WO2011002237A2 - 우점종 제거 기술에 기반한 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법 - Google Patents

우점종 제거 기술에 기반한 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법 Download PDF

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김중수
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a single cell-derived genomic library of rare or novel microorganisms, characterized by concentrating rare or novel microorganisms in the environment.
  • Phylogenetics based on the nucleotide sequence of 16S rDNA a gene of microbial SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA) is a method for analyzing the diversity of environmental microorganisms. It has played a decisive role in highlighting (Woese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87 (12): 4576, 1990), which can be used to determine whether a particular class of microorganisms exist in nature without culturing them. It became possible.
  • Kvist et al. Has a drawback that the diversity of genomes that can be obtained through experiments is biased to the target gene by selecting and labeling target microorganisms based on the gene sequences that have been discovered so far.
  • Stepanauskas et al. Has the advantage of being able to accurately analyze the microbial community present in the environmental samples applied to the experiment in terms of ecology, but it is difficult to detect and analyze rarely existing microorganisms due to the predominant microorganisms. I have it.
  • the present inventors concentrated on rare microorganisms existing in the natural environment without relying on culture to raise the limit of detection for rare microorganisms that could not be detected by a known method, and as a result of earnest efforts to secure new genes with high efficiency, Community analysis, two FACS techniques, and multiple displacement amplification (MDA) were performed to create a single cell-derived genomic library for rare cultured and novel microorganisms. Completed.
  • the present invention provides a method for producing a single cell-derived genomic library of rare or novel microorganisms, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for screening an activating enzyme or gene encoding the same using a single cell-derived genomic library of rare or novel microorganisms comprising the following steps:
  • the invention also provides a method for preparing a metanomic library with increased microbial diversity, comprising the following steps:
  • FIG. 1 is a schematic view showing a library manufacturing method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a method for preparing a library according to the present invention and a method for screening enzymes and genes using the same.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a verification experiment using the microbial community of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the results of confirming genome amplification, 16S rDNA, and cellulase gene amplification of the sample concentrated using Eco3 probe by single cell unit using FACS.
  • J. naejangsanesis 16S is a result of cloning and sequencing 16S rDNA PCR products of genome amplification samples containing cellulase 1, 2 isolated into single cells and comparing them to 16S rDNA sequences of J. naejangsanesis strains ( J. naejangsanesis 16S, SEQ ID No: 13; Single Cell MDA 16S # 1, SEQ ID No .: 14; Single Cell MDA 16S # 2, SEQ ID No .: 15; Single Cell MDA 16S # 3, SEQ ID No .: 16).
  • Figure 10 shows the results of PCR by PCR using each cellulase primer using the fosmid plasmid of the fosmid clone having cellulase activity as a template.
  • Figure 11 compares the cellulase 1 gene sequencing results for genome amplification samples containing single cell isolated cellulase 1 genes and fosmid clones with cellulase activity with the cellulase 1 sequence of the strain J. naejangsanesis.
  • cells # 1 and # 2 used genomic DNA of J. naejangsanesis strain as a template
  • MDA # 1 and # 2 used MDA products derived from single cells as templates
  • Fosmid # 1 and # 2 used cellulase.
  • PCR amplification was performed using the MDC # 11 clone, a Fosmid clone showing the active activity, as a template, and the amplified products were cloned and sequenced (Cell # 1, SEQ ID No: 17; Cell # 2, SEQ ID No. : 18; MDA # 1, SEQ ID No .: 19; MDA # 2, SEQ ID No .: 20; Fosmid # 1, SEQ ID No .: 21; Fosmid # 2, SEQ ID No .: 22).
  • Figure 12 compares cellulase 2 gene sequencing results for genomic amplification samples containing single cell isolated cellulase 2 genes and fosmid clones with cellulase activity with cellulase 2 sequences of the strain J. naejangsanesis.
  • cells # 1 and # 2 used genomic DNA of J. naejangsanesis strain as a template
  • MDA # 1 and # 2 used MDA products derived from single cells as templates
  • Fosmid # 1 and # 2 used cellulase.
  • PCR amplification was performed using MDC # 11 clone, a Fosmid clone showing the active activity as a template, and the amplified product was cloned and sequenced (Cell # 1, SEQ ID No: 23; Cell # 2, SEQ ID No. : 24; MDA # 1, SEQ ID No .: 25; MDA # 2, SEQ ID No .: 26; Fosmid # 1, SEQ ID No .: 27; Fosmid # 2, SEQ ID No .: 28).
  • microbial group refers to a microbial aggregate of a sample, that is, a microbial community
  • community analysis refers to a method of analyzing genetic diversity of a microbial community of a sample, and includes amplified riosomal intergenic spacer analysis (ARISA), T Terminal restriction fragment length polymorphism (RFLP), Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), Temporal Gradient Gel Electrophoresis (TGG), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA), and DNA microarray.
  • ARISA amplified riosomal intergenic spacer analysis
  • RFLP T Terminal restriction fragment length polymorphism
  • DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
  • TGG Temporal Gradient Gel Electrophoresis
  • ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
  • ARISA is a microbiological analysis method that provides an approximation of microbial diversity and community composition, without a culture-based approach or experiments constituting the ss rRNA gene clone library, the small (16S) and large (23S) sub in the rRNA operon PCR amplification of the intergenic region between the unit rRNA genes against the entire bacterial community DNA.
  • T-RFLP refers to a molecular biological technique for profiling a microbial community based on the location of the site of the restriction enzyme closest to the labeled end of the amplified gene. This is based on cutting a mixture of PCR amplification products of a single gene using one or more restriction enzymes and detecting the size of each of the individual terminal fragments using a DNA sequencer.
  • DGGE is a genetic fingerprinting technique used to isolate PCR-based DNA products. As PCR products move through polyacrylamide gels, they encounter increasing concentrations of chemical denaturants, resulting in weak separation ( Double-stranded PCR products with melting domains begin to denature first and thus significantly slow their migration, thereby utilizing the principle that different DNA sequences from different bacteria are separated at different denaturant concentrations.
  • TGGE is a genetic fingerprinting technique similar to the above-mentioned DGGE, and uses the principle of separating PCR products by gradually increasing the temperature instead of the chemical denaturant.
  • ARDRA is a molecular biological technique that amplifies 16S rDNA of a microorganism, cuts PCR products amplified with restriction enzymes, and then electrophores the restriction enzyme-treated products on an agarose gel to analyze band patterns.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • CLSM cofocal laser scanning microscope
  • FACS Fluorescence Associated Cell Sorter
  • MDA Multiple displacement amplification
  • the present invention relates to a method for preparing a single cell-derived genomic library of rare or novel microorganisms, comprising the following steps:
  • FIG. 1 and 2 show a schematic diagram of a method for preparing a single cell derived genomic library of rare or novel microorganisms according to the present invention.
  • the sample may be characterized in that collected from any one or more of water, soil, air, food, waste, flora and fauna and flora and fauna, but is not limited thereto.
  • the water includes precipitation, seawater, lakes and rainwater, wastes include sewage, wastewater, and the like.
  • Collected samples are preferably in the form of bacterial cocktails by removing non microbial particles and further performing a clean up process to obtain clear results in microbial community analysis. It may be provided as.
  • analysis of the collected microbial community includes: automated riosomal intergenic spacer analysis (ARISA), terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temporal gradient gel electrophoresis (TGG), and amplified (ARDRA).
  • ARISA automated riosomal intergenic spacer analysis
  • T-RFLP terminal restriction fragment length polymorphism
  • DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
  • TGG temporal gradient gel electrophoresis
  • ARDRA amplified
  • amplify 16S rDNA through PCR reaction construct a clone library for the amplified 16S rDNA, sequence more than a predetermined number of 16S rDNA clones, and analyze the same. It is preferable to use a method of identifying microorganisms.
  • Community analysis can be performed by combining two or more of the above methods, preferably after primary analysis by a method targeting the 16S rDNA, and then in ARISA, T-RFLP, DGGE, TGGE, ARDRA and DNA microarrays. This can be accomplished by performing any one or more methods.
  • the fluorescent labeling probe may be prepared and labeled by performing FISH (Fluoresence In Situ Hygridization), and the fluorescent labeling probe is preferably targeted to 16S rDNA.
  • the fluorescence to be labeled is preferably used a fluorescent reagent that is easy to detect in the FACS instrument to be used.
  • the FISH is preferably carried out in an aqueous solution for application to the FACS after the FISH.
  • a fixing method using 100% ethanol is preferable in order to increase amplification efficiency by using multiple separation amplification of nucleic acids later.
  • a first FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) technique may be performed on the microbial group including the labeled microorganism and the unlabeled microorganism to remove the labeled microorganism and collect only the unlabeled microorganism. That is, FACS techniques can be used to concentrate rare or new microorganisms. At this time, as shown in Figure 2, rare microorganisms or new microorganisms may also be labeled with a separate fluorescent label probe, and then separated by the FACS technique to concentrate the rare or new microorganisms.
  • FACS Fluorescence Associated Cell Sorter
  • the concentration step is performed by repetitively analyzing the community of the residual microbial group from which the labeled microorganisms have been removed, and repeating the step of labeling and removing the dominant species or known microorganisms. Can be removed.
  • the labeling of the entire remaining microbial group is DNA It is preferable to use a fluorescent reagent that exhibits specificity for and has little influence on DNA structure and is easy to detect in a FACS device used.
  • the genome of each single cell is amplified using multiple displacement amplification (MDA).
  • MDA multiple displacement amplification
  • the multiple-amplification amplification method uses Phi29 DNA polymerase, it is preferable to go through a pre-treatment process to prevent the contamination of nucleic acids for the reagents used as well as maintaining a clean environment to prevent non-specific amplification.
  • the genome amplified by the above process may be characterized in that it is a novel microorganism by comparing the 16S rRNA of the amplified genome with a 16S rRNA of a known microorganism, and then, only the genome determined as the new microorganism may be prepared as a library.
  • the step of analyzing the amplified genome to determine whether it is derived from a single cell may be further carried out, it can be characterized in that only the genome determined to be derived from a single cell to prepare a library. At this time, the determination of whether a single cell is derived may be made by examining whether a single peak chromatogram is formed upon sequencing of the 16S rDNA of the amplified genome.
  • DNA fingerprinting analysis DNA fingerprinting analysis
  • DGGE DGGE
  • T-RFLP etc.
  • the production of a library using a large size DNA fragment such as fosmid or BAC is preferable because of the high rate of chimeric formation.
  • the genome of single cell amplified by multiple separation amplification method was prepared as fosmid library to confirm the utility of the library.
  • genomic DNA amplified by multiple separation amplification method excess branches are formed and various restrictions are placed on library production. Therefore, branch forms formed using S1 nuclease are removed to remove branches of single strands. Giving needs a process.
  • the artificial microbial community was produced and the experiment was performed by applying the method of the present invention, J. microorganisms introduced as rare species in the artificial microbial community . It has been demonstrated that a single cell derived genomic library of naejangsanesis strain (KCTC 11523BP) can be constructed.
  • cellulase 1 and 2 were identified from single-cell-derived genomic library clones of the J. naejangsanesis strain prepared in the above example, and through this, the rare microorganisms or novel microorganisms produced according to the present invention. It has been demonstrated that single cell derived genomic libraries can be usefully used for the discovery of new enzymes and genes encoding them.
  • the present invention provides a method for screening an activator of a rare microorganism or a novel microorganism and a gene encoding the same, using the genome library in another aspect.
  • the screening method after producing a single cell-derived genomic library of rare microorganisms or novel microorganisms according to the above method, by processing the target enzyme substrate to the prepared genomic library to screen for the clones showing the substrate reaction, It can be carried out by obtaining a target enzyme or a gene encoding the same from the selected clone.
  • a method for obtaining a target enzyme and a gene encoding the same from the selected clone may be performed using a conventionally known genetic engineering method.
  • the present invention provides a method for producing a biodiversity community, comprising: (a) performing a microbial community analysis of collected environmental samples; (b) labeling the microorganisms identified as dominant species or known microorganisms in the community analysis; (c) removing the labeled microorganisms using a Fluorescence Associated Cell Sorter (FACS) technique; And (d) isolating and amplifying DNA from the microorganism group from which the labeled microorganisms have been removed to prepare a metagenonomic library.
  • FACS Fluorescence Associated Cell Sorter
  • the method for preparing a metagenonomic library by separating and amplifying DNA from a dominant species or a microorganism from which a known microorganism has been removed may be performed according to a known method for producing a metagenomic library.
  • rare species can be detected by the method according to the present invention by preparing an artificial microbial community including rare microorganisms to verify the effects of the present invention, but by collecting samples in a natural environment It is obvious to those skilled in the art that the same result can be obtained even by applying the method.
  • coli EPI300-T1 strain was purchased from Epicentre (USA). Microorganisms except for the above strains ( B. cerius KCTC 3624, P. aeruginosa KCTC 1637, P. mirabilis KCTC 2510) were used in the experiment was distributed from the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC).
  • the samples were incubated in LB medium of each microorganism for 16 hours, and then absorbance was measured at 600 nm using an absorbance spectrometer. Thereafter, centrifugation was again performed at 4 ° C. for 10 minutes at 8,000 g, and the supernatant was discarded.
  • the obtained cells were resuspended in 1 ⁇ PBS buffer so as to have an absorbance of 1.0 based on the measured absorbance.
  • the microbial suspension obtained by the above method was mixed in a volume of 9 ml of E. coli , 0.5 ml of B. cerius, 0.5 ml of P. aeruginosa , 0.1 ml of P. mirabilis and 0.1 ml of J. naejangsanesis , respectively .
  • J. naejangsanesis strains were prepared as an artificial microbial community as a rare microorganism.
  • an artificial microbial community including rare microorganisms was prepared and confirmed.
  • non-microbial elements are preferably obtained from collected samples. particles) and may be provided in the form of a bacterial cocktail by additionally performing a clean up process to obtain clear results in microbial community analysis.
  • microbial community analysis of environmental samples was performed by amplifying the 16S rDNA by PCR reaction, constructing a clone library for the amplified 16S rDNA, sequencing more than a certain number of 16S rDNA clone and analyzing the same to identify the predominant species of the sample It is preferable to use a method of serving.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • the hybridized sample was again 8,000 g, centrifuged for 10 minutes, resuspended in 1 ml of washing buffer (Table 2), and incubated at 48 ° C. for 1 hour. Then, the reaction sample was again centrifuged at 8,000 g for 10 minutes, resuspended using 1 ml of 1 X PBS buffer, and then refrigerated at 4 ° C. for later experiments.
  • Fluorescently labeled dominant microorganisms were analyzed and removed using FACS Aria equipment (Becton Dickinson Bioscience, USA). In this case, in detail, fluorescence was detected using a 488 nm laser and a 530 nm detector, and a sample was injected at a speed of 70 psi and a nozzle of 70 ⁇ m.
  • Each of the used sheath solutions was prepared using tertiary distilled water that was not contaminated with DNA, and in the case of FACS instrument, the sheath solution and the tube through which the sample passed were made by FACS clean solution (Becton Dickinson Bioscience) and DNA not contaminated with tertiary. After washing sufficiently with distilled water it was used in the experiment.
  • the software used for analysis and classification was FACS Diva (Becton Dickinson Bioscience), and the classification method was to classify dominant and rare microorganisms using the "single cell mode" method.
  • Example 3 Performing Secondary FACS—Isolation of Concentrated Rare Microorganisms into Single Cells
  • Nucleic acid was stained using SYTO-16 (Invitrogen, USA) dye for the entire residual microbial group from which the fluorescently labeled microorganisms were removed according to Example 2.
  • SYTO-16 dye was added to the residual microbial group to a final concentration of 5 ⁇ M, and then stained at room temperature for 1 hour.
  • the stained microbial group was then separated into single cells using FACS equipment.
  • fluorescence was detected using a 488 nm laser and a 530 nm detector, and a sample was injected at a speed of 70 psi and a nozzle of 70 ⁇ m.
  • Each sheath solution was prepared using tertiary distilled water that was not contaminated with DNA.
  • the sheath solution and the tube through which the sample passed were FACS clean solution (Becton Dickinson Bioscience) and tertiary that was not contaminated with DNA. After washing sufficiently with distilled water it was used in the experiment.
  • the software used for analysis and classification was FACS Diva (Becton Dickinson Bioscience), and the classification method was single cell type in the final 96 well PCR tube (Axygen, USA) using the "single cell mode" method. At this time, 3 ⁇ l of 1X PBS buffer was placed in the 96 well PCR tube so that the classified microorganisms were easy to settle.
  • the 96 well PCR tubes were divided into 1, 3, 5, and 7 rows by 1, 3, 5, and 7 cells in 8 wells, respectively.
  • the 96 well PCR tubes were immediately stored frozen at -20 °C and used for later experiments.
  • Example 3 The genome of each single cell isolated in Example 3 was amplified using multiple displacement amplification (MDA). At this time, the multi-amplification amplification method was used REPLI-g Mini Kit (QIAGEN, USA), and was performed according to the "Amplification of Genomic DNA from Blood or Cells the REPLI-g Mini Kit" method included in the manual. Results In order to confirm that the genomic DNA was amplified by MDA, 0.8% agarose gel electrophoresis and 16S rDNA PCR were used, wherein the primers for 16S rDNA PCR were prepared and used as follows.
  • MDA multiple displacement amplification
  • the intermediate position of the cellulase gene was detected in order to detect two kinds of cellulase genes already known to be contained in the rare J. naejangsanesis strain in the artificial microbial community for the MDA product amplified by Example 4-1.
  • Primers that can be amplified were synthesized as follows and PCR was performed.
  • PCR products of the cellulase gene were confirmed in 11 samples, and 6 of them confirmed that both types of cellulase gene were amplified.
  • the sample amplified by genomic DNA and classified into single cells it was confirmed that two kinds of cellulase genes were amplified by PCR in one sample. That is, it can be confirmed that the strain J. naejangsanesis, which was a rare species in an artificial microbial community, was obtained as an MDA amplification product by concentration according to the method of the present invention (FIG. 5).
  • SDA nuclease was used to resolve the MDA because excessive hyperbranches occur during amplification of single cell genomes. Through this, only a double-stranded DNA was obtained.
  • Fosmid library it was required to be a certain size (25 Kbp) or more, and an experiment was performed to confirm the size through agarose gel electrophoresis.
  • Example 5-1 genomic DNA derived from a single cell having a double strand was obtained, and a Fosmid library was prepared using the same.
  • the preparation of the Fosmid library was carried out using the "CopyControl Fosmid Library Production Kit” (Epicentre Biotechnologies, USA) by the method described in the manual provided by the manufacturer, finally secured over 50,000 clones.
  • Example 5-2 In order to screen active cellulase from the genomic library clones prepared in Example 5-2, the following experiments were performed.
  • Cellulase activity based enzyme search was prepared by adding LB_Agar solid medium to 1% CMC (Carboxyl Methyl Cellulose), 0.005% Tryphan Blue, to chloramphenicol 12.5 ⁇ g / ml as an antibiotic, and then smearing Fosmid library clones. By culturing at 37 °C was carried out by selecting clones appearing clear ring.
  • CMC Carboxyl Methyl Cellulose
  • Fosmid vectors of the active clones were isolated and treated with restriction enzyme Bam HI to confirm the size of the inserted DNA fragments.
  • DNAs between 27-40 Kbp were inserted with an average size of 32 Kbp (FIG. 9).
  • synthesizing primers capable of amplifying the intermediate positions of the cellulase genes for the cellulase-activated clones by PCR it was confirmed that each cellulase gene was amplified in all clones (FIG. 10).
  • the entire genes of cellulase 1 and 2 were PCR amplified using J. naejangsanesis genomic DNA, single cell-derived MDA product, and fosmid library MDC # 11 clone, respectively, into pGEM-T (promega, USA) vector. As a result of cloning and sequencing of the two clones, it was confirmed that all cellulase gene sequences were identical (FIGS. 11 and 12).
  • the sequence of the primer used for the PCR is as follows.
  • Cell 1 FF 5'-TCGATACCGGCAACGGCGGC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Cell 1 FR 5'-CTCAGCAGGTCGAGCACTGCCG-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Cell 2 FF 5'-AACATATGTTGAGAGGAGCGCATCCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Cell 2 FR 5'-TTGGATCCTTATGGCTGTTGCCACAACCCC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • the method for preparing a library according to the present invention provides a genome library of rare cultured and rare microorganisms and new microorganisms existing in a real environment that has been difficult to detect by conventional methods, and provides a large amount of genes for rare and new microorganisms.
  • it is useful to confirm the origin of the secured gene and to enable the production of a library based on diversity by removing microorganisms of the dominant present in the environment.

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Abstract

.본 발명은 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수집한 시료의 미생물군에 대하여 커뮤니티 분석, 이에 근거한 우점종 미생물군 제거를 위한 FISH와 1차 FACS 공정의 수행 및 단일세포로 분리하기 위한 2차 FACS 공정을 수행한 다음, 다중분리증폭법을 수행하여, 환경에 소수 존재하는 난배양성 희소 미생물 또는 신규 미생물을 단일 세포 유래의 게놈으로 증폭하여 유전자 라이브러리로 제조하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 라이브러리의 제조방법은 기존의 방법으로 검출이 어려웠던 실제 환경에 존재하는 난배양성 희소미생물 및 신규 미생물의 게놈 라이브러리를 획득, 제공하며, 희소 미생물 및 신규 미생물에 대한 대량의 유전자를 확보할 수 있게 한다. 또한, 기존의 메타게놈 라이브러리 제조방법과 달리 확보된 유전자의 유래를 확인할 수 있게 하며 환경에 존재하는 우점의 미생물을 제거함으로써 다양성에 기반을 둔 라이브러리의 제조가 가능하게 하므로 유용하다.

Description

우점종 제거 기술에 기반한 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법
본 발명은 환경 내의 희소 미생물 또는 신규 미생물을 농축하는 것을 특징으로 하는, 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법에 관한 것이다.
미생물의 SSU rRNA(small subunit ribosomal RNA)의 유전자인 16S rDNA의 염기서열을 기준으로 한 계통분류학은, 환경 미생물에 대한 다양성을 분석하는 방법으로서 배양에 의존하지 않고 기존의 분류체계에 비해 미생물 다양성을 부각시키는데 결정적인 역할을 하여 왔고 (Woese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87(12):4576, 1990), 이를 통하여 특정 분류군의 미생물이 자연계에 존재하는지를 미생물의 배양 없이도 알아볼 수 있게 되었다.
더 나아가, DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism), ARISA (Amplified Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), 클로닝(Cloning)과 같은 분자 수준의 미생물 생태 분석 기법이 개발되면서, 이제까지 알 수 없었던 미생물의 다양성을 밝혀낼 수 있게 되었다. 그러나, 각각의 분석방법의 발전에도 불구하고 환경시료에 희소하게 존재하는 미생물에 대한 분석 및 추출을 위해서는 많은 양의 시료를 통한 광범위한 분석이 필요한 실정이다. 또한, 현재까지 인간이 순수 분리하여 배양 가능한 미생물의 수는 자연계 전체 미생물의 1% 정도에 불과하다고 알려져 있다 (Pace, Science, 276(5313): 734, 1997).
이렇게 배양이 불가능한 미생물 또는 환경에 소수로 존재하는 미생물로부터 공업적으로 유용한 효소의 유전자나, 미생물이 생산하는 유용한 물질을 생합성 하는 유전자를 얻어 산업적으로 이용하고자, 메타게놈 유전자 라이브러리를 통한 방법을 대표적으로 하여 여러 가지 방법이 연구되어 활용되고 있다. 그러나 각각의 방법에는 실제 유전자의 원천 미생물이 무엇인지 알 수 없다는 단점과 환경에 존재하는 희소 미생물의 경우 완전한 형태의 유전자를 얻을 확률이 낮다는 단점 등이 제기되고 있다.
최근까지 미배양 미생물의 검출과 분리를 위한 여러 가지 연구가 이루어져 오고 있는데, 이러한 연구 중에는 미생물의 커뮤니티(community)를 분석한 후 미 배양 미생물에 대한 FISH를 수행하고 형광 표지된 미생물을 단일세포로 분리한 후, 이 단일세포의 게놈에 대한 다중 분리 증폭법을 이용하여 유전자를 확보하는 연구(T. Kvist et al. Appl. Microbiol. Biothechnol., 74:926, 2007)나, 환경시료를 충분히 희석하고 핵산을 형광 염색하여 FACS를 통한 단일세포 형태로 분리한 후 이 단일세포의 게놈에 대한 다중 분리 증폭법을 이용하여 유전자를 확보하는 연구 (R. Stepanauskas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 104(21):9052, 2007) 등이 있다.
그러나 Kvist 등의 방법은 현재까지 밝혀진 유전자 염기서열을 기반으로 목적 미생물을 표지 선발하는 방법으로 실험을 통해 얻을 수 있는 유전체의 다양성이 목적 유전자에 편향되어 나타난다는 단점을 지니고 있다. 또한, Stepanauskas 등의 연구는 실험에 적용한 환경시료에 존재하는 미생물 군집을 생태학적인 측면에서 정확하게 분석할 수 있다는 장점이 있으나 우점을 차지하고 있는 미생물로 인해 희소하게 존재하는 미생물의 검출 및 분석이 어렵다는 단점을 지니고 있다.
이에 본 발명자들은 자연 환경에 존재하는 희소미생물을 배양에 의존하지 않고 농축하여 기존에 알려진 방법으로 검출하지 못했던 희소 미생물에 대한 검출 한계를 높임과 더불어 높은 효율로 신규 유전자를 확보하고자 예의 노력한 결과, 미생물의 커뮤니티 분석, 2차례의 FACS 기법 및 다중분리증폭법(MDA: multiple displacement amplification)를 수행하여 난배양성 희소 미생물 및 신규 미생물에 대한 단일세포 유래의 게놈 라이브러리를 제작할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 기존의 방법으로 검출하지 못했던 희소 미생물 또는 신규 미생물의 게놈 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법을 제공한다:
(a) 수집된 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
(b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
(c) 상기 표지된 미생물을 1차 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계;
(d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군 전체를 표지한 다음, 2차 FACS 기법을 이용하여 상기 미생물군 전체를 단일 세포로 분리하는 단계;
(e) 상기 분리된 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭하는 단계; 및
(f) 상기 증폭된 단일세포의 게놈을 유전자 라이브러리로 제조하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리를 이용한 활성효소 또는 이를 코딩하는 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 수집된 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
(b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
(c) 상기 표지된 미생물을 1차 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계;
(d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군 전체를 표지한 다음, 2차 FACS 기법을 이용하여 상기 미생물군 전체를 단일 세포로 분리하는 단계;
(e) 상기 분리된 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭하는 단계;
(f) 상기 증폭된 단일세포의 게놈을 유전자 라이브러리로 제조하는 단계;
(g) 상기 제조된 게놈 라이브러리에 타겟 효소 기질을 처리하여 기질반응이 나타난 클론을 선별하는 단계; 및
(h) 상기 선별된 클론으로부터 타겟 효소 또는 이를 코딩하는 유전자를 수득하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 미생물 다양성이 증가된 메타게노믹(metagenomic) 라이브러리의 제조방법를 제공한다:
(a) 수집된 환경 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
(b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
(c) 상기 표지된 미생물을 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계; 및
(d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군으로부터 DNA를 분리하고 증폭하여 메타게노믹 라이브러리를 제조하는 단계.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부한 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 라이브러리 제조방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 라이브러리 제조방법 및 이를 이용한 효소와 유전자의 스크리닝 방법을 도식화한 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예의 인공미생물 군집을 이용한 검증실험을 도식화한 그림이다.
도 4는 FACS를 이용한 희소 미생물 농축 결과를 나타낸다.
도 5는 Eco3 probe를 이용 농축된 시료를 FACS를 이용 단일세포 단위로 분류 하고 분류된 시료에 대한 게놈 증폭과 16S rDNA, 셀룰레아제 유전자의 증폭을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 단일세포로 분리된 셀룰레아제 1, 2를 포함한 게놈 증폭 시료의 16S rDNA PCR 산물을 클로닝하고, 시퀀싱 하여 J. naejangsanesis 균주의 16S rDNA 시퀀스와 비교한 결과이다 (J.naejangsanesis 16S, SEQ ID No: 13; Single Cell MDA 16S #1, SEQ ID No.: 14; Single Cell MDA 16S #2, SEQ ID No.: 15; Single Cell MDA 16S #3, SEQ ID No.: 16).
도 7는 다중분리 증폭법 통해 증폭된 게놈에 S1 뉴클레아제를 처리하여 단일 가닥의 DNA를 제거하고, 이중가닥만의 DNA에 대한 크기를 확인한 결과이다.
도 8은 다중분리 증폭법 통해 증폭된 게놈을 이용하여 fosmid 라이브러리를 제작한 후 셀룰레아제 활성을 지니는 클론만을 선별한 결과이다.
도 9은 셀룰레아제 활성을 지니는 fosmid 클론의 삽입 단편의 크기를 BamHI 제한효소 처리를 통해 확인한 실험 결과이다.
도 10는 셀룰레아제 활성을 지니는 fosmid 클론의 fosmid 플라스미드를 주형으로 사용하여 각각의 셀룰레아제 프라이머를 사용하여 PCR을 실시 PCR산물을 확인한 결과이다.
도 11은 단일세포로 분리된 셀룰레아제 1 유전자를 포함한 게놈 증폭 시료와 셀룰레아제 활성을 지니는 fosmid 클론에 대한 셀룰레아제 1 유전자 시퀀싱 결과를 J. naejangsanesis 균주의 셀룰레아제 1 시퀀스와 비교한 결과로서, Cell #1, #2는 J. naejangsanesis 균주의 genomic DNA를 주형으로 사용하였고, MDA #1, #2는 단일 세포 유래 MDA 산물을 주형으로 사용하였으며, Fosmid #1, #2는 셀룰레아제 활성을 나타내는 Fosmid 클론인 MDC #11 클론을 주형으로 사용하여 각각 PCR 증폭하였고 증폭된 산물을 클로닝 하여 시퀀싱한 결과를 나타낸다(Cell #1, SEQ ID No: 17; Cell #2, SEQ ID No.: 18; MDA #1, SEQ ID No.: 19; MDA #2, SEQ ID No.: 20; Fosmid #1, SEQ ID No.: 21; Fosmid #2, SEQ ID No.: 22).
도 12은 단일세포로 분리된 셀룰레아제 2 유전자를 포함한 게놈 증폭 시료와 셀룰레아제 활성을 지니는 fosmid 클론에 대한 셀룰레아제 2 유전자 시퀀싱 결과를 J. naejangsanesis 균주의 셀룰레아제 2 시퀀스와 비교한 결과로서, Cell #1, #2는 J. naejangsanesis 균주의 genomic DNA를 주형으로 사용하였고, MDA #1, #2는 단일 세포 유래 MDA 산물을 주형으로 사용하였으며, Fosmid #1, #2는 셀룰레아제 활성을 나타내는 Fosmid 클론인 MDC #11 클론을 주형으로 사용하여 각각 PCR 증폭하였고 증폭된 산물을 클로닝 하여 시퀀싱한 결과를 나타낸다(Cell #1, SEQ ID No: 23; Cell #2, SEQ ID No.: 24; MDA #1, SEQ ID No.: 25; MDA #2, SEQ ID No.: 26; Fosmid #1, SEQ ID No.: 27; Fosmid #2, SEQ ID No.: 28).
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서, "미생물군"이란 시료의 미생물 집합체, 즉 미생물 군집을 의미하며, 이의 "커뮤니티 분석"이란 시료의 미생물 군집의 유전적 다양성을 분석하는 방법으로, ARISA (Amplified riosomal intergenic spacer analysis), T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism), DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis), ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 및 DNA microarray 등의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
여기서 "ARISA"란, 배양기반 접근이나, ss rRNA gene 클론 라이브러리 구성하는 실험 없이, 미생물 다양성 및 커뮤니티 조성의 대략값을 제공하는 미생물 분석방법으로, rRNA 오페론에서 small(16S) 및 large(23S) 서브유닛 rRNA gene 사이의 유전자간 부위(intergenic region)를 전체 박테리아 커뮤니티 DNA에 대하여 PCR 증폭시키는 것을 포함한다.
"T-RFLP"란, 증폭된 유전자의 라벨된 말단에 가장 가까운 제한효소의 사이트의 위치에 기반한 미생물 커뮤니티의 프로파일링을 위한 분자생물학적 기법을 말한다. 이는 하나 이상의 제한효소를 사용하여 단일 유전자의 PCR 증폭 산물의 혼합물을 자르고, DNA 시퀀서를 사용하여 개개의 말단 단편 각각의 사이즈를 탐지하는 것에 기반한다.
"DGGE"란, PCR 기반 DNA 산물을 분리하기 위하여 사용되는 유전적 핑거프린팅 기법으로, PCR 산물이 폴리아크릴아마이드 겔을 통해 이동하면서 점점 증가하는 화학적 변성제(chemical denaturant)의 농도에 부딪혀, 약한 분리(melting) 도메인을 가지는 이중-가닥 PCR 산물일수록 먼저 분리(denaturation)되기 시작하고 그에 따라 이동속도가 크게 느려지고, 이에 다른 박테리아 유래의 다른 DNA 서열은 다른 변성 농도(denaturant concentration)에서 분리되는 원리를 이용한다.
"TGGE"란, 상기 DGGE와 유사한 유전적 핑거프린팅 기법으로 화학적 변성제 대신에 온도를 점점 증가시켜서 PCR 산물을 분리시키는 원리를 사용한다.
"ARDRA"란, 미생물의 16S rDNA를 증폭한 다음, 제한효소로 증폭된 PCR 산물을 자른 후, 아가로스 겔에서 제한효소 처리된 산물을 전기영동하여 밴드 패턴을 분석하는 분자생물학적 기법이다.
한편, "FISH (Fluorescence in situ hybridization)"는 대표적으로 rRNA 올리고뉴클레오타이드 프로브(rRNA oligonucleotide probe)를 이용하여 자연 환경 및 폐수 처리장에 존재하는 미생물 군집구조 분석 및 정량화, 그리고 미생물 동정 및 분포를 이해하는데 배양에 따른 오차 없이 빠르고 믿을만한 정보를 제공하는 방법으로 알려져 있다. 특히 FISH 결과를 co focal laser scanning microscope (CLSM)를 사용하여 관찰함으로써 미생물의 특성을 공간적으로 분석할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기의 방법을 환경시료에 존재하는 우점 미생물을 표지하는 방법으로 사용하였다.
"FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter)"는 유액상태의 입자나 세포가 일정 감지지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여, 한 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정하고 경우에 따라 특정한 부분을 선택하여 분석하고 분류(sorting)할 수 있는 장비이다. 본 발명에서는 상기의 장비를 희소 미생물의 농축과 농축된 미생물을 단일세포로 분류하는 방법에 이용하였다.
"다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)"은 매우 적은 양의 DNA를 시퀀싱 반응에서 기질로서 사용될 정도의 충분한 양으로 증폭하는데 사용되는 기법으로, 기존에 널리 알려진 원형 DNA 염기서열 증폭용으로 개발된 박테리오파지 φ29의 폴리머레이즈를 이용하여 단일 세포로부터 직접 전체 게놈을 증폭하는데 사용할 수 있다.
본원에서, "메타게놈(metagenome)"이란, 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의된다.
본 발명은 일 관점에서, 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법에 관한 것으로, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 수집된 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
(b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
(c) 상기 표지된 미생물을 1차 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계;
(d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군 전체를 표지한 다음, 2차 FACS 기법을 이용하여 상기 미생물군 전체를 단일 세포로 분리하는 단계;
(e) 상기 분리된 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭하는 단계; 및
(f) 상기 증폭된 단일세포의 게놈을 유전자 라이브러리로 제조하는 단계.
도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법의 개략도를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 수집된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다.
채집된 시료는 바람직하게는 비미생물적 요소(non microbial particles)를 제거하고, 미생물 커뮤니티 분석 시 명확한 결과를 얻기 위하여 클린 업(clean up) 공정을 추가로 수행하여, 박테리아 혼합물(bacterial cocktail)의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에서, 수집된 미생물 커뮤니티의 분석은 ARISA (automated riosomal intergenic spacer analysis), T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism), DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis), ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 및 DNA microarray 등의 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 미생물의 커뮤니티를 분석하는 방법이면 이에 제한되지 않는다. 다만, 상기 방법들의 경우 PCR 반응의 제한성으로 인하여 정확한 커뮤니티의 분석이 가능하지 않은 경우가 많이 있으며 우점종으로 인지된 미생물에 대한 제한적인 정보만을 얻을 수 있다는 단점이 있다. 이에, 초기 환경 시료의 미생물 커뮤니티를 분석하는 방법으로 16S rDNA를 PCR 반응을 통해 증폭한 후 증폭된 16S rDNA에 대한 clone library를 제작하여 일정 수 이상의 16S rDNA clone을 시퀀싱하고 이를 분석하여 시료의 우점종인 미생물을 밝혀내는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 커뮤니티의 분석은 상기 방법을 둘 이상 조합하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 16S rDNA를 타겟으로 한 방법에 의하여 1차 분석한 후, ARISA, T-RFLP, DGGE, TGGE, ARDRA 및 DNA microarray중 어느 하나 이상의 방법을 수행함으로써 이루어질 수 있다.
미생물 커뮤니티를 분석한 다음, 우점종으로 확인된 미생물, 또는 알려진 데이터와 대비 시 공지의 미생물로 확인된 미생물을 타겟으로 하는 프로브를 제작하여 환경시료에 존재하는 우점 미생물 또는 공지 미생물을 표지하였다. 이때 바람직하게는 형광표지 프로브를 제작하여 FISH(Fluoresence In Situ Hygridization)를 수행하여 표지할 수 있으며, 상기 형광표지 프로브는 16S rDNA을 타겟으로 하는 것이 바람직하다. 표지되는 형광은 바람직하게는, 사용하는 FACS 기기에서 검출이 용이한 형광시약을 사용한다. 한편, FISH의 수행은 FISH 이후 FACS에 적용하기 위해 수용액 상에서 실시되는 것이 바람직하다. 또한 FISH 수행을 위한 미생물의 고정의 경우 추후 핵산의 다중분리 증폭법을 이용한 증폭 효율을 높이기 위해 100% 에탄올을 이용한 고정방법이 바람직하다.
이후, 표지된 미생물 및 비표지된 미생물을 포함하는 미생물 군에 대하여 1차 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 수행하여, 표지된 미생물을 제거하고, 비표지된 미생물만 수집할 수 있다. 즉, FACS 기법을 사용하여 희소미생물 또는 신규 미생물을 농축할 수 있다. 이때, 도 2에 나타난 바와 같이, 희소 미생물 또는 신규 미생물도 별도의 다른 형광표지 프로브로 표지한 다음, 이들을 FACS 기법을 통하여 분리하는 방법으로 희소 미생물 또는 신규 미생물을 농축할 수 있다.
이때, 바람직하게는 상기 농축 단계는 표지된 미생물이 제거된 잔류한 미생물 군의 커뮤니티를 재분석하여 우점종 또는 공지의 미생물이 확인되는 경우 표지하여 제거하는 단계를 추가로 반복하여 수행하여 충분한 우점종 또는 공지 미생물의 제거가 이루어지도록 할 수 있다.
이후, 상기와 같이 표지된 미생물이 제거된 잔류 미생물군 전체를 표지한 다음, 2차 FACS 기법을 이용하여 상기 미생물군 전체를 단일 세포로 분리하는 단계로서, 이때, 잔류 미생물군 전체의 표지는 DNA에 대해 특이성을 나타내면서 DNA 구조에 미치는 영향이 적고, 사용하는 FACS 기기에서 검출이 용이한 형광시약을 사용하는 것이 바람직하다.
단일세포로 분리한 후, 각 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭한다. 이때, 상기 다중분리증폭법은 Phi29 DNA 폴리머라제를 이용하며, 비 특이적 증폭을 방지하기 위해 청결한 환경을 유지함은 물론 사용 시약에 대해서도 핵산의 오염을 방지하는 전처리 과정을 거치는 것이 바람직하다.
상기 공정을 거쳐 증폭된 게놈은 증폭된 게놈의 16S rRNA를 공지 미생물의 16S rRNA와 대비하여 신규한 미생물인지를 판정한 다음, 신규한 미생물로 판정된 게놈만을 라이브러리로 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 증폭된 게놈을 분석하여 단일세포로부터 유래된 것인지 확인하는 단계를 추가로 수행하여, 단일세포로부터 유래된 것으로 판정된 게놈만을 라이브러리로 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 단일세포 유래인지의 판정은 증폭된 게놈의 16S rDNA의 시퀀싱시 단일 피크의 크로마토그램을 형성하는지 조사함으로서 이루어질 수 있다. 이외에 추가적으로 DNA 핑거프린팅 분석(DNA fingerprinting analysis), DGGE, T-RFLP 등의 방법으로도 이루어질 수 있다.
라이브러리로 제작은 shot gun 라이브러리의 경우 chimeric의 형성 비율이 높기 때문에 fosmid나 BAC과 같은 큰 크기의 DNA 단편을 이용하는 라이브러리의 제작이 바람직하다. 본 연구에서는 다중분리증폭법을 통해 증폭된 단일세포의 게놈을 fosmid 라이브러리로 제조하여 라이브러리의 활용성을 확인하였다. 또한 다중분리증폭법을 통해 증폭된 게놈 DNA의 경우 과량의 가지를 형성하여 라이브러리 제작에 여러 가지로 제약을 주기 때문에 단일 가닥의 가지를 제거 해 주기위해 S1 뉴클레아제를 사용하여 형성된 가지 형태를 제거해 주는 과정이 필요하다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법의 유용성의 검증을 위하여, 인공 미생물 군집을 제작하고 본 발명의 방법을 적용하여 실험을 수행한 결과, 인공 미생물 군집 중 희소종으로 도입한 미생물인 J.naejangsanesis 균주(KCTC 11523BP)의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리가 제작될 수 있음을 입증하였다.
아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 실시예에서 제작된 J.naejangsanesis 균주의 단일세포 유래 게놈 라이브러리 클론으로부터 각각 셀룰라아제 1, 2를 확인하였으며, 이를 통해 본 발명에 따라 제작된 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리가 신규 효소 및 그를 코딩하는 유전자의 발견에 유용하게 이용될 수 있음을 입증하였다.
이에, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 게놈 라이브러리를 이용하는 것을 특징으로 하는 희소 미생물 또는 신규 미생물의 활성효소 및 이를 코딩하는 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 스크리닝 방법은, 상기 방법에 따라 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리를 제작한 후, 상기 제조된 게놈 라이브러리에 타겟 효소기질을 처리하여 기질반응이 나타난 클론을 선별하고, 상기 선별된 클론으로부터 타겟 효소 또는 이를 코딩하는 유전자를 수득함으로써 수행될 수 있다. 이때, 선별된 클론으로부터 타겟 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 수득하는 방법은 통상의 알려진 유전공학적 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
또한 단일 세포유래의 라이브러리뿐 만아니라 우점 공지 미생물을 제거한 희소 난배양성 미생물 농축액 자체에 대한 유전자 증폭 및 라이브러리 제작이 가능하며 이를 통한 다양성이 증가된 형태의 메타게노믹(metagenomic) 라이브러리의 제작이 가능하다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 수집된 환경 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계; (b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계; (c) 상기 표지된 미생물을 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계; 및 (d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군으로부터 DNA를 분리하고 증폭하여 메타게노믹 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 다양성이 증가된 메타게노믹(metagenomic) 라이브러리의 제조방법에 관한 것이다. 우점종 또는 공지의 미생물이 제거된 미생물군으로부터 DNA를 분리, 증폭하여 메타게노믹 라이브러리를 제조하는 방법은 통상의 알려진 메타게노믹 라이브러리 제조방법에 따라 수행될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명의 효과의 검증을 위하여 희소 미생물을 포함한 인공 미생물 군집을 제작하여 본 발명에 따른 방법에 의하여 희소종이 검출될 수 있음을 확인하였으나, 자연 환경 내의 샘플을 수집하여 본 발명의 방법을 적용하여서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 인공 미생물군집 시료의 제작 및 미생물 커뮤니티의 분석
5종의 공지 미생물균주(Escherichia coli EPI300-T1, Bacillus cerius KCTC 3624, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637, Proteus mirabilis KCTC 2510, Jeongupia naejangsanesis)를 순수 배양한 후, 각각의 미생물을 다음과 같은 비율로 혼합하여 희소 미생물을 포함한 인공 미생물 군집 시료를 제조하였다(도 3). J. naejangsanesis 균주의 경우 본 실험실에서 셀룰레아제 활성균주로서 분리, 동정한 균주로서 2009년 7월 1일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC) 에 기탁한 균주이고 (Jeongeupia naejangsanensis BIO-TAS 4-1 KCTC 11523BP), E. coli EPI300-T1 균주의 경우 Epicentre사(USA)로부터 구입하였다. 상기의 균주를 제외한 미생물들(B. cerius KCTC 3624, P. aeruginosa KCTC 1637, P. mirabilis KCTC 2510)은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양 받아 실험에 이용하였다.
먼저 시료의 제조를 위하여 각각의 미생물의 LB 배지에 16시간 배양한 후 흡광광도계를 이용 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 후 8,000g로 10분간 4℃에서 다시 원심분리여, 상등액을 버리고 얻어진 세포를 앞서 측정한 흡광도를 기준으로 하여 1X PBS 완충액으로 흡광도 1.0이 되도록 재현탁 하였다. 그 다음, 상기의 방법을 통해 얻어진 미생물 현탁액을 각각 E. coli 9 ml, B. cerius 0.5 ml, P. aeruginosa 0.5 ml, P. mirabilis 0.1 ml, J. naejangsanesis 0.1 ml의 부피로 혼합하여 P. mirabilis 및 J. naejangsanesis 균주를 희소 미생물로 한 인공 미생물 군집을 제조하였다.
본 실시예에서는 본 발명에 따른 방법의 효과를 검증하기 위하여, 희소미생물을 포함한 인공 미생물 군집을 제조하여 확인하였으나, 실제 환경에 적용할 때에는, 바람직하게는 채집된 시료로부터 비 미생물적 요소(non microbial particles)를 제거하고, 미생물 커뮤니티 분석 시 명확한 결과를 얻기 위하여 클린 업(clean up) 공정을 추가로 수행하여, 박테리아 혼합물(bacterial cocktail)의 형태로 제공될 수 있다. 아울러, 환경 시료에 대한 미생물 커뮤니티 분석은 16S rDNA를 PCR 반응을 통해 증폭한 후 증폭된 16S rDNA에 대한 clone library를 제작하여 일정 수 이상의 16S rDNA clone을 시퀀싱하고 이를 분석하여 시료의 우점종인 미생물을 밝혀내는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
실시예 2: FISH 및 1차 FACS의 수행
2-1: FISH의 수행
실시예 1의 인공 미생물 군집에서 우점종이 되도록 혼합한 E. coli를 표지하고 FISH를 수행하기 위하여, 다음과 같이 E. coli에 대한 16S rRNA를 타겟으로 하는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)로 형광표지한 프로브를 2종 제조하였다.
Eco2: 5’ FITC-GTAACGTCAATGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCC-3’ (서열번호 1)
Eco3: 5’ FITC-CCGAAGGCACATTCTCATCTCTGAAAACTTCCGTGGATG-3’ (서열번호 2)
그 다음 실시예 1-1에서 제작한 인공 미생물군집의 미생물 조성의 변화를 막고 16 rRNA의 분해를 막기 위해, 100% 에탄올을 동일 부피로 첨가한 후, 4 ℃의 온도에서 16시간 동안 방치하여 고정화를 실시하였다. 이 후 1X PBS 완충액으로 2회 세척한 후 최종 세포의 농도가 108~109 cell/㎖이 되도록 현탁하여 실험에 이용하였다. 상기 시료 1 ㎖을 8,000 g, 10분간 원심분리한 후, 20% 포름아마이드(formamide) 농도의 혼성화 완충용액(hybridization buffer: 표 1, 최종 프로브 농도 50 ng/㎕) 1 ㎖로 재현탁하여 46 ℃에서 1시간 30분간 혼성화를 실시하였다.
혼성화 시료를 다시 8,000 g, 10분간 원심분리한 후, 세척완충용액(washing buffer: 표 2) 1 ㎖로 재현탁 하여 48 ℃에서 1시간 동안 incubation 하였다. 그 다음 상기 반응 시료를 다시 8,000 g, 10분간 원심분리한 후, 1 X PBS 완충액 1 ㎖을 이용하여 재현탁 한 후 추후 실험을 위해 4 ℃의 상태로 냉장 보관하였다.
표 1
Figure PCTKR2010004273-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2010004273-appb-T000002
2-2: 1차 FACS의 수행
상기 미생물군에 대하여 FACS Aria 장비 (Becton Dickinson Bioscience, USA)를 이용하여 형광표지된 우점 미생물을 분석하고 제거하였다. 이때, 상세하게는 488 nm 레이저와 530 nm 검출기를 이용하여 형광을 검출하였고, 70 ㎛의 노즐과 70 psi의 속도로 시료를 주입하였다. 각각 사용된 sheath 용액은 DNA에 오염되지 않은 3차 증류수를 이용하여 제조하였으며, FACS 기기의 경우는 sheath 용액과 시료가 통과하는 관을 FACS clean 용액(Becton Dickinson Bioscience)과 DNA에 오염되지 않은 3차 증류수를 이용하여 충분히 세척한 후 실험에 사용하였다. 분석과 분류에 사용한 소프트웨어는 FACS Diva (Becton Dickinson Bioscience)를 사용하였으며, 분류 방법은 "single cell mode"방법을 사용하여 우점 미생물과 희소 미생물을 분류하는 작업을 실시하였다.
실시예 2-1에서 FISH를 수행한 시료를 이용하여 FACS를 통해 분석한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Eco2 프로브 보다 Eco3 프로브에 의한 FISH 결과가 더 좋은 감도를 나타내었다.
실시예 3: 2차 FACS의 수행 - 농축된 희소미생물의 단일세포로의 분리
실시예 2에 따라 형광표지된 미생물이 제거된 잔류 미생물군 전체에 대해 핵산을 SYTO-16 (Invitrogen, USA) 염료를 이용하여 염색하였다. 잔류 미생물군에 SYTO-16 염료를 최종농도 5 μM이 되도록 첨가하여 준 후, 실온에서 1시간 동안 염색하였다.
이후 염색된 미생물군은 FACS 장비를 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 이때, 상세하게는 488 nm 레이저와 530 nm 검출기를 이용하여 형광을 검출하였고, 70 ㎛의 노즐과 70 psi의 속도로 시료를 주입하였다. 각각 사용된 sheath 용액은 DNA에 오염되지 않은 3차 증류수를 이용하여 제조 하였으며, FACS 기기의 경우는 sheath 용액과 시료가 통과하는 관을 FACS clean 용액(Becton Dickinson Bioscience)과 DNA에 오염되지 않은 3차 증류수를 이용하여 충분히 세척한 후 실험에 사용하였다. 분석과 분류에 사용한 소프트웨어는 FACS Diva (Becton Dickinson Bioscience)를 사용하였으며, 분류 방법은 "single cell mode"방법을 사용하여 최종 96 well PCR tube(Axygen, USA)에 단일세포의 형태로 분류하였다. 이때 96 well PCR tube에는 3 ㎕의 1X PBS 완충액을 넣어 두어 분류된 미생물이 안착되기 쉽도록 하였다. 96 well PCR tube로의 분류는 세로로 1, 3, 5, 7번째 줄로 각각 8개의 well에 1, 3, 5, 7개의 세포가 들어가도록 분류하였다. 분류가 끝난 96 well PCR tube는 곧바로 -20 ℃로 냉동 보관하여 추후 실험에 사용하였다.
실시예 4: 분리된 단일 세포의 게놈의 증폭
4-1: MDA를 통한 단일 세포의 게놈의 증폭
실시예 3에서 분리한 각 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭하였다. 이때, 다중분리증폭법은 REPLI-g Mini 키트(QIAGEN, USA)를 사용하였으며, 포함된 매뉴얼의 “Amplification of Genomic DNA from Blood or Cells the REPLI-g Mini Kit" 방법에 따라 수행하였다. 상기의 실험결과 MDA를 통해 genomic DNA가 증폭된 것을 확인하기 위해 0.8 % 아가로스겔 전기영동과, 16S rDNA PCR 방법을 사용하였다. 이때, 16S rDNA PCR을 위한 프라이머로는 다음과 같이 제조하여 사용하였다.
27F: 5’-GAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’(서열번호 3)
1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (서열번호 4)
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 32개의 시료 중 모든 시료에서 16S rDNA에 대한 PCR product가 생성됨을 확인하였다. 즉, 32개의 시료에서 모두 genomic DNA가 증폭되었음을 것을 확인하였다.
4-2: MDA 증폭 산물에 대한 검토
실시예 4-1에 의해 증폭된 MDA 산물에 대해 인공 미생물군집 중 희소하게 존재하는 J. naejangsanesis균주가 지니고 있는 것으로 이미 알고 있는 두 종류의 셀룰레아제 유전자를 검출하고자 셀룰레아제 유전자의 중간 위치를 증폭할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 합성하고 PCR을 실시하였다.
셀룰레아제 1
EC010 Cell 1 IF: 5’-TCGATACCGGCAACGGCGGC-3’ (서열번호 5)
EC010 Cell 1 IR: 5’-CTCAGCAGGTCGAGCACTGCCG-3’ (서열번호 6)
셀룰레아제 2
Cell 2 IF: 5’-CCGACCCGCAGGACGCAAGC-3’ (서열번호 7)
Cell 2 IR: 5’-GCCACCAGTTGCCGTCGTGCTC-3’ (서열번호 8)
그 결과, 11개의 시료에서 셀룰레아제 유전자의 PCR 산물이 확인되었으며, 그중 6개의 시료에서는 두 종류의 셀룰레아제 유전자가 모두 증폭되었음을 확인하였다. 그리고 단일 세포로 분류하여 genomic DNA가 증폭된 시료에서는 하나의 시료에서 두 종류의 셀룰레아제 유전자가 PCR을 통해 증폭된 것을 확인하였다. 즉, 인공 미생물 군집에서 희소종이었던 J. naejangsanesis 균주가 본 발명의 방법에 따라 농축되어 MDA 증폭산물로 수득되어졌음을 확인할 수 있다(도 5).
또한 16S rDNA를 PCR을 통해 증폭하고, 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터 (Promega, USA)에 클로닝 하여 클론 3개를 선발 시퀀싱 한 후 시퀀싱 결과를 분석한 결과 단일 세포 유래의 J. naejangsanesis 균주로 확인 되었고(도 6), 따라서 상기의 시료를 이후 Fosmid 라이브러리를 제작하는 실험에 이용하였다.
실시예 5: 희소종의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조
5-1: S1 뉴클레아제의 처리
MDA를 단일 세포의 게놈의 증폭반응 중 과도한 가지(hyperbranch)가 발생하므로, 이를 해소하기 위하여 S1 뉴클레아제를 사용하였다. 이를 통해 이중가닥의 DNA만을 얻을 수 있었는데, 이를 Fosmid 라이브러리에 적용하기 위해서는 일정크기(25 Kbp) 이상이 되어야하므로, 아가로스겔 전기영동을 통해 크기를 확인하는 실험을 실시하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, S1 뉴클레이즈를 과량으로 처리한 경우에도 대부분의 증폭 산물은 48 Kbp 이상의 크기를 지니는 것을 확인하였고 이를 통해 Fosmid 라이브러리를 제조할 수 있음을 확인하였다.
5-2: 게놈 라이브러리의 제조
실시예 5-1을 통해 이중가닥을 지니는 단일세포 유래의 genomic DNA를 확보하였고, 이를 이용하여 Fosmid 라이브러리를 제작하였다. Fosmid 라이브러리의 제조는 "CopyControl Fosmid Library Production Kit"(Epicentre Biotechnologies, USA)를 이용하여, 제조사에서 제공한 매뉴얼에 기재되어 있는 방법으로 실시하였고, 최종적으로 50,000여 클론을 확보하였다.
실시예 6: 활성효소의 스크리닝 및 신규 셀룰레아제 유전자의 분리
실시예 5-2에서 제조한 게놈 라이브러리 클론으로부터 활성 셀룰레아제를 스크리닝하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 셀룰레아제 활성 기반 효소탐색은, LB_Agar 고체배지를 CMC(Carboxyl Methyl Cellulose) 1 %, Tryphan Blue 0.005 %, 항생제로서 chloramphenicol 12.5 ㎍/㎖로 최종 농도가 되도록 첨가하여 제조한 다음, Fosmid 라이브러리 클론을 도말하여 37 ℃에서 배양하면서 투명환이 나타나는 클론을 선별함으로써 수행되었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 15 개의 셀룰레아제 활성을 지니는 Fosmid 클론을 확보할 수 있었다.
추가적으로, 활성 클론의 Fosmid 벡터를 분리하여, 제한효소 BamHI을 처리하여 삽입된 DNA 단편의 크기를 확인한 결과 평균 32 Kbp의 크기로 27-40 Kbp 사이의 DNA가 삽입되어 있는 것을 확인하였다(도 9). 상기의 셀룰레아제 활성 클론에 대한 셀룰레아제 유전자의 중간 위치를 증폭할 수 있는 프라이머를 합성하여 각각 PCR을 통해 증폭한 결과 모든 클론에서 각각의 셀룰레아제 유전자가 증폭되는 것을 확인할 수 있었다(도 10).
그리고 상기의 셀룰레아제 1과 2의 전체 유전자를 각각 J. naejangsanesis genomic DNA, 단일세포 유래 MDA 산물, fosmid library MDC #11 clone을 template로 하여 PCR 증폭한 후 pGEM-T (promega, USA) 벡터에 클로닝하여 각각 두 개의 클론을 시퀀싱 한 결과 모든 셀룰레아제 유전자의 시퀀스가 동일하게 나타남을 확인 할 수 있었다 (도 11, 12). 상기 PCR에 사용한 프라이머의 시퀀스는 다음과 같다.
셀룰레이즈 1
Cell 1 FF: 5’-TCGATACCGGCAACGGCGGC-3’ (서열번호 9)
Cell 1 FR: 5’-CTCAGCAGGTCGAGCACTGCCG-3’ (서열번호 10)
셀룰레이즈 2
Cell 2 FF: 5’-AACATATGTTGAGAGGAGCGCATCCGGTGT-3’ (서열번호 11)
Cell 2 FR: 5’-TTGGATCCTTATGGCTGTTGCCACAACCCC-3’ (서열번호 12)
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 라이브러리의 제조방법은 기존의 방법으로 검출이 어려웠던 실제 환경에 존재하는 난배양성 희소미생물 및 신규 미생물의 게놈 라이브러리를 제공하며, 희소 미생물 및 신규 미생물에 대한 대량의 유전자를 확보할 수 있게 한다. 또한, 기존의 메타게놈 라이브러리 제조방법과 달리 확보된 유전자의 유래를 확인할 수 있게 하며 환경에 존재하는 우점의 미생물을 제거함으로써 다양성에 기반을 둔 라이브러리의 제조가 가능하게 하므로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.
Figure PCTKR2010004273-appb-I000001

Claims (11)

  1. 다음 단계를 포함하는, 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리의 제조방법:
    (a) 수집된 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
    (b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
    (c) 상기 표지된 미생물을 1차 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계;
    (d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군 전체를 표지한 다음, 2차 FACS 기법을 이용하여 상기 미생물군 전체를 단일 세포로 분리하는 단계;
    (e) 상기 분리된 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭하는 단계; 및
    (f) 상기 증폭된 단일세포의 게놈을 유전자 라이브러리로 제조하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물군의 커뮤니티 분석은 ARISA (amplified riosomal intergenic spacer analysis), T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism), DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis), ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 및 DNA 마이크로어레이 중 어느 하나 이상의 방법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물군의 커뮤니티 분석은 16S rDNA를 증폭하여 제작한 라이브러리 클론을 시퀀싱하여 분석하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 표지는 FISH (Fluoresence In Situ Hygridization) 기법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (b)단계의 표지는 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물의 16S rDNA를 타겟으로 하는 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 표지된 미생물이 제거된 미생물군의 커뮤니티를 재분석하여 우점종 또는 공지의 미생물이 확인되는 경우 표지하여 제거하는 단계를 추가로 반복하여 수행한 다음, 남은 미생물군 전체에 대하여 표지하여 2차 FACS 기법을 이용하여 단일세포로 분리하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (f)단계에서 증폭된 게놈의 16S rRNA를 공지 미생물의 16S rRNA와 대비하여 신규한 미생물로 확인된 게놈만을 라이브러리로 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (f)단계에서 증폭된 게놈을 분석하여 단일세포로부터 유래된 것으로 확인된 게놈만을 라이브러리로 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 다음 단계를 포함하는, 희소 미생물 또는 신규 미생물의 단일 세포 유래 게놈 라이브러리를 이용한 신규 활성효소 또는 이를 코딩하는 유전자의 스크리닝 방법:
    (a) 수집된 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
    (b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
    (c) 상기 표지된 미생물을 1차 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계;
    (d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군 전체를 표지한 다음, 2차 FACS 기법을 이용하여 상기 미생물군 전체를 단일 세포로 분리하는 단계;
    (e) 상기 분리된 단일세포의 게놈을 다중분리증폭법 (multiple displacement amplification, MDA)를 이용하여 증폭하는 단계;
    (f) 상기 증폭된 단일세포의 게놈을 유전자 라이브러리로 제조하는 단계;
    (g) 상기 제조된 게놈 라이브러리에 타겟 효소 기질을 처리하여 기질반응이 나타난 클론을 선별하는 단계; 및
    (h) 상기 선별된 클론으로부터 타겟 효소 또는 이를 코딩하는 유전자를 수득하는 단계.
  11. 다음 단계를 포함하는, 미생물 다양성이 증가된 메타게노믹(metagenomic) 라이브러리의 제조방법:
    (a) 수집된 환경 시료의 미생물군 커뮤니티 분석을 수행하는 단계;
    (b) 상기 커뮤니티 분석에서 우점종 또는 공지의 미생물로 확인된 미생물을 표지하는 단계;
    (c) 상기 표지된 미생물을 FACS (Fluorescence Associated Cell Sorter) 기법을 이용하여 제거하는 단계; 및
    (d) 상기 표지된 미생물이 제거된 미생물군으로부터 DNA를 분리하고 증폭하여 메타게노믹 라이브러리를 제조하는 단계.
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