WO2011003984A1 - Moyens et methodes de detection et d'identification d'une nouvelle bacterie responsable d'affections phytosanitaires sur des plantes (courgettes) et nouvelles plantes resistantes - Google Patents

Moyens et methodes de detection et d'identification d'une nouvelle bacterie responsable d'affections phytosanitaires sur des plantes (courgettes) et nouvelles plantes resistantes Download PDF

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WO2011003984A1
WO2011003984A1 PCT/EP2010/059833 EP2010059833W WO2011003984A1 WO 2011003984 A1 WO2011003984 A1 WO 2011003984A1 EP 2010059833 W EP2010059833 W EP 2010059833W WO 2011003984 A1 WO2011003984 A1 WO 2011003984A1
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WO
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bacterium
peponis
pseudomonas
syringaea
plant
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Application number
PCT/EP2010/059833
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English (en)
Inventor
Charles Manceau
Sophie Gironde
Bérénice BRIAND
Hubert Lybeert
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Clause SA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Clause SA
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • the field of the invention is that of the detection of infections (especially bacterial) on plants, and in particular on zucchini.
  • the invention relates to means, methods and kits for detecting and identifying bacteria causing said infections, these means, methods and kits relating to molecular biology and / or immunology and / or microbiology.
  • the invention also relates to a new bacterium responsible for infections (especially bacterial) on plants, and in particular on zucchini.
  • the invention further relates to methods of identifying and creating plants resistant to this new bacterium.
  • the contamination of a seed in a batch can possibly and quickly trigger an epidemic in the greenhouse or in the field where the plants from these seeds are grown.
  • This epidemic can, depending on the case, ravage the cultivation of the field or the greenhouse and induce considerable losses of yield and therefore exploitation for the farmer.
  • the bacterium Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis that may be present on tomato seeds. It is transmitted mechanically or by irrigation water and can annihilate a whole field of production by causing wilting of plants.
  • contaminated seed lots can be either treated or decontaminated or destroyed.
  • WO 00/77214 also describes a technique for detecting antifungal drugs by administering a test substance and analyzing the differential expression of certain yeast genes. To do this, labeled DNA probes are used.
  • the plants particularly targeted by the invention are zucchini and bacterial infections likely to affect them.
  • Cucurbita pepo which is a short-stemmed, short-stemmed, early-stage, branchless, large-leafed, long-stalked, cut-up, and rough-matured plant, is of interest to Cucurbita pepo. .
  • the plant is monoecious, with large yellow flowers and fruit of varying color and morphology (J.Y. Péron 2006 Lavoisier: economy of the zucchini 327-328).
  • zucchini production is concentrated in the southeast, which accounts for 60% of the surface area, both in greenhouse production and in open fields.
  • the 2008 production represents approximately 134,000 tonnes, in production of fresh produce and in production for processing.
  • Zucchini seeds and plants can undergo various types of pathogen aggression, be they viral, fungal or bacterial.
  • one of the essential objectives of the invention is to understand and identify the causes of phytosanitary diseases of plants and seeds, and in particular zucchini.
  • Another essential objective of the invention is to develop means, methods and kits effective, reliable, fast, specific and economic detection and identification of pathogens, including bacteria, responsible for these phytosanitary conditions.
  • Another essential objective of the invention is that these means, methods and kits for detection and identification can be implemented on samples, preferably plant samples, and more preferably still on seeds, whole plants, parts of plants, or on cultivated soils (outdoors or under cover) to check for possible contamination by the said bacteria.
  • Another essential objective of the invention is to develop effective means and methods for combating these phytosanitary conditions, such as means and methods for identifying, or even creating, plants resistant to these phytosanitary conditions.
  • This new bacterium has been identified and characterized by the inventors as being a bacterium of the type Pseudomonas syringae, named Pseudomonas syringae pv. Peponis, because of its specificity on zucchini.
  • Pseudomonas syringae is a gram-negative bacterium that is pathogenic to plants and whose strains are defined according to their ability to attack certain hosts. Strains have been defined on more than 50 plant species that they are likely to attack. Pseudomonas are a large and very ubiquitous group.
  • the present invention which firstly relates to a new bacterium responsible for the symptoms mentioned above, namely the bacterium Pseudomonas syringae pv. peponis isolated and filed on 19.05.2009 with the National Collection of Culture of MicroOrganisms under the number CNCM 1-4159.
  • This bacterium Pseudomonas syringae pv. peponis has been identified and characterized by techniques including:
  • Molecular biology techniques include the hybridization of specific probes of nucleotide sequences of said bacterium or genetic amplification.
  • Polymerase Chain Reaction (PCR) assays have been developed on bean bacteria (Xanthomonas axonopodis pv phaseoli) and on tomato bacteria (Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis).
  • Immunological techniques are for example of the ELISA type.
  • Microbiological techniques include cell cultures and biochemical and morphological studies.
  • the subject of the invention is also:
  • New means (or tools) of molecular biology namely molecular markers (probes and primers) specific for the new bacterium identified Pseudomonas syringae pv. Peponis; (For example, a probe formed by all or part of the nucleotide sequence SEQ ID NO : 1 or SEQ ID No. 12 and primers, for example chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 10).
  • New detection kits for the new bacterium Pseudomonas syringae pv. peponis comprising at least one of said aforementioned means (tools) for implementing at least one of said methods for identifying and detecting the new bacterium.
  • a new method of identifying plants resistant to Pseudomonas syringae pv. peponis comprising inoculating at least one plant with the bacterium and identifying the plant that does not exhibit symptoms of susceptibility to the bacteria.
  • a new method of inoculation of a sample with a bacterium characterized in that the inoculum used comprises the bacterium Pseudomonas syringaea peponis.
  • a new method of creating a plant resistant to Pseudomonas syringae pv. peponis comprising the identification of a first plant resistant to the bacterium Pseudomonas syringae pv. peponis, its crossing with a plant sensitive to said bacterium and the identification in the offspring of this cross of plant resistant to the bacterium.
  • a new method for selecting or identifying a seed lot characterized in that it implements at least one of the methods and / or at least one of the diagnostic tools according to the present invention to identify the contamination of said seed lot by the bacterium Pseudomonas syringae pv. Peponis.
  • the methods for detecting the new bacterium Pseudomonas syringae pv. peponis can be used separately or in combination.
  • the newly identified bacterium can be detected by means of molecular biology techniques and / or by means of immunology and / or microbiology techniques and / or by means of a specific culture medium.
  • the plant is a plant of the cucurbitaceae family, preferably a plant of the genus cucurbita or of the genus cucumis, such as, in particular, cucumis melo (melon) or cucumis sativus (cucumber), and still more favorite a zucchini plant cucurbita pepo.
  • plant is meant for example a plant at any stage of development whatsoever, including: seed, embryo, or any other seedling stage or adult plant.
  • - Courgette for example means a plant of the genus Cucurbita.
  • Zucchini is a group of cultivars of the species Cucurbita pepo and subspecies Cucurbita pepo ssp. pepo.
  • Molecular marker means, for example, a specific fragment of a DNA sequence that can be identified within the genome of an individual and that can be used in particular to locate a gene of interest, to verify whether an individual has inherited a particular characteristic of a parent or differentiate individuals. It may or may not be a coding sequence. The marker may be dominant, co-dominant. The detection of the molecular marker, or its non-detection, makes it possible to select the individuals presenting the gene of interest or the particular characteristic, or on the contrary, not to select the individuals that do not have the gene of interest or the particular characteristic .
  • molecular markers allow for rapid testing of bacteria, seeds, plants or parts of plants and to identify bacteria as or not Pseudomonas Syringae pv bacteria. peponis, and / or diagnose the presence or absence of this bacterium on the seeds, plants or parts of plants analyzed.
  • a specific molecular marker according to the present invention will be a molecular marker specifically identifying the bacterium Pseudomonas syringae pv. Peponis. It differentiates this bacterium from other bacteria, including other Pseudomonas bacteria.
  • the 4Ba marker is such a specific molecular marker.
  • Part of the plant includes pollen, ova, embryos, leaves, anthers, stems, petioles, roots, fruits, seeds, flowers, buds, protoplasts, calluses, cells and tissues.
  • Pseudomonas syringae pv. eg peponis means the ability of a plant to restrict the growth and development of the bacteria and / or the damage they cause, in comparison with susceptible plants and under similar, environmental and pressure conditions of this bacteria Resistant plants can express some symptoms of the disease or some damage in case of strong pressure of the bacteria.
  • Pseudomonas syringae pv. eg peponis means the inability of a plant to restrict the growth and development of the bacterium, thereby developing the symptoms of necrosis on the cotyledons of seedlings, discolouration on young leaves, stunting of the plant and blockage of its development.
  • household gene is meant, for example, genes that are involved in the main metabolisms, genes common to all bacteria, coding for essential functions
  • primer is meant a short, (4 to 30 base pair) artificial DNA sequence complementary to one of the strands of the DNA fragment that is to be amplified by polymerase chain reaction (PCR) or that we want to sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the inventors have thus lifted the veil on a phytosanitary problem related to the courgettes Cucurbita pepo.
  • This problem is mainly manifested by foliar necrosis on young seedlings.
  • symptoms can become systemic, causing thinning of young leaves and blockage of plants.
  • a late attack on adult plants will manifest itself by the presence of necroses surrounded by a yellow halo on the leaves, without great damage on the yield. It is at the young plant level that the damage is most pronounced and also at this stage that the transmission of seedling seedlings is the most dangerous.
  • the bacterium Pseudomonas syringaea peponis comprises at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
  • the sanitary quality of the seeds being a major character for the marketing of the seeds and for the management of the sanitary quality of the cultures, it is essential to be able to have means for identifying the presence or absence of a bacterium in a sample, whether this sample is a seed, a plant, a part of a plant or even a soil of a field or greenhouse.
  • the present inventors have therefore developed various means and methods for the identification and detection of the bacterium Pseudomonas syringae peponis and the means (tools) for implementing said methods.
  • the present invention relates to:
  • a 4Ba molecular marker characterized in that it is defined by the pair of nucleotide primers constituted firstly by the sequence SEQ ID No. 9 and / or at least one sequence comprising at least 8 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 9, preferably at least 11 nucleotides, and secondly, by the sequence SEQ ID NO : 10 and / or at least one sequence comprising at least 8 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID NO : 10.
  • a 4Ba molecular marker characterized in that its nucleotide sequence comprises all or part of SEQ ID NO : 1, preferably at least 11 nucleotides of SEQ ID No. 11, or all or part of the sequence SEQ ID NO. 12
  • One of the objects of the present invention also relates to the isolated nucleotide sequence consisting of all or part of the sequence SEQ ID No. 11, preferably at least 11 nucleotides of SEQ ID NO : 1, or all or part of the sequence SEQ ID No. 12, characterized in that it allows the detection of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis.
  • This nucleotide sequence makes it possible to produce at least one nucleotide probe specific for this 4 Ba marker and in particular for all or part of SEQ ID NO : 1, preferably at least 11 nucleotides of SEQ ID NO: 1, or all or part of SEQ ID No. 12.
  • These probes are labeled DNA or RNA sequences (by a fluorescent compound, a radioisotope, or an enzyme or other suitable molecule) that are used to detect homologous (complementary) sequences by in situ or in situ hybridization. in vitro with their complementary nucleotide sequence. They then allow the detection and / or localization of the marker 4Ba and therefore the bacterium Pseudomonas syringaea peponis, object of the present application.
  • the DNA probes will be preferred.
  • the present invention relates to one (or more) nucleotide primer (s) for the detection and identification of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis as defined above, characterized in that it comprises
  • vs. from 8 to 30 nucleotides of the sequence SEQ ID No. 11, preferably at least 11 nucleotides of SEQ ID No. 11;
  • the nucleotide primers for the detection and identification of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis as defined above comprises:
  • nucleotides from 10 to 30 nucleotides of which at least at least 9, or at least 10, or at least 11, or at least 12, or at least 13, or at least 14, or at least 15, or at least 16, or at least 17, or at least 18, or at least 19, or at least 20, or at least 21, or at least 22, or at least 23, or at least 24, or at least 25, or at least 26, or at least 27, or at least 28, or at least 29, or 30 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 10, and, preferably, the sequence SEQ ID No. 10 integral;
  • a pair of primers comprising a first primer (a) as defined above and / or (c) as defined above, and a second primer (b) as defined above and / or (d) as defined above.
  • the nucleotide primer comprises the sequence SEQ ID No. 9 or the sequence SEQ ID No. 10. Methods , identification and . detection falling under the . molecular biology
  • the present invention relates to a method for detecting and identifying bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis as defined above, in a sample, using a molecular biology means selected from the group comprising at least l one of the above-defined markers and / or at least one above-defined primer.
  • the molecular biology means comprises:
  • PCR Polymerase Chain Reaction a pair of primers (e) as defined above allowing a polymerase chain reaction (PCR Polymerase Chain Reaction).
  • the method for identifying and detecting Pseudomonas syringaea peponis bacterium (s) in a sample is characterized in that it comprises the implementation of a molecular marker specific for the Pseudomonas bacterium. syringaea peponis.
  • This molecular marker is amplified in the genome of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis while it is not in the genome of other bacteria Pseudomonas syringaea. Means and methods, identification and detection under . immunology
  • the invention also relates to an antibody capable of recognizing the bacterium Pseudomonas syringaea peponis as defined above and an immunological method for detecting and identifying bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis in a sample using this antibody.
  • the immunological detection method comprises a first step of treating a sample in order to extract any bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis, and then bringing said treated sample into contact with a specific antibody of said bacterium.
  • Another subject of the present invention relates to a method for the detection and identification of the bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis in a sample, characterized in that it consists in using a specific culture medium LBCA supplemented or not with lincomycin.
  • This culture medium makes it possible, on the one hand, to inhibit the growth of most of the other bacterial strains found in the sample to be analyzed and, on the other hand, to identify the bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis thanks to its levaneous nature. among the possible bacterial strains that could grow in the medium.
  • Another object of the present invention relates to a method for detecting and identifying bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis as defined above, in a plant sample, characterized in that it comprises:
  • the sample is derived from a plant selected from plants of the cucurbitaceae family, a plant of the genus cucurbita or genus cucumis and a plant of zucchini cucurbita pepo.
  • An alternative of the present invention is to combine the means and / or methods for detecting Pseudomonas syringaea peponis.
  • the invention therefore relates to a method for detecting and identifying bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis as defined above, in a sample, characterized in that it combines at least two methods chosen from the group comprising:
  • the method involves comparative crops of plants.
  • a preferred variant of the invention consists of a method for the detection and identification of the bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis in a sample, characterized in that it comprises the implementation of an LBCA selective culture medium supplemented with or not lincomycin combined with the implementation of a molecular biology means for the detection and identification of the bacterium.
  • another preferred variant of the invention consists of a method for detecting and identifying the bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis in a sample, characterized in that it comprises the use of a medium LBCA selective culture supplemented or not with lincomycin combined with the implementation of an immunological means for the detection of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis.
  • a medium LBCA selective culture supplemented or not with lincomycin
  • an immunological means for the detection of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis the nature of the bacteria which develop on the selective medium and which have the levan character is confirmed by the recognition of the antibody capable of recognizing the bacterium Pseudomonas syringaea peponis.
  • another preferred variant of the invention consists of a method for detecting the bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis in a sample, characterized in that it comprises the use of an immunological means according to a aspects of the present invention and the implementation of a molecular biology means according to one aspect of the present invention for the detection of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis.
  • the implementation of the immunological means may follow or precede the implementation of the molecular biology means.
  • the detection of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis can be carried out on seed, a plant, a part of a plant or a soil.
  • the detection can be carried out on the seed in particular when it is a question of determining the health status of a lot of seed, that is to say its possible contamination by the bacterium Pseudomonas syringaea peponis.
  • the detection can be carried out on a plant, on a plantlet or on part of a plant, in particular before a transfer of the plant and / or seedling between two locations, for example between a greenhouse where the seedling initially develops and a field where it is transplanted to complete growth and bear fruit.
  • Detection can also be done on a plant, seedling or plant part when infection with Pseudomonas syringaea peponis is suspected, whether symptoms are already present or not.
  • the quickest and most accurate identification of a seed, plant or seedling contamination makes it possible to take adequate safeguarding measures, whether it is to decontaminate the seeds or to treat them. plant or seedling.
  • Detection can still be considered on a soil sample, for example in a field or in a greenhouse in which a plant culture sensitive to the bacterium Pseudomonas syringaea peponis is envisaged.
  • another plant may be sown, for example a plant resistant to the bacteria, or the means of struggle implemented very quickly, even before the appearance of the first symptoms.
  • the detection of the bacterium Pseudomonas syringaea peponis is carried out on a seed, a plant, a plant part of a plant of the cucurbitaceae family, preferably a plant of the genus cucurbita or of the genus cucumis such as in particular cucumis melo (melon) or cucumis sativus (cucumber), more preferably a zucchini plant cucurbita pepo.
  • the present invention also relates to a kit for the detection and identification of the bacterium (s) Pseudomonas syringaea peponis in a sample, characterized in that it comprises:
  • a molecular biology means selected from the group comprising at least one of the above-mentioned markers and / or at least one susdefine primer, and / or at least one susdefmi antibody,
  • the present invention also relates to a method for identifying plants resistant to the bacterium Pseudomonas syringaea peponis as defined above, characterized in that it comprises:
  • Another subject of the invention may be the method of inoculating a sample with a bacterium, characterized in that the inoculum used comprises the bacterium Pseudomonas syringaea peponis as defined in the present application.
  • this plant resistant to the bacterium Pseudomonas syringaea peponis is a plant of the cucurbitaceae family, preferably a plant of the genus cucurbita or genus cucumis such as in particular cucumis melo (melon) or cucumis sativus (cucumber), still favorite a zucchini plant cucurbita pepo
  • step (3) the identification of resistant plant in the progeny of the plant from step (2).
  • the plant identified as resistant to the bacterium Pseudomonas syringaea peponis is a plant of the cucurbitaceae family, preferably a plant of the genus cucurbita or of the genus cucumis such as in particular cucumis melo (melon) or cucumis sativus (cucumber), even more preferred is a zucchini plant cucurbita pepo.
  • the plant susceptible to the bacterium Pseudomonas syringaea peponis is a plant of the cucurbitaceae family, preferably a plant of the genus cucurbita or of the genus cucumis such as in particular cucumis melo (melon) or cucumis sativus (cucumber), more preferably zucchini plant cucurbita pepo.
  • the crossing of the resistant plant with the sensitive plant is carried out between plants of the same species, for example a cross between two plants of cucurbita pepo, between two plants of cucumis melo or between two plants of cucumis sativus.
  • the crossing can also take place within the same genre, for example between a plant cucurbita pepo and a plant cucurbita moschata.
  • the implementation and realization of these crossings is known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to a method of selecting a seed lot characterized in that it implements:
  • seed lot By selection of a seed lot, we mean the identification of a seed lot that can be directly sold, transferred, that its seeds are cultured as soon as the lot is identified and diagnosed as not contaminated by the bacterium Pseudomonas syringaea peponis while another batch will have to be either decontaminated or destroyed when diagnosed with Pseudomonas syringaea peponis.
  • the method of selecting a seed lot according to the invention can combine at least two of the methods i., Ii., Iii. and iv. mentioned above.
  • This method of selection of a seed lot can implement at least the 4 Ba molecular marker as defined above, and / or at least one specific primer of the molecular marker 4Ba as defined above, and / or at least the antibody capable of recognizing the bacterium according to the invention as defined above, and / or the detection kit of the bacterium, and / or at least one of the detection methods as mentioned above.
  • the present inventors have identified different batches of Cucurbita pepo zucchini seeds contaminated with a bacterium whose symptoms of foliar necrosis on young seedlings that are derived from these seeds are, until now, unknown.
  • the bacteria are extracted from the zucchini seeds by grinding with a Stomacher hammer mill for 10 minutes in a bag provided for this purpose. Strains of bacteria from different samples of contaminated zucchini seeds are named from A to F.
  • the characterization of these bacteria is carried out by various biochemical tests that make it possible to verify whether the bacterium has an oxidative or fermentative metabolism, if an acid is formed as a result of the use of a carbohydrate (sorbitol ), if a particular compound is used as the only source of carbon, if an amino acid can be transformed (arginine), if a particular enzyme may be present (oxidase) or if complex molecules can be degraded (gelatin):
  • These different tests are well known to those skilled in the art when identifying bacteria. The latter make it possible to identify the unknown bacterium as a bacterium of the Pseudomonas syringaea type (see Table 1).
  • PP stands for polypectate.
  • the unknown bacterium could be identified as a bacterium of the type Pseudomonas syringaea.
  • the first experiments having oriented the identification of unknown bacteria to Pseudomonas syringae type bacteria, biochemical analyzes specific to the analysis of Pseudomonas syringae bacteria are carried out in order to confirm the nature of the PsW1 to PsW10 bacteria.
  • LOPAT tests are the production of levane (the polymerization of fructose to polyfructose), the presence of oxidase (the determination of the presence of the enzyme cytochrome C oxidase), the degradation of pectin (the determination of the presence of pectinases ), the presence of arginine dehydrolase (the transformation of arginine by arginine dehydrolase) and hypersensitivity to tobacco (the demonstration of the pathogenicity of a bacterium by drying out the inoculation zones on the leaves tobacco).
  • H & L Hugh and Leifson medium analysis is used to determine the glucose metabolic pathway. The results are shown in Table 2 below: Table 2: LOPAT tests to confirm the nature of unknown bacteria
  • the analyzes confirm that the strains of the unknown bacterium PsW1 to Ps W9 are indeed strains of Pseudomonas syringae bacteria having the same characteristics as the six initial strains A to E. Only the strain PsWlO has differences and therefore does not correspond to a strain. of Pseudomonas syringae bacteria.
  • a morphological verification is then carried out by means of a microscope on fresh bacteria (bacteria in full growth, isolated on an artificial medium in a Petri dish, generally at 30 ° C., after 48 hours): all the strains are morphologically identical except PsW10 strain.
  • the microscopy shows, for the PsW1 to PsW9 strains, long-to-medium bacilli, isolated or more rarely grouped by two, mobile and having a random displacement.
  • the PsW10 strain for its part, is a very short ovoid bacillus (cocobacillus), therefore not flagellated, often grouped by 2.
  • the search for homologous sequences in the nucleic acid databases by the BLASTn software has resulted in a very strong homology with fluorescent oxidase-negative Pseudomonas sequences.
  • the first sequence displayed is that of P. s. pv. glycinea (1417 on 1426 analog bases). This gene, however, is not sufficiently discriminating to conclude on the identity of the bacterial species and a fortiori the pathovar to which the strain belongs.
  • the present inventors have chosen two gyrB household genes which encode the ⁇ subunit of the bacterial gyrase and rpoD that encodes the sigma factor of the RNA polymerase, such as identified in 2000 by S. Yamamoto et al. in "Phytogeny of the genus Pseudomonas / intragenic structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes" Microbiology (2000), 146, 2385-2394.
  • the DNA is extracted according to the method described by Llop et al. Journal of Microbiological Method (1999), 37, 23-31, the genes being amplified by conventional PCR according to the method and with the primers described by Yamamoto.
  • the sequencing of the amplifications is carried out by the company Genescreen.
  • the nucleotide sequences obtained are identical for all the strains of the unknown bacterium (from strain A to strain F), for both the gyrB gene and the rpoD gene.
  • Consensus sequence of rpoD gene of the bacterium responsible for the disease on zucchini Pseudomonas (SEQ ID NO: 5): CGAAATCGCCAAACGTATCGAAGAAGGCATCCGTGAAGTGATGGGCGCAATC GCGCACTTCCCAGGCACGGTTGACCACATTCTCTCCGAATACACACGCGTCAC CAGTGAAGGCGGTCGCCTTTCCGATGTTCTGAGTGGCTATATCGACCCGGACG ACGGCATTGCGCCGCCTGCCGAAGTCCCGCCGCCTGTCGACCCCAAGGCCGTC AAGGCCGAAGGTGCCGATGACGACGAGGAAGAGTCGGCAGACGCCAGCGACG AAGAAGACGAAGTCGAGCGGTCCTGATCCGGTCATCGCCCAGCAGCGCTTC GGTGCGGTTTCCGATCAAATGGAAATCACCCGCAAGGCCCTGAAGAAATTTGG TCGCGACGACAAGCACGCCATTGCCGAAATGGTTGCACTGGCCGAACTGTTCA TGCCGA
  • Consensus sequence of the syrB gene of the bacterium Pseudomonas responsible for the disease on zucchini (SEQ ID No. 6):
  • Sequence homology analysis is performed using the BLASTn program on the NCIMB server (http://www.ncimb.nlm.nih.gov) to identify bacterial strains with sequence homologies to the unknown bacterium .
  • the results are presented in the following two tables (Tables 3 and 4). The percentage identity is calculated on the nucleotide length having the maximum identity between the two sequences compared
  • the rpoD gene sequence of the unknown bacterium is compared to the rpoD gene sequences of other bacterial strains. Depending on the available information on the sequences of these other bacterial strains, the comparison is made over the entire length of the rpoD gene sequence of the unknown bacterium (780 nucleotides) or less.
  • nucleotide sequences of the gyrB and rpoD genes of Pseudomonas syringae bacteria isolated from the batches of zucchini seeds contaminated with the unknown bacterium were compared with the nucleotide sequences of the gyrB and rpoD genes of other Pseudomonas syringae bacteria.
  • the strongest sequence homology is found between the nucleotide sequences of the gyrB and rpoD genes of the unknown bacterium and those of the bacterium Pseudomonas syringae pv. syringae No. CFBP1392.
  • Pseudomonas syringae bacteria also show similar homologies, this is Pseudomonas syringae pv. lapsa, pv. pisi and pv. aptata. It can be concluded that the unknown bacterium is a strain of Pseudomonas syringae. 4 / Development of a culture medium adapted to the isolation of the phytopathogenic bacterium of the Pseudomonas syringaea type
  • the inventors have determined the antimicrobial resistance spectrum of strains of the bacterium Pseudomonas syringae unknown, by testing it on a range of antibiotics commonly used in phytobacteriology. The results are shown in Table 5. Table 5: Results of antibiotic resistance tests by determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics.
  • the lower concentration means that from this given antibiotic concentration, an effect on the growth of the bacteria is observed.
  • the lower concentration is identical to the higher concentration which means that it is an "all or nothing": below the given lower concentration of antibiotic the bacterium, object of the present invention, develops and, above this same concentration of said antibiotic, said bacterium does not develop.
  • the antibiotics bacitracin, colistin and lincomycin are dosed at the respective concentrations of 5,104 U / mg, 21.03 U / mg and 863 U / mg.
  • KBC media KBC media
  • BCBRVB King B
  • MSP levane character
  • LBCA levan character highlighted
  • Antibiotics are added at 100mg / L (final concentration in the medium) except vancomycin, bacitracin and novobiocin which are at 20mg / L, cefalexin at 80mg / L and carbenicillin, lincomycin and trimethoprim at 50mg / L. King B
  • KBC medium 1 supplemented with bacitracin and vancomycin
  • LBCA-based media have an advantage over King B-based media since LBCA differentiates the study strain by a biochemical character, the levan character: Pseudomonas have a slightly pearly appearance and colonies are highly susceptible. curved, round. In addition, since the sucrose concentration is very high in these media (50 g / l), it inhibits the growth of the saprophyte flora.
  • LBCA and LBCA supplemented with lincomycin (LBCAL) (50 mg / L) are the most suitable media for testing the health quality of zucchini seeds and the presence of the unknown bacterium.
  • a bacteria suspension at 10 CFU / ml is made from a fresh culture of bacteria to be tested (24 hours of culture on LBCA appropriate agar medium). Healthy zucchini seeds are added to the suspension and left to macerate for 1h30 to 2h with constant agitation, then recovered and sown in pots. A witness is also made with seeds bathed in water. It is then necessary to count 6 to 8 days to observe the first necrosis on cotyledons of the seedlings. Recurrent lightening of the nerves is also observed after 10 to 14 days, depending on the virulence of the strains tested).
  • the seeds of the plants macerated with the bacteria to be tested take longer to lift than the macerated seeds in the water and the cotyledons leave deformed, wound up; the leaves are not symmetrical and there is a twitching of the plant after the second leaf.
  • This method allows the expression of typical and quantifiable symptoms.
  • This test can be used to measure the virulence of bacterial strains and to measure zucchini genotype sensitivity. According to the protocol described above, this pathogenicity test carried out on seeds of melon cucumis melo has shown that for some strains, the seeds do not germinate.
  • This test can also be used to identify the presence of the bacteria. Finally, it allows a quantification of the virulence of the strains and the sensitivity of the plants. Thus, it makes it possible to identify plants that are resistant to bacteriosis induced by the unknown bacterium.
  • the inventors have carried out a new sequencing and an analysis of the homology of the Pseudomonas syringae peponis gyrB and rpoD gene sequences compared with other Pseudomonas-type bacteria and more particularly those presented in Table 7 above. The results of these analyzes are presented in Table 8 below:
  • Table 8 Homology test results for Pseudomonas syringae peponis gyrB and rpoD gene sequences compared to other Pseudomonas bacteria
  • FIG. 1 illustrates in a rectangle that particular sequence in the gyr B gene of the bacterium Pseudomonas syringae peponis Search for specific molecular markers of the pathogenic bacterium on zucchini Pseudomonas syringae peponis.
  • rpoD gene no sequence specific to the Pseudomonas syringae peponis strain can be isolated, no region of this gene being specific to it. The rpoD gene is therefore excluded for the specific primer design.
  • the gyrB gene has a zone (see box in FIG. 1) which could be sufficiently specific for the Pseudomonas syringae peponis strain, even if the number of polymorphic sites remains insufficient to obtain specific amplification in a reliable manner.
  • the PsCo tag is defined by the pair of primers of the following nucleotide sequences:
  • PsCoR anti-sense (or R for Reverse) primer PsCoR anti-sense (or R for Reverse) primer:
  • a chain reaction amplification is carried out to amplify the PsCo marker in the bacterium Pseudomonas syringae peponis.
  • the amplification of the PsCo marker is 252 base pairs.
  • this marker defined by the pair of PsCoF / PsCoR primer is not specific for the bacterium Pseudomonas syringae. pv. peponis (NF8, NC8, EN5, Co9A, Nm2) because it also amplifies genetic sequences different from those of the study strain, namely genetic sequences of Pseudomonas syringae pv bacteria. aptata (5428, 1617 and 5429), Pseudomonas syringae pv. pisi (2105), Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (2213) and Pseudomonas syringae pv. lapsa (1731).
  • the inventors then turned to another pair of primers used in the laboratory to differentiate strains of Xanthomonas arboricola, based on the amplification of a sequence included in an operon coding for NRPS (non-ribosomal peptide synthesis). This pair of primer had never been tested in Pseudomonas.
  • the marker 4BaF is defined by the pair of primers of the following nucleotide sequences:
  • Forward (or forward) primer 4BaF 5 'GAACAGC AGC CAGTT ACG 3' (SEQ ID NO: 9)
  • 4BaR anti-sense (or reverse) primer 5 'TACGC AGTCGATGAGTCC 3' (SEQ ID NO: 10)
  • a chain reaction amplification is carried out to amplify the 4Ba marker in the bacterium Pseudomonas syringae peponis.
  • the reaction mixture is identical to that used for the PsCo marker, but the PCR conditions are as follows:
  • the amplification of the 4Ba marker is 198bp.
  • this marker defined by the pair of 4BaF / 4BaR primers has been specifically created to differentiate strains of Xanthomonas campestris, a specifically pathogenic cruciferous bacterium, it shows a specificity with respect to Pseudomonas syringae pv. . peponis since only the strains of interest (Nm2, Clug, NF8, NC8, EN5, Co9A) are amplified (see Figure 3). No other group 1 Pseudomonas syringae strains tested were not amplified.
  • This molecular marker 4Ba could be sequenced thanks to these amplifications.
  • the sense and antisense sequences of this specific marker of Pseudomonas syringae pv. peponis are as follows:
  • the marker 4Ba defined by the pair of primers 4BaF and 4BaR shows a specificity with respect to the bacterium Pseudomonas syringae pv. peponis since only strains of this bacterium are amplified (see Figure 3). The other strains of Pseudomonas syringae group 1 are not amplified.
  • the present inventors have developed two procedures for detecting Pseudomonas syringae pv. peponis, namely a Bio-PCR technique and a Seed-PCR technique. These two techniques combine a biological amplification of the bacterium Pseudomonas syringaea pv. peponis to specific amplification of DNA by PCR reaction. However, these two methods are differentiated by the biological amplification medium of the bacterium Pseudomonas syringaea pv. Peponis.
  • Bio-PCR the culture media used are those selected in Examples 3 to 5, namely LBCA and LBCAL.
  • the optimal incubation time of the bacteria is 48 hours, but 24 hours are sufficient for the appearance of the first detectable colonies in PCR.
  • Seed-PCR biological amplification is done on germinating seeds. It has been shown that a pathogen present in a seed increases its population at the same time as the germination of this same seed (M. Niknejad-Kasempour's thesis, 1998). Thus, by germinating contaminated zucchini seeds under optimal conditions for the pathogen, the bacterial population increases, the germinating seed corresponds to the culture medium (there is no specific culture medium, the germination macerate seed constitutes the culture medium).
  • the biological amplification for the Seed-PCR is done in box of germination 48h at 27 ° C, the seeds then being washed lh30 in distilled water in erlen to extract all the pathogenic bacteria like saprophytes: the sprouted seeds have the open teguments which facilitates the exit of bacteria, a simple maceration is sufficient in the case of sprouted seeds to extract the bacteria.
  • each sub-sample is then recovered and then spread on LBCA and LBCAL medium.
  • the dishes are incubated at 27 ° C for 24 hours.
  • the ground material can be diluted in order to perform a count of Pseudomonas syringae pv. peponis in raw mash.
  • a dilution range of reason can be prepared up to one thousandth dilution; 100 ⁇ l of each dilution are then plated on LBCA and LBCAL rake and incubated at 27 ° C. The reading of the enumeration will then be done after 48 hours of incubation, by visual counting of the colonies developed.
  • the crude broyate dishes are washed with 2 ml of sterile distilled water using a sterile rake. 1.5 ml of this lava is recovered for the extraction of DNA. After centrifugation for 5 minutes at 13000 rpm, the supernatant is discarded and the pellet taken up in 750 ⁇ l of Edwards buffer (20 ⁇ M TrisHCl pH 7). 5.25mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, 2% PVP 360) before incubation at room temperature with gentle shaking. A new centrifugation of 5 min.
  • the reaction mixture for the PCR is prepared in a final volume of 20 ⁇ l according to Table 8 above.
  • the PCR is carried out in appropriate tubes at the rate of 17 ⁇ l of reaction mixture and 3 ⁇ l of the target DNA.
  • the amplification program of the classics PCR is carried out using a thermocycler (icycler BioRAD).
  • the amplification products are analyzed on a 2% agarose gel in 0.5 X TBE buffer prepared according to:
  • the gel is loaded in each well with 8 .mu.l of each amplified product to which are added 8 .mu.l of molecular weight marker 100 base pairs (bp) (at least 1 per gel).
  • the whole is subjected to electrophoresis under a constant voltage (100 V) and the migration of the amplified products is visualized using a UV transluminator, after staining with ethidium bromide (BET) and rinsing.
  • Figure 4 illustrates the results of this PCR.
  • A, B, C and D are DNA samples extracted from four different batches of zucchini seed, A, B and C being contaminated with Pseudomonas syringae peponis, where D is a lot uncontaminated with the bacterium.
  • "1" is a positive control constituted by a DNA amplification of a pure strain of pathogenic Pseudomonas syringae peponis on zucchini.
  • "4" is a negative PCR control that is made with sterile water.
  • the products and equipment for performing Seed-PCR are identical to those of Bio-PCR. However, there is no need to prepare a culture medium, only germination boxes and pleated or blotting paper are needed to germinate the seeds.
  • the size of the samples and sub-samples analyzed are the same as for Bio-PCR, ie samples of 500 seeds divided into 5 sub-samples of 100 seeds for analysis.
  • Each sprout box contains a blotting paper in the bottom and a folded 25 ply paper. Each box will contain a subsample of 100 seeds. 4 seeds are divided by folds and 30 ml of sterile water are added. The germination boxes are incubated at 27 ° C. in an oven for 48 hours. After this incubation, rootlets of about 2 cm are visible with some secondary roots. The seeds are recovered and transferred into a 250 ml Erlenmeyer flask to which 50 ml of sterile distilled water are added. The seeds are washed for 1 hour at room temperature and with constant stirring (universal plateau stirrer). 1.5mL of macerate are recovered in 2mL tubes for DNA extraction. DNA extraction protocols and PCR protocols are identical to those used for Bio-PCR.
  • a strip contains one or more antibodies that will fix the bacterium whose absence / presence wants to be confirmed. If the bacterium Pseudomonas syringaea pv. peponis is present in the submitted sample (a ground or macerated leaf, plant part or seed), it will be revealed by the addition of a second antibody to which an enzyme is generally bound and the addition of substrate triggers an enzymatic reaction revealing, usually by specific staining, the presence of the bacterium of interest.
  • the antibodies can be prepared by the techniques known to those skilled in the art, ie for example antisera prepared in rabbits and chicken. Immunization can be practiced in rabbits by intravenous injection of a suspension of living cells of the bacterium Pseudomonas syringae peponis according to, for example, the protocoloe described by Trigalet et al in 1978. The samples of sera are thus carried out after the 4th recall.
  • immunization can be subcutaneous with a suspension of live cells supplemented with Freund's complete adjuvant, for example 0.5 ml of adjuvant for 1.5 ml of bacterial suspension. Injections can be made at a rate of one injection per week for 3 weeks, the sample being taken 6 days after the last sting and after 3 reminders.
  • the immunoglobulins can be extracted from these sera by affinity chromato graphy, for example on Sepharose 4B columns. Their elution from the affinity column can be obtained with a 0.1 M HCl-glycine pH 2.8 buffer. After neutralization and concentration by ultrafiltration on Amicon PM 10 membrane, the immunoglobulins can be stored in the freezer. The concentration of the solution is determined from the value of the optical density at 280 nm.
  • the immunoglobulins which will be used as secondary antibodies may, for example, be coupled to alkaline phosphatase type III R (Sigma EC No. 3.1-3.1) via glutaraldehyde (one-time method) according to the method described by VASRAMEA et al. in 1978.
  • the ELISA test (acronym for Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) can be performed for example according to the sandwich method after the work of Clark and Adams (1976) or according to the double layer method according to Scherrer & Bernard (1977). The reactions can be carried out at will in microplates or tanks.
  • the ELISA is an immunological test generally intended to detect a protein in a biological fluid, it can also be used to detect the presence of bacteria, in particular of the bacterium Pseudomonas syringae peponis identified by the authors of the present invention.
  • Immunoglobulins (300 ⁇ l at 10 ⁇ g / ml) can be distributed in microwell microplates. The adsorption will be made 5 hours at 37 ° C. or 1 night at 40 ° C. After 3 washes with physiological saline, the deposit of the sample (a crushed or a maceration of leaf, part of plant or seed is deposited in the wells) is carried out at a rate of 200 .mu.l per microwell and the incubation takes place for 2 hours at 28.degree. C. After removal of the sample by washing with physiological fluid, 250 .mu.l of the antibody-enzyme coupling (secondary antibody) may be added and left for 4 hours at 37 ° C.
  • secondary antibody may be added and left for 4 hours at 37 ° C.
  • reaction will be revealed with 0.8 mg / ml of p-nitrophenyl phosphate in a 0.05 M Tris-HCl buffer, 1 M NaCl pH 8.0 A (REGN & MELRRHAL, 1960). The reading operates for this reaction, for example at 405 nm Beckman spectrophotometer DBG. In each test series, there are reaction controls (Pseudomonas syringae peponis and buffer as positive / negative controls).
  • the presence of the bacterium Pseudomonas syringae peponis in the sample is revealed when the addition of the substrate of the enzyme results in a change of color in the sample. well.
  • the reaction can even be quantified by colorimetry from a calibration curve made with known concentrations of bacteria since the number of secondary antibody molecules attached depends on the number of bacteria immobilized by the primary antibody.

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Abstract

L'invention concerne une nouvelle bactérie nommée Pseudomonas syringaea peponis déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM I-4159. L'invention concerne également un marqueur moléculaire, différentes amorces nucléotidiques ainsi qu'un moyen immunologique permettant de détecter et d' identifier cette nouvelle bactérie Pseudomonas syringaea peponis.

Description

MOYENS ET METHODES DE DETECTION ET D'IDENTIFICATION D'UNE
NOUVELLE BACTERIE RESPONSABLE D'AFFECTIONS PHYTOSANIT AIRES
SUR DES PLANTES (COURGETTES) ET NOUVELLES PLANTES
RESISTANTES
Le domaine de l'invention est celui de la détection des infections (notamment bactériennes) sur des plantes, et en particulier sur des courgettes.
Plus précisément, l'invention concerne des moyens, des méthodes et des kits de détection et d'identification des bactéries provoquant lesdites infections, ces moyens, méthodes et kits relevant de la biologie moléculaire et/ou de l'immunologie et/ou de la microbiologie.
L'invention vise également une nouvelle bactérie responsable d'infections (notamment bactériennes) sur des plantes, et en particulier sur des courgettes.
L'invention a trait par ailleurs à des méthodes d'identification et de création de plantes résistantes à cette nouvelle bactérie.
La distribution et le commerce de semences implique pour les sociétés semencières la nécessité de fournir des semences exemptes, à certains seuils définis, de pathogènes et des maladies y associées, qu'ils soient d'origine virale, fongique ou bactérienne.
En effet, la contamination d'une semence dans un lot peut éventuellement et rapidement déclencher une épidémie dans la serre ou dans le champ où les plantes issues de ces semences sont cultivées. Cette épidémie peut, selon les cas, ravager la culture du champ ou de la serre et induire des pertes considérables de rendement et donc d'exploitation pour l'agriculteur. Ainsi par exemple la bactérie Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis qui peut être présente sur les semences de tomate. Elle est transmise mécaniquement ou par les eaux d'irrigation et peut anéantir tout un champ de production en provoquant des flétrissements des plantes.
Afin d'éviter ou de ralentir la propagation territoriale de certains pathogènes, le commerce international des semences est régulé, notamment par la nécessité de fournir des certificats phytosanitaires pour le transit des graines d'un territoire à l'autre. La qualité sanitaire des semences est donc un critère majeur pour leur commercialisation des semences et pour la gestion de la qualité sanitaire des cultures.
Il est donc important de connaître l'état sanitaire des graines. Ainsi, les lots de semences contaminées, peuvent être soit traités ou décontaminés, soit détruits.
La transmission de bactéries par la semence est une étape critique dans l'écologie de nombreuses bactéries phytopathogènes (micro-organismes ayant une écologie liée aux végétaux et qui sont capables d'attaquer des plantes) mais également dans l'épidémiologie des maladies qu'elles occasionnent. Les bactéries survivent dans les semences pendant des durées très longues pouvant même être supérieures à la durée de vie de la semence. Dans certaines circonstances dépendant des agents pathogènes et des régimes climatiques, la semence contaminée représente l'unique source d'inoculum dans une culture. Pouvoir contrer cette source d'inoculum représente donc un enjeu majeur pour lutter efficacement contre les bactéries phytopathogènes.
La lutte contre ces bactéries passe par leur détection et leur identification.
Les techniques traditionnelles de détection et d'identification de bactéries phytopathogènes sur semences se répartissent généralement en deux catégories :
1) les techniques « classiques » d'isolement des souches sur des milieux sélectifs, suivies de test de pathogénicité consistant en des inoculations de souches isolées sur plantes témoin saines.
2) les autres techniques développées récemment basées sur des réactions immunologiques de type ELISA qui sont rapides, simples d'utilisation et peu coûteuses.
Le document WO 00/77214 décrit également une technique de détection de médicaments antifongiques par l'administration d'une substance test et l'analyse de l'expression différentielle de certains gènes de levure. Pour ce faire, des sondes d'ADN marquées sont utilisées.
Par ailleurs, il est important de pouvoir rapidement diagnostiquer, dans une serre ou dans un champ, l'apparition d'un pathogène afin de pouvoir prendre les mesures de sauvegarde adéquates de la culture. Plus l'identification est rapide et précise, plus les actions de lutte seront efficaces. Des mesures rapides permettent généralement de diminuer les doses des traitements appliqués sur la culture. Ces traitements ayant un coût économique et environnemental, leur diminution est importante pour l'agriculteur.
Les plantes particulièrement visées par l'invention sont les courgettes et les infections bactériennes susceptibles de les affecter. Plus précisément, on s'intéresse dans ce qui suit à la courgette Cucurbita pepo qui est une plante annuelle à tige courte, à port dressé dans ses premiers stades de développement, sans ramification, à feuilles de grande dimension, longuement pétiolées, découpées et rugueuses. La plante est monoïque, à grandes fleurs jaunes et à fruit de couleur et de morphologie très variables (J.Y. Péron 2006 Lavoisier: économie de la courgette 327-328).
En France, la production de courgette est concentrée dans le sud est qui représente 60% des surfaces, tant en production de serre que de plein champs. La production de 2008 représente environ 134 000 tonnes, en production de frais et en production pour la transformation. Si la France exporte environ 20 000 tonnes de courgettes, elle en importe surtout 100 000 tonnes, principalement de l'Espagne, du Maroc et d'Italie qui sont aussi des pays de production (Note Agreste Conjoncture, Novembre 2008).
Les graines et plantes de courgettes peuvent subir divers types d'agression de pathogènes, qu'ils soient de nature virale, fongique ou bactérienne.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention est de comprendre et d'identifier les causes des affections phytosanitaires des plantes et des semences, et en particulier des courgettes.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de mettre au point des moyens, des méthodes et des kits efficaces, fiables, rapides, spécifiques et économiques de détection et d'identification des agents pathogènes, notamment des bactéries, responsables de ces affections phytosanitaires.
Un autre objectif essentiel de l'invention est que ces moyens, des méthodes et des kits de détection et d'identification puissent être mis en œuvre sur des échantillons, de préférence végétaux, et, plus préférentiellement encore sur des graines (semences), des plantes entières, des parties de plantes, ou sur les sols de culture (en plein air ou sous abri) afin de vérifier son éventuelle contamination par ladite bactérie.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de mettre au point des moyens et des méthodes performants de lutte contre ces affections phytosanitaires, telles que des moyens et des méthodes d'identification, voire de création, de plantes résistantes à ces affections phytosanitaires.
DESCRIPTION SOMMAIRE DE L'INVENTION S'étant fixé ces objectifs, parmi d'autres, il est du mérite de la demanderesse d'avoir récemment identifié dans des lots de semences et sur des plants de courgettes Cucurbita pepo une nouvelle bactérie pathogène responsable de symptômes, qui, jusqu'alors, n'étaient pas corrélés à une bactériose. Cette nouvelle bactérie pathogène provoque des nécroses sur les cotylédons des plantules, des décolorations sur les jeunes feuilles, un rabougrissement de la plante et le blocage de son développement. Une attaque plus tardive dans le développement de la plante provoque des nécroses sur les feuilles, nécroses brunes entourées d'un halo jaune et dans ce cas l'incidence sur la production est seulement mineure.
Cette nouvelle bactérie a été identifiée et caractérisée par les inventeurs comme étant une bactérie du type Pseudomonas syringae, nommée Pseudomonas syringae pv. Peponis, en raison de sa spécificité sur les courgettes.
Pseudomonas syringae est une bactérie gram négative, pathogène des plantes et dont les souches sont définies suivant leur capacité à attaquer certains hôtes. Des souches spécifiques ont été définies sur plus de 50 espèces végétales qu'elles sont susceptibles d'attaquer. Les Pseudomonas sont un groupe large et très ubiquiste.
Forts de cette avancée, les inventeurs ont également développé de nouvelles techniques de détection et d'identification de ces bactéries phytopathogènes et donc de diagnostic des maladies phytosanitaires subséquentes.
Les objectifs susvisés, parmi d'autres, sont ainsi atteints par la présente invention qui concerne tout d'abord une nouvelle bactérie responsable des symptômes évoqués ci- dessus, à savoir la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis isolée et déposée le 19.05.2009 auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM 1-4159.
Cette bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis a été identifiée et caractérisée par des techniques faisant appel notamment:
• à la biologie moléculaire,
• à l'immunologie,
• à la microbiologie,
• à des tests comparatifs sur des cultures comprenant des témoins positifs contaminés voire des témoins négatifs sains.
Cela a ouvert l'accès à de nouvelles techniques de détection et d'identification qui allient sensibilité, spécificité et facilité d'utilisation et qui sont applicables sur des échantillons de type sol, semences, plante entière ou partie de plante.
Les techniques de biologie moléculaire sont notamment l'hybridation de sondes spécifiques de séquences de nucléotides de ladite bactérie ou l'amplification génétique. C'est ainsi qu'ont été mis au point des tests de détection PCR (Polymerase Chain Reaction) sur des bactéries du haricot (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) et sur des bactéries de la tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).
Les techniques immunologiques sont par exemple de type ELISA.
Les techniques microbiologiques sont notamment des cultures cellulaires et des études biochimiques et morphologiques.
L'invention a également pour objet:
• Des nouveaux moyens (ou outils) de biologie moléculaire, à savoir des marqueurs moléculaires (sondes et amorces) spécifiques de la nouvelle bactérie identifiée Pseudomonas syringae pv. Peponis; (par exemple sonde formée par tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N0I l ou SEQ ID N°12 et amorces par exemple choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°9 ou SEQ ID N°10).
• De nouveaux anticorps aptes à reconnaitre et à se lier de manière spécifique à la nouvelle bactérie identifiée Pseudomonas syringae pv. Peponis.
• De nouvelles méthodes d'identification et de détection de cette nouvelle bactérie dans un échantillon donné. Ces méthodes peuvent être mises en œuvre à l'aide de divers techniques et moyens susvisés de biologie moléculaire, d'immunologie, de microbiologie et de cultures comparatives de plantes.
• Des nouveaux kits de détection de la nouvelle bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis comprenant au moins un desdits moyens (outils) susmentionnés pour la mise en œuvre d'au moins une desdites méthodes de d'identification et de détection de la nouvelle bactérie.
• L'utilisation de l'une des méthodes et/ou de l'un des outils de la présente invention pour identifier la présence de la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis dans un lot de graine, sur une plante, sur une plantule, sur une partie de plante, voire dans un sol.
• Une nouvelle méthode d'identification de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis comprenant l'inoculation d'au moins une plante avec la bactérie et l'identification de la plante qui ne présente pas les symptômes de sensibilité à la bactérie.
• Une nouvelle méthode d'inoculation d'un échantillon avec une bactérie, caractérisée en ce que l'inoculum mis en œuvre comprend la bactérie Pseudomonas syringaea peponis.
• Une nouvelle méthode de création de plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis comprenant l'identification d'une première plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis, son croisement avec une plante sensible à ladite bactérie et l'identification dans la descendance de ce croisement de plante résistante à la bactérie.
• Une nouvelle méthode de sélection ou d'identification d'un lot de semences caractérisé en ce qu'il met en œuvre au moins l'une des méthodes et/ou au moins l'un des outils de diagnostics selon la présente invention pour identifier la contamination dudit lot de semence par la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis.
II est bien évident que les méthodes de détection de la nouvelle bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis peuvent être utilisés séparément ou bien de manière combinée. Ainsi la nouvelle bactérie identifiée peut être détectée au moyen de techniques de biologie moléculaire et/ou au moyen de techniques d'immunologie et/ou de microbiologie et/ou au moyen d'un milieu de culture spécifique.
Ces nouveaux moyens et méthodes permettent de déterminer si les graines (semences) ou les plantes sont infectées par cette nouvelle bactérie et donc affectées par la maladie correspondante. Selon un aspect particulier de l'invention, la plante est une plante de la famille des cucurbitacée, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo. DEFINITIONS
Afin de mieux comprendre l'invention, il convient tout d'abord de rappeler ou de donner quelques définitions. Au sens de la présente demande :
- Par plante, on entend par exemple un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment : graine, embryon, ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte.
- Par courgette, on entend par exemple une plante du genre Cucurbita. La courgette est notamment un ensemble de cultivars de l'espèce Cucurbita pepo et de la sous-espèce Cucurbita pepo ssp. pepo.
- Par marqueur moléculaire, on entend par exemple un fragment spécifique d'une séquence d'ADN pouvant être identifiée au sein du génome d'un individu et pouvant être notamment utilisée pour localiser un gène d'intérêt, vérifier si un individu a hérité d'une caractéristique particulière d'un parent ou différencier des individus. Il peut s'agir ou non d'une séquence codante. Le marqueur peut être dominant, co-dominant. La détection du marqueur moléculaire, ou sa non-détection, permet de sélectionner les individus présentant le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière, ou au contraire, de ne pas sélectionner les individus ne présentant pas le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière. Dans la présente invention, les marqueurs moléculaires permettent de tester rapidement les bactéries, les graines, les plantes ou les parties de plantes et d'identifier les bactéries comme étant ou pas des bactéries Pseudomonas Syringae pv. peponis, et/ou de diagnostiquer la présence ou l'absence de cette bactérie sur les graines, les plantes ou les parties de plantes analysées.
Un marqueur moléculaire spécifique selon la présente invention sera un marqueur moléculaire identifiant spécifiquement la bactérie Pseudomonas Syringae pv. peponis. Il permet de différencier cette bactérie d'autres bactéries, notamment d'autres bactéries Pseudomonas. Le marqueur 4Ba est un tel marqueur moléculaire spécifique.
- Par partie de plante on entend notamment le pollen, les ovules, les embryons, les feuilles, les anthères, les tiges, les pétioles, les racines, les fruits, les graines, les fleurs, les bourgeons, les protoplastes, les cals, les cellules et tissus cellulaires.
- Par résistance d'une plante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis on entend par exemple la capacité d'une plante à restreindre la croissance et le développement de la bactérie et/ ou les dommages qu'ils occasionnent, en comparaison avec des plantes sensibles et dans des conditions similaires, environnementales et de pression de cette bactérie Les plantes résistantes peuvent exprimer quelques symptômes de la maladie ou quelques dommages en cas de forte pression de la bactérie.
- Par sensibilité d'une plante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis, on entend par exemple l'incapacité d'une plante à restreindre la croissance et le développement de la bactérie, développant alors les symptômes de nécroses sur les cotylédons des plantules, de décolorations sur les jeunes feuilles, de rabougrissement de la plante et du blocage de son développement.
- Par gène de ménage on entend par exemple des gènes qui interviennent dans les métabolismes principaux, gènes communs à toutes les bactéries, codant pour des fonctions essentielles
- Par amorce, on entend une séquence artificielle d'ADN, courte (de 4 à 30 paires de bases) complémentaire d'un des brins du fragment d'ADN que l'on souhaite amplifier par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou que l'on souhaite séquencer. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont donc levé le voile sur un problème phytosanitaire lié aux cultures de courgettes Cucurbita pepo. Ce problème se manifeste principalement par les nécroses foliaires sur jeunes plantules. En conditions de basse température, les symptômes peuvent devenir systémiques, provoquant des éclaircissements sur jeunes feuilles et un blocage des plantes. Une attaque tardive sur plantes adultes se manifestera par la présence de nécroses entourées d'un halo jaune sur les feuilles, sans grand dommage sur le rendement. C'est au niveau jeune plant que les dommages sont les plus marqués et aussi à ce stade que la transmission de plantules à plantules est la plus dangereuse. Ce problème affectant largement le rendement des plantes, il est apparu indispensable aux inventeurs d'identifier cette nouvelle bactérie et de fournir des procédés d'identification, de caractérisation de celle-ci mais aussi de fournir des procédés permettant de détecter la présence ou l'absence de cette bactérie sur un échantillon donné, de préférence un échantillon de plante ou de graine donnée, de préférence de courgette.
L'identification d'un nouveau problème phytosanitaire sur des cultures de courgettes manifesté par des symptômes de nécrose foliaires encore jamais vus sur de jeunes plantules à conduit les présents inventeurs à identifier une nouvelle bactérie déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM 1-4159. Cette nouvelle bactérie a été identifiée par les présents inventeurs comme une bactérie Pseudomonas syringae, et, de part sa présence sur des graines de courgettes, a été nommée Pseudomonas syringae peponis.
Selon un autre objet de l'invention, la bactérie Pseudomonas syringaea peponis comprend au moins une séquence de nucléotides sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°10, SEQ ID N0I l, SEQ ID N°12 et SEQ ID N°13.
La qualité sanitaire des semences étant un caractère majeur pour la commercialisation des semences et pour la gestion de la qualité sanitaire des cultures, il est capital de pouvoir disposer de moyens d'identification de la présence ou de l'absence d'une bactérie dans un échantillon, que cet échantillon soit une graine, une plante, une partie de plante, voire éventuellement un sol d'un champ ou de serre.
Les présents inventeurs ont donc développé divers moyens et méthodes d'identification et de détection de la bactérie Pseudomonas syringae peponis ainsi que les moyens (outils) permettant la mise en œuvre desdites méthodes.
Moyens .d'identification et de. détection, relevant de. la b io.logie moléculaire
Sondes:
La présente invention a pour objet :
Un marqueur moléculaire 4Ba de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus.
Un marqueur moléculaire 4Ba caractérisé en ce qu'il est défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°9 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, de préférence au moins 11 nucléotides, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N0IO et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N0IO.
Un marqueur moléculaire 4Ba caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique comprend tout ou partie de la SEQ ID N0I l, de préférence au moins 11 nucléotides de la SEQ ID N°l 1, ou tout ou partie de la séquence SEQ ID N°12
(séquence complémentaire de SEQ ID N°l 1).
Un des objets de la présente invention concerne également la séquence de nucléotides isolée consistant en tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 11 , de préférence au moins 11 nucléotides de la SEQ ID N0I l, ou tout ou partie de la séquence SEQ ID N°12, caractérisée en ce qu'elle permet la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis.
Cette séquence de nucléotides permet de réaliser au moins une sonde de nucléotides spécifique de ce marqueur 4 Ba et en particulier de tout ou partie de SEQ ID N0I l, de préférence au moins 11 nucléotides de la SEQ ID N°l 1, ou tout ou partie de SEQ ID N°12. Ces sondes sont des séquences d'ADN ou d'ARN marquées (par un composé fluorescent, un radioisotope, ou une enzyme ou tout autre molécule adaptée) que l'on utilise pour détecter des séquences homologues (complémentaires) par hybridation in situ ou in vitro avec leur séquence nucléotidique complémentaire. Elles permettent alors la détection et/ou la localisation du marqueur 4Ba et par conséquent de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, objet de la présente demande. De préférence, selon la présente invention, on préférera les sondes d'ADN. La réalisation et l'utilisation des sondes marquées faisant appel à des techniques largement connues de l'homme de l'art, elles ne seront pas rappelées dans le présent exposé.
Amorces:
La présente invention a pour objet une (ou plusieurs) amorce(s) nucléotidique(s) pour la détection et l'identification de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend
a. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 8, de préférence au moins 11 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°9 intégrale;
b. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°10, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°10 intégrale;
c. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 11, de préférence d'au moins 11 nucléotides de la SEQ ID N° 11 ;
d. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 12; ou
e. un couple d'amorces comportant une première amorce (a) et/ou (c) et une seconde amorce (b) et/ou (d). Dans une variante de réalisation, les amorces nucléotidiques pour la détection et l'identification de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, comprend :
a. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 9, ou au moins 10, ou au moins 11, ou au moins 12, ou au moins 13, ou au moins 14, ou au moins 15, ou au moins 16, ou au moins 17, ou au moins 18, ou au moins 19, ou au moins 20, ou au moins 21, ou au moins 22, ou au moins 23, ou au moins 24, ou au moins 25, ou au moins 26, ou au moins 27, ou au moins 28, ou au moins 29, ou 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°9 intégrale;
b. de 10 à 30 nucléotides dont au moins au moins 9, ou au moins 10, ou au moins 11, ou au moins 12, ou au moins 13, ou au moins 14, ou au moins 15, ou au moins 16, ou au moins 17, ou au moins 18, ou au moins 19, ou au moins 20, ou au moins 21, ou au moins 22, ou au moins 23, ou au moins 24, ou au moins 25, ou au moins 26, ou au moins 27, ou au moins 28, ou au moins 29, ou 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°10, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°10 intégrale;
c. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 11 dont au moins 8, ou au moins 9, ou au moins 10, ou au moins 11, ou au moins 12, ou au moins 13, ou au moins 14, ou au moins 15, ou au moins 16, ou au moins 17, ou au moins 18, ou au moins 19, ou au moins 20, ou au moins 21, ou au moins 22, ou au moins 23, ou au moins 24, ou au moins 25, ou au moins 26, ou au moins 27, ou au moins 28, ou au moins 29, ou 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 11 ;
d. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 12 dont au moins 8, ou au moins 9, ou au moins 10, ou au moins 11, ou au moins 12, ou au moins 13, ou au moins 14, ou au moins 15, ou au moins 16, ou au moins 17, ou au moins 18, ou au moins 19, ou au moins 20, ou au moins 21, ou au moins 22, ou au moins 23, ou au moins 24, ou au moins 25, ou au moins 26, ou au moins 27, ou au moins 28, ou au moins 29, ou 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°12; ou
e. un couple d'amorces comportant une première amorce (a) telle que définie ci-dessus et/ou (c) telle que définie ci-dessus, et une seconde amorce (b) telle que définie ci-dessus et/ou (d) telle que définie ci-dessus.
De manière encore plus préférée, l'amorce nucléotidique comprend la séquence SEQ ID N°9 ou la séquence SEQ ID N°10. Méthodes, d'identification et de. détection relevant de la .biologie moléculaire
La présente invention a pour objet une méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie supra, dans un échantillon, à l'aide d'un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs susdéfinis et/ou au moins une amorce susdéfinie.
De préférence, le moyen de biologie moléculaire comprend:
une sonde d'ADN spécifique de tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 11 ou de la SEQ ID N° 12 permettant une hybridation, et/ou
un couple d'amorces (e) tel que défini supra permettant une amplification en chaîne par polymérase (PCR Polymerase Chain Reaction).
Selon un mode préféré de la présente invention, la méthode d'identification et de détection de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon est caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre d'un marqueur moléculaire spécifique de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Ce marqueur moléculaire est amplifié dans le génome de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis alors qu'il ne l'est pas dans le génome des autres bactéries Pseudomonas syringaea. Moyens et méthodes, d'identification et de détection relevant de. l'immunologie
L'invention a également pour objet un anticorps apte à reconnaître la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie supra et une méthode immunologique de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon à l'aide de cet anticorps.
Selon une variante possible, la méthode de détection immunologique comprend une première étape de traitement d'un échantillon en vue d'en extraire d'éventuelle(s) bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis, puis la mise en contact dudit échantillon traité avec un anticorps spécifique de ladite bactérie.
Moyens, et méthodes, d'identification et de. détection relevant de. la microbiologie
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de détection et d'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisé en ce qu'elle consiste à mettre en œuvre un milieu de culture spécifique LBCA additionné ou non de lincomycine.
Ce milieu de culture permet d'une part d'inhiber la croissance de la plupart des autres souches bactériennes se trouvant dans l'échantillon à analyser et d'autre part d'identifier la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis grâce à son caractère levane parmi les éventuelles souches bactériennes qui pourraient croître dans le milieu.
Moyens..et .méthodes .d'identification et de. détection relevant de cultures .comparées, de plantes
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, dans un échantillon végétal, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) le traitement dudit échantillon, de préférence par broyage ou macération, en vue d'extraire d'éventuelle(s) bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis,
(2) l'inoculation de plantes ou de graines exemptes de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis avec l'extrait obtenu en (1),
(3) la culture desdites plantes ou graines inoculées issues de l'étape (2),
(4) la comparaison morphologique des plantes ou graines issues de l'étape (3) avec des plantes issues de plantes ou de graines inoculées avec la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, pour en déduire l'infection ou la non-infection de l'échantillon objet de la détection et de l'identification. De préférence, l'échantillon est issu d'une plante sélectionnée parmi les plantes de la famille des cucurbitacées, une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis et une plante de courgette cucurbita pepo. Combinaisons
Une variante de la présente invention consiste à combiner les moyens et/ou les méthodes de détection de la Pseudomonas syringaea peponis .
L'invention vise donc une méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle combine au moins deux méthodes choisies dans le groupe comprenant :
i. La méthode relevant de la biologie moléculaire;
ii. La méthode relevant de l'immunologie ;
iii. La méthode relevant de la microbiologie;
iv. La méthode relevant de cultures comparées de plantes.
Une variante préférée de l'invention consiste en une méthode de détection et d'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre d'un milieu de culture sélectif LBCA additionné ou non de lincomycine combinée avec la mise en œuvre d'un moyen de biologie moléculaire pour la détection et l'identification de la bactérie. Ainsi, la nature des bactéries qui se développent sur le milieu sélectif et qui présentent le caractère levane est confirmé par l'analyse de marqueur moléculaire et/ou d'une sonde spécifique d'une séquence génétique de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. De manière alternative, une autre variante préférée de l'invention consiste en une méthode de détection et d'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre d'un milieu de culture sélectif LBCA additionné ou non de lincomycine combinée avec la mise en œuvre d'un moyen immunologique pour la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Ainsi, la nature des bactéries qui se développent sur le milieu sélectif et qui présentent le caractère levane est confirmé par la reconnaissance de l'anticorps apte à reconnaître la bactérie Pseudomonas syringaea peponis.
De manière encore alternative, une autre variante préférée de l'invention consiste en une méthode de détection de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre d'un moyen immunologique selon un des aspects de la présente invention et la mise en œuvre d'un moyen de biologie moléculaire selon un des aspects de la présente invention pour la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Dans ce dernier cas, la mise en œuvre du moyen immunologique peut suivre ou bien précéder la mise en œuvre du moyen de biologie moléculaire. Echantillons
La détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis selon les différents aspects de la présente invention peut être réalisée sur graine, une plante, une partie de plante ou un sol. La détection peut être réalisée sur la graine notamment lorsqu'il s'agit de déterminer l'état sanitaire d'un lot de graine, c'est-à-dire sa contamination éventuelle par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. La détection peut être réalisée sur une plante, sur une plantule ou sur une partie de plante notamment avant un transfert de la plante et ou de la plantule entre deux localisation, par exemple entre une serre ou la plantule se développe initialement et un champ ou elle est transplantée pour achever sa croissance et porter des fruits. La détection peut aussi être faite sur une plante, sur une plantule ou sur une partie de plante lorsque l'infection par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est suspectée, que des symptômes soient déjà présent ou pas encore. L'identification la plus rapide et la plus précise de la contamination d'une graine, d'une plante ou d'une plantule permet de prendre les mesures de sauvegarde adéquates, qu'il s'agisse de décontaminer les graines ou de traiter la plante ou la plantule. La détection peut encore être envisagée sur un échantillon de sol, par exemple dans un champ ou dans une serre dans lequel une culture de plante sensible à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est envisagée. En cas de contamination avérée du lieu de culture envisagée, une autre plante pourra être semée, par exemple une plante résistante à la bactérie, ou les moyens de luttes mis en œuvre très rapidement, avant même l'apparition des premiers symptômes.
Avantageusement, la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis selon les différents aspects de la présente invention est réalisée sur une graine, une plante, une partie de plante d'une plante de la famille des cucurbitacée, de manière préférée d'une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo.
Kits
La présente invention concerne également un kit pour la détection et l'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs susdéfmis et/ou au moins une amorce susdéfïnie, et/ou au moins un anticorps susdéfmi,
et/ou au moins un milieu de culture LBCA additionné ou non de lincomycine. Identification de. plantes .résistantes
La présente invention vise également une méthode d'identification de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend :
l'inoculation d'au moins une plante, d'au moins une graine ou d'au moins une partie de plante avec cette bactérie, puis
l'identification de la ou des plante(s) résistante(s) ne présentant pas les symptômes de sensibilité à cette bactérie.
Un autre objet de l'invention peut être la méthode d'inoculation d'un échantillon avec une bactérie, caractérisée en ce que l'inoculum mis en œuvre comprend la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la présente demande.
Avantageusement, cette plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est une plante de la famille des cucurbitacées, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo
Création de.plantes .résistantes
La présente invention concerne encore une méthode de création de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) l'identification d'une plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis,
(2) le croisement de cette plante résistant avec une plante sensible à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, et
(3) l'identification de plante résistante dans la descendance de la plante issue de l'étape (2).
Avantageusement, la plante identifiée comme résistante à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est une plante de la famille des cucurbitacées, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo. La plante sensible à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est une plante de la famille des cucurbitacées, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo . Selon un mode préféré de l'invention le croisement de la plante résistante avec la plante sensible est réalisée entre des plantes de même espèce, par exemple un croisement entre deux plantes de cucurbita pepo, entre deux plante de cucumis melo voire entre deux plantes de cucumis sativus. Toutefois, le croisement peut aussi avoir lieu au sein du même genre, par exemple entre une plante cucurbita pepo et une plante cucurbita moschata. La mise en œuvre et la réalisation de ces croisements est connue de l'homme du métier.
Sélection .d'un lot de semence
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de sélection d'un lot de semence caractérisée en ce qu'elle met en œuvre :
la méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, dans un échantillon, selon laquelle on met en œuvre au moins l'une des méthodes choisies dans le groupe comprenant :
i. La méthode relevant de la biologie moléculaire;
ii. La méthode relevant de l'immunologie
iii. La méthode relevant de la microbiologie;
iv. La méthode relevant de cultures comparées de plantes,
- et/ou la méthode d'identification d'une plante résistante susdéfînie,
et/ou le kit de détection et d'identification susdéfîni.
Par sélection d'un lot de semence, on entendra l'identification d'un lot de semence qui puisse être directement vendu, transféré, que ses graines soient mises en culture dès que le lot sera identifié et diagnostiqué comme non contaminé par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis alors qu'un autre lot devra être soit décontaminé soit détruit lorsqu'il sera diagnostiqué contaminé par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis.
Bien évidemment, la méthode de sélection d'un lot de semence selon l'invention peut combiner au moins deux des méthodes i., ii., iii. et iv. évoquées ci-dessus.
Cette méthode de sélection d'un lot de semence peut mettre en œuvre au moins le marqueur moléculaire 4 Ba tel que défini précédemment, et/ou au moins une amorce spécifique du marqueur moléculaire 4Ba telle que définie précédemment, et /ou au moins l'anticorps apte à reconnaitre la bactérie selon l'invention tel que défini précédemment, et/ou le kit de détection de la bactérie, et/ou au moins l'une des méthodes de détection telles que mentionnées ci-dessus. EXEMPLES :
I/ Identification d'une nouvelle souche bactérienne: 1/ Analyse biochimique de la souche bactérienne inconnue.
Les présents inventeurs ont identifié différents lots de graines de courgettes Cucurbita pepo contaminés par une bactérie dont les symptômes de nécrose foliaires sur les jeunes plantules qui sont issues de ces graines sont, jusqu'à présent, inconnus. Les bactéries sont extraites des semences de courgette par broyage avec un broyeur à marteau de type Stomacher durant 10 minutes dans un sachet prévu à cet effet. Les souches de bactéries issues des différents échantillons de graines de courgettes contaminés sont nommées de A à F.
La caractérisation de ces bactéries est réalisée par différents tests biochimiques qui permettent de vérifier si la bactérie à un métabolisme oxydatif ou fermentatif, s'il y a formation d'un acide à la suite de l'utilisation d'un hydrate de carbone (sorbitol), si un composé particulier est utilisé comme seule source de carbone, si un acide aminé peut être transformé (arginine), si un enzyme particulier peut être présent (oxydase) ou si des molécules complexes peuvent être dégradées (gélatine) : Ces différents test sont bien connus de l'homme de l'art lors de l'identification de bactéries. Ces derniers permettent d'identifier la bactérie inconnue comme une bactérie du type Pseudomonas syringaea (cf. tableau 1).
Tableau 1 : tests biochimi ues our déterminer la nature des bactéries inconnues
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
PP signifie polypectate.
Au vu des résultats obtenus sur les différents tests pratiqués et répertoriés dans le tableau 1 ci-dessus, la bactérie inconnue a pu être identifiée comme une bactérie du type Pseudomonas syringaea.
L'année suivante, 10 nouveaux lots de graines de courgettes contaminés par la bactérie inconnue sont identifiés par les inventeurs et les bactéries contaminantes isolées. :
A partir de plantes présentant des symptômes (nécroses) sur cotylédons ou feuilles, les isolements pour identification sont réalisés ; un prélèvement des nécroses est réalisé et cette partie du tissu végétal est dilacérée dans l'eau et en condition stérile. Un extrait du liquide où la bactérie est supposée présente est étalé dans une boîte de Pétri contenant un milieu artificiel classique permettant une croissance bactérienne. Ces boîtes sont positionnées dans une étuve à 300C favorable à la croissance bactérienne. Le développement et l'isolement de colonies bactériennes sont le point de départ de l'identification plus précise par la suite des tests biochimiques.
Ces dernières sont nommées de PsWl à PsWlO.
Les premières expériences ayant orienté l'identification des bactéries inconnues vers des bactéries de type Pseudomonas syringae, des analyses biochimiques spécifiques à l'analyse des bactéries Pseudomonas syringae sont réalisées afin de confirmer la nature des bactéries PsWl à PsWlO. Ces tests LOPAT sont la production de levane (la polymérisation du fructose en polyfructose), la présence d'oxydase (la détermination de la présence de l'enzyme cytochrome C oxydase), la dégradation de la pectine (la détermination de la présence de pectinases), la présence d'arginine déshydrolase (la transformation de l'arginine par l'arginine déshydrolase) et l'hypersensibilité au tabac (la mise en évidence du pouvoir pathogène d'une bactérie par le dessèchement des zones d'inoculation sur les feuilles de tabac). Une analyse sur milieu Hugh et Leifson (H&L) permet de déterminer la voie métabolique du glucose. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous : Tableau 2 : tests LOPAT pour confirmer la nature des bactéries inconnues
Figure imgf000019_0001
Les analyses confirment que les souches de la bactérie inconnue PsWl à Ps W9 sont bien des souches de bactéries Pseudomonas syringae ayant les mêmes caractères que les six souches initiales A a E. Seule la souche PsWlO présente des différences et ne correspond donc pas à une souche de bactérie Pseudomonas syringae.
Une vérification morphologique est alors réalisée au moyen d'un microscope sur des bactéries à l'état frais (bactéries en pleine croissance ; isolée sur un milieu artificiel en boîte de Pétri, généralement à 300C, après 48h): toutes les souches sont morphologiquement identiques sauf la souche PsWlO. La microscopie montre, pour les souches PsWl à PsW9, des bacilles long à moyen, isolés ou plus rarement groupés par deux, mobiles et ayant un déplacement aléatoire. La souche PsWlO, quant à elle, est un bacille très court ovoïde (cocobacile), statique donc non flagellé, groupé souvent par 2. Ces différentes analyses permettent de confirmer que la nouvelle bactérie inconnue est du type Pseudomonas syringae.
2/ Analyse de la séquence nucléotidique du gène rrs codant IΑRN16S : Résultat du séquençage et de l'analyse du gène rrs codant l'ARN 16S (SEQ ID N°13) : GTCGAGCGGCAGCACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGA GTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGC TAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCT ATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAG GCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGAC ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCG AAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTA CCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGA GGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTG TTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTG GCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATAC TGACACTGAGGTGCGAAAGCGTNNANAGCAAACAGNNTTAGATACCCTGGTA GTNNACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTG GCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGA GATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCT TAGTTACCAGCACATTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTAC ACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTA ATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAG CTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGG
La recherche de séquences homologues dans les banques de données de séquences nucléiques par le logiciel BLASTn a abouti à trouver une homologie très forte avec des séquences de Pseudomonas fluorescent oxydase-négatif. La première séquence affichée est celle de P. s. pv. glycinea (1417 sur 1426 bases analogues). Ce gène n'est cependant pas suffisamment discriminant pour conclure sur l'identité de l'espèce bactérienne et a fortiori du pathovar auquel appartient la souche.
3/ Analyse de la diversité génomique des souches :
Pour étudier la diversité génomique des souches et préciser leur identité phylogénétique, les présents inventeurs ont choisi deux gènes de ménage gyrB qui code pour la sous unité β de la gyrase bactérienne et rpoD qui code pour le facteur sigma de l'ARN polymérase tels qu'identifiés en 2000 par S. Yamamoto et al. dans « Phytogeny of the genus Pseudomonas / intragenic structure reconstructed from the nucleotide séquences of gyrB and rpoD gènes » Microbiology (2000), 146, 2385-2394.
L'ADN est extrait selon la méthode décrite par Llop et al. Journal of Microbiological Method (1999), 37, 23-31, les gènes étant amplifiés par PCR classique suivant la méthode et avec les amorces décrites par Yamamoto. Le séquençage des amplifications est réalisé par la société Genescreen.
Pour le gène gyrB
UP-IE: 5' CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA 3' (SEQ ID N°l)
APrU: 5' TGTAAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA 3' (SEQ ID
N°2)
Ml 3: 5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3'
M13R: 5' C AGG AAAC AGCT ATG AC C 3'
Pour le gène rpoD
Amorce sens (ou F pour Forward) 70F :
5' ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT 3' (SEQ ID
N°3)
Amorce anti-sens (ou R pour Reverse) 7OR :
5' ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYTTS' (SEQ ID
N°4)
Les séquences nucléotidiques obtenues sont identiques pour toutes les souches de la bactérie inconnue (de la souche A à la souche F), tant pour le gène gyrB que pour le gène rpoD.
Séquence consensus du gène rpoD de la bactérie Pseudomonas responsable de la maladie sur courgette (SEQ ID N°5): CGAAATCGCCAAACGTATCGAAGAAGGCATCCGTGAAGTGATGGGCGCAATC GCGCACTTCCCAGGCACGGTTGACCACATTCTCTCCGAATACACACGCGTCAC CAGTGAAGGCGGTCGCCTTTCCGATGTTCTGAGTGGCTATATCGACCCGGACG ACGGCATTGCGCCGCCTGCCGAAGTCCCGCCGCCTGTCGACCCCAAGGCCGTC AAGGCCGAAGGTGCCGATGACGACGAGGAAGAGTCGGCAGACGCCAGCGACG AAGAAGACGAAGTCGAGAGCGGTCCTGATCCGGTCATCGCCCAGCAGCGCTTC GGTGCGGTTTCCGATCAAATGGAAATCACCCGCAAGGCCCTGAAGAAATTTGG TCGCGACGACAAGCACGCCATTGCCGAAATGGTTGCACTGGCCGAACTGTTCA TGCCGATCAAACTGGTTCCAAAACAGTTTGAAGGCCTGGTGGAGCGTGTACGC GGTGCCCTTGAGCGTCTTCGTGCCCAGGAACGCGCCATCATGCAGCTGTGTGT ACGTGATGCACGTATGCCGCGCGCCGACTTCCTGCGCCAGTTCCCGGGCAACG AAGTTGACGAAAGCTGGACTGACGCACTGGCCAAGGGCAAGAGCAAATACGC CGAAGCCATCGGTCGCCTGCAGCCTGACATCCAGCGTTGCCAGCAGAAGCTGT CCGCACTGGAAGAAGAGACCGGCCTGAAAATCGCCGAGATCAAGGACATCAA CCGTCGCATGTCGATCGGTGAGGCCAAGGCCCGCCGCGCGAA
Séquence consensus du gène syrB de la bactérie Pseudomonas responsable de la maladie sur courgette (SEQ ID N°6):
GCGATATCCAGTGCGCCTTTACGACGGGTCATCTCACGCGCCTTGCGCGCAGC TTCACGGGCACGGGCTGCGTCGATCATCTTGCCGACAACCGCTTTGGCTTCATT CGGGTTTTCCAACAGGAAGTCGGAGAAGTACTTGCCCATTTCCTGTTCGACAG CCGTTTTGACTTCGGACGAAACCAGCTTGTCCTTGGTCTGCGAGCTGAACTTTG GATCAGGCACCTTGACCGAAATGATCGCCGTCAGACCTTCACGCGCGTCATCG CCAGTGGTCGCGACCTTGTGCTTCTTGGCCAGACCTTCCTGCTCGATGTAGTTG TTCAGGTTGCGCGTCAACGCAGAACGGAAACCCACCAGGTGAGTACCGCCATC ACGCTGCGGGATGTTGTTGGTGAAGCACAGCAGGTTCTCGTTGAAGCTGTCGT TCCACTGCAGAGCAATTTCGACACCGATACCGTCATCACGCTGAATGTTGAAG TGGAACACTTCGTTGACCGGCGTTTTATTGGTGTTCAGGTACTCAACGAACGCG CGCAGACCGCCTTCGTATTTGAACAATTCTTCCTTACCGCTGCGCTCATCCTTG AGGACAATGCCGACACCGGAGTTCAGGAAGGACAGTTCACGAATCCGCTTGGC CAGAATGTCCCAGCTGAAGTGGATGTTCTTGAACGTTTCAGCGGAAGGCTTGA AGTGGATCTGAGTGCCTGTGCTGTCACTTTCACCGACGATCTTCATCGGTTCCT GTGGAACACCATGAACATAGGTCTGTTCCCAGATCTTGCCGCTGCGGCGAACC GTCAGCAACAGAAGCTCTGAAAGGGCGTTAACCACAGAGACACCTACACCGT GCAAAC
Une analyse d'homologie de séquences est réalisée au moyen du programme BLASTn sur le serveur du NCIMB (http://www.ncimb.nlm.nih.gov) afin d'identifier des souches bactériennes présentant des homologies de séquences avec la bactérie inconnue. Les résultats sont présentés dans les deux tableaux suivants (Tableaux 3 et 4). Le pourcentage d'identité est calculé sur la longueur nucléotidique présentant le maximum d'identité entre les deux séquences comparées
Tableau 3 : Résultats des analyses d 'homologies pour le gène rpoD :
La séquence du gène rpoD de la bactérie inconnue est comparée aux séquences du gène rpoD d'autres souches bactériennes. En fonction des informations disponibles sur les séquences de ces autres souches bactériennes la comparaison se fait sur toute la longueur de la séquence du gène rpoD de la bactérie inconnue (780 nucléotides) ou moins.
Figure imgf000023_0001
Tableau 4 : Résultats des analyses d'homologies pour le gène gyrB :
Figure imgf000023_0002
Les séquences nucléotidiques des gènes gyrB et rpoD des bactéries Pseudomonas syringae isolés des lots de graines de courgette contaminées par la bactérie inconnue ont été comparées avec les séquences nucléotidiques des gènes gyrB et rpoD d'autres bactéries Pseudomonas syringae. La plus forte homologie de séquence est retrouvée entre les séquences nucléotidiques des gènes gyrB et rpoD de la bactérie inconnue et celles de la bactérie Pseudomonas syringae pv. syringae n°CFBP1392. D'autres bactéries Pseudomonas syringae montrent aussi des homologies proches, il s'agit de Pseudomonas syringae pv. lapsa, pv. pisi et pv. aptata. On peut en conclure que la bactérie inconnue est une souche de Pseudomonas syringae. 4/ Mise au point d'un milieu de culture adapté à l'isolement de la bactérie phytopathogène de type Pseudomonas syringaea
Afin de pouvoir conduire des expérimentations nécessaires à l'étude de cette nouvelle bactérie Pseudomonas syringae responsable de la bactériose sur courgette, les inventeurs ont dû identifier un milieu de culture adéquat à la bactérie. a) Détermination du spectre d'antibiorésistance des souches d'études:
Dans une première étape, les inventeurs ont déterminé le spectre d'antibiorésistance des souches de la bactérie Pseudomonas syringae inconnue, en la testant sur une gamme d'antibiotique couramment utilisé en phytobactériologie. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5 : résultats des tests de résistance aux antibiotiques par détermination de la concentration minimum inhibitrice (CMI) des antibiotiques.
Figure imgf000024_0001
La concentration inférieure signifie qu'à partir de cette concentration donnée d'antibiotique, un effet sur la croissance de la bactérie est observé.
La concentration supérieure signifie qu'au-delà de cette concentration d'antibiotique, la bactérie ne se développe plus.
A une concentration d'antibiotique située entre la concentration inférieure et la concentration supérieure, une croissance moyenne de la bactérie est observée.
Pour la bacitracine, la colistine, la spectinomycine et la carbénicilline, la concentration inférieure est identique à la concentration supérieure ce qui signifie qu'il s'agit d'un "tout ou rien" : en dessous de la concentration inférieure donnée d'antibiotique, la bactérie, objet de la présente invention, se développe et, au dessus de cette même concentration dudit antibiotique, ladite bactérie ne se développe pas.
Les tests ont été effectués à partir de dépôts de 2 μL de suspensions bactériennes à 106
UFC/mL, soit 103 UFC. Les lectures ont été réalisées après 2, 3, 4,5 et 6 jours de cultures à 27°C. La concentration minimum inhibitrice des antibiotiques est mesurée en mg/1.
Les antibiotiques bacitracine, colistine et lincomycine sont dosés aux concentrations respectives de 5,104 U/mg, 21,03 U/mg et 863 U/mg.
Les résultats de concentration minimum inhibitrice indiquent que les 6 souches de la bactérie inconnue étudiées sont résistantes à plusieurs des antibiotiques testés. La céfalexine, la céfalotine et la céfuroxine étant de la même famille et ayant le même mode, un seul sera conservé pour les étapes suivantes. Les antibiotiques conservés pour la mise au point d'un milieu de culture sélectif à l'agent causal de la maladie sur courgette sont donc la nitrofurantoïne, la bacitracine, la céfalexine, la lincomycine, la carbénicilline, le trimethoprime, la vancomycine et la novobiocine. b/ Mise au point du milieu de culture.
Dans la littérature et en particulier dans les trois publications suivantes :
- Plant Pathogenic Bacteria. Third édition. N.W. Schaad, J. B. Jones and W. Chun,
- S. K. Mohan and N.W. Schaad. An improved agar plating assay for detecting Pseudomonas syringae pv. syringae and P. s. pv. phaseolicola in contamined bean seed.
Phytopathology 77 : 1390-1395, et
- Schaad N.W., et al. 1995. A combined biological and enzymatic amplification (BioPCR) technique to detect Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in bean seed extract. Phytopathology 85 : 243-2,
sont décrits plusieurs milieux de culture donnés comme sélectifs ou adaptés aux Pseudomonas syringae comme par exemple les milieux KBC, BCBRVB, MSP et LBCA. Ces milieux sont à base de King B (KBC, BCBRVB) ou se basent sur un caractère biochimique pour une reconnaissance morphologique facile (MSP : caractère levane, à savoir la croissance bombée des bactéries et fluorescence bleu ; LBCA : caractère levane mis en évidence).
D'après les résultats de concentration minimum inhibitrice obtenus et en se basant sur les milieux connus dans la littérature, différents milieux à base de King B et de LBCA additionné d'antibiotiques sont testés (cf. Tableau 6).
Tableau 6 : Milieux de culture testés pour la culture de la bactérie inconnue
- KB sans antibiotique
- KBC + carbénicilline + bacitracine
- KBC + carbénicilline + lincomycine + novobiocine
- KBC + nitrofurantoïne + novobiocine
- KBC + lincomycine + bacitracine
KBC + lincomycine + nitrofurantoïne + triméthoprime
KBC
- KBC + vancomycine + carbénicilline
- KBC + vancomycine + novobiocine
KBC + bacitracine + vancomycine + carbénicilline
LBCA + novobiocine
- LBCA + bacitracine
- KBC + carbénicilline + novobiocine
KBC + carbénicilline + lincomycine + nitrofurantoïne
KBC + carbénicilline + lincomycine + bacitracine
- KBC + nitrofurantoïne + triméthoprime
- KBC + lincomycine + nitrofurantoïne + novobiocine
- MSP
- BCBRVB
- KBC + bacitracine + vancomycine
- KBC + vancomycine + novobiocine + carbénicilline
- LBCA
- LBCA + lincomycine
- LBCA + triméthoprime Description des milieux :
Les antibiotiques sont ajoutés à lOOmg/L (concentration finale dans le milieu) sauf la vancomycine, la bacitracine et la novobiocine qui sont à 20mg/L, la céfalexine à 80mg/L et la carbénicilline, la lincomycine et le triméthoprime qui sont à 50mg/L. King B
Protéose peptone 20g
Glycérol 1OmL ou 12.6g
K2HPO4 1.5g
MgSO4, 7H2O 1.5g
Agar 15g
q.s.p. IL BCBRVB
King B 95OmL
Après autoclave, ajouter le mélange d'antibiotique suivant dans 1OmL d'éthanol + 4OmL d'eau distillée : bacitracine (lOmg), vancomycine (6mg), rifampicine (0.5mg), cycloheximide (75mg) et bénomyl (0.25mg)
KBC
King B 90OmL
Après autoclave, ajouter 100 ml d'acide borique stérile 1.5% en solution aqueuse, 8mL de céfalexine lOmg/mL et 2 mL de cycloheximide lOOmg/mL MSP
Saccharose 20g
Peptone 5 g
K2HPO4 0.5g
MgSO4, 7H2O 25.0mg
Agar 20g
Ajuster le pH à 12-1 A, autoclaver puis ajouter 8mL de céfalexine lOmg/mL, 2mL de cycloheximide lOOmg/mL, ImL de vancomycine lOmg/mL et ImL de BBT 15mg/mL
LBCA
Levure 2g
Bacto-peptone 5 g
Saccharose 50g
Acide borique 1.5 g
Agar 15g
q.s.p. IL
NaOH 2mL Autoclaver puis ajouter 8mL de céfalexine lOmg/mL et 2mL de cycloheximide lOOmg/mL.
Ces milieux sont initialement testés sur des isolats de souche bactérienne afin d'identifier lesquels permettent une croissance de la bactérie inconnue. 8 milieux sont sélectionnés, les autres inhibant de façon plus ou moins conséquente la croissance de la bactérie pathogène.
Milieu 1 KBC additionné de bacitracine et de vancomycine
Milieu 2 KBC additionné de vancomycine et de novobiocine
Milieu 3 KBC
Milieu 4 MSP
Milieu 5 BCBRVB
Milieu 6 LBCA
Milieu 7 LBCA additionné de lincomycine
Milieu 8 LBCA additionné de novobiocine
Ces milieux sont alors utilisés non plus sur des isolats de la souche bactérienne inconnue, mais directement sur des macérats de graines contaminées avec la souche bactérienne inconnue(le macérât est la phase liquide obtenue après mise en présence d'un échantillon de semences dans une quantité d'eau, obtenu généralement après agitation, voir un broyage). Comme les graines ne sont pas uniquement porteuses de la bactérie inconnue mais aussi contaminées par d'autres bactéries qui constituent une flore saprophyte, il est nécessaire que le milieu choisi favorise la croissance de la bactérie inconnue mais pas celle des autres bactéries. Les tests sur macérât de graines contaminées montrent que les milieux à base de King B n'ont pas un pouvoir inhibiteur suffisant car d'autres souches bactériennes, différentes de la souche bactérienne inconnue croissent malgré les antibiotiques. Ces milieux sont donc éliminés. De manière similaire, le milieu MSP n'inhibe pas assez la flore saprophyte qui se trouve dans les macérats de graines et est éliminé pour les mêmes raisons.
Les milieux à base de LBCA présentent un avantage par rapport aux milieux à base de King B puisque le LBCA permet de différencier la souche d'étude par un caractère biochimique, le caractère levane : les Pseudomonas ont un aspect légèrement nacré et les colonies sont très bombées, rondes. De plus, la concentration en saccharose étant très élevée dans ces milieux, (50g/L) elle inhibe la croissance de la flore saprophyte.
Ainsi, lorsque du macérât de graine contaminé par la bactérie inconnue est testé sur les milieux à base de LBCA, on observe après 48h d'incubation sur boîte quelques colonies à la morphologie très remarquable et spéciale aux bactéries Pseudomonas. Il subsiste encore quelques colonies de la flore saprophyte mais elles sont facilement reconnaissables grâce au caractère levane. On notera que le milieu LBCA additionné de novobiocine inhibait légèrement la croissance de la bactérie Pseudomonas et a été écarté par précaution ; sur des lots à très faible contamination, il aurait été possible de ne pas identifier la contamination.
D'après les résultats obtenus lors des différents tests, les milieux LBCA et LBCA additionné de lincomycine (LBCAL) (50mg/L) sont les mieux adaptés pour tester la qualité sanitaire des semences de courgettes et la présence de la bactérie inconnue.
5/ Mise au point d'un test de pouvoir pathogène La bactérie inconnue pouvant être maintenant cultivée et maintenue sur un milieu de culture, les inventeurs ont mis au point un test de pouvoir pathogène afin de vérifier sa pathogénicité.
Une suspension de bactérie à 10 CFU/ml est réalisée à partir d'une culture fraîche de bactéries à tester (24 heures de culture sur milieu gélose approprié LBCA). Des graines de courgette saines sont ajoutées à la suspension et laissées macérées pendant lh30 à 2h en agitation constante, puis récupérées et semées en pots. Un témoin est aussi réalisé avec des graines baignant dans de l'eau. Il faut alors compter 6 à 8 jours pour observer les premières nécroses sur cotylédons des plantules. On observe aussi de façon récurrente un éclaircissement nervaire au bout de 10 à 14 jours, variant suivant la virulence des souches testées). Les graines des plantes macérées avec les bactéries à tester mettent plus de temps à lever que les graines macérées dans l'eau et les cotylédons sortent déformés, enroulés ; les feuilles ne sont pas symétriques et on observe une crispation de la plante après la deuxième feuille.
Cette méthode permet l'expression de symptômes typiques et quantifïables. Ce test peut être utilisé pour mesurer la virulence de souches bactériennes et pour mesurer la sensibilité de génotype de courgette. Selon le protocole décrit ci-dessus, ce test de pouvoir pathogène mis en œuvre sur des semences de melon cucumis melo a permis de montrer que, pour certaines souches, les graines ne germent pas.
Ce test peut aussi être utilisé pour identifier la présence de la bactérie. Enfin, il permet une quantification de la virulence des souches et de la sensibilité des plantes. Ainsi, il permet d'identifier des plantes résistantes à la bactériose induite par la bactérie inconnue.
6 / Identification phénotypique de V agent pathogène par l'étude du pouvoir pathogène sur Cucurbita pepo
Le pouvoir pathogène de différentes souches de bactéries de type Pseudomonas est testé selon la description faite précédemment. Les résultats sont présentés de façon succincte dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000030_0001
(*) Cinquante isolats de la bactérie inconnue sont isolés à partir de différents graines, plantes et partie de plante de courgette Cucurbita pepo contaminés.
(a) provoquant des symptômes atypiques tels que nécroses centrales sur cotylédons mais qui n'empêche pas la plante de continuer sa croissance.
(b) provoquant des symptômes typiques de la bactérie inconnue : nécroses en bordures de feuille et/ou cotylédons avec halo jaune, éclaircissements nervaire, blocage de la croissance à un stade avancé de la maladie.
Ces résultats de test de pouvoir pathogène, conduisent les inventeurs à conclure que seules les souches de bactéries Pseudomonas syringae isolées de courgette provoquent une maladie typique et gênante pour la croissance des plantules de courgette. Les bactéries Pseudomonas syringae pv. aptata provoquent des nécroses mais n'ont aucune incidence sur le bon développement de la plante.
Puisque toutes les souches isolées de courgette provoquent un type de symptômes singulier sur Cucurbita pepo, qui se différencient de ceux causés par les souches de Pseudomonas syringae pv. aptata, les inventeurs proposent de nommer la bactérie inconnue provoquant les symptômes typiques sur courgette Pseudomonas synringae pv. peponis.
Il/ Recherche de signature génétique utilisable pour l'identification de la nouvelle souche bactérienne Pseudomonas syringae peponis:
Les inventeurs ont réalisé un nouveau séquençage et une analyse de l'homologie des séquences des gènes gyrB et rpoD de Pseudomonas syringae peponis comparées à d'autres bactéries de type Pseudomonas et plus particulièrement celles présentées dans le tableau 7 précédent. Les résultats de ces analyses sont présentés dans le tableau 8 ci-dessous :
Tableau 8 : résultats des tests d'homologie des séquences des gènes gyrB et rpoD de Pseudomonas syringae peponis comparées à d 'autres bactéries de type Pseudomonas
Figure imgf000031_0001
Les niveaux d'homologie identifiés laissent très peu de place au polymorphisme dans ces séquences. Une zone à l'intérieur du gène gyrB de la souche Pseudomonas syringae peponis pourrait toutefois présenter un intérêt car une succession de trois nucléotides forme une combinaison unique au sein du groupe génomique 1 des bactéries Pseudomonas syringae.
La figure 1 illustre dans un rectangle cette séquence particulière dans le gène gyr B de la bactérie Pseudomonas syringae peponis Recherche de marqueurs moléculaires spécifiques de la bactérie pathogène sur courgette Pseudomonas syringae peponis.
Au sein du gène rpoD, aucune séquence spécifique à la souche Pseudomonas syringae peponis ne peut être isolée, aucune zone de ce gène n'étant spécifique de celle-ci. Le gène rpoD est donc exclu pour le dessin d'amorces spécifique.
Néanmoins le gène gyrB présente une zone (voir encadré dans la figure 1) qui pourrait être suffisamment spécifique de la souche Pseudomonas syringae peponis, même si le nombre de sites polymorphes reste insuffisant pour obtenir de manière sûre une amplification spécifique. Le marqueur PsCo est défini par le couple d'amorces de séquences nucléotidiques suivantes :
Amorce sens (ou F pour Forward) PsCoF :
5' CTTCACGCGCGTCATCGCCA 3' (SEQ ID N°7)
Amorce anti-sens (ou R pour Reverse) PsCoR :
5' CGCCGGTCAACGAAGTGTTCC 3' (SEQ ID N°8)
Une amplification par réaction en chaîne (PCR) est réalisée afin d'amplifier le marqueur PsCo chez la bactérie Pseudomonas syringae peponis. Pré aration du mélan e réactionnel our la PCR :
Figure imgf000032_0001
Programmes pour le couple d'amorce PsCoF/PsCoR.
Programme d'amplification pour PCR classique :
Ix 95°C 04 : 00
30x 95°C 00 : 30
72°C 00 : 30
Ix 72°C 07 : 00
15°C ∞ La figure 2 montre les résultats de cette PCR.
L'amplifiât du marqueur PsCo est de 252 paires de bases. Comme la figure 2 le montre, ce marqueur défini par le couple d'amorce PsCoF/ PsCoR n'est pas spécifique de la bactérie Pseudomonas syringae. pv. peponis (NF8, NC 8, EN5, Co9A, Nm2) car il amplifie aussi des séquences génétiques différentes de celles de la souche d'étude, à savoir des séquences génétiques de bactéries Pseudomonas syringae pv. aptata (5428, 1617 et 5429), Pseudomonas syringae pv. pisi (2105), Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (2213) et Pseudomonas syringae pv. lapsa (1731).
Les inventeurs se sont alors tournés vers un autre couple d'amorces utilisé au laboratoire pour différencier des souches de Xanthomonas arboricola, basés sur l'amplification d'une séquence comprise dans un opéron codant une NRPS (non ribosomal peptide synthesis). Ce couple d'amorce n'avait jamais été testé chez Pseudomonas. Le marqueur 4BaF est défini par le couple d'amorces de séquences nucléotidiques suivantes :
Amorce sens (ou forward) 4BaF : 5 'GAACAGC AGC CAGTT AC G 3' (SEQ ID N°9) Amorce anti-sens (ou reverse) 4BaR : 5 'TACGC AGTCGATGAGTCC 3 ' (SEQ ID N° 10)
Une amplification par réaction en chaîne (PCR) est réalisée afin d'amplifier le marqueur 4Ba chez la bactérie Pseudomonas syringae peponis.
Le mélange réactionnel est identique à celui utilisé pour le marqueur PsCo, mais les conditions de PCR sont les suivantes :
Programme d'amplification pour PCR classique :
Ix 95°C 04 : 00
3Ox 95°C 00 : 30
56°C 00 : 30
72°C 00:30
Ix 72°C 07 : 00
15°C ∞ La figure 3 montre les résultats de cette PCR.
L'amplifiât du marqueur 4Ba est de 198pb. De manière surprenante, alors que ce marqueur défini par le couple d'amorces 4BaF/4BaR a été spécifiquement créé pour différencier des souches de Xanthomonas campestris, une bactérie spécifiquement pathogène des crucifères, il montre une spécificité vis-à-vis du Pseudomonas syringae pv. peponis puisque seules les souches d'intérêt (Nm2, Clug, NF8, NC8, EN5, Co9A) sont amplifiées (voir figure 3). Aucune autre des souches de Pseudomonas syringae du groupe 1 testées ne sont pas amplifiées. Ce marqueur moléculaire 4Ba a pu être séquence grâce à ces amplifications. Les séquences sens et anti-sens de ce marqueur spécifique de Pseudomonas syringae pv. peponis sont les suivantes :
Séquence du marqueur moléculaire 4B (SEQ ID N°l 1):
5 'GAACAGCAGCCAGTTACGACGCTCGGCAGGCGACGCACAGTCGATCGAGAG
GTAGCACGCACCGGCTTTGAGTACGCCCAAGAGCGCTGCAACCTGCCACTCGG
AGCGCATCATGCAGATACCGACGACATCACCGGGCTGCACATCCTTGCGAAGC
AATATGTCGGCAATTTTGTCGGCGGACTCATCGACTGCGTAS'
Séquence du brin complémentaire du marqueur moléculaire 4B (SEQ ID N°12):
5 'TACGCAGTCGATGAGTCCGCCGACAAAATTGCCGACATATTGCTTCGCAAGG
ATGTGCAGCCCGGTGATGTCGTCGGTATCTGCATGATGCGCTCCGAGTGGCAG
GTTGCAGCGCTCTTGGGCGTACTCAAAGCCGGTGCGTGCTACCTCTCGATCGAC
TGTGCGTCGCCTGCCGAGCGTCGTAACTGGCTGCTGTTCS'
Les résultats des tests de spécificité des marqueurs moléculaires PsCo et 4Ba sont résumés dans le tableau 9
Tableau 9 : Test de spécificité des marqueurs moléculaires
Figure imgf000034_0001
Ainsi le marqueur 4Ba défini par le couple d'amorces 4BaF et 4BaR montre une spécificité vis-à-vis de la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis puisque seules les souches de cette bactérie sont amplifiées (voir figure 3). Les autres souches de Pseudomonas syringae du groupe 1 ne sont pas amplifiées.
IH/ Mise au point de procédures de détection de la bactérie à partir d'échantillons
Les auteurs de la présente invention ont mis au point deux procédures de détection de la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis, à savoir une technique de Bio-PCR et une technique de Seed-PCR. Ces deux techniques combinent une amplification biologique de la bactérie Pseudomonas syringaea pv. peponis à une amplification spécifique de l'ADN par réaction PCR. Toutefois ces deux méthodes se différencient par le milieu d'amplification biologique de la bactérie Pseudomonas syringaea pv. peponis. L'amplification biologique présente un intérêt non négligeable par rapport à d'autres techniques de PCR visant à identifier par exemple des lots de semences contaminées : en effet l'amplification biologique permet de s'assurer que les lots sont contaminés par des bactéries vivante alors qu'une simple PCR pourrait révéler comme contaminé un lot dans lequel les bactéries pathogènes sont mortes et ne sont donc plus un danger pour la culture. Pour la Bio-PCR, les milieux de culture utilisés sont ceux sélectionnés dans les exemples 3 à 5, à savoir le LBCA et le LBCAL. Le temps d'incubation optimal des bactéries est de 48 heures, mais 24 heures suffisent pour l'apparition des premières colonies détectables en PCR.
En ce qui concerne la Seed-PCR l'amplification biologique se fait sur les graines en germination. Il a été montré qu'un pathogène présent dans une graine augmente sa population en même temps que la germination cette même graine (thèse de M. Niknejad- Kasempour, 1998). Ainsi en faisant germer des semences de courgette contaminées dans des conditions optimales pour le pathogène, la population de bactérie augmente, la graine en germination correspond au milieu de culture (il n'y a pas de milieu de culture spécifique, le macérât de germination des semences constitue le milieu de culture). L'amplification biologique pour la Seed-PCR se fait en boîte de germination 48h à 27°C, les graines étant alors lavée lh30 dans de l'eau distillée en erlen pour en extraire toutes les bactéries pathogènes comme saprophytes : les graines germées ont les téguments ouverts ce qui facilite la sortie des bactéries, une simple macération suffit dans le cas des semences germées pour en extraire les bactéries.
Des tests préliminaires ont montrés que lorsque une PCR était faite directement après lavage de boîtes (pour Bio-PCR) ou lavage de graines germées (pour Seed-PCR) en faisant simplement bouillir les suspensions, aucun signal n'est détecté ; trop d'inhibiteurs de PCR sont contenus dans les semences et un nombre trop important de cellules sont présentes dans le tube de réaction. Il est donc nécessaire de réaliser une extraction d'ADN sur les échantillons issus de l'amplification biologique, que ce soit pour la technique de BIO-PCR ou de SEED PCR.
1/ Procédure de détection de Pseudomonas syringaea. pv. peponis dans les semences par Bio-PCR.
Différents sous échantillons de 100 graines d'un lot initial de 500 graines sont transférés dans des sacs Stomacher avec membrane filtrante et y sont ajoutés 50 mL d'eau distillée stérile. Les sacs sont ensuite fermés hermétiquement pour éviter toute fuite de broyât. Les échantillons sont broyés uns à uns pendant dix minutes.
Les broyats de chaque sous échantillon sont ensuite récupérés puis étalés sur milieu LBCA et LBCAL. Les boîtes sont mises à incuber à 27°C pendant 24h.
A noter que de manière facultative, les broyats peuvent être dilués dans le but d'effectuer un dénombrement de Pseudomonas syringae pv. peponis dans le broyât brut. Ainsi, une gamme de dilution de raison 10 peut être préparée jusqu'à une dilution au millième ; lOOμL de chaque dilution sont ensuite étalés sur LBCA et LBCAL au râteau et mis à incuber à 27°C. La lecture du dénombrement se fera ensuite après 48h d'incubation, par dénombrement visuel des colonies développées.
Après 24h d'incubation à 27°C, les boîtes de broyât brut sont lavées avec 2 mL d'eau distillée stérile à l'aide d'un râteau stérile. l,5mL de ce lavât est récupéré pour l'extraction d'ADN Après centrifugation de 5 minutes à 13000 tours par minutes (rpm.), le surnageant est jeté et le culot repris dans 750μL de tampon d'Edwards (20OmM TrisHCl pH 7,5, 25OmM NaCl, 25mM EDTA, 0,5% SDS, 2% PVP 360) avant incubationlh à température ambiante sous agitation douce. Une nouvelle centrifugation de 5 min. à lOOOOrpm permet de récupérer 700μL de surnageant qui est transféré dans un tube Phase Lock Gel® (Eppendorf). 1 volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (700μL) est ajouté dans le tube qui est mélangé doucement pendant 1 minute puis centrifugé 15 minutes à 14000rpm. Le surnageant est transféré dans un tube ordinaire (l,5mL) ou l'on ajoute 0,6 volume d'isopropanol (420μL) avant de mélanger doucement par inversion et placer le tube à -200C pendant 20 à 25 minutes. Une nouvelle centrifugation 2 minutes à 14000rpm et 4°C permet d'obtenir un culot qui est lavé dans 500μL d'alcool 70° conservé à -200C et une nouvelle fois centrifugé 2 minutes à 14000rpm et 4°C. Le culot est séché 15 minutes à 600C et resuspendu dans 50μL d'eau ultrapure stérile pour être conservé à -200C.
Le mélange réactionnel pour la PCR est préparé dans un volume final de 20 μl selon le tableau 8 ci-dessus. La PCR est réalisée dans des tubes appropriés à raison de 17μl du mélange réactionnel et 3 μl de l'ADN cible. Le programme d'amplification de la PCR classsique est réalisé à l'aide d'un thermocycleur (icycler BioRAD).
Ix 95° C 04 : 00
3Ox 95° C 00 : 30
56° C 00 : 30
72° C 00 : 30
Ix 72° C 07 : 00
15° C ∞
Les produits d'amplification sont analysés sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE 0,5 X préparé selon :
I. Préparation du tampon TBE 5x
Figure imgf000037_0001
IL Préparation de 2% de gel agarose pour l'électrophorèse :
Figure imgf000037_0002
III. Préparation du bromure d'éthidium :
Figure imgf000037_0003
Le gel est chargé, dans chaque puit, avec 8 μl de chaque produit amplifié auxquels sont ajoutés 8 μl de marqueur de poids moléculaire 100 paires de bases (pb) (au moins 1 par gel). L'ensemble est soumis à une électrophorèse sous un voltage constant (100 V) et la migration des produits amplifiés est visualisée à l'aide d'un transluminateur à UV, après coloration au bromure d'éthidium (BET) et rinçage. La figure 4 illustre les résultats de cette PCR.
A, B, C et D sont des échantillons d'ADN extraits de quatre lots de semence de courgette différents, A, B et C étant contaminés par Pseudomonas syringae peponis, D étant un lot non contaminé par la bactérie. « 1 » est un témoin positif constitué par une amplification d'ADN d'une souche pure de Pseudomonas syringae peponis pathogène sur courgette. « 4 » est un témoin négatif de PCR qui est faite avec de l'eau stérile.
Pour les trois échantillons contaminés A, B et C, la bande à 200 paires de bases est bien présente, de même d'ailleurs que pour le témoin positif « 1 »alors que pour le lot D non contaminé, aucune bande n'est présente. Ceci confirme bien que le marqueur 4 Ba est bien spécifique de la bactérie pathogène Pseudomonas syringae pv. Peponis et que celle-ci est détectable avec la technique de Bio-PCR
2/ Procédure de détection de Pseudomonas syringaea. pv. peponis dans les semences par Seed-PCR.
Les produits et appareillages pour réaliser la Seed-PCR sont identiques à ceux de la Bio- PCR. Il n'y a toutefois pas besoin de préparer un milieu de culture, seules sont nécessaires des boîtes de germination et du papier plissé ou buvard afin de faire germer les graines. La taille des échantillons et des sous échantillons analysés sont les mêmes que pour la Bio- PCR à savoir des échantillons de 500 graines divisés en 5 sous échantillons de 100 graines pour l'analyse.
Chaque boîte de germination contient un papier buvard dans le fond et un papier plissé de 25 plis. Chaque boîte contiendra un sous-échantillon de 100 graines. 4 graines sont réparties par plis et 3OmL d'eau stérile sont ajoutés. Les boîtes de germination sont mises à incuber à 27°C en étuve pendant 48h. Après cette incubation, des radicelles d'environ 2cm sont visibles avec quelques fois des racines secondaires. Les semences sont récupérées et transvasées dans un erlenmeyer de 25OmL auquel sont ajoutés 5OmL d'eau distillée stérile. Les graines sont lavées 1 heure à température ambiante et sous agitation constante (agitateur à plateau universel). l,5mL de macérât sont récupérés en tubes de 2mL pour l'extraction d'ADN. Les protocoles d'extraction d'ADN ainsi que les protocoles des PCR sont identiques à ceux mis en œuvre pour la Bio-PCR.
De même, l'interprétation des résultats se fera exactement de la même façon. Dans les cas de la Seed-PCR, seule la partie amplification biologique change par rapport à la Bio-PCR.
IV/ Procédure de détection de Pseudomonas syringaea. pv. peponis dans les semences par test sérologique
Même si les test sérologiques présentent certains problèmes de spécificité en ce qui concerne la reconnaissance de la bactérie d'intérêt par rapport à d'autres bactéries pouvant se trouver sur la graine, la plante ou sur une partie de plante, des tests de type Elisa et ses variantes DAS/TAS (double and triple antibody sandwich) peuvent se révéler utiles car ils sont généralement simples d'utilisation et peu coûteux.
Ces test peuvent se faire au laboratoire, mais les dernières années ont aussi vu la mise au point de tests utilisables directement dans les champs, dans les serres, basés sur ces techniques d'immunologies : une bandelette comporte un ou plusieurs anticorps qui vont fixer la bactérie dont l' absence/présence veut être confirmée. Si la bactérie Pseudomonas syringaea pv. peponis est présente dans l'échantillon soumis (un broyât ou une macération de feuille, de partie de plante ou de graine), elle sera révélée par l'ajout d'un second anticorps auquel un enzyme est généralement liés et dont l'ajout du substrat déclenche une réaction enzymatique révélant, généralement par une coloration spécifique, la présence de la bactérie d'intérêt.
Les anticorps peuvent être préparés par les techniques connues de l'homme du métier, à savoir par exemple des antisérums préparés chez le lapin et le poulet. L'immunisation peut être pratiquée chez le lapin par injection par voie intraveineuse d'une suspension de cellules vivantes de la bactérie Pseudomonas syringae peponis selon, par exemple, le protocoloe décrit par Trigalet et al en 1978. Les prélèvements de sérums s'effectuent ainsi après le 4e rappel.
Chez le poulet, l'immunisation peut se faire par voie souscutanée avec une suspension de cellules vivantes additionnée d'adjuvant complet de Freund, par exemple 0,5 ml d'adjuvant pour 1,5 ml de suspension bactérienne. Les injections peuvent être faites à raison d'une piqûre par semaine pendant 3 semaines, le prélèvement étant fait 6 jours après la dernière piqûre et après 3 rappels. Les immunoglobulines peuvent être extraites de ces sérums par chromato graphie d'affinité par exemple sur des colonnes de Sépharose 4B. Leur élution de la colonne d'affinité peut être obtenue avec un tampon HCl - glycine 0,1 M pH 2,8. Après neutralisation et concentration par ultrafîltration sur membrane Amicon PM 10, les immunoglobulines peuvent être stockées au congélateur. La concentration de la solution est déterminée d'après la valeur de la densité optique à 280 nm.
Les immunoglobulines qui seront utilisées comme anticorps secondaire peuvent par exemple être couplées à la phosphatase alcaline type III R (Sigma EC n° 3.1-3.1) par l'intermédiaire du glutaraldéhyde (méthode en un temps) selon le procédé décrit par VASRAMEA et al, en 1978.
Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) peut être réalisé par exemple suivant la méthode sandwich d'après les travaux de Clark et Adams (1976) ou encore selon la méthode de double couche d'après Scherrer & Bernard (1977). Les réactions peuvent être réalisées à loisir en microplaques ou en cuves.
Si le test ELISA est un test immunologique destiné généralement à détecter une protéine dans un liquide biologique, il peut être toutefois aussi utilisé pour détecter la présence de bactéries, notamment de la bactérie Pseudomonas syringae peponis identifiée par les auteurs de la présente invention.
Les immunoglobulines (300 μl à 10 μg/ml) peuvent être réparties dans les micropuits des microplaques. L'adsorption sera faite 5 h à 37 0C ou 1 nuit à 4 0C. Après 3 lavages avec le liquide physiologique, le dépôt de l'échantillon (un broyât ou une macération de feuille, de partie de plante ou de graine sont déposée dans les puits) est réalisé à raison de 200 μl par micropuit et l'incubation se fait 2 h à 28 0C. Après élimination de l'échantillon par lavage au liquide physiologique, 250 μl du couplage anticorps-enzyme (anticorps secondaire) peut être ajouté et laissés 4 h à 37 0C. La révélation de la réaction sera obtenue avec 0,8 mg/ml de p- nitrophényl phosphate dans un tampon Tris-HCI 0,05 M, NaCI 1 M pH 8,0 A( REGN & mELrrrHaL, 1960). La lecture s'opèrant, pour cette réaction, par exemple à 405 nm au spectrophotomètre Beckman DBG. Dans chaque série de test figurent des témoins de réaction (bactérie Pseudomonas syringae peponis et tampon comme témoins positifs/négatifs)
La phosphatase alcaline catalysant la transformation du p-nitrophényl phosphate incolore en p-nitrophenol jaune, la présence de la bactérie Pseudomonas syringae peponis dans l'échantillon est révélée lorsque l'ajout du substrat de l'enzyme entraîne un changement de la couleur dans le puit. Eventuellement, la réaction peut même être quantifiée par colorimétrie à partir d'une courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations connues de bactéries puisque le nombre de molécules d'anticorps secondaires fixées dépend du nombre de bactéries immobilisées par l'anticorps primaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Bactérie Pseudomonas syringaea peponis, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence de nucléotides sélectionnée parmi les séquences de nucléotides SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N0IO, SEQ ID N0I l, SEQ ID
N°12 et SEQ ID N°13.
2. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a été isolée et déposée le 19.05.2009 auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM 1-4159.
3. Marqueur moléculaire 4Ba de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°9 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°10 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N0IO.
4. Marqueur moléculaire 4Ba selon la revendication 3, caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique comprend tout ou partie de la SEQ ID N0I l ou de la séquence SEQ ID N012.
5. Amorce(s) nucléotidique(s) pour la détection et l'identification de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend :
a. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 11 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°9 intégrale; b. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°10, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°10 intégrale; c. de 11 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 11;
d. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 12; ou
e. un couple d'amorces comportant une première amorce (a) et/ou (c) et une seconde amorce (b) et/ou (d).
6. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, à l'aide d'un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs selon l'une des revendications 3 ou 4 et/ou au moins une amorce selon la revendication 5.
7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que le moyen de biologie moléculaire comprend:
- une sonde d'ADN spécifique de tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 11 ou de la SEQ ID N° 12 permettant une hybridation, et/ou
un couple d'amorces (e) tel que défini dans la revendication 5 permettant une amplification en chaîne par polymérase (PCR Polymerase Chain Reaction).
8. Anticorps apte à reconnaître la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon.
9. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, à l'aide d'au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 8.
10. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle consiste à mettre en œuvre un milieu de culture spécifique LBCA additionné ou non de lincomycine.
11. Méthode selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en œuvre d'un moyen de biologie moléculaire tel que défini dans la revendication 6.
12. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon végétal, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) le traitement dudit échantillon, de préférence par broyage ou macération, en vue d'extraire d'éventuelle(s) bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis,
(2) l'inoculation de plantes ou de graines exemptes de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis avec l'extrait obtenu en (1),
(3) la culture desdites plantes ou graines inoculées issues de l'étape (2),
(4) la comparaison morphologique des plantes ou graines issues de l'étape (3) avec des plantes issues de plantes ou de graines inoculées avec la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, pour en déduire l'infection ou la non-infection de l'échantillon objet de la détection et de l'identification.
13. Méthode selon l'une des revendications 6, 7, 9 à 12, caractérisée en ce que l'échantillon est issu d'une plante sélectionnée parmi les plantes de la famille des cucurbitacées, une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis et une plante de courgette cucurbita pepo.
14. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle combine au moins deux méthodes choisies dans le groupe comprenant :
i.La méthode telle que définie dans la revendication 6 ou 7;
ii. La méthode telle que définie dans la revendication 9 ;
iii. La méthode telle que définie dans la revendication 10;
iv. La méthode telle que définie dans la revendication 12.
15. Kit de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend :
un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs tels que définis dans l'une des revendications 3 à 4 et/ou au moins une amorce telle que définie dans la revendication 5,
et/ou au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 8,
- et/ou au moins un milieu de culture LBCA additionné ou non de lincomycine.
16. Méthode d'identification de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- l'inoculation d'au moins une plante, d'au moins une graine ou d'au moins une partie de plante avec cette bactérie, puis
l'identification de la ou des plante(s) résistante(s) ne présentant pas les symptômes de sensibilité à cette bactérie.
17. Méthode d'inoculation d'un échantillon avec une bactérie, caractérisée en ce que l'inoculum mis en œuvre comprend la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2.
18. Méthode de création de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) l'identification d'une plante résistante à cette bactérie Pseudomonas syringaea peponis selon la méthode de la revendication 16,
(2) le croisement de la plante résistante identifiée en étape 1) avec une plante sensible à cette bactérie,
(3) l'identification de plante résistante dans la descendance de la plante issue de l'étape (2) selon la méthode de la revendication 16.
19. Méthode de sélection d'un lot de semence caractérisée en ce qu'elle met en œuvre la méthode de détection et d'identification telle que définie dans au moins l'une des revendications 6, 7, 9-12 et 14 et/ou la méthode d'identification telle que définie dans la revendication 17 et/ou le kit tel que défini dans la revendication 15.
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