WO2010104176A1 - Mega-phosphoprotein cleavage inhibitor - Google Patents
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Abstract
Disclosed is an ameliorating agent for renal disorders, which relies on a novel mechanism, i.e., the inhibition of the cleavage of a mega-phosphoprotein. A substance capable of inhibiting a signal peptide peptidase or a ?-secretase is useful as a mega-phosphoprotein cleavage inhibitor, and can suppress only signaling-related negative functions of a mega-phosphoprotein specifically. Therefore, the substance can be used as a therapeutic/prophylactic agent for diseases associated with the cleavage of a mega-phosphoprotein, particularly renal diseases, which has few adverse side effects.
Description
本発明は、メガリンタンパクの切断に関する実験を行うための試薬やメガリンタンパクの切断により媒介される疾患を治療するための薬剤等に有用なメガリンタンパク切断阻害剤に関する。
The present invention relates to a megalin protein cleavage inhibitor useful as a reagent for conducting an experiment relating to the cleavage of megalin protein, a drug for treating a disease mediated by the cleavage of megalin protein, and the like.
メガリン(Megalin)は、Low-density lipoprotein (LDL)受容体ファミリーの１員であって、近位尿細管上皮細胞の細胞膜上に局在し、分子量が約６００ＫＤaの糖タンパク質である。メガリンは、４６５５個のアミノ酸（ヒトメガリン）、又は４６６０個のアミノ酸（ラットメガリン）から成る、Ｎ末側を細胞外に位置する巨大な細胞膜タンパク質であって、４つの機能的ドメインを有する巨大な細胞外領域と、それに続く（単一の細胞膜貫通領域を介して）短い細胞内領域から構成されている。
メガリンは腎疾患などに関与する抗原であることが知られており、腎疾患などの発症機序の解明などのためにメガリンの挙動や機能が着目され、メガリンについての種々の実験が行われている。これらのうち、特許文献１には、メガリンが腎症患者の尿中に排泄されることに着目し、その量を定量することにより、腎疾患などの病気を診断することが記載されている。 Megalin is a member of the low-density lipoprotein (LDL) receptor family, and is a glycoprotein having a molecular weight of about 600 KDa that is localized on the plasma membrane of proximal tubular epithelial cells. Megalin is a large cell membrane protein consisting of 4655 amino acids (human megalin) or 4660 amino acids (rat megalin) and located outside the N-terminal side, and is a large cell having four functional domains. It consists of an outer region followed by a short intracellular region (via a single transmembrane region).
Megalin is known to be an antigen involved in kidney diseases, etc., and the behavior and functions of megalin are focused on elucidating the onset mechanism of kidney diseases, and various experiments on megalin are being conducted. Yes. Among these, Patent Literature 1 describes that megalin is excreted in the urine of a nephropathy patient and diagnoses diseases such as kidney disease by quantifying the amount.
メガリンは腎疾患などに関与する抗原であることが知られており、腎疾患などの発症機序の解明などのためにメガリンの挙動や機能が着目され、メガリンについての種々の実験が行われている。これらのうち、特許文献１には、メガリンが腎症患者の尿中に排泄されることに着目し、その量を定量することにより、腎疾患などの病気を診断することが記載されている。 Megalin is a member of the low-density lipoprotein (LDL) receptor family, and is a glycoprotein having a molecular weight of about 600 KDa that is localized on the plasma membrane of proximal tubular epithelial cells. Megalin is a large cell membrane protein consisting of 4655 amino acids (human megalin) or 4660 amino acids (rat megalin) and located outside the N-terminal side, and is a large cell having four functional domains. It consists of an outer region followed by a short intracellular region (via a single transmembrane region).
Megalin is known to be an antigen involved in kidney diseases, etc., and the behavior and functions of megalin are focused on elucidating the onset mechanism of kidney diseases, and various experiments on megalin are being conducted. Yes. Among these, Patent Literature 1 describes that megalin is excreted in the urine of a nephropathy patient and diagnoses diseases such as kidney disease by quantifying the amount.
一方、近年メガリンタンパクはNotchやAPPといった他の一回膜貫通タンパクと同様な機序で切断を受けることが示唆されている。この切断は細胞外部分の1段階目の切断とそれに引き続く、膜貫通部分の2段階目の切断によるものと考えられている。メガリンが切断される生体における意義は未だ明らかとなっていないものの、Notchと同様、膜貫通部分での切断によって生じる細胞内領域を含むメガリンC末断片が細胞シグナルを伝える機能を有していることが示唆されている。（非特許文献１）
On the other hand, it has recently been suggested that megalin protein is cleaved by the same mechanism as other single-transmembrane proteins such as Notch and APP. This cleavage is thought to be due to the first step of the extracellular portion followed by the second step of the transmembrane portion. Although the significance of megalin cleaving in the living body has not been clarified yet, like Notch, the megalin C-terminal fragment containing the intracellular region generated by cleavage at the transmembrane portion has a function to transmit cell signals Has been suggested. (Non-Patent Document 1)
また、メガリンC末端側の細胞内領域には3箇所のNPXYモチーフがあり、メガリンタンパクの細胞内取り込みに重要であることが推測されている。最C末端側にはPDZ-bindingモチーフがあり、またDab2、Meg BPなどのメガリンの細胞内ドメインに結合するアダプター分子も同定され、このような分子がメガリンタンパクのそのものの機能、もしくはシグナル伝達の制御に関与することが推定されている。（非特許文献２）
In addition, there are three NPXY motifs in the intracellular region on the C-terminal side of megalin, which is presumed to be important for intracellular uptake of megalin protein. There is a PDZ-binding motif on the most C-terminal side, and adapter molecules that bind to the intracellular domain of megalin such as Dab2 and Meg BP have also been identified. It is estimated to be involved in control. (Non-Patent Document 2)
NotchやAPPといった一回膜貫通型タンパクを切断する酵素としては、プレセニリンタンパクを酵素本体にもつγ－セクレターゼが知られている。Selkoeらはプレセニリンタンパクの詳細な解析を行い、プレセニリン膜貫通部位の２箇所のアスパラギン酸をアラニンに置換することでγ－セクレターゼの抑制効果が得られることを示し、プレセニリンが新規の膜貫通型アスパルチルプロテアーゼであることを報告した。（非特許文献３）
プレセニリンは推定で8回膜貫通型のタンパクであり、APPからのアミロイドβタンパクの産生を調節している。プレセニリンに変異が入り異常が生じると、アミロイドβのうち、アルツハイマー病の発症の原因と推定されているアミロイドβ４２の産生が亢進し神経細胞死を助長することが明らかとなっている。こうしたことから、γ－セクレターゼの阻害剤は、アルツハイマー病の治療薬になる可能性が高いと考えられており、精力的にγ－セクレターゼ阻害剤の開発が進められている。（非特許文献４） As an enzyme that cleaves a single transmembrane protein such as Notch and APP, γ-secretase having a presenilin protein in the enzyme body is known. Selkoe et al. Conducted a detailed analysis of the presenilin protein and showed that substituting aspartic acid at two presenilin transmembrane sites with alanine can provide an inhibitory effect on γ-secretase. Presenilin is a novel transmembrane aspa Reported to be rutile protease. (Non Patent Literature 3)
Presenilin is a putative eight-transmembrane protein that regulates the production of amyloid β protein from APP. It has been clarified that when a mutation occurs in presenilin and an abnormality occurs, the production of amyloid β42, which is estimated to be the cause of the onset of Alzheimer's disease, is increased in amyloid β and promotes neuronal cell death. For these reasons, it is considered that inhibitors of γ-secretase are likely to be therapeutic agents for Alzheimer's disease, and γ-secretase inhibitors are being actively developed. (Non-Patent Document 4)
プレセニリンは推定で8回膜貫通型のタンパクであり、APPからのアミロイドβタンパクの産生を調節している。プレセニリンに変異が入り異常が生じると、アミロイドβのうち、アルツハイマー病の発症の原因と推定されているアミロイドβ４２の産生が亢進し神経細胞死を助長することが明らかとなっている。こうしたことから、γ－セクレターゼの阻害剤は、アルツハイマー病の治療薬になる可能性が高いと考えられており、精力的にγ－セクレターゼ阻害剤の開発が進められている。（非特許文献４） As an enzyme that cleaves a single transmembrane protein such as Notch and APP, γ-secretase having a presenilin protein in the enzyme body is known. Selkoe et al. Conducted a detailed analysis of the presenilin protein and showed that substituting aspartic acid at two presenilin transmembrane sites with alanine can provide an inhibitory effect on γ-secretase. Presenilin is a novel transmembrane aspa Reported to be rutile protease. (Non Patent Literature 3)
Presenilin is a putative eight-transmembrane protein that regulates the production of amyloid β protein from APP. It has been clarified that when a mutation occurs in presenilin and an abnormality occurs, the production of amyloid β42, which is estimated to be the cause of the onset of Alzheimer's disease, is increased in amyloid β and promotes neuronal cell death. For these reasons, it is considered that inhibitors of γ-secretase are likely to be therapeutic agents for Alzheimer's disease, and γ-secretase inhibitors are being actively developed. (Non-Patent Document 4)
一方、Martoglioらはプレセニリンと類似の膜貫通型アスパルチルプロテアーゼとしてシグナルペプチドペプチダーゼを同定した。（非特許文献５）さらに、シグナルペプチドペプチダーゼの臓器別の発現を詳細についても詳細に解析され、特に肝臓および腎臓に高発現していることが明らかにされた。（非特許文献６）
On the other hand, Martoglio et al. Identified a signal peptide peptidase as a transmembrane aspartyl protease similar to presenilin. (Non-patent document 5) Furthermore, the expression of the signal peptide peptidase for each organ was also analyzed in detail, and it was revealed that the expression was particularly high in the liver and kidney. (Non-patent document 6)
プレセニリンとシグナルペプチドペプチダーゼの推定構造から基質の膜配向性についても解析が進められている。プレセニリンはC末端が細胞質側に配向したＩ型膜タンパクを、シグナルペプチドペプチダーゼはN末端が細胞質側に配向したII型膜タンパクをそれぞれ切断する可能性を示唆させる文献報告がなされている一方で、シグナルペプチドペプチダーゼにはプレセニリンと同一の膜配向性をもつタイプがあることも示唆されており、どのような機序で膜タンパクの切断に関わるのかは、未だ明らかではない。（非特許文献７）
Analysis of the membrane orientation of the substrate is also underway from the presumed structures of presenilin and signal peptide peptidase. While presenilin is a type I membrane protein whose C-terminal is oriented to the cytoplasm side, and signal peptide peptidase has been reported to suggest the possibility of cleaving a type II membrane protein whose N-terminus is oriented to the cytoplasm, It has also been suggested that there are types of signal peptide peptidases with the same membrane orientation as presenilin, and it is not yet clear what mechanism is involved in membrane protein cleavage. (Non-patent document 7)
プレセニリンとシグナルペプチドペプチダーゼの関連性は明らかとなってはいないが、アルツハイマー病治療薬として開発が進められているγ－セクレターゼ阻害剤がプレセニリンのみならずシグナルペプチドペプチダーゼに対しても阻害活性を有する可能性を示す報告が近年なされている。Fuwaらの報告によると、γ－セクレターゼ阻害剤の構造活性相関を解析しており、(N-[N-(3,5-difluorophenylacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine tert-butyl ester (DAPT)はプレセニリンのみの阻害活性を有している一方、 (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorophenyl)acetylamino]-N-(5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propionamide (DBZ)や (2S)-2-{[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]amino}-N-[(3S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]propanamide (Compound E)には、プレセニリンとシグナルペプチドペプチダーゼの両方の阻害活性があることを明らかにしている。（非特許文献８）
Although the relationship between presenilin and signal peptide peptidase has not been clarified, γ-secretase inhibitors being developed as therapeutic agents for Alzheimer's disease may have inhibitory activity not only on presenilin but also on signal peptide peptidases Reports showing sex have been made in recent years. According to a report by Fuwa et al., The structure-activity relationship of γ-secretase inhibitor was analyzed, and (N- [N- (3,5-difluorophenylacetyl) -L-alanyl]-(S) -phenylglycine tert-butyl ester (DAPT) has inhibitory activity only for presenilin, while (S, S) -2- [2- (3,5-Difluorophenyl) acetylamino] -N- (5-methyl-6-oxo-6, 7-dihydro-5H-dibenzo [b, d] azepin-7-yl) propionamide (DBZ) and (2S) -2-{[(3,5-Difluorophenyl) acetyl] amino} -N-[(3S)- 1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl] propanamide (Compound E) has inhibitory activity on both presenilin and signal peptide peptidase (Non-patent Document 8)
文献記載中、推定ではあるが、メガリンタンパクの膜貫通部位にγ－セクレターゼにより切断を受ける位置が存在するとの報告もなされている。（非特許文献２）しかしながら、プレセニリンやシグナルペプチドペプチダーゼがメガリンタンパクの切断に関わるのか否か、またメガリンタンパク切断と病態との関わりについては明らかにはなっていない。
In the literature description, it is estimated that there is a report that there is a position that is cleaved by γ-secretase at the transmembrane site of megalin protein. (Non-patent document 2) However, it is not clear whether presenilin and signal peptide peptidase are involved in the cleavage of megalin protein or the relationship between megalin protein cleavage and pathological conditions.
本発明は、メガリンタンパク切断の阻害という新規機序に基づく腎障害治療薬を提供することを目的とする。
An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for renal injury based on a novel mechanism of inhibiting megalin protein cleavage.
非特許文献９の筆者らは、γ－セクレターゼ阻害活性を有するＤＢＺが腎障害モデルラットにおける尿中アルブミン漏出及び糸球体障害を改善することを根拠に、Notchタンパクの切断阻害が腎障害の治療に重要であると示している。
Based on the fact that DBZ, which has γ-secretase inhibitory activity, improves urinary albumin leakage and glomerular damage in renal injury model rats, the authors of Non-Patent Document 9 show that Notch protein cleavage inhibition is a treatment for renal injury. Indicates that it is important.
しかしながら、本発明者らはNotchタンパク切断阻害よりもむしろメガリン切断阻害がそれに伴う腎障害の改善に重要であることを見出した。すなわち本発明者らは、メガリンタンパク切断片のうち、2段階目切断片が腎尿細管細胞の障害を直接誘導することを確認した上で、γ－セクレターゼを阻害するがシグナルペプチドペプチダーゼを阻害せず、Notchタンパク切断を阻害することも知られるＤＡＰＴ（非特許文献８）の処理によってメガリンタンパクの切断が亢進し、腎障害モデルラットにおける障害がむしろ悪化することを見出し、一方、γ－セクレターゼとシグナルペプチドペプチダーゼの両方を阻害し、Notchタンパク切断を阻害することも知られるＤＢＺ（非特許文献８）の処理によって、メガリンタンパクの切断が阻害され腎障害モデルラットにおける障害が改善することを見出した。以上のことからシグナルペプチドペプチダーゼの阻害がメガリンタンパク切断の阻害に重要な役割を担い、メガリンタンパク切断の阻害に引き続く腎障害改善効果をも示すことを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
However, the present inventors have found that inhibition of megalin cleavage rather than inhibition of Notch protein cleavage is important for the improvement of the associated renal damage. That is, the present inventors confirmed that the second-stage fragment of the megalin protein fragment directly induces renal tubular cell damage and inhibits γ-secretase but not signal peptide peptidase. In addition, the treatment with DAPT (Non-patent Document 8), which is also known to inhibit Notch protein cleavage, found that the cleavage of megalin protein was enhanced, and that the damage in the kidney injury model rats was rather aggravated, while γ-secretase and It was found that treatment of DBZ (Non-patent Document 8), which is known to inhibit both signal peptide peptidases and to inhibit Notch protein cleavage, inhibits megalin protein cleavage and improves damage in renal injury model rats. . Based on the above, we found that inhibition of signal peptide peptidase plays an important role in inhibition of megalin protein cleavage and also has an effect of improving renal damage following inhibition of megalin protein cleavage, and the present invention was completed based on these findings. It came to do.
すなわち、本発明は、シグナルペプチドペプチダーゼ阻害物質を含有することを特徴とする、メガリンタンパク切断阻害剤を提供する。
また、本発明は、γセクレターゼ阻害物質を含有することを特徴とするメガリンタンパク切断阻害剤を提供する。
また、本発明は、分子内にアミド構造を有するメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とするメガリンタンパク切断阻害剤を提供する。
また、本発明は、メガリンタンパク切断阻害剤を含有することを特徴とする腎障害治療薬を提供する。 That is, the present invention provides a megalin protein cleavage inhibitor comprising a signal peptide peptidase inhibitor.
The present invention also provides a megalin protein cleavage inhibitor comprising a γ-secretase inhibitor.
The present invention also provides a megalin protein cleavage inhibitor comprising a megalin protein cleavage inhibitor having an amide structure in the molecule.
In addition, the present invention provides a therapeutic agent for renal injury characterized by containing a megalin protein cleavage inhibitor.
また、本発明は、γセクレターゼ阻害物質を含有することを特徴とするメガリンタンパク切断阻害剤を提供する。
また、本発明は、分子内にアミド構造を有するメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とするメガリンタンパク切断阻害剤を提供する。
また、本発明は、メガリンタンパク切断阻害剤を含有することを特徴とする腎障害治療薬を提供する。 That is, the present invention provides a megalin protein cleavage inhibitor comprising a signal peptide peptidase inhibitor.
The present invention also provides a megalin protein cleavage inhibitor comprising a γ-secretase inhibitor.
The present invention also provides a megalin protein cleavage inhibitor comprising a megalin protein cleavage inhibitor having an amide structure in the molecule.
In addition, the present invention provides a therapeutic agent for renal injury characterized by containing a megalin protein cleavage inhibitor.
メガリンタンパクの切断を阻害する物質は、メガリンタンパクのシグナル伝達に関わる負の機能のみを特異的に抑えることができるため、メガリンタンパク切断に関連する疾患、特に腎疾患に対する副作用の少ない治療／予防薬となる。
A substance that inhibits megalin protein cleavage can specifically suppress only the negative functions related to megalin protein signal transduction, so that it has few side effects on diseases associated with megalin protein cleavage, particularly kidney disease. It becomes.
本発明において、メガリンタンパク切断阻害物質は、メガリンタンパク切断を阻害する活性を有するものであれば、特に制限されず、シグナルペプチドペプチダーゼ阻害活性を有していても、γ－セクレターゼを阻害する活性を有していても良い。
メガリンタンパク切断阻害物質としては分子内にアミド構造を有するものが好ましく、該アミド構造の少なくとも一つの窒素原子と直結した環構造を有し、該環構造が窒素原子を含むものがより好ましい。
また、メガリンタンパク切断阻害物質としては、ポリアミド構造を有するものも好ましく、分子内に芳香族環基をさらに有するものがより好ましい。本発明において、ポリアミド構造とは４以上のアミド構造であるのが好ましく、より好ましくは４～２５のアミド構造であり、さらに好ましくは５～１５のアミド構造であり、最も好ましくは５～８のアミド構造である。
メガリンタンパク切断阻害物質としては、例えばNaunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2008;377(4-6):295-300、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.2007;282(51):36829-36836、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2003;278(19):16528-16533などに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、例えば、ＤＢＺ（非特許文献８）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ（非特許文献８）、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ（非特許文献１１）、ＬＹ４１１５７５（非特許文献１１）、Ｌ－６９５４５８（非特許文献１１）、ＴＢＬ４Ｋ（非特許文献１１）及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅ（非特許文献１１）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、メガリンタンパク切断阻害物質は、ＤＢＺ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ及びＬＹ４１１５７５である。また、ＴＢＬ４Ｋ及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅもメガリンタンパク切断阻害物質として好ましい。 In the present invention, the megalin protein cleavage inhibitor is not particularly limited as long as it has an activity that inhibits megalin protein cleavage, and even if it has a signal peptide peptidase inhibitory activity, it has an activity to inhibit γ-secretase. You may have.
As the megalin protein cleavage inhibitor, those having an amide structure in the molecule are preferred, those having a ring structure directly connected to at least one nitrogen atom of the amide structure, and those containing a nitrogen atom are more preferred.
Moreover, as a megalin protein cleavage inhibitor, what has a polyamide structure is also preferable, and what further has an aromatic ring group in a molecule | numerator is more preferable. In the present invention, the polyamide structure is preferably 4 or more amide structures, more preferably 4 to 25 amide structures, still more preferably 5 to 15 amide structures, and most preferably 5 to 8 amide structures. It is an amide structure.
Examples of megalin protein cleavage inhibitors include Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2008; 377 (4-6): 295-300, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.2007; 282 (51): 36829-36836, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2003; 278 (19): 16528-16533, and the like, but are not limited thereto. Specifically, for example, DBZ (Non-patent document 8), Compound E (Non-patent document 8), NAP-AHW700-NX (Non-patent document 11), LY411575 (Non-patent document 11), L-695458 (Non-patent document) Reference 11), TBL4K (Non-Patent Document 11) and (Z-LL) 2-Ketone (Non-Patent Document 11) are included, but not limited thereto. Preferably, the megalin protein cleavage inhibitors are DBZ, Compound E, NAP-AHW700-NX and LY411575. TBL4K and (Z-LL) 2-Ketone are also preferred as megalin protein cleavage inhibitors.
メガリンタンパク切断阻害物質としては分子内にアミド構造を有するものが好ましく、該アミド構造の少なくとも一つの窒素原子と直結した環構造を有し、該環構造が窒素原子を含むものがより好ましい。
また、メガリンタンパク切断阻害物質としては、ポリアミド構造を有するものも好ましく、分子内に芳香族環基をさらに有するものがより好ましい。本発明において、ポリアミド構造とは４以上のアミド構造であるのが好ましく、より好ましくは４～２５のアミド構造であり、さらに好ましくは５～１５のアミド構造であり、最も好ましくは５～８のアミド構造である。
メガリンタンパク切断阻害物質としては、例えばNaunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2008;377(4-6):295-300、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.2007;282(51):36829-36836、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2003;278(19):16528-16533などに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、例えば、ＤＢＺ（非特許文献８）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ（非特許文献８）、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ（非特許文献１１）、ＬＹ４１１５７５（非特許文献１１）、Ｌ－６９５４５８（非特許文献１１）、ＴＢＬ４Ｋ（非特許文献１１）及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅ（非特許文献１１）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、メガリンタンパク切断阻害物質は、ＤＢＺ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ及びＬＹ４１１５７５である。また、ＴＢＬ４Ｋ及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅもメガリンタンパク切断阻害物質として好ましい。 In the present invention, the megalin protein cleavage inhibitor is not particularly limited as long as it has an activity that inhibits megalin protein cleavage, and even if it has a signal peptide peptidase inhibitory activity, it has an activity to inhibit γ-secretase. You may have.
As the megalin protein cleavage inhibitor, those having an amide structure in the molecule are preferred, those having a ring structure directly connected to at least one nitrogen atom of the amide structure, and those containing a nitrogen atom are more preferred.
Moreover, as a megalin protein cleavage inhibitor, what has a polyamide structure is also preferable, and what further has an aromatic ring group in a molecule | numerator is more preferable. In the present invention, the polyamide structure is preferably 4 or more amide structures, more preferably 4 to 25 amide structures, still more preferably 5 to 15 amide structures, and most preferably 5 to 8 amide structures. It is an amide structure.
Examples of megalin protein cleavage inhibitors include Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2008; 377 (4-6): 295-300, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.2007; 282 (51): 36829-36836, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2003; 278 (19): 16528-16533, and the like, but are not limited thereto. Specifically, for example, DBZ (Non-patent document 8), Compound E (Non-patent document 8), NAP-AHW700-NX (Non-patent document 11), LY411575 (Non-patent document 11), L-695458 (Non-patent document) Reference 11), TBL4K (Non-Patent Document 11) and (Z-LL) 2-Ketone (Non-Patent Document 11) are included, but not limited thereto. Preferably, the megalin protein cleavage inhibitors are DBZ, Compound E, NAP-AHW700-NX and LY411575. TBL4K and (Z-LL) 2-Ketone are also preferred as megalin protein cleavage inhibitors.
上記の具体的なメガリンタンパク切断阻害剤の構造を以下に示す。
The structure of the specific megalin protein cleavage inhibitor is shown below.
上記の具体的な化合物のうち、ＴＢＬ４Ｋ及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅはいずれもシグナルペプチドペプチダーゼに対する阻害作用を示すが、γ－セクレターゼを阻害しないことが知られている。一方、ＤＢＺ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、Ｌ－６８５４５８、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ及びＬＹ４１１５７５はいずれもシグナルペプチドペプチダーゼに対する阻害活性に加えて、γ－セクレターゼに対する阻害活性をも有することが知られている。従って、本発明のメガリンタンパク切断阻害物質は、シグナルペプチドペプチダーゼ阻害物質、及び／又は、γセクレターゼ阻害物質であってもよく、シグナルペプチドペプチダーゼ阻害物質であることが好ましい。
Among the above-mentioned specific compounds, TBL4K and (Z-LL) 2-Ketone both have an inhibitory effect on signal peptide peptidase, but are known not to inhibit γ-secretase. On the other hand, DBZ, Compound E, L-684458, NAP-AHW700-NX and LY411575 are all known to have an inhibitory activity against γ-secretase in addition to an inhibitory activity against signal peptide peptidase. Therefore, the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention may be a signal peptide peptidase inhibitor and / or a γ-secretase inhibitor, and is preferably a signal peptide peptidase inhibitor.
本発明のメガリンタンパク切断阻害物質は、市販品を用いることも可能である。また、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。化学的に合成する方法としては、液相合成法や固相合成法が挙げられる。合成したシグナルペプチドペプチダーゼ阻害物質は通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーや再結晶などの手段によって精製することができる。このような化学合成法、およびそれに続く精製はこの技術分野においてよく知られたものである。
A commercially available product can be used as the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention. Moreover, it can acquire by using well-known methods, such as (1) the method of synthesize | combining chemically, or (2) the method of synthesize | combining by an enzymatic reaction suitably. Examples of the chemical synthesis method include a liquid phase synthesis method and a solid phase synthesis method. The synthesized signal peptide peptidase inhibitor can be purified by usual means such as ion exchange chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, affinity chromatography, recrystallization and the like. Such chemical synthesis methods and subsequent purification are well known in the art.
本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、上記のメガリンタンパク切断阻害物質を単独で又は任意の２種又は３種以上を組み合わせて含有してもよく、さらに、医薬的、生理学的、実験的に許容しうるあらゆる固体又は液体の担体、添加物等を含有させてもよい。
The megalin protein cleavage inhibitor of the present invention may contain the above-mentioned megalin protein cleavage inhibitor alone or in combination of any two or more thereof, and is further acceptable pharmaceutically, physiologically and experimentally. Any solid or liquid carrier, additive, etc. may be included.
上記担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤に、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
Examples of the carrier include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, gelatin, albumin, amino acid, water, and physiological saline. Water etc. are mentioned. Further, if necessary, conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, tonicity agents and the like can be appropriately added to the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention.
上記添加物としては、目的に応じて当該目的に対して通常用いられるものであれば特に制限されないが、具体的には、例えば、香料、糖類、甘味料、食物繊維類、ビタミン類、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、水などが挙げられる。
本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限なしにあらゆる形態で用いることができる。また、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、医薬、医薬部外品、試薬、健康食品等に用いることができる。 The additive is not particularly limited as long as it is usually used for the purpose depending on the purpose. Specifically, for example, flavoring, sugar, sweetener, dietary fiber, vitamins, sodium glutamate Amino acids such as (MSG), nucleic acids such as inosine monophosphate (IMP), inorganic salts such as sodium chloride, and water.
The megalin protein cleavage inhibitor of the present invention can be used in any form without limitation on physical properties such as dry powder, paste, and solution. In addition, the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention can be used in medicines, quasi drugs, reagents, health foods and the like.
本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限なしにあらゆる形態で用いることができる。また、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、医薬、医薬部外品、試薬、健康食品等に用いることができる。 The additive is not particularly limited as long as it is usually used for the purpose depending on the purpose. Specifically, for example, flavoring, sugar, sweetener, dietary fiber, vitamins, sodium glutamate Amino acids such as (MSG), nucleic acids such as inosine monophosphate (IMP), inorganic salts such as sodium chloride, and water.
The megalin protein cleavage inhibitor of the present invention can be used in any form without limitation on physical properties such as dry powder, paste, and solution. In addition, the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention can be used in medicines, quasi drugs, reagents, health foods and the like.
本発明のメガリンタンパク切断阻害剤の使用量は、それぞれの目的に応じて適宜調節されるが、例えば、経口投与で対象に投与される場合には、上記のメガリンタンパク切断阻害物質の合計量として、１回の投与において体重１ｋｇあたり、０．０１ｇ～１０ｇが好ましく、体重１ｋｇあたり、０．１ｇ～１ｇがより好ましい。投与回数は特に制限されず、１日あたり１回～数回投与することができる。
また、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤を、試薬に用いる場合には、１処方あたり０．０００００１ｇ～１０ｇが好ましく、１処方あたり０．００００１ｇ～１ｇがより好ましい。 The amount of the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention is appropriately adjusted according to each purpose. For example, when administered to a subject by oral administration, the total amount of the above megalin protein cleavage inhibitors is used. In a single administration, 0.01 g to 10 g per kg body weight is preferable, and 0.1 g to 1 g per kg body weight is more preferable. The frequency of administration is not particularly limited, and can be administered once to several times per day.
Further, when the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention is used as a reagent, it is preferably 0.000001 g to 10 g per formulation, more preferably 0.00001 g to 1 g per formulation.
また、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤を、試薬に用いる場合には、１処方あたり０．０００００１ｇ～１０ｇが好ましく、１処方あたり０．００００１ｇ～１ｇがより好ましい。 The amount of the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention is appropriately adjusted according to each purpose. For example, when administered to a subject by oral administration, the total amount of the above megalin protein cleavage inhibitors is used. In a single administration, 0.01 g to 10 g per kg body weight is preferable, and 0.1 g to 1 g per kg body weight is more preferable. The frequency of administration is not particularly limited, and can be administered once to several times per day.
Further, when the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention is used as a reagent, it is preferably 0.000001 g to 10 g per formulation, more preferably 0.00001 g to 1 g per formulation.
本発明のメガリンタンパク切断阻害剤中のメガリンタンパク切断阻害物質の含有量は、上記使用量に適したものであれば特に制限されず、好ましくは、乾燥重量あたり０．０００００１質量％～９９．９９９９質量％、より好ましくは、０．００００１質量％～９９．９９９質量％、特に好ましくは、０．０００１質量％～９９．９９質量％である。
また、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、メガリンタンパク切断阻害物質以外にも、その目的に応じて、あらゆる既知の物質を含むものであってもよい。
以下に、薬理試験の例を掲げて本発明を説明するが、これらは本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 The content of the megalin protein cleavage inhibitor in the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is suitable for the amount used, and preferably 0.000001% by mass to 99.9999 per dry weight. % By mass, more preferably 0.00001% by mass to 99.999% by mass, and particularly preferably 0.0001% by mass to 99.99% by mass.
Moreover, the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention may contain any known substance in addition to the megalin protein cleavage inhibitor, depending on the purpose.
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples of pharmacological tests, but these are for better understanding of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
また、本発明のメガリンタンパク切断阻害剤は、メガリンタンパク切断阻害物質以外にも、その目的に応じて、あらゆる既知の物質を含むものであってもよい。
以下に、薬理試験の例を掲げて本発明を説明するが、これらは本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 The content of the megalin protein cleavage inhibitor in the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is suitable for the amount used, and preferably 0.000001% by mass to 99.9999 per dry weight. % By mass, more preferably 0.00001% by mass to 99.999% by mass, and particularly preferably 0.0001% by mass to 99.99% by mass.
Moreover, the megalin protein cleavage inhibitor of the present invention may contain any known substance in addition to the megalin protein cleavage inhibitor, depending on the purpose.
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples of pharmacological tests, but these are for better understanding of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
比較例１：ネフローゼ症候群ラットモデルを用いたγ－セクレターゼ阻害剤(N-[N-(3,5-difluorophenylacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine tert-butyl ester （ＤＡＰＴ）の薬効試験
最初に馴化終了したラットについて、体重を測定し、中間値付近の個体を選択し、代謝ケージに入れて３日間馴化した。代謝ケージ飼育開始から４日目から２４時間蓄尿を開始した。２４時間経過後、尿重量を測定し、一部を尿中アルブミン(Alb)測定サンプルとして供した。尿サンプルを転倒混和後、遠心分離(３,０００rpm×１０分間，４℃)を行い、上清を用いて尿Albを測定した。ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）投与開始前日にラットの体重を測定し、エーテル麻酔下で頸静脈よりヘパリン加採血を実施した。群分けは第一優先項目を尿中Alb、第二優先項目を体重として実施した。
午前中にＰＡＮ投与液を５ mL/kgで尾静脈内投与した。ＰＡＮ投与後３日目から０．５ ％エタノール/corn oilに溶解させたＤＡＰＴ（被験液）を、５０ mg/kgの濃度で連日皮下投与を開始した。投与液量はＰＡＮ投与前日の体重を用いて算出した。被験液投与開始から１日後に体重を測定し、エーテル麻酔下で頸静脈よりヘパリン加採血を実施した。また、蓄尿を開始し、２４時間後に尿を回収した。尿回収後に体重及び尿重量を測定し、一部を投与後の尿中Ａｌｂ測定用サンプルとして供した。その後、２日目の被験液を腹腔内投与した。被験液投与開始から５日目に蓄尿を開始し、２４時間後に尿を回収した。尿回収後に体重及び尿重量を測定し、一部を投与後の尿中Ａｌｂ測定用サンプルとして供した。また、尿回収終了後に体重を測定し、エーテル麻酔下で頸静脈よりヘパリン加採血を実施した。頸静脈採血を実施後、剖検を行った。エーテル麻酔下で腹部大動脈よりヘパリン加採血を実施し、血液を得た。腎組織を摘出し、一部をホルマリンで固定した。血液は遠心分離(３,０００rpm，５分間，４℃)を行い、血漿を得た。ホルマリン固定した組織はパラフィン包埋し，４μm厚切片を作製し、PAS染色を行った。 Comparative Example 1: Drug efficacy test of γ-secretase inhibitor (N- [N- (3,5-difluorophenylacetyl) -L-alanyl]-(S) -phenylglycine tert-butyl ester (DAPT) using a rat model of nephrotic syndrome) The rats that were first acclimated were weighed, individuals near the median were selected, placed in metabolic cages and acclimated for 3 days, and urine collection was started for 24 hours from the 4th day after the start of metabolic cage feeding. After the lapse of time, the urine weight was measured, and a part was used as a sample for measuring urinary albumin (Alb) .The urine sample was mixed by inversion, centrifuged (3,000 rpm × 10 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was collected. Urinary Alb was used to measure the body weight of rats on the day before the start of puromycin aminonucleoside (PAN) administration, and heparinized blood was collected from the jugular vein under ether anesthesia. Alb, second priority is weight Carried out.
In the morning, the PAN administration solution was administered into the tail vein at 5 mL / kg. From the third day after PAN administration, DAPT (test solution) dissolved in 0.5% ethanol / corn oil was subcutaneously administered every day at a concentration of 50 mg / kg. The dose was calculated using the body weight of the day before PAN administration. One day after the start of administration of the test solution, the body weight was measured, and heparinized blood was collected from the jugular vein under ether anesthesia. Moreover, urine collection was started and urine was collected 24 hours later. After collecting urine, body weight and urine weight were measured, and a part was used as a sample for measuring urinary Alb after administration. Thereafter, the test solution on the second day was intraperitoneally administered. On the fifth day from the start of administration of the test solution, urine accumulation was started, and urine was collected 24 hours later. After collecting urine, body weight and urine weight were measured, and a part was used as a sample for measuring urinary Alb after administration. Moreover, the body weight was measured after completion | finish of urine collection | recovery, and heparinized blood collection was implemented from the jugular vein under ether anesthesia. After performing jugular vein blood sampling, an autopsy was performed. Heparinized blood was collected from the abdominal aorta under ether anesthesia to obtain blood. The kidney tissue was removed and a part was fixed with formalin. The blood was centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.) to obtain plasma. The formalin-fixed tissue was embedded in paraffin, 4 μm thick sections were prepared, and PAS staining was performed.
最初に馴化終了したラットについて、体重を測定し、中間値付近の個体を選択し、代謝ケージに入れて３日間馴化した。代謝ケージ飼育開始から４日目から２４時間蓄尿を開始した。２４時間経過後、尿重量を測定し、一部を尿中アルブミン(Alb)測定サンプルとして供した。尿サンプルを転倒混和後、遠心分離(３,０００rpm×１０分間，４℃)を行い、上清を用いて尿Albを測定した。ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）投与開始前日にラットの体重を測定し、エーテル麻酔下で頸静脈よりヘパリン加採血を実施した。群分けは第一優先項目を尿中Alb、第二優先項目を体重として実施した。
午前中にＰＡＮ投与液を５ mL/kgで尾静脈内投与した。ＰＡＮ投与後３日目から０．５ ％エタノール/corn oilに溶解させたＤＡＰＴ（被験液）を、５０ mg/kgの濃度で連日皮下投与を開始した。投与液量はＰＡＮ投与前日の体重を用いて算出した。被験液投与開始から１日後に体重を測定し、エーテル麻酔下で頸静脈よりヘパリン加採血を実施した。また、蓄尿を開始し、２４時間後に尿を回収した。尿回収後に体重及び尿重量を測定し、一部を投与後の尿中Ａｌｂ測定用サンプルとして供した。その後、２日目の被験液を腹腔内投与した。被験液投与開始から５日目に蓄尿を開始し、２４時間後に尿を回収した。尿回収後に体重及び尿重量を測定し、一部を投与後の尿中Ａｌｂ測定用サンプルとして供した。また、尿回収終了後に体重を測定し、エーテル麻酔下で頸静脈よりヘパリン加採血を実施した。頸静脈採血を実施後、剖検を行った。エーテル麻酔下で腹部大動脈よりヘパリン加採血を実施し、血液を得た。腎組織を摘出し、一部をホルマリンで固定した。血液は遠心分離(３,０００rpm，５分間，４℃)を行い、血漿を得た。ホルマリン固定した組織はパラフィン包埋し，４μm厚切片を作製し、PAS染色を行った。 Comparative Example 1: Drug efficacy test of γ-secretase inhibitor (N- [N- (3,5-difluorophenylacetyl) -L-alanyl]-(S) -phenylglycine tert-butyl ester (DAPT) using a rat model of nephrotic syndrome) The rats that were first acclimated were weighed, individuals near the median were selected, placed in metabolic cages and acclimated for 3 days, and urine collection was started for 24 hours from the 4th day after the start of metabolic cage feeding. After the lapse of time, the urine weight was measured, and a part was used as a sample for measuring urinary albumin (Alb) .The urine sample was mixed by inversion, centrifuged (3,000 rpm × 10 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was collected. Urinary Alb was used to measure the body weight of rats on the day before the start of puromycin aminonucleoside (PAN) administration, and heparinized blood was collected from the jugular vein under ether anesthesia. Alb, second priority is weight Carried out.
In the morning, the PAN administration solution was administered into the tail vein at 5 mL / kg. From the third day after PAN administration, DAPT (test solution) dissolved in 0.5% ethanol / corn oil was subcutaneously administered every day at a concentration of 50 mg / kg. The dose was calculated using the body weight of the day before PAN administration. One day after the start of administration of the test solution, the body weight was measured, and heparinized blood was collected from the jugular vein under ether anesthesia. Moreover, urine collection was started and urine was collected 24 hours later. After collecting urine, body weight and urine weight were measured, and a part was used as a sample for measuring urinary Alb after administration. Thereafter, the test solution on the second day was intraperitoneally administered. On the fifth day from the start of administration of the test solution, urine accumulation was started, and urine was collected 24 hours later. After collecting urine, body weight and urine weight were measured, and a part was used as a sample for measuring urinary Alb after administration. Moreover, the body weight was measured after completion | finish of urine collection | recovery, and heparinized blood collection was implemented from the jugular vein under ether anesthesia. After performing jugular vein blood sampling, an autopsy was performed. Heparinized blood was collected from the abdominal aorta under ether anesthesia to obtain blood. The kidney tissue was removed and a part was fixed with formalin. The blood was centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.) to obtain plasma. The formalin-fixed tissue was embedded in paraffin, 4 μm thick sections were prepared, and PAS staining was performed.
血漿中および尿中のＣｒｅ（クレアチニン）の含有量、Ａｌｂ（アルブミン）の含有量は以下の方法により求めた。
The content of Cre (creatinine) and the content of Alb (albumin) in plasma and urine were determined by the following methods.
Ｃｒｅ（クレアチニン）の含有量の測定方法
クレアチニンはCOBAS INTEGRA 400plusを用いて測定した。以下に測定の際に用いた試薬名を記載する。
クレアチニンカセット；名称：CREP2、Cat No.682965（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社）
血漿中Ａｌｂ（アルブミン）の含有量の測定方法
血漿中ＡｌｂはCOBAS INTEGRA 400plusを用いて測定した。以下に測定の際に用いた試薬名を記載する。
アルブミンカセット；名称：ALBIICat No.684310（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社）
尿中Ａｌｂの含有量の測定方法
尿はNEPHRATII ELISA kitを用いて尿中Albを測定した。
1)NEPHRATII ELISA kitを用いた尿中Alb測定法
(i)検量線用標準液の調製法
キット中のRat Serum Albumin(RSA) Standardを300μL採取し、300μLのEIA DILUENTを加えて混和し、10 mg/dL RSAとした。これを300μL採取し、300μLのEIA DILUENTを加えて混和し、5 mg/dL RSAとした。同様の希釈を実施し、2.5，1.25，0.625，0.313，0.156 mg/dL RSAを調製した。96穴プレートに各RSA及び0 mg/dLとしてEIA DILUENTを100μLずつ2 wellに播種した。
(ii)Washing bufferの調製
500 mLのSalineにTween20を250μL加えて混和し、Washing bufferとした。
(iii)測定法
回収した尿サンプルを、EIA DILUENTで適量に希釈した。各尿サンプルを10μLずつ2wellに播種し、各wellにEIA DILUENTを90μLずつ添加してさらに10倍希釈とした。尿サンプル及びRSAの各wellにHRP-Conjugateを100μLずつ加えて室温で50分間振盪した。インキュベート後、Washing bufferで6回洗浄した。各wellにTMB Color Developerを100μLずつ入れて室温で5分間放置した。その後、各wellにColor Stopperを100μLずつ入れて、450μmの吸光度を測定した。RSAの結果から検量線を作成し、尿サンプル中のＡｌｂ濃度を算出した。
組織中メガリンタンパク切断片の検出方法
腎組織中のメガリンタンパク切断片の検出は、一般的な手法として広く知られているウェスタンブロット法を用いた。メガリンタンパク切断片の検出には抗ラットメガリンポリクローナル抗体を用いた。本抗体はメガリンタンパクC末側の細胞内領域全てを抗原として作製されたものであり、メガリンタンパクの1段階目切断片および2段階目切断片の両方を認識する。 Method for measuring content of Cre (creatinine) Creatinine was measured using COBAS INTEGRA 400plus. The reagent names used in the measurement are described below.
Creatinine cassette; Name: CREP2, Cat No. 682965 (Roche Diagnostics Inc.)
Method for Measuring Content of Plasma Alb (Albumin) Plasma Alb was measured using COBAS INTEGRA 400plus. The reagent names used in the measurement are described below.
Albumin cassette; Name: ALBIICat No. 684310 (Roche Diagnostics)
Method for measuring urinary Alb content Urine Alb was measured using NEPHRATII ELISA kit.
1) Urinary Alb measurement using NEPHRATII ELISA kit
(i) Preparation of standard solution for calibration curve 300 μL of Rat Serum Albumin (RSA) Standard in the kit was sampled, and 300 μL of EIA DILUENT was added and mixed to obtain 10 mg / dL RSA. 300 μL of this was collected, and 300 μL of EIA DILUENT was added and mixed to give 5 mg / dL RSA. Similar dilutions were performed to prepare 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156 mg / dL RSA. A 96-well plate was seeded with 100 μL of each RSA and 0 mg / dL in 2 wells.
(ii) Preparation of Washing Buffer 250 μL ofTween 20 was added to 500 mL of Saline and mixed to obtain a washing buffer.
(iii) Measurement method The collected urine sample was diluted to an appropriate amount with EIA DILUENT. 10 μL of each urine sample was seeded in 2 wells, and 90 μL of EIA DILUENT was added to each well to further dilute 10 times. 100 μL of HRP-Conjugate was added to each well of the urine sample and RSA and shaken at room temperature for 50 minutes. After incubation, the plate was washed 6 times with a washing buffer. 100 μL of TMB Color Developer was added to each well and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Thereafter, 100 μL of Color Stopper was added to each well, and the absorbance at 450 μm was measured. A calibration curve was created from the RSA results, and the Alb concentration in the urine sample was calculated.
Method for detecting megalin protein fragment in tissue Tissue megalin protein fragment was detected using Western blotting, which is widely known as a general technique. Anti-rat megalin polyclonal antibody was used to detect megalin protein fragments. This antibody is prepared using the entire intracellular region of the C-terminal side of megalin protein as an antigen, and recognizes both the first-stage and second-stage fragments of megalin protein.
クレアチニンはCOBAS INTEGRA 400plusを用いて測定した。以下に測定の際に用いた試薬名を記載する。
クレアチニンカセット；名称：CREP2、Cat No.682965（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社）
血漿中Ａｌｂ（アルブミン）の含有量の測定方法
血漿中ＡｌｂはCOBAS INTEGRA 400plusを用いて測定した。以下に測定の際に用いた試薬名を記載する。
アルブミンカセット；名称：ALBIICat No.684310（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社）
尿中Ａｌｂの含有量の測定方法
尿はNEPHRATII ELISA kitを用いて尿中Albを測定した。
1)NEPHRATII ELISA kitを用いた尿中Alb測定法
(i)検量線用標準液の調製法
キット中のRat Serum Albumin(RSA) Standardを300μL採取し、300μLのEIA DILUENTを加えて混和し、10 mg/dL RSAとした。これを300μL採取し、300μLのEIA DILUENTを加えて混和し、5 mg/dL RSAとした。同様の希釈を実施し、2.5，1.25，0.625，0.313，0.156 mg/dL RSAを調製した。96穴プレートに各RSA及び0 mg/dLとしてEIA DILUENTを100μLずつ2 wellに播種した。
(ii)Washing bufferの調製
500 mLのSalineにTween20を250μL加えて混和し、Washing bufferとした。
(iii)測定法
回収した尿サンプルを、EIA DILUENTで適量に希釈した。各尿サンプルを10μLずつ2wellに播種し、各wellにEIA DILUENTを90μLずつ添加してさらに10倍希釈とした。尿サンプル及びRSAの各wellにHRP-Conjugateを100μLずつ加えて室温で50分間振盪した。インキュベート後、Washing bufferで6回洗浄した。各wellにTMB Color Developerを100μLずつ入れて室温で5分間放置した。その後、各wellにColor Stopperを100μLずつ入れて、450μmの吸光度を測定した。RSAの結果から検量線を作成し、尿サンプル中のＡｌｂ濃度を算出した。
組織中メガリンタンパク切断片の検出方法
腎組織中のメガリンタンパク切断片の検出は、一般的な手法として広く知られているウェスタンブロット法を用いた。メガリンタンパク切断片の検出には抗ラットメガリンポリクローナル抗体を用いた。本抗体はメガリンタンパクC末側の細胞内領域全てを抗原として作製されたものであり、メガリンタンパクの1段階目切断片および2段階目切断片の両方を認識する。 Method for measuring content of Cre (creatinine) Creatinine was measured using COBAS INTEGRA 400plus. The reagent names used in the measurement are described below.
Creatinine cassette; Name: CREP2, Cat No. 682965 (Roche Diagnostics Inc.)
Method for Measuring Content of Plasma Alb (Albumin) Plasma Alb was measured using COBAS INTEGRA 400plus. The reagent names used in the measurement are described below.
Albumin cassette; Name: ALBIICat No. 684310 (Roche Diagnostics)
Method for measuring urinary Alb content Urine Alb was measured using NEPHRATII ELISA kit.
1) Urinary Alb measurement using NEPHRATII ELISA kit
(i) Preparation of standard solution for calibration curve 300 μL of Rat Serum Albumin (RSA) Standard in the kit was sampled, and 300 μL of EIA DILUENT was added and mixed to obtain 10 mg / dL RSA. 300 μL of this was collected, and 300 μL of EIA DILUENT was added and mixed to give 5 mg / dL RSA. Similar dilutions were performed to prepare 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156 mg / dL RSA. A 96-well plate was seeded with 100 μL of each RSA and 0 mg / dL in 2 wells.
(ii) Preparation of Washing Buffer 250 μL of
(iii) Measurement method The collected urine sample was diluted to an appropriate amount with EIA DILUENT. 10 μL of each urine sample was seeded in 2 wells, and 90 μL of EIA DILUENT was added to each well to further dilute 10 times. 100 μL of HRP-Conjugate was added to each well of the urine sample and RSA and shaken at room temperature for 50 minutes. After incubation, the plate was washed 6 times with a washing buffer. 100 μL of TMB Color Developer was added to each well and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Thereafter, 100 μL of Color Stopper was added to each well, and the absorbance at 450 μm was measured. A calibration curve was created from the RSA results, and the Alb concentration in the urine sample was calculated.
Method for detecting megalin protein fragment in tissue Tissue megalin protein fragment was detected using Western blotting, which is widely known as a general technique. Anti-rat megalin polyclonal antibody was used to detect megalin protein fragments. This antibody is prepared using the entire intracellular region of the C-terminal side of megalin protein as an antigen, and recognizes both the first-stage and second-stage fragments of megalin protein.
尿サンプルおよび血漿サンプル中のＡｌｂ濃度の経日的な結果を図１に示す。ＰＡＮの投与により腎障害が惹起され、尿中アルブミンの上昇および血中アルブミンの低下が生じたが、γ－セクレターゼを阻害するがシグナルペプチドペプチダーゼを阻害しないことが知られるＤＡＰＴの投与によりさらに悪化した。また、ＰＡＳ染色による腎臓組織像を図２に示した。ＰＡＮ投与により生じた腎尿細管の障害が、ＤＡＰＴ投与によりさらに悪化した。また組織中のメガリンタンパクの切断片の量を測定した結果では、ＤＡＰＴによって1段階目のメガリン切断片の量は減少し、2段階目のメガリンタンパクの切断片の量は増加した（図３）。
Fig. 1 shows the daily results of the Alb concentration in the urine sample and plasma sample. Administration of PAN caused kidney damage, resulting in increased urinary albumin and decreased blood albumin, but was further exacerbated by administration of DAPT, which is known to inhibit γ-secretase but not signal peptide peptidase . Moreover, the kidney tissue image by PAS staining is shown in FIG. Renal tubular damage caused by PAN administration was further exacerbated by DAPT administration. In addition, as a result of measuring the amount of megalin protein fragments in the tissue, DAPT decreased the amount of the first-stage megalin protein and increased the amount of the second-stage megalin protein fragment (FIG. 3). .
実施例１：ネフローゼ症候群モデルラットを用いたγセクレターゼ阻害剤(S,S)-2-[2-(3,5-Difluorophenyl)acetylamino]-N-(5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propionamide（ＤＢＺ）の薬効試験
被検液としてＤＡＰＴの代わりにＤＢＺ（投与液：０．５% (w/v) hydroxypropyl methylcellulose / ０．１% (w/v) Tween-80、投与濃度５ mg/kgで腹腔内投与）を用いた以外は比較例１と同様の手順で、組織中のメガリンタンパクの切断片の量、尿中及び血中のアルブミン量並びにクレアチニン量、ＰＡＳ染色による腎臓組織像について試験を行った。 Example 1: γ-secretase inhibitor (S, S) -2- [2- (3,5-Difluorophenyl) acetylamino] -N- (5-methyl-6-oxo-6,7 using nephrotic syndrome model rats -Dihydro-5H-dibenzo [b, d] azepin-7-yl) propionamide (DBZ) as a test solution DBZ instead of DAPT (administration solution: 0.5% (w / v) hydroxypropyl methylcellulose / 0 1% (w / v) Tween-80, administered intraperitoneally at a dose concentration of 5 mg / kg), in the same manner as in Comparative Example 1, in the amount of megalin protein fragments in the urine In addition, the amount of albumin in blood, the amount of creatinine, and the kidney tissue image by PAS staining were examined.
被検液としてＤＡＰＴの代わりにＤＢＺ（投与液：０．５% (w/v) hydroxypropyl methylcellulose / ０．１% (w/v) Tween-80、投与濃度５ mg/kgで腹腔内投与）を用いた以外は比較例１と同様の手順で、組織中のメガリンタンパクの切断片の量、尿中及び血中のアルブミン量並びにクレアチニン量、ＰＡＳ染色による腎臓組織像について試験を行った。 Example 1: γ-secretase inhibitor (S, S) -2- [2- (3,5-Difluorophenyl) acetylamino] -N- (5-methyl-6-oxo-6,7 using nephrotic syndrome model rats -Dihydro-5H-dibenzo [b, d] azepin-7-yl) propionamide (DBZ) as a test solution DBZ instead of DAPT (administration solution: 0.5% (w / v) hydroxypropyl methylcellulose / 0 1% (w / v) Tween-80, administered intraperitoneally at a dose concentration of 5 mg / kg), in the same manner as in Comparative Example 1, in the amount of megalin protein fragments in the urine In addition, the amount of albumin in blood, the amount of creatinine, and the kidney tissue image by PAS staining were examined.
尿サンプルおよび血漿サンプル中のＡｌｂ濃度の経日的な結果を図４に示す。ＰＡＮの投与により腎障害が惹起され、尿中アルブミンの上昇および血中アルブミンの低下が生じたが、γ－セクレターゼおよびシグナルペプチドペプチダーゼの両方を阻害することが知られるＤＢＺの投与により改善した。さらに、ＰＡＳ染色による腎臓組織像を図５に示した。ＰＡＮ投与により生じた腎尿細管の障害が、ＤＢＺの投与により著しく改善していた。また組織中のメガリンタンパクの切断片の量を測定した結果では、ＤＢＺによって1段階目のメガリンタンパクの切断片の量は増加したが、2段階目の切断片は検出されなかった（図６）。
Fig. 4 shows the daily results of the Alb concentration in the urine sample and the plasma sample. Administration of PAN caused renal injury, resulting in an increase in urinary albumin and a decrease in blood albumin, but was improved by administration of DBZ, which is known to inhibit both γ-secretase and signal peptide peptidase. Furthermore, a kidney tissue image by PAS staining is shown in FIG. The renal tubular damage caused by PAN administration was markedly improved by DBZ administration. In addition, as a result of measuring the amount of megalin protein fragments in the tissue, DBZ increased the amount of first-stage megalin protein fragments, but the second-stage fragments were not detected (FIG. 6). .
Claims (11)
- シグナルペプチドペプチダーゼ阻害物質を含有することを特徴とする、メガリンタンパク切断阻害剤。 A megalin protein cleavage inhibitor characterized by containing a signal peptide peptidase inhibitor.
- γセクレターゼ阻害物質を含有することを特徴とする、メガリンタンパク切断阻害剤。 A megalin protein cleavage inhibitor comprising a γ-secretase inhibitor.
- 分子内にアミド構造を有するメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、メガリンタンパク切断阻害剤。 A megalin protein cleavage inhibitor comprising a megalin protein cleavage inhibitor having an amide structure in the molecule.
- 分子内にアミド構造を有し、かつ該アミド構造の少なくとも一つの窒素原子と直結した環構造を有し、該環構造が窒素原子を含むメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 It has an amide structure in the molecule and has a ring structure directly connected to at least one nitrogen atom of the amide structure, and the ring structure contains a megalin protein cleavage inhibitor containing a nitrogen atom, The megalin protein cleavage inhibitor according to any one of claims 1 to 3.
- ポリアミド構造を有するメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 The megalin protein cleavage inhibitor according to any one of claims 1 to 3, further comprising a megalin protein cleavage inhibitor having a polyamide structure.
- ポリアミド構造を有し、かつ分子内に芳香族環基を有するメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、請求項１～３及び５のいずれか１項記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 The megalin protein cleavage inhibitor according to any one of claims 1 to 3 and 5, which comprises a megalin protein cleavage inhibitor having a polyamide structure and an aromatic ring group in the molecule.
- ＤＢＺ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ、ＬＹ４１１５７５、Ｌ－６９５４５８、ＴＢＬ４Ｋ及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅからなる群より選択されるメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 A megalin protein cleavage inhibitor selected from the group consisting of DBZ, Compound E, NAP-AHW700-NX, LY411575, L-695458, TBL4K and (Z-LL) 2-Ketone, 4. The megalin protein cleavage inhibitor according to any one of 1 to 3.
- ＤＢＺ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、ＮＡＰ－ＡＨＷ７００－ＮＸ及びＬＹ４１１５７５からなる群より選択されるメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、請求項４記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 The megalin protein cleavage inhibitor according to claim 4, comprising a megalin protein cleavage inhibitor selected from the group consisting of DBZ, Compound E, NAP-AHW700-NX and LY411575.
- ＴＢＬ４Ｋ及び（Ｚ－ＬＬ）２－Ｋｅｔｏｎｅからなる群より選択されるメガリンタンパク切断阻害物質を含有することを特徴とする、請求項５又は６記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 The megalin protein cleavage inhibitor according to claim 5 or 6, comprising a megalin protein cleavage inhibitor selected from the group consisting of TBL4K and (Z-LL) 2-Ketone.
- メガリンタンパク切断阻害物質がシグナルペプチドペプチダーゼ阻害物質であることを特徴とする、請求項３～９のいずれか１項記載のメガリンタンパク切断阻害剤。 The megalin protein cleavage inhibitor according to any one of claims 3 to 9, wherein the megalin protein cleavage inhibitor is a signal peptide peptidase inhibitor.
- 請求項１～１０のいずれか１項記載のメガリンタンパク切断阻害剤を含有することを特徴とする、腎障害治療薬。 A therapeutic agent for renal disorders, comprising the megalin protein cleavage inhibitor according to any one of claims 1 to 10.
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