WO2010150578A1 - 輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法 - Google Patents

輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法 Download PDF

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lymph node
sentinel lymph
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允 日景
幸祐 権田
元博 武田
尚 亀井
憲明 大内
秀樹 郷田
中野　寧
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国立大学法人東北大学
コニカミノルタエムジー株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an imported lymphatic inflow portion detection method and a specific cell identification method.
  • lymph nodes suspected of metastasis of cancer are often excised.
  • sentinel lymph node biopsy has been performed to minimize excision of lymph nodes.
  • the sentinel lymph node is defined as the lymph node that first receives lymph flow from each organ. In cancer surgery, if the sentinel lymph node does not metastasize, the typical lymph node The sentinel lymph node theory that cleansing is unnecessary is widely accepted.
  • the sentinel lymph node biopsy makes it possible to reduce unnecessary surgical invasion, and contributes to the establishment of tailor-made medical care that selects a surgical method in detail according to the disease state of the patient.
  • the colloid particle size is several hundred nm to several tens of ⁇ m, which is larger than dyes (several nm) and quantum dots (several tens of nm), and poor migration to the lymphatic system. Cannot observe lymph flow in real time.
  • the resolution is low, there is a risk of oversight when the sentinel lymph node is in the vicinity of the colloidal local injection (shine-through phenomenon). There are problems such as restrictions and difficulty in expanding adaptation facilities.
  • sentinel lymph node biopsy The greatest objective of sentinel lymph node biopsy is to diagnose whether metastatic cancer cells are present in the sentinel lymph node during surgery.
  • diagnosis of cancer metastasis of sentinel lymph nodes is performed by microscopic examination after thinning the excised tissue and staining with hematoxylin and eosin staining, but only a small part of the excised lymph node tissue can be observed. Therefore, there is a risk that a minute metastasis may be missed. For example, in the case of a lymph node having a diameter of about 5 mm, only 1 to 3% of the entire cross-section is examined.
  • Non-Patent Document 1 it is reported that a melanoma tumor of a mouse pinna metastasizes to a regional lymph node, and according to this, it is said that lymph node metastasis of cancer occurs from the vicinity of the inflow portion of an imported lymphatic vessel.
  • the present invention has been made in view of the above problems in the prior art, and an object thereof is to accurately detect a site where metastatic cancer cells may exist in a sentinel lymph node.
  • the invention according to claim 1 is characterized in that the fluorescence intensity is measured for each of a plurality of sites in the sentinel lymph node after the extraction where the quantum dots are injected, and the measured plurality of sites.
  • This is an imported lymphatic inflow portion detection method in which one or a plurality of sites are detected as an imported lymphatic inflow portion in order from the highest fluorescence intensity.
  • the invention according to claim 3 is the imported lymphatic vessel inflow portion detection method according to claim 1 or 2, wherein the quantum dot includes a quantum dot to which an antibody specific to a specific cell is bound, The specific cells are identified based on fluorescence in the sentinel lymph node.
  • the specific cell is a T lymphocyte.
  • the specific cell is a cancer cell.
  • the invention according to claim 6 measures the fluorescence intensity for each of a plurality of sites in the sentinel lymph node after excision into which a quantum dot including a quantum dot to which an antibody specific for a specific cell is bound is injected. And detecting one or a plurality of sites in order from the highest fluorescence intensity among the plurality of measured sites as an imported lymphatic inflow portion, and identifying the specific based on the detected fluorescence of the imported lymphatic inflow portion A specific cell identification method for identifying a cell.
  • a site with high fluorescence intensity in the sentinel lymph node is detected as an imported lymphatic inflow portion, a site where metastatic cancer cells can exist in the sentinel lymph node is detected with high accuracy. be able to.
  • the fluorescence intensity can be measured with high accuracy for each of a plurality of parts by performing image analysis on an image acquired by a confocal fluorescence microscope for single-molecule observation.
  • the detection accuracy of specific cells can be improved.
  • the detection accuracy of T lymphocytes can be improved.
  • the detection accuracy of cancer cells can be improved.
  • 26B is an enlarged image of a part of FIG. 26A. It is a photographed image of a sentinel lymph node. It is a fluorescence image of a sentinel lymph node. It is an immunostaining image of a sentinel lymph node. It is an immunostaining image of a sentinel lymph node. It is the fluorescence image which image
  • FIG. 1 shows the configuration of the fluorescence measurement system 1.
  • the fluorescence measurement system 1 includes an endoscope fluorescence measurement device 10, an image analysis device 20, and a laser light excitation device 30.
  • the fluorescence measurement system 1 performs fluorescence analysis in the surgical field during surgery, and is used when specifying the position of the sentinel lymph node from a living body into which quantum dots have been injected as a tracer.
  • a quantum dot is a cluster of semiconductors with a diameter of 15-20 nanometers (nm), and is a particle that emits various fluorescence depending on its particle size.
  • the quantum dot is composed of a core of cadmium selenium, a shell covering the core, a polymer coating, and the like.
  • quantum dots When quantum dots are used as tracers for sentinel lymph nodes, they have the following characteristics. (1) Since the fluorescence intensity is strong and it is difficult to fade, long-time observation is possible. (2) When there are particles having various emission wavelengths and fluorescent particles having a wavelength longer than the visible region are used, the surgical field is not visually stained. (3) The fluorescence intensity is strong and the direction of lymph flow can be identified in real time.
  • Particles with various emission wavelengths can be detected with excitation light having the same wavelength, and can be identified by the emission wavelength.
  • the number of particles and the fluorescence intensity are in a proportional relationship, and the fluorescence intensity can be quantified.
  • Fluorescence is not deactivated even at the stage of preparation in a pathological tissue section, and can be applied to pathological evaluation.
  • the endoscopic fluorescence measurement device 10 is a high-sensitivity fluorescence measurement device for endoscopic surgery.
  • FIG. 2 the external appearance structure of the endoscope type fluorescence measuring device 10 is shown.
  • the endoscope fluorescence measuring apparatus 10 includes an EMCCD camera 11, a lens 12, a fluorescence filter 13, a light guide 14, an endoscope unit 15, a handle 16, and the like.
  • the endoscope unit 15 is a functional unit that irradiates the living body with the excitation light emitted by the laser light excitation device 30 and receives fluorescence from the living body.
  • the EMCCD camera 11 is a high-sensitivity CCD camera for endoscopic surgery, receives fluorescence guided through the endoscope unit 15, the fluorescence filter 13, and the lens 12, and receives image data as an image analysis device 20. Output to.
  • the image analysis apparatus 20 includes a CPU (Central Processing Unit) 21, a ROM (Read Only Memory) 22, a RAM (Random Access Memory) 23, a communication unit 24, an operation unit 25, a display unit 26, and a storage.
  • the units 27 and the like are provided, and each unit is connected by a bus 28.
  • the CPU 21 reads out various processing programs stored in the ROM 22, develops them in a work area formed in the RAM 23, and controls each part of the image analysis apparatus 20 according to the programs.
  • the ROM 22 stores a system program executed by the CPU 21, various programs for performing various processes, data necessary for executing these programs, and the like.
  • the RAM 23 temporarily stores various processing programs, input or output data, parameters, and the like read from the ROM 22 in various processes controlled by the CPU 21.
  • the communication unit 24 receives the image data of the fluorescence image from the endoscope type fluorescence measurement device 10.
  • the operation unit 25 includes a keyboard having a cursor key, a character input key, various function keys, and the like, and a pointing device such as a mouse.
  • the operation signal is input to the CPU 21 by a key operation or a mouse operation on the keyboard. Output.
  • the display unit 26 includes a monitor such as an LCD (Liquid Crystal Display), and displays an observation target image, an operation screen, and the like in accordance with an instruction of a display signal input from the CPU 21.
  • a monitor such as an LCD (Liquid Crystal Display)
  • LCD Liquid Crystal Display
  • the storage unit 27 is configured by a hard disk, a nonvolatile semiconductor memory, or the like, and stores various data.
  • the storage unit 27 stores a file (AVI file) of image data received from the endoscope fluorescence measurement apparatus 10.
  • the CPU 21 displays the observation target image on the display unit 26 based on the image data of the fluorescence image acquired by the endoscope fluorescence measuring apparatus 10, and calculates the fluorescence intensity by performing image analysis on the image data.
  • the laser beam excitation device 30 is a device that emits excitation laser light (632.8 nm) for irradiating a living body.
  • FIG. 3 shows the configuration of the microscope system 2.
  • the microscope system 2 includes a single molecule fluorescence microscope 40 and an image analysis device 50.
  • the microscope system 2 performs fluorescence analysis more precisely with respect to a tissue extracted from a living body, and is used when analyzing a structure in a sentinel lymph node.
  • the single-molecule fluorescence microscope 40 is a confocal fluorescence microscope for single-molecule observation, and is a confocal fluorescence microscope apparatus capable of observation at the level of one molecule (one fluorescent particle).
  • the single molecule fluorescence microscope 40 emits excitation laser light (532 nm) from a light source, and outputs a fluorescence image from the examination target tissue to the image analysis device 50 as image data.
  • the CPU 51 reads out various processing programs stored in the ROM 52, develops them in a work area formed in the RAM 53, and controls each part of the image analysis device 50 according to the programs.
  • the ROM 52 stores a system program executed by the CPU 51, various programs for performing various processes, data necessary for executing these programs, and the like.
  • the RAM 53 temporarily stores various processing programs read from the ROM 52, input or output data, parameters, and the like in various processes controlled by the CPU 51.
  • the communication unit 54 receives image data from the single molecule fluorescence microscope 40.
  • the operation unit 55 includes a keyboard having cursor keys, character input keys, various function keys, and the like, and a pointing device such as a mouse.
  • the operation signal is input to the CPU 51 by using key operations on the keyboard and mouse operations. Output.
  • the display unit 56 is configured by a monitor such as an LCD, and displays an observation target image, an operation screen, and the like according to an instruction of a display signal input from the CPU 51.
  • the storage unit 57 is configured by a hard disk, a nonvolatile semiconductor memory, or the like, and stores various data.
  • the storage unit 57 stores a file (AVI file) of image data received from the single molecule fluorescence microscope 40.
  • the CPU 51 displays an observation target image on the display unit 56 based on the image data of the fluorescence image acquired by the single molecule fluorescence microscope 40, and calculates the fluorescence intensity by analyzing the image data.
  • a more precise fluorescence analysis is performed by the microscope system 2 on the sentinel lymph node extracted in a state where the quantum dots are injected. Specifically, the fluorescence intensity is measured for each of a plurality of sites in the sentinel lymph node, and one or a plurality of sites in order from the highest fluorescence intensity among the plurality of measured sites is the import lymphatic inflow portion. Detected. The fluorescence intensity is measured by image analysis of an image acquired by the single molecule fluorescence microscope 40 using the image analysis device 50.
  • the imported lymphatic inflow portion when detecting the imported lymphatic inflow portion, it is also possible to detect a predetermined number of sites as the imported lymphatic inflow portion in order from the highest fluorescence intensity among a plurality of sites in the sentinel lymph node. Alternatively, a portion having a fluorescence intensity equal to or higher than a predetermined reference value among a plurality of portions may be detected as an imported lymphatic inflow portion.
  • the present invention is used for structural analysis of sentinel lymph nodes.
  • the detected tissue of the imported lymphatic inflow portion is collected, and a histopathological examination for diagnosing whether there is a cancer cell is performed. If there is no cancer metastasis at the import lymphatic inflow, no further lymph node removal is necessary.
  • FIG. 4 shows an example in which a pig representing a large animal model is used as a living body and gastric cancer is assumed.
  • the pigs were male castrated pigs (average body weight 26.7 kg) of Landrace-Yorkshire hybrid of 2-3 months old.
  • Qdot (registered trademark) 705 sold by Invitrogen (registered trademark) was used as the quantum dot.
  • the particle diameter is about 20 nm and the emission wavelength is 702 (700-715) nm.
  • the reason for selecting fluorescent particles having an emission wavelength in the near-infrared region is that the fact that there is little interference with the autofluorescence of the living body is taken into consideration.
  • the fluorescence spread of the quantum dots in the stomach and the subsequent lymph network was observed in real time using the endoscope fluorescence measuring apparatus 10.
  • the position of the sentinel lymph node was determined by fluorescence, and the sentinel lymph node was removed using fluorescence as a guide.
  • the extracted sentinel lymph node was subjected to structural analysis by precise fluorescence measurement using a single molecule fluorescence microscope 40.
  • FIG. 5 shows the relationship between the quantum dot concentration (QDs concentration) and the fluorescence intensity.
  • the graph shown in FIG. 5 is a result of injecting quantum dots of various concentrations into the stomach wall of a pig and measuring the fluorescence intensity using the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10.
  • the horizontal axis represents quantum dot concentration (nM), and the vertical axis represents gray-value / mm 2 . That is, in the image analysis device 20, the fluorescence intensity is calculated based on the density of the fluorescence image acquired by the endoscope fluorescence measurement device 10.
  • FIG. 6B is a fluorescence image obtained by analyzing the surgical field information acquired by the endoscope fluorescence measuring apparatus 10 by the image analysis apparatus 20.
  • the injection part 70a which is a position corresponding to the injection part 70 in the photographed image of FIG. 6A shows fluorescence. That is, fluorescence was detected at the position where the quantum dots were injected.
  • FIG. 7A is a captured image of the small wall side rear wall of the stomach.
  • the quantum dots injected from the injection portion 80 inside the stomach flow into the sentinel lymph node 81 and do not flow into the lymph nodes 82 other than the sentinel lymph node.
  • FIG. 7B is a fluorescence image obtained by photographing the small wall side rear wall of the stomach body portion with the endoscope type fluorescence measuring device 10 and analyzing it with the image analyzing device 20. Even in a wide field of view, a fluorescent signal could be recognized at the injection portion 80a and the sentinel lymph node 81a. In addition, the fluorescence signal was not shown about lymph nodes 82a other than a sentinel lymph node.
  • FIGS. 8A-8D are fluorescence images showing temporal changes in the fluorescence signal of the imported lymphatic vessel (imported lymphatic vessel 83a shown in FIG. 7B) acquired by the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10.
  • FIG. Imported lymphatic vessels are those that pour lymph fluid into lymph nodes. 8A is an image when 3 minutes have elapsed after quantum dot injection, FIG. 8B is an image when 10 minutes have elapsed since quantum dot injection, FIG. 8C is an image when 30 minutes have elapsed since quantum dot injection, and FIG. Is an image when 60 minutes have elapsed after quantum dot injection.
  • FIG. 8E is a schematic diagram of imported lymphatic vessels corresponding to FIGS. 8A-8D.
  • FIGS. 9A to 9D are fluorescence images showing temporal changes in the fluorescence signal of the sentinel lymph node (the sentinel lymph node 81a shown in FIG. 7B) acquired by the endoscope fluorescence measuring apparatus 10.
  • FIG. 9A is an image when 3 minutes have elapsed after quantum dot injection
  • FIG. 9B is an image when 10 minutes have elapsed since quantum dot injection
  • FIG. 9C is an image when 30 minutes have elapsed since quantum dot injection
  • FIG. Is an image when 60 minutes have elapsed after quantum dot injection.
  • FIG. 9E is a schematic diagram of a sentinel lymph node corresponding to FIGS. 9A-9D.
  • the intensity of the fluorescent signal hardly changed in the imported lymphatic vessel.
  • the fluorescence signal increased with time. The fluorescent signal did not leak around lymphatic vessels or lymph nodes, and no fluorescence was observed in lymph nodes following the sentinel lymph node (lymph nodes other than the sentinel lymph node).
  • FIG. 10 is a graph obtained by quantitatively analyzing the fluorescence signal intensity in the imported lymphatic vessel acquired by the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10.
  • FIG. 11 is a graph obtained by quantitatively analyzing the fluorescence signal intensity in the sentinel lymph node acquired by the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10. 10 and 11, the horizontal axis represents time (minutes) and the vertical axis represents gray-value / mm 2 . In the imported lymphatic vessels, the fluorescence intensity did not change with time, and in the sentinel lymph node, the fluorescence intensity increased with time.
  • FIG. 12A is a photographed image of the sentinel lymph node after excision.
  • FIG. 12B is a fluorescence image obtained by photographing the sentinel lymph node with the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10.
  • FIG. 12C is a fluorescence image after tissue fixation obtained by photographing the tissue in the region 90 shown in FIG. 12B with the single-molecule fluorescence microscope 40.
  • fluorescence was observed even after excision, and the fluorescence signal peculiar to the quantum dot was observed in the lymph node tissue in the observation with the single molecule fluorescence microscope 40.
  • FIG. 13A is a photographed image of lymph nodes other than sentinel lymph nodes after excision.
  • FIG. 13B is a fluorescence image obtained by photographing lymph nodes other than the sentinel lymph node shown in FIG. 13A with the endoscope fluorescence measuring apparatus 10.
  • FIG. 13C is a fluorescence image after tissue fixation obtained by photographing the tissue in the region 91 shown in FIG. 13B with the single-molecule fluorescence microscope 40. In the lymph nodes other than the sentinel lymph node, no fluorescence signal was observed in the observation with the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10 and the observation with the single molecule fluorescence microscope 40.
  • FIG. 14 shows the fluorescence intensity (gray-value) inside the sentinel lymph node (SLN) and lymph nodes other than the sentinel lymph node (Non-SLN) quantitatively analyzed by the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10 and the image analyzing apparatus 20. / Mm 2 ).
  • the fluorescence intensity was clearly higher in the sentinel lymph node, indicating that quantum dots were present in the sentinel lymph node.
  • Fluorescence signals measured in lymph nodes other than sentinel lymph nodes appear to be derived from tissue autofluorescence.
  • the near-infrared region used by the inventors is a wavelength region in which the autofluorescence of the living body is relatively small, but in order to keep it as low as possible, the excitation laser light (wavelength: 532 nm, irradiation surface output: The discoloration of the autofluorescence of the tissue by 80 pW / ⁇ m 2 ) was examined.
  • FIG. 15A, FIG. 15B, and FIG. 15C show the sentinel lymph node immediately after irradiation with the excitation laser light on the same field with the single-molecule fluorescence microscope 40 (0 minutes), after 30 minutes, and after 60 minutes. It is a fluorescence image which shows the fluorescence signal in each time after progress.
  • FIG. 16A, FIG. 16B, and FIG. 16C show that immediately after irradiation (0 minutes) when the excitation laser light is continuously irradiated to the same visual field with a single-molecule fluorescence microscope 40 for lymph nodes other than the sentinel lymph node, It is a fluorescence image which shows the fluorescence signal in each time after progress for 30 minutes after progress for 30 minutes.
  • the autofluorescence of the lymph node tissue faded with time, but the fluorescence signal of the quantum dot inside the sentinel lymph node tissue (the signal of the blinking particle) was 60 minutes. It was not deactivated even after irradiation with the excitation laser beam.
  • FIG. 17 is a graph showing the discoloration of fluorescence caused by irradiation with excitation laser light of a single molecule fluorescence microscope 40 in a specimen group of sentinel lymph nodes (SLN) and lymph nodes other than sentinel lymph nodes (Non-SLN) by quantitative evaluation. It is.
  • the horizontal axis is time (minutes), and the vertical axis is gray-value / ⁇ m 2 . That is, the image analysis apparatus 50 calculates the fluorescence intensity based on the density of the fluorescence image acquired by the single molecule fluorescence microscope 40.
  • FIG. 18 shows the graph of FIG. 17 as a relative value with respect to the fluorescence of the sentinel lymph node (SLN) and lymph nodes other than the sentinel lymph node (Non-SLN) by laser light irradiation.
  • the gray-value at 0 minutes is set to 1 for each sentinel lymph node and lymph nodes other than the sentinel lymph node.
  • the fluorescence was faded by irradiation with excitation laser light in both sentinel lymph nodes and lymph nodes other than the sentinel lymph nodes.
  • FIG. 19 is a graph showing temporal changes in the fluorescence signal intensity of one quantum dot particle in a sentinel lymph node sample.
  • the decrease in the fluorescence signal of the lymph node sample obtained in FIGS. 17 and 18 is derived from the autofluorescence of the lymph node tissue, and the fluorescence of the quantum dots is faded by 60 minutes of excitation laser light irradiation It was shown not to.
  • the fluorescence of the lymph nodes other than sentinel lymph nodes can be reduced to a negligible level (16% in 30 minutes, 10% in 60 minutes) by irradiation with excitation laser light. Indicated.
  • the sentinel lymph node it was shown that the internal autofluorescence was reduced, but the fluorescence of the quantum dots was maintained for 1 hour. From this data, when observing a tissue section with a single-molecule fluorescence microscope 40, irradiation of excitation laser light for about 30 minutes causes the majority of the autofluorescence of the tissue to fade, resulting in accurate quantum dot fluorescence intensity. It became clear that quantitative analysis was possible.
  • the fluorescence signal is inhomogeneous in the sentinel lymph node and is thought to be derived from the distribution of quantum dots inside the sentinel lymph node.
  • 20A is a photographed image of the extracted sentinel lymph node
  • FIG. 20B is a fluorescence image of the sentinel lymph node acquired by the endoscope fluorescence measuring apparatus 10.
  • Fluorescence intensity (proportional to the number of quantum dots) in each part of the sentinel lymph node specimen was analyzed with a single molecule fluorescence microscope 40.
  • FIG. 21 shows the positions of analysis sites A to F in the sentinel lymph node.
  • the single-molecule fluorescence microscope 40 was irradiated with excitation laser light for 30 minutes and then observed.
  • FIGS. 22A to 22F show fluorescence images obtained by photographing the tissues of the analysis sites A to F with the single molecule fluorescence microscope 40.
  • FIG. As shown in FIGS. 22A and 22B, a large number of quantum dots existed in the analysis sites A and B.
  • FIG. 23 shows the result of quantitative analysis of the fluorescence intensities in the analysis portions A to F by performing image analysis in the image analysis apparatus 50.
  • the relative fluorescence intensity value is a relative value of the fluorescence intensity at the analysis sites A to F when the fluorescence intensity at the analysis site F is “1”.
  • the number of samples: n 10 means that 10 specimens were observed from each of the regions of analysis sites A to F within one specimen slide.
  • FIG. 24 is a graph showing the relative fluorescence intensity values at the analysis sites A to F. Similarly to FIG. 23, the fluorescence intensity of the analysis site F is set to “1”. The quantitative evaluation of fluorescence makes it possible to precisely evaluate the number of quantum dots present at each site in the sentinel lymph node.
  • FIG. 25A is a microscopic image of a specimen in which the tissue of the removed sentinel lymph node is stained with hematoxylin and eosin.
  • An area 102 in FIG. 25A corresponds to the area 100 in FIG. 20A and the area 101 in FIG. 20B.
  • FIG. 25B is an enlarged image of the region 102 in FIG. 25A.
  • the positions of the imported lymphatic inflow portions 103 and 104 can be confirmed by staining.
  • FIG. 26A is an immunostained microscope image in which the tissue of the extracted sentinel lymph node is stained with DAB for a CD3 antibody specific for T cells in the lymph node.
  • the area 105 in FIG. 26A corresponds to the area 100 in FIG. 20A and the area 101 in FIG. 20B.
  • FIG. 26B is an enlarged image of the area 105 in FIG. 26A.
  • the portions surrounded by several lymphoid follicles that are not stained by immunostaining are imported lymphatic inflow portions 106 and 107.
  • the influx of imported lymphatic vessels in the sentinel lymph node is detected by fine quantitative analysis of the distribution of quantum dots used as the tracer of the sentinel lymph node in the sentinel lymph node. It became possible.
  • the area near the inflow of the imported lymphatic vessels is a high risk of cancer metastasis, and metastatic cancer cells in the sentinel lymph node can be detected by conducting a histopathological examination focusing on the data obtained by this fluorescence analysis as an index. The performance is expected to improve dramatically.
  • quantum dots fluorescence wavelength: 705 nm
  • quantum dots fluorescence wavelength: 605 nm
  • CD3ab-QD Quantum dots to which CD3 antibody is bound
  • quantum dots have different fluorescence wavelengths, so even with the same wavelength excitation (532 nm), each fluorescence wavelength can be evaluated by changing the absorption filter of the microscope. It is possible.
  • CD3ab-QD was localized around the T-cell targeted by the antibody in addition to being localized at the inflow of the imported lymphatic vessel of the sentinel lymph node as in the case of the quantum dot alone. Labeling was possible.
  • FIG. 27A is a photographed image of the extracted sentinel lymph node
  • FIG. 27B is a fluorescence image of the sentinel lymph node acquired by the endoscope type fluorescence measuring apparatus 10.
  • FIG. 27C is an immunostained image of the tissue in the region 110 of the photographed image of FIG. 27A
  • FIG. 27D is an immunostained image of the region 111 in FIG. 27C.
  • the stained cells are T lymphocytes.
  • FIG. 27E is a fluorescence image obtained by fluorescence analysis of the tissue in the region 112 in which many T lymphocytes are present in FIG. 27D with the single molecule fluorescence microscope 40 and the image analysis apparatus 50, and an absorption filter for 605 nm (band pass of 565-625 nm) Filter). Portions 113 and 114 corresponding to T lymphocytes show fluorescence.
  • FIG. 27F is a fluorescence image obtained by fluorescence analysis of the tissue in the region 112 where a large amount of T lymphocytes are present in FIG. 27D with the single molecule fluorescence microscope 40 and the image analysis apparatus 50.
  • the absorption filter for 705 nm (band of 690-730 nm) Pass filter).
  • T lymphocytes can be identified based on the fluorescence in the sentinel lymph node, and the detection accuracy of T lymphocytes can be improved.
  • FIG. 28 shows the detection result of the sentinel lymph node. Specifically, the weight of each of the 6 pigs, whether fluorescence was detected at the injection site, whether fluorescence was detected in the lymphatic vessels, the number of sentinel lymph nodes, until the sentinel lymph nodes were detected Show time. Sentinel lymph nodes could be detected within 10 minutes in all experimental examples.
  • the site where the fluorescence intensity is high in the sentinel lymph node that is, the site where the quantum dots are localized is the imported lymphatic inflow portion. Since the lymph node metastasis of cancer cells is thought to start near the inflow of the imported lymphatic vessel, the metastasis start site in the sentinel lymph node coincides with the localization site of the quantum dot in the sentinel lymph node. Therefore, by detecting the distribution of quantum dots in the sentinel lymph node with high sensitivity and high accuracy, it is possible to accurately detect a site with a high risk of cancer metastasis.
  • quantum dots be used as tracers for sentinel lymph nodes, but also can be used for structural analysis of sentinel lymph nodes using a single-molecule fluorescence microscope 40.
  • the sentinel lymph node can be regarded as a more precise microscopic area. .
  • the fluorescence intensity is measured for each of a plurality of sites in the sentinel lymph node that has been removed in a state where quantum dots are injected, and the measurement is performed.
  • one or a plurality of sites are detected as the import lymphatic inflow portion in order from the highest fluorescence intensity. Therefore, since the site
  • the fluorescence intensity can be measured with high accuracy for each of the plurality of parts.
  • the imported lymphatic vessel inflow portion detection method and specific cell identification method according to the present invention may be used in the medical field for detecting a site where cancer cells may exist.

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Abstract

　センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出する。　生体内の癌付近に量子ドットを注入し、蛍光によりセンチネルリンパ節の位置を特定し、センチネルリンパ節を摘出する。量子ドットが注入された状態で摘出されたセンチネルリンパ節に対して、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡を用いた精密蛍光測定によって構造解析を行う。具体的には、センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する。

Description

輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法
　本発明は、輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法に関する。
　従来、癌の切除手術においては、病変部だけでなく、癌の転移が疑われるリンパ節を切除する場合が多い。近年では、リンパ節の切除を最小限にとどめるために、センチネルリンパ節生検が行われている。
　センチネルリンパ節（Sentinel Lymph Node；ＳＬＮ）は、各臓器から最初にリンパ流を受けるリンパ節と定義されており、癌の手術においては、センチネルリンパ節に癌の転移がなければ定型的リンパ節郭清が不要である、というセンチネルリンパ節理論が広く認容されている。センチネルリンパ節生検は、無駄な手術侵襲を減らすことを可能とし、患者の病気の状態に応じて細かく手術法を選択する、オーダーメイド医療の確立に寄与するものである。
　センチネルリンパ節生検を行ううえでは、手術中における真のセンチネルリンパ節の検出感度を向上させること、及び、摘出したセンチネルリンパ節の内部に癌の転移があるか否かの診断精度を向上させることが重要な課題となる。
　現在、手術中にセンチネルリンパ節を同定するトレーサーとして臨床で用いられている材料は、色素（パテントブルー・墨汁等）やラジオアイソトープ（ＲＩ）コロイド（99mＴｃ等）であるが、両者には欠点も多い。例えば、色素の場合、（１）生体内のリンパ節に非特異的に炭粉沈着等の汚れがある場合、センチネルリンパ節かどうかの評価が不能となる、（２）リンパ節を郭清する領域が色素で汚染され、手術の邪魔になる、（３）色素に対するアレルギー（アナフィラキシー反応）がある、等の問題がある。一方、ＲＩコロイドの場合、（１）コロイドの粒径が数百ｎｍ～数十μｍであり、色素（数ｎｍ）や量子ドット（数十ｎｍ）に比べ大きく、リンパ系への移行が悪いため、リアルタイムにリンパ流の観察を行うことができない、（２）解像度が低いため、センチネルリンパ節がコロイド局注部の近傍にある場合見逃すおそれがある（shine-through現象）、（３）使用に関して規制があり、適応施設の拡大が難しい、等といった問題がある。
　また、乳癌・皮膚癌といった比較的単純なリンパ流を有する部位の癌に比べて、リンパ流が多方向で複雑な消化器癌では、リアルタイムのリンパ流の観察が困難なため、センチネルリンパ節生検法の適用が遅れている。
　以上の理由から、検出感度に優れた新たなトレーサーの開発が期待されており、蛍光色素を用いたセンチネルリンパ節の検出方法が提案されている（特許文献１、特許文献２参照）。特に、量子ドット（Quantum Dots；ＱＤｓ）は、優れた検出感度を有するセンチネルリンパ節のトレーサーになり得る可能性があると考えられている。
　センチネルリンパ節生検における最大の目的は、手術中にセンチネルリンパ節に転移癌細胞が存在するか否かを診断することにある。現在センチネルリンパ節の癌転移の有無の診断は、摘出組織を薄切し、ヘマトキシリン・エオジン染色等で染めた後、顕微鏡で行われているが、摘出したリンパ節組織のごく一部しか観察できないため、微小な転移は見逃してしまう危険がある。例えば、径５ｍｍ程度のリンパ節の場合、１～３断面を検査したとして全体の0.01％に過ぎない。
　癌の有無の診断能力の向上を図るために、（１）数種類の免疫染色を組み合わせた多重染色法、（２）リンパ節組織全体からＲＮＡを抽出しＲＴ－ＰＣＲ（Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction）を行い、組織内部の癌細胞を検出する手法等が試みられている。しかし、多重染色法では、通常染色法と同様に組織スライドを作成する段階で転移細胞を見逃すおそれがある。また、ＲＴ－ＰＣＲ法では、癌細胞の検出能力は高いが、検査が煩雑で時間がかかり手術中の迅速診断には適さない、組織全体の平均化された情報しか得られない、確実に微小な転移を見つけるためには組織全てを検査する必要があり、病理標本が作れなくなってしまう、等といった欠点がある。
　したがって、センチネルリンパ節生検における病理診断において、センチネルリンパ節内部の癌転移部位を高感度・高精度に特定する手法の開発が必要と考えられる。
　非特許文献１では、マウス耳介のメラノーマ腫瘍が所属リンパ節に転移する様子が報告されており、それによると、癌のリンパ節転移は輸入リンパ管の流入部付近より生じるとされている。
特開２００６－１４８６８号公報 特開２００４－２６９４３９号公報
T.Hoshida、他８名、「Imaging Steps of Lymphatic Metastasis Reveals That Vascular Endothelial Growth Factor-C Increases Metastasis by Increasing Delivery of Cancer Cells to Lymph Nodes:Therapeutic Implications」、Cancer Research 2006、（米国）、Waverly Press、2006年8月15日、第66巻、第16号、p.8065-8075
　しかし、従来の技術では、量子ドットをセンチネルリンパ節のトレーサーとして用いた場合でも、摘出したセンチネルリンパ節の評価においては、その組織が光っているか否かの定性的な観察のみにとどまっていた。これは蛍光計測技術の精度の低さに起因していると思われる。
　本発明は上記の従来技術における問題に鑑みてなされたものであって、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することを課題とする。
　上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する、輸入リンパ管流入部検出方法である。
　請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡により取得された画像を画像解析することにより、蛍光強度を測定する。
　請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記量子ドットは、特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含み、前記センチネルリンパ節内の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する。
　請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記特定細胞は、Ｔリンパ球である。
　請求項５に記載の発明は、請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記特定細胞は、癌細胞である。
　請求項６に記載の発明は、特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含む量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出し、前記検出された輸入リンパ管流入部の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する、特定細胞同定方法である。
　請求項１に記載の発明によれば、センチネルリンパ節内の蛍光強度が高い部位を輸入リンパ管流入部として検出するので、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することができる。
　請求項２に記載の発明によれば、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡により取得された画像を画像解析することにより、複数の部位のそれぞれについて精度よく蛍光強度を測定することができる。
　請求項３に記載の発明によれば、特定細胞の検出精度を向上させることができる。
　請求項４に記載の発明によれば、Ｔリンパ球の検出精度を向上させることができる。
　請求項５に記載の発明によれば、癌細胞の検出精度を向上させることができる。
　請求項６に記載の発明によれば、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することができるとともに、特定細胞の検出精度を向上させることができる。
蛍光計測システムの構成図である。 内視鏡型蛍光計測装置の外観構成図である。 顕微鏡システムの構成図である。 実験の流れを説明するための図である。 量子ドット濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。 手術野での内視鏡型蛍光計測装置による計測の様子を撮影した撮影画像である。 内視鏡型蛍光計測装置で取得した手術野情報を画像解析装置で解析して得られた蛍光画像である。 胃体部の小弯側後壁の撮影画像である。 胃体部の小弯側後壁を内視鏡型蛍光計測装置で撮影し画像解析装置で解析して得られた蛍光画像である。 量子ドット注入後３分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。 量子ドット注入後１０分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。 量子ドット注入後３０分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。 量子ドット注入後６０分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。 輸入リンパ管の模式図である。 量子ドット注入後３分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。 量子ドット注入後１０分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。 量子ドット注入後３０分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。 量子ドット注入後６０分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。 センチネルリンパ節の模式図である。 輸入リンパ管における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。 センチネルリンパ節における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。 センチネルリンパ節の撮影画像である。 センチネルリンパ節の蛍光画像である。 センチネルリンパ節の一部を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 センチネルリンパ節以外のリンパ節の撮影画像である。 センチネルリンパ節以外のリンパ節の蛍光画像である。 センチネルリンパ節以外のリンパ節の一部を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節の内部の蛍光強度を示すグラフである。 センチネルリンパ節に対して励起レーザー光を照射直後（０分）の蛍光画像である。 センチネルリンパ節に対して励起レーザー光を３０分照射した後の蛍光画像である。 センチネルリンパ節に対して励起レーザー光を６０分照射した後の蛍光画像である。 センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して励起レーザー光を照射直後（０分）の蛍光画像である。 センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して励起レーザー光を３０分照射した後の蛍光画像である。 センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して励起レーザー光を６０分照射した後の蛍光画像である。 センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節の標本群における励起レーザー光の照射による蛍光の褪色を示すグラフである。 図１７のグラフを相対値で表現したグラフである。 センチネルリンパ節サンプル内の量子ドット１粒子の蛍光シグナル強度の経時変化を示すグラフである。 センチネルリンパ節の撮影画像である。 センチネルリンパ節の蛍光画像である。 センチネルリンパ節内の解析部位Ａ～Ｆの位置を示す図である。 解析部位Ａの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 解析部位Ｂの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 解析部位Ｃの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 解析部位Ｄの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 解析部位Ｅの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 解析部位Ｆの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。 解析部位Ａ～Ｆにおける蛍光強度の定量解析結果である。 解析部位Ａ～Ｆにおける蛍光強度相対値を示すグラフである。 センチネルリンパ節の組織をヘマトキシリン・エオジン染色した標本の顕微鏡画像である。 図２５Ａの一部を拡大した画像である。 センチネルリンパ節の組織をリンパ節内のＴ細胞に特異的なＣＤ３抗体をＤＡＢで染色した免疫染色顕微鏡画像である。 図２６Ａの一部を拡大した画像である。 センチネルリンパ節の撮影画像である。 センチネルリンパ節の蛍光画像である。 センチネルリンパ節の免疫染色画像である。 センチネルリンパ節の免疫染色画像である。 Ｔリンパ球が多く存在する領域の組織を605ｎｍ用の吸収フィルタを用いて撮影した蛍光画像である。 Ｔリンパ球が多く存在する領域の組織を705ｎｍ用の吸収フィルタを用いて撮影した蛍光画像である。 センチネルリンパ節の検出結果である。
［装置構成］
　以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
　まず、装置の構成について説明する。
　図１に、蛍光計測システム１の構成を示す。図１に示すように、蛍光計測システム１は、内視鏡型蛍光計測装置１０、画像解析装置２０、レーザー光励起装置３０を備える。蛍光計測システム１は、手術中の術野での蛍光解析を行うものであり、トレーサーとして量子ドットが注入された生体からセンチネルリンパ節の位置を特定する際に用いられる。
　量子ドットは、径15-20ナノメートル（ｎｍ）の半導体のクラスターであり、その粒径に応じて様々な蛍光を放出する特性を持った粒子である。量子ドットは、その中心であるカドミウム・セレンのコア、コアを覆うシェル、ポリマーコーティング等により構成される。量子ドットをセンチネルリンパ節のトレーサーとして用いる場合、以下のような特徴がある。
（１）蛍光強度が強く褪色し難いため長時間の観察が可能である。
（２）様々な放出波長の粒子があり可視領域よりも長波長の蛍光粒子を使用した場合、肉眼的に術野を汚すことはない。
（３）蛍光強度が強く、リアルタイムでリンパ流の方向を同定可能である。
（４）様々な放出波長の粒子を同一波長の励起光で検出することができ、放出波長により識別が可能である。
（５）ＲＩを使用する際のような規制はほとんどない。
（６）粒子の数と蛍光強度が比例関係にあり、蛍光強度の定量化が可能である。
（７）病理組織切片に作成される段階でも蛍光が失活せず、病理評価に応用できる。
　内視鏡型蛍光計測装置１０は、内視鏡手術用の高感度蛍光計測装置である。図２に、内視鏡型蛍光計測装置１０の外観構成を示す。内視鏡型蛍光計測装置１０は、ＥＭＣＣＤカメラ１１、レンズ１２、蛍光フィルタ１３、ライトガイド１４、内視鏡部１５、ハンドル１６等を備えて構成される。
　内視鏡部１５は、レーザー光励起装置３０により発せられた励起光を生体に対して照射するとともに、生体からの蛍光を受ける機能部である。ＥＭＣＣＤカメラ１１は、内視鏡手術用の高感度のＣＣＤカメラであって、内視鏡部１５、蛍光フィルタ１３及びレンズ１２を介して導かれた蛍光を受光し、画像データを画像解析装置２０に出力する。
　画像解析装置２０は、図１に示すように、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、ＲＯＭ（Read Only Memory）２２、ＲＡＭ（Random Access Memory）２３、通信部２４、操作部２５、表示部２６、記憶部２７等を備えて構成され、各部はバス２８により接続されている。
　ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２に記憶されている各種処理プログラムを読み出して、ＲＡＭ２３内に形成されたワークエリアに展開し、該プログラムに従って画像解析装置２０の各部を制御する。
　ＲＯＭ２２は、ＣＰＵ２１により実行されるシステムプログラム、各種処理を行うための各種プログラム、及びこれらのプログラムの実行に必要なデータ等を記憶する。
　ＲＡＭ２３は、ＣＰＵ２１により実行制御される各種処理において、ＲＯＭ２２から読み出された各種処理プログラム、入力若しくは出力データ、及びパラメータ等を一時的に格納する。
　通信部２４は、内視鏡型蛍光計測装置１０から蛍光画像の画像データを受信する。
　操作部２５は、カーソルキー、文字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードに対するキー操作やマウス操作により入力された指示信号をＣＰＵ２１に出力する。
　表示部２６は、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニタにより構成され、ＣＰＵ２１から入力される表示信号の指示に従って、観察対象画像や操作画面等を表示する。
　記憶部２７は、ハードディスクや不揮発性の半導体メモリ等により構成され、各種データを記憶する。例えば、記憶部２７は、内視鏡型蛍光計測装置１０から受信した画像データのファイル（ＡＶＩファイル）等を記憶する。
　ＣＰＵ２１は、内視鏡型蛍光計測装置１０により取得された蛍光画像の画像データに基づいて観察対象画像を表示部２６に表示させるとともに、当該画像データを画像解析して蛍光強度を算出する。
　レーザー光励起装置３０は、生体に照射するための励起レーザー光（632.8ｎｍ）を発する装置である。
　図３に、顕微鏡システム２の構成を示す。図３に示すように、顕微鏡システム２は、１分子蛍光顕微鏡４０、画像解析装置５０を備える。顕微鏡システム２は、生体から摘出された組織について、より精密に蛍光解析を行うものであり、センチネルリンパ節内の構造を解析する際に用いられる。
　１分子蛍光顕微鏡４０は、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡であり、１分子（蛍光１粒子）レベルでの観察が可能な共焦点蛍光顕微鏡装置である。１分子蛍光顕微鏡４０は、光源により励起レーザー光（532ｎｍ）を照射し、検査対象組織からの蛍光画像を画像データとして画像解析装置５０に出力する。
　画像解析装置５０は、図３に示すように、ＣＰＵ５１、ＲＯＭ５２、ＲＡＭ５３、通信部５４、操作部５５、表示部５６、記憶部５７等を備えて構成され、各部はバス５８により接続されている。
　ＣＰＵ５１は、ＲＯＭ５２に記憶されている各種処理プログラムを読み出して、ＲＡＭ５３内に形成されたワークエリアに展開し、該プログラムに従って画像解析装置５０の各部を制御する。
　ＲＯＭ５２は、ＣＰＵ５１により実行されるシステムプログラム、各種処理を行うための各種プログラム、及びこれらのプログラムの実行に必要なデータ等を記憶する。
　ＲＡＭ５３は、ＣＰＵ５１により実行制御される各種処理において、ＲＯＭ５２から読み出された各種処理プログラム、入力若しくは出力データ、及びパラメータ等を一時的に格納する。
　通信部５４は、１分子蛍光顕微鏡４０から画像データを受信する。
　操作部５５は、カーソルキー、文字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードに対するキー操作やマウス操作により入力された指示信号をＣＰＵ５１に出力する。
　表示部５６は、ＬＣＤ等のモニタにより構成され、ＣＰＵ５１から入力される表示信号の指示に従って、観察対象画像や操作画面等を表示する。
　記憶部５７は、ハードディスクや不揮発性の半導体メモリ等により構成され、各種データを記憶する。例えば、記憶部５７は、１分子蛍光顕微鏡４０から受信した画像データのファイル（ＡＶＩファイル）等を記憶する。
　ＣＰＵ５１は、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された蛍光画像の画像データに基づいて観察対象画像を表示部５６に表示させるとともに、当該画像データを画像解析して蛍光強度を算出する。
［センチネルリンパ節生検］
　次に、センチネルリンパ節生検について説明する。
　生体から癌を切除する手術が行われる際に、生体内の癌の近くにセンチネルリンパ節のトレーサーとして量子ドットが注入される。量子ドットはリンパ管を流れてセンチネルリンパ節に到達する。蛍光計測システム１により、術野に対して励起光が照射され、蛍光に基づいてセンチネルリンパ節が同定される。そして、生体からセンチネルリンパ節が摘出される。
　ここで、量子ドットが注入された状態で摘出されたセンチネルリンパ節に対し、顕微鏡システム２により、より精密な蛍光解析が行われる。具体的には、センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度が測定され、測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位が輸入リンパ管流入部として検出される。蛍光強度は、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された画像を、画像解析装置５０において画像解析することにより、測定される。なお、輸入リンパ管流入部を検出する際に、センチネルリンパ節内の複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に予め定められた個数の部位を輸入リンパ管流入部として検出することとしてもよいし、複数の部位のうち蛍光強度が予め定められた基準値以上の部位を輸入リンパ管流入部として検出することとしてもよい。本発明は、センチネルリンパ節の構造解析に利用されるものである。
　検出された輸入リンパ管流入部の組織が採取され、癌細胞があるか否かを診断する病理組織検査が行われる。輸入リンパ管流入部に癌の転移がない場合には、それ以上リンパ節を切除する必要はない。
［実験の流れ］
　次に、図４を参照して、実験の流れを説明する。図４は、生体として大型動物モデルの代表であるブタを用い、胃癌を想定した場合の例である。ブタは、２～３カ月齢のランドレース・ヨークシャー交雑種の雄性去勢ブタ（平均体重26.7ｋｇ）を使用した。
　まず、ブタに全身麻酔をかけ、胃内視鏡６０の局注針を用い、ブタの胃体下部小弯側後壁の粘膜下層に２μＭの量子ドットを500μＬ局注した。
　量子ドットとして、Invitrogen（登録商標）社で販売されているQdot（登録商標）705を用いた。粒子の径は約20ｎｍであり、放出波長は702（700-715）ｎｍである。近赤外領域の放出波長の蛍光粒子を選択した理由は、生体の自家蛍光との干渉が少ない点を考慮したためである。
　量子ドットの局注後、胃とそれに続くリンパ網での量子ドットの蛍光の拡がりを内視鏡型蛍光計測装置１０を用いてリアルタイムに観察した。蛍光によりセンチネルリンパ節の位置を特定し、蛍光をガイドにセンチネルリンパ節を摘出した。
　次に、摘出されたセンチネルリンパ節について、１分子蛍光顕微鏡４０を用いた精密蛍光測定によって構造解析を行った。
［実験結果］
　＜量子ドット濃度と蛍光強度の関係＞
　図５に、量子ドットの濃度（ＱＤｓ濃度）と蛍光強度の関係を示す。図５に示すグラフは、様々な濃度の量子ドットをブタの胃壁内に注入し、内視鏡型蛍光計測装置１０を用いて蛍光強度を測定した結果である。横軸は量子ドット濃度（ｎＭ）、縦軸はgray-value／mm2である。すなわち、画像解析装置２０では、内視鏡型蛍光計測装置１０により取得された蛍光画像の濃淡により、蛍光強度を算出している。
　図５に示すように、量子ドットの濃度と蛍光強度とは比例関係にあることが確認された。したがって、内視鏡型蛍光計測装置１０により蛍光強度の定量的解析が可能であることが分かった。
　＜手術野での蛍光検出＞
　図６Ａは、手術野での内視鏡型蛍光計測装置１０による計測の様子を撮影した撮影画像である。内視鏡型蛍光計測装置１０の内視鏡部１５の先端から生体の観察対象部位に対して励起光が照射される。注射部７０は、量子ドットが注入された位置である。
　図６Ｂは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得した手術野情報を画像解析装置２０で解析して得られた蛍光画像である。図６Ａの撮影画像の注射部７０に対応する位置である注射部７０ａは、蛍光を示している。すなわち、量子ドットが注入された位置において、蛍光が検出された。
　＜量子ドットの流入観察＞
　図７Ａは、胃体部の小弯側後壁の撮影画像である。胃の内側の注射部８０から注入された量子ドットは、センチネルリンパ節８１に流れ込み、センチネルリンパ節以外のリンパ節８２には流れ込まない。
　図７Ｂは、胃体部の小弯側後壁を内視鏡型蛍光計測装置１０で撮影し画像解析装置２０で解析して得られた蛍光画像である。広範囲の視野においても、注射部８０ａとセンチネルリンパ節８１ａの部分で蛍光シグナルが認識可能であった。なお、センチネルリンパ節以外のリンパ節８２ａについては、蛍光シグナルを示さなかった。
　＜蛍光シグナル強度の時間変化＞
　図８Ａ～図８Ｄは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得した輸入リンパ管（図７Ｂに示す輸入リンパ管８３ａ）の蛍光シグナルの経時変化を示す蛍光画像である。輸入リンパ管は、リンパ節にリンパ液を注ぐ部分のリンパ管である。図８Ａは量子ドット注入後３分経過時の画像であり、図８Ｂは量子ドット注入後１０分経過時の画像であり、図８Ｃは量子ドット注入後３０分経過時の画像であり、図８Ｄは量子ドット注入後６０分経過時の画像である。図８Ｅは、図８Ａ～図８Ｄに対応する輸入リンパ管の模式図である。
　図９Ａ～図９Ｄは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得したセンチネルリンパ節（図７Ｂに示すセンチネルリンパ節８１ａ）の蛍光シグナルの経時変化を示す蛍光画像である。図９Ａは量子ドット注入後３分経過時の画像であり、図９Ｂは量子ドット注入後１０分経過時の画像であり、図９Ｃは量子ドット注入後３０分経過時の画像であり、図９Ｄは量子ドット注入後６０分経過時の画像である。図９Ｅは、図９Ａ～図９Ｄに対応するセンチネルリンパ節の模式図である。
　図８Ａ～図８Ｄに示すように、輸入リンパ管では、その蛍光シグナルの強さはほとんど変化しなかった。また、図９Ａ～図９Ｄに示すように、センチネルリンパ節では、時間とともにその蛍光シグナルが強くなった。蛍光シグナルがリンパ管やリンパ節の周辺に漏れ出ることはなく、センチネルリンパ節に続くリンパ節（センチネルリンパ節以外のリンパ節）に蛍光が認められることはなかった。
　図１０は、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得された輸入リンパ管における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。図１１は、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得されたセンチネルリンパ節における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。図１０及び図１１において、横軸は時間（分）、縦軸はgray-value／mm2である。輸入リンパ管では、時間とともに蛍光強度が変化せず、センチネルリンパ節では、時間とともに蛍光強度が増加しているデータが得られた。
　＜摘出リンパ節の蛍光観察＞
　図１２Ａは、摘出後のセンチネルリンパ節の撮影画像である。図１２Ｂは、このセンチネルリンパ節を内視鏡型蛍光計測装置１０で撮影して得られた蛍光画像である。図１２Ｃは、図１２Ｂに示す領域９０の組織を１分子蛍光顕微鏡４０で撮影して得られた組織固定後の蛍光画像である。センチネルリンパ節では、摘出後も蛍光が認められ、１分子蛍光顕微鏡４０における観察ではリンパ節組織内部に量子ドットに特有の明滅する蛍光シグナルが認められた。
　図１３Ａは、摘出後のセンチネルリンパ節以外のリンパ節の撮影画像である。図１３Ｂは、図１３Ａに示すセンチネルリンパ節以外のリンパ節を内視鏡型蛍光計測装置１０で撮影して得られた蛍光画像である。図１３Ｃは、図１３Ｂに示す領域９１の組織を１分子蛍光顕微鏡４０で撮影して得られた組織固定後の蛍光画像である。センチネルリンパ節以外のリンパ節では、内視鏡型蛍光計測装置１０の観察においても、１分子蛍光顕微鏡４０の観察においても、蛍光シグナルが認められなかった。
　図１４に、内視鏡型蛍光計測装置１０及び画像解析装置２０により定量解析されたセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）、センチネルリンパ節以外のリンパ節（Ｎｏｎ－ＳＬＮ）の内部の蛍光強度（gray-value／mm2）を示す。蛍光強度はセンチネルリンパ節において明らかに高く、センチネルリンパ節に量子ドットが存在することが示された。センチネルリンパ節以外のリンパ節において計測された蛍光シグナルは組織の自家蛍光に由来すると思われる。
　＜自家蛍光の影響＞
　組織サンプル内の量子ドットの蛍光の定量解析を正確に行うためには、組織の自家蛍光の影響が問題になる。発明者等が使用した近赤外領域は生体の自家蛍光が比較的少ない波長域ではあるが、それを極力低く抑えるために１分子蛍光顕微鏡４０の励起レーザー光(波長：532nm、照射面出力：80pW/μm2)による組織の自家蛍光の褪色を検討した。
　図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃは、センチネルリンパ節に対して、１分子蛍光顕微鏡４０で同視野に励起レーザー光を照射し続けた際の照射直後（０分）、３０分経過後、６０分経過後のそれぞれの時点での蛍光シグナルを示す蛍光画像である。
　同様に、図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃは、センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して、１分子蛍光顕微鏡４０で同視野に励起レーザー光を照射し続けた際の照射直後（０分）、３０分経過後、６０分経過後のそれぞれの時点での蛍光シグナルを示す蛍光画像である。
　図１５Ａ～図１５Ｃ、図１６Ａ～図１６Ｃに示すように、リンパ節組織の自家蛍光は時間とともに褪色したが、センチネルリンパ節組織内部の量子ドットの蛍光シグナル（明滅する粒子の信号）は６０分の励起レーザー光の照射後も失活しなかった。
　図１７は、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）、センチネルリンパ節以外のリンパ節（Ｎｏｎ－ＳＬＮ）の標本群における１分子蛍光顕微鏡４０の励起レーザー光の照射による蛍光の褪色を定量評価にて示したグラフである。横軸は時間（分）、縦軸はgray-value／μm2である。すなわち、画像解析装置５０では、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された蛍光画像の濃淡により、蛍光強度を算出している。
　図１８は、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）、センチネルリンパ節以外のリンパ節（Ｎｏｎ－ＳＬＮ）のレーザー光照射による蛍光の褪色について、図１７のグラフを相対値で表現したものである。センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節のそれぞれについて、０分におけるgray-valueを１としている。図１８に示すように、センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節ともに励起レーザー光の照射により蛍光が褪色している結果が得られた。
　次に、センチネルリンパ節サンプル内の量子ドット１粒子の輝点に注目して励起レーザー光照射による蛍光シグナル強度の変化を解析した。図１９は、センチネルリンパ節サンプル内の量子ドット１粒子の蛍光シグナル強度の経時変化を示すグラフである。図１９は、サンプル数n=20の量子ドットについて、量子ドット１粒子の輝点それぞれを中心とした周囲576×576nmのエリアで蛍光の解析を行った結果（１粒子当たりのgray-value、及び、０分におけるgray-valueを１とした場合の相対値）を示している。この結果、量子ドットの蛍光シグナルは１５分まで増加し、その後６０分まで保たれた。このことから、図１７及び図１８で得られたリンパ節サンプルの蛍光シグナルの減少はリンパ節組織の自家蛍光に由来するものであり、量子ドットの蛍光は６０分の励起レーザー光の照射では褪色しないことが示された。
　以上の結果から、センチネルリンパ節以外のリンパ節の蛍光（組織の自家蛍光）は、励起レーザー光の照射により無視できるレベル（３０分で16％、６０分で10％）まで軽減されることが示された。一方、センチネルリンパ節では、内部の自家蛍光は軽減されたが、量子ドットの蛍光は１時間保たれることが示された。このデータより、組織切片を１分子蛍光顕微鏡４０で観察する際に、３０分程度の励起レーザー光の照射を加えることで、組織の自家蛍光の大部分を褪色させ、正確な量子ドットの蛍光強度を定量解析可能となることがわかった。
　＜センチネルリンパ節内部における量子ドットの不均一分布（heterogeneity）＞
　センチネルリンパ節において蛍光シグナルは不均一であり、センチネルリンパ節内部の量子ドットの分布に由来するものと考えられる。
　図２０Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の撮影画像であり、図２０Ｂは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得されたセンチネルリンパ節の蛍光画像である。
　センチネルリンパ節の標本の各部位における蛍光強度（量子ドットの存在個数に比例）を１分子蛍光顕微鏡４０で解析した。図２１に、センチネルリンパ節内の解析部位Ａ～Ｆの位置を示す。蛍光の定量評価を正確に行うため、組織の自家蛍光を低減すべく、1分子蛍光顕微鏡４０にて３０分励起レーザー光を照射した後、観察を行った。
　図２２Ａ～図２２Ｆに、解析部位Ａ～Ｆのそれぞれの組織を１分子蛍光顕微鏡４０で撮影して得られた蛍光画像を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂに示すように、解析部位Ａ及びＢには、量子ドットが多数存在していた。
　図２３に、画像解析装置５０において画像解析することにより、解析部位Ａ～Ｆにおける蛍光強度を定量解析した結果を示す。蛍光強度相対値は、解析部位Ｆの蛍光強度を「１」とした場合の、解析部位Ａ～Ｆにおける蛍光強度の相対値である。サンプル数：ｎ＝１０とは、一つの標本スライド内で解析部位Ａ～Ｆの領域の中から１０か所ずつ顕微鏡観察したという意味である。
　図２４は、解析部位Ａ～Ｆにおける蛍光強度相対値をグラフ化したものである。図２３と同様、解析部位Ｆの蛍光強度を「１」としている。蛍光の定量評価により、センチネルリンパ節内の各部位における量子ドットの存在個数を精密に評価することが可能となった。
　図２５Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の組織をヘマトキシリン・エオジン染色した標本の顕微鏡画像である。図２５Ａの領域１０２は、図２０Ａの領域１００及び図２０Ｂの領域１０１に対応する部分である。図２５Ｂは、図２５Ａの領域１０２の拡大画像である。染色により、輸入リンパ管流入部１０３，１０４の位置が確認できる。
　図２６Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の組織をリンパ節内のＴ細胞に特異的なＣＤ３抗体をＤＡＢで染色した免疫染色顕微鏡画像である。図２６Ａの領域１０５は、図２０Ａの領域１００及び図２０Ｂの領域１０１に対応する部分である。図２６Ｂは、図２６Ａの領域１０５の拡大画像である。図２６Ｂにおいて、免疫染色で染まらない数個のリンパ濾胞に囲まれた部分が輸入リンパ管流入部１０６，１０７である。
　図２１、図２２Ａ～図２２Ｆ、図２３及び図２４に示した蛍光解析結果と、図２５Ａ、図２５Ｂ、図２６Ａ及び図２６Ｂに示した顕微鏡解析結果とを合わせて考えると、センチネルリンパ節において高い蛍光強度を示した部位（解析部位Ａ及びＢ）は、輸入リンパ管流入部の近傍に一致していた。
　すなわち、量子ドットの注射部からのリンパ流を受ける輸入リンパ管流入部付近には量子ドットが多数存在していた。一方、同じリンパ節内でも輸入リンパ管流入部以外のところでは解析部位Ａ、Ｂほどの高い蛍光強度を示さなかった。また、摘出されたセンチネルリンパ節において、輸入リンパ管は、解析部位Ａ、Ｂの他にも存在したが、蛍光を示していなかった。他の輸入リンパ管は、量子ドットの注射部以外の胃壁からのリンパ流を受けるリンパ管（リンパ節内の別のセグメント）であった。
　以上より、摘出したセンチネルリンパ節において、センチネルリンパ節のトレーサーとして用いた量子ドットのセンチネルリンパ節内での分布を精細に定量解析することにより、センチネルリンパ節での輸入リンパ管流入部を検出することが可能となった。輸入リンパ管流入部付近は癌転移の危険度が高い部位であり、この蛍光解析法で得られたデータを指標に重点的に病理組織検査を行うことにより、センチネルリンパ節における転移癌細胞の検出能が飛躍的に向上することが期待される。
　＜抗体結合量子ドット＞
　次に、センチネルリンパ節のトレーサーとして量子ドットを単独で用いた場合と、ある細胞に対して特異的な抗体が結合された抗体結合量子ドットを同時に用いた場合とで、量子ドットのセンチネルリンパ節内での局在の違い（トレーサーとしての挙動の違い）について観察した。
　センチネルリンパ節のトレーサーとして、量子ドット（蛍光波長705ｎｍ）だけでなく、リンパ節内に存在する細胞（ここではＴリンパ球）に特異的なＣＤ３抗体が結合された量子ドット（蛍光波長605ｎｍ）を同時に使用し、その挙動の違いを確認した。ＣＤ３抗体が結合された量子ドット（ＣＤ３ａｂ－ＱＤ）と量子ドットは蛍光波長が異なるため、同波長励起（532ｎｍ）であっても顕微鏡の吸収フィルタを変えるだけでそれぞれの蛍光波長を分けて評価することが可能である。
　結果として、ＣＤ３ａｂ－ＱＤは、量子ドット単独の場合と同様にセンチネルリンパ節の輸入リンパ管流入部に局在したのに加え、抗体がターゲットとしているＴ細胞周囲にも存在し、細胞の特異的な標識が可能であった。
　図２７Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の撮影画像であり、図２７Ｂは、内視鏡型蛍光計測装置１０により取得された同センチネルリンパ節の蛍光画像である。
　図２７Ｃは、図２７Ａの撮影画像の領域１１０の組織の免疫染色画像であり、図２７Ｄは、図２７Ｃの領域１１１の免疫染色画像である。図２７Ｃ及び図２７Ｄにおいて、染まっている細胞がＴリンパ球である。
　図２７Ｅは、図２７ＤにおいてＴリンパ球が多く存在する領域１１２の組織を１分子蛍光顕微鏡４０及び画像解析装置５０で蛍光解析した蛍光画像であり、605ｎｍ用の吸収フィルタ（565-625ｎｍのバンドパスフィルタ）を用いたものである。Ｔリンパ球に相当する部分１１３，１１４が蛍光を示している。図２７Ｆは、図２７ＤにおいてＴリンパ球が多く存在する領域１１２の組織を、１分子蛍光顕微鏡４０及び画像解析装置５０で蛍光解析した蛍光画像であり、705ｎｍ用の吸収フィルタ（690-730ｎｍのバンドパスフィルタ）を用いたものである。リンパ管流入部付近で量子ドット（705ｎｍ）が一定量存在し得る場所において、Ｔリンパ球周囲にＣＤ３ａｂ－ＱＤ（605ｎｍ）が局在し、Ｔ細胞を標識することが確認された。このように、センチネルリンパ節内の蛍光に基づいてＴリンパ球を同定することができ、Ｔリンパ球の検出精度を向上させることができる。
　この方法を応用して、様々な腫瘍マーカー（抗体）を量子ドットに結合させることにより、センチネルリンパ節内の癌細胞を特異的に標識することが可能であり、発明者等が開発したセンチネルリンパ節の内部構造解析技術を更に発展させることができる。すなわち、癌細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを用いることにより、癌細胞の検出精度を向上させることができる。
　＜センチネルリンパ節検出結果＞
　図２８に、センチネルリンパ節の検出結果を示す。具体的には、６頭のブタのそれぞれの体重、注射部で蛍光が検出されたか否か、リンパ管で蛍光が検出されたか否か、センチネルリンパ節の数、センチネルリンパ節を検出するまでの時間を示す。すべての実験例で１０分以内にセンチネルリンパ節を検出可能であった。
［結論］
　以上の実験結果から、センチネルリンパ節内において、蛍光強度が高い部位、すなわち、量子ドットが局在する部位は、輸入リンパ管流入部であることが確認された。癌細胞のリンパ節転移は輸入リンパ管流入部付近から始まると考えられるため、センチネルリンパ節内の転移開始部位は量子ドットのセンチネルリンパ節内での局在部位と一致する。したがって、センチネルリンパ節内での量子ドットの分布を高感度・高精度に検出することにより、癌転移の危険度の高い部位を精度よく検出することが可能となる。
　発明者等が開発した手法によれば、量子ドットをセンチネルリンパ節のトレーサーとして用いるだけでなく、１分子蛍光顕微鏡４０によるセンチネルリンパ節の構造解析に用いることができる。センチネルリンパ節内の量子ドットの蛍光強度を高精度で定量評価し、蛍光分布を精細に解析することにより、センチネルリンパ節を、より精密なリンパ節内微小区域（microscopic area）として捉えることができる。具体的には、１分子レベルで観察可能な１分子蛍光顕微鏡４０を用いて、量子ドットが注入された状態で摘出されたセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する。したがって、センチネルリンパ節内の蛍光強度が高い部位を輸入リンパ管流入部として検出するので、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することができる。
　また、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された画像を、画像解析装置５０において画像解析することにより、複数の部位のそれぞれについて精度よく蛍光強度を測定することができる。
　このように、センチネルリンパ節における量子ドットの蛍光分布を指標に、精度よく病理診断箇所の狙いを定めることが可能となる。転移危険度の高い部位に対して集中した病理組織診断を行うことで偽陰性（癌の転移の見逃し）が減少し、転移診断能が飛躍的に向上することが期待される。また、病理組織診断に必要な切片数を最小限にすることも可能となる。
　また、センチネルリンパ節生検を行う際に、リンパ節内の細胞に特異的に反応する抗体が結合された量子ドットを用いることにより、標的に対する能動性の付与が可能であることが示された。癌細胞に対して特異的に反応する抗体が結合された量子ドットを用いることにより、最終的にセンチネルリンパ節内の癌細胞の存在をつきとめることができ、癌細胞の検出精度を向上させることができる。
　本発明に係る輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法は、癌細胞が存在し得る部位を検出する医療分野において利用可能性がある。
１　蛍光計測システム
２　顕微鏡システム
１０　内視鏡型蛍光計測装置
１１　ＥＭＣＣＤカメラ
１２　レンズ
１３　蛍光フィルタ
１４　ライトガイド
１５　内視鏡部
１６　ハンドル
２０　画像解析装置
２１　ＣＰＵ
２２　ＲＯＭ
２３　ＲＡＭ
２４　通信部
２５　操作部
２６　表示部
２７　記憶部
２８　バス
３０　レーザー光励起装置
４０　１分子蛍光顕微鏡
５０　画像解析装置
５１　ＣＰＵ
５２　ＲＯＭ
５３　ＲＡＭ
５４　通信部
５５　操作部
５６　表示部
５７　記憶部
５８　バス

Claims (6)

  1. 　量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、
    　前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する、
    　輸入リンパ管流入部検出方法。
  2. 　前記センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡により取得された画像を画像解析することにより、蛍光強度を測定する、
    　請求項１に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
  3. 　前記量子ドットは、特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含み、
    　前記センチネルリンパ節内の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する、
    　請求項１又は２に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
  4. 　前記特定細胞は、Ｔリンパ球である、
    　請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
  5. 　前記特定細胞は、癌細胞である、
    　請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
  6. 　特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含む量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、
    　前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出し、
    　前記検出された輸入リンパ管流入部の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する、
    　特定細胞同定方法。
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