la utilización de un fotomultiplicador con enventanado temporal. Sin embargo, es necesario tener una referencia simultánea a la medida de una muestra patrón con tiempo de vida conocido. La demostración experimental de este método fue reportada por Petr Hermán en el artículo "Real-time background supresión duríng frequency domain Iifetime measurements", publicado en Analytical Biochemistry (año 2001).
En el documento US 4150295 se describe un método para la eliminación de la autofluorescencia cuando esta tiene un espectro óptico de emisión mucho más ancho que el de la muestra de interés, y se sugiere la posibilidad de eliminarlo por técnica de enventanado en el dominio del tiempo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El propósito de esta invención es la recuperación de la señal de interés de una medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia, en la que dicha señal puede ser mucho menor que Ja señal de fondo presente en la medida, sin la necesidad de realizar previamente o paralelamente una calibración de dicho fondo con una muestra conocida. La recuperación se basa en la inspección de la amplitud y/o la fase de modulación de la señal medida, y la exploración secuencial a través de varios estados en los que ía señal de fondo se mantiene constante, para poder recuperar Ja seflaJ de interés mediante la extracción de la señal cuya variación es síncrona con el control de la variación entre estados. Este método permite la recuperación de una señal de fluorescencia mucho menor que el nivel de fondo, lo cual flexibiliza el diseño del sistema óptico, permitiendo el abaratamiento dei mismo y una mayor miniaturización, al poder lograrse una mayor integración espacial sin aumentar con ello el efecto las señales interferentes sobre Ia medida.
A modo de introducción, y para facilitar Ia comprensión de Ia descripción, se resumen aquí brevemente las distintas realizaciones para eliminar la señal de fondo que se proponen:
1. Eliminación de una señal de fondo óptica, como la señal del emisor que alcanza el detector, o la señal de autofluorescencia. La cancelación se basa en que en este caso la señal de interés varía con la frecuencia de modulación, mientras que la señal no deseada se mantiene constante, o tiene una variación conocida, por lo que a partir de la información correspondiente a varias frecuencias de modulación se puede cancelar la parte común.
En el caso de que la construcción del sistema electro-óptico imponga variaciones en la señal (cambios de amplitud con la frecuencia, retardos que producen desfases, etc.) se proponen dos alternativas para normalizar esta señal antes de sustraer la parte común, y así poder seguir aplicando este sistema de detección:
1.1 Calibración previa del sistema. 1.2 Calibración del sistema durante la propia medida. Se proponen dos realizaciones, una en la que la calibración se realiza con un fotodetector adicional, y otra en la que la calibración se realiza con el mismo fotodetector, modificando las características de la luz que lo alcanza.
Además, se proponen dos realizaciones que tienen en cuenta sólo parte de la información del fasor medido, para obtener ventajas en exactitud de la medida o simplicidad del sistema: 1.3 Recuperación de la información de interés de la fluorescencia a partir únicamente de la parte real del fasor.
1.4 Recuperación de Ia información de interés de la fluorescencia a partir únicamente del módulo del fasor.
2. Eliminación de una señal de fondo electromagnética, que se mantiene constante al impedir el paso de luz por el sistema de medida. AI mantenerse constante Ia señal no deseada al bloquear el paso de la luz al detector, se podrán obtener medidas en ambas situaciones y eliminar la parte común, siendo la señal resultante la de interés.
Por lo general, la variación entre los distintos estados se repetirá periódicamente, de tal manera que se mejorare la robustez contra derivas de distintos componentes opto- electrónicos u otros factores ambientales que puedan modificar la medida, y que cambien en rangos temporales más lentos que la frecuencia de repetición. Además de esto, una exploración periódica permite aumentar en tiempo real el tiempo de integración de la medida en caso de que sea necesario reducir el ruido presente en la medida, o para conseguir recuperar una señal más pequeña de lo habitual. Este esquema de realización es más robusto a ruido, interferencias externas, y derivas de los componentes, ya que sólo las componentes de señal que varían de manera síncrona con el cambio de estado son detectadas. Sin embargo, es posible una realización en la que la secuencia de medición de estados se realiza una sola vez y no de manera repetitiva. Por lo general, el sistema optoelectrónico constará de:
- Un subsistema de generación de luz de excitación modulada: típicamente un diodo emisor de luz (LED) o diodo láser (LD), aunque no se excluyen otras realizaciones, como una fuente de luz no modulada seguida de un electromodulador, o cualquier otro medio presente o futuro.
- Una muestra fluorescente a caracterizar
Un subsistema de detección de íuz: típicamente compuesto por un fotodetector y un subsistema de amplificación y/o demodulación apropiado, aunque no se excluyen otras realizaciones, tanto presentes como futuras.
Un subsistema de cancelación de la señal común: típicamente esta tarea será realizada por un subsistema digital, aunque no se excluyen otras realizaciones. Por simplicidad, y sin pérdida de generalidad, se van a utilizar en esta descripción las ecuaciones correspondientes al caso de que la fluorescencia presente una caída monoexponencíal. Generalmente se producirá una conversión de Ia señal medida por el fotodetector a una frecuencia intermedia, lo que es denominado método de correlación cruzada, o demodulación heterodina. La conversión se realizará por cualquiera de los métodos habituales, como la modulación de la ganancia del fotodetector (fotomultiplicador o fotodiodo de avalancha) o multiplicación analógica de la señal eléctrica por la portadora de demodulación. La señal a la salida de este sistema, que contendrá información sobre la amplitud y la fase de la señal captada por el fotodetector, será analizada para recuperar la componente cuya variación es síncrona con el cambio de estado del sistema, y eliminar la componente común. La manera concreta en la que se realiza esta cancelación dependerá del caso concreto. En una aproximación más simple, se podría considerar que la variación se produce entre dos estados y la señal medida una señal eléctrica cuasi-continua que varía al variar dicho parámetro. Aplicando una técnica de demodulación lock-in, se podría extraer la señal de interés cancelando el valor de continua que permanece constante durante toda la medida, que se correspondería con la señal de fondo. En situaciones más complejas, como la del caso en que se desee una exploración de más de dos estados, o cuando se desee realizar algún cálculo matemático sobre la señal dicha cancelación puede ser realizada mediante procesado digital de señal tras una digitalización. Sin embargo no se excluyen otras posibles realizaciones para la cancelación de la señal común. A continuación se van a describir Jas diferentes estrategias para aplicar este método a la cancelación de una serial de fondo de tipo luz de excitación y a una de tipo acoplo electromagnético.
1. Eliminación de una señai de fondo óptica cuya amplitud y fase de modulación permanece constante (o tiene una variación conocida) con la variación de la frecuencia de modulación. Esta señal se corresponde con la señal de la fuente de excitación que alcanza el fotodetector, generalmente por deficiencias en el filtrado óptico. También es aplicable este método a Ia eliminación de la autofluorescencia de la muestra, que puede producirse, por ejemplo, por la presencia de otras sustancias fluorescentes en la misma, y cuya medición no es de interés. En este caso, será preciso que el tiempo de vida de esta fluorescencia parásita que se desea eliminar sea o bien mayor o bien menor que el de la muestra a medir, pero con una separación espectral suficiente como para que se pueda separar su efecto y ser considerada una señal de amplitud y fase constantes (si su tiempo de vida es mucho menor que el de la muestra) o de amplitud despreciable y fase irrelevante (si su tiempo de vida es mucho mayor que el de la muestra). También es aplicable este método para eliminar la posible fluorescencia del filtro óptico paso-largo utilizado para impedir la llegada de luz en longitudes de onda de excitación al fotodetector (es sabido que los filtros de vidrio coloreado presentan un cierto grado de fotoluminiscencia).
Este método se basa en que la señal óptica de excitación permanece constante al realizar una exploración de frecuencias, mientras que la señal fluorescente decrece en amplitud y se desfasa con respecto a la de excitación al aumentar la frecuencia de modulación. Si por razón de la arquitectura del sistema no fuera cierto que esta señal de excitación es constante (y por tanto que la señal de fluorescencia de interés se encuentra también modificada por este mismo patrón), habría que realizar una corrección sobre la señal medida (que incluye la señal de fluorescencia de interés y la señal de fondo) para corregir esta desviación, y poόer anular el efecto de la seña] de fondo y hacer significativa la medida de fluorescencia. Este puede ser el caso, por ejemplo, de un sistema en el que se use como fuente de luz de excitación un LED cuya velocidad no es lo suficientemente alta y por tanto su amplitud de modulación disminuye con la frecuencia, o un sistema con un cierto retardo constante, que se manifestaría como un aumento lineal de la fase de la señal medida con la frecuencia. En el presente documento se proponen dos realizaciones para llevar a cabo esta calibración, pero se va a describir primero el método de cancelación en caso de que esta no sea necesaria. La eliminación de la señal de fondo en el caso de que se pueda suponer constante la señal de fondo óptica se realiza haciendo una exploración secuencial de un determinado número de frecuencias de modulación de la excitación en el rango apropiado para obtener información sobre el tiempo de vida de Ia sustancia de interés. Si consideramos un sistema en el que se encuentran presentes, además de la señal de fluorescencia, señal debida a la excitación y a autofluorescencía de mayor y menor tiempo de vida, se puede expresar la señal que llega al fotodetector por el fasor complejo (se ha supuesto, por simplicidad y sin pérdida de generalidad, que todas las contribuciones son monoexponenciales) :
Figure imgf000014_0001
Donde Ao representa la señal invariante con la frecuencia y en fase 0, que se correspondería con la excitación, el segundo término agrupa las contribuciones fluorescentes con un tiempo de vida largo (τ¡/» TJ),
Figure imgf000014_0002
tercer término se corresponde con la señal fluorescente de interés, y el cuarto término representa las contribuciones fluorescentes con un tiempo de vida corto (%• « τ¡ ). El segundo término, correspondiente a señales con tiempo de vida largo, se puede despreciar, ya que a las frecuencias de exploración su amplitud habrá disminuido en gran medida, y no afectará a la medida. El cuarto término, por el contrario, no se puede despreciar, pero su efecto se puede incluir dentro de del primero, el de la excitación, ya que para las frecuencias de excitación que se explorarán, se cumplirá: / « =>— ^-— * «¥
2OTV 1 + y 2^rv
Por tanto, la expresión anterior del fasor de seflal medida será equivalente a la siguiente, en el que se han separado además la parte real y la imaginaria:
Figure imgf000015_0001
Dado que la presencia de un alto valor de Ao dificulta y llega a imposibilitar la obtención de una medida correcta tanto de la fase como de la amplitud de la fluorescencia, es necesario eliminarlo. Al realizar una exploración en varias frecuencias alrededor de Ia frecuencia de interés es posible eliminar el efecto de Ia seflal que permanece constante en todas ellas y extraer la información que varía. Esto se puede realizar de varías maneras, aunque a continuación se describe una de ellas. Se hace un barrido por un determinado conjunto de frecuencias que se repite periódicamente, y se registra el valor del fasor de señal medida en un sistema digital. En dicho sistema digital se mantiene un conjunto de variables que se corresponden con las frecuencias del barrido y que llamaremos "valor acumulado", en la que se registra la información completa (real e imaginaria) del fasor medido. En cada ciclo, al valor acumulado de cada frecuencia, se le suma el valor medido de la frecuencia correspondiente, y se resta el valor medido correspondiente a la frecuencia de mayor valor (u otra cualquiera). De este modo, tras una sucesión suficientemente alta de ciclos de medición, se tienen los valores acumulados correspondientes a cada una de las frecuencias, libres de ruido y libres de la influencia de la señal de fondo. Estos valores se podrán ajustar con la fórmula correspondiente o realizar algún otro tipo de procesamiento que permita deducir la información útil deseada de la medida. La gran ventaja de este método consiste en que la cancelación de la señal de fondo correspondiente a la excitación y a la autofluorescencia se elimina durante la propia medida sin necesidad de hacer ninguna medida ni calibración previa con una muestra patrón. La cancelación se basa precisamente en el hecho de que por su propia naturaleza, la señal άe interés tiene unas características variables con la frecuencia, mientras que la señal de fondo se mantiene constante. En los métodos existentes en el estado de la técnica, la cancelación de esta señal siempre se lleva a cabo mediante una anulación real (mediante elementos ópticos) o mediante la substracción de la señal de fondo, caracterizada en otra medida con una muestra patrón.
1.1 Calibración previa a la medida del error producido por la variación de Ao con la frecuencia y posterior corrección. Si la señal de excitación no presenta una amplitud y fase de modulación constantes en todo el rango de frecuencias, se puede caracterizar la variación de esta señal de excitación con respecto a la frecuencia y luego aplicar esta calibración para corregir el valor medido. Dado que la fluorescencia es excitada precisamente con esta señal, su amplitud y fase se ven modificadas en la misma manera, por Io que Ia intensidad medida podría ser expresada como:
Figure imgf000016_0001
Donde esta vez AQ(J) no se considera un valor real constante sino un número complejo variable con la frecuencia. Si es posible medir la respuesta del sistema en unas condiciones en las que la intensidad de fluorescencia sea 0 (o su respuesta temporal es perfectamente conocida), es posible medir la característica de variación Aoφ- Una vez hecho esto, será suficiente con dividir cada medida por el patrón de calibración A0(/i), obteniendo así un valor corregido del fasor medido, en el que la señal correspondiente a la excitación se mantiene constante con la frecuencia.
Nótese que esta calibración es conceptualmente distinta a la calibración de muestra patrón realizada habitualmente en el estado de la técnica. La calibración con muestra patrón suele corresponderse con una medida exacta del valor de fondo que luego será substraído de la señal. En esta alternativa se propone una calibración del patrón de variación de la señal de excitación para la correcta normalización de la señal medida, que permitirá la posterior cancelación de la señal de fondo al suprimir la parte que permanece invariante al cambiar la frecuencia. La diferencia entre estos dos esquemas de calibración previa, que pueden resultar similares a primera vista, queda manifiesta al observar distintos fenómenos que el método propuesto es capaz de suprimir y el de sustracción directa (usado en el estado de la técnica) no:
1. Variación de la señal autofluorescente: causado, por ejemplo por que la muestra bajo análisis tiene una mayor concentración de sustancias fluorescentes parásitas que la que se usó en la calibración. Con el método propuesto la variación de la señal autofluorescente será eliminada, sea cual sea su amplitud, al ser aproximadamente constante con la frecuencia en el rango de interés.
2. Variación de la intensidad de la fuente de excitación que afecte por igual a todas las frecuencias. Esto puede suceder por múltiples motivos, por ejemplo, por una degradación a largo plazo de la fuente de luz, por algún pequeño cambio en el sistema óptico (desajuste de alineamiento por un golpe, por ejemplo), o por una pequeña variación de la cantidad de luz emitida por la fuente de excitación en la banda de ía fluorescencia (banda amarilla en LEDs azules por ejemplo), o porque la muestra a analizar presente una mayor turbidez y, por tanto, mayor dispersión de Ia luz de excitación. Dado que esta variación afectaría por igual a todas las frecuencias de modulación, es correctamente corregida por el sistema propuesto, mientras que no lo sería por una mera substracción del valor de fondo. 1.2 Medida de un valor de referencia durante el experimento utilizado para la corrección de la medida. Dicho valor de referencia utilizado para la corrección deberá darnos una buena aproximación de AQ(J) (salvo coeficiente constantes que afecten por igual a todas las frecuencias). Por tanto es necesario que la relación fondo / fluorescencia sea mucho mayor (al menos en un factor 2) en esta señal de referencia que en la de medida.
Esto se puede conseguir con un esquema con dos fotodetectores como el representado en la figura 6. En este esquema, la fuente de excitación modulada (20) emite luz en la banda de excitación (26) y en la banda de fluorescencia (27). La luz alcanza la muestra fluorescente (21), produciéndose la señal fluorescente (28). Tras pasar por un filtro pasolargo (22), la luz de excitación en banda de fluorescencia (27) y la de fluorescencia (28) alcanzan el fotodetector principal (23). Por otro lado, la señal de excitación (26) alcanza el segundo fotodetector (25) tras ser filtrada, opcionalmente, por un filtro pasocorto o neutro (24). La señal άe este segundo fotodetector (25) serviría como referencia de amplitud y fase para corregir la del fotodetector principal (23).
Otra posible realización consistiría en la de utilización de un solo fotodetector en un esquema como el ¿Justrado en Ja figura 7. En este esquema, la fuente de excitación modulada (30) emite luz en la banda de excitación (37) y en la banda de fluorescencia (38). La luz alcanza la muestra fluorescente (31), produciéndose la señal fluorescente (39). La luz procedente de la muestra (31) puede alcanzar el fotodetector (36) por dos caminos alternativos, que se seleccionarán cambiando las características de transmisión ópticas de sendos elementos (33 y 35) moduladores de la intensidad de la luz. Se propone que estos elementos (33 y 35) sean láminas LCD, aunque otras realizaciones son posibles. En uno de los caminos la luz procedente de la muestra atraviesa un filtro pasolargo (34), alcanzando el fotodetector (36) la luz del emisor en banda de fluorescencia (37) y la señal fluorescente de interés (39). En el otro camino luz atraviesa un filtro (32) pasocorto o neutro antes de incidir sobre el fotodetector (36). La señal obtenida en los periodos en los que el LCD (33) transmite la luz y el LCD (35) la bloquea puede ser utilizada como referencia de fase y amplitud, dado que la relación de señal de fondo a señal fluorescente en esta medida es mucho mayor que la correspondiente a la situación en que el LCD (33) bloquea la luz y el LCD (35) la transmite. Nótese que una señal de calibración de características adecuadas podría obtenerse también con la utilización de un único elemento modulador que bloquee o deje pasar parte de la luz de excitación hasta el fotodetector.
De cualquiera de estas maneras obtenemos una señal de normalización en que la contribución de la fluorescencia es despreciable, y que contiene la información de los cambios de amplitud y de fase de la señal de excitación. Por tanto, dividiendo la señal medida en cada frecuencia por esta señal de referencia, conseguimos corregir la variabilidad de la señal de excitación y que posteriormente se pueda realizar correctamente la cancelación de la señal de fondo.
Antes de realizar la normalización será necesario que la señal de calibración sea mayor que el ruido presente en la medida. En un esquema de tratamiento de señal simplemente aditivo, la presencia de valores de ruido mayores que la propia señal no es problemática ya que al ir integrando sucesivos ciclos de medida el ruido se va eliminando y es posible recuperar la señal. Sin embargo, al utilizar este método la división de una señal por otra que también está sujeta a ruido, el tiempo de convergencia aumentaría en exceso si el ruido fuera mayor que la señai de normalización. Por tanto sería preferible que a la hora de la normalización, la señal de referencia tuviera un nivel de ruido inferior a la señal en al menos un factor 5. Sin embargo tampoco conviene aumentar en exceso el tiempo de integración previo a la normalización, porque en ese caso se perdería parte de la ventaja del esquema de medida cíclico que elimina mejor derivas y señales iníerferentes de baja frecuencia.
Nótese que este esquema propuesto es distinto al esquema comúnmente utilizado en el estado de la técnica. En el estado de la técnica comúnmente se toma una señal de referencia que sirve para calibrar la fase de la señal fluorescente medida e independizarla de los retardos del circuito. Sin embargo, la señal fluorescente se considera eminentemente libre de señal de fondo por contribución de la excitación o autofluorescencia, dado que si esta se encontrase presente, la medida por fase sería inutilizable (véase figura 4), o bien sería necesaria la substracción de un fondo previamente adquirido. En el esquema propuesto esta señal de referencia sirve para normalizar la medida con la fase y la amplitud de la fuente de excitación, y esto permite la eliminación de una señal de fondo arbitrariamente grande, por mantenerse esta constante en amplitud y fase para las distintas frecuencias de medida.
Por cualquiera de los métodos descritos anteriormente es posible obtener una señal medida en la que el fasor de la señal de fondo es constante o varía suficientemente poco como para extraer la información de interés. En el caso más general, la información completa del fasor será recogida y el fondo cancelado en módulo y fase, realizándose luego el tratamiento matemático adecuado según la realización concreta. En el estado de la técnica está extendida la obtención de información a partir de la información completa del fasor (módulo y fase), y también a partir de la información de fase únicamente, dado que esta es más robusta que la amplitud a cambios en la intensidad de la señal. Se proponen a continuación όos realizaciones para la recuperación de la señal de interés, una a partir de la parte real del fasor, y otra a partir de su módulo.
1.3 Recuperación de la información de interés de la fluorescencia a partir únicamente de la parte real del fasor. La robustez del sistema frente a señales de autofluorescencia aumenta si se considera únicamente la componente real del fasor. Con anterioridad se ha considerado que la separación espectral en el dominio de la frecuencia entre la sefíal autofluorescente y la de interés es suficiente para considerar la primera como una constante (si su tiempo de vida es corto), por lo que sería cancelada junto con la señal de excitación, o una señal de módulo despreciable (si su tiempo de vida es largo). Sin embargo esto no es del todo exacto, ya que una señal autofluorescente producirá un pequeño efecto sobre frecuencias alejadas de su frecuencia característica. Si la señal autofluorescente es mucho mayor que la sefíal de interés, Ia pequeña variación que produce a frecuencias alejadas podría ser relevante. Esta influencia se ha representado en la en la figura 5. El eje de abcisas se corresponde con Ia frecuencia de modulación normalizada a la frecuencia característica de la emisión autofluorescente, y en el eje de ordenadas el valor de la parte real y la parte imaginara normalizado al valor máximo del módulo del fasor (el valor para bajas frecuencias). Se han representado la curva de la parte real del fasor de la emisión autofluorescente (9), la parte imaginaria de dicho fasor (10), y el valor complementario de la parte real, 1 - Re{/α/} (11).
- Para frecuencias de medida menores a la frecuencia típica de la autofluorescencia, se asumirá que la parte real (9) se mantiene constante. El error cometido en esta estimación es precisamente 1 - Re{/α/} (11). La parte imaginaria se asumirá despreciable, por lo que el error cometido será el propio valor de la parte imaginaria (10). Como se puede ver, el error cometido es menor con la parte real que con la parte imaginaria.
- Para frecuencias de medida superiores a la de la autofluorescencia (este caso será el menos frecuente), se aproximarán a 0 tanto la parte real (9) como la imaginaria (10). Para frecuencias altas, el valor de la parte imaginaria (es decir, el error cometido al asumirla nula) es mayor que el valor de la parte real. Por tanto, un método basado en el análisis de Ja parte real será siempre nías fiable a la hora de eliminar la autofluorescencia que uno que utilice la información de la parte imaginaria. Además de esto, el valor de la parte real es mucho menos sensible a pequeños errores en la determinación de la fase de referencia en la medida que el de la parte imaginaria.
1.4 Recuperación de la información de interés de la fluorescencia a partir únicamente del módulo del fasor. Esta realización puede ser elegida por ser imposible recuperar correctamente Ia fase de ía señal medida, o porque resulte conveniente hacerlo así de cara a una mayor simplicidad del sistema. Supondremos, por tanto, que disponemos de una señal en la que la señal de fondo Ao(J) no es un valor real constante, pero sí es un complejo de módulo constante y fase variable con la frecuencia:
A(/HΛHJW)
Esta situación puede darse, por ejemplo, en un sistema en el que no se tiene perfectamente calibrado el retardo que sufre la señal al atravesarlo, pero se sabe que la rúente de excitación se modula con una amplitud que permanece constante en todas las frecuencias. Dado que la señal fluorescente es excitada precisamente con una señal idéntica en fase a la señal de fondo que se está intentando eliminar, tendrá la misma fase inicial que ésta:
Figure imgf000021_0001
En una situación como esta en la que no disponemos de una referencia de fase clara para poder separar las componentes reaí e imaginaria, es necesaria una modificación del método original. Dado que la fase de la señal medida es una información poco útil en este caso, se puede obtener la información deseada a partir tan sólo del módulo de este fasor, que responde a la siguiente fórmula (donde se ha hecho αj = |Λ0|-α/):
En este caso, como se puede deducir de las ecuaciones, el patrón de variación de la fracción de la señal que cambia con la frecuencia se ve modificado por la relación entre la señal de fondo y la señal fluorescente. Por tanto, el mecanismo consistente en anular la componente constante por diferencia entre distintas medidas no se puede aplicar de igual modo. Se podrá, sin embargo, en este caso, registrar el valor acumulado completo (sin restar la constante) y realizar posteriormente un ajuste de esta curva a la fórmula correspondiente. Este ajuste, sin embargo, requiere una mayor capacidad de cálculo, y puede suceder que esta no se encuentre disponible en el equipo.
Una alternativa a esta opción consiste en hacer la substracción del valor de continua, y obtener de estos datos el tiempo de vida aplicando una corrección. En la figura 9 se representa el la curva de (\Im(j)\-\Ao\)/af en función de la frecuencia para distintos valores de p, parámetro adimensional definido como el cociente entre la intensidad de la señal de fondo y la intensidad de la señal de fluorescencia (para bajas frecuencias). En concreto, para p= 0 (41), p = 0.2 (42), p = 0.5 (43), p= 1 (44), p = 2 (45), p = 10 (46). Como se puede observar, para distintos valores de p se obtienen distintos patrones de caída de la intensidad. Sin embargo, teniendo un conocimiento a priori de la magnitud aproximada del parámetro p (es decir, de la magnitud aproximada de la señal de fondo y de la señal fluorescente) se puede obtener una buena estimación del valor fo = l/2πτ/ buscado, que es relativamente insensible a variaciones de este parámetro p. Supongamos, por ejemplo, que obtenemos una estimación de la frecuencia^ a partir de una frecuencia medida fm que corresponde al momento en que ía intensidad normalizada ha caído a un valor k = 1/V2 = 0.707. En este caso la corrección a aplicar sería:
(2 p + Jc)-Ic
J O ~ Jm ' (\ - k)i2p + k + l) La elasticidad de la función fo(p), que expresa el porcentaje de variación de la magnitud medida jo producido por un porcentaje de variación en la variable p, permite cuantifícar el posible error en Ja medida de fo que produce el desconocimiento del verdadero valor del parámetro p.
Figure imgf000023_0001
Como se puede ver en la figura 9, para k = 1AÍ2 la elasticidad defo(p) tiene un máximo de 0.11 para p= 0.5, y decrece a una razón de 1 década por década. Esto significa que el impacto de una incorrecta calibración del parámetro p sobre la frecuencia medida es mínimo (por ejemplo, un error del 20% en p se transformaría en menos de un 2% de error enfo). De hecho, si la señal de fondo es mayor que la señal fluorescente, que será el caso habitual de utilización de este método, la sensibilidad de la medida de la frecuencia al parámetro p es mucho menor.
2. Eliminación de la interferencia electromagnética (IEM) que se acopla entre la electrónica de modulación y la amplificación en detección. Esta señal de fondo tiene por su propia naturaleza una amplitud y fase que son variables con la frecuencia de la modulación, por lo que no podrá ser eliminada por el método descrito anteriormente. Sin embargo esta señal, al no proceder de un acoplo óptico al fotodetector, permanece invariable, y, por tanto, podrá ser eliminada, si se impide la llegada de luz al fotodetector por algún medio que no modifique la geometría ni características electromagnéticas del sistema. Aunque en este apartado nos referimos a la IEM, este procedimiento servirá para eliminar cualquier señal de fondo presente en la medida cuya amplitud y fase no se vea modificada al impedir el paso de la luz hasta el fotodetector, como por ejemplo el causado por el efecto de acoplo de señal a través de la alimentación del sistema. Para conseguir esto, se propone ía interposición de una lámina de cristal líquido (LCD) entre la sustancia fluorescente y el fotodetector, aunque será válido cualquier otro método por el que se pueda modificar significativamente la cantidad de luz incidente sobre el detector sin cambiar las características de acoplo electromagnético, y preferentemente que no utilice componentes mecánicos. Nótese que no es necesario que e\ elemento άe modulación bloquee completamente el paso de luz, ya que la luz que no se consiga bloquear simplemente será señal común a los dos estados y será por tanto eliminada. La utilización de un elemento de modulación opto- electrónico en vez de un sistema mecánico presenta numerosas ventajas, como la mayor frecuencia de modulación, la mayor capacidad de integración, y la menor modificación del acoplo electromagnético, permitiendo una mejor sustracción del valor de fondo.
Dado que en este sólo es necesario conmutar entre dos estados para la eliminación del efecto de la señal de fondo, esta operación podrá ser realizada, además de por un método digital similar al explicado con anterioridad, por un método puramente analógico, consistente en una demodulación lock-in de la señal que varía al cambiar de estado el modulador de amplitud, síncrona con la señal que controla esta conmutación.
Dado que es posible que una medida presente señales de fondo de distintos tipos que sea necesario neutralizar, en ocasiones será necesario aplicar más de una técnica de corrección de fondo. La manera en que se apliquen en su conjunto dependerá de los requisitos de la medida y de diversos factores del sistema experimental, aunque Io más sencillo, al menos conceptualmente, es suponer una sucesión de etapas de cancelación. Los requisitos concretos de señal para cada una de las etapas impondrán por lo general un orden concreto para esta concatenación. En la "Descripción de una realización preferida" se detalla un posible ejemplo de combinación, aunque para un cualquier entendido en la materia la modificación de este sistema para adaptarlo a las características concretas de otros sistemas o el diseño de un esquema a medida sin apartarse del espíritu y alcance de lo aquí descrito y reivindicado debería ser sencillo.
Además, será evidente que se pueden concebir otras formas o formas adicionales de Ja invención, y formas de realización distintas a las formas de realización especificadas descritas anteriormente sin apartarse del espíritu y del alcance de las reivindicaciones anexas y, por lo tanto, se pretende que el alcance de esta invención solamente sea regido por Jas reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Con objeto de ayudar a una mejor comprensión de Jas características del invento de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo y para complementar esta descripción, se acompaña como parte integrante de la misma un juego de dibujos, cuyo carácter es ilustrativo y no limitativo. En estos dibujos:
Fig 1: patrón de caída en el dominio del tiempo de la intensidad de una emisión fluorescente con caída biexponencial, excitada con un pulso estrecho de radiación.
Fig 2: representación temporal del desfase y pérdida de modulación de una señal fluorescente al acercarse el periodo de la oscilación a su tiempo de vida medio. Fig 3: variación de la amplitud normalizada y la fase de modulación de una señal fluorescente monoexponencial frente a la frecuencia normalizada.
Fig 4: variación de la amplitud normalizada y la fase de una señal fluorescente monoexponencial frente a la frecuencia normalizada con la presencia de distintos niveles de señal de fondo correspondiente a la excitación.
Fig 5: representación de la influencia de una señal autofluorescente sobre la parte real y la parte imaginaria de una medida, para frecuencias alejadas de su frecuencia característica. Fig 6: representación esquemática del sistema de calibración de fase y amplitud de la excitación en tiempo real con dos fotodetectores separados situados en caminos ópticos distintos, donde:
(20) es una fuente de excitación modulada
(21) es la muestra fluorescente
(22) es un filtro pasolargo
(23) es el fotodetector principal
(24) es un filtro pasocorto o neutro
(25) es el fotodetector secundario
(26) es la señal de excitación
(27) es la luz de excitación en banda de fluorescencia
(28) es la señal fluorescente
Fig 7: representación esquemática del sistema de calibración de fase y amplitud de la excitación en tiempo real con un único fotodetector y dos caminos ópticos distintos, donde:
(30) es una fuente de excitación modulada
(31) es la muestra fluorescente
(32) es un filtro pasocorto o neutro
(33) es una lámina de cristal líquido
(34) es un filtro pasolargo
(35) es una lámina de cristal líquido
(36) es el fotodetector
(37) es la señal de excitación
(38) es la señal de excitación en banda de fluorescencia
(39) es la señal fluorescente
Fig 8: representación de la caída de la amplitud de la señal medida menos su parte constante con la frecuencia para distintos valores de la relación fondo/fluorescencia.
Fig 9: representación de la elasticidad de la estimación de la frecuencia característica de una emisión fluorescente con respecto a la relación fondo/fluorescencia. Fig 10: representación esquemática de la realización preferida, donde:
(50) es un LED
(51) es la señal que modula la fuente de excitación
(52) es un microcontrolador
(53) emisión del LED en banda roja
(54) emisión del LED en banda azul
(55) muestra fluorescente
(56) emisión fluorescente
(57) fotodiodo
(58) filtro de fluorescencia (pasolargo)
(59) LCD
(60) filtro neutro
(6I) LCD
(62) señal de control del primer LCD
(63) señal de control del segundo LCD
(64) señal eléctrica producida por el fotodiodo
(65) amplificador
(66) señal amplificada
(67) señal que multiplica a la señal amplificada
(68) señal resultante de la multiplicación de (67) y (68)
(69) filtro paso bajo
(70) señal demodulada Fig 11 : diagrama de estados de la realización preferida, donde:
(80) Inicialización; (81) Estado A: calibración interferencia; (82) Estado B: referencia de fase y amplitud; (83) Estado C: señal fluorescente y fondo; (84) Acumulación; (85) Corrección de interferencia, amplitud y fase; (86) Cancelación fondo y ajuste; (87) Presentación de resultados DESCRIPCIÓN DE UNA REALIZACIÓN PREFERIDA
La realización que se describe tiene como objetivo medir el tiempo de vida de una señal fluorescente con excitación en el azul y emisión en el rojo, con una caída monoexponencial cuyo tiempo de vida puede variar entre 100 ns y 1 μs. En la figura 10 se puede observar un diagrama esquemático del sistema, en el que se han obviado algunos elementos necesarios para su realización (acondicionadores de seflaí, alimentación, interfaz humana para la presentación de resultados o selección de opciones de Ia medida, etc.), porque se ha preferido poner especial énfasis en los aspectos que son específicos de esta invención. Se utiliza como fuente de luz para la excitación un diodo emisor de luz o LED (50) modulado en frecuencia por una señal (51), que es a su vez generada por un microcontrolador (52). El LED (50), a pesar de ser azul tiene una pequeña emisión (53) en la banda roja además de la emisión principal azul (54). La luz procedente del LED (50) alcanza la muestra (55) provocando la emisión fluorescente (56).
La luz procedente de la muestra (55) puede alcanzar el fotodiodo (57) por dos caminos distintos. En el primer camino atraviesa un filtro de fluorescencia (58) que bloquea la luz azul y un LCD (59), mientras que por el segundo camino atraviesa un filtro neutro (60) y otro LCD (61). Ambos LCD son controlados por el microcontrolador (52), el primer LCD (59) a través de la señal (62) y el segundo LCD (61) a través de la señal (63). La señal eléctrica (64) producida por el fotodiodo (57) es amplificada por un amplificador (65) y multiplicada por una señal (67) generada por el microcontrolador (52). Tras un filtrado paso bajo (69) la serial (50) es digitalizada y procesada por el microcontrolador (52).
La señal (51) que excita el LED (50) es una señal cuadrada. Su frecuencia puede tomar alguno de los valores del conjunto de frecuencias {f,} = {10 kHz, 20 kHz, 50 kHz, 100 kHz, 200 kHz, 500 kHz, 1 MHz, 2 MHz, 5 MHz, 10 MHz}. La señal (67) por la que se multiplica la señal amplificada (66) es una señal sinusoidal cuya frecuencia es 1 kHz superior a la frecuencia de la señal (51) que excita e] LED (50). Por tanto la señal (68) consistirá en una señal de frecuencia 1 kHz que contiene toda la información y la fase de la señal (64) (correlación cruzada o heterodinado). Las componentes inservibles de alta frecuencia de esta señal son eliminadas por el filtro paso bajo (69) y la señal resultante (70) es digitalizada y analizada por el microcontrolador (52) para extraer Ja información de amplitud y fase. Esta información se registra en forma de fasor complejo.
En la figura 11 se ilustra un diagrama de estados para la mejor comprensión del sistema de medida.
Lo primero que se hace es pasar por un estado de inicialización (80) en el que se ponen a cero los valores de todas las variables a utilizar. El microcontrolador conmuta los LCDs (59 y 61 ) entre tres posibles estados:
1. Estado A (81): ambos LCDs (59 y 61) opacos (estado A). La señal registrada se corresponde con la señal de fondo de interferencia electromagnética, dado que no llega luz al detector.
2. Estado B (82): LCD (59) opaco y LCD (61) transparente. La señal registrada se corresponde con la referencia de fase y amplitud que se usará para calibrar la señal medida, contaminada por la señal de fondo de interferencia electromagnética.
3. Estado C (83): LCD (59) transparente y LCD (61) opaco. La señal registrada se corresponde con la señal medida de fluorescencia, contaminada por las señales de fondo de excitación, autofluorescencia y interferencia electromagnética.
El microcontrolador varía el sistema secuencialmente por los estados A (81), B (82) y C (83), realizando en cada uno de ellos un barrido completo por el conjunto de frecuencias de excitación {f,}. Se emplean 10 ms en la medida de cada frecuencia, y 100 ms en la medida de cada estado (todas las posibles frecuencias de un mismo estado de los LCD). Para cada estado (A, B, ó C) se registra el conjunto de fasores complejos medidos para cada frecuencia, {α,}, {b,}, {c,}. Tras cada recorrido por los tres posibles estados, se acumula (84) el valor medido del fasor en respectivos conjuntos de variables complejas {A,}, {B,}, {C,}, de tal modo que A, = A, + a,, B1 = B, + b¡, C1 = C1 + c,. Tras esto se calcula (85) un nuevo conjunto de valores complejos {D,} que se corresponden con los fasores la señal medida libre de la influencia del fondo de interferencia electromagnética y con amplitud y fase corregida por el valor de calibración: D, = (C, - A1) I (B, - A1). Tras esto se calcula (86) un nuevo conjunto de valores complejos {E,} que se corresponden con los fasores de la señal medida, con la parte común eliminada: E, = D, — DjoMHz- De este conjunto de valores se tomará la parte real y se realizará un ajuste con la ecuación:
Figure imgf000030_0001
De tal modo que se obtendrán Jos parámetros α y τ que caracterizan la emisión fluorescente, y un parámetro K correspondiente a un valor de continua no eliminado. Si el ajuste no fuera lo suficientemente bueno, se considerará que la señal es todavía demasiado débil o el ruido muy alto, por lo que se procederá a realizar otro ciclo completo por los estados A, B y C, y se realizará un nuevo ajuste. Si el ajuste fuera suficientemente bueno, se procederá a la presentación de resultados (87).
A la vista de esta descripción y juego de figuras, el experto en la materia podrá entender que la invención ha sido descrita según algunas reaiizaciones preferentes de la misma, pero que múltiples variaciones pueden ser introducidas en dichas realizaciones preferentes, sin salir del objeto de la invención tal y como ha sido reivindicada.
APLICACIÓN INDUSTRIAL La técnica de fluorescencia se usa para multitud de análisis en química analítica, para medidas medioambientales, detección de sustancias peligrosas, y para todo tipo de análisis clínicos, médicos, biológicos que utilicen marcadores fluorescentes para medir cualquier variable.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de medida del patrón de decaimiento temporal de la intensidad fluorescente en el dominio de la frecuencia, caracterizado por los siguientes pasos:
a. Exploración de la señal medida en distintos estados del sistema, en los que la señal de fondo permanece constante o varía de una forma conocida, y la señal de interés varía de una forma a determinar, siendo que Ja(s) característíca(s) que varía(π) entre distintos estados consiste(n) en:
i. Un cambio en la frecuencia de modulación de la luz de excitación, de tal modo que una o varias de las características de la serial de fondo (módulo, fase, parte real, parte imaginaria) permanece(n) constante(s) o varía(n) de forma conocida, y que la señal de fluorescencia presenta un cambio en la amplitud y/o fase de modulación al variar la frecuencia de modulación.
y/o
ii. Un bloqueo total o parcial del camino óptico entre la sustancia fluorescente y el fotodetector, utilizando algún medio no mecánico que permita conmutar un elemento entre dos estados de transmisión óptica sin alterar las características eléctricas del medio, o alterándolas de tal manera en que la variación del acoplo electromagnético entre el subsistema de modulación y la señal medida sea menor que la señal de interés.
b. Cancelación de la parte común de la señal en las medidas tomadas en distintos estados del sistema, de tal forma que la señal de fondo es cancelada y la señal de interés recuperada.
2. Método según reivindicación 1, caracterizado por que al variar la frecuencia de modulación, alguna(s) de las características de la señal de fondo varía(n) de una forma que se conoce por la realización de una medida de calibración en condiciones conocidas previa a la medida de interés, y que la información de esta medida de calibración previa se usa para realizar una corrección de la señal medida, para luego realizar la cancelación de la señal común entre distintas frecuencias de medida.
3. Me'todo según reivindicación I, caracterizado por que al variar la frecuencia de modulación, alguna(s) de las características de la señal de fondo varía(n) de una forma que se conoce por la obtención durante el propio experimento de una señal y que sirva para calibrar dicha variación y que esta señal X se caracteriza por que Ia relación entre Ia señal de fondo debida a la excitación y la de fluorescencia es mayor que dicha relación en la señal Y de medida de la fluorescencia, realizándose posteriormente una corrección de la señal Y con el patrón de calibración X, procediendo a la cancelación de la señal común entre las distintas frecuencias de medida.
4. Método según reivindicación 3, caracterizado por que las señales X (de calibración) e Y (de medida) se obtienen de dos fotodetectores distintos.
5. Método según reivindicación 3, caracterizado por que las señales X (de calibración) e Y (de medida) proceden del mismo fotodetector, y se corresponden con dos estados distintos del sistema en que la relación entre señal de fondo debida a la excitación y la señal de fluorescencia es mayor para el estado correspondiente a la señal X que para el correspondiente a la señal Y.
6. Método según reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado por que la información de interés se obtiene únicamente a partir de la parte real del fasor de medida.
7. Método según reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado por que la información de interés se obtiene únicamente a partir del módulo del fasor de medida.
8. Sistema de medida de] patrón de decaimiento temporal medida que implementa el método descrito en la reivindicación 1, caracterizado por que posee:
a. Un subsistema de generación de luz de excitación modulada
b. Una muestra fluorescente a caracterizar
c. Un subsistema de detección de luz
d. Un subsistema de cancelación de la señal común.
9. Sistema según reivindicación 8, caracterizado por que realiza una calibración de Ia señal medida con una señal de calibración adquirida previamente a ía realización del experimento de interés, tal y como se describe en la reivindicación 2.
10. Sistema según reivindicación 8, caracterizado por que realiza una calibración de la señal medida Y con una señal de calibración X adquirida durante el propio experimento de interés, siendo en Ia señal X mayor la relación de Ia señal de fondo debida a la excitación y la señal de fluorescencia que en la señal Y, tal y como se describe en la reivindicación 3.
11. Sistema según reivindicación 10, caracterizado por que posee al menos dos fotodetectores distintos, de tal modo que de uno de ellos se obtiene la señal de calibración X y del otro fotodetector se obtiene la señal de medida Y.
12. Sistema según reivindicación 10, caracterizado por que las señales de calibración X y de medida Y se proceden del mismo fotodetector y se obtienen en dos estados distintos del sistema, que se caracterizan porque la relación entre la señal de fondo debida a la excitación y la señal de fluorescencia es mayor en la señal de calibración X que en la de medida Y, lo que se consigue variando entre estados distintos la característica de transmisión óptica de al menos un elemento modulador, de tal manera que bloquee o deje pasar parte de la luz que incide sobre el fotodetector.
13. Sistema según reivindicación 12, caracterizado por que elQos) elementos moduladores cuya transmisión óptica se hace variar consiste(n) en lámina(s) de cristal líquido (LCD).
14. Sistema según reivindicación 8, caracterizado por que el(los) elementos moduladores cuya transmisión óptica se hace variar para obtener dos señales, una de serial, y una de caracterización de la interferencia electromagnética, consiste(n) en lámina(s) de cristal líquido (LCD).
PCT/ES2010/000310 2009-07-20 2010-07-16 Método y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo Ceased WO2011009974A2 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200901614 2009-07-20
ES200901614A ES2342451B2 (es) 2009-07-20 2009-07-20 Metodo y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011009974A2 true WO2011009974A2 (es) 2011-01-27
WO2011009974A3 WO2011009974A3 (es) 2011-07-14

Family

ID=42269306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2010/000310 Ceased WO2011009974A2 (es) 2009-07-20 2010-07-16 Método y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2342451B2 (es)
WO (1) WO2011009974A2 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020231632A1 (en) * 2019-05-14 2020-11-19 Becton, Dickinson And Company Phase-calibration for imaging flow cytometry

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6323495B1 (en) * 1999-09-24 2001-11-27 Umm Electronics, Inc. Method and apparatus for the determination of phase delay in a lifetime fluorometer without the use of lifetime standards

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011009974A3 (es) 2011-07-14
ES2342451B2 (es) 2011-06-30
ES2342451A1 (es) 2010-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11504035B2 (en) Apparatus and methods for detecting optical signals from implanted sensors
US7679745B2 (en) Time-resolved fluorescence spectrometer for multiple-species analysis
JP4220374B2 (ja) マルチチャネル蛍光センサ
EP2071306B1 (en) Ultraviolet ray detection device and ultraviolet ray protection effect evaluating device
ES2918951T3 (es) Dispositivo de espectrometría y método de espectrometría
US20120203114A1 (en) Intrinsic and swept-source raman spectroscopy
JP6804445B2 (ja) 吸光度測定装置への蛍光検出機能の統合
EP3099232B1 (en) System and method for photoluminescence detection
ES2971975T3 (es) Sensor con autorreferencia
Thomsen et al. Single-grain results from an EMCCD-based imaging system
BR112014007122B1 (pt) sistema para a detecção e/ou qualificação in vitro por fluorometria de pelo menos um analito em uma amostra de fluido
Nettels et al. Excited-state annihilation reduces power dependence of single-molecule FRET experiments
ES2342451B2 (es) Metodo y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo.
WO2019146172A1 (ja) 光測定装置及び光測定方法
JP2010515046A (ja) 分光測定
Lagarto et al. Development of low-cost instrumentation for single point autofluorescence lifetime measurements
ES2292273B1 (es) Pigmentos luminiscentes utilizados en documentos de seguridad y procedimiento de deteccion de los mismos.
ES2558733A1 (es) Dispositivo y método para medida remota de temperatura
KR20170122847A (ko) 선광도 및 굴절률 측정장치
Bano et al. Microcontroller based spectrophotometer using compact disc as diffraction grid
CN114983404A (zh) 一种利用光学实现经皮氧分压tcpO2和经皮二氧化碳分压tcpCO2的方法
Wabnitz et al. Assessment of basic instrumental performance of time-domain optical brain imagers
Draxler Lifetime based sensors/sensing
RU2582622C1 (ru) Люминесцентный дозиметр ультрафиолетового излучения
Stagliano et al. EPH-International Journal of Science And Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10801979

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2