WO2010066938A1 - Use of nanoparticles as cytotoxic agents - Google Patents

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WO2010066938A1
WO2010066938A1 PCT/ES2009/070575 ES2009070575W WO2010066938A1 WO 2010066938 A1 WO2010066938 A1 WO 2010066938A1 ES 2009070575 W ES2009070575 W ES 2009070575W WO 2010066938 A1 WO2010066938 A1 WO 2010066938A1
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nanoparticles
silver
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cells
wavelength
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PCT/ES2009/070575
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Inventor
Ernesto Jiménez Villar
Gustavo Fuertes Vives
Esteban Pedrueza Villalmanzo
Jesús SALGADO BENITO
Rafael ABARGUES LÓPEZ
Juan MARTÍNEZ-PASTOR
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Universitat De València
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics

Definitions

  • the present invention relates to the use of nanoparticles with high intensity of SPR absorbance, in a narrow wavelength range, as cytotoxic agents for the induction of cell death.
  • the present invention can be applied in biomedicine, in phototherapy methods for the treatment of diseases by inducing cell death. More specifically, the present invention can be applied in treatments of infectious diseases by inducing the death of microorganisms.
  • nanomaterials used for its properties as a disinfectant for about 1200 years. Preparations of this metal have been used for centuries with various medical uses, such as: ocular prophylaxis of newborns, topical use in burn wounds, treatment of orthopedic infections and other medical conditions. Silver also serves as a potent bactericide, acting against a broad spectrum of microorganisms.
  • Ag nanoparticles can also be used as effective antimicrobial agents when applied as a surface coating that requires a bactericidal function, for example, in cases of medical material and water treatment filters.
  • SERS Surface-enhanced Raman Scattering
  • This electromagnetic resonance is called “Resonant Surface Plasmon” (SPR), and includes very diverse phenomena and applications, such as “SPR biosensing”, photodynamic therapy using the plasmon of the nanocorages or nanocortezas of Au and optical transmission lines based nanoparticles. All these applications are based on the intense electromagnetic fields that occur in the vicinity of the metal nanoparticles because of the polarization of an external electromagnetic field. The intensity and increase of this local electromagnetic field are determined by the shape, size, configuration and composition of the nanoparticles.
  • the increase in the intensity of the electromagnetic field on the surface of an isolated and resonantly excited nanoparticle is about 30 times. However, at intermediate points between coupled nanoparticles, the field strength can be intensified about 5000 times. Therefore, in the vicinity of a nanoparticle system, the excitation light intensity is amplified by a factor that varies between 10 3 and 10 7 . It is also noteworthy that the intensity of these fields Electromagnetic decays rapidly with the distance to the surface of the metal nanoparticle.
  • Another important aspect is the change in the chemical activity of the nanoparticles under the effects of a light radiation (laser or fluorescent lamp).
  • the laser radiation of the metal (Ag) nanoparticles diluted in aqueous solution causes fragmentation or fusion of the colloid.
  • Laser radiation has been shown to cause electron photo-ejection, causing surface ionization-oxidation of nanoparticles and the consequent ion segregation (Ag + ).
  • This phenomenon is intensified in the presence of Cl ions "due to oxidative attack O 2 / C1" ( “oxidative etching”), which in the case of Ag nanoparticles morphology of twin planes may result in complete dissolution.
  • the oxidative attack effect has been used for the photo-conversion of nano-spheres into other nanoparticles of different morphology.
  • the application of the nanoparticles used in the present invention is not based on the increase in temperature.
  • the effects achieved are rather related to the plasmon induced on the surface of the nanoparticles. That is, the effect achieved in the present invention is due to a specific optical property of the nanoparticles used, and not to a thermal property.
  • the photo-thermal effects are ruled out as a cause of cell death, since the electromagnetic radiation used in the present invention is low average power, 0.018 W / cm 2 , that is, 220 times less than that used in photothermal treatments reported by other authors (1).
  • the cell death achieved by the present invention is partly due to the special optical characteristics of the nanoparticles used.
  • These nanoparticles have a series of important peculiarities, among which are: a high SPR absorbance intensity (between 0.4 and 1.2, for a 1 cm optical path) in a narrow range of wavelengths between 350 and 500 nm.
  • the present invention relates to the use of nanoparticles with a high intensity of SPR absorbance (between 0.4 and 1.2) at a wavelength range between 350 and 500 nm, preferably between 400 and 410 nm, as a cytotoxic agent for induce death mobile.
  • the stimulation of the electromagnetic field in the environment of the nanoparticles adhered to the cell surface implies the inhibition of the growth of said cells and, eventually, their death. Because the electromagnetic radiation used in the present invention is low power, photo-thermal effects as the cause of cell death are ruled out.
  • the present invention proposes as causes of cell death the electroporation of the cell membrane, the photo-oxidative attack ("photooxidative etching") of the Ag nucleus of the nanoparticles, producing toxic Ag + ions, or photoinduction of the formation of reactive oxygen species in the cellular medium near the nanoparticles. All these effects have their origin in the high electromagnetic fields induced in the environment of the nanoparticles specifically used in the present invention when subjected to low power electromagnetic radiation.
  • the nanoparticles used in the present invention have the physical characteristic of having a high intensity of SPR absorbance in a narrow range of wavelengths between 350 and 500 nm, preferably between 400 and 410 nm. These are also nanoparticles that comprise an inner core, preferably of silver (Ag) or of alloys that comprise silver.
  • the nanoparticles are coated with a semiconductor, ceramic and / or dielectric inert material, preferably a semiconductor, ceramic and dielectric metal oxide of the group: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 , ZnO 2 .
  • Ag nanoparticles coated by an outer layer of SiO 2 called Ag-silica nanoparticles, are used in the present invention.
  • the nanoparticles used in the present invention once attached to the cell surface and irradiated with a wavelength within the range between 350 nm - 500 nm, preferably between 400 and 410 nm, induce the death of prokaryotic cells, although by their characteristics This effect is also extensible to eukaryotic cells.
  • infectious disease is understood as the clinical manifestation caused by the action of microorganisms or other infectious agents, such as, for example, bacteria, fungi, yeasts, viruses, protozoa, etc.
  • high absorbance intensity SPR is defined between the values 0.4 and 1.2 (for an optical pitch of 10 mm).
  • narrow wavelength range is defined between 350 and 500nm.
  • cytotoxic agent is defined as anyone who causes toxicity in the cells by suppressing their functions and / or causing their death. It refers to any type of cell, prokaryotic or eukaryotic, preferably bacterial cells.
  • the induction of cytotoxicity in a sample comprises sterilization, disinfection or preservation thereof; as well as any other effect from the induction of cytotoxicity in the cells present in the sample.
  • the sample comprises living cells whose cytotoxicity, and eventually death, is desired to induce, and this can be of any type, both solid and liquid, and of any origin.
  • the sample can be both surgical or laboratory material or instruments, such as water or other liquid, such as a culture medium or biological tissue.
  • the effective dose of nanoparticles to cause cell death in the present invention corresponds to a concentration of at least 0.15 x 10 14 nanoparticles per liter.
  • the X axis shows the wavelength (nm) and the Y axis absorbance (a.u).
  • the inside graph shows the distribution of sizes measured by TEM.
  • the X axis shows the diameter of the nanoparticles with an average value of 1 lnm.
  • the adhesion of the nanoparticles of the invention to the cell surface is shown. This union is essential to ensure that the high electromagnetic fields induced in the environment of the nanoparticles, due to the SPR phenomenon, reach and interact with the cells.
  • B Bacteria growth curves measured through OD 600 (Optical density of the liquid culture medium at 600nm), Y axis, versus the growth time in minutes, X axis. Squares, without nanoparticles, stars, with a concentration 0.15 xlO 14 nanoparticles / L, triangles, with 1.5x10 14 nanoparticles / L and circles, with 15x10 14 nanoparticles / L.
  • B blue laser
  • R red laser
  • said cell-free zone does not appear when the plate is irradiated with the 633 nm red laser (point R). That is, blue light is more effective because it is close to the maximum absorbance SPR of the nanoparticles.
  • B Culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the absence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. No cell free area is observed. That is, the treatment is not effective, despite the radiation, due to the absence of nanoparticles.
  • C Culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with blue light radiation (B) of 405 nm for 16 hours. A cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B).
  • the treatment with the nanoparticles of the invention and 405nm light is effective and, in addition, irreversible.
  • Figure 5 Representative scheme of the mechanisms responsible for cell death after treatment with the nanoparticles of the invention and irradiation with a wavelength between 350 and 500 nm.
  • ROS reactive oxygen species
  • the present invention relates to the induction of cell death by cytotoxic nanoparticles with special optical characteristics, adhered to the cell surface and irradiated with a frequency between 350 and 500 nm.
  • the silica layer of the Ag-silica nanoparticles decreases the intrinsic segregation of Ag + ions and hence their effects, such as coordination with protein SH groups, also decreasing their intrinsic toxicity.
  • the fact that the silica coating is very thin (1-2 nm) allows the electromagnetic field on the insulating surface to be intense.
  • the silica layer or coating is not compact, that is, it has pores, which allow chemical reactions induced or intensified by light radiation. If the cell medium is rich in salts with abundant Cl ions "light radiation causes photo-oxidation of the surface of the Ag nanoparticles and segregation or injection of silver ions. Thus, by irradiation with light The toxicity of the nanoparticles can be controlled from the appropriate wavelength in selected areas.
  • the nanoparticles used in the present invention effectively bind to the surface cell (see Figure 2A), it can be concluded that the reduction of intrinsic toxicity of Ag is not due to the lack of proximity to the cells.
  • Figure IA shows the absorption spectrum of a suspension of Ag nanoparticles, observing a high intensity of SPR absorbance in a narrow range of wavelengths around 400 nm.
  • Figure IB shows HRTEM images showing spherical Ag particles with a diameter of l lnm (see internal Figure IA), each covered with an amorphous silica layer between 1 and 2 nm thick (arrows black, Figure IB).
  • the twin planes are also distinguished, as evidenced by the white arrows of Figure IB, together with the five vertices contained on each face, giving rise to a decahedron morphology.
  • This type of structure is formed by five radially oriented tetrahedral mono crystals through a central abscissa, so that all tetrahedra have a common corner and each of them has two faces in contact with their neighbors. With this type of morphology the "oxidative etching" phenomenon is amplified due to distortions in the glass framework.
  • FIG. 4 shows the bactericidal effect in solid medium.
  • Figure 4 A shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with application of two types of radiation: blue laser (B), 405 nm, and red laser (R), 633 nm.
  • FIG. 4B shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the absence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. No cell-free area is observed in any case.
  • Figure 4C shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with blue light irradiation (B) of 405 nm for 16 hours, a period necessary for the growth of bacterial colonies under normal conditions, observing a cell-free area in the irradiated area (point B).
  • Figure 4D shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles, irradiated with blue light of 405 nm for 16 hours, and then maintained without irradiation at optimum growth temperature for an additional 48 hours.
  • One of the causes of cell death caused by the nanoparticles used in the invention must be a direct attack on the cell surface through electrical disturbances in the cell wall and / or membrane, causing its malfunction and eventually death. (Figure 5 A).
  • the pulses of the nanosecond-scale laser, and even smaller ones are capable of temporarily disturbing the integrity of the membrane and this effect has been used for cell transformation with exogenous DNA.
  • ROS reactive oxygen species
  • 1 O 2 oxygen singlet
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • OH hydroxyl radicals
  • Another mechanism would be the one that synergistically integrates several, or all, of the above.
  • the pores formed in the membrane due to electrical disturbances facilitate the entry of Ag + ions or reactive oxygen species into the cells where they exert their toxic effect.
  • Ag + ions can even directly induce the generation of reactive oxygen species by well known reactions.
  • the present invention evidences two clear phenomena related to the specific use of the nanoparticles of the invention for the induction of cell death: •
  • the inert coating of the nanoparticles (particularly silica) reduces the intrinsic toxicity of its silver core, in places or moments where such intrinsic toxic effect is not required or is harmful.
  • the time and place in which the toxicity of the nanoparticles is activated can be controlled by the selective application of the appropriate radiation.
  • the method evidenced in the present invention has a direct application related to the selective and controlled induction of cell death in both prokaryotic and eukaryotic cells.
  • the reduced intrinsic toxicity of nanoparticles and the high electric fields generated via SPR offer many applications in medicine and biology.
  • the first aspect of the present invention relates to the use of nanoparticles with a high intensity of SPR absorbance, which externally comprise an inert coating (preferably a semiconductor metal oxide selected from: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 , ZnO 2 or an inert metal) and internally a metal core (preferably Ag), as cytotoxic agents.
  • the nanoparticles have a SPR absorbance intensity between 0.4 and 1.2, for an optical pitch of 10 mm, at a wavelength of 400 nm.
  • the second aspect of the present invention relates to the use of the nanoparticles defined above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of infectious diseases.
  • the third aspect of the present invention relates to a method for the induction of cytotoxicity in a sample comprising contacting said nanoparticles and irradiating the nanoparticles adhered to the cell surface with light of a wavelength between 350 and 500 nm
  • the sample can be of any type, both solid and liquid, comprising living cells.
  • the sample may be surgical or laboratory material or instruments.
  • Another type of sample may be water, or other liquids, contaminated with bacteria.
  • Example 1 Physical characterization of the Ag-silica nanoparticle.
  • Figure 1A shows the special optical properties of the nanoparticles used in a wavelength range around 400 nm.
  • Figure 1 A shows the absorption spectrum of a suspension of Ag nanoparticles with high intensity of SPR absorbance in a wavelength range around 400 nm.
  • HRTEM images showing spherical Ag particles with a diameter of 1 1 nm are shown in Figure IB (see internal Figure IA), each covered with an amorphous layer of silica with a thickness between 1 and 2 nm (black arrows, Figure IB).
  • the twin planes are distinguished in the TEM images, which are evidenced by the white arrows of Figure IB, along with the five vertices contained on each face, resulting in a decahedron morphology.
  • This type of structure is formed by five radially oriented tetrahedral mono crystals through a central abscissa in such a way that the entire tetrahedron has a common corner and each of them has two faces in contact with its neighbors.
  • oxidative attack (“oxidative etching”) is amplified, due to distortions in the interfaces between the tetrahedral crystals that make up the nanoparticles.
  • the analysis of the data obtained by XRD indicates that the Ag of the nanoparticles is in the form of crystals with a diameter of 1 lnm.
  • the characteristic peaks of silica are not present in the XRD spectrum, suggesting that said material is amorphous.
  • the measurements made in the Ag-silica nanoparticles by EDX show a Si / O ratio of Vi, which coincides with the presence of amorphous silica on the surface of the nanoparticle.
  • Example 2 Adhesion of nanoparticles to the cell surface.
  • Example 3 Estimation of the cytotoxic effect of nanoparticles in a liquid medium.
  • Example 4 Estimation of the cytotoxic effect of nanoparticles in solid medium.
  • the radiation of solid cultures was used as a method of study and validation of the method since in this type of cultures the diffusion of the bacteria is limited and it can be assumed that the radiation applied on the sample is constant.
  • LB medium agar agar plates were used as solid medium, in which the bacteria were seeded and grown to the formation of colonies that, ideally, covered the entire surface of the plate.
  • Ag-silica nanoparticles were present at a concentration of 1.5.10 14 nanoparticles / L, both in the inoculum used to sow the plates and in the plate culture medium itself. Irradiation with the blue and red lasers was maintained throughout the cell growth and carried out on small selected non-overlapping areas.
  • Figure 4 shows the bactericidal effect in solid medium.
  • Figure 4 A shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and 633 nm red laser (R).
  • B blue laser
  • R 633 nm red laser
  • a cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B) and, on the other hand, said cell-free zone does not appear when the plate is irradiated with the 633 nm red laser (point R). That is, blue light is more effective because it has a wavelength similar to which nanoparticles have their maximum absorbance SPR.
  • Figure 4B shows a culture of E.coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the absence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. No cell free area is observed. That is, in the absence of nanoparticles the treatment is not effective.
  • Figure 4C shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with blue light irradiation (B) of 405 nm for 16 hours (cell colonies growth period). A cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B).
  • Figure 4D shows a culture of E.

Abstract

The present invention relates to the use of nanoparticles with a silver central core and inert outer coating for inducing cell death in a controlled manner. The invention likewise relates to the method required for performing said cytotoxic process, which involves laser irradiation at a wavelength close to the SPR absorption maximum of the nanoparticles and at a medium-low power, photothermic effects thereby being eliminated. Said invention may be used in biomedicine, as phototherapy for inducing the death of both prokaryotic and eukaryotic cells, especially cells of microorganisms that cause infections. Furthermore, the present invention may also be used as a method for disinfection or preservation, under aseptic conditions, of a selected medium or material, and also as a multipurpose tool.

Description

USO DE NANOPARTICULAS COMO AGENTES CITOTOXICOS USE OF NANOPARTICLES AS CYTOTOXIC AGENTS
CAMPO DE LA INVENCIÓNFIELD OF THE INVENTION
La presente invención se refiere al uso de nanopartículas con elevada intensidad de absorbancia SPR, en un estrecho rango de longitud de onda, como agentes citotóxicos para la inducción de muerte celular. Así la presente invención puede aplicarse en biomedicina, en métodos de fototerapia para el tratamiento de enfermedades mediante la inducción de muerte celular. Más concretamente la presente invención puede aplicarse en tratamientos de enfermedades infecciosas mediante la inducción de la muerte de microorganismos.The present invention relates to the use of nanoparticles with high intensity of SPR absorbance, in a narrow wavelength range, as cytotoxic agents for the induction of cell death. Thus the present invention can be applied in biomedicine, in phototherapy methods for the treatment of diseases by inducing cell death. More specifically, the present invention can be applied in treatments of infectious diseases by inducing the death of microorganisms.
ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE
La fabricación y estudio de nanomateriales ha tenido un desarrollo creciente durante la pasada década. Los materiales con dimensiones nanométricas representan un cambio significativo en sus propiedades físico-químicas y en algunos casos son origen de nuevos fenómenos. Sin embargo, los estudios relacionados con la actividad biológica de estos nanomateriales aún son muy incipientes. Algunas investigaciones recientes muestran resultados importantes relacionados con la actividad de diferentes medicamentos y con la función antimicrobiana. Entre los nanomateriales utilizados se encuentra la plata (Ag), conocida por sus propiedades como desinfectante desde hace alrededor de 1200 años. Preparaciones de este metal han sido utilizadas durante siglos con varios usos médicos, como son: profilaxis ocular de recién nacidos, uso tópico en heridas por quemaduras, tratamiento de infecciones ortopédicas y otras dolencias. La plata también sirve como un potente bactericida, actuando contra un amplio espectro de microorganismos. Se cree que cationes de este metal reaccionan con las proteínas, provocando su inactivación, mediante la formación de enlaces de coordinación con grupos -SH de residuos de Cys. Cuando este material es preparado en forma de nanopartículas es de esperar una mayor actividad antimicrobiana debido al aumento de la superficie específica de interacción. Análisis mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) e investigaciones proteómicas sugieren que las nanopartículas de plata interactúan con los componentes de la membrana bacteriana, causando cambios estructurales que terminan por provocar la disipación de la fuerza protón- motriz y consecuentemente inducen la muerte de la célula. Se cree también que la inactivación general de proteínas celulares a causa del tratamiento con iones Ag+ tiene otras consecuencias graves, como la pérdida de la capacidad de replicación del ADN. Adicionalmente, se encontró que la unión de iones Ag+ con grupos funcionales de las proteínas puede dar lugar a su desnaturalización. Las nanopartículas de Ag también pueden utilizarse como agentes antimicrobianos efectivos al ser aplicadas como recubrimiento de superficies que requieren una función bactericida, por ejemplo, en los casos de material médico y filtros para tratamiento de agua.The manufacture and study of nanomaterials has had a growing development over the past decade. Materials with nanometric dimensions represent a significant change in their physicochemical properties and in some cases are the origin of new phenomena. However, studies related to the biological activity of these nanomaterials are still very incipient. Some recent research shows important results related to the activity of different medications and antimicrobial function. Among the nanomaterials used is silver (Ag), known for its properties as a disinfectant for about 1200 years. Preparations of this metal have been used for centuries with various medical uses, such as: ocular prophylaxis of newborns, topical use in burn wounds, treatment of orthopedic infections and other medical conditions. Silver also serves as a potent bactericide, acting against a broad spectrum of microorganisms. It is believed that cations of this metal react with proteins, causing their inactivation, by forming coordination bonds with -SH groups of Cys residues. When this material is prepared in the form of nanoparticles, greater antimicrobial activity is expected due to the increase in the specific surface area of interaction. Analysis by Transmission Electron Microscopy (TEM) and proteomic investigations suggest that nanoparticles Silver interacts with the components of the bacterial membrane, causing structural changes that eventually cause dissipation of the proton-motive force and consequently induce cell death. It is also believed that the general inactivation of cellular proteins due to treatment with Ag + ions has other serious consequences, such as loss of DNA replication capacity. Additionally, it was found that the binding of Ag + ions with functional groups of the proteins can lead to their denaturation. Ag nanoparticles can also be used as effective antimicrobial agents when applied as a surface coating that requires a bactericidal function, for example, in cases of medical material and water treatment filters.
Otra aplicación interesante de las nanopartículas metálicas en el campo de la biología es la detección de concentraciones muy bajas de moléculas mediante el efecto denominado "Surface-enhanced Raman Scattering" (SERS), descubierto a finales de la década del 1970. Este fenómeno está relacionado con un incremento gigantesco de la dispersión Raman (1010- 1015) en el entorno de nanopartículas metálicas. En una de sus interpretaciones, el fenómeno se relaciona con la resonancia electromagnética en las nano estructuras de metales nobles, lo cual ha servido de base para la teoría electromagnética del SERS. Actualmente, esta resonancia electromagnética es denominada "Surface Plasmon Resonante" (SPR), e incluye fenómenos y aplicaciones muy diversas, tales como "SPR biosensing", terapia fotodinámica usando el plasmon de las nanocorazas o nanocortezas de Au y líneas de transmisión óptica basadas en nanopartículas. Todas estas aplicaciones están basadas en los intensos campos electromagnéticos que se producen en la vecindad de las nanopartículas metálicas a causa de la polarización de un campo electromagnético externo. La intensidad e incremento de este campo electromagnético local vienen determinadas por la forma, tamaño, configuración y composición de las nanopartículas.Another interesting application of metal nanoparticles in the field of biology is the detection of very low concentrations of molecules through the effect called "Surface-enhanced Raman Scattering" (SERS), discovered in the late 1970s. This phenomenon is related with a gigantic increase in the Raman dispersion (10 10 - 10 15 ) in the environment of metal nanoparticles. In one of its interpretations, the phenomenon is related to electromagnetic resonance in the noble structures of noble metals, which has served as the basis for the electromagnetic theory of SERS. Currently, this electromagnetic resonance is called "Resonant Surface Plasmon" (SPR), and includes very diverse phenomena and applications, such as "SPR biosensing", photodynamic therapy using the plasmon of the nanocorages or nanocortezas of Au and optical transmission lines based nanoparticles. All these applications are based on the intense electromagnetic fields that occur in the vicinity of the metal nanoparticles because of the polarization of an external electromagnetic field. The intensity and increase of this local electromagnetic field are determined by the shape, size, configuration and composition of the nanoparticles.
El incremento de la intensidad del campo electromagnético en la superficie de una nanopartícula aislada y excitada resonantemente es alrededor de 30 veces. Sin embargo, en puntos intermedios entre nanopartículas acopladas, la intensidad del campo puede intensificarse unas 5000 veces. Por tanto, en la proximidad de un sistema de nanopartículas, la intensidad de luz de excitación se amplifica por un factor que varía entre 103 y 107. Es de destacar también que la intensidad de estos campos electromagnéticos decae rápidamente con la distancia a la superficie de la nanopartícula metálica.The increase in the intensity of the electromagnetic field on the surface of an isolated and resonantly excited nanoparticle is about 30 times. However, at intermediate points between coupled nanoparticles, the field strength can be intensified about 5000 times. Therefore, in the vicinity of a nanoparticle system, the excitation light intensity is amplified by a factor that varies between 10 3 and 10 7 . It is also noteworthy that the intensity of these fields Electromagnetic decays rapidly with the distance to the surface of the metal nanoparticle.
Otro aspecto importante es el cambio en la actividad química de las nanopartículas bajo los efectos de una radiación luminosa (láser o lámpara fluorescente). La radiación láser de las nanopartículas metálicas (de Ag) diluidas en solución acuosa provoca la fragmentación o fusión del coloide. Se ha demostrado que la radiación láser origina la foto-eyección de electrones, provocando la ionización-oxidación superficial de las nanopartículas y la consecuente segregación de iones (Ag+). Este fenómeno se intensifica en presencia de iones Cl", debido a un ataque oxidativo O2/C1" ("oxidative etching"), que en el caso de las nanopartículas de Ag con morfología de planos gemelos puede dar lugar a su disolución completa. El efecto de ataque oxidativo ha sido utilizado para la foto-conversión de nano-esferas en otras nanopartículas de distinta morfología.Another important aspect is the change in the chemical activity of the nanoparticles under the effects of a light radiation (laser or fluorescent lamp). The laser radiation of the metal (Ag) nanoparticles diluted in aqueous solution causes fragmentation or fusion of the colloid. Laser radiation has been shown to cause electron photo-ejection, causing surface ionization-oxidation of nanoparticles and the consequent ion segregation (Ag + ). This phenomenon is intensified in the presence of Cl ions "due to oxidative attack O 2 / C1" ( "oxidative etching"), which in the case of Ag nanoparticles morphology of twin planes may result in complete dissolution. The oxidative attack effect has been used for the photo-conversion of nano-spheres into other nanoparticles of different morphology.
Recientemente se han explorado las posibles aplicaciones foto-terapéuticas de nanopartículas metálicas, proponiéndose tratamientos anticancerígenos basados en las propiedades foto-térmicas de las nanopartículas de Au (1-3). En estos casos la actividad de la nanopartícula se basa en el calentamiento local producido en zonas irradiadas debido a su proximidad con los nanoelementos. El papel de las nanopartículas es asegurar una absorción efectiva de la radiación a través del fenómeno SPR y transferir el exceso de energía en forma calor al tejido adyacente. Utilizando un láser continuo con una longitud de onda de 820 nm y una potencia de 4 W/cm2, Hirsch y sus colaboradores (1) han observado incrementos en la temperatura de aproximadamente 370C por encima de las condiciones fisiológicas en áreas irradiadas en presencia de los nanoelementos. Sin embargo, la aplicación de las nanopartículas utilizadas en la presente invención no se basa en el aumento de la temperatura. Los efectos conseguidos están más bien relacionados con el plasmon inducido sobre la superficie de las nanopartículas. Es decir, el efecto conseguido en la presente invención se debe a una propiedad óptica específica de las nanopartículas utilizadas, y no a una propiedad térmica. Así mismo, los efectos foto-térmicos quedan descartados como causa de la muerte de las células, ya que la radiación electromagnética utilizada en la presente invención es de baja potencia media, 0,018 W/cm2, es decir, 220 veces menor que la utilizada en tratamientos fototérmicos reportados por otros autores (1).The possible photo-therapeutic applications of metal nanoparticles have recently been explored, with anticancer treatments based on the photo-thermal properties of Au nanoparticles (1-3) being proposed. In these cases the activity of the nanoparticle is based on the local heating produced in irradiated areas due to its proximity to the nanoelements. The role of the nanoparticles is to ensure effective absorption of radiation through the SPR phenomenon and transfer excess energy in heat to adjacent tissue. Using a continuous laser with a wavelength of 820 nm and a power of 4 W / cm 2 , Hirsch and his collaborators (1) have observed increases in temperature of approximately 37 0 C above physiological conditions in irradiated areas in presence of nanoelements. However, the application of the nanoparticles used in the present invention is not based on the increase in temperature. The effects achieved are rather related to the plasmon induced on the surface of the nanoparticles. That is, the effect achieved in the present invention is due to a specific optical property of the nanoparticles used, and not to a thermal property. Likewise, the photo-thermal effects are ruled out as a cause of cell death, since the electromagnetic radiation used in the present invention is low average power, 0.018 W / cm 2 , that is, 220 times less than that used in photothermal treatments reported by other authors (1).
Por lo tanto, la muerte celular conseguida mediante la presente invención se debe en parte a las características ópticas especiales de las nanopartículas utilizadas. Dichas nanopartículas presentan una serie de peculiaridades importantes, entre las cuales están: una intensidad de absorbancia SPR elevada (entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 1 cm) en un rango estrecho de longitudes de onda entre 350 y 500 nm. Cuando la zona de aplicación de las nanopartículas se irradia con luz de una longitud de onda cercana al máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas (preferentemente entre 400 y 410 nm), se originan campos electromagnéticos elevados en el entorno de las nanopartículas que pueden dar lugar a diversos fenómenos que afectarían a la viabilidad de las células, tales como electroporación: de la membrana celular, ataque fotooxidativo o formación de especies reactivas de oxígeno, los cuales serían responsables en última instancia de la muerte de las células. Ninguno de los documentos localizados en el estado de la técnica comprende el uso de las nanopartículas utilizadas en la presente invención para inducir muerte celular. La utilización de estas nanopartículas aprovechando su propiedad física SPR anteriormente mencionada hace posible que en la presente invención, a diferencia de otros casos descritos en el estado de la técnica, se emplee radiación electromagnética de baja potencia para inducir campos electromagnéticos elevados en el entorno de las nanopartículas, los cuales actúan eficazmente induciendo muerte celular.Therefore, the cell death achieved by the present invention is partly due to the special optical characteristics of the nanoparticles used. These nanoparticles have a series of important peculiarities, among which are: a high SPR absorbance intensity (between 0.4 and 1.2, for a 1 cm optical path) in a narrow range of wavelengths between 350 and 500 nm. When the area of application of the nanoparticles is irradiated with light of a wavelength close to the maximum absorbance SPR of the nanoparticles (preferably between 400 and 410 nm), high electromagnetic fields originate in the environment of the nanoparticles that can give rise to various phenomena that would affect the viability of the cells, such as electroporation: of the cell membrane, photooxidative attack or formation of reactive oxygen species, which would ultimately be responsible for the death of the cells. None of the documents located in the state of the art comprise the use of the nanoparticles used in the present invention to induce cell death. The use of these nanoparticles taking advantage of their previously mentioned SPR physical property makes it possible that in the present invention, unlike other cases described in the state of the art, low power electromagnetic radiation is used to induce high electromagnetic fields in the environment of the nanoparticles, which act effectively inducing cell death.
El efecto fue ensayado en células procariotas, particularmente en cepas de laboratorio de la bacteria Escherichia coli. Esta aplicación de las nanopartículas de la invención aún no ha sido prevista en los documentos del estado de la técnica analizados.The effect was tested on prokaryotic cells, particularly in laboratory strains of the Escherichia coli bacteria. This application of the nanoparticles of the invention has not yet been foreseen in the documents of the prior art analyzed.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invenciónDESCRIPTION OF THE INVENTION Brief description of the invention
La presente invención se refiere al uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR (entre 0,4 y 1,2) a un rango de longitudes de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm, como agente citotóxico para inducir muerte celular. La estimulación del campo electromagnético en el entorno de las nanopartículas adheridas a la superficie celular conlleva la inhibición del crecimiento de dichas células y, eventualmente, su muerte. Debido a que la radiación electromagnética utilizada en la presente invención es de baja potencia se descartan los efectos foto-térmicos como la causa de la muerte de las células. Por el contrario, la presente invención propone como causas de la muerte celular la electroporación de la membrana celular, el ataque foto-oxidativo ("photooxidative etching") del núcleo de Ag de las nanopartículas, produciendo iones de Ag+ tóxicos, o la fotoinducción de la formación de especies reactivas de oxígeno en el medio celular próximo a las nanopartículas. Todos estos efectos tienen su origen en los altos campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas específicamente utilizadas en la presente invención al ser sometidas a radiación electromagnética de baja potencia.The present invention relates to the use of nanoparticles with a high intensity of SPR absorbance (between 0.4 and 1.2) at a wavelength range between 350 and 500 nm, preferably between 400 and 410 nm, as a cytotoxic agent for induce death mobile. The stimulation of the electromagnetic field in the environment of the nanoparticles adhered to the cell surface implies the inhibition of the growth of said cells and, eventually, their death. Because the electromagnetic radiation used in the present invention is low power, photo-thermal effects as the cause of cell death are ruled out. On the contrary, the present invention proposes as causes of cell death the electroporation of the cell membrane, the photo-oxidative attack ("photooxidative etching") of the Ag nucleus of the nanoparticles, producing toxic Ag + ions, or photoinduction of the formation of reactive oxygen species in the cellular medium near the nanoparticles. All these effects have their origin in the high electromagnetic fields induced in the environment of the nanoparticles specifically used in the present invention when subjected to low power electromagnetic radiation.
Las nanopartículas utilizadas en la presente invención presentan la característica física de poseer una elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango estrecho de longitudes de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm. Se trata además de nanopartículas que comprenden un núcleo interno, preferentemente de plata (Ag) o de aleaciones que comprendan plata. Además las nanopartículas están recubiertas por un material inerte semiconductor, cerámico y/o dieléctrico, siendo preferentemente un óxido metálico semiconductor, cerámico y dieléctrico del grupo: SiO2, GeO2, ZrO2, TiO2, ZnO2. De manera particular, en la presente invención se utilizan nanopartículas de Ag recubiertas por una capa externa de SiO2, denominadas nanopartículas Ag-sílice.The nanoparticles used in the present invention have the physical characteristic of having a high intensity of SPR absorbance in a narrow range of wavelengths between 350 and 500 nm, preferably between 400 and 410 nm. These are also nanoparticles that comprise an inner core, preferably of silver (Ag) or of alloys that comprise silver. In addition, the nanoparticles are coated with a semiconductor, ceramic and / or dielectric inert material, preferably a semiconductor, ceramic and dielectric metal oxide of the group: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 , ZnO 2 . In particular, Ag nanoparticles coated by an outer layer of SiO 2 , called Ag-silica nanoparticles, are used in the present invention.
Las nanopartículas usadas en la presente invención, una vez unidas a la superficie celular e irradiadas con una longitud de onda dentro del rango entre 350 nm - 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm, inducen la muerte de células procariotas, aunque por sus características este efecto también es extensible a células eucariotas.The nanoparticles used in the present invention, once attached to the cell surface and irradiated with a wavelength within the range between 350 nm - 500 nm, preferably between 400 and 410 nm, induce the death of prokaryotic cells, although by their characteristics This effect is also extensible to eukaryotic cells.
En la presente invención se entiende por enfermedad infecciosa a la manifestación clínica provocada por la acción de microorganismos u otros agentes infectivos, como por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, virus, protozoos, etc. A efectos de la presente invención el término elevada intensidad de absorbancia SPR se define entre los valores 0,4 y 1,2 (para un paso óptico de 10 mm). Asimismo, el término rango estrecho de longitud de onda se define entre 350 y 500nm.In the present invention, infectious disease is understood as the clinical manifestation caused by the action of microorganisms or other infectious agents, such as, for example, bacteria, fungi, yeasts, viruses, protozoa, etc. For the purposes of the present invention the term "high absorbance intensity SPR" is defined between the values 0.4 and 1.2 (for an optical pitch of 10 mm). Also, the term narrow wavelength range is defined between 350 and 500nm.
En la presente invención se define como agente citotóxico a todo aquel que causa toxicidad en las células suprimiendo sus funciones y/o provocando su muerte. Se refiere a cualquier tipo de célula, procariota o eucariota, preferentemente células bacterianas. Además, en la presente invención, la inducción de citotoxicidad en una muestra comprende la esterilización, desinfección o conservación de la misma; así como cualquier otro efecto procedente de la inducción de la citotoxicidad en las células presentes en la muestra.In the present invention, cytotoxic agent is defined as anyone who causes toxicity in the cells by suppressing their functions and / or causing their death. It refers to any type of cell, prokaryotic or eukaryotic, preferably bacterial cells. Furthermore, in the present invention, the induction of cytotoxicity in a sample comprises sterilization, disinfection or preservation thereof; as well as any other effect from the induction of cytotoxicity in the cells present in the sample.
La muestra comprende células vivas cuya citotoxicidad, y eventualmente muerte, se desea inducir, y ésta puede ser de cualquier tipo, tanto sólida como líquida, y de cualquier origen. Así, por ejemplo, la muestra puede ser tanto material o instrumental quirúrgico o de laboratorio, como agua u otro líquido, como un medio de cultivo o un tejido biológico.The sample comprises living cells whose cytotoxicity, and eventually death, is desired to induce, and this can be of any type, both solid and liquid, and of any origin. Thus, for example, the sample can be both surgical or laboratory material or instruments, such as water or other liquid, such as a culture medium or biological tissue.
Por otro lado, mencionar que la dosis efectiva de nanopartículas para provocar la muerte celular en la presente invención corresponde a una concentración de al menos 0,15xl014 nanopartículas por litro.On the other hand, mention that the effective dose of nanoparticles to cause cell death in the present invention corresponds to a concentration of at least 0.15 x 10 14 nanoparticles per liter.
Descripción de las figurasDescription of the figures
Figura 1. Caracterización física de la nanopartícula Ag-sílice.Figure 1. Physical characterization of the Ag-silica nanoparticle.
A. Espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag-sílice que muestra la banda del Plasmon centrada en 400 nm. El eje X muestra la longitud de onda (nm) y el eje Y la absorbancia (a.u).A. Absorption spectrum of an Ag-silica nanoparticle suspension showing the Plasmon band centered at 400 nm. The X axis shows the wavelength (nm) and the Y axis absorbance (a.u).
La gráfica interior muestra la distribución de tamaños medidos mediante TEM. El eje X muestra el diámetro de las nanopartículas siendo su valor medio 1 lnm.The inside graph shows the distribution of sizes measured by TEM. The X axis shows the diameter of the nanoparticles with an average value of 1 lnm.
B. Imagen HRTEM (Microscopía Electrónica de Transmisión de Alta Resolución) de una nanopartícula de Ag-sílice mostrando el recubrimiento de sílice amorfo (flechas negras). La fotografía además muestra los planos cristalinos gemelos ("twin planes"), flechas blancas, y las 5 caras o pliegues gemelos que conforman el tipo de morfología o de crecimiento de nanopartículas con forma de decaedro. En este tipo de morfología de nanopartículas se potencia el fenómeno de ataque oxidativo ("oxidative etching") debido a distorsiones significativas de la red cristalina, a la relajación superficial y en general a la presencia de defectos.B. HRTEM (High Resolution Transmission Electron Microscopy) image of an Ag-silica nanoparticle showing the amorphous silica coating (black arrows). The photograph also shows the twin crystal planes ("twin plans"), white arrows, and the 5 faces or twin folds that make up the type of morphology or growth of decanter-shaped nanoparticles. In this type of nanoparticle morphology, the phenomenon of oxidative attack ("oxidative etching") is enhanced due to significant distortions of the crystalline network, surface relaxation and, in general, the presence of defects.
Figura 2. Efecto de las nanopartículas de Ag-sílice en cultivos de bacterias E.coli.Figure 2. Effect of Ag-silica nanoparticles on cultures of E.coli bacteria.
A. Imagen de TEM de una suspensión de células de Escherichia coli en presencia de nanopartículas de Ag-sílice añadidas en una concentración de 0.15x1014 nanopartículas/L. Se muestra la adherencia de las nanopartículas de la invención a la superficie celular. Esta unión es imprescindible para conseguir que los altos campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas, debido al fenómeno SPR, alcancen e interactúen con las células.A. TEM image of a suspension of Escherichia coli cells in the presence of Ag-silica nanoparticles added at a concentration of 0.15x10 14 nanoparticles / L. The adhesion of the nanoparticles of the invention to the cell surface is shown. This union is essential to ensure that the high electromagnetic fields induced in the environment of the nanoparticles, due to the SPR phenomenon, reach and interact with the cells.
B. Curvas de crecimiento de las bacterias medidas a través de OD600 (Densidad Óptica del medio de cultivo líquido a 600nm), eje Y, versus el tiempo de crecimiento en minutos, eje X. Cuadrados, sin nanopartículas, estrellas, con una concentración de 0.15 xlO14 nanopartículas/L, triángulos, con 1,5x1014 nanopartículas/L y círculos, con 15x1014 nanopartículas/L.B. Bacteria growth curves measured through OD 600 (Optical density of the liquid culture medium at 600nm), Y axis, versus the growth time in minutes, X axis. Squares, without nanoparticles, stars, with a concentration 0.15 xlO 14 nanoparticles / L, triangles, with 1.5x10 14 nanoparticles / L and circles, with 15x10 14 nanoparticles / L.
Figura 3. Efecto bactericida en medio líquido.Figure 3. Bactericidal effect in liquid medium.
Estas gráficas muestran las curvas de crecimiento bacteriano mediante las medidas de OD600 (eje Y) frente al tiempo de crecimiento en minutos (eje X) y bajo diferentes tratamientos. Para estos experimentos se utilizó una concentración intermedia correspondiente a 1.5x1014 nanopartículas/L, para la cual no se manifiesta toxicidad intrínseca de forma previa a la aplicación de la radiación. De esta forma cualquier efecto foto -bactericida conseguido cuando se aplica la radiación puede ser discriminado con respecto al efecto de toxicidad intrínseca de la nanopartícula. Los círculos corresponden a muestras irradiadas y los cuadrados corresponden a las muestras control (sin irradiación). A. Muestra con nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 405nm (láser azul) sobre un 5% del volumen. Se evidencia una disminución en la OD600 entre el 30% y el 40%, incluso siendo irradiado solamente un 5% del volumen total del cultivo.These graphs show the bacterial growth curves by means of OD 600 measurements (Y axis) versus the growth time in minutes (X axis) and under different treatments. For these experiments an intermediate concentration corresponding to 1.5x10 14 nanoparticles / L was used, for which no intrinsic toxicity is manifested prior to the application of radiation. In this way any photo-bactericidal effect achieved when the radiation is applied can be discriminated with respect to the intrinsic toxicity effect of the nanoparticle. The circles correspond to irradiated samples and the squares correspond to the control samples (without irradiation). A. Sample with Ag-silica nanoparticles irradiated at 405nm (blue laser) about 5% of the volume. A decrease in OD 600 between 30% and 40% is evident, even being irradiated only 5% of the total volume of the crop.
B. Muestra sin nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 405nm (láser azul) sobre un 15% del volumen. En este caso se observó una ligera disminución en la OD600.B. Sample without Ag-silica nanoparticles irradiated at 405nm (blue laser) about 15% of the volume. In this case a slight decrease in OD 600 was observed.
C. Muestra con nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 633nm (láser rojo). No muestran cambios significativos en el crecimiento celular.C. Sample with Ag-silica nanoparticles irradiated at 633 nm (red laser). They do not show significant changes in cell growth.
D. Muestra sin nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 633nm (láser rojo). No muestran cambios significativos en el crecimiento celular.D. Sample without Ag-silica nanoparticles irradiated at 633nm (red laser). They do not show significant changes in cell growth.
Figura 4. Efecto bactericida en medio sólido.Figure 4. Bactericidal effect in solid medium.
A. Cultivo de bacterias Escherichia coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con aplicación de dos tipos de radiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. Se observa un área libre de células (superficie gris), claramente distinguible de la zona ocupada por colonias bacterianas (superficie brillante, blanca) en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). En cambio, dicha zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es más efectiva porque es cercana al máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas.A. Culture of Escherichia coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with application of two types of radiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. A cell-free area (gray surface) is observed, clearly distinguishable from the area occupied by bacterial colonies (bright, white surface) in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B). On the other hand, said cell-free zone does not appear when the plate is irradiated with the 633 nm red laser (point R). That is, blue light is more effective because it is close to the maximum absorbance SPR of the nanoparticles.
B. Cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de células. Es decir, el tratamiento no es efectivo, a pesar de la radiación, debido a la ausencia de nanopartículas. C. Cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con radiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas. Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B).B. Culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the absence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. No cell free area is observed. That is, the treatment is not effective, despite the radiation, due to the absence of nanoparticles. C. Culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with blue light radiation (B) of 405 nm for 16 hours. A cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B).
D. Cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas después de 48 horas sin irradiación, habiendo sido antes irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B).D. Culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles after 48 hours without irradiation, having previously been irradiated with 405 nm blue light for 16 hours. After 48 hours without irradiation continues observing a cell-free area in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B).
Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz de 405nm es efectivo y, además, irreversible.That is, the treatment with the nanoparticles of the invention and 405nm light is effective and, in addition, irreversible.
Figura 5. Esquema representativo de los mecanismos responsables de la muerte celular después del tratamiento con las nanopartículas de la invención e irradiación con una longitud de onda entre 350 y 500nm.Figure 5. Representative scheme of the mechanisms responsible for cell death after treatment with the nanoparticles of the invention and irradiation with a wavelength between 350 and 500 nm.
A. Ataque directo a la superficie celular a través de perturbaciones eléctricas en la pared celular y en la membrana causando el mal funcionamiento de la células y eventualmente su muerte.A. Direct attack on the cell surface through electrical disturbances in the cell wall and in the membrane causing cell malfunction and eventually death.
B. Fenómeno de ataque fotooxidativo ("foto-oxidative etching"): liberación de iones Ag+ de las nanopartículas Ag-sílice, en presencia de anión Cl" (presente en el medio de cultivo), que son inyectados justo en la membrana celular.B. phenomenon photooxidative attack ( "photo-oxidative etching"): release of Ag + ions of Ag-silica nanoparticles in the presence of anion Cl "(present in the culture medium), which are injected directly in the cell membrane .
C. Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). La excitación de cromóforos endógenos bacterianos foto-sensibles provoca la reducción de moléculas de oxígeno cercanas, produciendo ROS muy reactivas capaces de matar a las células.C. Production of reactive oxygen species (ROS). The excitation of photo-sensitive bacterial endogenous chromophores causes the reduction of nearby oxygen molecules, producing very reactive ROS capable of killing cells.
Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention
La presente invención se refiere a la inducción de muerte celular por parte de nanopartículas citotóxicas con características ópticas especiales, adheridas a la superficie celular e irradiadas con una frecuencia entre 350 y 500 nm.The present invention relates to the induction of cell death by cytotoxic nanoparticles with special optical characteristics, adhered to the cell surface and irradiated with a frequency between 350 and 500 nm.
La capa de sílice de las nanopartículas Ag-sílice (preferentemente utilizadas en la presente invención) disminuye la segregación intrínseca de iones Ag+ y por ende sus efectos, como la coordinación con grupos SH proteicos, disminuyendo también su toxicidad intrínseca. Sin embargo, el hecho de que el recubrimiento de sílice sea muy fino (1-2 nm) posibilita que el campo electromagnético sobre la superficie aislante sea intenso. Además, la capa o recubrimiento de sílice no es compacta, es decir, presenta poros, los cuales permiten reacciones químicas inducidas o intensificadas por la radiación luminosa. Si el medio celular es rico en sales con presencia abundante de iones Cl" la radiación luminosa provoca la foto-oxidación de la superficie de las nanopartículas de Ag y la segregación o inyección de iones de plata. De esta forma, mediante la irradiación con luz de la longitud de onda adecuada en zonas seleccionadas se puede controlar la toxicidad de las nanopartículas.The silica layer of the Ag-silica nanoparticles (preferably used in the present invention) decreases the intrinsic segregation of Ag + ions and hence their effects, such as coordination with protein SH groups, also decreasing their intrinsic toxicity. However, the fact that the silica coating is very thin (1-2 nm) allows the electromagnetic field on the insulating surface to be intense. In addition, the silica layer or coating is not compact, that is, it has pores, which allow chemical reactions induced or intensified by light radiation. If the cell medium is rich in salts with abundant Cl ions "light radiation causes photo-oxidation of the surface of the Ag nanoparticles and segregation or injection of silver ions. Thus, by irradiation with light The toxicity of the nanoparticles can be controlled from the appropriate wavelength in selected areas.
Tal y como se ha mencionado en el estado de la técnica, las nanopartículas de Ag son conocidas por su actividad antibiótica intrínseca. Sin embargo, en la presente invención la capa de sílice aisla y estabiliza la Ag que forma el núcleo interno de la nanopartícula atenuando o inhibiendo su efecto bactericida intrínseco. En la presente invención se testó este fenómeno mediante el estudio del crecimiento de la bacteria E. coli en la presencia de nanopartículas Ag-sílice. Las nanopartículas fueron añadidas al cultivo de bacterias, justo antes del comienzo del su crecimiento exponencial, a concentraciones entre 0,15.1014 y 15.1014 nanopartículas/L. Las curvas de crecimiento bajo estas condiciones, medidas en base al OD600, se representan en la Figura 2B. Sólo se observó un débil efecto tóxico con la mayor de las concentraciones de nanopartículas utilizadas (15.1014 nanopartículas/L), lo que dio lugar a una pequeña reducción del crecimiento de las bacterias. Estudios similares llevados a cabo con nanopartículas de Ag no recubiertas a concentraciones comparables con las anteriores mostraron un efecto bactericida mucho mayor (disminución del crecimiento en un 90%). Por lo tanto, se concluye que las nanopartículas utilizadas en la invención (particularmente las nanopartículas Ag-sílice) poseen un efecto inhibidor intrínseco (previo a la aplicación de radiación) del crecimiento de los cultivos bacterianos muy pequeño. Dicha atenuación de la toxicidad intrínseca de las nanopartículas es debida a su recubrimiento inerte, el cual, a su vez, debilita su efecto inductor de la muerte celular permitiendo además su activación posterior mediante la aplicación de la radiación requerida. Es decir, permite controlar temporal y espacialmente la toxicidad de la nanopartícula, ya que ésta ocurrirá solo en el momento y en el lugar en que sea aplicada la radiación luminosa de la longitud de onda adecuada. Debido a que las nanopartículas utilizadas en la presente invención se unen eficazmente a la superficie celular (ver la Figura 2A), puede concluirse que la reducción de toxicidad intrínseca de la Ag no es debida a la falta de proximidad a las células.As mentioned in the state of the art, Ag nanoparticles are known for their intrinsic antibiotic activity. However, in the present invention the silica layer isolates and stabilizes the Ag that forms the inner core of the nanoparticle by attenuating or inhibiting its intrinsic bactericidal effect. In the present invention, this phenomenon was tested by studying the growth of E. coli bacteria in the presence of Ag-silica nanoparticles. The nanoparticles were added to the bacteria culture, just before the beginning of their exponential growth, at concentrations between 0.15.10 14 and 15.10 14 nanoparticles / L. The growth curves under these conditions, measured based on OD 600 , are depicted in Figure 2B. Only a weak toxic effect was observed with the highest concentrations of nanoparticles used (15.10 14 nanoparticles / L), which resulted in a small reduction in bacterial growth. Similar studies carried out with uncoated Ag nanoparticles at concentrations comparable to the previous ones showed a much greater bactericidal effect (growth decrease by 90%). Therefore, it is concluded that the nanoparticles used in the invention (particularly the Ag-silica nanoparticles) possess an intrinsic inhibitory effect (prior to the application of radiation) of the growth of very small bacterial cultures. Said attenuation of the intrinsic toxicity of the nanoparticles is due to its inert coating, which, in turn, weakens its inducing effect of cell death, also allowing its subsequent activation by applying the required radiation. That is, it allows to temporarily and spatially control the toxicity of the nanoparticle, since it will occur only at the time and in the place where the light radiation of the appropriate wavelength is applied. Because the nanoparticles used in the present invention effectively bind to the surface cell (see Figure 2A), it can be concluded that the reduction of intrinsic toxicity of Ag is not due to the lack of proximity to the cells.
Las nanopartículas utilizadas en la invención han sido caracterizadas por varias técnicas físicas. La Figura IA muestra el espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag, observándose una elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango estrecho de longitudes de onda en torno a 400nm. En la Figura IB se muestran imágenes HRTEM donde se observan partículas de Ag esféricas con un diámetro de l lnm (ver la Figura IA interna), cada una de ellas cubierta con una capa amorfa de sílice de un espesor entre 1 y 2 nm (flechas negras, Figura IB). En las imágenes TEM se distinguen además los planos gemelos, evidenciados por las flechas blancas de la Figura IB, junto con los cinco vértices contenidos en cada cara, dando lugar a una morfología de decaedro. Este tipo de estructura está formada por cinco mono cristales tetraédricos orientados radialmente a través de una abscisa central, de tal forma que todos los tetraedros tiene una esquina en común y cada uno de ellos tiene dos caras en contacto con sus vecinos. Con este tipo de morfología el fenómeno "oxidative etching" es amplificado debido a distorsiones en el entramado del cristal.The nanoparticles used in the invention have been characterized by various physical techniques. Figure IA shows the absorption spectrum of a suspension of Ag nanoparticles, observing a high intensity of SPR absorbance in a narrow range of wavelengths around 400 nm. Figure IB shows HRTEM images showing spherical Ag particles with a diameter of l lnm (see internal Figure IA), each covered with an amorphous silica layer between 1 and 2 nm thick (arrows black, Figure IB). In the TEM images, the twin planes are also distinguished, as evidenced by the white arrows of Figure IB, together with the five vertices contained on each face, giving rise to a decahedron morphology. This type of structure is formed by five radially oriented tetrahedral mono crystals through a central abscissa, so that all tetrahedra have a common corner and each of them has two faces in contact with their neighbors. With this type of morphology the "oxidative etching" phenomenon is amplified due to distortions in the glass framework.
El análisis los datos obtenidos por XRD (Difracción de Rayos X) indica que la Ag de las nanopartículas está formada por cristales con un diámetro de 11 nm. Además, los picos característicos de sílice no están presentes en el espectro XRD, lo que sugiere que este último material es amorfo. Las medidas realizadas en las nanopartículas Ag- sílice por EDX (Fluorescencia de Rayos X) muestran una ratio Si/O de 1A lo cual coincide con la presencia de sílice amorfo en la superficie de las nanopartículas.The analysis of the data obtained by XRD (X-ray Diffraction) indicates that the Ag of the nanoparticles is formed by crystals with a diameter of 11 nm. In addition, the characteristic silica peaks are not present in the XRD spectrum, suggesting that the latter material is amorphous. The measurements made in the Agustica nanoparticles by EDX (X-ray Fluorescence) show an Si / O ratio of 1 A which coincides with the presence of amorphous silica on the surface of the nanoparticles.
Un requisito indispensable para observar el efecto de los fenómenos causados por la absorbancia SPR es que la estructura diana (en este caso la superficie celular) se encuentre próxima a la superficie de la nanopartícula, donde el plasmón debe originarse. Tal y como se ha demostrado en la presente invención mediante TEM, las nanopartículas utilizadas se adhieren eficazmente a la membrana de las células, acumulándose en su superficie (ver Figura 2A). Para estudiar el efecto de los altos campos electromagnéticos inducidos mediante la excitación de las nanopartículas utilizadas en la invención mediante SPR, se usaron dos láseres, llamados azul y rojo. La longitud de onda del láser azul (405nm) es muy próxima a la absorción máxima del espectro de las nanopartículas utilizadas en la invención (Figura IA). El láser rojo tiene una longitud de onda de 633 nm, y fue elegido como control negativo debido a que su absorción por las nanopartículas es muy pequeña.An indispensable requirement to observe the effect of the phenomena caused by SPR absorbance is that the target structure (in this case the cell surface) is close to the surface of the nanoparticle, where the plasmon must originate. As demonstrated in the present invention by TEM, the nanoparticles used adhere effectively to the cell membrane, accumulating on its surface (see Figure 2A). To study the effect of the high electromagnetic fields induced by excitation of the nanoparticles used in the invention by SPR, two lasers, called blue and red, were used. The wavelength of the blue laser (405nm) is very close to the maximum absorption of the spectrum of the nanoparticles used in the invention (Figure IA). Red laser It has a wavelength of 633 nm, and was chosen as a negative control because its absorption by the nanoparticles is very small.
Un grupo de experimentos fueron llevados a cabo en medios de cultivo líquidos, donde las bacterias fueron irradiadas con un láser introducido en una caja termostática a 370C. Este hecho permitió una fácil medición del OD600 en pequeños volúmenes de cultivo, los cuales son requeridos para conseguir una irradiación significativa con láseres cuyo foco de irradiación es de 1,4 mm2 aproximadamente. Por lo tanto, para un medio de 3 mm, correspondiente al grosor de la cubeta o vial del cultivo, el volumen irradiado es 4,2 μl, lo cual corresponde aproximadamente al 9,3% del total de los 45 μl de cultivo original. La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento medidas bajo estas condiciones. En los cultivos donde se añadieron nanopartículas (concretamente nanopartículas de Ag-sílice) se utilizó una concentración de 1,5.104 nanopartículas/L, que es la concentración que causa una toxicidad intrínseca de las nanopartículas de Ag medible (Figura 2B), lo que permite la observación del efecto sobre el crecimiento celular debido exclusivamente a la irradiación láser. Las muestras que contenían nanopartículas Ag-sílice y fueron irradiadas con un láser azul mostraron un crecimiento atenuado con un descenso en el OD600 en la parte superior de la curva de entre el 30 y el 40%, comparado con los experimentos control donde se usaron las mismas muestras sin irradiación, o muestras sin nanopartículas irradiadas con el mismo láser (ver Figura 3A). Por otro lado, experimentos control realizados mediante la irradiación con el láser rojo, ya fuera añadiendo o sin añadir nanopartículas, no mostraron cambios significativos en el crecimiento celular (Figuras 3 C y D). Estos resultados indican claramente que las nanopartículas utilizadas en la presente invención (particularmente las nanopartículas Ag-sílice) deben estar presentes para que la irradiación afecte negativamente al crecimiento celular. Además se demuestra que el efecto observado se relaciona específicamente con la aplicación de una longitud de onda (entre 350 y 500 nm preferentemente entre 400 y 410 nm) que se corresponde con la mayor intensidad de absorbancia SPR conseguida por las nanopartículas.A group of experiments were carried out in liquid culture media, where the bacteria were irradiated with a laser introduced in a thermostatic box at 37 0 C. This fact allowed an easy measurement of OD 600 in small culture volumes, which are required to achieve significant irradiation with lasers whose irradiation focus is approximately 1.4 mm 2 . Therefore, for a medium of 3 mm, corresponding to the thickness of the cuvette or vial of the culture, the irradiated volume is 4.2 μl, which corresponds to approximately 9.3% of the total of the 45 μl of the original culture. Figure 3 shows the growth curves measured under these conditions. In cultures where nanoparticles (specifically Ag-silica nanoparticles) were added a concentration of 1.5.10 4 nanoparticles / L, which is the concentration that causes an intrinsic toxicity of the measurable Ag nanoparticles (Figure 2B), which It allows the observation of the effect on cell growth due exclusively to laser irradiation. Samples containing Ag-silica nanoparticles and were irradiated with a blue laser showed attenuated growth with a decrease in OD 600 at the top of the curve between 30 and 40%, compared to the control experiments where they were used. the same samples without irradiation, or samples without nanoparticles irradiated with the same laser (see Figure 3A). On the other hand, control experiments performed by irradiation with the red laser, either adding or without adding nanoparticles, showed no significant changes in cell growth (Figures 3 C and D). These results clearly indicate that the nanoparticles used in the present invention (particularly the Ag-silica nanoparticles) must be present for irradiation to negatively affect cell growth. Furthermore, it is shown that the observed effect is specifically related to the application of a wavelength (between 350 and 500 nm preferably between 400 and 410 nm) that corresponds to the higher intensity of SPR absorbance achieved by the nanoparticles.
Los experimentos en medios de cultivo líquidos no informan sobre la viabilidad de las células debido a que no permiten distinguir entre la reducción de la velocidad de división celular y la reducción del número de células viables. Adicionalmente, debido a que únicamente se puede incidir con el láser sobre una fracción del volumen total, y teniendo en cuenta que la población de células cambia con el tiempo debido al movimiento de las bacterias en la muestra, no se controla de manera exhaustiva la dosis de radiación efectiva. Por lo tanto, en la presente invención se utilizó también la irradiación de cultivos sólidos como sistema de estudio y validación del método, ya que en este tipo de cultivos la difusión de las bacterias es limitada y puede asumirse que la radiación aplicada sobre la muestra es constante. Se utilizaron como medio sólido placas de agar (medio LB), en las cuales las bacterias fueron sembradas y crecidas hasta la formación de colonias que, idealmente, cubrían toda la superficie de la placa. Las nanopartículas Ag-sílice fueron introducidas en el medio a una concentración de 1,5.1014 nanopartículas /L, tanto en el inoculo utilizado para sembrar las placas como en el medio LB-agar correspondiente a éstas, y la irradiación con los láseres azul y rojo fue mantenida durante el crecimiento celular completo y llevada a cabo sobre pequeñas áreas seleccionadas y no superpuestas. La Figura 4 muestra el efecto bactericida en medio sólido. La Figura 4 A muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con aplicación de dos tipos de radiación: láser azul (B), de 405 nm, y láser rojo (R), de 633 nm. Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B) y, en cambio, dicha zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es efectiva porque tiene una longitud de onda similar a la del máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas. La Figura 4B muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de células en ningún caso. Es decir, en ausencia de nanopartículas el tratamiento bactericida no es efectivo. La Figura 4C muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con irradiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas, periodo necesario para el crecimiento de las colonias bacterianas en condiciones normales, observándose un área libre de células en la zona irradiada (punto B). La Figura 4D muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas, irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas, y mantenidas después sin irradiación a temperatura óptima de crecimiento durante 48 horas más. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz a 405 nm es efectivo y, además, irreversible.The experiments in liquid culture media do not report on the viability of the cells because they do not allow to distinguish between the reduction of the speed of cell division and the reduction of the number of viable cells. Additionally, because only a fraction of the total volume can be affected with the laser, and Given that the population of cells changes over time due to the movement of bacteria in the sample, the effective radiation dose is not exhaustively controlled. Therefore, in the present invention the irradiation of solid cultures was also used as a method of study and validation of the method, since in this type of cultures the diffusion of the bacteria is limited and it can be assumed that the radiation applied on the sample is constant. Agar plates (LB medium) were used as solid medium, in which the bacteria were sown and grown to the formation of colonies that, ideally, covered the entire surface of the plate. The Ag-silica nanoparticles were introduced into the medium at a concentration of 1.5.10 14 nanoparticles / L, both in the inoculum used to sow the plates and in the LB-agar medium corresponding to them, and irradiation with the blue lasers and Red was maintained during complete cell growth and carried out on small selected and non-overlapping areas. Figure 4 shows the bactericidal effect in solid medium. Figure 4 A shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with application of two types of radiation: blue laser (B), 405 nm, and red laser (R), 633 nm. A cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B) and, on the other hand, said cell-free zone does not appear when the plate is irradiated with the 633 nm red laser (point R). That is, blue light is effective because it has a wavelength similar to that of the maximum absorbance SPR of the nanoparticles. Figure 4B shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the absence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. No cell-free area is observed in any case. That is, in the absence of nanoparticles the bactericidal treatment is not effective. Figure 4C shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with blue light irradiation (B) of 405 nm for 16 hours, a period necessary for the growth of bacterial colonies under normal conditions, observing a cell-free area in the irradiated area (point B). Figure 4D shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles, irradiated with blue light of 405 nm for 16 hours, and then maintained without irradiation at optimum growth temperature for an additional 48 hours. After 48 hours without Irradiation continues to observe a cell-free area in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B). That is, treatment with the nanoparticles of the invention and light at 405 nm is effective and, in addition, irreversible.
Por lo tanto, se pueden extraer dos conclusiones importantes: « La presencia de nanopartículas en la superficie celular y la irradiación de la zona con la longitud de onda a la cual las nanopartículas muestran su máxima absorbancia SPR (longitud de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm) es fundamental para el éxito del efecto citotóxico. • En la zona donde se aplican las condiciones explicadas en el punto anterior no se observa una reactivación del crecimiento celular aunque se deje de aplicar la radiación. En presencia de las nanopartículas la irradiación a una frecuencia correspondiente al espectro de absorbancia SPR de las nanopartículas esteriliza la zona. Una de las causas de la muerte celular provocada por las nanopartículas utilizadas en la invención debe ser un ataque directo a la superficie celular a través de perturbaciones eléctricas en la pared y/o la membrana de las células, causando su mal funcionamiento y eventualmente se muerte (Figura 5 A). De hecho, los pulsos del láser a escala de nanosegundos, e incluso menores, son capaces de perturbar temporalmente la integridad de la membrana y este efecto ha sido usado para la transformación celular con ADN exógeno.Therefore, two important conclusions can be drawn: «The presence of nanoparticles on the cell surface and irradiation of the area with the wavelength at which the nanoparticles show their maximum absorbance SPR (wavelength between 350 and 500 nm , preferably between 400 and 410 nm) is essential for the success of the cytotoxic effect. • There is no reactivation of cell growth in the area where the conditions explained in the previous point are applied, even if radiation is no longer applied. In the presence of the nanoparticles, irradiation at a frequency corresponding to the SPR absorbance spectrum of the nanoparticles sterilizes the area. One of the causes of cell death caused by the nanoparticles used in the invention must be a direct attack on the cell surface through electrical disturbances in the cell wall and / or membrane, causing its malfunction and eventually death. (Figure 5 A). In fact, the pulses of the nanosecond-scale laser, and even smaller ones, are capable of temporarily disturbing the integrity of the membrane and this effect has been used for cell transformation with exogenous DNA.
Alternativamente, otros mecanismos indirectos están implicados en la muerte celular. Es sabido que el fenómeno de ataque fotooxidativo ("foto-oxidative etching") libera cationes Ag+ de las nanopartículas Ag-sílice en presencia de aniones Cl" en la disolución, lo cual da lugar a una inyección de los iones Ag+ justo en la membrana celular. La capa o recubrimiento de las nanopartículas no es compacta, es decir, presentan poros que permiten reacciones químicas, que pueden a su vez ser inducidas o intensificadas por la radiación luminosa. Si el medio celular es rico en sales con abundante presencia de iones Cl" la radiación luminosa provoca la foto-oxidación de la superficie de las nanopartículas de Ag y la segregación o inyección de iones Ag+. De esta forma, mediante la irradiación con luz de la longitud de onda adecuada en zonas seleccionadas se puede controlar la toxicidad de las nanopartículas. En el caso de células eucariotas las nanopartículas pueden ser incluso fagocitadas, por lo que la inyección de Ag+ ocurriría también directamente en su interior (Figura 5 B).Alternatively, other indirect mechanisms are involved in cell death. It is known that the phenomenon of photooxidative attack ("photo-oxidative etching") releases Ag + cations from the Ag-silica nanoparticles in the presence of Cl anions " in the solution, which results in an injection of the Ag + ions just in the cell membrane The layer or coating of the nanoparticles is not compact, that is, they have pores that allow chemical reactions, which in turn can be induced or intensified by light radiation, if the cellular medium is rich in salts with abundant presence of Cl ions " the light radiation causes the photo-oxidation of the surface of the Ag nanoparticles and the segregation or injection of Ag + ions. Thus, by irradiation with light of the appropriate wavelength in areas Selected can control the toxicity of the nanoparticles. In the case of eukaryotic cells, the nanoparticles can even be phagocytosed, so the injection of Ag + would also occur directly inside (Figure 5 B).
Por otro lado, la muerte celular puede producirse debido a la producción de especies reactivas de oxígeno. Este efecto ocurre debido a la absorción de luz violeta-azul por cromóforos endógenos bacterianos foto-sensibles, los cuales, una vez excitados, son capaces de transferir la energía a moléculas de oxígeno cercanas, produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS), especialmente oxígeno singlete (1O2), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radicales hidroxilo (OH). La presencia de las nanopartículas en su superficie celular posibilita la amplificación de la intensidad de luz efectiva, que a su vez incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno. Esta combinación de luz, moléculas fotosensibles y especies reactivas de oxígeno se conoce en el campo de la oncología como terapia foto-dinámica. Las consecuencias tóxicas del incremento de ROS en las células son conocidas e incluyen mutaciones del genoma, peroxidación de lípidos, inhibición de la glucólisis y de la síntesis de ADN.On the other hand, cell death can occur due to the production of reactive oxygen species. This effect occurs due to the absorption of violet-blue light by photo-sensitive bacterial endogenous chromophores, which, once excited, are capable of transferring energy to nearby oxygen molecules, producing reactive oxygen species (ROS), especially oxygen singlet ( 1 O 2 ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and hydroxyl radicals (OH). The presence of nanoparticles on their cell surface allows the amplification of the effective light intensity, which in turn increases the production of reactive oxygen species. This combination of light, photosensitive molecules and reactive oxygen species is known in the field of oncology as photo-dynamic therapy. The toxic consequences of the increase in ROS in cells are known and include genome mutations, lipid peroxidation, inhibition of glycolysis and DNA synthesis.
Otro mecanismo sería el que sinérgicamente integra varios, o todos, los arriba mencionados. De hecho, los poros formados en la membrana debido a las perturbaciones eléctricas facilitan la entrada de iones Ag+ o de especies reactivas de oxígeno al interior de las células donde ejercen su efecto tóxico. Alternativamente, los iones Ag+ pueden incluso inducir directamente la generación de especies reactivas de oxígeno mediante reacciones bien conocidas.Another mechanism would be the one that synergistically integrates several, or all, of the above. In fact, the pores formed in the membrane due to electrical disturbances facilitate the entry of Ag + ions or reactive oxygen species into the cells where they exert their toxic effect. Alternatively, Ag + ions can even directly induce the generation of reactive oxygen species by well known reactions.
En conclusión la presente invención evidencia dos claros fenómenos relacionados con el uso concreto de las nanopartículas de la invención para la inducción de la muerte celular: • El recubrimiento inerte de las nanopartículas (particularmente sílice) reduce la toxicidad intrínseca de su núcleo de plata, en lugares o momentos donde tal efecto tóxico intrínseco no es requerido o es perjudicial. El momento y lugar en el cual se activa la toxicidad de las nanopartículas pueden controlarse mediante la aplicación selectiva de la radiación adecuada. • La excitación de dichas nanopartículas con una radiación de una longitud de onda dentro de la banda (alrededor de 400 nm) de su absorbancia SPR (350-5 OOnm, preferentemente 400-4 lOnm), produce la activación del efecto tóxico que actúa induciendo la muerte celular a través de mecanismos bioactivos como la electroporación de la membrana, el ataque fotooxidativo o la foto inducción de radicales libres.In conclusion, the present invention evidences two clear phenomena related to the specific use of the nanoparticles of the invention for the induction of cell death: • The inert coating of the nanoparticles (particularly silica) reduces the intrinsic toxicity of its silver core, in places or moments where such intrinsic toxic effect is not required or is harmful. The time and place in which the toxicity of the nanoparticles is activated can be controlled by the selective application of the appropriate radiation. • The excitation of said nanoparticles with a radiation of a wavelength within the band (around 400 nm) of its SPR absorbance (350-5 OOnm, preferably 400-4 lOnm), causes the activation of the toxic effect that acts by inducing cell death through bioactive mechanisms such as membrane electroporation, photooxidative attack or photo free radical induction.
Así, el método evidenciado en la presente invención tiene una aplicación directa relacionada con la inducción de manera selectiva y controlada de muerte celular tanto en células procariotas como eucariotas. La reducida toxicidad intrínseca de las nanopartículas y los elevados campos eléctricos generados vía SPR ofrecen multitud de aplicaciones en medicina y biología.Thus, the method evidenced in the present invention has a direct application related to the selective and controlled induction of cell death in both prokaryotic and eukaryotic cells. The reduced intrinsic toxicity of nanoparticles and the high electric fields generated via SPR offer many applications in medicine and biology.
El primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR, que comprenden externamente un recubrimiento inerte (preferentemente un óxido metálico semiconductor seleccionado entre: SiO2, GeO2, ZrO2, TiO2, ZnO2 o un metal inerte) e internamente un núcleo metálico (preferentemente Ag), como agentes citotóxicos. En una realización preferida de la invención las nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de 400 nm. El segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas arriba definidas para la elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades infecciosas.The first aspect of the present invention relates to the use of nanoparticles with a high intensity of SPR absorbance, which externally comprise an inert coating (preferably a semiconductor metal oxide selected from: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 , ZnO 2 or an inert metal) and internally a metal core (preferably Ag), as cytotoxic agents. In a preferred embodiment of the invention the nanoparticles have a SPR absorbance intensity between 0.4 and 1.2, for an optical pitch of 10 mm, at a wavelength of 400 nm. The second aspect of the present invention relates to the use of the nanoparticles defined above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of infectious diseases.
El tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la inducción de citotoxicidad en una muestra que comprende poner ésta en contacto con dichas nanopartículas y la irradiación de las nanopartículas adheridas a la superficie celular con luz de una longitud de onda entre 350 y 500 nm. La muestra puede ser de cualquier tipo, tanto sólida como líquida, que comprenda células vivas. Por ejemplo la muestra puede ser material o instrumental quirúrgico o de laboratorio. Otro tipo de muestra puede ser agua, u otros líquidos, contaminados con bacterias. Los ejemplos que se exponen a continuación tienen el objetivo de ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.The third aspect of the present invention relates to a method for the induction of cytotoxicity in a sample comprising contacting said nanoparticles and irradiating the nanoparticles adhered to the cell surface with light of a wavelength between 350 and 500 nm The sample can be of any type, both solid and liquid, comprising living cells. For example, the sample may be surgical or laboratory material or instruments. Another type of sample may be water, or other liquids, contaminated with bacteria. The examples set forth below are intended to illustrate the invention without limiting the scope thereof.
EJEMPLOSEXAMPLES
Ejemplo 1. Caracterización física de la nanopartícula Ag-sílice.Example 1. Physical characterization of the Ag-silica nanoparticle.
Tal y como puede verse en la Figura 1 A en la presente invención se elucidaron las propiedades ópticas especiales de las nanopartículas empleadas. Así, la Figura 1 A muestra el espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag con elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango de longitudes de onda alrededor de 400nm. Además, en la Figura IB se muestran imágenes HRTEM donde se observan partículas de Ag esféricas con un diámetro de 1 1 nm (ver la Figura IA interna), cada una de ellas cubierta con una capa amorfa de sílice de un espesor entre 1 y 2 nm (flechas negras, Figura IB). Se distinguen los planos gemelos en las imágenes TEM, los cuales son evidenciados por las flechas blancas de la Figura IB, junto con los cinco vértices contenidos en cada cara, dando lugar a una morfología de decaedro. Este tipo de estructura está formada por cinco mono cristales tetraédricos radialmente orientados a través de una abscisa central de tal forma que todo el tetraedro tiene una esquina en común y cada una de ellas tiene dos caras en contacto con sus vecinas. Con este tipo de morfología el fenómeno de ataque oxidativo ("oxidative etching") es amplificado, debido a distorsiones en las interfases entre los cristales tetrahédricos que conforman las nanopartículas. Por otro lado, el análisis los datos obtenidos por XRD (Difracción de Rayos X) indica que la Ag de las nanopartículas se encuentra en forma de cristales con un diámetro de 1 lnm. Además, los picos característicos de sílice no están presentes en el espectro XRD, lo que sugiere que dicho material es amorfo. Las medidas realizadas en las nanopartículas Ag-sílice por EDX (Fluorescencia de Rayos X) muestran un ratio Si/O de Vi, lo cual coincide con la presencia de sílice amorfo en la superficie de la nanopartícula. Ejemplo 2. Adhesión de las nanopartículas a la superficie celular.As can be seen in Figure 1A in the present invention, the special optical properties of the nanoparticles used were elucidated. Thus, Figure 1 A shows the absorption spectrum of a suspension of Ag nanoparticles with high intensity of SPR absorbance in a wavelength range around 400 nm. In addition, HRTEM images showing spherical Ag particles with a diameter of 1 1 nm are shown in Figure IB (see internal Figure IA), each covered with an amorphous layer of silica with a thickness between 1 and 2 nm (black arrows, Figure IB). The twin planes are distinguished in the TEM images, which are evidenced by the white arrows of Figure IB, along with the five vertices contained on each face, resulting in a decahedron morphology. This type of structure is formed by five radially oriented tetrahedral mono crystals through a central abscissa in such a way that the entire tetrahedron has a common corner and each of them has two faces in contact with its neighbors. With this type of morphology the phenomenon of oxidative attack ("oxidative etching") is amplified, due to distortions in the interfaces between the tetrahedral crystals that make up the nanoparticles. On the other hand, the analysis of the data obtained by XRD (X-ray Diffraction) indicates that the Ag of the nanoparticles is in the form of crystals with a diameter of 1 lnm. In addition, the characteristic peaks of silica are not present in the XRD spectrum, suggesting that said material is amorphous. The measurements made in the Ag-silica nanoparticles by EDX (X-ray Fluorescence) show a Si / O ratio of Vi, which coincides with the presence of amorphous silica on the surface of the nanoparticle. Example 2. Adhesion of nanoparticles to the cell surface.
La adhesión exitosa de las nanopartículas a la superficie celular se evidenció mediante imágenes TEM (Figura 2 A) de una suspensión de células de E. coli en presencia de nanopartículas de Ag-sílice añadidas en una concentración de 0.15x1014 nanopartículas/L. Esta unión es imprescindible para conseguir que los altos campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas debido al fenómeno SPR alcancen las células e interactúen con ellas.The successful adhesion of the nanoparticles to the cell surface was evidenced by TEM images (Figure 2 A) of a suspension of E. coli cells in the presence of Ag-silica nanoparticles added at a concentration of 0.15x10 14 nanoparticles / L. This union is essential to ensure that the high electromagnetic fields induced in the environment of the nanoparticles due to the SPR phenomenon reach the cells and interact with them.
Ejemplo 3. Estimación del efecto citotóxico de las nanopartículas en un medio líquido.Example 3. Estimation of the cytotoxic effect of nanoparticles in a liquid medium.
Se llevó a cabo un grupo de experimentos en medios de cultivo líquidos, donde las bacterias fueron crecidas e irradiadas con un láser en el interior de una caja termostática a 370C. Este hecho permitió una fácil medición del OD600 en pequeños volúmenes de cultivo, los cuales son requeridos para conseguir una irradiación significativa con láseres cuya superficie de irradiación es de 1,4 mm2 aproximadamente. Por lo tanto, para un espesor de la muestra de 3 mm, correspondiente a la anchura de los viales empleados, el volumen irradiado es de 4,2μl, lo cual corresponde aproximadamente al 9% del total de los 45 μl del cultivo original. La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento medidas bajo estas condiciones. En los cultivos donde se añadieron nanopartículas (concretamente, nanopartículas de Ag-sílice) se utilizó una concentración de 1,5.104 nanopartículas/L, que es la concentración que causa una toxicidad intrínseca de las nanopartículas de Ag medible (Figura 2B), lo que permite la observación de efectos en el crecimiento celular debidos exclusivamente a la irradiación láser. Las muestras que contenían nanopartículas Ag-sílice y fueron irradiadas con un láser azul mostraron un crecimiento atenuado, con un descenso en el OD600 en la parte superior de la curva de entre el 30 y el 40%, comparado con los experimentos control donde se usaron las mismas muestras sin irradiación, o muestras sin nanopartículas irradiadas con el mismo láser (ver Figura 3A). Por otro lado, experimentos control realizados mediante la irradiación con el láser rojo, añadiendo o sin añadir nanopartículas, no mostraron cambios significativos en el crecimiento celular (Figuras 3 C y D). Estos resultados indican claramente que las nanopartículas utilizadas en la presente invención (particularmente las nanopartículas Ag-sílice) deben estar presentes para que la irradiación afecte negativamente al crecimiento celular. Además se demuestra que el efecto observado se relaciona específicamente con la aplicación de una longitud de onda correspondiente a la banda de absorbancia SPR de las nanopartículas, que se encuentra en torno a -400 nm (entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm).A group of experiments was carried out in liquid culture media, where the bacteria were grown and irradiated with a laser inside a thermostatic box at 37 0 C. This fact allowed an easy measurement of OD 600 in small culture volumes. , which are required to achieve significant irradiation with lasers whose irradiation surface is approximately 1.4 mm 2 . Therefore, for a sample thickness of 3 mm, corresponding to the width of the vials used, the irradiated volume is 4.2 μl, which corresponds to approximately 9% of the total of 45 μl of the original culture. Figure 3 shows the growth curves measured under these conditions. In cultures where nanoparticles (specifically Ag-silica nanoparticles) were added, a concentration of 1.5.10 4 nanoparticles / L was used, which is the concentration that causes an intrinsic toxicity of the measurable Ag nanoparticles (Figure 2B), which allows the observation of effects on cell growth due exclusively to laser irradiation. Samples containing Ag-silica nanoparticles and were irradiated with a blue laser showed attenuated growth, with a decrease in OD 600 at the top of the curve between 30 and 40%, compared to control experiments where they used the same samples without irradiation, or samples without nanoparticles irradiated with the same laser (see Figure 3A). On the other hand, control experiments performed by irradiation with the red laser, adding or without adding nanoparticles, did not show significant changes in cell growth (Figures 3 C and D). These results clearly indicate that the nanoparticles used in the present invention (particularly the Ag-silica nanoparticles) must be present for irradiation to negatively affect cell growth. It is also demonstrated that the observed effect is specifically related to the application of a wavelength corresponding to the absorbance band SPR of the nanoparticles, which is around -400 nm (between 350 and 500 nm, preferably between 400 and 410 nm).
Sin embargo, los experimentos en medios de cultivo líquidos no informan sobre la viabilidad de las células debido a que no permiten distinguir entre la reducción de la velocidad de división celular y la reducción del número de células viables.However, experiments in liquid culture media do not report on the viability of the cells because they do not allow to distinguish between the reduction in the rate of cell division and the reduction in the number of viable cells.
Adicionalmente, debido a que únicamente se puede incidir con el láser sobre una fracción del volumen total, donde además la población de células cambia con el tiempo debido al movimiento de la bacteria en la muestra, en medios líquidos no puede llevarse a cabo un control exhaustivo de la radiación efectiva. Por ello se llevaron a cabo también experimentos en medios de cultivo sólidos (ver ejemplo 4).Additionally, because only a fraction of the total volume can be affected with the laser, where in addition the population of cells changes over time due to the movement of the bacteria in the sample, in exhaustive media an exhaustive control cannot be carried out of effective radiation. Therefore, experiments were also carried out in solid culture media (see example 4).
Ejemplo 4. Estimación del efecto citotóxico de las nanopartículas en medio sólido.Example 4. Estimation of the cytotoxic effect of nanoparticles in solid medium.
En la presente invención se utilizó la radiación de cultivos sólidos como sistema de estudio y validación del método ya que en este tipo de cultivos la difusión de las bacterias es limitada y puede asumirse que la radiación aplicada sobre la muestra es constante. Se utilizaron como medio sólido placas demedio LB en agar, en las cuales las bacterias fueron sembradas y crecidas hasta la formación de colonias que, idealmente, cubrían toda la superficie de la placa. Las nanopartículas Ag-sílice se encontraban presentes a una concentración de 1,5.1014 nanopartículas/L, tanto en el inoculo utilizado para sembrar las placas como en el propio medio de cultivo de las placas. La irradiación con los láseres azul y rojo fue mantenida durante todo el crecimiento celular y llevada a cabo sobre pequeñas áreas seleccionadas no superpuestas. La Figura 4 muestra el efecto bactericida en medio sólido. La Figura 4 A muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B) y, en cambio, dicha zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es más efectiva porque tiene una longitud de onda similar a la cual las nanopartículas presentan su máxima absorbancia SPR. La Figura 4B muestra un cultivo de bacterias E.coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de células. Es decir, en ausencia de nanopartículas el tratamiento no es efectivo. La Figura 4C muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con irradiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas (periodo de crecimiento de las colonias celulares). Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). La Figura 4D muestra un cultivo de bacterias E. coli similar al anterior, donde las bacterias sembradas sobre placas Petri en presencia de nanopartículas, una vez irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas, son después mantenidas en crecimiento durante 48 horas adicionales, pero sin irradiación. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz a 405nm es efectivo y, además, irreversible. In the present invention the radiation of solid cultures was used as a method of study and validation of the method since in this type of cultures the diffusion of the bacteria is limited and it can be assumed that the radiation applied on the sample is constant. LB medium agar agar plates were used as solid medium, in which the bacteria were seeded and grown to the formation of colonies that, ideally, covered the entire surface of the plate. Ag-silica nanoparticles were present at a concentration of 1.5.10 14 nanoparticles / L, both in the inoculum used to sow the plates and in the plate culture medium itself. Irradiation with the blue and red lasers was maintained throughout the cell growth and carried out on small selected non-overlapping areas. Figure 4 shows the bactericidal effect in solid medium. Figure 4 A shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and 633 nm red laser (R). A cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B) and, on the other hand, said cell-free zone does not appear when the plate is irradiated with the 633 nm red laser (point R). That is, blue light is more effective because it has a wavelength similar to which nanoparticles have their maximum absorbance SPR. Figure 4B shows a culture of E.coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the absence of nanoparticles and with two types of irradiation: blue laser (B) of 405 nm and red laser (R) of 633 nm. No cell free area is observed. That is, in the absence of nanoparticles the treatment is not effective. Figure 4C shows a culture of E. coli bacteria seeded on agar Petri dishes in the presence of nanoparticles and with blue light irradiation (B) of 405 nm for 16 hours (cell colonies growth period). A cell-free area is observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B). Figure 4D shows a culture of E. coli bacteria similar to the previous one, where bacteria seeded on Petri dishes in the presence of nanoparticles, once irradiated with blue light of 405 nm for 16 hours, are then kept growing for an additional 48 hours, But without irradiation. After 48 hours without irradiation, a cell-free area is still observed in the area irradiated with the 405nm blue laser (point B). That is, the treatment with the nanoparticles of the invention and light at 405 nm is effective and, in addition, irreversible.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico, como agentes citotóxicos.1. Use of nanoparticles with a high intensity of SPR absorbance and externally comprising an inert coating and internally a metal core, as cytotoxic agents.
2. Uso, según la reivindicación 1, donde la solución coloidal de nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de 400 nm.2. Use according to claim 1, wherein the colloidal nanoparticle solution has an SPR absorbance intensity between 0.4 and 1.2, for an optical pitch of 10 mm, at a wavelength of 400 nm.
3. Uso, según la reivindicación 1, donde el recubrimiento inerte es un material semiconductor, cerámico y/o dieléctrico.3. Use according to claim 1, wherein the inert coating is a semiconductor, ceramic and / or dielectric material.
4. Uso, según la reivindicación 3, donde el recubrimiento inerte se selecciona entre: SiO2, GeO2, ZrO2, TiO2 o ZnO2. 4. Use according to claim 3, wherein the inert coating is selected from: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 or ZnO 2 .
5. Uso, según la reivindicación 1, donde el metal comprendido en el núcleo de la nanopartícula es plata o aleaciones que comprendan plata. 5. Use according to claim 1, wherein the metal comprised in the core of the nanoparticle is silver or alloys comprising silver.
6. Uso, según la reivindicación 1, donde la nanopartícula comprende externamente SiO2 e internamente un núcleo de plata o aleaciones que comprendan plata. 6. Use according to claim 1, wherein the nanoparticle comprises externally SiO 2 and internally a silver core or alloys comprising silver.
7. Uso, según la reivindicación 1, donde el efecto citotóxico se lleva a cabo tanto sobre células procariotas como eucariotas.7. Use according to claim 1, wherein the cytotoxic effect is carried out on both prokaryotic and eukaryotic cells.
8. Uso, según la reivindicación 7, donde el efecto citotóxico se lleva a cabo sobre células bacterianas.8. Use according to claim 7, wherein the cytotoxic effect is carried out on bacterial cells.
9. Uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico, para la elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades infecciosas.9. Use of nanoparticles with a high intensity of SPR absorbance and externally comprising an inert coating and internally a metal core, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases.
10. Uso, según la reivindicación 9, donde las nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de 400 nm.10. Use according to claim 9, wherein the nanoparticles have a SPR absorbance intensity between 0.4 and 1.2, for an optical pitch of 10 mm, at a wavelength of 400 nm.
11. Uso, según la reivindicación 9, donde el recubrimiento inerte es un material semiconductor, cerámico y/o dieléctrico.11. Use according to claim 9, wherein the inert coating is a semiconductor, ceramic and / or dielectric material.
12. Uso, según la reivindicación 11, donde el recubrimiento inerte se selecciona entre: SiO2, GeO2, ZrO2, TiO2 o ZnO2. 12. Use according to claim 11, wherein the inert coating is selected from: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 or ZnO 2 .
13. Uso, según la reivindicación 9, donde el metal comprendido en el núcleo de la nanopartícula es plata o aleaciones que comprendan plata.13. Use according to claim 9, wherein the metal comprised in the core of the nanoparticle is silver or alloys comprising silver.
14. Uso, según la reivindicación 9, donde la nanopartícula comprende externamente SiO2 e internamente un núcleo de plata o aleaciones que comprendan plata.14. Use according to claim 9, wherein the nanoparticle comprises externally SiO 2 and internally a silver core or alloys comprising silver.
15. Método para la inducción de citotoxicidad en una muestra con células que comprende:15. Method for the induction of cytotoxicity in a sample with cells comprising:
• Poner en contacto la muestra con nanopartículas, con una elevada intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico; e• Contact the sample with nanoparticles, with a high intensity of SPR absorbance and externally comprising an inert coating and internally a metal core; and
• Irradiar las nanopartículas adheridas a la superficie celular con luz de una longitud de onda entre 350 y 500 nm.• Irradiate the nanoparticles attached to the cell surface with light of a wavelength between 350 and 500 nm.
16. Método, según la reivindicación 15, donde la muestra puede ser de cualquier tipo y origen siempre que presente células vivas, tanto eucariotas como pro cariotas.16. Method according to claim 15, wherein the sample can be of any type and origin provided it has live cells, both eukaryotic and pro-karyotic.
17. Método, según la reivindicación 16, donde las células son bacterianas.17. Method according to claim 16, wherein the cells are bacterial.
18. Método, según la reivindicación 15, donde la muestra puede ser tanto sólida como líquida.18. Method according to claim 15, wherein the sample can be both solid and liquid.
19. Método, según la reivindicación 18, donde la muestra es material o instrumental quirúrgico o de laboratorio.19. Method according to claim 18, wherein the sample is surgical or laboratory material or instruments.
20. Método, según la reivindicación 18, donde la muestra es una disolución acuosa.20. Method according to claim 18, wherein the sample is an aqueous solution.
21. Método, según la reivindicación 15, donde la luz tiene una longitud de onda entre 400 y 410 nm. 21. Method according to claim 15, wherein the light has a wavelength between 400 and 410 nm.
22. Método, según la reivindicación 15, donde las nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de 400 nm. 22. Method according to claim 15, wherein the nanoparticles have a SPR absorbance intensity between 0.4 and 1.2, for an optical pitch of 10 mm, at a wavelength of 400 nm.
23. Método, según la reivindicación 15, donde el recubrimiento inerte es un material semiconductor, cerámico y/o dieléctrico. 23. Method according to claim 15, wherein the inert coating is a semiconductor, ceramic and / or dielectric material.
24. Método, según la reivindicación 23, donde el recubrimiento inerte se selecciona entre: SiO2, GeO2, ZrO2, TiO2 o ZnO2. 24. Method according to claim 23, wherein the inert coating is selected from: SiO 2 , GeO 2 , ZrO 2 , TiO 2 or ZnO 2 .
25. Método, según la reivindicación 15, donde el metal comprendido en el núcleo de la nanopartícula es plata o aleaciones que comprendan plata.25. A method according to claim 15, wherein the metal comprised in the core of the nanoparticle is silver or alloys comprising silver.
26. Método, según la reivindicación 15, donde la nanopartícula comprende externamente SiO2 e internamente un núcleo de plata o aleaciones que comprendan plata. 26. A method according to claim 15, wherein the nanoparticle comprises externally SiO 2 and internally a silver core or alloys comprising silver.
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