WO2010106209A1 - Use of a compound for the treatment of a lesion produced by postischemic reperfusion - Google Patents

Use of a compound for the treatment of a lesion produced by postischemic reperfusion Download PDF

Info

Publication number
WO2010106209A1
WO2010106209A1 PCT/ES2010/070135 ES2010070135W WO2010106209A1 WO 2010106209 A1 WO2010106209 A1 WO 2010106209A1 ES 2010070135 W ES2010070135 W ES 2010070135W WO 2010106209 A1 WO2010106209 A1 WO 2010106209A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reperfusion
ischemia
compound
medicament
administered
Prior art date
Application number
PCT/ES2010/070135
Other languages
Spanish (es)
French (fr)
Inventor
Ángel MESSEGUER
Anna M. Planas
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Publication of WO2010106209A1 publication Critical patent/WO2010106209A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin

Abstract

The present invention relates to the use of the compound CR-6 (3,4-dihydro-6-hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-1(2H)-benzopyran) or of a derivative compound for the treatment of a lesion produced in given individuals as a consequence of reperfusion following an episode of cerebral ischemia. Such lesion is known as a reperfusion lesion and is associated with specific early signs such as reactive hyperaemia when said postischaemic reperfusion occurs. The present invention demonstrates that not all individuals who have suffered ischemia will respond favourably to treatment with this compound, solely those presenting signs of reperfusion lesion wherein said sign is hyperperfusion or reactive hyperaemia. Hyperperfusion is considered to occur when cerebral blood flow exceeds 20% of the base value, a condition not satisfied in all subjects who have suffered cerebral ischemia/reperfusion.

Description

USO DE UN COMPUESTO PARA EL TRATAMIENTO DE UNA LESIÓN PRODUCIDA POR UNA REPERFUSIÓN POST-ISQUÉMICA USE OF A COMPOUND FOR THE TREATMENT OF AN INJURY CAUSED BY A POST-ISCHEMICAL REPERFUSION
La presente invención se refiere al uso del compuesto CR-6 (3, 4-dihidro-6- hidroxi-7-metoxi-2, 2-dimetil-1(2H)-benzopirano) o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión producida en determinados individuos como consecuencia de Ia reperfusión tras un episodio de isquemia cerebral. Esta lesión se denomina lesión por reperfusión y se asocia a determinados signos precoces como es Ia hiperemia reactiva cuando ocurre Ia reperfusión post- isquémica. En Ia presente invención se demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a responder favorablemente al tratamiento con este compuesto, sino solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión, donde dicho signo es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% del valor basal, condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.The present invention relates to the use of compound CR-6 (3,4-dihydro-6- hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-1 (2H) -benzopyran) or a derivative compound, for the treatment of an injury produced in certain individuals as a result of reperfusion after an episode of cerebral ischemia. This lesion is called reperfusion injury and is associated with certain early signs such as reactive hyperemia when post-ischemic reperfusion occurs. In the present invention it is demonstrated that not all individuals who have suffered ischemia will respond favorably to treatment with this compound, but only those who show signs of reperfusion injury, where said sign is hyperperfusion or reactive hyperemia. Hyperperfusion is considered to occur when cerebral blood flow increases above 20% of baseline, a condition that does not occur in all subjects who have suffered cerebral ischemia / reperfusion.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIORSTATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE
La reperfusión es actualmente Ia mejor estrategia para proteger el cerebro contra el daño isquémico, y Ia trombolisis con rtPA es el único tratamiento aprobado para el ictus isquémico (isquemia) en Europa y Norte América. Estudios preclínicos han demostrado que una oclusión de Ia arteria cerebral media (ACM) seguida de una reperfusión causa menos daño que una oclusión permanente de Ia ACM en ratas (Menezawa et al., 1992. Stroke, 23: 552-559; Rogers et al., 1997. Stroke: 28: 2060-2065). No obstante, Ia reperfusión conlleva algunos riesgos, como una transformación hemorrágica o edema, los cuales podrían ser atribuidos, al menos en parte, al daño o herida por reperfusión (Pan et al., 2007. Neuroradioloqy, 49: 93-102). El daño postisquémico asociado a Ia reperfusión está bien documentado en el corazón (Kutala et al., 2007. Antioxid. Redox Signal, 9: 1193-1206) y en los órganos trasplantados (Jamieson y Friend, 2008. Front. Biosci., 13: 221-235), pero Ia evidencia de que ocurre lesión por reperfusión en el cerebro humano ha resultado más difícil de encontrar. Datos experimentales obtenidos en ciertos modelos de ratas sometidas a Ia oclusión intraluminal de Ia ACM (Aronowski et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow Metab.. 17: 1048-1056) evidencian el daño de Ia reperfusión en el contexto preclínico. Estos estudios evidencian que las manifestaciones del daño por reperfusión pueden depender de varios factores como Ia duración de Ia oclusión de Ia ACM o factores genéticos. Esto sugiere que Ia lesión por reperfusión podría ser una variable en el ictus humano (isquémico o hemorrágico), así como factores genéticos también podrían estar involucrados, al igual que Ia duración y el grado de reducción del flujo pueden diferir en cada paciente. El daño por reperfusión se atribuye a varios efectos de ésta, como el estrés oxidativo (Chan, 1996. Stroke, 27: 1124-1129), el daño de Ia barrera hematoencefálica (BBB) (del Zoppo y Mabuchi, 2003. J. Cereb. Blood Flor. Metab., 23: 879-894), y de Ia acumulación de leucocitos en los vasos sanguíneos (del Zoppo et al., 1991. Stroke, 22: 1276-1283), Ia infiltración al parénquima cerebral (Zhang et al., 1994. J. Neurol. ScL 125: 3-10) de plaquetas (Chong et al., 2001. Acta Pharmacol. Sin.. 22: 679-684), Ia activación del complemento (D' Ambrosio et al., 2001. Mol. Med.. 7: 367-382) y Ia transformación hemorrágica (Pan et al., 2007. Neuroradioloqy, 49: 93-102). La reperfusión puede inducir un incremento en el flujo sanguíneo por encima de niveles básales, como se ha visto en animales (Tasdemiroglu et al., 1992. Am. J. PhvsioL 263:H533-6; Tsuchidate et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow. Metab., 17: 1066-1073). En humanos, Ia hiperperfusión después de una trombolisis se encontró en el 40% de los pacientes (Kidwell et al., 2001. Neurology, 57: 2015- 2021 ).Reperfusion is currently the best strategy to protect the brain against ischemic damage, and thrombolysis with rtPA is the only approved treatment for ischemic stroke (ischemia) in Europe and North America. Preclinical studies have shown that an occlusion of the middle cerebral artery (MCA) followed by reperfusion causes less damage than a permanent occlusion of the MCA in rats (Menezawa et al., 1992. Stroke, 23: 552-559; Rogers et al ., 1997. Stroke: 28: 2060-2065). However, reperfusion carries some risks, such as hemorrhagic transformation or edema, which could be attributed, at least in part, to reperfusion damage or injury (Pan et al., 2007. Neuroradioloqy, 49: 93-102). The postischemic damage associated with reperfusion is well documented in the heart (Kutala et al., 2007. Antioxid. Redox Signal, 9: 1193-1206) and in the organs transplanted (Jamieson and Friend, 2008. Front. Biosci., 13: 221-235), but the evidence that reperfusion injury occurs in the human brain has been more difficult to find. Experimental data obtained in certain models of rats subjected to intraluminal occlusion of the ACM (Aronowski et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow Metab .. 17: 1048-1056) show the damage of reperfusion in the preclinical context. These studies show that the manifestations of reperfusion damage can depend on several factors such as the duration of the occlusion of the MCA or genetic factors. This suggests that reperfusion injury could be a variable in the human stroke (ischemic or hemorrhagic), as well as genetic factors could also be involved, just as the duration and degree of flow reduction may differ in each patient. The reperfusion damage is attributed to several effects of this, such as oxidative stress (Chan, 1996. Stroke, 27: 1124-1129), the damage of the blood brain barrier (BBB) (from Zoppo and Mabuchi, 2003. J. Cereb Blood Flor. Metab., 23: 879-894), and of the accumulation of leukocytes in the blood vessels (from Zoppo et al., 1991. Stroke, 22: 1276-1283), the infiltration to the cerebral parenchyma (Zhang et al., 1994. J. Neurol. ScL 125: 3-10) of platelets (Chong et al., 2001. Acta Pharmacol. Sin .. 22: 679-684), complement activation (D 'Ambrosio et al. , 2001. Mol. Med .. 7: 367-382) and hemorrhagic transformation (Pan et al., 2007. Neuroradioloqy, 49: 93-102). Reperfusion can induce an increase in blood flow above baseline levels, as seen in animals (Tasdemiroglu et al., 1992. Am. J. PhvsioL 263: H533-6; Tsuchidate et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow. Metab., 17: 1066-1073). In humans, hyperperfusion after thrombolysis was found in 40% of patients (Kidwell et al., 2001. Neurology, 57: 2015-2021).
El CR-6 es un derivado sintético de Ia vitamina E con capacidad de secuestrar especies reactivas de nitrógeno. Se ha demostrado previamente que CR-6 tiene efectos beneficiosos contra el daño causado por el estrés oxidativo in vitro (Montoliu et al., 1999. Biochem. Pharmacol.. 58: 255-61 ; Sanvicens et al., 2006. J. Neurochem., 98: 735-747) e in vivo (Miranda et al., 2007. Free Radie. Biol. Med., 43: 1494-1498). Los ensayos clínicos con otros compuestos antioxidantes para el tratamiento de Ia isquemia/reperfusión han fracasado, pese a las evidencias preclínicas de sus beneficios. Por tanto, sería necesario aumentar el número de recuperaciones de pacientes que sufran lesiones como consecuencia de haber padecido una isquemia.CR-6 is a synthetic derivative of vitamin E capable of sequestering reactive nitrogen species. It has been previously shown that CR-6 has beneficial effects against damage caused by oxidative stress in vitro (Montoliu et al., 1999. Biochem. Pharmacol .. 58: 255-61; Sanvicens et al., 2006. J. Neurochem ., 98: 735-747) and in vivo (Miranda et al., 2007. Free Radie. Biol. Med., 43: 1494-1498). Clinical trials with other antioxidant compounds for the treatment of ischemia / reperfusion have failed, despite preclinical evidence of its benefits. Therefore, it would be necessary to increase the number of recoveries of patients suffering from injuries as a result of having suffered an ischemia.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓNEXPLANATION OF THE INVENTION
La presente invención se refiere al uso del compuesto CR-6 (3, 4-dihidro-6- hidroxi-7-metoxi-2, 2-dimetil-1(2H)-benzopirano) o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión producida como consecuencia de una hiperperfusión ocurrida después de una isquemia. En Ia presente invención se demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a responder favorablemente al tratamiento con CR-6 o de un compuesto derivado, sino solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión, donde Ia reperfusión es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% de los valores básales, condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.The present invention relates to the use of compound CR-6 (3,4-dihydro-6- hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-1 (2H) -benzopyran) or a derivative compound, for the treatment of an injury caused as a result of hyperperfusion after an ischemia. In the present invention it is shown that not all individuals who have suffered ischemia will respond favorably to treatment with CR-6 or a derivative compound, but only those that show signs of reperfusion injury, where reperfusion is hyperperfusion or reactive hyperemia . Hyperperfusion is considered to take place when cerebral blood flow increases above 20% of baseline values, a condition that does not occur in all subjects who have suffered cerebral ischemia / reperfusion.
CR-6 o compuestos derivados mejoran Ia eficacia del tratamiento de daños por isquemia con reperfusión consiguiendo un efecto sorprendente en el tratamiento de las lesiones. El significado del término eficacia que se emplea en Ia presente invención se refiere al mayor número de recuperaciones de individuos, tratados con CR-6 o derivados, que sufren lesiones asociadas a hiperemia post-isquémica, respecto del colectivo de pacientes con isquemia con reperfusión que no muestran signos que anticipan que se va a producir lesión por reperfusión. Gracias a este aumento de Ia eficacia se pueden seleccionar antioxidantes derivados de CR-6, no contemplados en el estado de Ia técnica para este uso, para poder curar las lesiones citadas y asimismo, esta selección evitaría el posible abandono del tratamiento de Ia isquemia con reperfusión con estos compuestos por falta de eficacia en el colectivo de pacientes que padezcan isquemia con reperfusiones de cualquier tipo, con hiperemia o sin ella.CR-6 or derived compounds improve the efficacy of the treatment of ischemia damage with reperfusion, achieving a surprising effect in the treatment of lesions. The meaning of the term efficacy used in the present invention refers to the greater number of recoveries of individuals, treated with CR-6 or derivatives, who suffer lesions associated with post-ischemic hyperemia, with respect to the group of patients with reperfusion ischemia who they show no signs that anticipate that reperfusion injury will occur. Thanks to this increase in efficacy, antioxidants derived from CR-6 can be selected, not contemplated in the state of the art for this use, in order to cure the aforementioned lesions and also Selection would avoid the possible abandonment of the treatment of ischemia with reperfusion with these compounds due to lack of efficacy in the group of patients suffering from ischemia with reperfusions of any type, with or without hyperemia.
Es decir, Ia selección de pacientes con las características citadas, es un aspecto determinante en el tratamiento de Ia isquemia con reperfusión mediante CR-6 o sus derivados cuando aparecen signos precoces que anticipan que se va a producir lesión por reperfusión. Un signo precoz es Ia hiperperfusión o hiperemia reactiva cuando ocurre Ia reperfusión post- isquémica. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% del valor basal.That is, the selection of patients with the aforementioned characteristics, is a determining aspect in the treatment of ischemia with reperfusion by CR-6 or its derivatives when early signs appear that anticipate that reperfusion injury will occur. An early sign is hyperperfusion or reactive hyperemia when post-ischemic reperfusion occurs. Hyperperfusion is considered to take place when cerebral blood flow increases above 20% of baseline.
Como se muestra en los ejemplos, se ha ensayado el compuesto CR-6 en ratas sometidas a un episodio de isquemia cerebral por oclusión de Ia arteria cerebral media de 90 minutos de duración, seguido de reperfusión. CR-6 se ha administrado de forma oral dos horas después del comienzo de Ia isquemia. De estos resultados se deriva que es factible trasladar este tratamiento a Ia práctica clínica. Además, se ha valorado el déficit neurológico de los animales, se ha cuantificado el volumen de infarto cerebral, el flujo sanguíneo durante Ia isquemia y en Ia reperfusión, y se ha correlacionado Ia hiperperfusión con un mayor daño cerebral. También se ha determinado el contenido tisular de glutatión, y se ha determinado Ia expresión en el cerebro de proteínas pro- inflamatorias como Ia isoforma inducible de Ia ciclooxigenasa (Cox-2), que se ha localizado primordialmente en neuronas de Ia zona afectada por Ia isquemia.As shown in the examples, compound CR-6 has been tested in rats subjected to an episode of cerebral ischemia due to occlusion of the middle cerebral artery lasting 90 minutes, followed by reperfusion. CR-6 has been administered orally two hours after the onset of ischemia. From these results it is derived that it is feasible to transfer this treatment to clinical practice. In addition, the neurological deficit of the animals has been assessed, the volume of cerebral infarction, blood flow during ischemia and reperfusion have been quantified, and hyperperfusion has been correlated with greater brain damage. The tissue content of glutathione has also been determined, and the expression in the brain of pro-inflammatory proteins has been determined as the inducible isoform of the cyclooxygenase (Cox-2), which has been located primarily in neurons of the area affected by Ia ischemia.
Los resultados muestran que CR-6 atenúa el déficit neurológico, reduce el volumen de infarto cerebral, reduce el consumo de glutatión, así como ciertos procesos inflamatorios, y previene Ia rotura de Ia barrera hematoencefálica, particularmente en los sujetos que desarrollan hiperemia reactiva. En determinados sujetos, Ia reperfusión puede inducir un daño adicional denominado 'lesión por reperfusión' caracterizada por mayor estrés oxidativo, mayor consumo de antioxidantes endógenos (glutatión), mayor rotura de barrera hematoencefálica, mayor activación de ciertas vías de señalización relacionadas con estrés oxidativo y con inflamación, y como consecuencia de todo ello se produce mayor daño cerebral y mayor déficit neurológico. Uno de los marcadores de este tipo de lesión es Ia hiperemia reactiva que se asocia a esta lesión por reperfusión. Por tanto, el tratamiento con CR-6 en Ia isquemia/reperfusión sería adecuado si se detecta hiperemia reactiva u otro signo precoz de lesión por reperfusión. La hiperemia reactiva se detecta con técnicas que permiten valorar Ia perfusión cerebral, por ejemplo, pero sin limitarse, con láser Doppler o técnicas no invasivas de neuroimagen como por ejemplo pero sin limitarse, Ia tomografía computerizada o resonancia magnética. Estas técnicas se aplican de manera rutinaria en Ia práctica clínica.The results show that CR-6 attenuates the neurological deficit, reduces the volume of cerebral infarction, reduces the consumption of glutathione, as well as certain inflammatory processes, and prevents the rupture of the blood-brain barrier, particularly in subjects who develop reactive hyperemia. In certain subjects, reperfusion may induce additional damage called 'reperfusion injury' characterized by increased oxidative stress, increased consumption of endogenous antioxidants (glutathione), greater blood brain barrier rupture, greater activation of certain signaling pathways related to oxidative stress and with inflammation, and as a consequence of all this there is greater brain damage and greater neurological deficit. One of the markers of this type of lesion is the reactive hyperemia that is associated with this reperfusion injury. Therefore, treatment with CR-6 in ischemia / reperfusion would be adequate if reactive hyperemia or another early sign of reperfusion injury is detected. Reactive hyperemia is detected with techniques that allow assessing cerebral perfusion, for example, but not limited to, with Doppler laser or non-invasive neuroimaging techniques such as, but not limited to, computed tomography or magnetic resonance imaging. These techniques are routinely applied in clinical practice.
En este sentido, un aspecto de Ia presente invención es el uso de un compuesto de fórmula general (I), para Ia elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión post- isquémica, donde el flujo sanguíneo de Ia reperfusión es igual o mayor de un 20 % del valor basal,In this sense, one aspect of the present invention is the use of a compound of general formula (I), for the preparation of a medicament for the treatment of an injury caused by a post-ischemic reperfusion, where the blood flow of the reperfusion is equal to or greater than 20% of the baseline value,
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0001
El compuesto tiene Ia fórmula general (I), donde Ri y R4 son iguales o diferentes y se seleccionan de entre H ó un alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono (Ci-C4);The compound has the general formula (I), where Ri and R 4 are the same or different and are selected from H or an alkyl having between 1 and 4 carbon atoms (Ci-C 4 );
R2 y R3 son iguales o diferentes y se seleccionan de entre H, OH, un alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono (CrC4) o un alcoxilo (OR3); Rs se selecciona de entre H ó un grupo alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono (CrC4) yR2 and R3 are the same or different and are selected from H, OH, an alkyl having between 1 and 4 carbon atoms (CrC 4 ) or an alkoxy (OR 3 ); Rs is selected from H or an alkyl group having between 1 and 4 carbon atoms (CrC 4 ) and
Re es un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de entre 1 y 10 átomos de carbono (C1-C10).Re is a linear or branched alkyl group having between 1 and 10 carbon atoms (C1-C10).
El término "alquilo" se refiere, en Ia presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n- hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono.The term "alkyl" refers, in the present invention, to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 10 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, tere-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc. Preferably the alkyl group has between 1 and 4 carbon atoms.
El término "alcoxilo" se refiere en Ia presente invención a un grupo de fórmula -ORa en Ia que Ra es un alquilo (CrC4), por ejemplo, pero sin limitarse a metoxilo, etoxilo ó propoxilo.The term "alkoxy" refers in the present invention to a group of formula -OR a in which R a is an alkyl (CrC 4 ), for example, but not limited to methoxy, ethoxy or propoxy.
Una realización preferida de Ia presente invención es el uso del compuesto de fórmula general (I), o de cualquiera de sus sales, donde Ri es H, R2 es un alcoxilo (0-(Ci)), R3 es un hidroxilo, R4 es H, R5 es un grupo alquilo (CrC4) y Re es un grupo alquilo (CrC4). Una realización aún más preferida es el uso del compuesto de fórmula general (I), donde R5 es un grupo metilo y Re es también un grupo metilo.A preferred embodiment of the present invention is the use of the compound of general formula (I), or of any of its salts, where Ri is H, R2 is an alkoxy (0- (Ci)), R3 is a hydroxyl, R 4 is H, R 5 is an alkyl group (CrC 4 ) and Re is an alkyl group (CrC 4 ). An even more preferred embodiment is the use of the compound of general formula (I), where R 5 is a methyl group and Re is also a methyl group.
En adelante, se hará referencia a cualquiera de los compuestos anteriores como "compuestos de Ia invención" o "compuestos de Ia presente invención".Hereinafter, any of the above compounds will be referred to as "compounds of the invention" or "compounds of the present invention".
El medicamento comprende, al menos, cualquiera de los compuestos de Ia invención. Cualquiera de los compuestos de Ia presente invención, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento de una lesión por reperfusión (post-isquémica) que se manifiesta con signos como Ia hiperemia reactiva (hiperperfusión post-isquémica), donde el flujo sanguíneo de Ia reperfusión es igual o mayor de un 20 % del valor basal.The medicine comprises, at least, any of the compounds of the invention. Any of the compounds of the present invention, pharmaceutically acceptable derivatives or their prodrugs, are formulated in an appropriate pharmaceutical composition, in the therapeutically effective amount, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or excipients. The drug is used for the treatment of a reperfusion injury (post-ischemic) that manifests itself with signs such as hyperemia reactive (post-ischemic hyperperfusion), where the reperfusion blood flow is equal to or greater than 20% of the baseline.
Por un "derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) cualquiera de los compuestos de Ia invención.By a "pharmaceutically acceptable derivative" means any salt, pharmaceutically acceptable or any other compound that, after administration, is capable of providing (directly or indirectly) any of the compounds of the invention.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.A "pharmaceutically acceptable vehicle" refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
El término "tratamiento" tal como se entiende en Ia presente invención supone combatir los efectos causados como consecuencia de una reperfusión post- isquémica para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores. El término "prevención" tal como se entiende en Ia presente invención consiste en evitar Ia aparición de daños cuya causa sea Ia reperfusión post-isquémica.The term "treatment" as understood in the present invention is to combat the effects caused as a result of a post-ischemic reperfusion to stabilize the condition of individuals or prevent further damage. The term "prevention" as understood in the present invention is to avoid the occurrence of damage whose cause is post-ischemic reperfusion.
La perfusión es Ia acción de introducir lenta y continuamente un líquido, como Ia sangre o una sustancia medicamentosa, por vía intravenosa o en el interior de órganos, cavidades o conductos. El término "reperfusión" hace referencia a Ia restauración del flujo sanguíneo después de Ia ocurrencia de una isquemia. La restauración del flujo sanguíneo se produce de forma espontánea, aunque en este caso Ia restauración es muy lenta, o se produce de forma inducida por medio de Ia administración de compuestos que se encargan de deshacer el trombo cuando ésta es Ia causa de Ia isquemia. En este último caso, se suele administrar un tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular recombinante rt- PA y a partir del momento en el que se administra el compuesto trombolítico se comienza Ia restauración del flujo sanguíneo a Ia zona afectada. En Ia presente invención, Ia reperfusión post-isquémica donde el flujo sanguíneo de Ia reperfusión es igual o mayor de un 20 % del valor basal se denomina hiperperfusión. El término "hiperperfusión" tal como se entiende en Ia presente invención es el fluir de Ia sangre por el interior de órganos, cavidades o conductos con un flujo sanguíneo superior al flujo que se da en un individuo en condiciones normales (valores básales). En Ia presente invención, el término hiperemia puede emplearse como un sinónimo de hiperperfusión.Perfusion is the action of slowly and continuously introducing a liquid, such as blood or a drug substance, intravenously or into organs, cavities or ducts. The term "reperfusion" refers to the restoration of blood flow after the occurrence of an ischemia. The restoration of blood flow occurs spontaneously, although in this case the restoration is very slow, or occurs induced by means of the administration of compounds that are responsible for undoing the thrombus when this is the cause of ischemia. In the latter case, a thrombolytic treatment with recombinant tissue plasminogen activator rt-PA is usually administered and from the moment in which the thrombolytic compound is administered, the restoration of blood flow to the affected area is started. In the present invention, the post-ischemic reperfusion where the reperfusion blood flow is equal to or greater than 20% of the baseline is called hyperperfusion. The term "hyperperfusion" as understood in the present invention is the flow of blood through the interior of organs, cavities or ducts with a blood flow greater than the flow that occurs in an individual under normal conditions (baseline values). In the present invention, the term hyperemia can be used as a synonym for hyperperfusion.
El término "post-isquémica" indica que Ia hiperperfusión se da después de una isquemia. La isquemia es una reducción del flujo sanguíneo hasta niveles que son insuficientes para mantener el metabolismo necesario para Ia función y estructura normales de un tejido o de un órgano. La reducción del flujo sanguíneo causa Ia disminución del aporte de oxígeno a las células de un tejido biológico y como consecuencia se puede llegar a Ia muerte celular. La causa de una isquemia puede ser, pero sin limitarse, una embolia causada por un émbolo que provoca Ia oclusión o bloqueo de un vaso sanguíneo de menor diámetro al del émbolo.The term "post-ischemic" indicates that hyperperfusion occurs after an ischemia. Ischemia is a reduction in blood flow to levels that are insufficient to maintain the metabolism necessary for the normal function and structure of a tissue or an organ. The reduction of blood flow causes the decrease in the oxygen supply to the cells of a biological tissue and as a consequence cell death can be achieved. The cause of an ischemia can be, but not limited to, an embolism caused by a plunger that causes occlusion or blockage of a blood vessel of smaller diameter than that of the plunger.
El término "hiperperfusión post-isquémica" se utiliza como sinónimo de "hiperemia reactiva". A Io largo de Ia memoria, estos dos términos se pueden utilizar indistintamente.The term "post-ischemic hyperperfusion" is used as a synonym for "reactive hyperemia." Throughout memory, these two terms can be used interchangeably.
En Ia presente invención, el medicamento se destina al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión post-isquémica, donde dicha reperfusión presenta un flujo sanguíneo igual o mayor de un 20 % del valor basal. El término "valor basal" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere al valor del flujo sanguíneo de un individuo antes de que se produzca Ia isquemia o bien al valor del flujo sanguíneo de Ia región homologa del hemisferio cerebral contralateral. El valor del flujo sanguíneo de Ia vasculatura del hemisferio en el que no se produce Ia isquemia puede servir para establecer el valor basal con el que comparar el valor del flujo sanguíneo cuando se produce Ia reperfusión. Tal como se ha comentado anteriormente, en los casos en que Ia causa de Ia isquemia es un trombo se suele administrar un tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular recombinante rt-PA y a partir del momento en el que se administra el compuesto trombolítico se comienza Ia restauración del flujo sanguíneo a Ia zona afectada. En ese momento se puede llevar a cabo Ia medida del flujo sanguíneo para compararla con el flujo basal.In the present invention, the medicament is intended for the treatment of an injury caused by a post-ischemic reperfusion, where said reperfusion has a blood flow equal to or greater than 20% of the baseline value. The term "baseline value" as understood in the present invention refers to the value of an individual's blood flow before ischemia occurs or to the value of the blood flow of the homologous region of the contralateral cerebral hemisphere. The value of the blood flow of the vasculature of the hemisphere in which ischemia does not occur can serve to establish the baseline value with which to compare the value of blood flow when reperfusion occurs. As previously mentioned, in cases where the cause of ischemia is a thrombus, it is usually administer a thrombolytic treatment with recombinant tissue plasminogen activator rt-PA and from the moment in which the thrombolytic compound is administered, the restoration of blood flow to the affected area begins. At that time, the blood flow measurement can be carried out to compare it with the basal flow.
La hiperperfusión reactiva se puede detectar con técnicas que permiten valorar el flujo sanguíneo cerebral de Ia reperfusión cerebral como por ejemplo, pero sin limitarse, láser Doppler o técnicas no invasivas de neuroimagen como Ia tomografía computerizada o resonancia magnética.Reactive hyperperfusion can be detected with techniques that allow the cerebral blood flow of cerebral reperfusion to be assessed, such as, but not limited to, Doppler laser or non-invasive neuroimaging techniques such as computed tomography or magnetic resonance imaging.
La hiperperfusión puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo de un animal después de sufrir una isquemia que se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, isquemia cerebral, isquemia miocárdica o isquemia renal. Preferiblemente el animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.Hyperperfusion can occur in any part of an animal's body after suffering an ischemia that is selected from the list comprising, but not limited to, cerebral ischemia, myocardial ischemia or renal ischemia. Preferably the animal is a mammal. Preferably the mammal is a human.
Los ejemplos que se presentan en Ia presente invención se llevan a cabo in vivo en ratas. El efecto conseguido mediante Ia administración del compuesto de Ia presente invención al mamífero rata, puede extrapolarse al resto de mamíferos ya que los mecanismos de acción de cualquiera de los compuestos de Ia invención, se conservan en todos los mamíferos. Por otra parte se ha demostrado que Ia hiperperfusión en pacientes después de sufrir una isquemia, no sólo ocurre en ratas sino que también puede ocurrir en pacientes, o bien de forma espontánea, o después de administración de un tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular recombinante rt-PA (Kidwell et al., 2001. Neuroloαv. 57:2015-2021 ).The examples presented in the present invention are carried out in vivo in rats. The effect achieved by administering the compound of the present invention to the rat mammal can be extrapolated to the rest of mammals since the mechanisms of action of any of the compounds of the invention are conserved in all mammals. On the other hand, it has been shown that hyperperfusion in patients after suffering an ischemia, not only occurs in rats but can also occur in patients, either spontaneously, or after administration of a thrombolytic treatment with recombinant tissue plasminogen activator rt-PA (Kidwell et al., 2001. Neuroloαv. 57: 2015-2021).
Otra realización preferida se refiere al uso del compuesto donde Ia hiperperfusión post-isquémica es cerebral. A título informativo, las causas más frecuentes de isquemia cerebral son: infarto lacunar (en pacientes con hipertensión vascular), infartos dependientes de las carótidas (por mecanismos hemodinámicos) o embolias cerebrales de origen cardíaco.Another preferred embodiment refers to the use of the compound where the post-ischemic hyperperfusion is cerebral. For information purposes, the most frequent causes of cerebral ischemia are: lacunar infarction (in patients with vascular hypertension), carotid-dependent infarctions (by hemodynamic mechanisms) or cerebral embolisms of cardiac origin.
Según otra realización preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral o parenteral. Una realización más preferida se refiere a un compuesto donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral.According to another preferred embodiment, the medicament is presented in a form adapted to oral or parenteral administration. A more preferred embodiment refers to a compound where the medicament is presented in a form adapted to oral administration.
En cada caso Ia forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición de Ia presente invención se puede presentar bajo Ia forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.In each case the form of presentation of the medication will be adapted to the type of administration used, therefore, the composition of the present invention can be presented in the form of solutions or any other form of clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount.
La forma adaptada a Ia administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. La forma adaptada a Ia administración oral se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.The form adapted to oral administration refers to a physical state that can allow oral administration. The form adapted to oral administration is selected from the list comprising, but not limited to, drops, syrup, tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, seal, pill, tablet, tablet, tablet or lyophilized.
La forma adaptada a Ia administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. El compuesto de fórmula general (I) puede ir asociado, por ejemplo, pero sin limitarse, con liposomas o micelas. Un liposoma es una vesícula esférica con una membrana fosfolipídica. El liposoma contiene un núcleo de solución acuosa. La micela es un lípido esférico que contiene material no acuoso. Tanto los liposomas como las micelas pueden utilizarse como transportadores de diversas sustancias entre el exterior y el interior de Ia célula. Otra posibilidad es que el medicamento se presente en una forma adaptada a Ia administración sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada. La forma adaptada a Ia administración rectal se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, cápsula rectal, dispersión rectal o pomada rectal. La forma adaptada a Ia administración transdérmica se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, parche transdérmico o iontoforesis.The form adapted to parenteral administration refers to a physical state that can allow its injectable administration, that is, preferably in a liquid state. Parenteral administration can be carried out by intramuscular, intraarterial, intravenous, intradermal, subcutaneous or intraosseous administration but not limited to these types of parenteral administration routes. The compound of general formula (I) may be associated, for example, but not limited to, with liposomes or micelles. A liposome is a spherical vesicle with a phospholipid membrane. The liposome contains a core of aqueous solution. The micelle is a spherical lipid that contains non-aqueous material. Both liposomes and micelles can be used as carriers of various substances between the exterior and interior of the cell. Another possibility is that the medication is presented in a form adapted to the sublingual, nasal, intracatecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal or inhaled administration. The form adapted to the rectal administration is selected from the list comprising, but not limited to, suppository, rectal capsule, rectal dispersion or rectal ointment. The form adapted to transdermal administration is selected from the list comprising, but not limited to, transdermal patch or iontophoresis.
Otra realización preferida se refiere al uso del compuesto, donde el medicamento incluye al menos un excipiente farmacológicamente aceptable.Another preferred embodiment relates to the use of the compound, wherein the medicament includes at least one pharmacologically acceptable excipient.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a Ia absorción de cualquiera de los compuestos de Ia presente invención (sustancia activa), estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a Ia preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que Io hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener Ia función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o Ia humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar Ia disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.The term "excipient" refers to a substance that helps the absorption of any of the compounds of the present invention (active substance), stabilizes said active substance or helps the preparation of the drug in the sense of giving consistency or providing flavors that Make it more enjoyable. Thus, the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
El término excipiente "farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.The term "pharmacologically acceptable" excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
Además, el excipiente debe ser farmacológicamente adecuado, es decir, un excipiente que permita Ia actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de Ia presente invención. Otra realización preferida se refiere al uso de cualquiera de los compuestos de Ia invención, donde el medicamento incluye al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.In addition, the excipient must be pharmacologically suitable, that is, an excipient that allows the activity of the active principle or of the active principles, that is, that it is compatible with the active principle, in this case, the active principle is any of the compounds of the present invention. Another preferred embodiment refers to the use of any of the compounds of the invention, wherein the medicament includes at least one pharmacologically acceptable vehicle.
El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de Ia presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de Ia presente invención. La función del vehículo es facilitar Ia incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando Ia forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.The vehicle, like the excipient, is a substance that is used in the medicament to dilute any of the compounds of the present invention to a certain volume or weight. The pharmacologically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to any of the compounds of the present invention. The function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the medication. When the form of presentation is liquid, the pharmacologically acceptable vehicle is the diluent.
Según otra realización preferida, el vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia grasa y el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral. Una realización más preferida se refiere al uso de un compuesto para Ia elaboración de un medicamento donde Ia sustancia grasa del vehículo farmacológicamente aceptable es aceite de oliva.According to another preferred embodiment, the pharmacologically acceptable carrier is a fatty substance and the medicament is presented in a form adapted to oral administration. A more preferred embodiment refers to the use of a compound for the preparation of a medicament where the fatty substance of the pharmacologically acceptable vehicle is olive oil.
Cualquiera de los compuestos de Ia presente invención es liposoluble, es decir, es capaz de disolverse en una solución que tenga una sustancia grasa. El término "sustancia grasa" tal como se entiende en Ia presente invención es una sustancia formada mayoritariamente por ácidos grasos. La sustancia grasa se selecciona, por ejemplo, pero sin limitarse, de grasa de origen animal, grasa de origen vegetal o grasa de origen artificial.Any of the compounds of the present invention is liposoluble, that is, it is capable of dissolving in a solution having a fatty substance. The term "fatty substance" as understood in the present invention is a substance formed mainly by fatty acids. The fatty substance is selected, for example, but not limited to, from animal fat, vegetable fat or artificial fat.
Otra realización preferida de Ia presente invención se refiere al uso del compuesto descrito anteriormente donde el medicamento comprende además otra sustancia activa. Esta sustancia activa debe permitir Ia actividad de cualquiera de los compuestos de Ia invención, es decir, debe ser compatible. Otra realización preferida se refiere al uso del compuesto descrito anteriormente donde el medicamento se administra en dos tomas de 100 mg de compuesto por kilogramo (Kg) de peso corporal, por vía oral. Según una realización más preferida, Ia primera toma se administra a partir de entre el momento en el que se produce Ia reperfusión y 60 minutos después del inicio de Ia reperfusión. Una realización aún más preferida se refiere al uso donde el medicamento se administra a partir de entre 15 y 45 minutos después del inicio de Ia reperfusión.Another preferred embodiment of the present invention relates to the use of the compound described above where the medicament further comprises another active substance. This active substance must allow the activity of any of the compounds of the invention, that is, it must be compatible. Another preferred embodiment relates to the use of the compound described above where the medicament is administered in two doses of 100 mg of compound per kilogram (Kg) of body weight, orally. According to a more preferred embodiment, the first shot is administered from the moment in which the reperfusion occurs and 60 minutes after the start of the reperfusion. An even more preferred embodiment refers to the use where the medicine is administered from 15 to 45 minutes after the start of reperfusion.
Según otra realización preferida las dos tomas se administran con una diferencia de tiempo de entre 4 y 8 horas. Es decir, si Ia primera toma se realiza a los 30 minutos desde el inicio de Ia reperfusión, Ia segunda toma se realizará entre las 4 horas y 30 minutos desde el inicio de Ia reperfusión y las 8 horas y 30 minutos desde el inicio de Ia reperfusión.According to another preferred embodiment the two shots are administered with a time difference of between 4 and 8 hours. That is, if the first shot is made 30 minutes after the beginning of the reperfusion, the second shot will be made between 4 hours and 30 minutes from the start of the reperfusion and 8 hours and 30 minutes from the start of the reperfusion
La administración del medicamento se lleva a cabo en un animal. Preferiblemente el animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano. El término "toma" tal como se entiende en Ia presente invención es cada una de las veces que se administra el medicamento por vía oral. La dosis de cada una de las tomas es de 100 mg de cualquiera de los compuestos de Ia presente invención por kilogramo (Kg) de de peso corporal. El medicamento se administra en dos tomas que se realizan después del inicio de Ia reperfusión post-isquémica, a partir de entre 15 y 45 minutos después del inicio. Las dos tomas se administran separadas por un intervalo de tiempo de entre 4 y 8 horas.The administration of the drug is carried out in an animal. Preferably the animal is a mammal. Preferably the mammal is a human. The term "take" as understood in the present invention is each of the times that the medication is administered orally. The dose of each of the shots is 100 mg of any of the compounds of the present invention per kilogram (Kg) of body weight. The medicine is administered in two doses that are made after the onset of post-ischemic reperfusion, from 15 to 45 minutes after the start. The two shots are administered separated by a time interval of between 4 and 8 hours.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.Throughout the description and the claims, the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and characteristics of the invention will emerge partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are They are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES
Con Ia intención de complementar Ia descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de Ia invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping to better understand the characteristics of the invention, according to some examples made, the following figures are shown here, for illustrative and non-limiting purposes :
FIG. 1. Muestra el volumen de infarto después de Ia isquemia transitoria y permanente. ** p<0.01FIG. 1. Shows the volume of infarction after transient and permanent ischemia. ** p <0.01
A: En el eje de ordenadas, se representa el volumen de infarto (I) en mm3 en función del tipo de isquemia.A: In the ordinate axis, the volume of infarction (I) in mm 3 is represented depending on the type of ischemia.
B: En el eje de ordenadas se representa Ia puntuación obtenida en el test neurológico en función del tipo de isquemia. En Ia isquemia permanente se analizan 5 individuos. En Ia isquemia transitoria se analizan 18 individuos.B: In the ordinate axis, the score obtained in the neurological test is represented according to the type of ischemia. In permanent ischemia, 5 individuals are analyzed. In transient ischemia, 18 individuals are analyzed.
FIG. 2. Muestra el efecto de Ia administración del agente antioxidante CR- 6 (dos dosis a las 2 y 8h después de Ia oclusión de Ia ACM).FIG. 2. It shows the effect of the administration of the antioxidant agent CR-6 (two doses at 2 and 8h after the occlusion of the ACM).
Volumen infartado (p<0.05) (A): (I). Valoración neurológica (p≤0.05)(2B) (N). Medidas del volumen infartado en córtex (C): (IC). Medidas del volumen infartado en subcórtex (D): (IS). Volumen infartado después de Ia isquemia permanente (E): (I). Valoración neurológica (F): (N). En A, B, C y D se analizan 16 individuos a los que se les ha administrado sólo el vehículo y 14 individuos a los que se les ha administrado CR-6 junto con el vehículo. En E y F se analizan 5 individuos control y 4 individuos a los que se les ha administrado CR-6 junto con el vehículo. FIG. 3. Muestra el efecto de una dosis única de CR-6 sobre el volumen de infarto y sobre el déficit neurológico.Infarcted volume (p <0.05) (A): (I). Neurological assessment (p≤0.05) (2B) (N). Measures of infarcted volume in cortex (C): (IC). Measures of infarct volume in subcortex (D): (IS). Infarcted volume after permanent ischemia (E): (I). Neurological assessment (F): (N). In A, B, C and D, 16 individuals who have been administered only the vehicle and 14 individuals who have been administered CR-6 together with the vehicle are analyzed. In E and F, 5 control individuals and 4 individuals who have been administered CR-6 together with the vehicle are analyzed. FIG. 3. It shows the effect of a single dose of CR-6 on the volume of infarction and on the neurological deficit.
A. Efecto de una dosis única de CR-6 sobre el volumen de infarto. En el eje de ordenadas se representa el volumen infartado (I) en mm3. En el eje de abcisas se representan los valores medios del volumen infartado de 18 individuos a los que se les ha administrado el vehículo, 16 individuos a los que se les ha administrado CR-6 y 8 individuos a los que se les administró CR-6 únicamente 30 minutos después de Ia reperfusión.A. Effect of a single dose of CR-6 on the volume of infarction. The infarcted volume (I) in mm 3 is represented on the ordinate axis. The abcissa axis represents the mean values of the infarcted volume of 18 individuals who have been administered the vehicle, 16 individuals who have been administered CR-6 and 8 individuals who have been administered CR-6 only 30 minutes after reperfusion.
B: En el eje de ordenadas se representa Ia puntuación obtenida en el test neurológico con una dosis única del vehículo (6 individuos) o de CR-6 con el vehículo (8 individuos).B: In the ordinate axis, the score obtained in the neurological test with a single dose of the vehicle (6 individuals) or CR-6 with the vehicle (8 individuals) is represented.
FIG. 4. Muestra Ia influencia de Ia administración de CR-6 en los niveles de GSH.FIG. 4. Shows the influence of the administration of CR-6 on GSH levels.
A: En el eje de ordenadas se representa Ia concentración de GSH cortical (nmol/mg de proteína) en el córtex. CR-6 previene Ia caída de GSH en el córtex después de que los individuos sufran una isquemia.A: The concentration of cortical GSH (nmol / mg protein) in the cortex is represented in the ordinate axis. CR-6 prevents the fall of GSH in the cortex after individuals suffer an ischemia.
B: En el eje de ordenadas se representa Ia concentración de GSH (nmol/mg de proteína) en el núcleo estriado. Hay dos regiones cerebrales afectadas por Ia isquemia: Ia corteza (o córtex) y el estriado. CR-6 previene Ia caída de GSH en el córtex después de que los individuos sufran una isquemia. C: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto (I) en mm3 frente a Ia concentración de GSH tanto para individuos a los que se administra el vehículo como a los que se administra CR-6 más el vehículo.B: The concentration of GSH (nmol / mg protein) in the striatum is represented on the ordinate axis. There are two brain regions affected by ischemia: the cortex (or cortex) and the striatum. CR-6 prevents the fall of GSH in the cortex after individuals suffer an ischemia. C: In the ordinate axis, the volume of infarction (I) in mm 3 is represented against the concentration of GSH both for individuals to whom the vehicle is administered and to whom CR-6 is administered plus the vehicle.
FIG. 5. Muestra Ia expresión neuronal de Cox-2 después de Ia isquemia y el efecto de CR-6. Magnifcación x200.FIG. 5. It shows the neuronal expression of Cox-2 after ischemia and the effect of CR-6. Magnification x200.
FIG. 6. Muestra el resultado de Ia isquemia en función de si hubo (Sl) o no (NO) hiperemia. A: En el eje de ordenadas se representa el infarto de volumen (Log mm3) frente al flujo sanguíneo en Ia reperfusión (Log del porcentaje de incremento respecto del flujo sanguíneo basal) en el eje de abcisas. B: En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de flujo en Ia reperfusión de 5 individuos sin hiperemia (NO) y de 13 individuos con hiperemia (Sl), todos ellos administrados con el vehículo.FIG. 6. Shows the result of the ischemia depending on whether there was (Sl) or not (NO) hyperemia. A: In the ordinate axis, the volume infarction (Log mm 3 ) is represented against the blood flow in the reperfusion (Log of the percentage of increase with respect to the basal blood flow) in the axis of abscissa. B: In the ordinate axis, the percentage of reperfusion flow of 5 individuals without hyperemia (NO) and 13 individuals with hyperemia (Sl), all of them administered with the vehicle, is represented.
C: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto en los grupos que se han comentado para Ia figura B. D: En el eje de ordenadas se representa Ia puntación de Ia valoración neurológica en los grupos que se han comentado anteriormente.C: In the ordinate axis, the volume of infarction is represented in the groups that have been commented for Figure B. D: In the ordinate axis, the neurological assessment score is represented in the groups that have been previously mentioned.
E: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto cortical en los grupos que se han comentado anteriormente.E: In the ordinate axis, the volume of cortical infarction is represented in the groups mentioned above.
F: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto subcortical en los grupos que se han comentado anteriormente.F: The volume of subcortical infarction in the groups mentioned above is represented in the ordinate axis.
FIG. 7. Muestra el efecto de CR-6 y vehículo (aceite de oliva) en animales hiperémicos (Sl) y no hiperémicos (NO).FIG. 7. Shows the effect of CR-6 and vehicle (olive oil) on hyperemic (Sl) and non-hyperemic (NO) animals.
Los términos Sl y NO siempre hacen referencia a si hubo o no hiperemia. Por ejemplo, vehículo-SI = administrado con vehículo, con hiperemia; vehículo-NO = administrado con vehículo, sin hiperemia.The terms Sl and NO always refer to whether or not there was hyperemia. For example, vehicle-SI = administered with vehicle, with hyperemia; vehicle-NO = administered with vehicle, without hyperemia.
En los ejes de abcisas se representan los valores medios de determinados parámetros en los siguientes grupos de individuos: 5 individuos a los que se les administra el vehículo y que no desarrollan hiperemia, 13 individuos a los que se les administra el vehículo y que sí desarrollan hiperemia, 7 individuos a los que se les administra CR-6 y que no desarrollan hiperemia, y 7 individuos a los que se les administra CR-6 y que sí desarrollan hiperemia. Los parámetros que se representan en cada uno de los ejes de ordenadas son: porcentaje de flujo sanguíneo respecto del flujo basal en Ia reperfusión (A), porcentaje de flujo sanguíneo respecto del flujo basal durante Ia oclusión de Ia arteria cerebral media, MCA (B), volumen de infarto (C), valoración neurológica (D), medidas del volumen infartado en córtex (E) y medidas del volumen infartado en subcórtex (F).In the axes of abscissa the average values of certain parameters are represented in the following groups of individuals: 5 individuals who are administered the vehicle and who do not develop hyperemia, 13 individuals who are administered the vehicle and who do develop hyperemia, 7 individuals who are given CR-6 and who do not develop hyperemia, and 7 individuals who are given CR-6 and who do develop hyperemia. The parameters that are represented in each of the ordinate axes are: percentage of blood flow with respect to basal flow in reperfusion (A), percentage of blood flow with respect to basal flow during occlusion of the middle cerebral artery, MCA (B ), volume of infarction (C), neurological assessment (D), measures of infarcted volume in cortex (E) and measures of infarcted volume in subcortex (F).
FIG. 8. Muestra cómo Ia hiperemia (Sl) se asocia a rotura de BHE y cómo CR-6 atenúa dicho efecto.FIG. 8. It shows how hyperemia (Sl) is associated with BHE rupture and how CR-6 attenuates said effect.
En el eje de ordenadas se representa Ia concentración de Evans Blue (Azul de Evans) en el grupo de individuos a los que no se administra ni vehículo ni CR-6 y a los que sí que se les administra vehículo o CR-6 (junto con su vehículo).In the ordinate axis, the concentration of Evans Blue (Evans Blue) is represented in the group of individuals to whom neither a vehicle nor CR-6 is administered and to whom the vehicle or CR-6 is administered (together with your vehicle)
FIG. 9. Muestra el número de neutrófilos por área de tejido isquémico en función de si los animales desarrollaron hiperemia y del tratamiento recibido.FIG. 9. Shows the number of neutrophils per area of ischemic tissue depending on whether the animals developed hyperemia and the treatment received.
En el eje de ordenadas se representa el valor medio del n° de células MPO+ por área En las imágenes de microscopía en las que se ha realizado una tinción para ver los neutrófilos marcados por inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-mieloperoxidasa (MPO) se ha contado el número de células positivas por área.The average value of the number of MPO + cells per area is represented on the ordinate axis. In microscopy images in which staining has been performed to see the neutrophils marked by immunohistochemistry with an anti-myeloperoxidase antibody (MPO) has been counted the number of positive cells per area.
FIG. 10. Muestra Ia formación de ion superóxido en Ia arteria cerebral media (MCA) en el grupo de ratas tratadas sólo con el vehículo pero no en el grupo de ratas tratadas con CR-6, según tinción con dihidroetidio (DHE).FIG. 10. It shows the formation of superoxide ion in the middle cerebral artery (MCA) in the group of rats treated only with the vehicle but not in the group of rats treated with CR-6, according to dihydroetide staining (DHE).
EJEMPLOSEXAMPLES
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el uso de prolactina para Ia hepatoprotección y regeneración de células hepáticas. EJEMPLO 1. MÉTODOSNext, the invention will be illustrated by means of illustrative and non-limiting tests carried out by the inventors who describe the use of prolactin for hepatoprotection and regeneration of liver cells. EXAMPLE 1. METHODS
1.1. Animales1.1. Animals
Fueron usadas ratas macho adultas Sprague-Dawley (Harían, Spain) de entre 300 y 350 gramos de peso. El trabajo con los animales se llevó a cabo de acuerdo con Ia legislación local y con Ia aprobación del Comité Ético de Ia Universidad de Barcelona y de acuerdo con Ia legislación Europea vigente. Los animales se mantuvieron respetando el ciclo de vigilia/sueño de 12 h, y controlando las condiciones ambientales de temperatura y humedad, y se les dio agua y comida ad libitum. La anestesia utilizada en las intervenciones quirúrgicas fue isofluorano.Adult male rats Sprague-Dawley (Harían, Spain) of between 300 and 350 grams were used. The work with the animals was carried out in accordance with local legislation and with the approval of the Ethical Committee of the University of Barcelona and in accordance with current European legislation. The animals were kept respecting the 12 h wake / sleep cycle, and controlling the environmental conditions of temperature and humidity, and were given water and food ad libitum. The anesthesia used in the surgical interventions was isofluoran.
1.2. Inducción de Ia isquemia focal.1.2. Induction of focal ischemia.
La isquemia cerebral focal fue inducida por oclusión intraluminal de Ia arteria cerebral media (ACM) derecha (Justicia et al., 2006 J. Cereb. Blood Flow Metab., 26: 321-32). Un grupo de ratas fueron sometidas a 90 minutos de isquemia seguida de reperfusión, mientras que otro grupo fue sometido a una isquemia permanente. Las ratas fueron anestesiadas con isofluorano e intubadas por Ia tráquea bajo ventilación controlada. Durante todo el procedimiento quirúrgico se obtuvieron varias muestras sanguíneas para Ia determinación de gases en sangre. La presión arterial fue monitorizada durante todo el procedimiento y Ia temperatura corporal mantenida entre 36,5 y 37,5 0C. La arteria carótida común y externa fueron expuestas y Ia arteria pterigopalatina fue ligada. Un filamento de nylon (4/0, looksutures, Havard- Apparatus) de 21 mm se introdujo a través de Ia arteria carótida externa hasta el nivel donde se ramifica Ia ACM. Este filamento fue cautelosamente retirado en el grupo sometido a Ia reperfusión tras 90 minutos de Ia oclusión, y Ia ligadura de Ia ACM fue desecha permitiendo Ia reperfusión. En el grupo sometido a una isquemia permanente el filamento intraluminal se mantuvo en su sitio sin ser retirado. Las ratas se recuperaron de Ia anestesia, y a las 8, 24 ó 48 horas después de Ia oclusión de Ia ACM fueron profundamente anestesiadas con isofluorano y sacrificadas por perfusión coronaria con bomba de infusión de 60 ml_ de salino heparinizado (30 U/mL) a un volumen de infusión de 10 mL/min seguido por 120 ml_ de salino para retirar Ia sangre de los tejidos cerebrales.Focal cerebral ischemia was induced by intraluminal occlusion of the right middle cerebral artery (MCA) (Justicia et al., 2006 J. Cereb. Blood Flow Metab., 26: 321-32). One group of rats underwent 90 minutes of ischemia followed by reperfusion, while another group underwent permanent ischemia. The rats were anesthetized with isofluorane and intubated by the trachea under controlled ventilation. During the entire surgical procedure several blood samples were obtained for the determination of blood gases. The blood pressure was monitored throughout the procedure and the body temperature maintained between 36.5 and 37.5 0 C. The common and external carotid artery were exposed and the pterygopalatine artery was ligated. A nylon filament (4/0, looksutures, Havard-Apparatus) of 21 mm was introduced through the external carotid artery to the level where the MCA branches. This filament was cautiously removed in the group undergoing reperfusion after 90 minutes of occlusion, and the ACM ligation was discarded allowing reperfusion. In the group undergoing permanent ischemia, the intraluminal filament remained in place without being removed. Rats recovered from anesthesia, and at 8, 24 or 48 hours after the occlusion of the MCA they were deeply anesthetized with isofluorane and sacrificed by coronary infusion with an infusion pump of 60 ml_ of heparinized saline (30 U / mL) at an infusion volume of 10 mL / min followed by 120 ml_ of saline for withdraw blood from brain tissues.
1.3. Medida de Ia perfusión cortical.1.3. Measurement of cortical perfusion.
La perfusión cortical fue medida con un sistema de láser-Doppler (Perimed, Sweden) en las ratas sometidas a Ia oclusión de ACM. El día anterior a Ia inducción de Ia isquemia, las ratas se anestesiaron para Ia implantación de una guía en Ia superficie del cráneo después de reducir 1 mm el grosor del hueso con una pequeña broca. La guía se fijó al cráneo con cemento dental y 2 pequeños tornillos siguiendo las coordenadas: 2 mm posterior y 3,5 mm lateral con relación a bregma, sobre el hemisferio ipsilateral (derecho). Al día siguiente se introdujo una sonda láser-Doppler a través de Ia guía y se empezó el registro. Después de un registro estable, Ia isquemia fue inducida. La perfusión fue continuamente monitorizada antes de Ia isquemia, durante los 90 minutos de ésta y los primeros 15 minutos de reperfusión. Algunos datos de Ia perfusión se usaron para Ia exclusión de algunos animales del estudio como por ejemplo:Cortical perfusion was measured with a laser-Doppler system (Perimed, Sweden) in rats subjected to ACM occlusion. The day before the induction of ischemia, the rats were anesthetized for the implantation of a guide on the surface of the skull after reducing the thickness of the bone by 1 mm with a small drill. The guide was fixed to the skull with dental cement and 2 small screws following the coordinates: 2 mm posterior and 3.5 mm lateral in relation to bregma, on the ipsilateral hemisphere (right). The next day a laser-Doppler probe was introduced through the guide and registration was started. After a stable record, ischemia was induced. The perfusion was continuously monitored before ischemia, during the 90 minutes of it and the first 15 minutes of reperfusion. Some perfusion data were used for the exclusion of some animals in the study, such as:
1 ) ratas que después de Ia introducción del filamento para Ia oclusión de MCA no recuperaron Ia perfusión hasta el 40% o más del nivel basal; éstos animales fueron excluidos del estudio ya que se consideró que Ia isquemia no había sido exitosa posiblemente debido a factores individuales de Ia anatomía cerebrovascular. El porcentaje de disminución del flujo sanguíneo necesario para causar infarto según nuestras condiciones experimentales fue del 40%, verificando que con una caída inferior las ratas no desarrollaron un infarto.1) rats that after the introduction of the filament for occlusion of MCA did not recover the infusion up to 40% or more of the baseline level; These animals were excluded from the study since it was considered that the ischemia had not been successful possibly due to individual factors of the cerebrovascular anatomy. The percentage of decrease in blood flow necessary to cause infarction according to our experimental conditions was 40%, verifying that with a lower fall the rats did not develop a heart attack.
2) Las ratas que no mostraron una recuperación a Ia reperfusión por encima del 80% del nivel basal fueron excluidas del estudio ya que sólo mostraron una restauración parcial del flujo sanguíneo. Estos criterios de exclusión son independientes del tratamiento que se inició a los 30 minutos de Ia reperfusión, una vez que se obtuvieron datos del flujo sanguíneo. 1.4. Tratamiento2) Rats that did not show a recovery from reperfusion above 80% of the baseline level were excluded from the study since they only showed a partial restoration of blood flow. These exclusion criteria are independent of the treatment that began 30 minutes after reperfusion, once blood flow data were obtained. 1.4. Treatment
CR-6 fue sintetizado químicamente como previamente se refirió (Casas et al., 1992. J. Agrie. Food Chem., 40: 585-90). CR-6 fue disuelto en aceite de oliva comestible y comercializado (Carbonell, España) y se administró oralmente a las ratas a una dosis de 1 mL (100 mg/Kg) usando un medidor de comida. El mismo aceite fue usado como vehículo. Cada animal fue tratado dos veces a las 2 h y 8 h del comienzo de Ia isquemia, ó sólo a las 2 h. Las ratas recibieron un código que no revelaba el tipo de tratamiento asignado a cada animal.CR-6 was chemically synthesized as previously referred to (Casas et al., 1992. J. Agrie. Food Chem., 40: 585-90). CR-6 was dissolved in edible and marketed olive oil (Carbonell, Spain) and was administered orally to rats at a dose of 1 mL (100 mg / Kg) using a food meter. The same oil was used as a vehicle. Each animal was treated twice at 2 h and 8 h from the beginning of the ischemia, or only at 2 h. The rats received a code that did not reveal the type of treatment assigned to each animal.
1.5. Evaluación del volumen de infarto1.5. Infarction Volume Evaluation
Para Ia determinación del volumen de infarto, las ratas fueron anestesiadas con isofluorano y sacrificadas por decapitación a las 24 h. El cerebro se retiró y se cortó en secciones coronales de 2 mm de grosor, que fueron teñidos con una solución al 1 % de cloruro de 2, 3, 5-triphenyltetrazolio (TTC) durante 10 minutos a 370C. Los cortes se sumergieron toda Ia noche en una solución alTo determine the volume of infarction, the rats were anesthetized with isofluorane and sacrificed by decapitation at 24 h. The brain was removed and cut into coronal sections 2 mm thick were stained with a 1% solution of chloride 2, 3, 5-triphenyltetrazolio (TTC) for 10 minutes at 37 0 C. The sections were immersed all night in a solution to
4% de paraformaldehído en tampón fosfato y después se lavaron y se guardaron en tampón fosfato 0,1 M a un pH de 7.4. Las mitocondrias de los tejidos isquémicos no reaccionaron a Ia tinción con TTC, mientras que se adquirieron color rojo en los tejidos sanos. En las imágenes de las secciones, se midieron las zonas blancas o claras de cada sección, rectificando Ia zona del edema producido en Ia zona cerebral infartada por el ratio entre las áreas contralateral e ipsilateral. Las áreas fueron integradas para calcular el volumen infartado.4% paraformaldehyde in phosphate buffer and then washed and stored in 0.1 M phosphate buffer at a pH of 7.4. Mitochondria of ischemic tissues did not react to staining with TTC, while red color was acquired in healthy tissues. In the images of the sections, the white or clear areas of each section were measured, rectifying the area of the edema produced in the cerebral zone infarcted by the ratio between the contralateral and ipsilateral areas. The areas were integrated to calculate the infarcted volume.
1.6. Valoración neurológica1.6. Neurological assessment
Un simple test neurológico en una escala de 0 a 9 puntos (0 = no déficit y 9 = Ia deficiencia más alta) se realizó como se indicaba previamente (Justicia et al., 2006. J Cereb. Blood Flow Metab.. 26: 321-32) antes de Ia muerte de los animales. Se siguieron 4 test para Ia evaluación: 1 ) Actividad espontánea (movimiento/exploración = 0; movimiento sin exploración = 1 ; no movimiento ó sólo cuando se Ie tira de Ia cola = 2).A simple neurological test on a scale of 0 to 9 points (0 = no deficit and 9 = the highest deficiency) was performed as previously indicated (Justicia et al., 2006. J Cereb. Blood Flow Metab .. 26: 321 -32) before the death of the animals. Four tests were followed for the evaluation: 1) Spontaneous activity (movement / exploration = 0; movement without exploration = 1; no movement or only when the tail is pulled = 2).
2) Rotación hacia Ia izquierda (si no hace nada = 0; si hay elevación de Ia cola o Ia rata se estira o se arrastra {push & pulí) = 1 ; espontáneamente = 2; rotación sin desplazamiento (spinning top) = 3.2) Rotate to the left (if you do nothing = 0; if there is elevation of the tail or the rat is stretched or dragged {push & pulí) = 1; spontaneously = 2; rotation without displacement (spinning top) = 3.
3) Resistencia a Ia extensión de Ia pata izquierda (si no se puede realizar Ia extensión = 0; si se puede realizar extensión = 1 ; si no hay resistencia a Ia extensión = 3). 4) Reflejo a Ia caída (simétrico = 0; asimétrico = 1 ; pata delantera contralateral retraída = 3)3) Resistance to the extension of the left leg (if extension = 0 cannot be made; if extension = 1 can be made; if there is no resistance to extension = 3). 4) Reflection to the fall (symmetric = 0; asymmetric = 1; contralateral front leg retracted = 3)
1.7. Análisis de permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica1.7. Permeability analysis of the blood brain barrier
Para el análisis de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica (BBB, siglas del término en inglés), se inyectaron 4 mL/Kg (por Kg de peso corporal) de solución de Evans Blue al 2% en solución salina a través de Ia vena femoral 4 h después Ia inducción de Ia reperfusión. 2 h más tarde, las ratas fueron anestesiadas y se realizó perfusión transcardíaca para eliminar Ia sangre del tejido. El cerebro se cortó en secciones coronales y en cortes de 2mm de grosor y dos de las secciones (coordenadas de Bregma) fueron usadas para Ia extracción de Evans Blue, mientras una tercera sección fue guardada para Ia extracción de RNA. El córtex ipsilateral y contralateral y el estriado se diseccionaron, se pesaron y se sumergieron en una solución al 50% de ácido tricloroacético (TCA) (1.3 ml_ por gramo de tejido). El tejido se homogenizó por medio de un polytron y se centrifugó a 12000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se mezcló con etanol (1 :3). La intensidad de fluorescencia fue medida en un fluorímetro a 680 nm usando una alícuota de 110 μl de muestra. La concentración de Evans Blue (ng/mL) se calculó usando una curva estándar con las concentraciones conocidas de este colorante.For the analysis of the blood brain barrier permeability (BBB), 4 mL / Kg (per kg of body weight) of 2% Evans Blue solution in saline solution was injected through the femoral vein 4 h after induction of reperfusion. 2 h later, the rats were anesthetized and transcardiac perfusion was performed to remove the blood from the tissue. The brain was cut into coronal sections and 2mm thick cuts and two of the sections (Bregma coordinates) were used for the extraction of Evans Blue, while a third section was saved for RNA extraction. The ipsilateral and contralateral cortex and the striatum were dissected, weighed and immersed in a 50% solution of trichloroacetic acid (TCA) (1.3 ml_ per gram of tissue). The tissue was homogenized by means of a polytron and centrifuged at 12000 x g for 20 minutes. The supernatant was mixed with ethanol (1: 3). The fluorescence intensity was measured in a fluorometer at 680 nm using an aliquot of 110 μl of sample. The concentration of Evans Blue (ng / mL) was calculated using a standard curve with the known concentrations of this dye.
1.8. Determinación de Ia concentración de GSH 24 horas después de provocar Ia isquemia, las ratas fueron anestesiadas y perfundidas a través del corazón usando una bomba de infusión a una frecuencia de 10 mL/min con 60 ml_ de solución salina heparinizada a Ia concentración de (30 U/mL) seguido de 120 ml_ de solución salina para extraer toda Ia sangre del cuerpo. El tejido cerebral se extrajo y se diseccionó separando el córtex y el estriado ipsilateral y contralateral y fue rápidamente congelado y almacenado a -8O0C hasta su análisis. La concentración de GSH fue estimada según Ia siguiente fórmula: GSH = GSH - (2xGSSG).1.8. Determination of the concentration of GSH 24 hours after causing ischemia, the rats were anesthetized and perfused through the heart using an infusion pump at a frequency of 10 mL / min with 60 ml_ of heparinized saline solution at the concentration of (30 U / mL) followed by 120 ml_ of saline solution to extract all the blood from the body. Brain tissue was removed and dissected by separating the cortex and the ipsilateral and contralateral striatum and was quickly frozen and stored at -8O 0 C until analysis. The concentration of GSH was estimated according to the following formula: GSH = GSH - (2xGSSG).
1.9. Inmunohistoquímica1.9. Immunohistochemistry
La expresión de Ia proteína ciclooxigenasa-2 (Cox-2) se estudió por inmunoquímica como previamente se describe (Planas et al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22: 918-925) a las 24 h post-isquemia. Se sumergieron 2 mm de una sección coronal de cerebro en 4% de paraformaldehído en tampón fosfato a pH 7.4 durante toda Ia noche y después se lavaron en el mismo tampón. La inmunohistoquímica de Cox-2 se realizó en secciones flotantes obtenidas en el vibratomo. Se obtuvieron secciones de 50 μm de grosor y se sometieron a inmunotinción usando anticuerpos monoclonales contra Cox-2 (Cayman) diluido 1 :200. La inmunohistoquímica contra Ia mieloperoxidasa (MPO) (Pharmingen) se realizó en secciones de parafina que se obtuvieron después de incluir 2 mm de cerebro en parafina y de obtener cortes de 5 μm de grosor en el microtomo. Se usaron anticuerpos monoclonales de ratón contra MPO a una dilución de 1 :500. Después del anticuerpo primario, las secciones fueron incubadas con anticuerpos secundarios biotinilados seguidos por el procedimiento de ABC (Serotec). La reacción de revelado se llevó a cabo con diaminobencidina como se describe en (Planas et al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22: 918-925). El número de células por área se contó en tres áreas de cada sección.The expression of the cyclooxygenase-2 protein (Cox-2) was studied by immunochemistry as previously described (Planas et al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22: 918-925) at 24 h post- ischemia. 2 mm of a coronal section of the brain was immersed in 4% paraformaldehyde in phosphate buffer at pH 7.4 overnight and then washed in the same buffer. Cox-2 immunohistochemistry was performed on floating sections obtained in the vibratome. Sections 50 μm thick were obtained and subjected to immunostaining using monoclonal antibodies against Cox-2 (Cayman) diluted 1: 200. The immunohistochemistry against myeloperoxidase (MPO) (Pharmingen) was performed in paraffin sections that were obtained after including 2 mm of brain in paraffin and obtaining cuts of 5 μm thick in the microtome. Mouse monoclonal antibodies against MPO were used at a dilution of 1: 500. After the primary antibody, the sections were incubated with biotinylated secondary antibodies followed by the ABC procedure (Serotec). The developing reaction was carried out with diaminobenzidine as described in (Planas et al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22: 918-925). The number of cells per area was counted in three areas of each section.
1.10. Determinación de Ia formación de anión superóxido en Ia arteria cerebral media aislada La ACM ipsilateral al hemisferio isquémico se aisló de algunos animales después de 24 h post-isquemia. Los segmentos de Ia arteria se colocaron en solución KHS (de las siglas en inglés de Krebs-Henseleit solution) conteniendo sacarosa al 30% durante Ia noche y se transfirieron a un criomolde (Bayer Química Farmacéutica, Barcelona, Spain) relleno de medio de inclusión (Tissue Tek OCT embedding médium, Sakura Finetek Europe, The Netherlands) durante 20 minutos, y después se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -7O0C. El colorante fluorescente dihidroetidio (DHE) se utilizó para evaluar Ia producción de 02 " in situ, tal como se ha descrito previamente (Jimenez-Altayó et al., 2006. J. Pharmacol. Exp. Ther.. 316: 42-52; Martinez- Revelles et al., 2008. Pharmacol. Exp. Ther., 325: 363-369).1.10. Determination of superoxide anion formation in the isolated middle cerebral artery The ipsilateral ACM to the ischemic hemisphere was isolated from some animals after 24 h post-ischemia. The segments of the artery were placed in KHS solution (Krebs-Henseleit solution) containing 30% sucrose overnight and transferred to a cryomold (Bayer Pharmaceutical Chemistry, Barcelona, Spain) filled with inclusion medium (Tissue Tek OCT medium embedding, Sakura Finetek Europe, The Netherlands) for 20 minutes, and then frozen in liquid nitrogen and stored at -7O 0 C. The fluorescent dye dihydroetidium (DHE) was used to evaluate the production of 02 " in situ, as previously described (Jimenez-Altayó et al., 2006. J. Pharmacol. Exp. Ther. 316: 42-52; Martinez-Revelles et al., 2008. Pharmacol. Exp. Ther., 325: 363-369).
1.11. Análisis estadístico1.11 Statistic analysis
La comparación entre los dos grupos se hizo con Ia realización del t-test ó del test no paramétrico de Mann-Whitney, dependiendo de si los valores pasaron o no pasaron el test de normalidad (D'Agostino &Pearson ómnibus normally test). Las comparaciones entre más de dos grupos se hicieron con one-way ANOVA seguida del análisis post-hoc de Bonferroni's para valores que se ajustaban a Ia normalidad, o con el test de Kruskal-Wallis seguido del Dunn's Múltiple Comparíson Test. Se consideraron significativos aquellos valores p<0.05. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism software.The comparison between the two groups was made with the performance of the t-test or the non-parametric Mann-Whitney test, depending on whether the values passed or did not pass the normality test (D'Agostino & Pearson omnibus normally test). Comparisons between more than two groups were made with one-way ANOVA followed by Bonferroni's post-hoc analysis for values that adjusted to normal, or with the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn's Multiple Comparison Test. Those values p <0.05 were considered significant. Statistical analysis was performed with GraphPad Prism software.
EJEMPLO 2. RESULTADOSEXAMPLE 2. RESULTS
2.1. Volumen de infarto después de Ia isquemia transitoria y permanente2.1. Infarction volume after transient and permanent ischemia
La oclusión de Ia ACM en rata Sprague-Dawley puede inducir varios grados de lesión tisular y consecuencias funcionales. El volumen infartado (media±desviación estándar) fue menor (p<0.01 ) después de una isquemia transitoria (140.2±64.4 mm3) que en Ia isquemia permanente (265.6±69.2 mm3) (FIG. 1 B). Sin embargo, el déficit neurológico sólo mostró una insignificante tendencia a incrementar después de isquemia permanente comparado con Ia transitoria (p=0.1 ) (FIG. 1C). Esta observación sugiere que, en relación a Ia extensión del tejido lesionado, el déficit funcional fue comparativamente peor después de Ia isquemia transitoria que de Ia permanente.The occlusion of the MCA in Sprague-Dawley rat can induce various degrees of tissue injury and functional consequences. The infarcted volume (mean ± standard deviation) was lower (p <0.01) after an ischemia transient (140.2 ± 64.4 mm 3 ) than in permanent ischemia (265.6 ± 69.2 mm 3 ) (FIG. 1 B). However, the neurological deficit only showed an insignificant tendency to increase after permanent ischemia compared to the transient one (p = 0.1) (FIG. 1C). This observation suggests that, in relation to the extension of the injured tissue, the functional deficit was comparatively worse after the transient ischemia than the permanent one.
2.2. CR-6 reduce el volumen de infarto y mejora el déficit neurológico después de Ia isquemia transitoria pero no en Ia permanente2.2. CR-6 reduces the volume of infarction and improves neurological deficit after transient ischemia but not in permanent
La administración del agente antioxidante CR-6 (dos dosis a las 2 y 8 h después de Ia oclusión de Ia ACM redujo el volumen infartado (p≤0.05) (FIG. 2A) y mejoró Ia valoración neurológica (p<0.05) (FIG. 2B) después de Ia isquemia transitoria. El CR-6 protegió al córtex y al estriado (FIG. 2C, D). No obstante, este tratamiento con CR-6 no tuvo efecto protector después de Ia isquemia permanente (FIG. 2E, F). En el grupo del CR-6, el volumen infartado fue significativamente más extenso (p≤O.001 ) después de Ia isquemia permanente (300.1 ±38.4 mm3) que de Ia isquemia transitoria, pero, de nuevo, Ia valoración neurológica sólo demostró una insignificante tendencia a aumentar después de Ia isquemia permanente vs a Ia transitoria (p=0.06).The administration of the antioxidant agent CR-6 (two doses at 2 and 8 h after the occlusion of the MCA reduced the infarcted volume (p≤0.05) (FIG. 2A) and improved the neurological assessment (p <0.05) (FIG 2B) after transient ischemia CR-6 protected the cortex and striatum (FIG. 2C, D) However, this treatment with CR-6 had no protective effect after permanent ischemia (FIG. 2E, F) In the CR-6 group, the infarcted volume was significantly more extensive (p≤O.001) after permanent ischemia (300.1 ± 38.4 mm 3 ) than transient ischemia, but, again, the assessment Neurological showed only an insignificant tendency to increase after permanent vs transient ischemia (p = 0.06).
Una administración única de CR-6 a las 2 h de Ia reperfusión no fue suficiente para inducir Ia protección, puesto que no redujo el volumen infartado (FIG. 3A) ni tampoco mejoró el déficit neurológico (FIG. 3B). Esto sugiere que una acción prolongada del antioxidante puede ser necesaria para neutralizar los efectos de Ia reperfusión.A single administration of CR-6 at 2 h of the reperfusion was not sufficient to induce protection, since it did not reduce the infarcted volume (FIG. 3A) nor did it improve the neurological deficit (FIG. 3B). This suggests that a prolonged action of the antioxidant may be necessary to neutralize the effects of reperfusion.
2.3. El consumo de glutatión endógeno fue atenuado en los animales tratados con CR-6.2.3. Endogenous glutathione consumption was attenuated in animals treated with CR-6.
La concentración del glutatión total (GSx) y del oxidado (GSSG) se determinó en el córtex ipsilateral y contralateral y en el estriado a las 24 h post-isquemia en las ratas tratadas con vehículo ó CR-6 y Ia reducción del contenido en glutatión reducido (GSH) se calculó con las medidas previas (ver Métodos). A las 24 h después de Ia isquemia transitoria, Ia concentración de GSH, estaba significativamente reducida en el córtex ipsilateral (p≤0.05) (FIG. 4A) y en el estriado (p≤O.001 ) (FIG. 4B) de las ratas isquémicas que recibieron vehículo. Este efecto fue atenuado por CR-6, ya que el contenido en GSH en este grupo no fue significativamente diferente de los controles no isquémicos. (FIG. 4A, B). Se encontró una relación negativa entre el contenido en GSH y el volumen infartado (FIG. 4C), Io que sugirió que el grado de consumo de GSH era un indicativo de Ia magnitud de Ia lesión tisular después de Ia isquemia/perfusión.The concentration of total glutathione (GSx) and oxidized (GSSG) was determined in the ipsilateral and contralateral cortex and in the striatum at 24 h post-ischemia in rats treated with vehicle or CR-6 and the reduction in reduced glutathione (GSH) content was calculated with the previous measures (see Methods). At 24 h after transient ischemia, the concentration of GSH was significantly reduced in the ipsilateral cortex (p≤0.05) (FIG. 4A) and in the striatum (p≤O.001) (FIG. 4B) of the Ischemic rats that received vehicle. This effect was attenuated by CR-6, since the GSH content in this group was not significantly different from non-ischemic controls. (FIG. 4A, B). A negative relationship was found between the content in GSH and the infarcted volume (FIG. 4C), which suggested that the degree of GSH consumption was an indication of the magnitude of the tissue lesion after ischemia / perfusion.
2.4. CR-6 atenuó Ia expresión marcadores de inflamación y de daño cerebral2.4. CR-6 attenuated the expression markers of inflammation and brain damage
La isquemia induce Ia expresión de Ia proteína Cox-2 a las 24 h (FIG. 5) y este efecto fue altamente atenuado por CR-6 (FIG. 5). Cox-2 fue principalmente detectado en neuronas (FIG. 5) sugiriendo que el estrés oxidativo está involucrado en Ia inducción de Cox-2 neuronal y que el efecto de CR-6, también directa ó indirectamente alcanza las neuronas.Ischemia induces the expression of Cox-2 protein at 24 h (FIG. 5) and this effect was highly attenuated by CR-6 (FIG. 5). Cox-2 was mainly detected in neurons (FIG. 5) suggesting that oxidative stress is involved in the induction of neuronal Cox-2 and that the effect of CR-6, also directly or indirectly reaches neurons.
2.5. Relación de Ia hiperemia reactiva después de una isquemia transitoria y volumen infartado.2.5 Relationship of reactive hyperemia after transient ischemia and infarcted volume.
El estudio de Ia perfusión cortical antes (basal), durante y después de Ia isquemia, demostró que algunas ratas muestran valores de flujo sanguíneo en Ia reperfusión muy similar a los valores básales, mientras que otras ratas muestran valores muy por encima de los básales. En el grupo vehículo (n=18), se encontró una relación entre el grado de incremento del flujo sanguíneo a Ia reperfusión y el volumen infartado, ya que el logaritmo de estos valores está positivamente correlacionado (p<0.002) (FIG. 6A). Esto indica que el aumento del flujo sanguíneo en Ia reperfusión por encima de los niveles básales (i.e hiperemia reactiva) se asocia a una mayor extensión del volumen infartado. Sin embargo, no se encontró relación entre el desarrollo de Ia hiperemia reactiva y Ia bajada del flujo sanguíneo durante Ia isquemia, indicando que Ia magnitud de Ia hiperemia no depende del grado de caída de flujo durante Ia isquemia. La hiperperfusión se definió como un aumento de flujo superior al 20% del basal, por encima de Ia cual se consideró que las ratas mostraban hiperemia reactiva (para referirse a este término, en Ia presente invención también se utiliza el término hiperperfusión) (FIG. 6B). La media ±desviación estándar (DE) de flujo sanguíneo durante Ia isquemia fue similar en el grupo de ratas con hiperemia (44.1±17.5 % del flujo basal) que en el grupo sin ella (53.4±10.7 % del flujo basal). Entonces los volúmenes infartados fueron comparados en función de Ia presencia o ausencia de hiperemia reactiva, de acuerdo con nuestra definición. El volumen infartado (valor medio±SD) fue más extenso (p≤0.01 ) en el grupo de ratas que mostró hiperemia (162.7±56.6) que en el grupo que no mostró hiperemia (81.7±45.5 mm3) (FIG. 6C). Además, Ia valoración neurológica (valor medio±SD) fue peor (p<0.05) en el grupo con hiperemia (5.4±1.5 puntos) que en el no-hiperémico (3.6±1.3 puntos). (FIG. 6D). La hiperemia se refiere a Ia hiperperfusión cortical ya que con Ia sonda del láser Doppler se midió el flujo de sanguíneo cortical. De acuerdo con esto, el infarto cortical (valor medio±SD) fue más extenso (p≤0.01 ) en el grupo hiperémico (93.7±48.4 mm3) que en el no hiperémico (17.6±16.0 mm3) (FIG. 6E). En cambio, no se encontraron diferencias significativas en el volumen infartado (valor medio±SD) entre el estriado del grupo con hiperemia (67.4±17.8 mm3) y el grupo no hiperémico (56.5±28.4 mm3) (FIG. 6F). Estos resultados sugieren que Ia hiperemia cortical en Ia reperfusión tiene valor predictivo de Ia exacerbación del daño cortical por reperfusión y por Io tanto es un marcador de daño de Ia reperfusión.The study of cortical perfusion before (baseline), during and after ischemia, showed that some rats show blood flow values in reperfusion very similar to baseline values, while other rats show values well above baseline. In the vehicle group (n = 18), a relationship was found between the degree of increase in blood flow to reperfusion and infarcted volume, since the logarithm of these values is positively correlated (p <0.002) (FIG. 6A) . This indicates that the increase in blood flow in reperfusion above baseline levels (ie reactive hyperemia) is associated with a greater extent of infarcted volume. Without However, no relationship was found between the development of reactive hyperemia and the decrease in blood flow during ischemia, indicating that the magnitude of the hyperemia does not depend on the degree of flow drop during ischemia. Hyperperfusion was defined as a flow increase greater than 20% of the baseline, above which it was considered that the rats showed reactive hyperemia (to refer to this term, the term hyperperfusion is also used in the present invention) (FIG. 6B). The mean ± standard deviation (SD) of blood flow during ischemia was similar in the group of rats with hyperemia (44.1 ± 17.5% of basal flow) than in the group without it (53.4 ± 10.7% of baseline flow). Then the infarcted volumes were compared according to the presence or absence of reactive hyperemia, according to our definition. The infarcted volume (mean value ± SD) was more extensive (p≤0.01) in the group of rats that showed hyperemia (162.7 ± 56.6) than in the group that did not show hyperemia (81.7 ± 45.5 mm 3 ) (FIG. 6C) . In addition, the neurological assessment (mean value ± SD) was worse (p <0.05) in the group with hyperemia (5.4 ± 1.5 points) than in the non-hyperemic group (3.6 ± 1.3 points). (FIG. 6D). Hyperemia refers to cortical hyperperfusion since the cortical blood flow was measured with the Doppler laser probe. Accordingly, cortical infarction (mean value ± SD) was more extensive (p≤0.01) in the hyperemic group (93.7 ± 48.4 mm 3 ) than in the non-hyperemic group (17.6 ± 16.0 mm 3 ) (FIG. 6E) . In contrast, no significant differences were found in the infarcted volume (mean value ± SD) between the striatum of the hyperemia group (67.4 ± 17.8 mm 3 ) and the non-hyperemic group (56.5 ± 28.4 mm 3 ) (FIG. 6F). These results suggest that cortical hyperemia in reperfusion has a predictive value of exacerbation of cortical damage due to reperfusion and is therefore a marker of reperfusion damage.
2.6. CR-6 es protector en aquellos animales que muestran hiperemia reactiva2.6. CR-6 is protective in those animals that show reactive hyperemia
Tomando todos los animales juntos (n=33), Ia incidencia de hiperemia fue del 62%. No obstante, Ia hiperemia no fue equitativamente distribuida en los dos grupos. Así, Ia hiperemia fue retrospectivamente encontrada en el 72% de las ratas asignadas en el grupo vehículo (n=18) mientras que sólo fue del 50% en el grupo del CR-6 (n=14) las que Ia habían desarrollado. El aumento de Ia perfusión en los grupos hiperémicos fue similar entre el grupo del CR- 6 y el del vehículo (FIG. 7A). Además, el grado de caída del flujo sanguíneo durante Ia isquemia fue similar en todos los grupos (FIG. 7B). En el grupo de animales que fueron tratados con CR-6, el volumen infartado (valor medio±SD) fue similar tanto si previamente habían desarrollado hiperemia (85.7±39.2 mm3) como si no Ia habían desarrollado (73.8±40.6 mm3) (FIG. 7C). Sin embargo, las ratas hiperémicas tratadas con CR-6 mostraron una reducción del volumen infartado (p≤0.01 ) respecto a las ratas hiperémicas tratadas con vehículo (FIG. 7C). En cambio el volumen de infarto fue similar en Ia ratas no hiperémicas tratadas con CR-6 ó vehículo (FIG. 7C).Taking all the animals together (n = 33), the incidence of hyperemia was 62%. However, hyperemia was not evenly distributed in the two groups. Thus, hyperemia was retrospectively found in 72% of the rats assigned in the vehicle group (n = 18) while only 50% in the CR-6 group (n = 14) had developed them. The increase in perfusion in the hyperemic groups was similar between the CR-6 group and the vehicle group (FIG. 7A). In addition, the degree of blood flow drop during ischemia was similar in all groups (FIG. 7B). In the group of animals that were treated with CR-6, the infarcted volume (mean value ± SD) was similar both if they had previously developed hyperemia (85.7 ± 39.2 mm 3 ) or if they had not developed (73.8 ± 40.6 mm 3 ) (FIG. 7C). However, hyperemic rats treated with CR-6 showed a reduction in infarcted volume (p≤0.01) compared to vehicle-treated hyperemic rats (FIG. 7C). In contrast, the volume of infarction was similar in non-hyperemic rats treated with CR-6 or vehicle (FIG. 7C).
Resultados similares se encontraron para Ia valoración neurológica, ya que las ratas hiperémicas tratadas con CR-6 tenían un déficit neurológico menor que aquellas que recibieron vehículo. Sin embargo no hubo grandes diferencias en Ia valoración entre las ratas no hiperémicas tratadas con CR-6 o con vehículo (FIG. 7D). La proteína CR-6 protegió de una manera más efectiva el córtex (i.e Ia región que desarrolló más lesión con Ia hiperemia) que el estriado (FIG. 7E, F). Estos resultados mostraron que CR-6 protegió de manera más efectiva a las ratas hiperémicas que a las no hiperémicas, sugiriendo que éste antioxidante ejerce más efecto en condiciones en las que aparecen signos de lesión por reperfusión como se ha visto en el córtex en el presente modelo experimental.Similar results were found for neurological assessment, since the hyperemic rats treated with CR-6 had a lower neurological deficit than those who received vehicle. However, there were no large differences in the assessment between non-hyperemic rats treated with CR-6 or with vehicle (FIG. 7D). The CR-6 protein protected the cortex more effectively (i.e. the region that developed more lesion with hyperemia) than the striatum (FIG. 7E, F). These results showed that CR-6 more effectively protected hyperemic than non-hyperemic rats, suggesting that this antioxidant exerts more effect under conditions where signs of reperfusion injury appear as seen in the cortex here. experimental model.
2.7. CR-6 atenúa las alteraciones de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica2.7. CR-6 attenuates the changes in the permeability of the blood brain barrier
Los animales con hiperemia desarrollaron alteraciones de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica, BHE (BBB, de las siglas en inglés), según se observó con extravasación de Evans Blue (FIG. 8). La extravasación de Evans Blue tendió a ser menor después de Ia administración de CR-6. Las diferencias que se vieron con el grupo vehículo no fueron significativas. Los signos de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica no se observaron en todas las ratas.Animals with hyperemia developed alterations of the blood brain barrier permeability, BHE (BBB), as observed with Evans Blue extravasation (FIG. 8). The extravasation of Evans Blue tended to be less after the administration of CR-6. The differences that were seen with the vehicle group were not significant. The signs of the permeability of the blood brain barrier were not observed in all rats.
2.8. CR-6 reduce Ia infiltración de neutrófilos2.8. CR-6 reduces neutrophil infiltration
La expresión de mieloperoxidasa (MPO) se examinó para valorar Ia infiltración de neutrófilos al tejido lesionado. En los animales hiperémicos se detectó un aumento en Ia infiltración de neutrófilos comparado con los no hiperémicos. El número de células MPO-positivas (MPO+) por área fue mayor en el grupo vehículo que en el grupo CR-6. Se demuestra que los individuos que no sufren hiperemia tienen menor número de células MPO+ que los individuos que sí que han sufrido una hiperemia.The expression of myeloperoxidase (MPO) was examined to assess the infiltration of neutrophils into the injured tissue. In hyperemic animals, an increase in neutrophil infiltration was detected compared to non-hyperemic ones. The number of MPO-positive cells (MPO +) per area was higher in the vehicle group than in the CR-6 group. It is shown that individuals who do not suffer from hyperemia have fewer MPO + cells than individuals who have suffered from hyperemia.
2.9. CR-6 atenuó el estrés oxidativo en Ia ACM aislada.2.9. CR-6 attenuated oxidative stress in isolated ACM.
Se procedió con el aislamiento de Ia ACM de ratas tratadas con CR-6 o con vehículo a las 24 h post-isquemia. Comparado con las ratas operadas del grupo control, Ia isquemia transitoria indujo Ia formación de superóxido (que detectamos con Ia técnica de dihidroetidio; DHE) en Ia ACM en el grupo vehículo (FIG. 10), mientras que el CR-6 inhibió Ia formación de superóxido en Ia ACM.The ACM was isolated from rats treated with CR-6 or with a vehicle at 24 h post-ischemia. Compared to the rats operated in the control group, transient ischemia induced the formation of superoxide (which we detected with the dihydroetide technique; DHE) in the ACM in the vehicle group (FIG. 10), while CR-6 inhibited the formation of superoxide in the ACM.
En base a todos estos hallazgos, se concluye que Ia hiperemia reactiva a una temprana reperfusión es un signo de lesión por reperfusión. Dado el beneficio de Ia supresión prolongada del estrés oxidativo después de Ia reperfusión que hemos descrito aquí, tenemos Ia hipótesis de que una isquemia transitoria puede inducir alteraciones del flujo sanguíneo cerebral que se producen durante varias horas después de Ia reperfusión y que pueden contribuir significativamente a Ia lesión por reperfusión. La hiperperfusión en Ia reperfusión post-isquémica no es un fenómeno que ocurre sólo en ratas, ya que algunos pacientes pueden desarrollar una hiperperfusión después una trombólisis con rt-PA (Kidwell et al.2001. Los resultados que se muestran en Ia presente invención muestran que sólo algunos individuos (ratas) que desarrollan hiperperfusión son diana para el tratamiento con antioxidantes, Io que significa que los efectos beneficiosos delBased on all these findings, it is concluded that reactive hyperemia at an early reperfusion is a sign of reperfusion injury. Given the benefit of prolonged suppression of oxidative stress after reperfusion that we have described here, we have the hypothesis that a transient ischemia can induce alterations of cerebral blood flow that occur for several hours after reperfusion and that can contribute significantly to The reperfusion injury. Hyperperfusion in post-ischemic reperfusion is not a phenomenon that occurs only in rats, since some patients may develop hyperperfusion after thrombolysis with rt-PA (Kidwell et al. 2001. The results shown in the present invention show that only some individuals (rats) who develop hyperperfusion are targeted for antioxidant treatment, which means that the beneficial effects of
CR-6 en Ia afectación neurológica y el volumen infartado sólo se dieron en esos animales, pero no en animales que no desarrollaron hiperperfusión en Ia reperfusión ó en animales que no presentaron reperfusión.CR-6 in neurological involvement and infarct volume only occurred in these animals, but not in animals that did not develop hyperperfusion in reperfusion or in animals that did not have reperfusion.
En conclusión, los presentes resultados muestran que el antioxidante CR-6 es protector en Ia isquemia/reperfusión en ratas, que esta protección es especifica para un subgrupo de animales que desarrollaron hiperemia en el momento de Ia reperfusión, que el daño cerebral fue mayor en esos animales comparado con los animales que no mostraron hiperperfusión, que el tratamiento con antioxidante se debe mantener durante varias horas después de Ia reperfusión y que CR-6 confiere beneficios en Ia interfase entre Ia sangre y el cerebro previniendo Ia generación de estrés oxidativo y nitrosativo en los vasos sanguíneos y previniendo el colapso o ruptura de Ia BHE. In conclusion, the present results show that the antioxidant CR-6 is protective in ischemia / reperfusion in rats, that this protection is specific for a subgroup of animals that developed hyperemia at the time of reperfusion, that brain damage was greater in those animals compared to animals that did not show hyperperfusion, that the antioxidant treatment should be maintained for several hours after reperfusion and that CR-6 confers benefits in the interface between the blood and the brain preventing the generation of oxidative and nitrosative stress in the blood vessels and preventing the collapse or rupture of the BHE.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un compuesto de fórmula general I,1. Use of a compound of general formula I,
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0001
donde Ri y R4 son iguales o diferentes y se seleccionan de entre H ó un alquilo (Ci-C4); R2 y R3 son iguales o diferentes y se selecciona de entre H, OH, un alquilo (CrC4) o un alcoxilo (O-(CrC4));where Ri and R 4 are the same or different and are selected from H or an alkyl (Ci-C 4 ); R2 and R3 are the same or different and are selected from H, OH, an alkyl (CrC 4 ) or an alkoxy (O- (C r C 4 ));
R5 se selecciona de entre H y un grupo alquilo (CrC4) y R6 es un grupo alquilo (C1-C10),R5 is selected from H and an alkyl group (CrC 4 ) and R 6 is a (C1-C10) alkyl group,
para Ia elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión post-isquémica, donde el flujo sanguíneo al inicio de Ia reperfusión es igual o superior a un 20 % del valor basal,for the preparation of a medicament for the treatment of an injury caused by a post-ischemic reperfusion, where the blood flow at the beginning of the reperfusion is equal to or greater than 20% of the baseline value,
2. Uso del compuesto según Ia reivindicación 1 donde Ri es H, R2 es un alcoxilo (0-(Ci)), R3 es un hidroxilo, R4 es H, R5 es un grupo alquilo (CrC4) y R6 es un grupo alquilo (CrC4)2. Use of the compound according to claim 1 wherein Ri is H, R 2 is an alkoxy (0- (Ci)), R3 is a hydroxyl, R 4 is H, R 5 is an alkyl group (CrC 4 ) and R 6 it is an alkyl group (CrC 4 )
3. Uso del compuesto según Ia reivindicación 2, donde R5 y R6 son un grupo metilo.3. Use of the compound according to claim 2, wherein R 5 and R 6 are a methyl group.
4. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ia reperfusión post-isquémica es cerebral. 4. Use of the compound according to any of claims 1 to 3, wherein the post-ischemic reperfusion is cerebral.
5. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral o parenteral.5. Use of the compound according to any of claims 1 to 4, wherein the medicament is presented in a form adapted to oral or parenteral administration.
6. Uso del compuesto según Ia reivindicación 5, donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral.6. Use of the compound according to claim 5, wherein the medicament is presented in a form adapted to oral administration.
7. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el medicamento incluye al menos un excipiente farmacológicamente aceptable.7. Use of the compound according to any one of claims 1 to 6, wherein the medicament includes at least one pharmacologically acceptable excipient.
8. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el medicamento incluye al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.8. Use of the compound according to any one of claims 1 to 7, wherein the medicament includes at least one pharmacologically acceptable carrier.
9. Uso del compuesto según Ia reivindicación 8, donde el vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia grasa y el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral.9. Use of the compound according to claim 8, wherein the pharmacologically acceptable carrier is a fatty substance and the medicament is presented in a form adapted to oral administration.
10. Uso del compuesto según Ia reivindicación 9 donde Ia sustancia grasa es aceite de oliva.10. Use of the compound according to claim 9 wherein the fatty substance is olive oil.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el medicamento comprende además otra sustancia activa.11. Use according to any of claims 1 to 10, wherein the medicament further comprises another active substance.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde el medicamento se administra en dos tomas de 100 mg de compuesto por kilogramo de peso corporal, por vía oral.12. Use according to any one of claims 1 to 11, wherein the medicament is administered in two doses of 100 mg of compound per kilogram of body weight, orally.
13. Uso según Ia reivindicación 12, donde Ia primera toma se administra a partir de entre el momento en el que se produce Ia reperfusión y 60 minutos después del inicio de Ia reperfusión. 13. Use according to claim 12, wherein the first shot is administered from the moment the reperfusion occurs and 60 minutes after the start of the reperfusion.
14. Uso según Ia reivindicación 13, donde Ia primera toma se administra a partir de entre 15 y 45 minutos después del inicio de Ia reperfusión.14. Use according to claim 13, wherein the first shot is administered from 15 to 45 minutes after the start of reperfusion.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde las dos tomas se administran con una diferencia de tiempo de entre 4 y 8 horas. 15. Use according to any of claims 12 to 14, wherein the two shots are administered with a time difference of between 4 and 8 hours.
PCT/ES2010/070135 2009-03-20 2010-03-09 Use of a compound for the treatment of a lesion produced by postischemic reperfusion WO2010106209A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200900756A ES2345378B1 (en) 2009-03-20 2009-03-20 USE OF A COMPOUND FOR THE PREPARATION OF A MEDICINAL PRODUCT INTENDED FOR THE TREATMENT OF AN INJURY CAUSED BY A POST-ISCHEMIC REPERFUSION.
ESP200900756 2009-03-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010106209A1 true WO2010106209A1 (en) 2010-09-23

Family

ID=42697139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2010/070135 WO2010106209A1 (en) 2009-03-20 2010-03-09 Use of a compound for the treatment of a lesion produced by postischemic reperfusion

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2345378B1 (en)
WO (1) WO2010106209A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016190852A1 (en) * 2015-05-26 2016-12-01 Stealth Peptides International, Inc. Therapeutic compositions including chromanyl compounds, variants and analogues thereof, and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877810A (en) * 1988-02-05 1989-10-31 Eastman Kodak Company Protection of heart tissue from reperfusion injury
EP1066832A1 (en) * 1998-02-06 2001-01-10 Cci Corporation Preventives and remedies for ischemic reflow disorder
EP1987829A1 (en) * 2006-02-20 2008-11-05 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd Prophylactic or therapeutic agent for cerebral ischemia or cerebral ischemic reperfusion injury in stroke

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877810A (en) * 1988-02-05 1989-10-31 Eastman Kodak Company Protection of heart tissue from reperfusion injury
EP1066832A1 (en) * 1998-02-06 2001-01-10 Cci Corporation Preventives and remedies for ischemic reflow disorder
EP1987829A1 (en) * 2006-02-20 2008-11-05 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd Prophylactic or therapeutic agent for cerebral ischemia or cerebral ischemic reperfusion injury in stroke

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016190852A1 (en) * 2015-05-26 2016-12-01 Stealth Peptides International, Inc. Therapeutic compositions including chromanyl compounds, variants and analogues thereof, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ES2345378B1 (en) 2011-07-21
ES2345378A1 (en) 2010-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2922501T3 (en) Use of oxygenated cholesterol sulfates (OCS) for the treatment of renal dysfunction
ES2517340T3 (en) Treatment of portal hypertension using L-ornithine and phenylacetate
ES2664594T3 (en) Medium chain fatty acids and glycerides as nephroprotective agents
Wakade et al. Curcumin attenuates vascular inflammation and cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in mice
Zhang et al. Emulsified isoflurane preconditioning protects against liver and lung injury in rat model of hemorrhagic shock
ES2614490T3 (en) Medical use of the antioxidant and radical scavenger alpha 1-microglobulin
ES2738914T3 (en) Hypotonic aqueous composition with low chloride content, with or without phospholipids
CN103561770A (en) Lipoyl compounds and their use for treating ischemic injury
Liao et al. Delayed treatment with NSC23766 in streptozotocin-induced diabetic rats ameliorates post-ischemic neuronal apoptosis through suppression of mitochondrial p53 translocation
JP4971150B2 (en) Aequorin-containing composition and method of use thereof
Gu et al. Rosiglitazone attenuates early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage in rats
ES2913946T3 (en) Peptide and its use in the treatment of inflammatory disorders
ES2345378B1 (en) USE OF A COMPOUND FOR THE PREPARATION OF A MEDICINAL PRODUCT INTENDED FOR THE TREATMENT OF AN INJURY CAUSED BY A POST-ISCHEMIC REPERFUSION.
CN110339232A (en) A kind of Chinese medicine composition prevented and/or treat ischemical reperfusion injury
CA3094187C (en) Medicaments and uses in treatment of cancer and other pathological conditions associated with aging
ES2788697T3 (en) Methods and compositions for safe and effective thrombolysis
ES2353606T3 (en) USE OF THE COMBINATION THAT INCLUDES TEMOZOLOMIDE AND TNF-ALFA FOR THE TREATMENT OF GIOBLASTOMA.
WO2017161155A1 (en) Methods for preventing or treating parkinson&#39;s disease by the farnesylation of paris
ES2898240A1 (en) NAD + precursors for use in the prevention and/or treatment of hereditary aortic aneurysms (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)
ES2351005B1 (en) USE OF CARBONIC ANHYDRASE II FOR THE PREPARATION OF A MEDICINAL PRODUCT.
ES2912350B2 (en) NEW TREATMENT FOR COLORECTAL CANCER
Chen et al. Female-sensitive multifunctional phytoestrogen nanotherapeutics for tailored management of postmenopausal Alzheimer's disease
Lin et al. Ginsenoside Rg1 Alleviates Rat Liver Ischemia-Reperfusion Ischemia Through Mitochondrial Autophagy Pathway.
BR112020013318A2 (en) use of a compound of formula i or a deuterated compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of small cerebral vessel disease in a patient
US11576945B2 (en) Treatment for ischemic stroke

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10753156

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10753156

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1