WO2011004051A1 - Composiciones de terapia génica para prevenir y/o tratar enfermedades autoinmunes - Google Patents

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stz
plasmid
diabetes
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Xavier ANGUELA MARTÍNEZ
María Fátima BOSCH TUBERT
Sabrina Tarufo
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Universidad Autónoma De Barcelona
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/007—Vectors comprising a special translation-regulating system cell or tissue specific

Definitions

  • the present invention relates to gene therapy compositions comprising vectors that have at least one sequence encoding insulin-like growth factor 1 (IGF-I), which will be used to prevent or treat autoimmune diseases.
  • the invention comprises the method for preventing or treating type 1 diabetes (DT1) by means of the expression of IGF-I specifically in liver cells.
  • DT1 type 1 diabetes
  • the present invention belongs to the field of gene therapy, in particular to gene therapy that focuses on the prevention or treatment of autoimmune diseases.
  • DT1 is the result of autoimmune destruction of pancreatic ⁇ cells, which leads to insulin deficiency and hyperglycemia (Eizirik et al., 2009).
  • the occurrence of spontaneous DT1 in humans is preceded by a progressive leukocyte infiltration in the islets (insulitis), which persists for a relatively long period of time before the massive destruction of islet ⁇ cells (Atkinson and Eisenbarth, 2001).
  • DT1 is diagnosed when the destruction of ⁇ cells is almost complete (Couper et al., 1991) and patients need insulin replacement therapy to survive. Therefore, preventive interventions aimed at interrupting the immune attack against the islets and preventing the loss of ⁇ cells are of extreme interest.
  • IGF-I is an interesting candidate as an antidiabetic gene for several reasons.
  • prediabetic NOD non-obese diabetic mice
  • Th ivolet et al in the U S patent 6342227 described the administration of IGF-I as a method to delay the clinical onset of diabetes.
  • Thivolet and collaborators administered the recombinant IGF-I twice a day in their study probably because the half-life of IGF-I in the circulation is 9 min, although it can be further increased up to 16 hours when it binds to factor binding proteins insulin-like growth (IGFBP) (Janssen, 2008).
  • IGFBP insulin-like growth
  • Thivolet's study it was proposed that the protective action of IGF-I would arise due to changes in the transit of committed autoreactive T cells to the islets of the recipient mouse. That is, after the transfer of autoreactive T cells from diabetic donors, treatment with IGF-I decreased the number of donor T cells in the spleens of the receptors.
  • the present invention focuses on the discovery of an alternative method capable of preventing or treating DT1, while solving the problems associated with the methods known in the art.
  • the method developed in the present invention it was able to prevent or treat DT1 by means of a weekly hydrodynamic injection of a plasmid that allowed to express IGF-I in the liver, while maintaining normal circulating levels of IGF-I. No abnormal increase in circulating free IGF-I levels was observed at any time.
  • the number of administrations necessary to prevent or treat DT1 in the present invention could be reduced, under the appropriate conditions, to a single injection.
  • a unit dosage regimen per treatment, or even a weekly application would greatly increase the quality of life of patients.
  • the strategy used in the present invention was able to reduce the incidence of the disease up to 80% and provide complete protection against DT1 after 10 administrations, even after the treatment was withdrawn.
  • the DNA-based treatment of the invention is cheaper, easier to produce and safer than the administration of protein and does not require refrigeration for short-term or long-term storage.
  • the invention relates to the specific expression, both in hepatocytes and in non-parenchymal liver cells, of vectors comprising at least one sequence encoding IGF-I.
  • vectors comprising at least one sequence encoding IGF-I.
  • Particularly preferred vectors are plasmids.
  • the adverse hypoglycemic effect caused by the direct administration of IGF-I does not occur after the administration of gene therapy compositions comprising DNA constructs that include a DNA sequence coding for I GF-I or a functional biological equivalent thereof, associated with at least one vector, particularly plasmids, suitable for the expression of IGF-I or its functional biological equivalent in liver cells, probably because IGF-I is not synthesized acutely by the cells.
  • a sequence of experiments was carried out in the present invention to test the preventive effects of IGF-I against DT1 when it was administered in the form of a plasmid encoding IGF-I injected hydrodynamically.
  • One of the essential characteristics of the invention is the fact that the gene therapy compositions and their administration are designed for the expression of IGF-I in hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Is all As a result, physiological levels of circulating IGF-I, thus avoiding the undesirable effects achieved when serum levels of IGF-I increase and cause unwanted effects on other target tissues: by way of example, hypertrophy in cardiac muscle tissue.
  • a gene therapy approach was developed in which the hepatic administration of a plasmid expressing IGF-I leads to the prevention of the development of diabetic hyperglycemia in a mouse autoimmune diabetes model.
  • the interruption of the immune attack against pancreatic ⁇ cells in animals treated with IGF-I prevents the loss of ⁇ cell mass observed in diabetic mice and, therefore, circulating insulin levels are maintained.
  • This protection against the disease could be mediated, at least in part, by an increase in the percentage of intrapancreatic regulatory T cells ( reg T cells), since a depletion of this antibody-mediated population prevents the prevention of disease mediated by IGF-I.
  • IGF-I in liver by means of plasmids that have the CAG or CD68 promoters, was able to mediate protection against DT1.
  • any promoter that can direct the expression of a transgene in parenchymal and non-parenchymal liver cells such as CMV (van Til et al.), PGK (Uesugi et al.) Or acetyl-LDL (Bradshaw et al.; Klein et al. 2007), could potentially be used to express transgenes in liver cells and, therefore, should be within the scope of the patent protection conferred to the present invention.
  • the plasmids effectively used to administer IGF-I were pCAG IGF-I WPRE (SEC I D N °: 1) and pCD68 IGF-I (SEQ ID N °: 2).
  • adenoviral vectors examples include high capacity adenoviral vectors (HC-Ad or gutless), AAV (vi rus Adenoasociados), Poxvirus, Lentiviral vectors, or viral vectors derived from the Herpes simplex virus.
  • a description of a method similar to the hydrodynamic injection adapted to pigs is described in Ali ⁇ o et al.
  • the method of administration of the gene therapy compositions to humans is a local injection directly into the liver.
  • the functional biological equivalent expression of IGF-I can have a sequence identical to the sequence that is found naturally in IGF-I, but it can also have modified sequences that provide a function equivalent to a vector in which said sequences are incorporated. In particular, said modifications may include the deletion of repetitive sequences ALU of the 3 'UTR.
  • the experimental confirmation of the claimed invention has been carried out in experimental animal models, particularly in mice and, consequently, the DNA used in the constructions for gene therapy of DT1 encoded for mouse GF-I.
  • the experimental results achieved can be extrapolated to humans and, therefore, for the purposes of the description of the present invention, the term IGF-I applies interchangeably to a polypeptide of mouse or human origin.
  • the sequence encoding IGF-I is a synthetic IGF-I coding sequence.
  • Said synthetic sequence has a nucleotide sequence that differs from a natural human IGF-I coding sequence. It is preferred that the sequence uses an optimal use of codons; preferably, at least 50%, 70% or 90% of the codons are optimized. Therefore, in preferred embodiments, the synthetic DNA sequence has at least a sequence identity of 80, 90, 95 or 99% with the natural human IGF-I sequence. In a particular preferred embodiment, the synthetic DNA sequence has an identity of at least 95%, more preferably an identity of at least 99% and, more preferably, an identity of 100% with the natural IGF-I sequence.
  • another embodiment of the above vector may contain a regulatory system to adjust the expression of the nucleic acid construct or cassette.
  • regulatory system refers to sequences that act in cis or that act in trans incorporated in the above vectors, which regulate in some characteristic the expression of the nucleic acid of interest, as well as gene products which act in trans that are coexpressed in the cell with the vector described above. Regulatory systems can be used for the positive or negative regulation of the expression from the normal levels of expression or existing levels of expression at the time of the regulation. The system contributes to the temporal expression pattern of the polynucleotide.
  • a related aspect of the invention provides a pharmaceutical composition formulation for the administration and expression of an IGF-I gene in a cell, preferably a human IGF-I gene.
  • the formulation includes a vector of the previous aspect with or without more or more other pharmaceutically acceptable components that can, for example, act by stabilizing the vector or increasing transfection efficiency, but which can also provide other functions.
  • the formulation includes the vector in a solution having polyvinylpyrrolidone (PVP) at between about 0.5% and 50%, preferably PVP at about 5%.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the PVP has an average molecular weight of approximately 50,000 g / mol. Additional information is described in PCT document US95 / 17038.
  • another example of a formulation includes the vector with a cationic lipid (for example, as described in US Patent 4,897,355, issued on January 30, 1990) and may also include a colipid, such as a neutral colipid
  • the expression “therapeutically effective dose” refers to that amount of active ingredient that increases or decreases the activity with respect to the activity that occurs in the absence of the therapeutically effective dose.
  • the term “therapeutically”, for the purposes of the present description of the invention also includes the prevention of the occurrence of the disease. Therefore, for the purpose of the present invention, the terms prevention or treatment refer to a preventive therapy or treatment that, on the one hand, can prevent the onset of autoimmune disease and, on the other hand, can stop the progression of an autoimmune disease already in progress or initiated, blocking the harmful effects of that autoimmune disease in the body.
  • the therapeutically effective dose can be estimated initially in cell culture assays or in animal models, usually mice, rabbits, dogs or pigs. The animal model can also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine the doses and route of administration useful in humans.
  • the therapeutic efficacy and toxicity can be determined, for example, the ED50 (the therapeutically effective dose in 50% of the population) and the LD50 (the dose is 50% of the population) by conventional pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals.
  • the dose ratio of toxic effects to therapeutic is the therapeutic index, and can be expressed as the ratio LD50 / ED50.
  • compositions with high therapeutic indices are preferred.
  • the data obtained from cell culture assays and animal studies are used in the formulation of a dosage range for human use.
  • the dosage contained in said compositions is preferably in a range of circulating concentrations that includes the ED50, with little or no toxicity.
  • the dosage varies within this range depending on the dosage form used, the sensitivity of the patient and the route of administration.
  • the exact dosage will be determined by a competent professional.
  • the dosage and administration are adjusted to provide sufficient levels of the active ingredient or to maintain the desired effect.
  • the facts that must be taken into account include the severity of the pathology, the general health of the subject, age, weight and gender of the subject, diet, time and frequency of administration, combination or combinations of drugs, sensitivity reactions and tolerance / response to
  • Normal dosage amounts may vary from 0.1 to 100,000 micrograms, up to a total dose of approximately 1 g, depending on the route of administration.
  • Guidance is provided in what refers to particular dosages and methods of administration in the literature and is generally available to professionals skilled in the art. Those skilled in the art will use different formulations for nucleotides than for proteins or their inhibitors.
  • any of the pharmaceutical compositions of the invention can be administered in combination with other appropriate therapeutic agents.
  • the selection of the appropriate agents for use in a combination therapy can be carried out by a person skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles.
  • the combination of therapeutic agents can act synergistically to achieve the treatment or prevention of the various disorders described above. Using this approach, one may be able to achieve therapeutic efficacy with lower dosages of each agent, thereby reducing the potential for adverse side effects.
  • any of the therapeutic methods described above can be applied to any subject in need of such therapy, including, for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys and, more preferably, humans.
  • FIG. 1 Immunohistochemical analysis of the expression of GFP and Mac-2 in liver sections. Twenty-four hours after hydrodynamic post-injection of the CAG, hAAT and CD68 plasmids expressing GFP and 1 week after the injection of the CAV GFP WPRE AAV8 vector, staining with specific antibodies against Mac-2 in mouse liver sections was examined. Cells were detected double positive GFP + / Mac-2 + in livers of mice that were injected with plasmids CAG-GFP and CD68-GFP (AC, GI), but not after the injection of plasmid hAAT-GFP (DF).
  • CAG-GFP and CD68-GFP AC, GI
  • AAV8 vectors lack tropism by Kupffer cells, as revealed by the absence of GFP + / Mac-2 + cells in animals injected with AAV8-CAG-GFP (JL).
  • the white arrows indicate the location of the Kupffer cells.
  • Scale bars 18 ⁇ m (AC); 22 ⁇ m (DF); 16 ⁇ m (GI); 24 ⁇ m (JL).
  • FIG. 1 Analysis of the expression of GFP by RT-PCR in separate CDH b + cells. Animals were injected with saline solution (B) or 20 ⁇ g of pCAG
  • GFP WPRE C. Twenty-four hours post-injection, liver CDH b + cells were separated and RNA was extracted. A single band specific for GFP was amplified in the group in which plasmid DNA was injected, demonstrating that non-parenchymal cells expressed the GFP transgene. In the lane (A) the molucular weight marker is shown.
  • FIG. 3 Flow cytometric analysis of the expression of GFP in non-parenchymal liver cells after hydrodynamic injection of plasmid DNA. Different liver cell populations in animals that were injected with pCAG and AAV8 CAG were analyzed by flow cytometry. GFP expression was detected in macrophages - Kupffer cells CDH b + - (M ⁇ ), CDH c + dendritic cells (DCs), CD19 + B lymphocytes (BCs) and CD4 + and CD8 + T cells.
  • M ⁇ macrophages - Kupffer cells CDH b + -
  • DCs CDH c + dendritic cells
  • BCs B lymphocytes
  • CD4 + and CD8 + T cells CD4 + and CD8 + T cells.
  • Tg IFN ⁇ were administered 5 consecutive daily doses of STZ (25 mg / kg) on days 1-5. Tg IFN ⁇ mice not treated with STZ were used as control animals (With). On day 9, the STZ-Con mice were hydrodynamically injected with plasmid pVAX1, which is devoid of an expression cassette, or 5 ⁇ g of a plasmid encoding IGF-I under the control of the CAG promoter (STZ-IGF-I ). The mice were given a hydrodynamic injection per week for 10 weeks. Then, the glycemia of the mice was monitored for another 6 weeks. The numbers indicate the number of weeks the treatment lasted in the murine animal model.
  • the Y axis represents the percentage of lymphocytic infiltration in the pancreatic islets of samples of these animals.
  • the degree of infiltration was measured using the following ranking: not infiltrated (0); peri-insulitis ( ⁇ 25%); moderate insulitis ( ⁇ 50%); severe insulitis (> 50%).
  • Insulitis was quantified 15 days after STZ treatment by flow cytometry. The percentage of infiltrating cells T CD4 + and T CD8 + was reduced in animals treated with pCAG IGF-I. The results show the mean ⁇ SEM of 3 animals per group. * p ⁇ 0.05 vs Con. # p ⁇ 0.05 vs STZ-con.
  • CD1 1 b +, CD4 + and CD8 + cells respectively is represented on the Y axes of each of the graphs.
  • C Detection by immunohistochemistry of insulin present in pancreatic tissue sections of control animals not treated with STZ (Con), control animals treated with STZ (STZ-Con) and of animals treated with STZ-IGF-I, at two weeks (1) and 4 months (2) from the beginning of treatment.
  • 100x Maginification Figure 6. Analysis of apoptosis and replication of ⁇ cells, of the mass of ⁇ cells and circulating levels of insulin and IGF-I.
  • the Y axis represents the mass of ⁇ cells in percentage with respect to the control animals.
  • D The insulinemia was measured 7 weeks after the first administration of IGF-I by an enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA). The animals treated with normoglycemic IGF-I maintained normal insulin values while the STZ-Con animals had very low levels of the hormone. The results are expressed as the mean ⁇ SEM of 4 animals per group. ( * p ⁇ 0.05 versus Con). The Y axis represents the concentration of insulin expressed as ng / ml.
  • E Serum IGF-I levels at 7 weeks after the first administration of IGF-I, measured by ELISA, showed no differences between groups. The results are the mean ⁇ SEM of 4 animals per group. The Y axis represents serum IGF-I levels expressed as ng / ml.
  • B The cumulative incidence of diabetes reached 90% at week 6 in STZ-Con mice (9 of 10 mice). Animals expressing IGF-I under the control of the CD68 promoter were protected from the disease since only 40% (5/12) of them became diabetic at week 6 post-STZ.
  • mice not treated with STZ developed hyperglycemia. Animals were considered diabetic when 2 consecutive blood glucose measurements were above 250 mg / dl. A representative experiment of 2 separate experiments is shown. The time expressed in days and on the Y axis the percentage of cumulative incidence of diabetes is represented on the X axis.
  • T reg regulatory T cells
  • T reg in the liver and pancreas of mice treated with IGF-I was increased while intrasplenic T regs remained unchanged. The values are shown as the mean ⁇ SEM.
  • n 4 animals per group.
  • the percentage of CD25 + GITR + cells versus CD4 + cells is plotted on the Y axis of graphs (A), (B) and (C).
  • D Depletion of CD4 + CD25 + reg T cells using anti-CD25 monoclonal antibody resulted in the loss of the protective effects of IGF-I since 100% of the animals treated with pIGF-1 were diabetic on day 30 post -STZ.
  • the X axis represents the time expressed in days and on the Y axis the percentage of cumulative incidence of diabetes.
  • FIG. 10 Schematic representation of the constructions that code for the expression of GFP. From the upper part to the lower part, the plasmids pCAG, phAAT and pCD68 used for expression studies of indicator genes are presented. Below these is the AAV8-CAG vector.
  • the CAG promoter is a hybrid promoter composed of the CMV early / intermediate enhancer, the chicken ⁇ -actin promoter and the first intron of the human ⁇ -globin gene. It is expressed ubiquitously.
  • the hAAT promoter is a hybrid promoter composed of the enhancer of the hepatocyte control region (HCR) of the apolipoprotein E and the human ⁇ -antitrypsin promoter. Its expression is limited to hepatocytes.
  • the CD68 protein is a classic macrophage marker. Its expression should be limited mainly to Kupffer cells. Vectors are not to scale.
  • FIG. 11 Schematic representation of the constructions expressing IGF-I. From the upper part to the lower part, the plasmids pCAG, phAAT and pCD68 used for studies on the preventive actions of IGF-I for type 1 diabetes are presented. The vectors are not to scale.
  • a gene therapy approach was developed in the present invention in which the hepatic administration of a plasmid expressing IGF-I leads to the prevention of the development of diabetic hyperglycemia in a mouse autoimmune diabetes model.
  • the interruption of the immune attack against pancreatic ⁇ cells in animals treated with IGF-I prevents the loss of ⁇ cell mass observed in diabetic mice and, therefore, circulating insulin levels are maintained.
  • IGF-I The synthesis of IGF-I is carried out in the present invention, from vectors comprising a promoter suitable for expression in liver cells.
  • Preferred vectors are plasmids comprising CAG or CD68 as suitable promoters, resulting in a constant supply of IGF-I.
  • the preventive use of IGF-I is achieved by administering a hydrodynamic injection of a solution once a week. which carries a plasmid that contains the genetic information necessary for the cells to produce IGF-I.
  • a treatment was established in the present invention consisting of one administration of DNA per week, in contrast to the daily injections used by others in the state of the art.
  • the present invention demonstrated that the animals achieved complete protection against DT1 after 10 administrations of a plasmid encoding IGF-I, even after the treatment was withdrawn.
  • IGF-I therapy decreased the incidence of diabetes: 90% of the mice developed diabetes in the STZ-Control group while 80% of the animals in the IGF-treated group -I did not develop the disease. However, a small percentage of the animals treated with IGF-I became diabetic. Therefore, treatment with IGF-I does not delay the onset of the disease but decreases the incidence of DT1. Importantly, after a weekly treatment period that has been estimated at 10 weeks, the animals are completely protected from the disease and do not develop diabetes when the treatment is withdrawn.
  • the invention which uses IGF-I, leads to an intervention in the immune system that has as a final result the interruption of the autoimmune attack against pancreatic islets by infiltration of CD4 + and CD8 + T cells, probably through the involvement of cells Regulatory T (T reg ). This leads to protection against autoimmune diabetes.
  • T reg cells Regulatory T
  • Examples are type 1 diabetes (Kukreja et al., 2002; Lindley et al., 2005), multiple sclerosis (Viglietta et al., 2004), autoimmune vasculitis (Boyer et al., 2004), rheumatoid arthritis (RA) ( Cao et al., 2003) and Langerhans cell histiocytosis (LCH) (Senechal et al., 2007), graft versus host disease (Cohen and Boyer, 2006), autoimmune proliferative syndrome of type Il (Kriegel et al., 2004), atherosclerosis (George, 2008), Crohn's disease (Ricciardelli et al., 2008), myasthenia gravis (Meriggioli et al., 2008), psoriasis (Sugiyama et al., 2005), Grave's disease (Pan et al ., 2009), myositis (Banica et al.,
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • EAG experimental autoimmune gastritis
  • lupus erythematosus-like disease Kerhn et al., 2009
  • type diabetes 1 Choen et al., 2005; Setoguchi et al., 2005
  • ulcerative colitis Denning et al., 2005
  • experimental myasthenia gravis Sheng et al., 2008
  • experimental autoimmune myositis Allenbach et al., 2009
  • uveitis Matta et al., 2008
  • the present invention shows a gene therapy approach in which the hepatic administration of a vector expressing IGF-I leads to protection against the development of diabetic hyperglycemia or other autoimmune diseases in both humans and models of autoimmune diabetes in mouse.
  • the interruption of the immune attack against pancreatic ⁇ cells in animals treated with IGF-I prevents the loss of ⁇ cell mass observed in diabetic mice and, therefore, circulating insulin levels are maintained. It is considered that this protection against the disease is mediated, at least in part, by an increase in the percentage of both intrahepatic and reg reg T cells intrapancreatic, since an antibody-mediated depletion of this population prevents the prevention of IGF-I induced disease.
  • the first embodiment of the present invention refers to a DNA construct that comprises a nucleotide sequence encoding IGF-I and a promoter suitable for expressing said IGF-I in liver cells.
  • Preferred promoters such as CAG or CD68 are selected.
  • the DNA construction consists of plasmid pCAG IGF-I WPRE characterized by SEC I D N °: 1 or plasmid pCD68 I GF-I characterized by SEQ ID N °: 2.
  • the second embodiment of the invention relates to the use of said DNA construction for the manufacture of active pharmaceutical compositions for treating DT1 or any other autoimmune disease, particularly, but not limited to, autoimmune diseases caused by dysfunction or deregulation of cells. T reg .
  • the third embodiment of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the construction of DNA mentioned above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions or formulations include those that are suitable for oral or parenteral administration (including its bcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous), although the best route of administration depends on the patient's condition.
  • the formulations may be in the form of individual doses.
  • the formulations are prepared according to methods known in the field of pharmacology.
  • the amounts of active substances to be administered may vary according to the particularities of the therapy.
  • the fourth embodiment of the invention relates to a method for treating or preventing DT1 or any other autoimmune disease comprising the administration to the patient of said composition.
  • the method is characterized in that the composition is administered to the patient by hydrodynamic injection once a week, or even once by treatment. The method was able to reduce the incidence of DT1 up to 20% and provide complete protection against DT1 after 10 administrations.
  • non-parenchymal liver cells of the liver NPC
  • parenchymal cells were able to express the transgene after the hydrodynamic injection procedure by tail vein.
  • the hydrodynamic injection of a plasmid encoding IGF-I leads to the prevention of DT1 in a mouse autoimmune diabetes model.
  • the administration of IGF-I in the circulation of muscle or liver tissues is not sufficient to prevent autoimmune diabetes in the RIP / hIFN ⁇ model.
  • Transgenic CD1 mice (N 10 generation) expressing human interferon beta (IFN- ⁇ ) in ⁇ cells were used. All experiments were performed on male transgenic mice. It was administered to transgenic mice, 5 consecutive days, an intraperitoneal injection of STZ (25 mg / kg body weight), dissolved in 0.1 mol / l citrate buffer (pH 4.5) immediately before administration. The mice were fed ad limitum on a conventional diet and maintained a 12-hour light-dark cycle (the lights were turned on at 8:00 A.M.). The procedures for animal care and experimentation were approved by the Ethics Committee on Animal and Human Experimentation of the Autonomous University of Barcelona.
  • STZ 25 mg / kg body weight
  • 0.1 mol / l citrate buffer pH 4.5
  • the tissues were fixed for 12-24 h in formalin, embedded in paraffin and sectioned.
  • the sections were incubated overnight at 4 0 C with antibodies specific for each protein, washed with PBS 3 x 5 min and incubated with the corresponding secondary antibodies.
  • the sections were incubated with secondary antibody conjugated with fluorochrome for 1 h at room temperature and the nuclei were counterstained with Topro or Hoechst.
  • Topro or Hoechst For lightfield detections, it was revealed through the use of the ABC complex (Vector Laboratories, United Kingdom) that employs 3'3'-diaminobenzidine (DAB) as a chromogenic substrate. Sections contracted in Mayer's hematoxylin.
  • pancreas For the immunohistochemical detection of insulin, glucagon, somatostatin and polypeptide proteins pancreatic, pancreas was fixed for 12-24 h in formalin, embedded in paraffin and sectioned. Sections were then incubated overnight at 4 0 C with porcine anti-insulin guinea pig antibody (Sigma Chemical, St.
  • peroxidase-coupled rabbit anti-guinea pig IgG (Dako, Glostrup, Denmark) or biotinylated goat anti-rabbit antibody (Pierce, Rockford, IL) and ABC complex (Vector Laboratories, Burlingame, CA) were used.
  • insulitis The incidence and severity of insulitis was analyzed in 3 paraffin sections by pancreas separated by 100-150 ⁇ m, stained against insulin using the antibody mentioned above (section 1 .3) and counterstained with hematoxylin.
  • the degree of mononuclear cell infiltration was measured using the following classifications: non-infiltrated, peri-insulitis (mononuclear cells surrounding islets and ducts but without infiltration of the islet architecture), moderate insulitis (mononuclear cells infiltrating ⁇ 50 % of the islet architecture) and severe insulitis (> 50% of the islet tissue infiltrated by lymphocytes and / or loss of the islet architecture).
  • Pancreas were obtained from transgenic mice and immunohistochemical detection of insulin was performed in three sections (2-3 ⁇ m), separated by 200 ⁇ m.
  • the area (in square micrometers) of each islet and the area of each section were determined using a Nikon Eclipse E800 microscope (Nikon, Tokyo, Japan) connected to a video camera with a color monitor and an image analyzer (analySIS 3.0 ; Soft Imaging System, Lakewood, CO).
  • the percentage of area of ⁇ cells in the pancreas was calculated by dividing the area of all insulin-positive cells in one section by the total area of this section and multiplying the result by 100.
  • the mass of ⁇ cells was calculated by multiplying the weight of the pancreas by the percentage of the area of ⁇ cells.
  • Ki67 is expressed at low levels during the initial G1 phase and is it accumulates during the following phases S, G2 and M of the cell cycle, therefore it is usually used as a replication marker.
  • Poptotic cells were identified in deparaffinized pancreatic sections using transferase-mediated dUTP free end (TUNNEL) (in situ cell death detection kit; Roche Molecular Biochemicals). No ⁇ cell was stained with a combination of antibodies (anti-glucagon, anti-somatostatin and anti-pancreatic polypeptide). The nuclei contracted with Hoechst (Sigma Chemical). The apoptotic ⁇ cell was considered when it was positive for TUNNEL and negative for staining with a combination of antibodies. In these sections, the non- ⁇ cell layer showed a red cytosolic staining, while the TUNNEL positive cells had green nuclei. At least 1000 nuclei of islet ⁇ cells per pancreas were counted and 4 animals per group were examined.
  • TUNNEL transferase-mediated dUTP free end
  • livers and spleens obtained from control and treated mice were mechanically disintegrated using the flat portion of a plunger of a 10 ml syringe.
  • the homogenate was then passed through 30 ⁇ m pore pre-separation filters (Milteny Biotec) to obtain a single cell suspension.
  • the cell suspension was gently coated on a Histopaque-1,083 (Sigma-Aldrich) and centrifuged at 800 g for 20 min. Non-parenchymal cells were collected from the interface.
  • Intrapancreatic lymphocytes were obtained from control and treated mice after enzymatic digestion with collagenase, mechanical rupture and purification by discontinuous density gradient, using a Histopaque-1,083 (Sigma-Aldrich).
  • the following conjugated mAbs were used for cell staining: anti-CD11 b labeled with PE and labeled with PE-Cy7 (M1 / 70), anti-CD4 labeled with PE (GK 1 .5), anti-CD8 (53-6.7 ), anti-CD19 (6D5), anti-F4 / 80 conjugated to FITC (BM8), anti-CD49 conjugated to PE (BioLegend) anti-CD25 conjugated to FITC, anti-GITR conjugated to PE-CY7 (YGITR765), anti -CD1 1 c conjugated to PE (HL3) (BD Pharmingen). Antibodies of the same isotype served as controls. The data were obtained on a double laser FC 500 MPL cytometer (Beckman
  • a conventional PCR was used to detect the expression of GFP in Kupffer cells separated by FACS and that of IGF-I from plasmid in total liver, using the GoTaq® DNA Polymerase (Promega, United States).
  • the following primers were used: SEQ ID NO: 3 (GFP Fw primer), SEQ ID NO: 4 (GFP Rv primer), SEQ ID NO: 5 (IGF-I Fw primer) and SEQ ID NO: 6 (primer IGF-I Rv).
  • a hydrodynamic injection was made through the tail vein as described in Liu et al., 1999. Plasmid DNA was diluted in saline solution in a volume (mi) equal to -10% of the average body weight of the animals (grams) , and was injected manually into the lateral vein of the tail in less than 5 seconds. Before the injection, the animals were placed under a 250 W infrared heat lamp for a few minutes to dilate the blood vessels and facilitate observation and easier access to the tail vein. A plastic immobilization device (Harvard Apparatus) was used to hold the animal well for injection. No anesthesia was used as it is not necessary as long as an appropriate immobilization device is used. Hypodermic needles of gauge 26G of 9,525 mm (3/8 inches) (BD) were used, the largest possible needle gauge that fits perfectly into the access vein to inject the animals. Example 7. Statistical analysis
  • mice were injected using a series of different constructs expressing GFP under the control of ubiquitous or cell-specific promoters, as summarized in Table 1.
  • FIG. 1 shows that, apart from hepatocytes, some Kupffer Mac-2 + cells were also GFP + after HTV injection of pCAG GFP WPRE (AC), suggesting the transfection of Kupffer cells.
  • pCAG GFP WPRE AC
  • pCD68 GFP no GFP + hepatocytes were observed, but many Kupffer GFP + (GI) cells could be detected.
  • GI Kupffer GFP +
  • Kupffer cells eliminate large and insoluble waste fragments by phagocytosis, part of the positivity for GFP after the injection of the plasmid pCAG GFP WPRE detected in KC could be the result of phagocytosis of GFP from hepatocytes.
  • Kupffer GFP + cells were detected ( Figure 1 JL).
  • CDH b + cells from liver homogenates enriched in non-parenchymal cells were separated by FACS after the hydrodynamic injection of the plasmid pCAG GFP WPRE.
  • hepatic sinusoids Apart from sinusoidal endothelial liver cells (LSEC) and Kupffer cells, hepatic sinusoids also house resident dendritic cells and a heterogeneous population of intrahepatic lymphocytes, which contains the subpopulation of pit cells representing liver-specific natural killer (NK) cells .
  • a flow cytometric analysis was performed. 20 ⁇ g of pCAG-GFP WPRE mice were injected hydrodynamically, sacrificed 24 hours later and non-parenchymal liver cells were isolated. A group of animals 2.5 x 10 11 viral genomes / animal of AAV8 CAG GFP WPRE were also injected and the livers were removed 7 days post-injection.
  • Non-parenchymal cells were stained with antibodies specific for the different types of liver cells: CD11 b for KC; CD11 b for DC, CD19 for B lymphocytes; CD4 and CD8 for T lymphocytes.
  • a flow cytometry analysis was performed to detect the presence of GFP + cells. Approximately 20% of Kheffer cells and intrahepatic B lymphocytes and 5 to 10% of dendritic cells and T lymphocytes were GFP + after the hydrodynamic injection of the CAG GFP WPRE plasmid ( Figure 3). Confirming the previous histochemical observations, Kupffer GFP + cells or other non-parenchymal GFP + cells were not detected by flow cytometry after the injection of the adeno-associated vector.
  • Tg IFN ⁇ mice were treated weekly with a plasmid expressing IGF-I under the control of the ubiquitous CAG promoter.
  • Tg IFN ⁇ mice express human ⁇ interferon in pancreatic ⁇ cells. These mice develop overt diabetes with lymphocytic infiltration of the islets when treated with very low doses of streptozotocin, which do not induce diabetes in control mice (Casellas et al., 2006; Pelegrin et al., 1998). It has been previously shown that local expression in IGF-I ⁇ cells prevents islet infiltration and death of ⁇ cells in these Tg IFN ⁇ mice (Casellas et al., 2006).
  • Experimental diabetes was induced by administration of daily injections of 25 mg / kg of streptozotocin (STZ) for 5 consecutive days. Seven days after the first administration of STZ, a plasmid was injected hydrodynamically that directed the expression of IGF-I under the control of the ubiquitous CAG promoter, weekly for 10 weeks.
  • STZ streptozotocin
  • Example 12 Analysis of lymphocytic infiltration of pancreatic islets.
  • Insulitis was measured 4 months after treatment with STZ and the degree of insulitis in mice treated with normoglycemic IGF-I was similar to that observed in control mice not treated with STZ ( Figure 5A).
  • lymphocytic infiltration of the islets was also determined by flow cytometry. Relative quantification of infiltrating lymphocytes was performed
  • Example 13 Analysis of apoptosis and replication of ⁇ cells
  • Example 14 Measurement of the mass of ⁇ cells in mice treated with IGF-I
  • Example 16 The specific overexpression of exogenous IGF-I in hepatocytes does not lead to the prevention of diabetes.
  • the CAG promoter is capable of directing the expression of the transgene both in hepatocytes and in several non-parenchymal liver cells after the injection procedure. hydrodynamics To further characterize whether the protection against the development of diabetes after treatment with IGF-I depended on the specific expression of exogenous IGF-I in hepatocytes, a new plasmid construct expressing IGF-I was examined under the control of a specific promoter of hepatocytes composed of the enhancer of the hepatocyte control region (HCR) of the apolipoprotein E and the human ⁇ -antitrypsin promoter (phAAT-IGF). As demonstrated earlier in the study, the hAAT promoter is as potent as the GAC promoter in terms of transcriptional activity.
  • HCR hepatocyte control region
  • phAAT-IGF human ⁇ -antitrypsin promoter
  • IGF-I insulin growth factor-I
  • liver of mice injected with plasmid was determined by RT-PCR using primers specific for exogenous IGF-I. Twenty-four after the HTV injection of phAAT IGF-I, only expression of IGF-I from the plasmid could be detected in the animals in which pCAG IGF-I WPRE had been injected ( Figure 7A).
  • IFN ⁇ mice were treated with daily injections of 25 mg / kg streptozotocin (STZ) for 5 consecutive days. After the injection of STZ, a plasmid was injected hydrodynamically that directed the expression of IGF-I under the control of the specific hepatocyte promoter hAAT (STZ-hAAT-1 GF-I) every week for 4 weeks. Mice not treated with STZ and STZ-Con were included as controls. Two weeks after the injection of STZ, the cumulative incidence of diabetes was approximately 80% in STZ-Con mice. Animals expressing exogenous IGF-I under the control of the hAAT promoter showed no protection against diabetes and the cumulative incidence of the disease was similar to that of STZ-Con mice ( Figure 7B). Animals not treated with STZ did not develop diabetes, as expected. Therefore, these results suggested that the specific expression of exogenous IGF-I hepatocytes was not sufficient to prevent the development of diabetes in mice treated with STZ.
  • Example 17 Overexpression of exogenous IGF-I under the control of the CD68 promoter in non-parenchymal liver cells is sufficient for the prevention of diabetes.
  • liver Since the expression limited to hepatocytes of plasmid IGF-I was unable to suppress the onset of diabetes, the effects of IGF-I expression in other types of liver cells were examined.
  • the population of non-parenchymal cells is mainly composed of endothelial cells sinusoidal (LSEC), resident tissue macrophages (Kupffer cells), dendritic cells, star cells and lymphocytes associated with the liver (Blouin et al., 1977). Only recently has it been shown that many liver functions depend on the cooperation of non-parenchymal and parenchymal liver cells (Kmiec, 2001).
  • CD68 is a macrophage marker and is a type I transmembrane protein that is expressed in the endosomal compartment of all mononuclear phagocyte lineage cells including monocytes, macrophages, microglia, osteoclasts and, to a lesser extent, immature dendritic cells. (Gough et al., 2001). Hepatic star cells also express CD68 (Vi ⁇ as et al., 2003).
  • Example 18 Changes in hepatic and pancreatic regulatory T cells after treatment with IGF-I
  • T reg in the mouse autoimmune diabetes model Tg I FN ⁇ could be breaking the peripheral tolerance to ⁇ cells, leading to the appearance of the disease. This also suggested that the T reg could be involved in the protection against the DT1 mediated by IGF-I.
  • Example 19 Muscle electrotransfer of pCMV-IGF-1 does not prevent Type 1 Diabetes.
  • an experimental diabetic state was induced in RIP-l / hIFN ⁇ mice by administering daily injections of 25 mg / kg of streptozotocin (STZ) for 5 consecutive days.
  • STZ streptozotocin
  • a plasmid was directed electrotransfering the expression of IGF-I under the control of the ubiquitous CMV promoter (pCMV IGF-I) to the muscles of IFN ⁇ transgenic mice previously treated with STZ (STZ I GF-I).
  • STZ I GF-I ubiquitous CMV promoter
  • IGF-I Insulin-like growth factor-1
  • Beta cell expression of IGF-I leads to recovery from type 1 diabetes. J Clin Invest 109, 1 153-1 163.
  • IGF-I Insulin-like growth factor I

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Abstract

Composiciones de terapia génica para prevenir y/o tratar enfermedades autoinmunes. La presente invención se refiere a vectores, preferiblemente a plásmidos que comprenden promotores específicos, que codifican el factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-I) o un equivalente biológico funcional del mismo, que se usarán para prevenir o tratar la Diabetes Tipo 1 (DT1) y/u otras enfermedades autoinmunes. Además, la invención comprende el método para prevenir o tratar la DT1 por medio de la expresión de IGF-I, o un equivalente biológico funcional del mismo, en células hepáticas. El IGF-I era capaz de interrumpir el ataque inmune contra las células β pancreáticas, evitando la pérdida de masa de células β y, por lo tanto, manteniendo la insulina circulante a niveles normales.

Description

COMPOSICIONES DE TERAPIA GENICA PARA PREVENIR Y/O TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a composiciones de terapia génica que comprenden vectores que tienen al menos una secuencia que codifica para el factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-I), que se usarán para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes. Además, Ia invención comprende el método para prevenir o tratar Ia diabetes tipo 1 (DT1 ) por medio de Ia expresión de IGF-I específicamente en células hepáticas. El IGF-I fue capaz de detener el ataque inmune contra las células β pancreáticas, evitando Ia pérdida de masa de células β y, por Io tanto, manteniendo Ia insulina circulante a niveles normales.
Por tanto, Ia presente invención pertenece al campo de Ia terapia génica, en particular a Ia terapia génica que se centra en Ia prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunes.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La DT1 es el resultado de Ia destrucción autoinmune de células β pancreáticas, que conduce a una deficiencia de insulina e hiperglucemia (Eizirik et al., 2009). La aparición de DT1 espontánea en seres humanos está precedida por una infiltración leucocitaria progresiva en los islotes (insulitis), que persiste durante un periodo de tiempo relativamente prolongado antes de Ia destrucción masiva de células β de los islotes (Atkinson y Eisenbarth, 2001 ). La DT1 se diagnostica cuando Ia destrucción de células β es casi completa (Couper et al., 1991 ) y los pacientes necesitan terapia sustitutoria con insulina para sobrevivir. Por Io tanto, son de extremo interés intervenciones preventivas dirigidas a interrumpir el ataque inmune contra los islotes e impedir Ia pérdida de células β.
Varios factores de crecimiento han demostrado propiedades protectoras frente a Ia DT1 en diferentes modelos animales. Entre ellos, el IGF-I es un candidato interesante como un gen antidiabético por varias razones. En primer lugar, tiene efectos antiapoptóticos in vitro en islotes expuestos a citoquinas proinflamatorias (Giannoukakis et al., 2000). En segundo lugar, Ia administración subcutánea diaria de IGF-I recombinante humano a ratones NOD (diabéticos no obesos) prediabéticos reduce Ia gravedad de Ia insulitis y Ia incidencia de DT1 , demostrando Ia eficacia de Ia protección de IGF-I frente a Ia DT1. Sin embargo, se produce un efecto adverso marcado en los minutos siguientes a Ia administración de IGF-I libre: los niveles circulantes de glucosa disminuyen, causando una hipoglucemia mortal a algunos animales. Este efecto adverso se debe a Ia acción hipoglucémica similar a insulina de IGF-I. La hipoglucemia y sus efectos adversos resultantes potencialmente mortales, junto con su impacto sobre Ia función neurocognitiva y bienestar emocional, continúa representando un peligro grave y un obstáculo muy importante para el logro de un control glucémico estrecho. Además, después de Ia administración subcutánea de IGF-I recombinante, Ia aparición de Ia diabetes se retrasa solamente del día 16 al día 18, pero Ia incidencia final de Ia enfermedad más allá del día 22 después de Ia inducción de diabetes puede ser probablemente Ia misma entre los grupos sin tratar y tratados (Bergerot et al., 1995).
En especial , Th ivolet y colaboradores en Ia patente U S 6342227 describieron Ia administración de IGF-I como un método para retrasar Ia aparición clínica de diabetes. Thivolet y colaboradores administraron dos veces al día el IGF-I recombinante en su estudio, probablemente porque Ia vida media del IGF-I en Ia circulación es de 9 min, aunque puede aumentarse adicionalmente hasta 16 horas cuando se une a proteínas de unión al factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP) (Janssen, 2008). En el estudio de Thivolet, se propuso que Ia acción protectora de IGF-I surgiría debido a los cambios en el tránsito de células T autorreactivas comprometidas hacia los islotes del ratón receptor. Es decir, después de Ia transferencia de células T autorreactivas desde donantes diabéticos, el tratamiento con IGF-I disminuía el número de células T donantes en los bazos de los receptores.
En trabajos anteriores de nuestro laboratorio, demostramos que Ia expresión local en el páncreas de ratones transgénicos de IGF-I previene Ia infiltración de los islotes y Ia muerte de células β en un modelo de DT1 , el ratón RIP/hIFNβ, que presenta una susceptibilidad aumentada a desarrollar diabetes (Casellas et al., 2006). Además, Ia expresión de IGF-I en células β de ratones diabéticos es capaz de regenerar el páncreas endocrino en un modelo transgénico (George et al., 2002).
Teniendo en cuenta Ia información comprendida en el estado de Ia técnica, Ia presente invención se centra en el descubrimiento de un método alternativo capaz de prevenir o tratar Ia DT1 , al tiempo que se resuelvan los problemas asociados con los métodos conocidos en Ia técnica. Particularmente, el método desarrollado en Ia presente invención era capaz de prevenir o tratar Ia DT1 por medio de una inyección hidrodinámica semanal de un plásmido que permitía expresar IGF-I en el hígado, al tiempo que se mantenían niveles circulantes de IGF- I normales. No se observó en ningún momento un aumento anormal en los niveles de IGF-I libre circulante. Además, el número de administraciones necesarias para prevenir o tratar Ia DT1 en Ia presente invención podía reducirse, con las condiciones apropiadas, a una sola inyección. En un entorno clínico, un régimen de dosificación unitaria por tratamiento, o incluso una aplicación semanal, aumentaría enormemente Ia calidad de vida de los pacientes. La estrategia usada en Ia presente invención era capaz de reducir hasta un 80% Ia incidencia de Ia enfermedad y proporcionar una protección completa frente a Ia DT1 después de 10 administraciones, incluso después de que se retirara el tratamiento. Por último, el tratamiento basado en ADN de Ia invención es más económico, más fácil de producir y más seguro que Ia administración de proteína y no requiere refrigeración para un almacenamiento a corto plazo o a largo plazo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de Ia invención
La invención se refiere a Ia expresión específica, tanto en hepatocitos como en células hepáticas no parenquimatosas, de vectores que comprenden al menos una secuencia que codifica IGF-I. Son vectores particularmente preferidos los plásmidos. El efecto hipoglucemiante adverso causado por Ia administración directa de IGF-I no se produce después de Ia administración de composiciones de terapia génica que comprenden construcciones de ADN que incluyen una secuencia de ADN codificante para I GF-I o un equivalente biológico funcional del mismo, asociadas con al menos un vector, particularmente plásmidos, adecuado para Ia expresión de IGF-I o su equivalente biológico funcional en células hepáticas, probablemente debido a que el IGF-I no se sintetiza de forma aguda por las células. Se realizó una secuencia de experimentos en Ia presente invención para ensayar los efectos preventivos del IGF-I frente a Ia DT1 cuando se administraba en forma de un plásmido que codifica IGF-I inyectado hidrodinámicamente.
Una de las características esenciales de Ia invención es el hecho de que las composiciones de terapia génica y su administración están diseñadas para Ia expresión de IGF-I en hepatocitos y células hepáticas no parenquimatosas. Esto da como resultado niveles fisiológicos de IGF-I circulante, evitando por Io tanto los efectos indeseables conseguidos cuando los niveles séricos de IGF-I aumentan y provocan efectos no deseados en otros tejidos diana: a modo de ejemplo, hipertrofia en el tejido muscular cardiaco.
Por Io tanto, se desarrolló un enfoque de terapia génica en el que Ia administración hepática de un plásmido que expresa IGF-I conduce a Ia prevención del desarrollo de hiperglucemia diabética en un modelo de diabetes autoinmune en ratón. La interrupción del ataque inmune contra las células β pancreáticas en los animales tratados con IGF-I impide Ia pérdida de masa de células β observada en ratones diabéticos y, por Io tanto, se mantienen los niveles de insulina circulante. Esta protección frente a Ia enfermedad podría estar mediada, al menos en parte, por un aumento en el porcentaje de células T reguladoras intrapancreáticas (células Treg), ya que una depleción de esta población mediada por anticuerpos impide Ia prevención de Ia enfermedad mediada por IGF-I.
Más específicamente, Ia presente invención mostraba que Ia expresión de
IGF-I en hígado, por medio de plásmidos que tienen los promotores CAG o CD68, era capaz de mediar Ia protección frente a DT1. Sin embargo, cualquier promotor que pueda dirigir Ia expresión de un transgén en células hepáticas parenquimatosas y no parenquimatosas, tal como CMV (van Til et al.), PGK (Uesugi et al.) o acetil- LDL (Bradshaw et al. ; Klein et al. 2007), se podría usar potencialmente para expresar transgenes en células hepáticas y, por Io tanto, debería estar comprendido en el alcance de Ia protección de patente que se confiera a Ia presente invención.
En una realización preferida de Ia invención , los plásmidos usados eficazmente para administrar IGF-I eran pCAG IGF-I WPRE (SEC I D N°: 1 ) y pCD68 IGF-I (SEC ID N°: 2).
Adicionalmente, varios vectores han demostrado ser hepatotrópicos y, por Io tanto, podrían funcionar como vectores apropiados para expresar IGF-I en las células hepáticas. La presente invención demostraba que Ia inyección hidrodinámica de un plásmido conduce a Ia transfección de Ia mayoría de clases de células hepáticas y, por Io tanto, es probable que Ia inyección hidrodinámica de un vector viral también Io haga. Por Io tanto, Ia presente invención sugiere que Ia inyección hidrodinámica de un vector viral que expresa IGF-I sería capaz de expresar el transgén en células hepáticas y, por Io tanto, proteger frente a DT1. Se enumeran a continuación ejemplos de dichos vectores: vectores adenovirales, vectores adenovirales de alta capacidad (HC-Ad o gutless), AAV (vi rus Adenoasociados), Poxvirus, vectores Lentivirales, o vectores virales derivados del virus Herpes simple.
El método de administración usado en los experimentos con ratones, Ia denominada inyección hidrodinámica, cuando se extrapola a animales o seres humanos que tienen pesos corporales superiores debe adaptarse. Una descripción de un método similar a Ia inyección hidrodinámica adaptado a cerdos se describe en Aliño et al. Para los fines de Ia presente invención, el método de administración de las composiciones de terapia génica a seres humanos es una inyección local directamente en el hígado.
Puede observarse un ejemplo de una construcción de ADN comprendida en un vector viral en Ia Figura 10 de Ia presente memoria descriptiva.
Para los fines de Ia presente invención, Ia expresión equivalente biológico funcional de IGF-I puede tener una secuencia idéntica a Ia secuencia que se encuentra de forma natural en IGF-I, pero también puede tener secuencias modificadas que proporcionen una función equivalente a un vector en el que se incorporen dichas secuencias. En particular, dichas modificaciones pueden incluir Ia deleción de secuencias repetitivas ALU de Ia 3' UTR. Éste es sólo un ejemplo y no es limitante. La confirmación experimental de Ia invención que se reivindica se ha realizado en modelos animales experimentales, particularmente en ratones y, por consiguiente, el ADN usado en las construcciones para terapia génica de DT1 codificaba para I GF-I de ratón. Sin embargo, los resultados experimentales logrados pueden extrapolarse a seres humanos y, por Io tanto, para los fines de Ia descripción de Ia presente invención, el término IGF-I se aplica indistintamente a un polipéptido de origen de ratón o humano.
También en una realización preferida, Ia secuencia que codifica IGF-I es una secuencia codificante de IGF-I sintética. Dicha secuencia sintética tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de una secuencia codificante de IGF-I humano natural . Se prefiere que Ia secuencia utilice un uso óptimo de codones; preferiblemente, al menos 50%, 70% o 90% de los codones están optimizados. Por Io tanto, en realizaciones preferidas, Ia secuencia de ADN sintética tiene al menos una identidad de secuencia de 80, 90, 95 ó 99% con Ia secuencia de IGF-I humano natural. En una realización preferida particular, Ia secuencia de ADN sintético tiene una identidad de al menos 95%, más preferiblemente una identidad de al menos 99% y, más preferiblemente, una identidad de 100% con Ia secuencia de IGF-I natural. Además, otra realización del vector anterior puede contener un sistema regulador para ajustar Ia expresión de Ia construcción o cásete de ácido nucleico. La expresión "sistema regulador", como se usa en este documento, se refiere a secuencias que actúan en cis o que actúan en trans incorporados en los vectores anteriores, que regulan en alguna característica Ia expresión del ácido nucleico de interés, así como productos génicos que actúan en trans que se coexpresan en Ia célula con el vector descrito anteriormente. Pueden usarse sistemas reguladores para Ia regulación positiva o negativa de Ia expresión a partir de los niveles normales de expresión o niveles existentes de expresión en el momento de Ia regulación. El sistema contribuye al patrón de expresión temporal del polinucleótido.
Un aspecto relacionado de Ia invención proporciona una formulación de composición farmacéutica para Ia administración y expresión de un gen de IGF-I en una célula, preferiblemente un gen de IGF-I humano. La formulación incluye un vector del aspecto anterior ju nto con u no o más de otros componentes farmacéuticamente aceptables que pueden, por ejemplo, actuar estabilizando el vector o aumentando Ia eficacia de transfección, pero que también pueden proporcionar otras funciones. En una realización preferida, Ia formulación incluye el vector en una solución que tiene polivinilpirrolidona (PVP) a entre aproximadamente 0,5% y 50%, preferiblemente PVP a aproximadamente 5%. Preferiblemente, Ia PVP tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50.000 g/mol. Se describe información adicional en el documento PCT US95/17038. Sin embargo, otro ejemplo de una formulación incluye el vector con un lípido catiónico (por ejemplo, como se describe en Ia Patente de Estados Unidos 4.897.355, expedida el 30 de enero de 1990) y también puede incluir un colípido, tal como un colípido neutro.
Además, para los fines de Ia presente invención, Ia expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a esa cantidad de ingrediente activo que aumenta o disminuye Ia actividad con respecto a Ia actividad que se produce en ausencia de Ia dosis terapéuticamente eficaz. El término "terapéuticamente", para los fines de Ia presente descripción de Ia invención, también incluye Ia prevención de Ia aparición de Ia enfermedad. Por Io tanto, con el fin de Ia presente invención, los términos prevención o tratamiento se refieren a una terapia o tratamiento preventivo que, por un lado, pueden prevenir Ia aparición de Ia enfermedad autoinmune y, por otro lado, pueden detener el avance de una enfermedad autoinmune ya en curso o iniciada, bloqueando los efectos perjudiciales de esa enfermedad autoinmune en el organismo. Para cualquier compuesto, Ia dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, habitualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentraciones apropiado y Ia vía de administración. Dicha información puede usarse después para determinar las dosis y vía de administración útiles en seres humanos.
Puede determinarse Ia eficacia terapéutica y Ia toxicidad, por ejemplo, Ia DE50 (Ia dosis terapéuticamente eficaz en 50% de Ia población) y Ia DL50 (Ia dosis l eta l pa ra 50 % d e I a po b l ación) mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación. La relación de las dosis de efectos tóxicos respecto a terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como Ia relación DL50/DE50.
Se prefieren composiciones farmacéuticas que presentan elevados índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos celulares y estudios animales se usan en Ia formulación de un intervalo de dosificación para uso h umano. La dosificación contenida en dichas composiciones está preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluye Ia DE50, con escasa o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de Ia forma dosificación de empleada, Ia sensibilidad del paciente y Ia vía de administración.
La dosificación exacta se determinará por un profesional competente. La dosificación y Ia administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del ingrediente activo o para mantener el efecto deseado. Los hechos que deben tenerse en cuenta incluyen Ia gravedad de Ia patología, Ia salud general del sujeto, edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación o combinaciones de fármacos, reacciones de sensibilidad y tolerancia/respuesta a Ia terapia. Las cantidades de dosificación normales pueden variar de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de Ia vía de administración. Se proporciona una orientación en Io que se refiere a dosificaciones y métodos de administración particulares en Ia bibliografía y está disponible en general para los profesionales competentes en Ia técnica. Los especialistas en Ia técnica emplearán diferentes formulaciones para nucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De forma similar, Ia administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células, afecciones, localizaciones, etc. particulares. En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, cualquiera de las composiciones farmacéuticas de Ia invención puede administrarse en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados. La selección de los agentes apropiados para usar en una terapia de combinación puede realizarse por un especialista en Ia técnica de acuerdo con principios farmacéuticos convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar sinérgicamente para lograr el tratamiento o Ia prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Usando este enfoque, se puede ser capaz de lograr una eficacia terapéutica con dosificaciones inferiores de cada agente, reduciendo de este modo el potencial de efectos secundarios adversos.
Cualquiera de los métodos terapéuticos descritos anteriormente puede aplicarse a cualquier sujeto que necesite dicha terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos y, más preferiblemente, seres humanos.
Todas las patentes y solicitudes de patente citadas en esta descripción se incorporan expresamente en este documento como referencia en su totalidad. La descripción anterior describe en general Ia presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa por referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan con fines de ilustración solamente, y que no pretenden limitar el alcance de invención.
Depósito de microorganismos de acuerdo con el Tratado de Budapest
Los plásmidos mencionados anteriormente pCAG IGF-I WPRE (SEC ID N°: 1 ) y pCD68 IGF-I (SEC ID N°: 2) se depositaron en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT); Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, Burjasot (Valencia), España, con los números de acceso CECT7560 y CECT7561 , respectivamente, realizándose los depósitos en las Autoridades del Tratado de Budapest con fecha 09-06-09. Descripción de las Figuras
Figura 1. Análisis inmunohistoquímico de Ia expresión de GFP y Mac-2 en secciones de hígado. Veinticuatro horas post-inyección hidrodinámica de los plásmidos CAG, hAAT y CD68 que expresan GFP y 1 semana después de Ia inyección del vector AAV8 CAG GFP WPRE, se examinó Ia tinción con anticuerpos específicos contra Mac-2 en secciones de hígado de ratones. Se detectaron células dobles positivas GFP+/Mac-2+ en hígados de ratones a los que se les inyectaron los plásmidos CAG-GFP y CD68-GFP (A-C, G-I), pero no después de Ia inyección de plásmido hAAT-GFP (D-F). Los vectores AAV8 carecen de tropismo por células de Kupffer, como revelaba Ia ausencia de células GFP+/Mac-2+ en los animales a los que se les inyectó AAV8-CAG-GFP (J-L). Las flechas blancas indican Ia localización de las células de Kupffer. Barras de escala: 18 μm (A-C); 22 μm (D-F); 16 μm (G-I); 24 μm (J-L).
Figura 2. Análisis de Ia expresión de GFP mediante RT-PCR en células CDH b+ separadas. Se inyectó a animales solución salina (B) o 20 μg de pCAG
GFP WPRE (C). Veinticuatro horas post-inyección, se separaron células CDH b+ hepáticas y se extrajo el ARN. Se amplificó una sola banda específica para GFP en el grupo al que se inyectó ADN plasmídico, demostrando que las células no parenquimatosas expresaban el transgén de GFP. En el carril (A) se muestra el marcador de peso molucular.
Figura 3. Análisis por citometría de flujo de Ia expresión de GFP en células hepáticas no parenquimatosas después de inyección hidrodinámica de ADN plasmídico. Se analizaron por citometría de flujo diferentes poblaciones celulares hepáticas en los animales a los que se les inyectó pCAG y AAV8 CAG. Se detectó expresión de GFP en macrófagos -células de Kupffer CDH b+ - (MΦ), células dendríticas CDH c+ (DCs), linfocitos B CD19+ (BCs) y células T CD4+ y CD8+. En todas las poblaciones celulares analizadas, el porcentaje de células GFP+ en animales a los que se les inyectó el plásmido CAG era significativamente superior que las obtenidas de animales a los que se les inyectó el vector AAV8, que eran prácticamente negativas para Ia presencia de GFP. Se muestra un experimento representativo de 4 experimentos independientes. Los resultados son Ia media ± error típico de Ia media (EEM) del número relativo de células GFP+ dentro de cada población, n = 4 ratones por grupo. En el eje Y se representa el % de células GFP+ frente al número de células total.
Figura 4. Prevención de Ia diabetes tipo 1 por expresión hepática de
IGF-I mediante inyección hidrodinámica del plásmido CAG-IGF-I. (A) A ratones
Tg IFNβ se les administraron 5 dosis diarias consecutivas de STZ (25 mg/kg) los días 1-5. Se usaron ratones Tg IFNβ no tratados con STZ como animales control (Con). El día 9, a los ratones STZ-Con se les inyectó hidrodinámicamente el plásmido pVAX1 , que está desprovisto de un cásete de expresión, o 5 μg de un plásmido que codifica IGF-I bajo el control del promotor CAG (STZ-IGF-I). A los ratones se les administró una inyección hidrodinámica por semana durante 10 semanas. Después, se realizó un seguimiento de Ia glucemia de los ratones durante 6 semanas más. Los números indican el número de semanas que duró el tratamiento en el modelo animal murino. En Ia semana 2 se realizó un análisis de Ia replicación de las células B, medida de Ia masa de células B y un análisis de Ia presencia de insulitis en todos los animales del estudio. En Ia semana 6 se realizó un test de tolerancia a glucosa. En Ia semana 8 se midió Ia insulinemia y los niveles séricos de IGF-I en los animales del estudio y en Ia semana 16 se volvió a analizar en todos los animales Ia masa de células B y Ia insulitis que presentaban. La flecha superior indica el seguimiento de los niveles de glucosa (glucemia) que mostraron los animales a Io largo de todo el estudio. (B) La mayoría de los ratones tratados con IGF-I no desarrollaron hiperglucemia después del tratamiento con STZ. Por el contrario, los animales tratados con un plásmido vacío (STZ-Con) se volvieron altamente hiperglucémicios en las primeras semanas después de Ia administración de STZ. Los animales no tratados con STZ (Con) mantuvieron Ia normoglucemia. Los valores se muestran como Ia media ± EEM. Sólo se muestran los animales normoglucémicos en ambos grupos STZ-IGF-I. El final de Ia readministración de pIGF-l se indica mediante una línea de puntos. El eje Y representa Ia concentración de glucemia expresada en mg/dl y el eje X el tiempo expresado en semanas. (C) En ratones STZ-Con, Ia incidencia diabetes alcanzaba 90% (15/17) a Ia semana 8, mientras que los animales tratados con IGF-I mostraban una clara resistencia al desarrollo de hiperglucemia: 83% (19/23) de animales eran normoglucémicos en el grupo STZ-IGF-I tratado con 05 μg de ADN plasmídico. Ninguno de los animales Con (no tratados con STZ) se volvió diabético (0/19). Los animales se consideraban diabéticos cuando 2 mediciones consecutivas de glucosa en sangre estaban por encima de 250 mg/dl. Los resultados que se muestran son representativos de 3 experimentos independientes. El final de Ia readministración de pIGF-l se indica mediante una línea de puntos. El eje Y representa el % de animales diabéticos y el eje X el tiempo expresado en semanas. Figura 5. Análisis de Ia infiltración linfocitaria en islotes pancreáticos después del tratamiento con IGF-1. (A) Cuantificación de los islotes pancreáticos que presentaban infiltrado linfocitario. Los niveles de insulitis se determinaron en animales control (barras blancas) y en animales tratados con STZ (barras negras) y con STZ-IGF-I (barras grises) después de 15 días de tratamiento. El eje Y representa el porcentaje de infiltración linfocitaria en los islotes pancreáticos de muestras de dichos animales. El grado de infiltración se midió utilizando el siguiente ranking: no infiltrado (0); peri-insulitis (<25%); insulitis moderada (<50%); insulitis severa (>50%). *p<0.05 vs STZ-control. (B) La insulitis se cuantificó 15 días después del tratamiento con STZ mediante citometría de flujo. El porcentaje de células infiltrantes T CD4+ y T CD8+ se redujo en los animales tratados con pCAG IGF-I. Los resultados muestran Ia media± EEM de 3 animales por grupo. *p<0.05 vs Con. # p<0.05 vs STZ-con. En los ejes Y de cada una de las gráficas se representa el porcentaje de células CD1 1 b+, CD4+ y CD8+ respectivamente. (C) Detección mediante inmunohistoquímica de Ia insulina presente en secciones tisulares pancreáticas de animales control no tratados con STZ (Con), animales control tratados con STZ (STZ-Con) y de animales tratados con STZ-IGF-I, a las dos semanas (1 ) y a los 4 meses (2) de comienzo del tratamiento. Maginificación 100x Figura 6. Análisis de Ia apoptosis y replicación de células β, de Ia masa de células β y de los niveles circulantes de insulina e IGF-I. (A) Dos semanas después de Ia inyección de STZ, se determinó el porcentaje de células β apoptóticas en ratones no tratados con STZ (Con), en tratados con STZ (STZ-Con) y en tratados con STZ a los que se les administró plásmido codificante para IGF-I (STZ CAG IGF-I). Los resultados son Ia media ± EEM de cuatro ratones por grupo. (* p < 0,05 frente a Con. # p < 0,05 frente a STZ-Con). El eje Y representa el porcentaje de células β apoptóticas. (B) Se realizó un análisis de Ia replicación de células β en ratones Con, STZ-Con y STZ CAG IGF-I 2 semanas después del tratamiento con STZ. Se inmunotiñeron tres secciones pancreáticas por animal contra insulina y Ki67 y se determinó Ia frecuencia de núcleos de células β positivos para Ki67. Los resultados son Ia media ± EEM de cuatro ratones por grupo. (# p < 0,05 frente a STZ-Con). El eje Y representa el porcentaje de células β Ki67+. (C) Se midió Ia masa de células β en ratones no tratados con STZ (Con) y tratados con STZ a los que se les inyectó plásmido vacío (STZ-Con) y tratados con IGF-I (STZ IGF-I ) a los cuatro meses después de Ia administración de STZ. Se analizaron nueve secciones pancreáticas de cada ratón individual. Los resultados son Ia media ± EEM de 4 animales por grupo. (* p < 0,05 frente a Con). El eje Y representa Ia masa de células β en porcentaje respecto a los animales control. (D) Se midió Ia insulinemia 7 semanas después de Ia primera administración de IGF-I mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los animales tratados con IGF-I normoglucémicos mantenían valores de insulina normales mientras que los animales STZ-Con tenían niveles muy bajos de Ia hormona. Los resultados se expresan como Ia media ± EEM de 4 animales por grupo. (* p < 0,05 frente a Con). El eje Y representa Ia concentración de insulina expresada como ng/ml. (E) Los niveles de IGF-I en suero a las 7 semanas después de Ia primera administración de IGF-I, medidos por ELISA, no mostraban diferencias entre grupos. Los resultados son Ia media ± EEM de 4 animales por grupo. El eje Y representa los niveles séricos de IGF-I expresados como ng/ml. Figura 7. Incidencia acumulativa de diabetes después de Ia inyección
HTV de un plásmido que expresa IGF-I bajo el control de un promotor específico de hepatocitos (phAAT -IGF-I). (A) Se extrajo el ARN total del hígado 24 h después de Ia inyección hidrodinámica de 5 μg de phAAT IGF-I y se retrotranscribió a ADNc. Se usaron cebadores específicos para detectar mediante RT-PCR Ia expresión de IGF-I procedente de plásmido después de Ia inyección hidrodinámica. En carril 1 muestra el marcador de peso molecular. El carril 2 muestra los resultados en animales control inyectados con solución salina y en el carril 3 se muestran los resultados de los animales inyectados con phAAt-IGF-l. (B) La incidencia acumulativa de diabetes alcanzó aproximadamente 90% (13 de 14 animales) en ratones STZ-Con a las 2 semanas post-tratamiento con STZ. Los animales que expresaban IGF-I bajo el control de un promotor específico de hepatocitos no mostraban prevención de Ia diabetes (12/12). Los animales se consideraban diabéticos cuando 2 mediciones consecutivas de glucosa en sangre estaban por encima de 250 mg/dl. Se muestra un experimento representativo de 3 experimentos separados. La supresión del tratamiento con IGF-I se indica mediante una línea de puntos. En el eje X se representa el tiempo expresado en días y en el eje Y el porcentaje de incidencia acumulativa de diabetes. Figura 8. Incidencia acumulativa de diabetes después de Ia inyección hidrodinámica de un plásmido que expresa IGF-I bajo el control de un promotor específico de células mieloides (pCD68-IGF-l). (A) Se extrajo ARN total del hígado 24 h después de Ia inyección hidrodinámica de 5 μg de pCD68 IGF- I y se retrotranscribió en ADNc. Se usaron cebadores específicos para detectar mediante RT-PCR Ia expresión de IGF-I procedente de plásmido después de Ia inyección hidrodinámica. En carril 1 muestra el marcador de peso molecular. El carril 2 muestra los resultados en animales control inyectados con solución salina y en el carril 3 se muestran los resultados de los animales inyectados con pCD68 IGF-I. (B) La incidencia acumulativa de diabetes alcanzó 90% a Ia semana 6 en ratones STZ-Con (9 de 10 ratones). Los animales que expresaban IGF-I bajo el control del promotor CD68 estaban protegidos de Ia enfermedad ya que sólo 40% (5/12) de ellos se volvió diabético a Ia semana 6 post-STZ. Ninguno de los ratones no tratados con STZ desarrolló hiperglucemia. Los animales se consideraban diabéticos cuando 2 mediciones consecutivas de glucosa en sangre estaban por encima de 250 mg/dl. Se muestra un experimento representativo de 2 experimentos separados. En el eje X se representa el tiempo expresado en días y en el eje Y el porcentaje de incidencia acumulativa de diabetes. Figura 9. Porcentaje de células T reguladoras (Treg) después del tratamiento con pIGF-l e incidencia acumulativa de diabetes después de Ia depleción de células Treg. Un mes después de Ia inducción de diabetes, se aislaron y se analizaron mediante citometría de flujo linfocitos intrahepáticos (A), intrapancreáticos (B) e intraesplénicos (C), después de Ia tinción con anticuerpos específicos contra CD4, CD25 y GITR. El porcentaje de Treg en el hígado y el páncreas de ratones tratados con IGF-I estaba aumentado mientras que las Treg intraesplénicas permanecían sin cambios. Los valores se muestran como Ia media ± EEM. n = 4 animales por grupo. En el eje Y de las gráficas (A), (B) y (C) se representa el porcentaje de células CD25+GITR+ frente a las células CD4+. (D) La depleción de células Treg CD4+ CD25+ usando anticuerpo monoclonal anti-CD25 dio como resultado Ia pérdida de los efectos protectores de IGF-I ya que 100% de los animales tratados con pIGF-l eran diabéticos el día 30 post-STZ. Más de 80% de los animales a los que se les administró suero de conejo como control (NRS), así como plásmido vacío, también desarrollaron Ia enfermedad. Sólo una tercera parte de los animales pIGF-l + NRS se volvieron diabéticos, n = 5-6 ratones por grupo. En el eje X se representa el tiempo expresado en días y en el eje Y el porcentaje de incidencia acumulativa de diabetes.
Figura 10. Representación esquemática de las construcciones que codifican para Ia expresión de GFP. De Ia parte superior a Ia parte inferior se presentan los plásmidos pCAG, phAAT y pCD68 usados para estudios de expresión de genes indicadores. Debajo de estos está el vector AAV8-CAG. El promotor CAG es un promotor híbrido compuesto por el potenciador temprano/intermedio de CMV, el promotor de β-actina del pollo y el primer intrón del gen de Ia β-globina humana. Se expresa de forma ubicua. El promotor hAAT es un promotor híbrido compuesto por el potenciador de Ia región de control de hepatocitos (HCR) de Ia apolipoproteína E y el promotor de α-antitripsina humano. Su expresión se limita a hepatocitos. La proteína CD68 es un marcador clásico de macrófagos. Su expresión debería limitarse principalmente a células de Kupffer. Los vectores no están a escala.
Figura 11. Representación esquemática de las construcciones que expresan IGF-I. De Ia parte superior a Ia parte inferior se presentan los plásmidos pCAG, phAAT y pCD68 usados para estudios sobre las acciones preventivas de IGF-I para Ia diabetes tipo 1. Los vectores no están a escala.
Descripción detallada de Ia invención
Como se ha descrito anteriormente, se desarrolló un enfoque de terapia génica en Ia presente invención en el que Ia administración hepática de un plásmido que expresa IGF-I conduce a Ia prevención del desarrollo de hiperglucemia diabética en un modelo de diabetes autoinmune en ratón. La interrupción del ataque inmune contra las células β pancreáticas en los animales tratados con IGF-I impide Ia pérdida de masa de células β observada en ratones diabéticos y, por Io tanto, se mantienen los niveles de insulina circulante.
La síntesis de IGF-I se realiza en Ia presente invención, procedente de vectores que comprenden un promotor adecuado para Ia expresión en células hepáticas. Son vectores preferidos plásmidos que comprenden CAG o CD68 como promotores adecuados, dando como resultado un suministro constante de IGF-I. Además, en Ia presente invención, se consigue el uso preventivo de IGF-I administrando una vez por semana una inyección hidrodinámica de una solución que lleva un plásmido que contiene Ia información genética necesaria para que las células produzcan IGF-I. Se estableció en Ia presente invención un tratamiento que consistía en una administración de ADN por semana, en contraste con las inyecciones diarias usadas por otros en el estado de Ia técnica. La presente invención demostraba que los animales alcanzaban una protección completa frente a DT1 después de 10 administraciones de un plásmido que codifica IGF-I, incluso después de que se retirara el tratamiento. Estos puntos adquieren un interés especial cuando se tiene en cuenta que Ia prevalencia de Ia diabetes está aumentando rápidamente en los países en desarrollo, en los que los tratamientos repetidos con insulina son habitualmente demasiado costosos e inaccesibles para muchos pacientes, dando origen a una carga sanitaria, social y económica muy importante.
Uno de los puntos más importantes de Ia presente invención es que Ia terapia con IGF-I disminuía Ia incidencia de diabetes: 90% de los ratones desarrollaron diabetes en el grupo STZ-Control mientras que 80% de los animales en el grupo tratado con IGF-I no desarrollaron Ia enfermedad. Sin embargo, un pequeño porcentaje de los animales tratados con IGF-I se volvieron diabéticos. Por Io tanto, el tratamiento con IGF-I no retrasa Ia aparición de Ia enfermedad sino que disminuye Ia incidencia de Ia DT1. De forma importante, después de un periodo de tratamiento semanal que se ha estimado en 10 semanas, los animales están completamente protegidos de Ia enfermedad y no desarrollan diabetes cuando se retira el tratamiento.
La invención, que usa IGF-I, conduce a una intervención en el sistema inmune que tiene como resultado final Ia interrupción del ataque autoinmune contra los islotes pancreáticos por infiltración de células T CD4+ y CD8+, probablemente a través de Ia implicación de células T reguladoras (Treg). Esto conduce a Ia protección frente a Ia diabetes autoinmune. Además, los resultados de los experimentos demuestran que el IGF-I no previene Ia aparición de Ia diabetes cuando las células T reguladoras se han reducido por medio de un anticuerpo específico. Estas observaciones relacionan el efecto protector logrado por IGF-I con Ia presencia de células T reguladoras. Las células Treg son una subpoblación especializada de células T que actúan suprimiendo Ia activación del sistema inmune y, por Io tanto, mantienen Ia homeostasis del sistema inmune y Ia tolerancia a autoantígenos. Los recientes avances en Ia caracterización molecular de esta población celular han establecido firmemente su existencia y su papel crítico en el sistema inmune de vertebrados. Se ha aumentado el interés en las células T reguladoras por indicios en modelos experimentales en ratón que demuestran que el potencial inmunosupresor de estas células puede aprovecharse terapéuticamente para tratar enfermedades autoinmunes.
Considerando todos estos resultados, se sugiere que este enfoque sería ventajoso para todas aquellas enfermedades autoinmunes en las que esté implicado en el desarrollo del trastorno un ataque de las células inmunes (tales como células T CD4+ y CD8+) al órgano diana.
Son ejemplos Ia diabetes tipo 1 (Kukreja et al., 2002; Lindley et al., 2005), esclerosis múltiple (Viglietta et al., 2004), vasculitis autoinmune (Boyer et al., 2004), artritis reumatoide (AR) (Cao et al., 2003) e histiocitosis de células de Langerhans (LCH) (Senechal et al., 2007), enfermedad de injerto contra huésped (Cohén y Boyer, 2006), síndrome proliferativo autoinmune de tipo Il (Kriegel et al., 2004), aterosclerosis (George, 2008), enfermedad de Crohn (Ricciardelli et al., 2008), miastenia gravis (Meriggioli et al. , 2008), psoriasis (Sugiyama et al., 2005), enfermedad de Grave (Pan et al., 2009), miositis (Banica et al., 2009), colitis ulcerosa (Holmen et al., 2006) y lupus eritematoso (Kuhn et al., 2009; Valencia et al., 2007), espondilitis anquilosante (Forger et al., 2009), uveítis (Chen et al., 2008), cirrosis biliar primaria (Lan et al., 2006) y hepatitis autoinmune (Vergani y Mieli- Vergana, 2008).
Los ejemplos en modelos animales incluyen Ia encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (Luth et al., 2008), gastritis autoinmune experimental (EAG) (McHugh, 2005), enfermedad similar a lupus eritematoso (Kuhn et al., 2009), diabetes tipo 1 (Chen et al., 2005; Setoguchi et al., 2005), colitis ulcerosa (Denning et a l . , 2005), miastenia gravis experimental (Sheng et al ., 2008), miositis autoinmune experimental (Allenbach et al., 2009) y uveítis (Matta et al., 2008).
En resumen, Ia presente invención muestra un enfoque de terapia génica en el que Ia administración hepática de un vector que exprese IGF-I conduce a Ia protección frente al desarrollo de hiperglucemia diabética u otras enfermedades autoinmunes tanto en seres humanos como modelos de diabetes autoinmune en ratón. La interrupción del ataque inmune contra las células β pancreáticas en los animales tratados con IGF-I impide Ia pérdida de masa de células β observada en ratones diabéticos y, por Io tanto, se mantienen los niveles de insulina circulante. Se considera que esta protección frente a Ia enfermedad está mediada, al menos en parte, por un aumento en el porcentaje de células Treg tanto intrahepáticas como intrapancreáticas, ya que una depleción mediada por anticuerpos de esta población impide Ia prevención de Ia enfermedad inducida por IGF-I.
Por Io tanto, Ia primera realización de Ia presente invención se refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para IGF-I y un promotor adecuado para expresar dicho IGF-I en células hepáticas. Se seleccionan promotores preferidos tales como CAG o CD68. En una realización preferida de Ia invención, Ia construcción de ADN consiste en el plásmido pCAG IGF-I WPRE caracterizado por Ia SEC I D N°: 1 o el plásmido pCD68 I GF-I caracterizado por Ia SEC ID N°: 2.
La segunda realización de Ia invención se refiere al uso de d icha construcción de ADN para Ia fabricación de composiciones farmacéuticas activas para tratar Ia DT1 o cualquier otra enfermedad autoinmune, particularmente, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes causadas por Ia disfunción o Ia desregulación de células Treg.
La tercera realización de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia construcción de ADN mencionada anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los excipientes, sustancias vehículo y sustancias auxiliares deben ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables, de modo que puedan combinarse con otros compuestos de Ia formulación o preparación y no tengan ningún efecto adverso sobre el organismo tratado. Las composiciones o formulaciones farmacéuticas incluyen las que son adecuadas para administración oral o parenteral (incluyendo su bcutánea, intradérmica, intramuscu lar e intravenosa), aunque Ia mejor vía de administración depende de Ia afección del paciente. Las formulaciones pueden estar en forma de dosis individuales. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de Ia farmacología. Las cantidades de sustancias activas a administrar pueden variar de acuerdo con las particularidades de Ia terapia.
La cuarta realización de Ia invención se refiere a un método para tratar o prevenir Ia DT1 o cualquier otra enfermedad autoinmune que comprende Ia administración al paciente de Ia composición citada. El método se caracteriza por que Ia composición se administra al paciente por inyección hidrodinámica una vez por semana, o incluso una vez por tratamiento. El método era capaz de reducir hasta 20% Ia incidencia de Ia DT1 y proporcionar una protección completa frente a DT1 después de 10 administraciones. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se centran en ilustrar Ia invención, sin limitar su alcance, y en demostrar algunos fenómenos importantes. En primer lugar, las células hepáticas no parenquimatosas del hígado (NPC) y las células parenquimatosas eran capaces de expresar el transgén después del procedimiento de inyección hidrodinámica por vena de Ia cola. En segundo lugar, Ia inyección hidrodinámica de un plásmido que codifica IGF-I conduce a Ia prevención de Ia DT1 en un modelo de diabetes autoinmune en ratón. En tercer lugar, Ia administración de IGF-I en Ia circulación de tejidos musculares o hepáticos no es suficiente para prevenir Ia diabetes autoinmune en el modelo de RIP/hIFNβ.
Ejemplo 1. Ratones transgénicos
Se usaron ratones CD1 transgénicos (generación N 10) que expresan interferon beta (IFN-β) humano en células β. Todos los experimentos se realizaron en ratones transgénicos macho. Se administró a ratones transgénicos, 5 días consecutivos, una inyección intraperitoneal de STZ (25 mg/kg peso corporal), disuelta en tampón citrato 0,1 mol/l (pH 4,5) inmediatamente antes de Ia administración. Los ratones se alimentaron ad limitum con una dieta convencional y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (las luces se encendían a las 8:00 A.M.). Los procedimientos de cuidado y experimentación animal estaban aprobadas por el Comité de Ética en Experimentación Animal y Humana de Ia Universitat Autónoma de Barcelona.
Ejemplo 2. Inmunohistoquímica e histopatología
Los tejidos se fijaron durante 12-24 h en formalina, se embebieron en parafina y se seccionaron. Para Ia detección inmunohistoquímica, las secciones se incubaron durante una noche a 40C con anticuerpos específicos para cada proteína, se lavaron con PBS 3 x 5 min y se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes. Para Ia detección de fluorescencia, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo durante 1 h a temperatura ambiente y los núcleos se contratiñeron con Topro o Hoechst. Para las detecciones en campo claro, se reveló mediante el uso del complejo ABC (Vector Laboratories, Reino Unido) que emplea 3'3'-diaminobenzidina (DAB) como sustrato cromógeno. Las secciones se contratiñeron en hematoxilina de Mayer. Para Ia detección inmunohistoquímica de insulina, glucagón, somatostatina y proteínas polipeptídicas pancreáticas, se fijaron páncreas durante 12-24 h en formalina, se embebieron en parafina y se seccionaron. Las secciones se incubaron después durante una noche a 40C con anticuerpo de cobaya anti-insulina porcina (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a una dilución 1 :100, con anticuerpo de conejo anti-glucagón humano (Signet Labs, Dedham, MA) a una dilución 1 :4.500, con anticuerpo de conejo anti- somatostatina humana (Serotec, Oxford, Reino Unido) a una dilución 1 :750 o con anticuerpo de conejo anti-polipéptido pancreático humano (ICN Biomedicals) a una dilución 1 :2.000. Como anticuerpos secundarios, se usó IgG de conejo anti-cobaya acoplada a peroxidasa (Dako, Glostrup, Dinamarca) o anticuerpo de cabra anti- conejo biotinilado (Pierce, Rockford, I L) y complejo ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
La incidencia y Ia gravedad de Ia insulitis se analizó en 3 secciones de parafina por páncreas separadas por 100-150 μm, teñidas contra insulina usando el anticuerpo mencionado anteriormente (sección 1 .3) y contrateñidas con hematoxilina. El grado de infiltración de células mononucleares (porcentaje de insulitis) se midió usando las siguientes clasificaciones: no infiltrado, peri-insulitis (células mononucleares rodeando islotes y conductos pero sin infiltración de Ia arquitectura del islote), insulitis moderada (células mononucleares infiltrando <50% de Ia arquitectura del islote) e insulitis grave (>50% del tejido del islote infiltrado por linfocitos y/o pérdida de Ia arquitectura del islote).
Ejemplo 3. Análisis morfométrico y determinación de Ia masa de células β
Se obtuvieron páncreas de ratones transgénicos y se realizó Ia detección inmunohistoquímica de insulina en tres secciones (2-3 μm), separadas por 200 μm. El área (en micrómetros cuadrados) de cada islote y el área de cada sección se determinaron usando un microscopio Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokio, Japón) conectado a una cámara de vídeo con un monitor en color y un analizador de imágenes (analySIS 3.0; Soft Imaging System, Lakewood, CO). El porcentaje de área de células β en el páncreas se calculó dividiendo el área de todas las células positivas para insulina en una sección por el área total de esta sección y multiplicando el resultado por 100. La masa de células β se calculó multiplicando el peso del páncreas por el porcentaje del área de células β.
Se midió Ia replicación de células β mediante el análisis inmunohistoquímico del marcador Ki67. Ki67 se expresa a bajos niveles durante Ia fase G1 inicial y se acumula durante las fases S, G2 y M siguientes del ciclo celular, por Io tanto se usa habitualmente como marcador de replicación.
Las muestras se desparafinaron y se trataron con Proteinasa K (10 μg/ml) con Tris/HCI, pH 7,6, durante aproximadamente 10 min a 370C y se permeabilizaron con Tritón X (0,1 %) en PBS durante 2 min. Por último, se realizó una tinción doble usando anticuerpo contra insulina (1 :100) y anticuerpo contra Ki67 (1 :200) para detectar Ia replicación de células β. Estos anticuerpos primarios y sus anticuerpos secundarios, junto con Ia estreptavidina marcada y Hoechst (usado para contrateñir los núcleos y descartar células falsas positivas) se describen en Ia Sección 3 de este capítulo. Se contaron al menos 1000 núcleos de células β de islotes por páncreas y se examinaron cuatro animales por grupo.
Se identificaron cél u las a poptóticas en secciones pancreáticas desparafinadas usando mareaje del extremo libre por dUTP mediado por transferasa (TÚNEL) (kit de detección de muerte celular in situ; Roche Molecular Biochemicals). Ninguna célula β se tiñó con un combinado de anticuerpos (anti- glucagón, anti-somatostatina y anti-polipéptido pancreático). Los núcleos se contratiñeron con Hoechst (Sigma Chemical). Se consideraba Ia célula β apoptótica cuando era positiva para TÚNEL y negativa para Ia tinción con un combinado de anticuerpos. En estas secciones, Ia capa de células no β mostraban una tinción citosólica roja, mientras que las células positivas para TÚNEL tenían núcleos verdes. Se contaron al menos 1000 núcleos de células β de islotes por páncreas y se examinaron 4 animales por grupo.
Ejemplo 4. Análisis por Citometría de Flujo
Para el análisis mediante citometría de flujo de células hepáticas no parenquimatosas y células esplénicas, se disgregaron mecánicamente los hígados y bazos obtenidos de ratones de control y tratados usando Ia porción plana de un émbolo de una jeringa de 10 mi. El homogeneizado se pasó después a través de filtros de pre-separación de poro de 30 μm (Milteny Biotec) para obtener una suspensión de una sola célula. La suspensión celular se recubrió suavemente sobre un Histopaque-1.083 (Sigma-Aldrich) y se centrifugó a 800 g durante 20 min. Se recogieron las células no parenquimatosas de Ia interfaz. Se obtuvieron linfocitos intrapancreáticos de ratones de control y tratados después de Ia digestión enzimática con colagenasa, rotura mecánica y purificación mediante gradiente de densidad discontinuo, usando un Histopaque-1.083 (Sigma-Aldrich). Se usaron los siguientes mAb conjugados para Ia tinción celular: anti-CD11 b marcado con PE y marcado con PE-Cy7 (M1/70), anti-CD4 marcado con PE (GK 1 .5), anti-CD8 (53-6.7), anti-CD19 (6D5), anti-F4/80 conjugado con FITC (BM8), anti-CD49 conjugado con PE (BioLegend) anti-CD25 conjugado con FITC, anti- GITR conjugado con PE-CY7 (YGITR765), anti-CD1 1 c conjugado con PE (HL3) (BD Pharmingen). Anticuerpos del mismo isotipo sirvieron como controles. Los datos se obtuvieron en un citómetro FC 500 MPL de doble láser (Beckman Coulter).
Ejemplo 5. PCR
Se usó una PCR convencional para detectar Ia expresión de GFP en células de Kupffer separadas por FACS y Ia de IGF-I procedente de plásmido en hígado total, usando Ia ADN Polimerasa GoTaq® (Promega, Estados Unidos). Se usaron los siguientes cebadores: SEC ID N°: 3 (cebador GFP Fw), SEC ID N°: 4 (cebador GFP Rv), SEC ID N°: 5 (cebador IGF-I Fw) y SEC ID N°: 6 (cebador IGF-I Rv).
Ejemplo 6. Inyección hidrodinámica en Ia vena de Ia cola
Se realizó una inyección hidrodinámica por Ia vena de Ia cola como se describe en Liu et al., 1999. Se diluyó ADN plasmídico en solución salina en un volumen (mi) igual a -10% del peso corporal medio de los animales (gramos), y se inyectó manualmente en Ia vena lateral de Ia cola en menos de 5 segundos. Antes de Ia inyección, los animales se colocaron bajo una lámpara de calor infrarroja de 250 W durante unos pocos minutos para dilatar los vasos sanguíneos y facilitar Ia observación y un acceso más sencillo a Ia vena de Ia cola. Se usó un dispositivo de inmovilización de plástico (Harvard Apparatus) para sujetar bien al animal para Ia inyección. No se usó anestesia ya que no es necesario siempre que se emplee un dispositivo de inmovilización apropiado. Se usaron agujas hipodérmicas de calibre 26G de 9,525 mm (3/8 pulgadas) (BD), el calibre de aguja más grande posible que encaja perfectamente en Ia vena de acceso para inyectar a los animales. Ejemplo 7. Análisis estadístico
Se realizaron análisis estad ísticos usando el programa informático
GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, Estados Unidos). Todos los datos se muestran como media ± EEM a menos que se indique otra cosa. Cuando los datos seguían una distribución normal, se usó una prueba t para muestras independientes para comparar entre 2 grupos. La significación estadística se ajustó a P < 0,05. Ejemplo 8. Análisis de Ia transfección hepática después del procedimiento hidrodinámico
La inyección hidrodinámica en Ia vena de Ia cola de ADN plasmídico es una herramienta potente para transferencia de genes al hígado de ratón. Consiste en una inyección en Ia vena de Ia cola en 5 segundos de solución fisiológica, que contiene ADN plasmídico, equivalente a 8-10% del peso corporal. A pesar del gran porcentaje de células hepáticas que pueden transfectarse con este método, todos los datos publicados hasta Ia fecha describían que Ia transfección del plásmido suministrado se limitaba a hepatocitos (Budker et al, 2006). Sin embargo, en sus análisis de expresión, Budker y colaboradores no usaron anticuerpos específicos contra células no parenquimatosas para identificar inequívocamente las células no parenquimatosas transducidas como tales. Para caracterizar completamente el repertorio de células hepáticas transducidas, y aprovechando el uso de técnicas sensibles, tales como un análisis inmunohistoquímico específico, se analizó a continuación si también podían transfectarse otros tipos de células hepáticas después del procedimiento de inyección hidrodinámica. Se inyectaron ratones usando una serie de construcciones diferentes que expresan GFP bajo el control de promotores ubicuos o específicos de células, como se resume en Ia Tabla 1. Se usaron las siguientes construcciones: a) un plásmido que codifica GFP bajo el control de un promotor ubicuo (pCAG GFP WPRE); b) un plásmido que codifica GFP bajo el control de un promotor específico de hepatocitos (phAAT GFP WPRE); c) un plásmido que codifica GFP bajo el control de un promotor específico de células mieloides (pCD68 GFP), y d) un vector de AAV8 que codifica GFP bajo el control de un promotor ubicuo (AAV8 CAG GFP WPRE). Se sacrificaron los ratones 24 horas post-inyección de plásmido o 5 días después de Ia inyección de AAV8. Los hígados se extirparon y se tiñeron secciones hepáticas para detectar Ia presencia de GFP en hepatocitos o células de Kupffer (células Mac2+). La Figura 1 muestra que, aparte de los hepatocitos, algunas células de Kupffer Mac-2+ también eran GFP+ después de Ia inyección HTV de pCAG GFP WPRE (A-C), sugiriendo Ia transfección de células de Kupffer. Después de Ia inyección de phAAT GFP WPRE, como se esperaba, se observaron muchos hepatocitos GFP+, pero no se detectaron células de Kupffer GFP+. Después de Ia administración de pCD68 GFP, no se observaron hepatocitos GFP+, pero podían detectarse muchas células de Kupffer GFP+ (G-I). Por último, después de Ia inyección de AAV8 GFP WPRE, las células de Kupffer permanecían negativas para GFP, mientras que un porcentaje importante de los hepatocitos eran positivos para GFP (J-L).
Tabla 1
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Se muestran los mapas de cada plásmido correspondiente en las Figuras 10-11 para cada una de las construcciones representadas en Ia Tabla 1.
Ejemplo 9. Análisis de Ia expresión de GFP en células de Kupffer separadas por FACS.
Puesto que las células de Kupffer (KC) eliminan fragmentos de desecho grandes e insoluoles por fagocitosis, parte de Ia positividad para GFP después de Ia inyección del plásmido pCAG GFP WPRE detectada en KC podría ser el resultado de Ia fagocitosis de GFP procedente de hepatocitos. Sin embargo, después de Ia administración del vector AAV8-CAG-GFP no se detectaron células de Kupffer GFP+ (Figura 1 J-L). No obstante, para descartar esta posibilidad, se separaron por FACS células CDH b+ de homogeneizados de hígado enriquecidos en células no parenquimatosas después de Ia inyección hidrodinámica del plásmido pCAG GFP WPRE. Posteriormente se realizó un análisis por RT-PCR en estas células separadas para detectar Ia expresión del transcrito de GFP 24 horas después de Ia inyección hidrodinámica. Como se muestra en Ia Figura 2, las células CDH b+ expresaban el transgén después del procedimiento de inyección hidrodinámica. Esta es Ia primera prueba descrita de que Ia inyección hidrodinámica de plásmido puede transfectar eficazmente células hepáticas no parenquimatosas. Ejemplo 10. Análisis mediante citometría de flujo de células hepáticas no parenquimatosas transducidas después de una inyección hidrodinámica de plásmido
Aparte de células hepáticas endoteliales sinusoidales (LSEC) y de células de Kupffer, los sinusoides hepáticos también albergan células dendríticas residentes y una población heterogénea de linfocitos intrahepáticos , que contiene Ia subpoblación de células pit cells que representan células asesinas naturales (NK) específicas del hígado. Para caracterizar completamente el repertorio de NPC hepáticas que podrían transfectarse después del procedimiento de inyección hidrodinámica, se realizó un análisis por citometría de fl ujo. Se inyectó hidrodinámicamente a ratones 20 μg de pCAG-GFP WPRE, se sacrificaron 24 horas después y se aislaron células hepáticas no parenquimatosas. También se inyectó a un conjunto de animales 2,5 x 1011 genomas virales/animal de AAV8 CAG GFP WPRE y los hígados se extirparon 7 días post-inyección. Las células no parenquimatosas se tiñeron con anticuerpos específicos para los distintos tipos de células hepáticas: CD11 b para KC; CD11 b para DC, CD19 para linfocitos B; CD4 y CD8 para linfocitos T. Se realizó un análisis por citometría de flujo para detectar Ia presencia de células GFP+. Aproximadamente 20% de las células de Kupffer y linfocitos B intrahepáticos y de 5 a 10% de las células dendríticas y linfocitos T eran GFP+ después de Ia inyección hidrodinámica del plásmido CAG GFP WPRE (Figura 3). Confirmando las observaciones histoquímicas previas, no se detectaron mediante citometría de flujo células de Kupffer GFP+ ni otros tipos de células no parenquimatosas GFP+ después de Ia inyección del vector adenoasociado. Ejemplo 11. Niveles de glucosa en sangre después del tratamiento con pCAG IGF-I
Para examinar si Ia expresión de IGF-I exógeno en el hígado podía prevenir Ia DT1 , se trataron ratones Tg IFNβ semanalmente con un plásmido que expresaba IGF-I bajo el control del promotor ubicuo CAG. Los ratones Tg IFNβ expresan interferón β humano en células β pancreáticas. Estos ratones desarrollan una diabetes manifiesta con infiltración linfocítica de los islotes cuando se tratan con dosis muy bajas de estreptozotocina, que no inducen diabetes en ratones de control (Casellas et al., 2006; Pelegrin et al., 1998). Se ha demostrado previamente que Ia expresión local en células β de IGF-I previenen Ia infiltración de los islotes y Ia muerte de células β en estos ratones Tg IFNβ (Casellas et al., 2006). Se indujo una diabetes experimental por administración de inyecciones diarias de 25 mg/kg de estreptozotocina (STZ) durante 5 días consecutivos. Siete días después de Ia primera administración de STZ, se inyectó hidrodinámicamente un plásmido que dirigía Ia expresión de IGF-I bajo el control del promotor ubicuo CAG, semanalmente durante 10 semanas. El diseño experimental se indica en Ia Figura 4A.
Después de Ia inyección del plásmido, se midieron los niveles de glucosa en sangre semanalmente durante 16 semanas. Antes del tratamiento con STZ, todos los animales eran normoglucémicos. Los animales que no recibieron el tratamiento con STZ (Con) permanecieron normoglucémicos. Después del tratamiento con STZ, los niveles de glucosa en sangre aumentaron por encima de 500 mg/dl en los animales tratados con un plásmido no codificante (STZ-Con) mientras que aproximadamente 80% de los ratones tratados con STZ que recibieron el tratamiento semanal con pIGF-l permanecieron normoglucémicos durante Ia duración total del experimento, incluso después de interrumpir el tratamiento con IGF-I a Ia semana 10 post-STZ (Figura 4B).
Cuando se midió Ia incidencia de diabetes ratones, se descubrió que 90% de los animales eran diabéticos 8 semanas post-STZ en el grupo tratado con plásmido no codificante (grupo STZ-Con), mientras que 83% de los animales no desarrollaron diabetes cuando se trataron con 5 μg de pCAG IGF-I (Figura 4C). Un animal se consideraba diabético cuando 2 mediciones consecutivas de Ia glucemia estaban por encima de 250 mg/dl.
Estos resultados indicaban que Ia expresión hepática de IGF-I después de Ia inyección hidrodinámica era capaz de prevenir el desarrollo de hiperglucemia en un modelo de diabetes tipo 1 en ratón.
Ejemplo 12. Análisis de Ia infiltración linfocítica de islotes pancreáticos.
Se midió Ia insulitis 4 meses después del tratamiento con STZ y el grado de insulitis en los ratones tratados con IGF-I normoglucémicos era similar al observado en ratones de control no tratados con STZ (Figura 5A).
También se determinó Ia infiltración linfocítica de los islotes mediante citometría de flujo. Se realizó una cuantificación relativa de los linfocitos infiltrantes
(T CD4+ y T CD8+) y macrófagos (CDH b+) 2 semanas después de Ia primera inyección de STZ. Se descubrió un aumento significativo de células T CD4+ y CD8+ en el páncreas de ratones STZ-Con cuando se comparaba con animales control no tratados con STZ. En el grupo IGF-I, el número de células T CD4+ y CD8+ infiltrantes se reducía significativamente en comparación con ratones STZ-Con (Figura 5B).
Por consiguiente, los islotes de animales no tratados con STZ tenían un patrón de tinción de insulina normal, tanto a los 15 días como a los 4 meses (Figura 5C).
Cuatro meses después del tratamiento con STZ, los animales tratados con IGF-I presentaban una masa de células β similar a animales a los que no se les inyectó STZ, mientras que los ratones STZ-Con mostraban una fuerte reducción de aproximadamente 90% (Figura 6C).
Ejemplo 13. Análisis de Ia apoptosis y replicación de células β
Para estudiar si el tratamiento con IGF-I protegía a las células β de Ia apoptosis inducida por STZ en ratones Tg IFNβ, se realizó un análisis inmunohistoquímico para detectar células no β (con un combinado de anticuerpos anti-glucagón, anti-somatostatina y anti-polipéptido pancreático) y TÚNEL para identificar células apoptóticas. Dos semanas después del tratamiento con STZ, se detectó un aumento de 2,5 veces en células β positivas a TÚNEL en ratones STZ- Con en comparación con animales tratados con IGF-I a los que se les inyectó STZ (Figura 6A). Este resultado confirmaba que el tratamiento con IGF-I protegía a las células β pancreáticas de Ia muerte mediada por el sistema inmune.
Además, para determinar si el tratamiento con IGF-I inducía replicación de células β en animales tratados con STZ, se realizó un análisis inmunohistoquímico doble de insulina y marcador de replicación Ki67. Dos semanas después de Ia inyección de STZ, se observó un aumento de dos veces en células β en replicación en los islotes de ratones tratados con IGF-I a los que se les inyectó STZ, en comparación con animales STZ-Con (Figura 6B).
El aumento en las células β en replicación después del tratamiento con IGF-I en comparación con ratones STZ-Con sugería que se bloqueaba Ia autoinmunidad contra células β (Nir et al., 2007).
Ejemplo 14. Medición de Ia masa de células β en ratones tratados con IGF-I
Los bajos niveles de insulitis detectados en animales tratados con IGF-I sugerían que el tratamiento estaba causando una interrupción en el ataque autoinmune contra células β. Se realizó una detección inmunohistoquímica de insulina en secciones pancreáticas de ratones Tg I FNβ 4 meses después del tratamiento con STZ para determinar si Ia masa de células β se mantenía en animales tratados con IGF-I (Figura 6C). Podían detectarse pocos islotes en el páncreas de ratones STZ-Con y Ia mayoría de ellos eran pequeños y estaban altamente infi ltrad os . Por el contra rio , los ratones tratad os con I G F-I normoglucémicos tenían un número de islotes normal con un aspecto normal a las 16 semanas después del tratamiento con STZ. Ejemplo 15. Niveles de insulina e IGF-I en sangre en ratones tratados con IGF-I
La capacidad para mantener Ia normoglucemia después de Ia administración de STZ, Ia interrupción del avance de Ia insulitis y el mantenimiento de Ia masa de células β en los animales tratados con IGF-I sugería que su páncreas era funcional y capaz de producir niveles de insulina en sangre apropiados. Para confirmarlo, se midieron los niveles de insulina en suero. Los animales tratados con el plásmido vacío (STZ-Con) presentaban niveles de insulina en suero disminuidos aproximadamente 80%, mientras que los controles no tratados con STZ (Con) permanecían normoinsulinémicos (Figura 6D). Los animales tratados con 5 μg de plásmido IGF-I que eran capaces de mantener Ia normoglucemia presentaban niveles de insulina normales. El pequeño porcentaje de animales tratados con IGF-I que desarrollaron hiperglucemia tenían niveles de insulina similares a los de animales STZ-Con (no se muestran los datos).
Para examinar si un aumento en los niveles circulantes de IGF-I después de una inyección HTV de pIGF-l podía ser responsable de Ia protección observada frente al desarrollo de hiperglucemia, se midieron los niveles de IGF-I circulante total 8 semanas después de Ia inducción de diabetes. Sin embargo, no se detectaron diferencias en los niveles circulantes de IGF-I entre los grupos (Figura 6E).
Ejemplo 16. La sobreexpresión específica de IGF-I exógeno en hepatocitos no conduce a Ia prevención de Ia diabetes
Como se ha descrito anteriormente, el promotor CAG es capaz de dirigir Ia expresión del transgén tanto en hepatocitos como también en varias células hepáticas no parenquimatosas después del procedimiento de inyección hidrodinámica. Para caracterizar adicionalmente si Ia protección frente al desarrollo de diabetes después del tratamiento con IGF-I dependía de Ia expresión específica del IGF-I exógeno en hepatocitos, se examinó una nueva construcción plasmídica que expresaba IGF-I bajo el control de un promotor específico de hepatocitos compuesto por el enhancer de Ia región de control de hepatocitos (HCR) de Ia apolipoproteína E y el promotor de α-antitripsina humano (phAAT-IGF). Como se ha demostrado anteriormente en el estudio, el promotor hAAT es tan potente como el promotor GAC en términos de actividad transcripcional.
La expresión de IGF-I en el hígado de los ratones a los que se les inyectó plásmido se determinó mediante RT-PCR usando cebadores específicos para el IGF-I exógeno. Veinticuatro después de Ia inyección HTV de phAAT IGF-I, sólo podía detectarse expresión de IGF-I procedente del plásmido en los animales a los que se les había inyectado pCAG IGF-I WPRE (Figura 7A).
Los ratones IFNβ se trataron con inyecciones diarias de 25 mg/kg de estreptozotocina (STZ) durante 5 días consecutivos. Después de Ia inyección de STZ, se inyectó hidrodinámicamente un plásmido que dirigía Ia expresión de IGF-I bajo el control del promotor específico de hepatocitos hAAT (STZ-hAAT-l GF-I) cada semana durante 4 semanas. Se incluyeron ratones no tratados con STZ y STZ-Con como controles. Dos semanas después de Ia inyección de STZ, Ia incidencia acumulativa de diabetes era de aproximadamente 80% en ratones STZ-Con. Los animales que expresaban IGF-I exógeno bajo el control del promotor hAAT no mostraban protección frente a Ia diabetes y Ia incidencia acumulativa de Ia enfermedad era similar a Ia de ratones STZ-Con (Figura 7B). Los animales no tratados con STZ no desarrollaron diabetes, como se esperaba. Por Io tanto, estos resultados sugerían que Ia expresión específica de hepatocitos de IGF-I exógeno no era suficiente para prevenir el desarrollo de Ia diabetes en ratones tratados con STZ.
Ejemplo 17. La sobreexpresión de IGF-I exógeno bajo el control del promotor CD68 en células hepáticas no parenquimatosas es suficiente para Ia prevención de diabetes
Puesto que Ia expresión limitada a hepatocitos de IGF-I plasmídico era incapaz de suprimir Ia aparición de Ia diabetes, se examinaron los efectos de Ia expresión de IGF-I en otros tipos de células hepáticas. En el hígado, Ia población de células no parenquimatosas está compuesta principalmente por células endoteliales sinusoidales (LSEC), macrófagos tisulares residentes (células de Kupffer), células dendríticas, células estrelladas y linfocitos asociados con el hígado (Blouin et al., 1977). Sólo recientemente se ha demostrado que muchas funciones del hígado dependen de Ia cooperación de células hepáticas no parenquimatosas y parenquimatosas (Kmiec, 2001 ). Por Io tanto, para examinar si Ia sobreexpresión de IGF-I exógeno en células hepáticas no parenquimatosas podía conducir a Ia reducción de Ia hiperglucemia, se generó un plásmido que expresaba IGF-I bajo el control del promotor CD68 murino. CD68 es un marcador de macrófagos y es una proteína transmembrana tipo I que se expresa en el compartimento endosomal de todas las células del linaje de fagocitos mononucleares incluyendo monocitos, macrófagos, microglía, osteoclastos y, en menor medida, células dendríticas inmaduras. (Gough et al., 2001 ). Las células estrelladas hepáticas también expresan CD68 (Viñas et al., 2003).
Se siguió el mismo diseño experimental que se indica en Ia Figura 4A. Se trataron ratones Tg IFNβ con inyecciones diarias de 25 mg/kg de estreptozotocina (STZ) durante 5 días consecutivos. Después de Ia inducción de diabetes, se inyectaron hidrodinámicamente cada semana 5 μg de un plásmido que dirigía Ia expresión de IGF-I bajo el control del promotor CD68 murino (STZ-CD68-IGF-I). Un conjunto de animales se trató con un plásmido vacío (STZ-Con), mientras que otro se dejó sin inyectar con STZ (Con). La expresión del plásmido se confirmó mediante PCR (Figura 8A). Ninguno de los ratones no tratados con STZ desarrolló hiperglucemia, mientras que 90% de los animales en el grupo STZ-Con se volvieron diabéticos a Ia semana 6 post-STZ. Por el contrario, el porcentaje de animales diabéticos en el grupo STZ-CD68-IGF-I era solamente de aproximadamente 40% 6 semanas después de Ia inducción de diabetes (Figura 8B).
Estos resultados indicaban que Ia sobreexpresión de IGF-I en células hepáticas no parenquimatosas era suficiente para prevenir Ia aparición de Ia enfermedad en aproximadamente 60% de los ratones tratados con STZ. Por Io tanto, las células hepáticas no parenquimatosas pueden estar implicadas en Ia prevención de Ia DT1 en el modelo de diabetes tipo 1 en ratón Tg IFNβ.
Ejemplo 18. Cambios en células T reguladoras hepáticas y pancreáticas después del tratamiento con IGF-I
Se ha demostrado que las células T reguladoras controlan procesos fisiológicos autoinmunes tales como Ia diabetes autoinmune y se ha demostrado que las variaciones en las proporciones de Treg en Ia periferia regulan Ia evolución hacia Ia enfermedad (Belghith et al . , 2003). Por Io tanto, se realizó una cuantificación relativa del porcentaje de Treg intrahepáticas, intraesplénicas e intrapancreáticas (células T CD4+ CD25+ GITR+) 1 mes después de Ia primera inyección de STZ— después de 4 inyecciones hidrodinámicas de pCAG IGF-I y pCD68 IGF-I.
Se detectó un aumento significativo de 60% de Treg en el hígado en animales tratados tanto con CAG IGF-I como con CD68 IGF-I cuando se compararon con ratones STZ Con (Figura 9A). El porcentaje de Treg intrahepáticas en animales sin tratar (Con) era el menor entre los grupos, indicando que el aumento observado en el porcentaje de Treg en los grupos tratados con IGF-I en comparación con STZ Con no podía atribuirse exclusivamente a Ia condición normoglucémica de los primeros.
Además, se observó un aumento de aproximadamente dos veces en los niveles de Treg intrapancreáticas tanto en animales tratados con CAG IGF-I como con CD68 IGF-I, cuando se compararon con ratones STZ Con (Figura 9B). Por último, todos los grupos tratados con STZ mostraban porcentajes similares de Treg intraesplénicas (Figura 9C).
Estos datos sugerían que el tratamiento con IGF-I inducía un aumento local en el porcentaje de Treg intrahepáticas e intrapancreáticas que podría explicar Ia protección observada en el desarrollo de hiperglucemia diabética.
Un aumento en el porcentaje de Treg un mes después del tratamiento con STZ en el hígado de animales tratados con pIGF-l (Figura 9A), sugería que esta población celular podía ser responsable del control de Ia autoinmunidad en el modelo de DT1 en Tg IFNβ. Por Io tanto, se determinó Ia contribución de células T reguladoras al desarrollo de Ia diabetes en el modelo de Tg IFNβ por reducción de esta población celular.
Se realizó una depleción de células CD25+ a los d ías 9 y12 mediante inyecciones intraperitoneales de anticuerpo monoclonal de rata anti-CD25 murino a un dosis de 30 μg/ratón («1 ,5 mg/kg). Los ratones control recibieron suero de conejo.
La incidencia acumulativa de diabetes en todos los grupos se muestra en Ia Figura 9D. Los animales que no recibieron ni inyección de STZ ni tratamiento con plásmido (grupo Con) no desarrollaron diabetes (0 de 6 ratones). Por el contrario, más de 80% (5/6) de los ratones tratados con STZ que recibieron una inyección hidrodinámica de un plásmido vacío (grupo STZ) eran diabéticos 3 semanas después de Ia administración de STZ. El tratamiento con IGF-I en los ratones tratados con STZ que recibieron suero de conejo como control (grupo STZ IGF-I) disminuía Ia inducción de diabetes hasta el 33% de los animales (2 de 6), mostrando un efecto protector frente al desarrollo de hiperglucemia que se ha descrito en este estudio anteriormente. Sin embargo, Ia depleción de linfocitos CD25+ en los ratones tratados con pIGF-l a los que se les inyectó STZ (STZ-CD25 IGF-I) elevaba Ia aparición de diabetes hasta 100% (5 de 5 animales), 2 semanas después del régimen de depleción, suprimiendo completamente el fenotipo protector observado en el grupo STZ IGF-I. De forma similar, el porcentaje de animales diabéticos cuando se realizó Ia depleción en animales tratados con plásmido vacío a los que se les inyectó STZ era de 80%.
Estos resultados indicaban que Ia depleción de Treg en el modelo de diabetes autoinmune en ratón Tg I FNβ podría estar rompiendo Ia tolerancia periférica a células β, conduciendo a Ia aparición de Ia enfermedad. Esto también sugería que las Treg podían estar implicadas en Ia protección frente a Ia DT1 mediada por IGF-I.
Ejemplo 19. La electrotransferencia muscular de pCMV-IGF-l no previene Ia Diabetes Tipo 1.
En otro conjunto de experimentos, se indujo u n estado diabético experimental en ratones RIP-l/hIFNβ administrando diariamente inyecciones de 25 mg/kg de estreptozotocina (STZ) durante 5 días consecutivos. Después de Ia inducción de diabetes se electrotransfirió un plásmido que dirige Ia expresión de IGF-I bajo el control del promotor ubicuo CMV (pCMV IGF-I) a los músculos de ratones transgénicos IFNβ previamente tratados con STZ (STZ I GF-I). Como controles, se usaron ratones sin tratar (Con) y ratones a los que se les inyectó STZ (STZ-Con). Cuarenta días después de Ia inducción de diabetes, ninguno de los animales (0/6) en el grupo Con se había vuelto diabético, como se esperaba, mientras que el 80% de los ratones en el grupo STZ-Con (4/5) desarrollaron hiperglucemia. Todos los animales STZ-IGF-I (7/7) se volvieron diabéticos. Los animales que desarrollaron hiperglucemia mostraban síntomas evidentes de diabetes tales como una infiltración linfocítica grave en el páncreas (insulitis) y reducción de 80% en los niveles de insulina circulante en comparación con animales de control. Estos resultados indicaban que Ia electrotransferencia de un plásmido que codifica I GF-I en los músculos de ratones transgénicos IFNβ prediabéticos no era capaz de proteger frente a Ia enfermedad.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para el factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I), o un equivalente biológico funcional del mismo, caracterizado por que se incluye en un vector adecuado para expresar IGF-I en células hepáticas.
2. Una construcción de ADN de acuerdo con Ia reivindicación 1 , en Ia que las células hepáticas son células hepáticas no parenquimatosas (NPC).
3. Una construcción de ADN de acuerdo con Ia reivindicación 2, en Ia que dicho vector consiste en un plásmido que comprende un promotor adecuado para expresar IGF-I, o un equivalente biológico funcional del mismo, en NPC.
4. Una construcción de ADN de acuerdo con Ia reivindicación 3, en Ia que dicho vector consiste en un plásmido que comprende un promotor adecuado para expresar IGF-I, o un equivalente biológico funcional del mismo, en células de Kupffer.
5. Una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4, en Ia que el promotor se selecciona de: CAG o CD68.
6. Una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que consiste en el plásmido pCAG IGF-I WPRE caracterizado por Ia SEC ID No: 1.
7. Una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que consiste en el plásmido pCD68 IGF-I caracterizado por Ia SEC ID No: 2.
8. Uso de Ia construcción de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para fabricar una composición farmacéutica activa para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes.
9. Uso de Ia construcción de ADN de acuerdo con Ia reivindicación 8, en el que las enfermedades autoinmunes están causadas por Ia disfunción o desregulación de células Treg.
10. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9, en el que Ia enfermedad autoinmune es Diabetes Tipo 1 (DT1 ).
11. Composiciones farmacéuticas que comprenden Ia construcción de ADN de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Una construcción de ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I), o un equivalente biológico funcional del mismo, incluida en un vector adecuado para expresar IGF-I o un equivalente biológico funcional del mismo en células hepáticas, para el uso en Ia prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunes.
13. Una construcción de ADN de acuerdo con Ia reivindicación 12, en Ia que las células hepáticas son células hepáticas no parenquimatosas (NPC).
14. Una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en Ia que las enfermedades autoinmunes están causadas por una disfunción o desregulación de células Treg.
15. Una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 12 a 14, en Ia que Ia enfermedad autoinmune es Diabetes Tipo 1 (DT1 ).
16. Una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, que consiste en el plásmido pCAG IGF-I WPRE representado por Ia SEC ID No: 1.
17. Una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13 que consiste en el plásmido pCD68 IGF-I representado por Ia SEC ID No: 2.
18. Un método para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes que comprende Ia administración al paciente de una dosis terapéuticamente eficaz de Ia composición farmacéutica de Ia reivindicación 1 1.
19. Un método de acuerdo con Ia reivindicación 18, en el que las enfermedades autoinmunes están causadas por una disfunción o desregulación de células Treg.
20. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, en el que Ia enfermedad autoinmune es Diabetes Tipo 1 (DT1 ).
21. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado por que Ia composición se administra al hígado del paciente directamente mediante una inyección local.
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