WO2010076358A1 - Análogos sintéticos de merosesquiterpenos y compuestos relacionados con actividad antitumoral - Google Patents

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WO2010076358A1
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merosquiterpenes
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Inventor
Antonia ARÁNEGA JIMÉNEZ
Enrique ÁLVAREZ DE MANZANEDA ROLDÁN
Rachid Chahboun
Fernando RODRÍGUEZ SERRANO
Houria Boulaiz
Juan Antonio Marchal Corrales
Consolación MELGUIZO ALONSO
Macarena PERÁN QUESADA
José Carlos PRADOS SALAZAR
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Universidad de Granada
Universidad de Jaen
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Universidad de Granada
Universidad de Jaen
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines

Definitions

  • the invention relates to the useful antitumor pharmacological properties of new synthetic compounds of merosquiterpenic structure and related compounds, similar to marine metabolites of the puupehenone type against solid tumors, such as breast cancers, neuroblastomas, lung, colorectal, liver and pancreas , and against acute and chronic myeloproliferative syndromes in both humans and animals.
  • the invention relates to pharmaceutical formulas comprising said compounds in their pharmacological use.
  • Cancer is a set of diseases characterized by the existence of an abnormal proliferation of cells. What confers the characteristic of malignancy to this cell proliferation is its ability to invade organs and tissues and spread at a distance.
  • cancer In absolute terms, cancer is the leading cause of death in Spain, with 94,100 deaths in 2003 (59,500 in men and 34,600 in women), which accounted for 25.6% of all deaths.
  • Breast carcinoma is the most prevalent cancer in women, although it also occurs in men. It is estimated that 216,000 women have manifested the disease in the European Union during the year 2000 [Tyczynski JE, Bray F, Parkin DM. Breast cancer in Europe. ENCR Fact Sheets of the International Agency for Research on Cancer. (2002) VoI. 2].
  • Lung cancer is the leading cause of death in men of the European Union, and the third in women. In that territory, lung cancer had an estimated mortality of 171,990 men and 64,100 women during 2006.
  • the treatment of cancer in general depends on a large number of factors, the main strategies being surgery, radiotherapy, chemotherapy, photodynamic therapy and some that are in the experimental phase such as gene therapy.
  • tamoxifen, taxanes, paclitaxel and doxorubicin are used in breast cancer [Glück S. Adjuvant chemotherapy for early breast cancer: optimal use of epirubicin. Oncologist (2005); 10 (10): 780-91].
  • adjuvant chemotherapy in lung cancer cisplatin and taxol-carboplatin, cisplatin-vinorelbine, cisplatin-docetaxel and carboplatin-docetaxel can be used.
  • second-line chemotherapeutic agents we will highlight docetaxel, premetrexed and epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors such as erlotinib and gefitinib.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • bevacizumab a monoclonal antibody that blocks the endothelial vasculature growth factor has been used in combination with paclitaxel and carboplatin [from Cos Escu ⁇ n JS, Delgado IU, Rodr ⁇ guez JC, López MJ, Vicente CD, Miranda JA. Stage IHA and IHB non-small cell lung cancer: results of chemotherapy combined with radiation therapy and analysis of prognostic factors. Arch Bronconeumol (2007). 43 (7): 358-65]. In colon cancer, it has been shown that the chemotherapeutic drug 5-fluorouracil increases the possibility of cure in certain patients.
  • the invention claims the anti-tumor properties against solid tumors, such as breast, neuroblastoma, lung, colorectal, liver and pancreas cancers, and against acute and chronic myeloproliferative syndromes in both humans and animals, of compounds synthetics that have a merosquiterpenic structure related to marine metabolites of the puupehenone type.
  • solid tumors such as breast, neuroblastoma, lung, colorectal, liver and pancreas cancers
  • acute and chronic myeloproliferative syndromes in both humans and animals of compounds synthetics that have a merosquiterpenic structure related to marine metabolites of the puupehenone type.
  • the general formulas, 1 and 2 of the families of compounds that exhibit antitumor activity are:
  • R 1 and R 2 independently represent a group selected from -R, -CHO, - CH 2 OH, -CH 2 OR, -CH 2 OCOCH 3 , -COOH, -COR, -COOR, -OCHO, -OCOCH 3 , -OH, - OR, where -R represents a linear or branched C 1 -C 4 alkyl group, or aryl.
  • R 3 represents a group selected from -R, -CHO, -CH 2 OH, -CH 2 OR, - CH 2 OCOCH 3 , -COR, -COOH, -COOR (where -R represents a C 1 -C alkyl group 4 linear or branched, or aryl), when the double bond is endocyclic, and R 3 represents a methylene group or an oxygen when the double bond is exocyclic.
  • R 1 and R 2 independently represent a group selected from -R, -CHO, - CH 2 OH, -CH 2 OR, -CH 2 OCOCH 3 , -COR, -COOH, -COOR, -OCHO, -OCOCH 3 , -OH, - OR, where -R represents a linear or branched C 1 -C 4 alkyl group, or aryl.
  • R 3 represents a group selected from -R, -CHO, -CH 2 OH, -CH 2 OR, - CH 2 OCOCH 3 , -COR, -COOH, -COOR (where -R represents a C 1 -C alkyl group 4 linear or branched, or aryl), when the double bond is endocyclic, and R 3 represents a methylene group or an oxygen when the double bond is exocyclic.
  • R 4 , R 5 independently represent a group selected from -H, -OH, -R, -OR and halogen, where -R represents a linear or branched C 1 -C 4 alkyl or aryl group.
  • the present invention focuses on the use of said compounds, in their appropriate therapeutic amounts and through any method or means of administration, in the antitumor therapy both for the treatment and for the prophylaxis of cancer.
  • the claim extends to the pharmaceutical formulas used for the treatment of cancer that comprise the use of at least one of the compounds of the invention, independently of the rest of active components or of the excipients that are part of said medicament or pharmaceutical formula.
  • the present invention also contemplates the derivatives and prodrugs of the member compounds of the families object of the invention, as well as the chemical forms of salts, combinations with acids and bases of said compounds.
  • epithelial cell line derived from an adenocarcinoma of the human mammary gland, of a 69 year old Caucasian patient.
  • the cells express estrogen receptors and the WNT7B oncogene, and among the cellular products they produce are insulin-type factor binding proteins, BP-2, BP-4 and BP-5.
  • the cell line is cataloged in the ATCC (American Type Culture Collection) under the code HTB-22.
  • cell line of epithelial morphology isolated from a pulmonary metastasis of a colorectal carcinoma of a 72-year-old patient.
  • the cells of this line have receptors for a large group of hormones and neurotransmitters, and among the cellular products that express are the carcinoembryonic antigen (CEA) and the keratin.
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • the line is cataloged in the ATCC with the code CCL-248.
  • - A549 cell line that was established in 1972 from an explant from carcinomatous lung tissue of a 58-year-old Caucasian patient. They are characterized by producing keratin. Its ATCC code is CCL-185.
  • the 3 cell lines were obtained through the Cell Culture Service of the Center of Scientific Instrumentation of the University of Granada.
  • the modified Dubelcco ' s Eagle (DMEM) medium (Gibco, USA) (13.37 g of base medium) was used, supplemented with 10% of inactivated fetal bovine serum ( Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) in heat wet at 56 ° C for 30 minutes.
  • the medium was buffered with 27 ml of 7.5% NaHCO 3 , and 10 ml Hepes buffer (Sigma Chemical co., St.
  • the culture of the T-84 line a mixture with a 1: 1 ratio of the previous culture medium and Ham F12 was used, and the final amount of inactivated bovine fetal serum was 5%.
  • the culture medium was prepared, it was filtered with sterile 0.22 ⁇ m Millex filters (Millipore, France) and stored in sterile bottles.
  • the cells had to be reseeded in new Falcon containers, as cell confluence was reached. To do this, the cells were washed twice with PBS (Phosphate Saline Buffer, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), with a volume of 0.2 ml / cm 2 , and detached with 0.1 ml / cm 2 of trypsin-EDTA (0.25% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS, Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA).
  • PBS Phosphate Saline Buffer
  • trypsin-EDTA 0.25% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS, Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA.
  • the action of trypsin was blocked by adding the corresponding culture medium with fetal serum. After centrifuging, the cell pellet was resuspended in sterile culture medium and after counting the total number of cells with Neubauer chamber, the pellets were diluted to obtain a concentration of 2 x 10 4 cells / ml, which were arranged in New culture jars.
  • Method of cell freezing For cell freezing, the cells were detached from the surface of the culture bottles by means of the protocol described above, until obtaining a cell pellet that was resuspended in the freezing medium at a rate of 0.5 x 10 6 cells per ml, being introduced immediately in cryotubes and these in the freezer at -8O 0 C for 24 h, to then be finally stored in liquid nitrogen.
  • the freezing medium used consisted of fetal bovine serum (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) inactivated wet heat at 56 0 C for 30 min, and dimethylsulfoxide (DMSO) 10%.
  • fetal bovine serum Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the cryotubes were taken out of the liquid nitrogen container and placed in a bucket of water at 37 0 C. Once the cryotube was thawed, it was rinsed with 70% alcohol and opened in sterile conditions. The content of the cryotubes was resuspended in a sterile culture medium at 37 ° C, washed twice with fresh medium to remove the remains of DMSO and a Neubauer chamber count was performed, in order to obtain a cell suspension with a concentration of 2 x 10 4 cells / mi, which was finally planted in new culture bottles.
  • the treatment of the cell lines was developed following the following protocol: cells of the different lines were detached from the culture surface with a trypsin-EDTA mixture (0.25% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS, Sigma Chemical co ., St. Louis, MO, USA), washed, resuspended in culture medium and counted by Neubauer chamber, as described above. They were then seeded in sterile 24-well plates at a rate of 5 x 10 3 cells per well in a final volume of 1mL of the corresponding culture medium. After 24 hours of incubation in a CO 2 oven, the culture medium was changed and increasing concentrations of the compounds to be tested were added, ranging from 0.1 to 60 ⁇ M. The control group did not receive any dose of compound. The plates were then allowed to incubate 72 hours and the medium was changed again and a new compound added. After another 72h, the induction time with the compounds was terminated. 7. Method for determining the value of the inhibitory concentrations 50 (CUn) of the compounds.
  • the culture medium was aspirated from the plates.
  • the cells were fixed by adding 300 ⁇ l_ of trichloroacetic acid (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) to 10% cold (4 0 C) in each of the wells, and left in Ia refrigerator at 4 0 C for 30 minutes. 3. Then 3 washes were performed with distilled water and the plates were allowed to dry.
  • trichloroacetic acid Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA
  • the cells were stained with 500 ⁇ L / well of 0.4% SRB in 1% acetic acid for 20 min at room temperature.
  • the SRB bound to the cells was solubilized with 500 ⁇ L / well of a 1OmM Tris-base solution (pH 10.5) with gentle agitation.
  • optical density values obtained in a Multiskan-Ex (Thermo Scientific) plate reader were transformed into the corresponding cell number value, using a previously adjusted regression line, considering known values of cell numbers and their resulting optical densities.
  • Table 4 shows the Cl 50 values of the compounds that exemplify the invention:
  • the number 6 resulted in the best activity value of all the compounds evaluated in the three lines.
  • the result obtained with MCF-7 has been the most active, with a value of 0.35 ⁇ 0.10 ⁇ M, of the order of 5 times more potent than the result achieved with a positive control, established by treating cells of Ia same cell line with the antitumor drug 5-Fluorouracil.
  • Another object of this invention would be the manufacture of a medicament or pharmaceutical formula comprising any of the compounds mentioned for the treatment of cancer, especially for the treatment of breast cancer, lung cancer and colorectal cancer.

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Abstract

La invención se refiere a las propiedades antitumorales frente a tumores sólidos, tales como los cánceres de mama, neuroblastomas, pulmón, colorrectal, hepático y páncreas tanto en humanos como en animales, de compuestos sintéticos que presentan una estructura merosesquiterpénica relacionada con los metabolitos marinos del tipo puupehenona.

Description

ANÁLOGOS SINTÉTICOS DE MEROSESQUITERPENOS Y COMPUESTOS RELACIONADOS CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con las propiedades farmacológicas antitumorales útiles de nuevos compuestos sintéticos de estructura merosesquiterpénica y compuestos relacionados, similares a los metabolitos marinos del tipo puupehenona frente a tumores sólidos, tales como los cánceres de mama, neuroblastomas, pulmón, colorrectal, hepático y páncreas, y frente a síndromes mieloproliferativos agudos y crónicos tanto en humanos como en animales. Además, Ia invención se relaciona con las fórmulas farmacéuticas que comprenden dichos compuestos en su uso farmacológico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer es un conjunto de enfermedades caracterizadas por Ia existencia de una proliferación anormal de células. Lo que confiere Ia característica de malignidad a esta proliferación celular es su capacidad para invadir órganos y tejidos y diseminarse a distancia.
En términos absolutos, el cáncer es Ia primera causa de muerte en España, con 94.100 muertes en 2003 (59.500 en hombres y 34.600 en mujeres), Io que supuso el 25,6% de todas las defunciones. El carcinoma mamario es el cáncer de mayor prevalencia en Ia mujer, aunque también se presenta en hombres. Se estima que 216.000 mujeres han manifestado Ia enfermedad en Ia Unión Europea durante el año 2000 [Tyczynski JE, Bray F, Parkin DM. Breast cáncer in Europe. ENCR Fact Sheets of the International Agency for Research on Cáncer. (2002) VoI. 2]. El cáncer de pulmón es Ia principal causa de muerte en hombres de Ia Unión Europea, y Ia tercera en mujeres. En dicho territorio, el cáncer de pulmón tuvo una mortalidad estimada de 171.990 varones y 64.100 mujeres durante 2006. [Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M, Boyle P. Estimates of the cáncer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol (2007); 18:581-92]. Por último, el cáncer colorrectal es el segundo cáncer más frecuente en España, siendo responsable del 11.5% del total de muertes provocadas por cáncer en hombres y del 14.9% en mujeres [López-Abente G, Pollán M, Aragonés N, Pérez-Gómez B. Informe sobre Ia salud de los españoles. Cáncer. Centro Nacional de Epidemiología. Instituto de Salud Carlos III (2003)].
El tratamiento del cáncer en general depende de una gran cantidad de factores, siendo las principales estrategias Ia cirugía, Ia radioterapia, Ia quimioterapia, Ia terapia fotodinámica y algunas que están en fase experimental como Ia terapia génica.
En el cáncer de mama se usan agentes como el tamoxifeno, taxanos, paclitaxel y doxorubicina [Glück S. Adjuvant chemotherapy for early breast cáncer: optimal use of epirubicin. Oncologist (2005); 10(10):780-91]. Por otro lado, como quimioterapia adyuvante en el cáncer de pulmón se puede utilizar el cisplatino y taxol-carboplatino, cisplatino-vinorelbina, cisplatino-docetaxel y carboplatino-docetaxel. Como agentes quimioterapéuticos de segunda línea actualmente destacaremos el docetaxel, premetrexed y los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como erlotinib y gefitinib. Por último, bevacizumab, un anticuerpo monoclonal que bloquea el factor de crecimiento vásculo endotelial ha sido usado en combinación con paclitaxel y carboplatino [de Cos Escuín JS, Delgado IU, Rodríguez JC, López MJ, Vicente CD, Miranda JA. Stage IHA and IHB non-small cell lung cáncer: results of chemotherapy combined with radiation therapy and analysis of prognostic factors. Arch Bronconeumol (2007). 43(7): 358-65]. En el cáncer de colon, se ha demostrado que el medicamento quimioterapéutico 5-fluorouracilo incrementa Ia posibilidad de cura en ciertos pacientes. En los últimos cinco años se ha incorporado otros compuestos como irinotecan, oxaliplatino y capecitabina, así como anticuerpos monoclonales frente a dianas moleculares como cetuximab y bevacizumab [Weitz J, Koch M, Debus J, Hóhler T, Galle PR, Büchler MW. Colorectal cáncer. Lancet (2005); 365:153-165].
La aplicación de los fármacos antineoplásicos anteriormente mencionados en este tipo de patologías, aunque provocan una respuesta parcial mejorando el pronóstico de los pacientes, provocan efectos adversos a veces limitantes en cuanto a su capacidad de ser aplicados, que justifican Ia necesidad de desarrollar nuevos compuestos con mayor efectividad y menor toxicidad.
Debemos destacar dentro de las toxicidades que provocan los compuestos antitumorales que actualmente se emplean, Ia aparición de infecciones principalmente en el tracto urinario y en el tracto superior de las vías respiratorias. Además pueden aparecer trastornos sanguíneos, cardíacos, renales, inmunológicos, del sistema nervioso, y trastornos gastrointestinales. [Bonomi P, Kim K, Chang A, Johnson D Phase III trial comparing etoposide and cisplatin versus Taxol with cisplatin-GCSF versus taxol-cisplatin In advanced non-small cell lung cáncer: an Eastern Cooperative Oncology Group trial. Proc Am SOC clin Oncol (1996); 15:382-7; Hainsworth JD, Urba WJ, Hon JK, Thompson KA, Stagg MP, Hopkins LG. One-hour paclitaxel plus carboplatin in the treatment of advanced non-small cell lung cáncer: result of a multicentre, phase Il trial. Eurp J Cáncer (1998); 34:654-8].
Todas estas alteraciones son uno de los factores que limitan Ia aplicación de los tratamientos actuales con agentes quimioterapéuticos. El desarrollo de nuevos agentes que mejoren Ia respuesta antitumoral, provocando menores efectos secundarios es un elemento clave para que mejore de forma significativa el pronóstico de los pacientes afectos de cánceres sólidos tales como los de mama, neuroblastoma, pulmón y colorrectal, hepático y páncreas, así como en el caso de síndromes mieloproliferativos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer punto, Ia invención reivindica las propiedades antitumorales frente a tumores sólidos, tales como los cánceres de mama, neuroblastomas, pulmón, colorrectal, hepático y páncreas, y frente a síndromes mieloproliferativos agudos y crónicos tanto en humanos como en animales, de compuestos sintéticos que presentan una estructura merosesquiterpénica relacionada con los metabolitos marinos del tipo puupehenona. Las fórmulas generales, 1 y 2, de las familias de compuestos que presentan actividad antitumoral son:
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Donde: Las líneas punteadas indican las tres posiciones posibles, y excluyentes entre sí, de un doble enlace.
R1y R2 representan, independientemente, un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, - CH2OH, -CH2OR, -CH2OCOCH3, -COOH, -COR, -COOR, -OCHO, -OCOCH3, -OH, - OR, donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo.
R3 representa un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, -CH2OH, -CH2OR, - CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR (donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo), cuando el doble enlace es endocíclico, y R3 representa un grupo metileno o un oxígeno cuando el doble enlace es exocíclico.
R4 y R5, representan independientemente un grupo seleccionado de entre -H, -R, -CHO, -COR, -CN, -COOH, -COOR, -CF3, -COOCO-, -SO2R, -NO2, -COCI, - CH2OH, -CH2OCOCH3, CH2OR, -CH2CI, -CH2NH2, -CH2COOH, -CH=CH2, -OCHO, - OCOCH3, -OH, -OR y halógeno; donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado o arilo. y
Figure imgf000005_0001
Donde:
Las líneas punteadas indican las tres posiciones posibles, y excluyentes entre sí, de un doble enlace. R1y R2 representan, independientemente, un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, - CH2OH, -CH2OR, -CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR, -OCHO, -OCOCH3, -OH, - OR, donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo.
R3 representa un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, -CH2OH, -CH2OR, - CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR (donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo), cuando el doble enlace es endocíclico, y R3 representa un grupo metileno o un oxígeno cuando el doble enlace es exocíclico.
R4, R5 representan independientemente un grupo seleccionado de entre -H, -OH, -R, - OR y halógeno, donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado o arilo.
La presente invención se centra en Ia utilización de dichos compuestos, en sus cantidades terapéuticas adecuadas y a través de cualquier método o medio de administración, en Ia terapia antitumoral tanto para el tratamiento como para Ia profilaxis del cáncer.
En un segundo punto, Ia reivindicación se extiende a las fórmulas farmacéuticas utilizadas para el tratamiento del cáncer que comprendan Ia utilización de al menos uno de los compuestos de Ia invención, independientemente del resto de componentes activos o de los excipientes que formen parte de dicho medicamento o fórmula farmacéutica.
En un tercer punto, Ia presente invención contempla del mismo modo, los derivados y profármacos de los compuestos miembros de las familias objeto de Ia invención, así como las formas químicas de sales, combinaciones con ácidos y bases de dichos compuestos.
A continuación se expondrán algunos ejemplos concretos que permitan clarificar el objeto de Ia presente invención, sin que se entienda por ello, como Ia limitación del alcance de Ia invención. Se describirá Ia determinación de Ia capacidad antitumoral de miembros de las familias de compuestos que responden a las fórmulas generales I y Il respectivamente.
1. Líneas celulares. La actividad antitumoral de diferentes compuestos que responden a las fórmulas generales I y II, respectivamente, ha sido evaluada utilizando las siguientes líneas celulares tumorales:
- MCF7: línea celular de tipo epitelial derivada a partir de un adenocarcinoma de Ia glándula mamaria humana, de una paciente de etnia caucásica de 69 años.
Las células expresan receptores de estrógenos y el oncogén WNT7B, y entre los productos celulares que producen se encuentran proteínas de unión al factor tipo-insulina, BP-2, BP-4 y BP-5. La línea celular está catalogada en Ia ATCC (American Type Culture Collection) bajo el código HTB-22.
- T84: línea celular de morfología epitelial aislada a partir de una metástasis pulmonar de un carcinoma colorrectal de un paciente de 72 años de edad. Las células de esta línea presentan receptores para un amplio grupo de hormonas y neurotransmisores, y entre los productos celulares que expresan se encuentra el antígeno carcinoembrionario (CEA) y Ia queratina. La línea está catalogada en Ia ATCC con el código CCL-248.
- A549: línea celular que fue establecida en 1972 a partir de un explante procedente de tejido carcinomatoso de pulmón de una paciente caucásica de 58 años de edad. Se caracterizan por producir queratina. Su código de Ia ATCC es CCL- 185.
Las 3 líneas celulares fueron obtenidas a través del Servicio de Cultivos Celulares del Centro de Instrumentación Científica de Ia Universidad de Granada.
2. Mantenimiento de los cultivos.
Los cultivos de células se realizaron en una cabina de flujo laminar (Micro-V, Telstar, España) bajo condiciones de esterilidad. Los frascos de cultivo estériles Falcon (25 o 75 cm2, Corning Costar), se mantuvieron en una estufa a 370C con una atmósfera de 5% de CO2 y 90% de humedad.
Para el cultivo de las líneas MCF-7 y A-549 se utilizó el medio Dubelcco's Eagle modificado (DMEM) (Gibco, USA) (13,37 gr de medio base), suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) en calor húmedo a 56°C durante 30 minutos. El medio fue tamponado con 27 mi de NaHCO3 al 7,5%, y 10 mi buffer Hepes (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) 1 M pH 7,2 y suplementado con 40 mg/l de gentamicina (Antibióticos S.A), 500 mg/l de ampicilina (Antibióticos S.A), 10 mi de L-glutamina (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) 200 mM, 0,1 lU/ml de Insulina bovina (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) y agua bidestilada, c.s.p. hasta 1000 mi.
Para el cultivo de Ia línea T-84 se utilizó una mezcla con una relación 1 :1 del medio de cultivo anterior y Ham F12, y Ia cantidad final de suero fetal bovino inactivado fue del 5%. En ambos casos, una vez preparado el medio de cultivo fue filtrado con filtros Millex estériles de 0,22 μm (Millipore, France) y conservado en frascos estériles.
Durante el cultivo celular las células tuvieron que ser resembradas en nuevos envases Falcon, conforme se alcanzaba Ia confluencia celular. Para ello, las células fueron lavadas dos veces con PBS (Tampón salino de fosfato, Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA), con un volumen de 0,2 mi/ cm2, y despegadas con 0,1 mi/ cm2 de tripsina- EDTA (0,25 % Tripsina, 0,02 % EDTA en PBS, Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA).
Transcurrido el tiempo necesario, se bloqueó Ia acción de Ia tripsina mediante Ia adición del correspondiente medio de cultivo con suero fetal. Tras centrifugar, el pellet de células se resuspendió en medio de cultivo estéril y tras realizar el contaje del número total de células con cámara de Neubauer, se diluyeron los pellets hasta obtener una concentración de 2 x 104 células / mi, que fueron dispuestas en nuevos frascos de cultivo.
Para el conteo de las células mediante cámara de Neubauer, se tomaron alícuotas de 100 μL de las suspensiones celulares, sobre las que se añadieron 100 μL de Azul de Tripan al 0,5%, para poder determinar Ia viabilidad de las células. Las mezclas se dispusieron en cámaras de Neubauer y se contabilizaron 5 cuadrantes, de manera que el número de células/mL se obtuvo medíante Ia siguiente fórmula: Media del número de células contabilizadas en los 5 cuadrantes x factor dilución (2) x 104.
3. Método de congelación celular. Para la congelación celular, las células fueron despegadas de Ia superficie de los frascos de cultivo mediante el protocolo descrito anteriormente, hasta obtener un pellet celular que fue resuspendido en medio de congelación a razón de 0,5 x 106 células por mi, siendo introducidas inmediatamente en criotubos y éstos en el congelador a -8O0C durante 24 h, para posteriormente ser almacenadas definitivamente en nitrógeno líquido.
El medio de congelación empleado estaba constituido por suero fetal bovino (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) inactivado en calor húmedo a 560C durante 30 min, y dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%.
4. Método de descongelación celular.
Para Ia descongelación de Ia línea celular, los criotubos fueron sacados del contenedor de nitrógeno líquido e introducidos en una cubeta de agua a 37 0C. Una vez descongelado el criotubo se enjuagó con alcohol de 70% y se abrió en condiciones de esterilidad. Se resuspendió el contenido de los criotubos en medio de cultivo estéril a 37°C, se lavaron dos veces con medio nuevo para eliminar los restos de DMSO y se procedió a realizar un contaje con cámara de Neubauer, para poder obtener una suspensión celular con una concentración de 2 x 104 células / mi, que finalmente fue sembrada en nuevos frascos de cultivo.
5. Preparación de los compuestos a ensayar.
Los compuestos que se han utilizado como ejemplos de cada una de las familias con fórmula general tipo 1 y 2 respectivamente fueron:
- Fórmula General 1 (Tabla 1):
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Fórmula General 2 (Tabla 2):
Figure imgf000010_0002
Los compuestos, protegidos mediante patente ES200800837, partieron de una forma sólida que fue resuspendida en DMSO puro hasta obtener una concentración de entre 1 ,8 a 3 mg/mL en función del peso molecular de cada uno de los compuestos. Las soluciones stock fueron almacenadas a -20° C hasta su utilización.
6. Tratamiento de las líneas celulares con los compuestos.
El tratamiento de las líneas celulares se desarrolló siguiendo el siguiente protocolo: células de las diferentes líneas fueron despegadas de Ia superficie de cultivo con una mezcla de tripsina-EDTA (0,25 % Tripsina, 0,02 % EDTA en PBS, Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA), lavadas, resuspendidas en medio de cultivo y contadas mediante cámara de Neubauer, tal y como se describió anteriormente. A continuación se sembraron en placas estériles de 24 pocilios a razón de 5 x 103 células por pocilio en un volumen final de 1mL del medio de cultivo correspondiente. Transcurridas 24h de incubación en estufa de CO2, se procedió a cambiar el medio de cultivo y a añadir concentraciones crecientes de los compuestos a ensayar, que oscilaron en un rango de entre 0.1 a 60 μM. El grupo control no recibió ninguna dosis de compuesto. A continuación, se dejaron las placas incubar 72h y se volvió a cambiar el medio y a adicionar compuesto nuevo. Después de pasar otras 72h se dio por finalizado el tiempo de inducción con los compuestos. 7. Método para Ia determinación del valor de las concentraciones inhibitorias 50 (CUn) de los compuestos.
Al cabo de los 6 días de inducción de las células con los compuestos a concentraciones crecientes, se procedió a cuantificar el número de células presente en cada uno de los pocilios. Para ello se utilizó una técnica de cuantificación colorimétrica con Sulforrodamina-B (SRB) [Papazisis K. T., Geromichalos G. D., Dimitríadis K. A., Kortsaris A. H. Optimization of the sulforhodamine B colorimetric assay. J Immunol Methods (1997); 208(2): 757-8/ tal y como se describe a continuación:
1. Se aspiró el medio de cultivo de las placas.
2. Se fijaron las células mediante Ia adición de 300 μl_ de ácido tricloroacético (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) al 10% frío (40C) en cada uno de los pocilios, y se dejó en Ia nevera a 40C durante 30 minutos. 3. Después se realizaron 3 lavados con agua destilada y se dejaron secar las placas.
4. Posteriormente, se procedió a teñir las células con 500 μL/pocillo de SRB al 0.4% en ácido acético al 1% durante 20 min a temperatura ambiente.
5. Se eliminó Ia SRB, se lavaron tres veces las placas con ácido acético al 1% y se dejaron secar a temperatura ambiente en oscuridad.
6. Se solubilizó Ia SRB fijada a las células con 500 μL/pocillo de una solución 1OmM Tris-base (pH 10.5) con agitación suave.
7. Alícuotas de 100 μl_ se transfirieron a placas de 96 pocilios por triplicado y se leyeron las densidades ópticas en un colorímetro Titertek multiscan con un filtro para una longitud de onda de 492 nm.
Los valores de densidades ópticas obtenidas en un lector de placas Multiskan-Ex (Thermo Scientific), fueron transformados en el correspondiente valor de número de células, mediante el empleo de una recta de regresión ajustada anteriormente, considerando valores conocidos de número de células y sus densidades ópticas resultantes.
8. Acción de los compuestos sobre el crecimiento de las líneas tumorales. En Ia tabla 4 aparecen los valores de Cl50 de los compuestos que ejemplifican Ia invención:
Tabla 4
Linea celular
MCF-7 A- 549 T-84
Código Media Cl50 en μM ± Desv. Estándar |
Fórmula I
1 33,01 ± 2,79 19,89 ± 0,22 25,04 ± 0,24
1b 45,06 ± 6,5 26,96 ± 0,14 40,02 ± 0,23
3 40,41 ± 9,75 28,14 ± 0,45 29,02 ± 0,48
4 39,63 ± 6,00 20,17 ± 0,21 23,66 ± 4,40
Fórmula Il 6 0,35 ± 0,10 1 ,38 ± 0,83 0,559 ± 0,13
7 16,02 ± 0,40 17,51 ± 0,75 16,74 ± 0,62
8 28,63 ± 0,80 10,53 ± 1,80 14,70 ± 3,06
11 38,37 ± 5,30 41 ,17 ± 2,70 30,01 ± 3,92
En Ia línea celular MCF7, los compuestos de estructura tipo I dieron lugar a unos valores de Cl50 por encima de 30 μM, mientras que en términos generales, en las otras dos líneas los valores fueron inferiores a Io observado en MCF-7, destacando el valor del compuesto 1 y 4 sobre Ia línea A-549.
Entre los compuestos de estructura tipo II, el número 6 dio como resultado el mejor valor de actividad de todos los compuestos evaluados en las tres líneas. El resultado obtenido con MCF-7 ha sido el más activo, con un valor de 0,35 ± 0,10 μM, del orden de 5 veces más potente que el resultado alcanzado con un control positivo, establecido mediante el tratamiento de células de Ia misma línea celular con el fármaco antitumoral 5-Fluorouracilo.
La estructura merosesquiterpénica del compuesto 6, relacionada con los metabolitos tipo puupehenona otorga a este tipo de estructuras una importante actividad biológica. Además, de los cuatro representantes de su grupo, el compuesto 6 tiene una constitución más simple, carente de sustituyentes OMe y OH en posiciones R4 y R5, que a tenor de los resultados representados en Ia tabla 4, reducen sensiblemente Ia actividad, especialmente los que ocupan las posiciones R4. Aunque en estos ensayos el compuesto 6 muestra mayor especificidad frente a Ia estirpe tumoral de mama, en las otras dos líneas celulares, A-549 y T-84, Ia actividad del compuesto también fue muy importante, mejorando en ambos casos el valor del control positivo.
En resumen, y tras los ensayos realizados, Ia presente invención tiene como objetivo el uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, para el tratamiento del cáncer, donde dichos compuestos son seleccionados de Ia familia determinada por las fórmulas generales 1 y 2, especialmente el de aquellos compuestos que se obtienen cuando R1=CH3, R2= COOMe y R3= CH2.
En los experimentos realizados, destaca Ia efectividad frente a células tumorales de los compuestos de fórmula general 1 en los que R4= COOMe ó OH y R5= COOMe y en los que R4= COOMe ó CN y R5= H y los compuestos de fórmula general 2 en los que R4= H y R5= H ó OMe y en los que R4= OMe ó OH y R5= H.
Dentro de las numerosas aplicaciones para el tratamiento del cáncer, destacan las aplicaciones frente al cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer colorrectal.
Otro de los objetivos de esta invención sería Ia fabricación de un medicamento o fórmula farmacéutica que comprendiese cualquiera de los compuestos mencionados para el tratamiento de cáncer, en especial para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer colorrectal.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, para el tratamiento del cáncer, donde dichos compuestos son seleccionados de Ia familia determinada por las fórmulas generales 1 y 2, donde
a) La fórmula general de Ia familia de compuestos del tipo 1 es:
Figure imgf000014_0001
Donde:
Las líneas punteadas indican las tres posiciones posibles, y excluyentes entre sí, de un doble enlace.
R1y R2 representan, independientemente, un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, - CH2OH, -CH2OR, -CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR, -OCHO, -OCOCH3, -OH, - OR, donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo.
R3 representa un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, -CH2OH, -CH2OR, - CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR (donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo), cuando el doble enlace es endocíclico, y R3 representa un grupo metileno o un oxígeno cuando el doble enlace es exocíclico.
R4 y R5, representan independientemente un grupo seleccionado de entre -H, -R, -CHO, -COR, -CN, -COOH, -COOR, -CF3, -COOCO-, -SO2R, -NO2, -COCI, - CH2OH, -CH2OCOCH3, CH2OR, -CH2CI, -CH2NH2, -CH2COOH, -CH=CH2 1 -OCHO, - OCOCH3, -OH, -OR y halógeno; donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado o arilo.
b) La fórmula general de Ia familia de compuestos del tipo 2 es:
Figure imgf000015_0001
Donde:
Las líneas punteadas indican las tres posiciones posibles, y excluyentes entre sí, de un doble enlace.
R1y R2 representan, independientemente, un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, - CH2OH, -CH2OR, -CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR, -OCHO, -OCOCH3, -OH, - OR, donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo.
R3 representa un grupo seleccionado de entre -R, -CHO, -CH2OH, -CH2OR, - CH2OCOCH3, -COR, -COOH, -COOR (donde -R representa un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o arilo), cuando el doble enlace es endocíclico, y R3 representa un grupo metileno o un oxígeno cuando el doble enlace es exocíclico. R4, R5 representan independientemente un grupo seleccionado de entre -H, -OH, -R, -OR y halógeno, donde -R representa un grupo alquilo Ci-C4 lineal o ramificado o arilo.
2.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, donde dichos compuestos son seleccionados de Ia familia determinada por las fórmulas generales 1 y 2.
3.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque R1=CH3, R2= COOMe y R3= CH2
4.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, seleccionados de Ia familia determinada por Ia fórmula 1 , según reivindicación 3, caracterizado porque R4= COOMe ó OH y R5= COOMe
5.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, seleccionados de Ia familia determinada por Ia fórmula 1 , según reivindicación 3, caracterizado porque R4= COOMe ó CN y R5= H
6.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, seleccionados de Ia familia determinada por Ia fórmula 2, según reivindicación 3, caracterizado porque R4= H y R5= H ó OMe.
7.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, seleccionados de Ia familia determinada por Ia fórmula 2, según reivindicación 3, caracterizado porque R4= OMe ó OH y R5= H.
8.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el tratamiento y/o profilaxis frente a cánceres sólidos, especialmente los cánceres de mama, neuroblastomas, pulmón, colorrectal, hepático y páncreas, y frente a síndromes mieloproliferativos agudos y crónicos tanto en humanos como en animales.
9.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis frente a cánceres sólidos, especialmente los cánceres de mama, neuroblastomas, pulmón, colorrectal, hepático y páncreas, y frente a síndromes mieloproliferativos agudos y crónicos tanto en humanos como en animales.
10.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el tratamiento y/o profilaxis frente cáncer de mama
11.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis frente cáncer de mama
12.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el tratamiento y/o profilaxis frente cáncer de pulmón.
13.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis frente cáncer de pulmón.
14.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el tratamiento y/o profilaxis frente cáncer colorrectal.
15.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis frente cáncer colorrectal.
16.- Uso de merosesquiterpenos, sus derivados, formas homoquirales, sales farmacológicamente aceptables y profármacos de los mismos, según reivindicaciones 1 a 7, en composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer, independientemente del resto de componentes activos o de excipientes que formen parte de dicho medicamento o fórmula farmacéutica.
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Non-Patent Citations (2)

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