WO2010070170A1 - Modelos animales y células derivadas para su uso en la determinación de compuestos útiles en el tratamiento de linfomas de células t - Google Patents

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lymphoid
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Xose Ramón GARCÍA BUSTELO
Sergio RUIZ MACÍAS
Eugenio Santos De Dios
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Salamanca
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Salamanca
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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases

Definitions

  • the present invention falls within the field of biotechnology. It refers to a method to evaluate if a compound is effective in the prevention and / or treatment of a disease associated with T-cell lymphomas.
  • Vav1 is a guanosine nucleotide exchange factor (abbreviated from now on as FING) that is specifically expressed in hematopoietic cells and that is activated in a phosphorylation-dependent manner after RCT stimulation (Kane et al. (2000) Curr Opinion Immunol. 12: 242-249).
  • Vav1 the specific phosphorylation in tyrosine residues in Vav1 is a necessary requirement for the transduction of signals that lead to the increase in calcium fluxes, for the activation of the NFAT transcription factors (in English, nuclear factor of activated T-cells) or to the activation of the Ras / Erk pathway (from English, extracellular signal-regulated kinase) (Bustelo (2001) Oncogene. 20: 6372-6381).
  • Animals deficient in Vav1 have defects in the differentiation of thymocytes CD44 + CD25 + to CD44-CD25 + as well as defects in positive and negative selection (Tybulewicz et al. 2003). As a result of these defects, animals deficient in the Vav1 gene are characterized by strong T-cell lymphopenia as well as defects in proliferation, cytokine synthesis and ERK activation after RCT stimulation.
  • the RasGRF family of proteins is composed of two members, RasGRFI and RasGRF2 that work as FINGs for GTPases of the Ras superfamily (Quilliam et al. (2002) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 71: 391-444). These proteins contain several functional domains, among which are an ilimaquinone domain capable of binding to Ca2 + ions and calmodulin protein, a domain homologous to DbI regions present in FINGs for Rho / Rac proteins and a typical FINGs Cdc25 domain for Ras proteins . These last two domains are responsible for catalyzing the exchange of GDP molecules with GTP molecules in GTPases Rac1 and Ras, respectively (Quilliam et al.
  • RasGRF2 has recently been identified as a new component of the signaling of RCT in T lymphocytes (Ruiz et al. (2007) Mol CeII Biol. 27: 8127-8142). Animals deficient in RasGRF2 have defects in the NFAT-dependent transcriptional activation of certain cytokines, such as tumor necrosis factor alpha or interleukin 2, after RCT stimulation (Ruiz et al. (2007) Mol CeII Biol. 27: 8127 -8142).
  • lymphoma a group of types of cancer that begin in the lymphatic system. It is estimated that for every 100,000 inhabitants, 7.7 percent of men and 5.2 percent of women suffer from lymphoma, and it is estimated that the incidence of lymphoma increases between 3 and 4% each year. Lymphomas are a clinically heterogeneous disease, with more than 35 types of lymphomas that fall into two main categories: Hodgkin lymphoma and all other lymphomas, called non-Hodgkin lymphomas.
  • Hodgkin lymphoma Hodgkin lymphoma and all other lymphomas, called non-Hodgkin lymphomas.
  • transgenic animals used for these purposes for different diseases are those described in the patents with publication number: ES2303454, EP1586653, EP1619248, EP1839485, EP1907566, US2008060088, US2007186299, WO2008084566, WO2005098008 and WO03081996. Specifically, transgenic animals have been described for the study of lymphomas in patents with publication number: US5907079, US2006294611, US2008167457 and US2008070256.
  • lymphoma Despite the incidence of lymphoma in industrialized countries, the etiology of most lymphomas is unknown, and there may be different molecular pathways affected. On the other hand, at present, most of the treatments used are not specific approaches to each type of lymphoma or molecular alteration, but general treatments based on chemotherapy or radiotherapy. Therefore, there is a need to develop new animal models of lymphoma that allow understanding the molecular mechanisms underlying the initiation and progression of lymphomas, as well as identifying new compounds that allow a more specific and effective therapy.
  • the present invention relates to the use of a non-human animal or the cell line derived therefrom, deficient in the expression and / or activity of endogenous Vav1 and / or RasGRF2 proteins for determining the effect of a compound or combination of compounds useful for the prevention and / or treatment of T-cell lymphomas.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that mice deficient in the Vav1 gene develop T-cell lymphomas in the adult animal and, additionally, that simultaneous deficiency in the Rasgrf2 gene increases the susceptibility, kinetics of appearance , progression and aggressiveness of said lymphomas.
  • the authors of the present invention demonstrate that the low sensitivity of the murine strain B10.BR to the development of metastatic T-type lymphomas increases in the absence of the Rasgrf2 gene (Rasgfrf2 - / -) and is even more evident in mice with deficiency in the Vav1 gene (Vav1 - / - mice).
  • they have observed that the simultaneous loss of the Rasgrf2 and Vav1 genes (Vav1 - / - mice; Rasgrf2 - / -) increases the susceptibility to lymphoma formation, reduces the latency time for the appearance of said lymphomas and, in addition, increases the aggressiveness and malignancy of the same.
  • T lymphomas have an origin in the thymus, demonstrated by the fact that in the early stages pretumoral and / or tumor cells were observed exclusively in the thymus that are not disseminated in other tissues. Finally, a decrease in the expression levels of the Rasgrf2 gene is common in lymphomas, as the inventors have observed when analyzing the expression in a panel of different types of human lymphomas.
  • a first aspect of the present invention refers to a method to evaluate if a compound is effective in the prevention and / or treatment of lymphoid neoplasms comprising:
  • a) Obtaining or generating an experimental animal model of a non-human mammal with a deficiency in the activity of Vav1 and / or RasGRF2 proteins or cells derived therefrom; b) Administration of the compound to the animal model and / or cells of a); and c) The determination of its effect on at least one parameter indicative of the disease.
  • the experimental model of a non-human mammal with a deficiency in the activity of Vav1 and / or RasGRF2 proteins generated in step a) can be used as a model of in vivo study of the role played by endogenous Vav1 and / or RasGRF2 proteins in lymphoid neoplasms.
  • Vav1 protein refers to an intracellular enzyme whose activity is dependent on tyrosine phosphorylation and that promotes the exchange of guanosine nucleotides in the GTPases of the Rho / Rac family.
  • the gene that encodes the Vav1 protein is scientifically named Vav1.
  • Mice lacking functional versions of the VaW gene are referred to as Vav1 - / - mice.
  • RasGRF2 protein refers to an intracellular enzyme whose activity is dependent on tyrosine phosphorylation and that promotes the exchange of guanosine nucleotides in the GTPases of the Ras superfamily.
  • the gene that encodes the RasGRF2 protein is scientifically called Rasgr ⁇ 2. Mice lacking functional versions of the Rasgr ⁇ 2 gene are referred to as Rasgr ⁇ 2 - / - mice.
  • non-human mammal refers to a non-human mammalian animal of any genetic background, preferably laboratory animals as rodents, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, belonging to the Next group: rabbits, hamsters, rats and mice, or nonhuman primates.
  • experimental animal model of a non-human mammal, as used in the description, refers to a viable animal in which the levels of Vav1 and / or RasGRF2 proteins have been reduced or canceled through various techniques. Pharmacological or genetic by any method known by an expert in the field that serves this purpose.
  • the experimental animal model is a transgenic animal.
  • transgenic refers to non-human mammals that contain a transgene and includes, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, models knock-out, knock-in or knock-down animals, conditional or inducible, generated by any method known to a person skilled in the art that serves this purpose, in any genetic background.
  • the transgenic animal is a knock-out animal of the endogenous Vav1 and / or Rasgr ⁇ 2 genes.
  • knock-out refers to the partial or total suppression of the expression of at least a part of a protein encoded by an endogenous DNA sequence in a cell, both in its form of RNA as a protein
  • the knock-out non-human mammal of the invention may possess somatic and germ cells in which at least one allele, of the endogenous Vav1 and / or Rasgr ⁇ 2 genes is inactivated
  • the non-human mammal Knock-out of the invention has somatic and germ cells in which both alleles, of one endogenous Vav1 and / or Rasgr ⁇ 2 genes are inactivated
  • the knock-out non-human mammal of the invention has somatic cells and germinals in which both alleles the endogenous Vav1 and Rasgr ⁇ 2 genes are inactivated.
  • the experimental animal models of non-human mammals of the invention can be used to obtain cells for cell culture or for the generation of stable cell lines, by any method known to a person skilled in the art that serves this purpose.
  • the cells obtained from the animal experimental model are lymphatic tissue cells. More preferably T lymphocytes, which can be derived from the thymus itself or from other organs invaded by tumor T cells such as the spleen, peripheral lymph nodes, liver, kidney, lung or intestines.
  • the cells obtained from the experimental non-human mammal model of the invention may lack the partial or total expression of endogenous Vav1 and / or RasGRF2 proteins. These cells may have at least one allele, of the inactivated endogenous Vav1 and / or Rasgrf2 genes. In a preferred embodiment, these cells have both alleles, one of the endogenous, inactivated Vav1 and / or Rasgrf2 genes. In a very preferred embodiment, the cells have both alleles of the inactivated endogenous Vav1 and Rasgrf2 genes.
  • the method of the present invention allows to evaluate if a compound is effective in the prevention and / or treatment of lymphoid neoplasms, such as lymphomas
  • B cell neoplasms B cell neoplasms
  • T cell neoplasms T cell neoplasms
  • natural killer (NK) cell neoplasms or associated immunodeficiency lymphoproliferative diseases, both childhood and those developed in the adult.
  • neoplasia is a T-cell neoplasm such as, but not limited to, acute T-cell precursor lymphoblastic leukemia and T-cell precursor lymphoblastic lymphoma, chronic T-cell lymphocytic leukemia and T-cell granular lymphocytic leukemia , fungoid mycosis and Sezary syndrome, peripheral T-cell lymphoma, hepatosplenic T-cell and delta T lymphoma, subcutaneous paniculitic T-cell lymphoma, angioimmunoblastic T-cell lymphoma, extranodal nasal-type T / NK lymphoma, lymphoma intestinal type T cell Enteropathic lymphoma and T-cell leukemia in adults, systemic large cell lymphoma or anaplastic large cell lymphoma of the primary cutaneous type.
  • T-cell neoplasm such as, but not limited to, acute T-cell precursor lymphoblastic leukemia and T-cell precursor
  • the term "compound”, as used in the present invention, refers to any compound of natural or synthetic origin, with a genetic therapeutic activity or a pharmacological therapeutic activity.
  • the concepts of gene therapy as well as pharmacological therapy are well known to an expert in the field.
  • the compound is an antineoplastic agent.
  • the determination of the effectiveness of the compound can be carried out by measuring a parameter that is indicative of the disease in the experimental animal models of non-human mammals of the invention, such as, but not limited to , lymphocyte morphology, lymphocyte proliferative index, lymphoma growth rate, extent of the disease, determined according to the number, location and size of the affected nodal and extraganglionic areas, serum markers (such as, but not limited to, LDH and beta2-microglobulin), the expression of lymphocyte surface markers and morbidity or mortality, where a favorable change with the level of the indicator in relation to the reference change using untreated animals under comparable conditions, indicates that the compound is active / or to treat said disease.
  • a parameter that is indicative of the disease in the experimental animal models of non-human mammals of the invention such as, but not limited to , lymphocyte morphology, lymphocyte proliferative index, lymphoma growth rate, extent of the disease, determined according to the number, location and size of the affected nodal and extraganglionic areas, serum markers (such as
  • the study of these parameters can be carried out by different techniques known by an expert in the field, among which are, but not limited to, hemogram, radiographs, ultrasound, computed tomography (CT Sean), magnetic resonance imaging (MRI) , gallium scintigraphy, PET positron emission tomography (PET), bone scintigraphy, bone marrow analysis, lumbar puncture, flow cytometry, surgical biopsy or necropsy.
  • CT Sean computed tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • PET positron emission tomography
  • bone scintigraphy bone marrow analysis
  • flow cytometry surgical biopsy or necropsy
  • the determination of the effectiveness of the compound can be carried out by means of the measurement of a parameter that is indicative of the disease in the cells derived from the experimental animal models of non-human mammals of the invention, such as, but not limited to, proliferation, apoptosis, drug resistance, tumor or metastatic capacity.
  • Another aspect of the invention refers to the use of experimental animal models of non-human mammals of the invention or to cells derived therefrom for the identification of new markers with diagnostic or prognostic value in lymphoid neoplasms.
  • the identification of markers takes place through the analysis of the differential expression of genes between a wild non-human mammal and an experimental animal model of a non-human mammal with deficiency of the activity of Vav1 and / or RasGRF2 proteins, or of the cells derived from them.
  • the detection of the quantity of product of the expression of the genes can be carried out by any method of determining the quantity of the product of the expression of the genes known by the person skilled in the art.
  • the detection of the product of the expression of the genes is performed by determining the level of mRNA derived from its transcription where the analysis of the mRNA level can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), back transcription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), back transcription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), back transcription in combination with the quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR), or any other nucleic acid amplification method; DNA microarrays made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybridization with a specific probe; by NMR or any other imaging technique using paramagnetic nanoparticles or any other type of nanoparticles detectable functional
  • PCR poly
  • the detection of the product of the expression of the genes is carried out by determining the protein level derived from its translation where the analysis of the protein level can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by Ia incubation with a specific antibody, for example, by Western blotting, electrophoresis gels, protein chips, ELISA or any other enzymatic method; by NMR or any other imaging technique.
  • kits adapted to carry out the method for evaluating whether a compound is effective in the prevention and / or treatment of lymphoid neoplasms, comprising:
  • RasGRF2 RasGRF2; and b) Cells derived from a wild mouse.
  • kits may also comprise the elements necessary for the determination of its effect on at least one parameter that is indicative of the disease in the cells derived from the experimental animal models of non-human mammals of the invention, such as, but not limited to, proliferation or apoptosis.
  • the kit also includes instructions for carrying out the first method of the invention.
  • Figure 1 It shows that the joint loss of the genes for Rasgrf2 and Vav1 increases the formation of lymphoblastic lymphomas in the mouse.
  • A Schematic representation by means of a Kaplan-Meyer histogram of the percentage of mice of the different genotypes indicated that did not develop tumors as a function of time (in months), n> 24.
  • FIG. 2 It shows that lymphoid tumors of Vav1 - / - mice; Rasgrf2-l- contain highly proliferative positive CD3 cells
  • A Cell suspensions obtained from animals of the indicated genotypes were analyzed by flow cytometry after incubating the cells with antibodies specific against CD3, a protein expressed exclusively in T lymphocytes. The red squares indicate the positive CD3 tumor populations detected in Vav1 - / - mice; Rasgrf2-l- that had developed tumors in the lymphoid system.
  • SSC refers to the parameter known in flow cytometry as "side scatter" or light scattered at right angles.
  • FCS refers to the parameter used in flow cytometry known as "forward scatter” or light scattered at the small conical angle.
  • D Organs obtained from a Vav1 mouse - ⁇ - ⁇ Rasgrf2- ⁇ - were stained with antibodies against CD3 (upper panels) or with antibodies against PCNA (lower panels) using immunocytochemical techniques. Bar: 10 ⁇ m.
  • FIG. 4 It shows that the T lymphomas found in Vav1-I- ⁇ Rasgrf2-l- and Vav1-I- mice derive from the thymic gland.
  • Figure 5 Shows the expression of the Rasgrf2 gene in human lymphomas is less than in normal tissues. Analysis of the expression of Vav1 genes (panel upper) and human Rasgrf2 (lower panel) by quantitative PCR in a panel of human lymphoma samples representative of different stages of the disease. Sample 1 represents the average relative expression of 6 samples of lymphoid tissue from different control animals (dashed line) while the rest of the samples are referred to as percentage of change with respect to the control sample. The expression of the Gapdh gene was used as a value for the normalization of the expression values between the different samples, ua, arbitrary units.
  • Rasgrf2-I- mice showed intermediate death / disease rates in these studies to those observed in mice Vav1 - / - and Vav1 - ⁇ - ⁇ Rasgrf2- ⁇ - (Fig. 1A).
  • thymus hyperplasia, splenomegaly and lymphadenopathy were observed in the majority of animals analyzed (Fig. 1 B).
  • the thymus, spleen and lymph nodes showed significant histological alterations due to the invasion and growth of tumor cells in said organs (Fig. 1C).
  • the pathological analysis of these animals also showed numerous infiltrations of tumor cells in various non-hematopoietic organs such as the kidneys, livers, intestines and bone marrow (Fig. 1C and data not shown).
  • Tumors present in these animals were identified as having lymphoid origin, since studies by flow cytometry indicated that the tumor cells present in the thymus, spleen and bone marrow of these animals expressed high levels of CD3, a surface antigen specifically expressed in T lymphocytes and not in other cell types (Fig. 2A). Similarly, studies conducted by immunocytochemical techniques revealed that the tumor cells present in the hematopoietic and non-hematopoietic organs of these animals were positive for said T-cell marker (Fig. 2D). Despite this uniformity regarding the expression of this marker, subsequent studies showed that tumor cells could have different immunophenotypes for two other T-cell markers, CD4 and CD8 proteins, depending on the animal analyzed.
  • animals could be detected where the tumor cells were homogeneously double positive for CD4 and CD8, others in which the tumor cells belonged to two different subgroups (double positive for CD4 and CD8 and positive populations only for the CD8 marker) and animals in which the tumor cells were stained homogeneously for CD8 and not for the CD4 marker (Fig. 2B).
  • Fig. 2B it was always observed that for a specific animal, all tumor cells had the same immunophenotype for CD4 and CD8 markers regardless of the organ from which they had been purified (Fig. 2B).
  • lymphoid tumors 1.2.
  • the ontology of lymphoid tumors demonstrates their origin in thymus lymphocytes.
  • the observations obtained in example 1 indicate that the deletion of the VaW gene and / or Ia of the Rasgrf2 gene can participate in the development of tumors lymphoid in humans.
  • the expression was analyzed by quantitative PCR of both proteins in a panel of samples containing lymphocytes from 6 normal individuals and samples from 42 patients who had different types of human lymphomas. These samples included different stages of tumor progression of tumors as well as T and B cell derived lymphomas (Fig. 5). While it was seen that the VaW gene did not suffer decreases in its expression in said tumor collection with respect to the levels present in healthy individuals, it was observed instead that the expression of the Rasgrf2 gene was decreased by 81% of the analyzed tumor samples ( Fig. 5).
  • the expression of the Rasgrf2 gene was completely repressed in a stage I lymphocytic lymphoma (sample 23), a stage II follicular lymphoma (sample 33), and a stage NE mantle cell lymphoma (sample 37).
  • levels of Rasgrf2 gene expression comparable or superior to healthy individuals were observed in only three (7%, samples 29, 36 and 41) and four cases (9%, samples 9, 27, 32 and 43), respectively (Fig. 5).
  • mice deficient in the VaW gene were obtained and were initially described by V. Tybulevicz (NIMR, London, United Kingdom, EU) (Turner et al, 1997).
  • Mice deficient in the Rasgrf2 gene were obtained and were initially described by E. Santos (Cancer Research Center, Salamanca, Spain) (Fernández-Melarde et al, 2002).
  • Mice deficient jointly in the VaW and Rasgrf2 genes were generated by crosses of the previous mice. All the mice used in this study were homogenized in the genetic strain B10.BR. The animals were sacrificed following international regulations at the age of one year or when obvious signs of disease due to tumor development were detected.
  • Flow cytometry analysis (Examples 1.1 and 1.2): The organs extracted from the mice under study were homogenized using a sterile 50 ⁇ m mesh (Falcon) to generate cell suspensions. In the case of bone marrow cells, the femurs of the mice were removed and the bone marrow was extracted by introducing a flow of saline into the bone cavity. Cell suspensions were treated by hypotonic shock in 0.17 M NH 4 CI to remove contaminating erythrocytes and, after several washes in saline solution, lymphocyte populations were labeled with specific antibodies to membrane markers coupled to fluorescent compounds. The antibodies against the CD4, CD3, CD8, CD44, CD25 and B220 markers were all purchased from BD Biosciences.
  • the blasts were detected using the usual SSC and FCS parameters in this type of techniques.
  • Flow cytometry analyzes were performed on a FACSCalibur cytometer (BD Biosciences) and the data was analyzed with the CeII Quest (BD Biosciences), Paint-a-Gate and WinMDI 2.8 software.
  • Histology and immunohistological analysis Selected tissues were fixed in 4% paraformaldehyde in saline solution for 48 hours after which they were embedded in paraffin. Histological sections were stained with hematoxylin / eosin (Sigma) or processed for immunohistochemistry. Immunohistochemical stains were performed in deparaffinized sections using standardized protocols. Antibodies against CD3 were obtained from DAKO, used at a dilution of 1: 200. The monoclonal antibody against PCNA (clone PC10) was obtained from CeII Signaling and was used at a dilution of 1: 100. Secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase against mouse immunoglobulins necessary to reveal immunohistochemicals were obtained from GE Healthcare.
  • Example 2 To analyze the expression of the VaW and Rasgrf2 genes in lymphomas, a panel of cDNAs from samples of dehydrated human lymphomas was used in a 96-well plate (TissueScan Lymphoma Tissue qPCR Array I (2), Cat. Number LYRT101, Origene Technologies). A detailed description of the lymphoma samples contained in this commercial preparation can be found at the Internet address (http://www.origene.com/geneexpression/disease-panels / products / LYRT101.aspx).
  • Quantitative PCR reactions were performed in the IQ5 Real-Time PCR detection system (BioRad) and the SYBR® GreenTM two-step qRT-PCR (Invitrogen) kit was used.
  • Sample number 1 represents an average of the relative expression of 6 different samples of normal tissues. At this average, an arbitrary value of 1 was given. The remaining expression values are shown in the study as a percentage of variation with respect to that value. To eliminate spurious variations due to different sample loads, etc., the relative values of Vav1 and Rasgrf2 expression obtained in each sample were normalized using, for this, the value of the expression of the gene encoding the GAPDH enzyme.

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Abstract

La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biotecnología. Se refiere a un método para evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada a linfomas de células T.

Description

MODELOS ANIMALES Y CÉLULAS DERIVADAS PARA SU USO EN LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS ÚTILES EN EL TRATAMIENTO DE
LINFOMAS DE CÉLULAS T.
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biotecnología. Se refiere a un método para evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada a linfomas de células T.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La activación del receptor de Ia célula T (abreviado a partir de ahora como RCT) induce Ia activación de múltiples vías de señalización necesarias para Ia correcta diferenciación y función de las células T (Kane et al. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:242-249). Vav1 es un factor de intercambio de nucleótidos de guanosina (abreviado a partir de ahora como FING) que se expresa específicamente en células hematopoyéticas y que se activa de una manera dependiente de fosforilación tras Ia estimulación del RCT (Kane et al. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:242-249). De hecho, Ia fosforilación específica en residuos de tirosina en Vav1 es un requisito necesario para Ia transducción de señales que conllevan al incremento en flujos de calcio, para Ia activación del factores de transcripción NFAT (del inglés, nuclear factor of activated T-cells) o a Ia activación de Ia vía de Ras/Erk (del inglés, extracellular signal-regulated kinase) (Bustelo (2001 ) Oncogene. 20:6372-6381 ). Los animales deficientes en Vav1 tienen defectos en Ia diferenciación de timocitos CD44+CD25+ a CD44- CD25+ así como defectos en selección positiva y negativa (Tybulewicz et al. 2003). Como resultado de estos defectos, los animales deficientes en el gen Vav1 se caracterizan por una fuerte linfopenia de células T así como defectos en Ia proliferación, síntesis de citoquinas y activación de ERK tras Ia estimulación del RCT.
La familia de proteínas RasGRF está compuesta por dos miembros, RasGRFI and RasGRF2 que trabajan como FINGs para GTPasas de Ia superfamilia Ras (Quilliam et al. (2002) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 71 :391-444). Estas proteínas contienen varios dominios funcionales, entre los que se encuentran un dominio ilimaquinona capaz de unirse a iones Ca2+ y a Ia proteína calmodulina, un dominio homólogo a regiones DbI presentes en FINGs para proteínas Rho/Rac y un dominio Cdc25 típico de FINGs para proteínas Ras. Estos dos últimos dominios están encargados de catalizar el intercambio de moléculas GDP por moléculas GTP en las GTPasas Rac1 y Ras, respectivamente (Quilliam et al. (2002) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 71 :391-444). RasGRF2 se ha identificado recientemente como un nuevo componente de Ia señalización del RCT en linfocitos T (Ruiz et al. (2007) Mol CeII Biol. 27:8127-8142). Animales deficientes en RasGRF2 presentan defectos en Ia activación transcripcional dependiente de NFAT de ciertas citoquinas, tales como el factor de necrosis tumoral alfa o Ia interleukina 2, tras Ia estimulación del RCT (Ruiz et al. (2007) Mol CeII Biol. 27:8127-8142). La comparación de Ia función de células T obtenidas de ratones silvestres, ratones deficientes en el gen Vav1, ratones deficientes en el gen Rasgrf2 y ratones deficientes conjuntamente en los genes Vav1 y Rasgrf2 ha permitido demostrar también que Ia vía de RasGRF2 coopera funcionalmente con Ia de Vav1 para asegurar valores óptimos de transformación blástica y proliferación tras Ia estimulación de dichos linfocitos a través de su RCT. Debido a ello, Ia ausencia del gen Rasgrf2 agrava los defectos en transformación blástica y proliferativos que poseen los linfocitos T procedentes de ratones deficientes en el gen Vav1 estimulados a través del RCT (Ruiz et al. (2007) Mol CeII Biol. 27:8127-8142).
Reciben el nombre de linfoma un grupo de tipos de cáncer que comienzan en el sistema linfático. Se calcula que por cada 100.000 habitantes un 7,7 por ciento de hombres y un 5,2 por ciento de mujeres sufren linfoma, y se estima que Ia incidencia del linfoma aumenta entre un 3 y un 4 % cada año. Los linfomas son una enfermedad clínicamente heterogénea, existiendo más de 35 tipos de linfomas que se dividen en dos categorías principales: linfoma de Hodgkin y todos los demás linfomas, denominados linfomas no Hodgkin. Está ampliamente reconocido el potencial que tienen los modelos experimentales de animales de laboratorio para el análisis de Ia función in vivo de un determinado gen, así como para el estudio de compuestos que potencialmente podrían ser útiles en el tratamiento o prevención de patologías relacionadas con Ia expresión nula o inadecuada de dicho gen. Algunos ejemplos de animales transgénicos empleados con estos fines para diferentes enfermedades son los descritos en las patentes con número de publicación: ES2303454, EP1586653, EP1619248, EP1839485, EP1907566, US2008060088, US2007186299, WO2008084566, WO2005098008 y WO03081996. Concretamente, se han descrito animales transgénicos para el estudio de los linfomas en las patentes con número de publicación: US5907079, US2006294611 , US2008167457 y US2008070256.
A pesar de Ia incidencia del linfoma en los países industrializados, Ia etiología de Ia mayoría de los linfomas es desconocida, pudiendo existir diferentes rutas moleculares afectadas. Por otra parte, en Ia actualidad Ia mayoría de los tratamientos empleados son aproximaciones no específicas a cada tipo de linfoma o alteración molecular, sino tratamientos generales basados en Ia quimioterapia o Ia radioterapia. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevos modelos animales de linfoma que permitan entender los mecanismos moleculares subyacentes a Ia iniciación y progresión de los linfomas, así como identificar nuevos compuestos que permitan una terapia más específica y eficaz.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al empleo de un animal no humano o de Ia línea celular derivada del mismo, deficientes en Ia expresión y/o actividad de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2 endógenas para Ia determinación del efecto de un compuesto o combinación de compuestos útiles para Ia prevención y/o el tratamiento de linfomas de células T. La solución proporcionada por esta invención se basa en el hecho de que los ratones deficientes en el gen Vav1 desarrollan linfomas de células T en el animal adulto y, adicionalmente, a que Ia deficiencia simultánea en el gen de Rasgrf2 aumenta Ia susceptibilidad, cinética de aparición, progresión y agresividad de dichos linfomas.
Los autores de Ia presente invención demuestran que Ia baja sensibilidad de Ia cepa murina B10.BR al desarrollo de linfomas metastáticos de tipo T aumenta en ausencia del gen Rasgrf2 (Rasgfrf2-/-) y es aún mucho más evidente en ratones con deficiencia en el gen Vav1 (ratones Vav1-/-). Además, han observado que Ia pérdida simultánea de los genes Rasgrf2 y Vav1 (ratones Vav1-/-;Rasgrf2-/-) incrementa Ia susceptibilidad a Ia formación de linfomas, reduce el tiempo de latencia para Ia aparición de dichos linfomas y, además, aumenta Ia agresividad y malignidad de los mismos. Los linfomas T tienen un origen en el timo, demostrado por el hecho de que en estadios tempranos se observaron células pretumorales y/o tumorales exclusivamente en el timo que no están diseminadas en otros tejidos. Por último, una disminución en los niveles de expresión del gen Rasgrf2 es algo común en linfomas, tal y como han observado Io inventores al analizar Ia expresión en un panel de diferentes tipos de linfomas humanos.
Por Io tanto, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de neoplasias linfoides que comprende:
a) La obtención o generación de un modelo experimental animal de mamífero no humano con deficiencia de Ia actividad de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2 o las células derivadas del mismo; b) La administración del compuesto al modelo animal y/o células de a); y c) La determinación de su efecto sobre al menos un parámetro indicativo de Ia enfermedad. El modelo experimental de mamífero no humano con deficiencia de Ia actividad de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2 generado en el paso a) puede ser utilizado como modelo de estudio in vivo del papel desempeñado por las proteínas Vav1 y/o RasGRF2 endógenas en neoplasias linfoides, así como para el diseño y Ia evaluación de compuestos que podrían ser potencialmente interesantes para el tratamiento de las mismas. Asimismo, el uso de las células derivadas de dichos modelos animales podrían servir para el estudio in vitro de determinados aspectos implicados en Ia formación de neoplasias linfoides, y en el diseño y evaluación de compuestos que pudieran actuar modulando dichos aspectos.
El término proteína Vav1 se refiere a una enzima intracelular cuya actividad es dependiente de fosforilación en tirosinas y que promociona el intercambio de nucleótidos de guanosina en las GTPasas de Ia familia Rho/Rac. El gen que codifica a Ia proteína Vav1 se denomina científicamente Vav1. Ratones carentes de versiones funcionales del gen VaW se denominan como ratones Vav1-/-.
El término proteína RasGRF2 se refiere a una enzima intracelular cuya actividad es dependiente de fosforilación en tirosinas y que promociona el intercambio de nucleótidos de guanosina en las GTPasas de Ia superfamilia Ras. El gen que codifica a Ia proteína RasGRF2 se denomina científicamente Rasgrí2. Ratones carentes de versiones funcionales del gen Rasgrí2 se denominan como ratones Rasgrí2-/-.
La deficiencia conjunta en los genes VaW y Rasgrí2 se denota científicamente como Vav1-¡-\Rasgrí2-¡-
TaI como se utiliza en Ia presente invención el término "mamífero no humano " se refiere a un animal mamífero no humano de cualquier fondo genético, preferentemente animales de laboratorio como roedores, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, pertenecientes al siguiente grupo: conejos, hámsteres, ratas y ratones, o primates no humanos. El término "modelo experimental animal" de mamífero no humano, tal y como se utiliza en Ia descripción, hace referencia a un animal viable en el que los niveles de Ia proteínas Vav1 y/o RasGRF2 han sido reducidos o anulados a través de diversas técnicas farmacológicas o genéticas mediante cualquier método conocido por un experto en Ia materia que sirva para tal fin. Preferentemente, el modelo experimental animal es un animal transgénico.
El término "transgénico", aplicado a mamífero no humano, tal como se utiliza en Ia presente invención, se refiere a mamíferos no humanos que contienen un transgén e incluye, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, a modelos animales knock-out, knock-in o knock-down, condicionales o inducibles, generados mediante cualquier método conocido por un experto en Ia materia que sirva para tal fin, en cualquier fondo genético. Preferente, el animal transgénico es un "animal knock-out' de los genes Vav1 y/o Rasgrí2 endógeno.
El término "knock-out' tal como se utiliza en Ia presente invención se refiere a Ia supresión parcial o total de Ia expresión de al menos una parte de una proteína codificada por una secuencia de DNA endógeno en una célula, tanto en su forma de RNA como proteica. El mamífero no humano knock-out de Ia invención puede poseer células somáticas y germinales en las que al menos un alelo, de los genes Vav1 y/o Rasgrí2 endógenos se encuentra inactivado. En una realización preferida, el mamífero no humano knock-out de Ia invención posee células somáticas y germinales en las que ambos alelos, de uno los genes Vav1 y/o Rasgrí2 endógenos se encuentran inactivados. En una realización muy preferida, el mamífero no humano knock-out de Ia invención posee células somáticas y germinales en las que ambos alelos los genes Vav1 y Rasgrí2 endógenos se encuentran inactivados. En otra realización preferida, los modelos experimentales animales de mamíferos no humanos de Ia invención pueden ser utilizados para obtener células para cultivo celular o para Ia generación de líneas celulares estables, mediante cualquier método conocido por un experto en Ia materia que sirva para tal fin. Preferentemente, las células obtenidas a partir del modelo experimental animal son células del tejido linfático. Más preferentemente linfocitos T, los cuales pueden ser derivados del propio timo o de otros órganos invadidos por las células T tumorales como pueden ser el bazo, los ganglios linfáticos periféricos, hígado, riñon, pulmón o intestinos.
Las células obtenidas a partir del modelo experimental de mamífero no humano de Ia invención pueden carecer de Ia expresión parcial o total de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2 endógenas. Estas células puede presentar al menos un alelo, de los genes Vav1 y/o Rasgrf2 endógenos inactivado. En una realización preferida, estas células presentan ambos alelos, de uno los genes Vav1 y/o Rasgrf2 endógenos, inactivados. En una realización muy preferida, las células presentan ambos alelos de los genes Vav1 y Rasgrf2 endógenos inactivados.
El método de Ia presente invención permite evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de neoplasias linfoides, como linfomas
Hodkings, neoplasias de células B, neoplasias de células T, neoplasias de células natural killer (NK) o enfermedades linfoproliferativas asociadas inmunodeficiencia, tanto infantiles como aquellas desarrolladas en el adulto.
Preferentemente, neoplasia es una neoplasia de células T como, por ejemplo, pero sin limitarse a, leucemia linfoblástica aguda precursora de células T y linfoma linfoblástico precursor de células T, leucemia linfocítica y leucemia prolinfocítica crónicas de células T, leucemia linfocítica granular de células T, micosis fungoides y síndrome de Sezary, linfoma periférico de célula T, linfoma hepatoesplénico de células T gamma y delta, linfoma de apariencia paniculítica subcutáneo de células T, linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma extranodal de células T/ NK de tipo nasal, linfoma intestinal de células T de tipo enteropático, linfoma y leucemia de células T en adultos, linfoma sistémico de célula grande o linfoma anaplásico de células grandes de tipo cutáneo primario.
El término "compuesto", tal y como se utiliza en Ia presente invención, se refiere a cualquier compuesto de origen natural o sintético, con una actividad terapéutica génica o una actividad terapéutica farmacológica. Los conceptos de terapia génica así como el de terapia farmacológica son bien conocidos para un experto en Ia materia. Preferentemente, el compuesto es un agente antineoplásico.
En una realización preferida, Ia determinación de Ia efectividad del compuesto, puede ser llevada a cabo mediante Ia medida de un parámetro que sea indicativo de Ia enfermedad en los modelos experimentales animales de mamíferos no humanos de Ia invención, como por ejemplo, pero sin limitarse, morfología linfocitaria, índice proliferativo linfocitario, velocidad de crecimiento que tiene el linfoma, extensión de Ia enfermedad, determinada según el número, localización y tamaño de las áreas ganglionares y extraganglionares afectas, marcadores séricos (como por ejemplo, pero sin limitarse, LDH y beta2-microglobulina), Ia expresión de marcadores de Ia superficie linfocitaria y Ia morbilidad o mortalidad, donde un cambio favorable con el nivel del indicador en relación con el cambio de referencia usando animales no tratados en condiciones comparables, indica que el compuesto es activa/o para tratar dicha enfermedad. El estudio de dichos parámetros puede ser realizado por diferentes técnicas conocidas por un experto en Ia materia, entre los que se encuentran, pero sin limitarse, hemograma, radiografías, ultrasonido, tomografía axial computarizada (CT Sean), resonancia magnética por imágenes (MRI), centellograma con galio, tomografía por emisión de positrones TEP (PET sean), gammagrafía ósea, análisis de médula ósea, punción lumbar, citometría de flujo, biopsia quirúrgica o necropsia. En una realización alternativa, Ia determinación de Ia efectividad del compuesto, puede ser llevada a cabo mediante Ia medida de un parámetro que sea indicativo de Ia enfermedad en las células derivadas de los modelos experimentales animales de mamíferos no humanos de Ia invención, como por ejemplo, pero sin limitarse, proliferación, apoptosis, resistencia a drogas, capacidad tumoral o metastásica.
Otro aspecto de Ia invención, se refiere al uso de los modelos experimentales animales de mamíferos no humanos de Ia invención o a las células derivadas de los mismos para Ia identificación de nuevos marcadores con valor diagnóstico o pronóstico en neoplasias linfoides. Preferentemente, Ia identificación de marcadores tiene lugar mediante el análisis de Ia expresión diferencial de genes entre un mamíferos no humano silvestre y un modelo experimental animal de mamífero no humano con deficiencia de Ia actividad de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2, o de las células derivadas de los mismos. De acuerdo con Ia presente invención, Ia detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes conocido por el experto en Ia materia. En una realización preferida, Ia detección del producto de Ia expresión de los genes se realiza determinando el nivel de RNAm derivado de su transcripción donde el análisis del nivel de RNAm se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, mediante amplificación por reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia ligasa (RT- LCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. En una realización alternativa, Ia detección del producto de Ia expresión de los genes se realiza determinando el nivel proteína derivado de su traducción donde el análisis del nivel de proteína se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, mediante Ia incubación con un anticuerpo específico, por ejemplo, mediante Western blot, geles de electroforesis, chips de proteína, ELISA o cualquier otro método enzimático; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un kit adaptado para llevar a cabo el método para Ia evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de neoplasias linfoides, que comprende:
a) Células derivadas un modelo experimental animal de mamífero no humano con deficiencia de Ia actividad de las proteínas Vav1 y/o
RasGRF2; y b) Células derivadas de un ratón silvestre.
Dicho kit puede comprender también los elementos necesarios para Ia determinación de su efecto sobre al menos un parámetro que sea indicativo de Ia enfermedad en las células derivadas de los modelos experimentales animales de mamíferos no humanos de Ia invención, como por ejemplo, pero sin limitarse, proliferación o apoptosis. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el primer método de Ia invención.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra que Ia pérdida conjunta de los genes para Rasgrf2 y Vav1 incrementa Ia formación de linfomas linfoblásticos en el ratón. (A) Representación esquemática mediante un histograma de tipo Kaplan-Meyer del porcentaje de ratones de los diferentes genotipos indicados que no desarrollaron tumores en función del tiempo (en meses), n > 24. (B) Apariencia macroscópica del timo, bazo, ganglios mesentéricos y riñon provenientes de animales control y de animales en los que se había desarrollado un linfoma. Barra=1 cm. NT, órgano sin tumor. T, órgano con tumor. (C) Secciones histológicas teñidas con hematoxilina/eosina de los tejidos indicados en los que se observa Ia pérdida de Ia arquitectura celular normal en el timo, bazo y ganglios mesentéricos así como el infiltrado de células metastáticas localizadas en tejidos no-hematopoiéticos tales como riñon, pulmón e hígado. Barra: 10 μm.
Figura 2. Muestra que los tumores linfoides de los ratones Vav1-/-;Rasgrf2-l- contienen células CD3 positivas altamente proliferativas (A) Suspensiones celulares obtenidas de animales de los genotipos señalados se analizaron mediante citometría de flujo tras incubar las células con anticuerpos específicos contra CD3, una proteína expresada exclusivamente en linfocitos T. Los cuadrados rojos señalan las poblaciones tumorales CD3 positivas detectadas en los ratones Vav1-/-;Rasgrf2-l- que habían desarrollado tumores en el sistema linfoide. SSC se refiere al parámetro conocido en citometría de flujo como "side scatter" o luz dispersada en el ángulo recto. (B) Suspensiones celulares aisladas de un ratón Vav1-/-;Rasgrf2-l- sano y de cuatro ratones Vav1-/-;Rasgrf2-/- que habían desarrollado tumores se analizaron mediante citometría de flujo tras incubar las células con anticuerpos contra CD4 y CD8, dos marcadores específicos de linfocitos T. (C) Suspensiones celulares aisladas de los tejidos indicados de un ratón Vav1-¡-\Rasgrf2-¡- sano y de dos ratones Vav1-/-;Rasgrf2-l- que habían desarrollado tumores se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el número de blastos. Las líneas verticales de color rojo indican el punto a partir del cual las células fueron consideradas como blastos. FCS se refiere al parámetro usado en citometría de flujo conocido por "forward scatter" o luz dispersada en el ángulo cónico pequeño. (D) Órganos obtenidos a partir de un ratón Vav1 -¡-\Rasgrf2-¡- fueron teñidos con anticuerpos contra CD3 (paneles superiores) o con anticuerpos contra PCNA (paneles inferiores) usando técnicas inmunocitoquímicas. Barra: 10 μm.
Figura 3. Muestra Ia ausencia de tumores en ratones de corta edad independientemente de su genotipo. Representación esquemática del porcentaje de subpoblaciones de timocitos (paneles superiores) y linfocitos esplénicos (paneles inferiores) obtenidos de animales con los genotipos indicados (n=5).
Figura 4. Muestra que los linfomas T encontrados en los ratones Vav1-I- \Rasgrf2-l- y Vav1-I- derivan de Ia glándula tímica. (A) Tinciones realizadas con hematoxilina/eosina e inmunohistoquímicas realizadas con anticuerpos contra CD3 y PCNA de secciones de órganos obtenidos de un ratón Vav1-/-;Rasgrf2-l- con un tumor localizado en el timo. Barra: 10 μm. (B) Suspensiones celulares de los órganos indicados aislados de un ratón Vav1 -¡-\Rasgrf2-¡- sano (panel superior izquierdo) y de un ratón Vav1-/-;Rasgrf2-/- (resto de paneles) que presentaba un linfoma de localización exclusivamente tímica fueron analizadas mediante citometría de flujo tras incubar las células con anticuerpos contra CD3. El cuadrado rojo señala Ia población anormal CD3 positiva que se detectó en el tumor intratímico. (C) Representación gráfica en Ia que se puede observar el porcentaje de animales con los genotipos indicados a Ia edad de un año que presentan timos normales o timos tumorales (sin metástasis en otros órganos). Dicha clasificación se basa en datos provenientes de citometría de flujo y datos histológicos.
Figura 5. Muestra Ia expresión del gen Rasgrf2 en linfomas humanos es menor que en tejidos normales. Análisis de Ia expresión de los genes Vav1 (panel superior) y Rasgrf2 (panel inferior) humanos mediante PCR cuantitativa en un panel de muestras de linfomas humanos representativos de diferentes estadios de Ia enfermedad. La muestra 1 representa Ia expresión relativa media de 6 muestras de tejido linfoide proveniente de diferentes animales control (línea discontinua) mientras que el resto de las muestras se refieren como porcentaje de cambio respecto a Ia muestra control. La expresión del gen de Ia Gapdh se usó como valor para Ia normalización de los valores de expresión entre las diferentes muestras, u.a., unidades arbitrarias.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1
1.1. La deficiencia de los genes Vav1 v/o Rasαrf2 acelera v agrava el desarrollo de tumores de linfocitos T altamente proliferativos en ratones de Ia cepa B10.BR.
En el transcurso de estudios de envejecimiento de los ratones de los genotipos silvestre (control), Vav1-/-, Rasgrf2-¡- y Vav1-/-;Rasgrf2-/-, se observó que mientras los ratones de genotipo silvestre presentaban bajas tasas de muerte/enfermedad hasta un año de edad (6%, n=32), los ratones Vav1-/- (32%, n=25) y, sobre todo, los ratones Vav1-l-;Rasgrf2-l- (68,56%, n= 35), eran más sensibles a morirse o mostrar signos físicos de enfermedad grave a Io largo de su vida (Fig. 1A). Los ratones Rasgrf2-I- mostraron en estos estudios unas tasas de muerte/enfermedad intermedias a las observadas en los ratones Vav1-/- y Vav1 -¡-\Rasgrf2-¡- (Fig. 1A). El examen de los animales muertos o sacrificados que mostraban signos de enfermedad grave indicó que Ia muerte/enfermedad se debía a Ia presencia de tumores linfoides altamente diseminados en estos animales. En concreto, se observaron hiperplasias del timo, esplenomegalias y linfoadenopatías en Ia mayoría de animales analizados (Fig. 1 B). Junto a ello, se apreció que el timo, el bazo y los ganglios linfáticos mostraban unas alteraciones histológicas importantes debido a Ia invasión y crecimiento de las células tumorales en dichos órganos (Fig. 1C). El análisis anatomopatológico de estos animales mostró también infiltraciones numerosas de las células tumorales en diversos órganos no hematopoyéticos como eran los ríñones, hígados, intestinos y médula ósea (Fig. 1C y datos no mostrados).
Los tumores presentes en estos animales se identificaron como de origen linfoide, puesto que estudios por citometría de flujo indicaron que las células tumorales presentes en el timo, bazo y médula ósea de estos animales expresaban altos niveles de CD3, un antígeno de superficie expresado específicamente en linfocitos T y no en otros tipos celulares (Fig. 2A). De igual forma, estudios realizados por técnicas inmunocitoquímicas revelaron que las células tumorales presentes en los órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos de estos animales eran positivas para dicho marcador de células T (Fig. 2D). Pese a esta uniformidad en cuanto a Ia expresión de este marcador, estudios subsecuentes demostraron que las células tumorales podían tener distinto inmunofenotipo para otros dos marcadores de células T, las proteínas CD4 y CD8, dependiendo del animal analizado. Por ejemplo, se pudieron detectar animales en donde las células tumorales eran homogéneamente doble positivas para CD4 y CD8, otros en los que las células tumorales pertenecían a dos subgrupos diferentes (doble positivas para CD4 y CD8 y poblaciones positivas solo para el marcador CD8) y animales en los que las células tumorales se teñían homogéneamente para CD8 y no para el marcador CD4 (Fig. 2B). En todo caso, siempre se observó que para un animal concreto, todas las células tumorales tenían el mismo inmunofenotipo para los marcadores CD4 y CD8 independientemente del órgano de donde habían sido purificadas (Fig. 2B).
Análisis llevados a cabo por técnicas de citometría de flujo demostraron que los tumores estaban compuestos por células en estado blástico (Fig. 2C), una indicación de que tenían alto potencial proliferativo. Consistente con esta observación, estudios inmunohistoquímicos revelaron Ia presencia en los órganos de animales con tumores de células altamente positivas para PCNA
(del inglés proliferating cell nuclear antigen) (Fig. 2D), un marcador proliferativo estándar. Resultados similares se obtuvieron con ratones de todos los genotipos bajo estudio en este trabajo que habían desarrollado tumores diseminados (datos no mostrados).
Estos resultados indican que Ia ausencia del gen VaW incrementa el porcentaje de tumores derivados de células T de ratones de Ia cepa B10.BR y, adicionalmente, que Ia ausencia combinada de este gen con Ia deficiencia en el gen Rasgrf2 acorta el periodo de latencia de desarrollo de estos tumores así como su agresividad y letalidad.
1.2. La ontoloqía de los tumores linfoides demuestra su origen en linfocitos del timo.
Para investigar el origen de estos tumores, se procedió al estudio de animales jóvenes de entre seis y ocho semanas de edad, un periodo durante el cual no se detectaron muertes por linfomas. Además, se usaron también animales de un año de edad de los genotipos silvestre, Vav1-/-, Rasgrf2-¡- y Vav1-/- \Rasgrf2-¡- que no habían mostrado signos de enfermedad y/o incomodidad y que, por tanto, habían sido clasificados en nuestro primer análisis como "libres de cáncer".
En el caso de los ratones jóvenes de todos los genotipos bajo análisis, no se detectaron ningún tipo de anormalidad histológica o tumores. Además, el examen de las poblaciones linfocitarias presentes en el timo y el bazo mostraron las distribuciones habituales para cada genotipo (Fig. 3, n=20 animales de cada uno de los genotipos en estudio).
Por el contrario, se pudo observar que los ratones supuestamente "libres de cáncer" de un año de edad sí presentaban alteraciones. Estas alteraciones eran hiperplasias del timo, las cuales se debían a Ia presencia dentro del timo de linfocitos T altamente positivos para los marcadores PCNA y CD3 (Fig. 4A,B), características similares a las previamente observadas en las células tumorales de ratones con tumores diseminados. Sin embargo, y a diferencia de éstos últimos, no se detectó ningún tipo de infiltración o proceso metastático de células linfoblásticas positivas para el marcador CD3 en órganos que no fuesen el timo (Fig. 4A,B). Estas alteraciones restringidas al timo se detectaron en ratones Vav1-I- (85% de los casos, n=14) y Vav1-/-;Rasgrf2-l- (80% de los casos, n=14) (Fig. 4C). En cambio, los porcentajes de ratones con tumores exclusivamente localizados en el timo fue mucho menor en caso de animales con genotipos silvestre (17%, n=25) y Rasgrf2-¡- (22%, n=20) (Fig. 4C). Tomados colectivamente, estos resultados indican que: (a) Ia deleción del gen Vav1 aumenta Ia tendencia de los ratones correspondientes a generar tumores linfoblásticos altamente proliferativos en el timo; (b) Ia deleción del gen Rasgrf2 conjuntamente con Ia del gen VaW acelera Ia aparición de dichos tumores linfoblásticos con alta capacidad de diseminación en órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos del ratón; (c) en ambos casos, las células tumorales son positivas para el marcador de células T CD3 y poseen alta capacidad proliferativa.
EJEMPLO 2
Evidencia de bajos niveles de expresión del gen Rasgrf2 en linfomas humanos.
Las observaciones obtenidas en el ejemplo 1 indican que Ia deleción del gen VaW y/o Ia del gen Rasgrf2 pueden participar en el desarrollo de tumores linfoides en humanos. Con Ia intención de verificar esta posibilidad, se analizó Ia expresión mediante PCR cuantitativa de ambas proteínas en un panel de muestras que contenían linfocitos de 6 individuos normales y muestras procedentes de 42 pacientes que poseían diferentes tipos de linfomas humanos. Estas muestras incluían estadios diferentes de progresión tumoral de los tumores así como linfomas derivados de células T y B (Fig. 5). Mientras que se vio que el gen VaW no sufría disminuciones de su expresión en dicha colección de tumores respecto a los niveles presentes en individuos sanos, se observó en cambio que Ia expresión del gen Rasgrf2 estaba disminuida en un 81 % de las muestras tumorales analizadas (Fig. 5). La expresión del gen Rasgrf2 se vio completamente reprimida en un linfoma linfocítico de estadio I (muestra 23), un linfoma folicular de estadio Il (muestra 33), y un linfoma de células del manto de estadio NE (muestra 37). En cambio, se observaron niveles de expresión del gen Rasgrf2 comparables o superiores a los individuos sanos sólo en tres (7%, muestras 29, 36 y 41 ) y cuatro casos (9%, muestras 9, 27, 32 y 43), respectivamente (Fig. 5). Estos datos sugieren que Ia inhibición, parcial o total, de Ia expresión del gen Rasgrf2 puede representar un factor coadyuvante en el desarrollo de linfomas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ratones (Ejemplos 1.1 y 1.2): Los ratones deficientes en el gen VaW se obtuvieron y fueron inicialmente descritos por V. Tybulevicz (NIMR, Londres, Reino Unido, UE) (Turner et al, 1997). Los ratones deficientes en el gen Rasgrf2 se obtuvieron y fueron inicialmente descritos por E. Santos (Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca, España) (Fernández-Melarde et al, 2002). Los ratones deficientes conjuntamente en los genes VaW y Rasgrf2, se generaron mediante cruces de los anteriores ratones. Todos los ratones usados en este estudio se homogeneizaron en Ia cepa genética B10.BR. Los animales se sacrificaron siguiendo Ia normativa internacional a Ia edad de un año o cuando se detectaron de visu signos evidentes de enfermedad debidos al desarrollo del tumor. Análisis de citometría de flujo (Ejemplos 1.1 y 1.2): Los órganos extraídos de los ratones en estudio se homogenizaron utilizando una malla de 50 μm (Falcon) estéril para generar suspensiones celulares. En el caso de células de médula ósea, los fémures de los ratones se extrajeron y Ia médula ósea se extrajo mediante Ia introducción de un flujo de solución salina en Ia cavidad ósea. Las suspensiones celulares se trataron mediante choque hipotónico en 0.17 M NH4CI para eliminar los eritrocitos contaminantes y, tras varios lavados en solución salina, las poblaciones linfocitarias se marcaron con anticuerpos específicos para marcadores de membrana acoplados a compuestos fluorescentes. Los anticuerpos contra los marcadores CD4, CD3, CD8, CD44, CD25 y B220 fueron todos ellos comprados a BD Biosciences. Los blastos se detectaron utilizando los parámetros SSC y FCS habituales en este tipo de técnicas. Los análisis de citometría de flujo se llevaron a cabo en un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences) y los datos se analizaron con los programas informáticos CeII Quest (BD Biosciences), Paint-a-Gate y WinMDI 2.8.
Histología y análisis inmunohistológicos (Ejemplos 1.1 y 1.2): Los tejidos seleccionados se fijaron en paraformaldehído al 4% en solución salina durante 48 horas tras Io cuál se embebieron en parafina. Las secciones histológicas se tiñeron con hematoxilina/eosina (Sigma) o se procesaron para inmunohistoquímica. Las tinciones inmunohistoquímicas se realizaron en secciones desparafinadas mediante protocolos estandarizados. Los anticuerpos contra CD3 se obtuvieron de DAKO, utilizándose a una dilución de 1 :200. El anticuerpo monoclonal contra PCNA (clon PC10) se obtuvo de CeII Signalling y se usó a una dilución de 1 :100. Los anticuerpos secundarios conjugados con Ia peroxidada de rábano contra inmunoglobulinas de ratón necesarios para revelar las inmunohistoquímicas se obtuvieron de GE Healthcare.
PCR cuantitativa (Ejemplo 2): Para analizar Ia expresión de los genes VaW y Rasgrf2 en linfomas, se usó un panel de cDNAs provenientes de muestras de linfomas humanos deshidratados en una placa de 96 pocilios (TissueScan Lymphoma Tissue qPCR Array I (2), Cat. Number LYRT101 , Origene Technologies). Una descripción detallada de las muestras de linfomas contenido en este preparado comercial puede encontrarse en Ia dirección de Internet (http://www.origene.com/geneexpression/disease- panels/products/LYRT101.aspx). Las reacciones de PCR cuantitativa se realizaron en el aparato IQ5 Real-Time PCR detection system (BioRad) y para ello se utilizó el kit de SYBR® GreenTM two-step qRT-PCR (Invitrogen). La muestra número 1 representa una media de Ia expresión relativa de 6 muestras diferentes de tejidos normales. A esta media se Ie dio un valor arbitrario de 1. Los valores de expresión restantes se muestran en el estudio como porcentaje de variación respecto a dicho valor. Para eliminar variaciones espurias debidas a diferentes cargas de muestra, etc., los valores relativos de Ia expresión de Vav1 y Rasgrf2 obtenidos en cada muestra se normalizaron usando, para ello, el valor de Ia expresión del gen que codifica Ia enzima GAPDH.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de neoplasias linfoides que comprende:
a) La obtención o generación de un modelo experimental animal de mamífero no humano con deficiencia de Ia actividad de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2 o a las células derivadas del mismo; b) La administración del compuesto al modelo animal o células de a); y c) La determinación de su efecto sobre al menos un parámetro indicativo de Ia enfermedad.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde el modelo animal es un animal transgénico.
3. Método según Ia reivindicación 2 donde el animal transgénico es un animal knock-out de los genes Vav1 y/o Rasgrí2.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el modelo animal es un roedor o un primate no humano.
5. Método según Ia reivindicación 1 donde las células de mamífero no humano son del tejido linfoide.
6. Método según Ia reivindicación 5 donde las células del tejido linfoide son linfocitos T.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde Ia neoplasia linfoide es una neoplasia de las células T.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el parámetro indicativo de Ia enfermedad es Ia presencia de tumores linfoides.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el parámetro indicativo es Ia mortalidad o Ia morbilidad asociada a Ia presencia de Ia neoplasia.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el compuesto es un agente antineoplásico.
11. Kit adaptado para llevar a cabo el método para Ia evaluar si un compuesto es efectivo en Ia prevención y/o tratamiento de neoplasias linfoides, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
a) Células derivadas de un modelo experimental animal de mamífero no humano con deficiencia de Ia actividad de las proteínas Vav1 y/o RasGRF2; y b) Células derivadas de un ratón silvestre.
12. Kit según Ia reivindicación 11 que además comprende las instrucciones para llevar a cabo dicho método.
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