WO2010066330A2 - Enzyme-catalyzed method - Google Patents

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WO2010066330A2
WO2010066330A2 PCT/EP2009/008198 EP2009008198W WO2010066330A2 WO 2010066330 A2 WO2010066330 A2 WO 2010066330A2 EP 2009008198 W EP2009008198 W EP 2009008198W WO 2010066330 A2 WO2010066330 A2 WO 2010066330A2
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enzyme
alkyl
ionic liquid
aspergillus spec
mixture
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Nikolai Ignatyev (Mykola)
Michael Schulte
Emil Ferdinand Aust
Wolfgang Streit
Julia Pottkaemper
Peter Barthen
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Merck Patent Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme-catalyzed process in
  • ionic liquids with halide anions such as, for example, BMIM Cl (1-butyl-3-methylimidazolium chloride) are strong solvents which make it possible to dissolve degradation-resistant celluloses on a large scale.
  • BMIM Cl 1-butyl-3-methylimidazolium chloride
  • a disadvantage of the known methods is that the known enzymes, in particular cellulases, are very stable to unstable in ionic liquids containing halide anions. It has even been found that, for example, cellulases derived from the fungus Trichoderma reesei are not active in BMIM CI. Rather, it has even been observed that the cellulases denature in these ionic liquids (MB Turner, SK Spear, JG Huddiestone, JD Holbrey, RD Rogers, Green Chemistry, 5 (2003), p. 443). It is also known from Seongsoon Park and Romas, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) p.
  • lipase B from Candida antarctica, both as an unbound enzyme (SP525) as well as in immobilized form (Novozym 435) in BMIM BF 4 (1-butyl-3-methyl-imidazolium tetrafluoroborate) or BMIM PF 6 (1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate) in the absence of water of processes can catalyze.
  • the enzymes are present in other ionic liquids, such as BMIM NO 3 , BMIM lactate, BMIM ethylsulfate and in Ethyl ammonium nitrate (EtNH 3 NO 3 ) show little or no activity.
  • BMIM NO 3 BMIM lactate
  • BMIM ethylsulfate BMIM ethylsulfate
  • Ethyl ammonium nitrate Ethyl ammonium nitrate
  • compositions or products which contain ionic liquids.
  • ionic liquids are used for use in textiles, hard surfaces or in air treatment compositions.
  • compositions are described which are composed of three or more different ionic liquids.
  • Anions of the ionic liquids are called hexafluorophorate and tetrafluoroborate.
  • enzymes, proteases, amylases, lipases and mixtures are disclosed.
  • the activity of the enzymes depends on various factors, namely, the origin of the cellulases of the incubation, the incubation temperature that should not exceed 50 to 60 0 C, and various properties of the ionic liquids so At the time of application of the present invention, it did not appear possible to find an efficient solvent in which, for example, cellulose can be effectively dissolved and in which the enzymatic activity of the cellulases is not restricted, as described in Current opinion in Biotechnology, 14 (2003). , p. 432-437 derivable.
  • the present invention is therefore based on the object to provide an efficient enzyme-catalyzed process.
  • a further object of the present invention is in particular to provide an efficient process for the enzyme-catalyzed conversion of cellulose into to provide a starting material for, for example, drugs, fine chemicals, or for conversion to bio-ethanol.
  • the present invention has the further object of providing enzymes for use in ionic liquids with strong anion.
  • the invention relates to an enzyme-catalyzed process in the presence of at least one ionic liquid as a solvent, wherein at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for the enzyme catalytic conversion of a substance dissolved in the solvent is used.
  • a specimen from Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture can be used advantageously in an enzyme-catalytic process.
  • the claimed enzyme or the enzyme or protein mixture can be used for an enzyme-catalytic process using at least one ionic liquid as solvent.
  • a substance dissolved in the at least one ionic liquid is enzyme-catalytically by Aspergillus spec. isolated enzymes or enzyme or protein mixtures can be implemented.
  • As enzyme-catalyzed reaction all known enzymatic reactions can be understood.
  • enzyme-catalyzed reaction is preferably understood as meaning lipolytic, cellulolytic, amylolytic and proteolytic enzymatic reactions. Preference is given to the term enzyme catalyzed conversion understood cellulolytic enzymatic reactions.
  • Such a (natural and isolated or commercial) enzyme mixture consists mainly of various, by Aspergillus spec. synthesized enzymes with different activities, which are synthesized in connection with the natural protein production of the fungus.
  • the following enzyme activities are mainly observed in the mixtures according to the invention: ⁇ -1, 4-glycosylhydrolase (5-70%), ⁇ -1,3-glycosylhydrolase (5-30%) and ⁇ -1,6-glycosylhydrolase (5-30%).
  • the enzyme activities are determined by the DNSA test according to Bergemeyer, 1974, mod., which is described in the examples. These enzymes are capable of degrading cellulose, thereby releasing glucose oligomers or monomers (i.e., hydrolysis of the 1,4-linkages of 1,4- ⁇ -D-glucans to release glucose units).
  • the enzyme activities found may be either exo- or endo-cellulases.
  • increased activity and stability of Aspergillus spec-cellulase can be provided with cellulolytic activity in ionic liquid. The reason for this is that all the proteins in this mixture in their entirety, due to synergistic effects between the proteins / enzymes, lead to the high activity and stability of the enzymes in the at least one ionic liquid.
  • ionic liquids are used as the solvent.
  • ionic liquids with halide anions and more preferably ionic liquids with chloride anions are suitable, which also make it possible to dissolve degradation-resistant celluloses.
  • Ionic liquids with anions are suitable in addition to the ionic liquids containing halide anions, in particular selected from the group [RFSO 3] ", [alkyl-SO 3]", [alkyl OSO 3] -, [alkyl-C ( O) -, [R F C (O) O] -, where
  • the substance dissolved in the solvent is preferably di- or trisaccharides, polysaccharides, polysaccharide-containing material or mixtures of these compounds.
  • Disaccharides are, for example, cane sugar (sucrose), milk sugar (lactose) or malt sugar ((+) - maltose), (+) - cellobiose, Gentiiobiose or Melibiiose.
  • Trisaccharides are, for example, raffinose.
  • Polysaccharides are for example starch, glycogen or cellulose.
  • the solute is particularly preferably selected from cellulose, modified cellulose or cellulose-containing Material. Very particular preference is given to using cellulose in the process according to the invention.
  • Modified cellulose is, for example, etherified or esterified cellulose.
  • carboxymethyl cellulose is a modified cellulose.
  • Cellulose-containing materials are, for example, pulp or paper.
  • Mixtures of di- and trisaccharides, polysaccharides or polysaccharide-containing materials may also contain monosaccharides.
  • celluloses are degradable by cellulolytically active enzymes and in particular by cellulases, which is why a Zellulase from Aspergillus spec. or an enzyme or protein mixture containing at least one cellulase from Aspergillus spec. is used.
  • a protein mixture containing at least one cellulase from Aspergillus spec. used for degradation and for implementation in the process according to the invention, since due to synergy effects between the proteins, the activity and stability of the cellulases, or the active enzyme can be preserved over a longer period. This increases the efficiency and specificity of the enzyme-catalyzed reaction.
  • lipolytic, amylolytic and proteolytic enzymatically-catalyzed reactions in ionic liquids as further typical examples of the enzymes from Aspergillus spec. isolated lipases, amylases and proteases or mixtures thereof may be mentioned, which may of course also be present together with the at least one claimed cellulase or other Zellulasen as mixtures.
  • the reaction rate and the conversion of the solute, in particular the cellulose, over the used Enzyme quantity adjustable are adjusted.
  • the enzyme preferably cellulase, in an amount which is determined by the ratio to the total amount of the enzyme or protein mixture to the amount of the enzyme, from 0.1% to 99%.
  • the anion A can therefore be selected from the group comprising [HSO 4 ] -, [SO 4 ] 2 -, [NO 3 ] -, [BF 4 ] -, [(RF) BF 3 ] " , [(RF) 2 BF 2 ] " , [(RF) 3 BF] " , [(RF) 4 B] ' ,
  • the alkyl group in the abovementioned anions can be selected from straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 20 C atoms, preferably having 1 to 14 C atoms and especially preferably having 1 to 4 C atoms.
  • [Alkyl-CH (OH) C (O) O] " is preferably [CH 3 -CH (OH) C (O) O] " .
  • R F is CF 3 , C 2 F 5 , C 3 F 7 or C 4 F 9 .
  • the anion is an anion of a corresponding strong acid.
  • cation of the ionic liquid there are no restrictions per se on the choice of cation of the ionic liquid.
  • they are organic cations, with particular preference being given to ammonium, phosphonium, thiouronium, guanidinium cations or heterocyclic cations, for example imidazolium.
  • R is in each case independently H, where not all substituents R may simultaneously be H, straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 ° C Atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or completely unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms and containing alkyl groups having 1- 6 C atoms may be substituted, where one or more R partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or partially with -OR ' , -CN, - C (O) OH, -C ( O) NR ' 2 , -SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 , and wherein one or two non-ad
  • R 2 are each independently H, NR ' 2 straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more a plurality of non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms substituted with alkyl groups having 1-6 C atoms wherein one or more R 2 is partially or completely halogen, in particular -F and / or -Cl, or partially -OR ' , -CN, -C (O) OH, -C (O) NFT 2 , -SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 , and wherein one or two non-adjacent and non- ⁇ -carbon
  • cations of the formulas (1) and (2) in which all four or three substituents R and R 2 are completely substituted by halogens are excluded, for example the tris (trifluoromethyl) methylammonium cation, the tetra (trifluoromethyl) ammonium cation or the tetra (nonafluorobutyl) ammonium cation.
  • Suitable thiouronium cations can be described by the formula (3), [C (R 3 R 4 N) (SR 5 ) (NR 6 R 7 )] + (3), wherein R 3 to R 7 are each independently H, straight-chain or branched alkyl having 1 to 20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated Is triple bonds, saturated, partially or completely unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms, which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, where one or more of the substituents R 3 to R 7 is partially or completely halogenated, especially -F and / or -Cl, or partially with -OH, -OR ' , - CN, -C (O) OH, -C (O) NR ' 2
  • Guanidinium cations can be described by the formula (4) [C (NR 8 R 9 ) (NR 10 R 11 ) (NR 12 R 13 )] + (4) wherein
  • R 8 to R 13 are each independently
  • HetN + is a heterocyclic cation selected from the group
  • R 1 'to R 4 ' are each independently
  • R 2 are in particular also atomic groups selected from -OR ', - NR' 2) -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR' 2 , -SO 2 OH, - SO 2 X or -NO 2 .
  • Fully unsaturated substituents also mean aromatic substituents.
  • Suitable substituents R and R 2 to R 13 of the compounds of the formulas (1) to (4) include, in addition to H: C 1 to C 20 -, in particular C 1 to C 14 alkyl groups, and saturated or unsaturated, ie also aromatic, C 3 - to C 7 -cycloalkyl groups which may be substituted by C 1 - to C 6 -alkyl groups, in particular phenyl.
  • the substituents R and R 2 in the compounds of formula (1) or (2) may be the same or different.
  • the substituents R and R 2 may be methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl or tetradecyl.
  • Up to four substituents of the guanidinium cation [C (NR 8 R 9 ) (NR 10 R 11 ) (NR 12 R 13 )] + may also be linked in pairs to form mono-, bi-, or polycyclic cations.
  • the carbocycles or heterocycles of the above-mentioned guanidinium cations can still by d- to C ⁇ -alkyl, C 1 - to Ce-alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 -alkyl, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 NR ' 2l SO 2 X' or SO 3 H be substituted, where X and R 'have the meaning given above, substituted or unsubstituted phenyl or unsubstituted or substituted heterocycle be substituted.
  • the carbocycles or heterocycles of the cations specified above can also be replaced by C 1 - to C 6 -alkyl, C 1 - to C 6 -alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 -alkyl, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH 1 SO 2 NR ' 2 , SO 2 X or SO 3 H or substituted or unsubstituted phenyl or unsubstituted or substituted heterocycle may be substituted, wherein X and R' have the meaning given above ,
  • the substituents R 3 to R 13 may each independently be a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 10 C atoms.
  • the Substituents R 3 and R 4 , R 6 and R 7 , R 8 and R 9 , R 10 and R 11 and R 12 and R 13 in compounds of formulas (3) to (4) may be the same or different.
  • R 3 to R 13 are each independently methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, sec-butyl, phenyl or cyclohexyl.
  • R 1 to R 4 of compounds of the formula (5) are in addition to H in question: Cr to C2o> in particular Cr to Ci2-alkyl groups, and saturated or unsaturated, ie also aromatic, C 3 to C 7 - cycloalkyl groups with C 1 - to C ⁇ -alkyl groups may be substituted, in particular phenyl.
  • the substituents R 1 and R 4 may each independently be methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl, cyclohexyl, phenyl or benzyl.
  • the two substituents R 1 and R 4 are preferably different.
  • the substituent R 2 or R 3 is in each case independently of one another in particular H, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, cyclohexyl, phenyl or benzyl.
  • the C 1 -C 12 -alkyl group is, for example, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl or tert-butyl, and also pentyl, 1-, 2- or 3-methylbutyl, 1, 1, 1, 2 or 3 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl or dodecyl.
  • a straight-chain or branched alkenyl having 2 to 20 C atoms, wherein a plurality of double bonds may also be present, is, for example, allyl, 2- or 3-butenyl, isobutenyl, sec-butenyl, furthermore 4-pentenyl, isobutyl, Pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, -C 9 H 17 , -Ci 0 H 19 to -C 2 oH 39 ; preferably allyl, 2- or 3-butenyl, isobutenyl, sec-butenyl, furthermore preferred is 4-pentenyl, iso-pentenyl or hexenyl.
  • a straight-chain or branched alkynyl having 2 to 20 C atoms, wherein a plurality of triple bonds may also be present, is, for example, ethynyl, 1- or 2-propynyl, 2- or 3-butynyl, furthermore 4-pentynyl, 3-pentynyl, hexynyl, Heptynyl, octynyl, -C 9 H 15 , -Ci 0 H 17 to -C 20 H 37 , preferably ethynyl, 1- or 2-propynyl, 2- or 3-butynyl, 4-pentynyl, 3-pentynyl or hexynyl.
  • Aryl-d-C ⁇ -alkyl is, for example, benzyl, phenylethyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl or phenylhexyl, where both the phenyl ring and the alkylene chain, as described above, partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or partially with -OR ', - NR' 2 , -CN, -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR' 2> -C (O) X, -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 may be substituted.
  • Unsubstituted saturated or partially or fully unsaturated cycloalkyl groups having 3-7 C atoms are therefore cyclopropyl, cyclobutyl,
  • Cycloheptenyl which may be substituted by C 1 - to C 6 alkyl groups, in turn, the cycloalkyl group or substituted with C 1 - to C 6 alkyl cycloalkyl group with halogen atoms such as F, Cl, Br or I, in particular F or Cl or with -OR ', -CN, -C (O) OH, -C (O) NR' 2 , -
  • SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 may be substituted.
  • C 3 - to C 7 -cycloalkyl is, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
  • R 1 substituted phenyl, by C 1 - to C 6 alkyl, C 1 - to C 6 - alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, Ci-C 6 alkoxy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 X ', SO 2 NR " 2 or SO 3 H substituted phenyl, wherein X' is F, Cl or Br and R" is a non, partially or perfluorinated Cr to C 6 alkyl or C 3 to C 7 -cycloalkyl as defined for R ', for example, o-, m- or p-methylphenyl, o-, m- or p-ethylphenyl, o-, m- or p-propylphenyl, o-, m - or p-isopropylphenyl, o-, m- or p-tert-butylphen
  • R 1 to R 4 as heteroaryl is a saturated or unsaturated mono- or bicyclic heterocyclic radical having 5 to 13 ring members understood, wherein 1, 2 or 3 N and / or 1 or 2 S or O atoms may be present and the heterocyclic radical one or more times
  • C 1 to C 6 alkyl, C 1 to C 6 alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 alkoxy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH , SO 2 X ', SO 2 NR' 2 or SO 3 H may be substituted, wherein X 'and R' have a meaning given above.
  • the heterocyclic radical is, for example, substituted or unsubstituted 2- or 3-furyl, 2- or 3-thienyl, 1-, 2- or 3-pyrrolyl, 1-, 2-, 4- or 5-imidazolyl, 3-, 4- or 5-pyrazolyl, 2-, 4- or 5-oxazolyl, 3-, 4- or 5-isoxazolyl, 2-, 4- or 5-thiazolyl, 3-, 4- or 5-isothiazolyl, 2-, 3- or 4-pyridyl, 2-, 4-, 5- or 6-pyrimidinyl, more preferably 1, 2,3-triazole-1, -4- or -5-yl, 1, 2,4-triazoM-, - 4- or 5-yl, 1- or 5-tetrazolyl, 1,2,3-oxadiazol-4 or 5-yl 1, 2,4-oxadiazol-3 or -5-yl, 1, 3, 4-thiadiazol-2 or -5-yl, 1, 2,4-thiadiazol-3 or -5-yl, 1, 2,3-thiadiazol-4 or -5
  • Heteroaryl-C 1 -C 6 -alkyl is analogous to aryl-C -C 6 -alkyl, for example, pyridinyl-methyl, pyridinyl-ethyl, pyridinyl-propyl, pyridinyl-butyl, pyridinyl-pentyl, pyridinyl-hexyl understood, wherein further heterocycles described in this way can be linked to the alkylene chain.
  • HetN + can be:
  • the cations of the ionic liquid are imidazolium, morpholinium or pyrrolidinium cations, as described in the preceding accompanying formulas and the associated substituents. These show, in conjunction with the anions indicated as preferred or particularly preferred, a particularly high cellulase activity of Aspergillus spec. isolated enzymes or protein mixtures.
  • the ionic liquids ammonium, phosphonium, imidazolium, morpholinium or pyrrolidinium acetate, trifluoroacetate, hydrogensulfate, alkylsulfate, alkylsulfonate, perfluoroalkylsulfonate, phosphate, hydrogenphosphate, alkylphosphate, alkyl- and - Perfluoroalkyl phosphinate, alkyl and perfluoroalkyl phosphonate or perfluoroalkylcarboxylate, with substituents as described above, for enzymatically catalytic processes.
  • BMIM Cl 1-butyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate
  • BMMIM CI 1-butyl-2,3-dimethylimidazolium chloride
  • EMIM ATF 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoroacetate
  • BMPL OTF 1-butyl 1-methylpyrrolidinium trifluoromethanesulfonate
  • AMIM CI 1-allyl-3-methylimidazolium chloride
  • EMIM OTF very particular preference is given to 1-butyl-3-methylimidazolium chloride, 1-ethyl-3-methylimidazolium
  • diioder trisaccharides or polysaccharides or polysaccharide-containing material can be dissolved and with the Aspergillus spec. isolated enzyme or with at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture are enzymatically converted into saccharide or polysaccharide mixtures, which are used in biochemical and / or chemical processes.
  • Aspergillus spec. isolated enzyme or with at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture are enzymatically converted into saccharide or polysaccharide mixtures, which are used in biochemical and / or chemical processes.
  • enzyme-catalytically effective in a large extent starting materials for pharmaceuticals and fine chemicals can be produced.
  • Another object of the invention is a composition
  • a composition comprising a) at least one ionic liquid and b) at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture.
  • Another object of the invention is also the use of at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for enzyme-catalytic reaction of dissolved in ionic liquid Dioder Trisacchahd, dissolved polysaccharide, dissolved polysaccharide-containing material or dissolved mixtures of these compounds.
  • Another object of the invention is also a kit containing an ionic liquid or at least a mixture of ionic liquids and containing at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture.
  • composition containing at least one ionic liquid and at least one from Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture and with respect to the claimed use of at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme. or protein mixture, as well as with respect to the claimed kit, reference is made to the statements and the advantages of the claimed enzyme-catalyzed process to avoid repetition.
  • 1 is a graph showing a result of the specific activity of enzymes (cellulases) from Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich,
  • Fig. 2 is a graph showing a result of the specific activity of
  • Enzymes (cellulases) from Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich,
  • MIP refers to the control in Mclllvaine buffer without ionic liquid. In the control, a reduction of the activity of the cellulases is achieved by half within 2 h of incubation. Afterwards (17 h incubation), the cellulase activity no longer decreases noticeably.
  • ILIO (1-allyl-3-methylimidazolium chloride AMIM Cl) enzymes maximally still on incubation of Oh an activity of Zellulasen.
  • the measurement for IL1 which uses BMIM CI as the ionic liquid, shows no activity. This means that even with the addition of BMIM CI to the enzyme mixture from Trichoderma reesei all cellulases are inactivated by the highly polar halogen-containing ionic liquid.
  • Figure 2 shows the result of a DNSA activity test of the method according to the invention, using enzymes (cellulases) from Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany, article number C2605, 2008).
  • MIP shows control in Mclllvaine buffer without ionic liquid. In the control, a reduction of the activity of the cellulases to 2-thirds within 2 h of incubation is achieved. Thereafter (17 h incubation) the cellulase activity drops to just under half measured at the initial value 0 h.
  • the enzymes from Aspergillus spec. see Figure 1
  • FIG. 2 therefore shows that the addition of ionic liquids causes the specific Enzyme activity derived from Aspergillus spec. isolated enzymes, not appreciably decreases.
  • the following embodiment shows the experimental setup for the DNAA activity tests.
  • a cellulase mixture of Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany, article number C8546, 2008) and Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany, article number C2605, 2008) diluted 1: 1000 with 50 mM Tris buffer, pH 8.0.
  • 100 ⁇ l of the 1: 1000 dilution are used.
  • the cellulase mixture from Aspergillus spec. consists mainly of different from Aspergillus spec. isolated enzymes, with the following activities: ß-1, 4-Glycosylhydrolase (5-70%), ß-1, 3-Glycosylhydrolase (5 - 30%) and ß-1, 6-Glycosylhydrolase (5 - 30%). These activities are determined by the DNSA test according to Bergemeyer, 1974, mod., As described later.
  • Glucose rich medium is made up of 1% by weight of glucose; 0.05 wt% yeast extract and 1 x yeast nitrogen bases w / AA.
  • Mushroom supernatants are prepared for the activity test.
  • Complete CM agar plates are labeled with Aspergillus spec. (Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger) or Trichoderma reesei.
  • Aspergillus spec. Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger
  • Trichoderma reesei After growing on the agar plates, small agar pieces are punched out of the agar plate. The agar pieces are each inoculated with 50 ml of glucose rich medium and incubated at 28 0 C and 150 rpm for 3 days. The incubation is followed by a centrifugation step at room temperature and 5000 rpm. The pellet produced during the centrifugation step is washed 3 times with H 2 O de st.
  • an induction culture is set, for which the pellet is first resuspended in 50 ml of salt minimal medium and the resulting liquid culture incubated at 28 0 C and 150 rpm for 1 day. This is followed by the centrifugation of this culture Room temperature and 5000 rpm. The centrifugation supernatant (PiIz supernatants) is used to carry out the activity tests (DNSA tests).
  • a DNSA solution (10 g of 3,5-dinitrosalicylic acid, 10 g of NaOH, 200 g of potassium Natirum Tatrat, 0.5 g of Na 2 SO 3 and 2 g of phenol, made up with H 2 O de st); Mclllvaine buffer (0.2 M Na 2 HPO 4 adjusted to pH 6.5 with 0.1 M citric acid) and a carboxymethyl cellulose solution (2% carboxymethylcellulose dissolved by boiling in H 2 Odest) are prepared.
  • 150 ⁇ l each of Mclllvaine buffer or 150 ⁇ l of ionic liquid are mixed with 250 ⁇ l of carboxymethylcellulose solution and 100 ⁇ l of fungal supernatant. For all samples duplicate determinations are carried out.
  • the mixtures are incubated at 37 ° C. for 30 min, treated with 750 ⁇ l of DNSA solution and incubated at 100 ° C. for a further 15 min. After incubation, the batches are cooled on ice and centrifuged at 13,000 rpm for 2 min and the absorbance against blank values measured at 546 nm.
  • the cellulose is hydrolyzed by the cellulases contained in the mushroom supernatants into fragments whose reducing
  • Nitrosalicylic acid or the measured absorbance at 546 nm is equimolar to the number of reducing hemiacetal groups.
  • the protein determination of the mushroom supernatants is carried out according to Bradford with Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Düsseldorf) according to the manufacturer.

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Abstract

The present invention relates to an enzyme-catalyzed method in the presence of at least one ionic liquid as solvent, to a composition containing at least one ionic liquid and at least one enzyme isolated from Aspergillus spec. or an enzyme mixture or protein mixture isolated from Aspergillus spec. and also to the use of at least one enzyme isolated from Aspergillus spec. or at least one enzyme mixture or protein mixture isolated from Aspergillus spec. for the enzyme-catalyzed reaction of substances dissolved in an ionic liquid, which substances are selected from disaccharides or trisaccharides, polysaccharides, polysaccharide-containing materials or mixtures of said compounds.

Description

Enzym-katalysiertes Verfahren Enzyme-catalyzed process
Gegenstand der ErfindungSubject of the invention
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym-katalysiertes Verfahren inThe present invention relates to an enzyme-catalyzed process in
Anwesenheit mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als Lösungsmittel, eine Zusammensetzung enthaltend mindestens eine Ionische Flüssigkeit und mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung sowie die Verwendung mindestens eines aus Aspergillus spec. isolierten Enzyms oder mindestens einer aus Aspergillus spec. isolierten Enzym- oder Proteinmischung zur Enzym-katalytischen Umsetzung von in Ionischer Flüssigkeit gelösten Stoffen, ausgewählt aus Di- oder Trisacchariden, Polysacchariden, Polysaccharid-haltigen Materialien oder Mischungen dieser Verbindungen.Presence of at least one ionic liquid as solvent, a composition containing at least one ionic liquid and at least one from Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture and the use of at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for enzyme-catalytic conversion of substances dissolved in ionic liquid, selected from di- or trisaccharides, polysaccharides, polysaccharide-containing materials or mixtures of these compounds.
Stand der TechnikState of the art
Aus Seongsoon Park and Romas, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) S. 432-437, ist bekannt, dass Ionische Flüssigkeiten im Gegensatz zu polaren organischen Lösungsmitteln Enzyme nicht inaktivieren. Diese Eigenschaft ermöglicht Enzym-katalysierte Reaktionen in einem polaren Lösungsmittelbereich, der vorher unmöglich erschien.It is known from Seongsoon Park and Romas, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) p. 432-437, that ionic liquids do not inactivate enzymes unlike polar organic solvents. This property allows enzyme-catalyzed reactions in a polar solvent region that previously seemed impossible.
Die Möglichkeit Lösungsmittel mit größerer Polarität einzusetzen, erhöht zwangsläufig die Löslichkeit von polaren Substraten, wie zum BeispielThe ability to use solvents with greater polarity inevitably increases the solubility of polar substrates, such as
Glucose, Maltose und Ascorbinsäure, was zu schnellerenGlucose, maltose and ascorbic acid, resulting in faster
Reaktionsprozessen und Änderungen in der Selektivität führt. Aus R. P.Reaction processes and changes in the selectivity leads. From R. P.
Swatlowski, S. K. Spear, J. D. Holbrey, R. D. Rogers, J. Am. Chem. Soc,Swatlowski, S.K. Spear, J.D. Holbrey, R.D. Rogers, J. Am. Chem. Soc.
124 (2002) S.4974, ist beispielsweise bekannt, dass Ionische Flüssigkeiten mit Halogenidanionen, wie beispielsweise BMIM CI (1-Butyl-3-methyl imidazoliumchlorid) starke Lösungsmittel sind, die es erlauben, abbauresistente Zellulosen in großem Umfang zu lösen. So gewinnen enzymatische Methoden in Ionischen Flüssigkeiten zunehmend an Bedeutung, da Naturstoffe, wie zum Beispiel Peptide, Zucker, Nukleotide und Stoffe, die aus Biomasse gewonnen werden, ein bedeutendes Ausgangsmaterial für Arzneimittel und für die Feinchemie sind. Insbesondere gewinnt Zellulose als ein wertvolles Biopolymer für die124 (2002) p. 4974, it is known, for example, that ionic liquids with halide anions, such as, for example, BMIM Cl (1-butyl-3-methylimidazolium chloride) are strong solvents which make it possible to dissolve degradation-resistant celluloses on a large scale. To win Enzymatic methods in ionic liquids are becoming increasingly important as natural products such as peptides, sugars, nucleotides, and biomass derived materials are an important source of drug and fine chemistry. In particular, cellulose gains as a valuable biopolymer for the
Herstellung von Bio-Kraftstoffen, beispielsweise Bio-Ethanol, immer mehr an Bedeutung.Production of biofuels, for example bioethanol, is becoming increasingly important.
Nachteilig an den bekannten Methoden ist, dass die bekannten Enzyme, insbesondere Zellulasen, in Ionischen Flüssigkeiten mit Halogenidanionen sehr gering stabil bis instabil sind. So wurde sogar festgestellt, dass beispielsweise aus dem Pilz Trichoderma reesei gewonnene Zellulasen in BMIM CI nicht aktiv sind. Vielmehr konnte sogar beobachtet werden, dass die Zellulasen in diesen Ionischen Flüssigkeiten denaturieren (M.B. Turner, S. K. Spear, J. G. Huddiestone, J. D. Holbrey, R. D. Rogers, Green Chemistry, 5 (2003), S. 443). So ist auch aus Seongsoon Park and Romas, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) S. 432-437, bekannt, dass Enzyme gewöhnlich nur in Ionischen Flüssigkeiten stabil sind, die Tetrafluoroborat-, Hexyfluorophosphat oder Bis(trifluormethansulfonyl)imid- Anionen enthalten, jedoch in in Ionischen Flüssigkeiten mit Chlorid-, Nitrat-, Trifluormethylsulfonat-, Trifluoracetat- und Acetatanionen instabil sind. Ein Grund dafür scheint die geringere basische Eigenschaft der Wasserstoffbrückenbindung der Enzym-kompatiblen Anionen zu sein. Auch aus A. S. Roger, M. L. Rute, J. S. Menno, F. van Rantwijk and R. S. Kenneth, Green Chemistry, 4 (2002), S.147-151, ist bekannt, dass Lipase B (CaLB) aus Candida antarctica, sowohl als ungebundenes Enzym (SP525) als auch in immobilisierter Form (Novozym 435) in BMIM BF4 (1-Butyl-3- methyl-imidazolium Tetrafluoroborat) oder BMIM PF6 (1-Butyl-3-methyl- imidazolium Hexafluorophosphat) in Abwesenheit von Wasser eine Vielzahl von Prozessen katalysieren kann. Aus dem zuletzt genannten Artikel ist auch bekannt, dass die Enzyme in anderen ionischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel in BMIM NO3, BMIM Lactat, BMIM Ethylsulfat und in Ethylammoniumnitrat (EtNH3 NO3) keine bzw. nur eine geringe Aktivität zeigen. Als Grund für die geringe Aktivität wird vermutet, dass die Struktur der Ionischen Flüssigkeiten, insbesondere die sehr starke Bindung und Anzahl der Anionen entscheidend ist, was zu Konformationsänderungen und dadurch zum Verlust der Aktivität der Enzyme führt.A disadvantage of the known methods is that the known enzymes, in particular cellulases, are very stable to unstable in ionic liquids containing halide anions. It has even been found that, for example, cellulases derived from the fungus Trichoderma reesei are not active in BMIM CI. Rather, it has even been observed that the cellulases denature in these ionic liquids (MB Turner, SK Spear, JG Huddiestone, JD Holbrey, RD Rogers, Green Chemistry, 5 (2003), p. 443). It is also known from Seongsoon Park and Romas, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) p. 432-437, that enzymes are usually stable only in ionic liquids containing tetrafluoroborate, hexyfluorophosphate or bis (trifluoromethanesulfonyl) imide anions, however, they are unstable in ionic liquids with chloride, nitrate, trifluoromethylsulfonate, trifluoroacetate and acetate anions. One reason for this seems to be the lower basic hydrogen bonding property of the enzyme-compatible anions. Also, from AS Roger, ML Rute, JS Menno, F. van Rantwijk and RS Kenneth, Green Chemistry, 4 (2002), p.147-151, it is known that lipase B (CaLB) from Candida antarctica, both as an unbound enzyme (SP525) as well as in immobilized form (Novozym 435) in BMIM BF 4 (1-butyl-3-methyl-imidazolium tetrafluoroborate) or BMIM PF 6 (1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate) in the absence of water of processes can catalyze. From the latter article it is also known that the enzymes are present in other ionic liquids, such as BMIM NO 3 , BMIM lactate, BMIM ethylsulfate and in Ethyl ammonium nitrate (EtNH 3 NO 3 ) show little or no activity. The reason for the low activity is believed to be that the structure of the ionic liquids, in particular the very strong bond and number of anions, is crucial, which leads to conformational changes and thereby to the loss of the activity of the enzymes.
Auch aus der US 2008/0017224 A1 sind Zusammensetzungen oder Produkte bekannt, die Ionische Flüssigkeiten enthalten. Insbesondere werden Ionische Flüssigkeiten zur Verwendung in Textilien, harten Oberflächen oder in Luft-Behandlungs-Zusammensetzungen verwendet. Zudem werden Zusammensetzungen beschrieben, die sich aus drei oder mehr verschiedenen Ionischen Flüssigkeiten zusammensetzen. Als Anionen der Ionischen Flüssigkeiten werden Hexafluoroposphat und Tetrafluoroborat genannt. Als Enzyme werden Proteasen, Amylasen, Lipasen und Mischungen offenbart.Also known from US 2008/0017224 A1 are compositions or products which contain ionic liquids. In particular, ionic liquids are used for use in textiles, hard surfaces or in air treatment compositions. In addition, compositions are described which are composed of three or more different ionic liquids. Anions of the ionic liquids are called hexafluorophorate and tetrafluoroborate. As enzymes, proteases, amylases, lipases and mixtures are disclosed.
Obwohl die Aktivität der Enzyme, hier insbesondere der Zellulasen, von unterschiedlichen Faktoren abhängt, nämlich von der Herkunft der Zellulasen, der Inkubationsdauer, der Inkubationstemperatur, die nicht mehr als 50 bis 60 0C betragen sollte, und von verschiedenen Eigenschaften der Ionischen Flüssigkeiten, so schien es doch bis zum Zeitpunkt der Anmeldung der vorliegenden Erfindung unmöglich, ein effizientes Lösungsmittel zu finden, in dem beispielsweise Zellulose effektiv aufgelöst werden kann und in welchem die enzymatische Aktivität der Zellulasen nicht eingeschränkt wird, wie aus Current opinion in Biotechnology, 14 (2003), p. 432-437 ableitbar.Although the activity of the enzymes, in particular the cellulases, depends on various factors, namely, the origin of the cellulases of the incubation, the incubation temperature that should not exceed 50 to 60 0 C, and various properties of the ionic liquids so At the time of application of the present invention, it did not appear possible to find an efficient solvent in which, for example, cellulose can be effectively dissolved and in which the enzymatic activity of the cellulases is not restricted, as described in Current opinion in Biotechnology, 14 (2003). , p. 432-437 derivable.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein effizientes Enzym-katalysiertes Verfahren bereitzustellen.The present invention is therefore based on the object to provide an efficient enzyme-catalyzed process.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, ein effizientes Verfahren zur Enzym-katalysierten Umsetzung von Zellulose in ein Ausgangsmaterial für beispielsweise Arzneimittel, Feinchemikalien oder für die Umwandlung in Bio-Ethanol bereitzustellen.A further object of the present invention is in particular to provide an efficient process for the enzyme-catalyzed conversion of cellulose into to provide a starting material for, for example, drugs, fine chemicals, or for conversion to bio-ethanol.
Zudem liegt der vorliegenden Erfindung die weitere Aufgabe zugrunde, Enzyme zur Verwendung in Ionischen Flüssigkeiten mit starkem Anion bereitzustellen.In addition, the present invention has the further object of providing enzymes for use in ionic liquids with strong anion.
Die voranstehenden Aufgaben werden durch die Merkmale der nebengeordneten Patentansprüche 1 , 11 , 18 und 19 gelöst.The above objects are achieved by the features of the independent claims 1, 11, 18 and 19.
Gegenstand der Erfindung ist ein Enzym-katalysiertes Verfahren in Anwesenheit mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als Lösungsmittel, wobei mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung zur Enzym- katalytischen Umsetzung eines im Lösungsmittel gelösten Stoffes verwendet wird.The invention relates to an enzyme-catalyzed process in the presence of at least one ionic liquid as a solvent, wherein at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for the enzyme catalytic conversion of a substance dissolved in the solvent is used.
Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass sich ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung in einem Enzym-katalytischen Verfahren vorteilhaft verwenden lässt. Darüber hinaus ist erfindungsgemäß erkannt worden, dass sich das beanspruchte Enzym oder die Enzym- oder Proteinmischung für ein Enzym-katalytisches Verfahren unter Verwendung mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als Lösungsmittel einsetzen lässt. Schließlich ist erfindungsgemäß erkannt worden, dass sich ein in der mindestens einen Ionischen Flüssigkeit gelöster Stoff Enzym-katalytisch durch aus Aspergillus spec. isolierte Enzyme oder Enzym- oder Proteinmischungen umsetzen lässt. Als Enzym-katalysierte Umsetzung können sämtliche bekannte enzymatische Reaktionen verstanden werden. Vorzugsweise werden unter dem Begriff Enzym-katalysierte Umsetzung lipolytische, cellulolytische, amylolytische und proteolytische enzymatische Reaktionen verstanden. Bevorzugt wird unter dem Begriff Enzym- katalysierte Umsetzung cellulolytische enzymatische Reaktionen verstanden.According to the invention it has been recognized that a specimen from Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture can be used advantageously in an enzyme-catalytic process. In addition, it has been recognized according to the invention that the claimed enzyme or the enzyme or protein mixture can be used for an enzyme-catalytic process using at least one ionic liquid as solvent. Finally, it has been recognized according to the invention that a substance dissolved in the at least one ionic liquid is enzyme-catalytically by Aspergillus spec. isolated enzymes or enzyme or protein mixtures can be implemented. As enzyme-catalyzed reaction, all known enzymatic reactions can be understood. The term enzyme-catalyzed reaction is preferably understood as meaning lipolytic, cellulolytic, amylolytic and proteolytic enzymatic reactions. Preference is given to the term enzyme catalyzed conversion understood cellulolytic enzymatic reactions.
Es bietet sich als besonders vorteilhaft an, das gewünschte Enzym in einem Gemisch aus verschiedenen Proteinen/Enzymen zu verwenden. So handelt es sich beispielsweise bei der Aspergillus spec. -Zellulase der Firma Sigma, Germany, um ein Gemisch aus verschiedenen Proteinen, die in zueinander unterschiedlichen Konzentrationen in dem Gemisch vorliegen. Ein solches (natürliches und isoliertes oder kommerzielles) Enzymgemisch besteht hauptsächlich aus verschiedenen, durch Aspergillus spec. synthetisierten Enzymen mit unterschiedlichen Aktivitäten, welche im Zusammenhang mit der natürlichen Proteinproduktion des Pilzes synthetisiert werden. In den erfindungsgemäßen Mischungen werden hauptsächlich folgende Enzymaktivitäten beobachtet: ß-1 ,4- Glycosylhydrolase (5 - 70 %), ß-1 ,3-Glycosylhydrolase (5 - 30 %) und ß- 1 ,6-Glycosylhydrolase (5 - 30 %). Die Enzymaktivitäten werden mithilfe des DNSA Tests nach Bergemeyer, 1974, mod., welcher in den Beispielen beschrieben wird, bestimmt. Diese Enzyme sind in der Lage Zellulose abzubauen und dabei Glucose-Oligomere oder -Monomere freizusetzen (d.h. Hydrolyse der 1 ,4- Verknüpfungen der 1 ,4-ß-D-Glucane zur Freisetzung von Glucose-Einheiten). Bei den gefundenen Enzymaktivitäten kann es sich dabei entweder um Exo- oder Endo-Zellulasen handeln. Bei Verwendung eines solchen Gemisches wurde erfindungsgemäß erkannt, dass eine erhöhte Aktivität und Stabilität der Aspergillus spec- Zellulase mit cellulolytischer Aktivität in Ionischen Flüssigkeit bereitgestellt werden kann. Als Grund dafür gilt, dass alle Proteine in diesem Gemisch in ihrer Gesamtheit aufgrund synergetischer Effekte zwischen den Proteinen/Enzymen zu der hohen Aktivität und Stabilität der Enzyme in der mindestens einen Ionischen Flüssigkeit führen.It is particularly advantageous to use the desired enzyme in a mixture of different proteins / enzymes. For example, Aspergillus spec. Cellulase Sigma, Germany, to a mixture of different proteins, which are present in mutually different concentrations in the mixture. Such a (natural and isolated or commercial) enzyme mixture consists mainly of various, by Aspergillus spec. synthesized enzymes with different activities, which are synthesized in connection with the natural protein production of the fungus. The following enzyme activities are mainly observed in the mixtures according to the invention: β-1, 4-glycosylhydrolase (5-70%), β-1,3-glycosylhydrolase (5-30%) and β-1,6-glycosylhydrolase (5-30%). ). The enzyme activities are determined by the DNSA test according to Bergemeyer, 1974, mod., Which is described in the examples. These enzymes are capable of degrading cellulose, thereby releasing glucose oligomers or monomers (i.e., hydrolysis of the 1,4-linkages of 1,4-β-D-glucans to release glucose units). The enzyme activities found may be either exo- or endo-cellulases. When using such a mixture has been recognized according to the invention that increased activity and stability of Aspergillus spec-cellulase can be provided with cellulolytic activity in ionic liquid. The reason for this is that all the proteins in this mixture in their entirety, due to synergistic effects between the proteins / enzymes, lead to the high activity and stability of the enzymes in the at least one ionic liquid.
Vorzugsweise werden als Lösungsmittel ausschließlich Ionische Flüssigkeiten verwendet. In Bezug auf die Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung, eignen sich insbesondere Ionische Flüssigkeiten mit Halogenidanionen und in besonders bevorzugter Weise Ionische Flüssigkeiten mit Chloridanionen, die es erlauben, auch abbauresistente Zellulosen zu lösen. Darüber hinaus eignen sich ganz besonders bevorzugt neben den Ionischen Flüssigkeiten mit Halogenidanionen auch Ionische Flüssigkeiten mit Anionen insbesondere ausgewählt aus der Gruppe [RFSO3]", [Alkyl-SO3]", [Alkyl- OSO3]-, [Alkyl-C(O)O]-, [RFC(O)O]-, wobeiPreferably, only ionic liquids are used as the solvent. With regard to the object of the present invention, in particular ionic liquids with halide anions and more preferably ionic liquids with chloride anions are suitable, which also make it possible to dissolve degradation-resistant celluloses. In addition, very particularly preferably also Ionic liquids with anions are suitable in addition to the ionic liquids containing halide anions, in particular selected from the group [RFSO 3] ", [alkyl-SO 3]", [alkyl OSO 3] -, [alkyl-C ( O) -, [R F C (O) O] -, where
RF die Bedeutung fluoriertes Alkyl
Figure imgf000007_0001
mit m = 1-12 und x = 0- 7 hat, wobei für m = 1 x = 0 bis 2 sein soll und Alkyl eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C- Atomen bedeutet, zum Lösen von Di- oder Trisacchariden, Polysacchariden, Polysaccharid-haltigem Material oder zum Lösen von Mischungen dieser Verbindungen und ebenfalls zum enzymatischen Abbau.RF meaning fluorinated alkyl
Figure imgf000007_0001
with m = 1-12 and x = 0-7, where for m = 1 x = 0 to 2 and alkyl is a straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 20 C atoms, for dissolving di- or trisaccharides, Polysaccharides, polysaccharide-containing material or for dissolving mixtures of these compounds and also for enzymatic degradation.
Somit handelt es sich bei dem im Lösungsmittel gelösten Stoff bevorzugt um Di- oder Trisaccharide, Polysaccharide, Polysaccharid-haltiges Material oder um Mischungen dieser Verbindungen.Thus, the substance dissolved in the solvent is preferably di- or trisaccharides, polysaccharides, polysaccharide-containing material or mixtures of these compounds.
Disaccharide sind beispielsweise Rohrzucker (Saccharose), Milchzucker (Lactose) oder Malzzucker ((+)-Maltose), (+)-Cellobiose, Gentiiobiose oder Melibiiose.Disaccharides are, for example, cane sugar (sucrose), milk sugar (lactose) or malt sugar ((+) - maltose), (+) - cellobiose, Gentiiobiose or Melibiiose.
Trisaccharide sind beispielsweise Raffinose. Polysaccharide sind beispielsweise Stärke, Glykogen oder Zellulose.Trisaccharides are, for example, raffinose. Polysaccharides are for example starch, glycogen or cellulose.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist der gelöste Stoff besonders bevorzugt ausgewählt aus Zellulose, modifizierter Zellulose oder Zellulose-haltigem Material. Ganz besonders bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren Zellulose verwendet.In the process according to the invention, the solute is particularly preferably selected from cellulose, modified cellulose or cellulose-containing Material. Very particular preference is given to using cellulose in the process according to the invention.
Modifizierte Zellulose ist beispielsweise veretherte oder veresterte Zellulose. Insbesondere ist Carboxymethylcellulose eine modifizierte Zellulose.Modified cellulose is, for example, etherified or esterified cellulose. In particular, carboxymethyl cellulose is a modified cellulose.
Zellulose-haltige Materialien sind beispielsweise Zellstoff oder Papier.Cellulose-containing materials are, for example, pulp or paper.
Mischungen von Di- und Trisacchariden, Polysacchariden oder Polysaccharid-haltigen Materialien können auch Monosaccharide enthalten.Mixtures of di- and trisaccharides, polysaccharides or polysaccharide-containing materials may also contain monosaccharides.
In bekannter Weise sind Zellulosen durch cellulolytisch aktive Enzyme und insbesondere durch Zellulasen abbaubar, weshalb als besonders vorteilhaft eine Zellulase aus Aspergillus spec. oder ein Enzym- oder Proteingemisch, enthaltend mindestens eine Zellulase aus Aspergillus spec. verwendet wird.In a known manner, celluloses are degradable by cellulolytically active enzymes and in particular by cellulases, which is why a Zellulase from Aspergillus spec. or an enzyme or protein mixture containing at least one cellulase from Aspergillus spec. is used.
In bevorzugter Weise wird ein Proteingemisch enthaltend mindestens eine Zellulase aus Aspergillus spec. zum Abbau und zur Umsetzung im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, da aufgrund von Synergieeffekten zwischen den Proteinen, die Aktivität und Stabilität der Zellulasen, bzw. des aktiven Enzyms über einen längeren Zeitraum konserviert werden kann. Dies erhöht die Effizienz und Spezifität der Enzym-katalysierten Reaktion.Preferably, a protein mixture containing at least one cellulase from Aspergillus spec. used for degradation and for implementation in the process according to the invention, since due to synergy effects between the proteins, the activity and stability of the cellulases, or the active enzyme can be preserved over a longer period. This increases the efficiency and specificity of the enzyme-catalyzed reaction.
Für lipolytische, amylolytische und proteolytische enzymatisch-katalysierte Reaktionen in Ionischen Flüssigkeiten können als weitere typische Bespiele für die Enzyme aus Aspergillus spec. isolierte Lipasen, Amylasen und Proteasen oder Mischungen daraus genannt werden, die natürlich auch zusammen mit der mindestens einen beanspruchten Zellulase oder anderen Zellulasen als Mischungen vorliegen können.For lipolytic, amylolytic and proteolytic enzymatically-catalyzed reactions in ionic liquids, as further typical examples of the enzymes from Aspergillus spec. isolated lipases, amylases and proteases or mixtures thereof may be mentioned, which may of course also be present together with the at least one claimed cellulase or other Zellulasen as mixtures.
Vorzugsweise sind die Reaktionsgeschwindigkeit und die Umsetzung des gelösten Stoffes, insbesondere der Zellulose, über die eingesetzte Enzymmenge einstellbar. Dabei kann das Enzym, hier vorzugsweise Zellulase, in einer Menge, die durch das Verhältnis zur Gesamtmenge des Enzym- oder Proteingemisches zu der Menge des Enzyms bestimmt wird, von 0,1 % bis 99 % eingesetzt werden.Preferably, the reaction rate and the conversion of the solute, in particular the cellulose, over the used Enzyme quantity adjustable. In this case, the enzyme, preferably cellulase, in an amount which is determined by the ratio to the total amount of the enzyme or protein mixture to the amount of the enzyme, from 0.1% to 99%.
Zur Steigerung der Enzymaktivität in den beschriebenen Ionischen Flüssigkeiten kann es erwünscht sein, dass Wasser dem Reaktionsgemisch beigefügt wird. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine Zugabe von Wasser aber nicht zwingend notwendig.To increase enzyme activity in the described ionic liquids, it may be desirable for water to be added to the reaction mixture. However, in the method of the present invention, addition of water is not mandatory.
Um die Löslichkeit von polaren Stoffen zu erhöhen, und dabei die EnzymaktivitätASpezifität aufrecht zu erhalten, bietet es sich an, für das erfindungsgemäße Verfahren eine Ionische Flüssigkeit oder Mischungen von Ionischen Flüssigkeiten der allgemeinen Formel KA, wobei K für Kation und A für Anion steht, zu verwenden.In order to increase the solubility of polar substances while maintaining the enzyme activity specificity, it is advisable to use for the process according to the invention an ionic liquid or mixtures of ionic liquids of the general formula KA, where K is cation and A is anion use.
Dabei spielt insbesondere die Auswahl des Anions der IonischenIn particular, the selection of the anion of the ionic plays
Flüssigkeit eine besondere Rolle.Fluid a special role.
Das Anion A kann daher ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend [HSO4]-, [SO4]2-, [NO3]-, [BF4]-, [(RF)BF3]", [(RF)2BF2]", [(RF)3BF]", [(RF)4B]',The anion A can therefore be selected from the group comprising [HSO 4 ] -, [SO 4 ] 2 -, [NO 3 ] -, [BF 4 ] -, [(RF) BF 3 ] " , [(RF) 2 BF 2 ] " , [(RF) 3 BF] " , [(RF) 4 B] ' ,
[B(CN)4]", [PO4]3", [HPO4]2", [H2PO4]", [Alkyl-OPO3]2", [(AlkylO)(HO)PO2]",[B (CN) 4 ] " , [PO 4 ] 3" , [HPO 4 ] 2 " , [H 2 PO 4 ] " , [alkyl-OPO 3 ] 2 " , [(alkylO) (HO) PO 2 ] " ,
[(Alkyl-O)2PO2]-, [Alkyl-PO3]2", [RFPO3]2", [(Alkyl)2PO2]\ [(RF)2PO2]", [RFSO3]" [(Alkyl-O) 2 PO 2 ] -, [alkyl-PO 3 ] 2 " , [R F PO 3 ] 2" , [(alkyl) 2 PO 2 ] \ [(R F ) 2 PO 2 ] " , [RFSO 3 ] "
[HOSO2(CF2)nSO2O]", [OSO2(CF2)nSO2O]2-, [Alkyl-SO3]",[HOSO 2 (CF 2 ) n SO 2 O] " , [OSO 2 (CF 2 ) n SO 2 O] 2 -, [alkyl-SO 3 ] " ,
[HOSO2(CH2)nSO2O]", [OSO2(CH2)nSO2O]2", [Alkyl-OSO3]-, [Alkyl-C(O)O]\ [O(O)C(CH2)nC(O)O]2", [HO(O)C-(CH2)n-C(O)O]"2, [RFC(O)O]",[HOSO 2 (CH 2 ) n SO 2 O] " , [OSO 2 (CH 2 ) n SO 2 O] 2" , [alkyl-OSO 3 ] -, [alkylC (O) O] [O (O ) C (CH 2 ) n C (O) O] 2 " , [HO (O) C- (CH 2 ) n -C (O) O] " 2 , [RFC (O) O] " ,
[HO(O)C(CF2)nC(O)O]", [O(O)C(CF2)nC(O)O]2", [(RFSO2)2N] ", [(FSO2J2N] ", [((RF)2P(O))2N] ", [(RFSO2)3C] ", [(FSO2)3C] ", [Alkyl-CH(OH)C(O)O]", [HO(O)CCH2CH(OH)C(O)O]", [0(O)CCH2CH(OH)C(O)O]2",[HO (O) C (CF 2 ) n C (O) O] " , [O (O) C (CF 2 ) n C (O) O] 2" , [(R F SO 2 ) 2 N] " , [(FSO 2 J 2 N] " , [((R F ) 2 P (O)) 2 N] " , [(R F SO 2 ) 3 C] " , [(FSO 2 ) 3 C] " , [Alkyl-CH (OH) C (O) O] " , [HO (O) CCH 2 CH (OH) C (O) O] " , [O (O) CCH 2 CH (OH) C (O) O ] 2 " ,
(HOC[CH2C(O)OH]2C(O)O)", (HOC[CH2C(O)OH][CH2C(O)O]C(O)O)2-, (HOC[CH2C(O)O][CH2C(O)O]C(O)O)3", Cl" und/oder Br", und wobei n = O bis 6 bedeutet RF die Bedeutung fluoriertes Alkyl
Figure imgf000010_0001
mit m = 1-12 und x = 0- 7 hat, wobei für m = 1 x = 0 bis 2 sein soll und Alkyl eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C- Atomen bedeutet.(HOC [CH 2 C (O) OH] 2 C (O) O) " , (HOC [CH 2 C (O) OH] [CH 2 C (O) O] C (O) O) 2 -, ( HOC [CH 2 C (O) O] [CH 2 C (O) O] C (O) O) 3 " , Cl " and / or Br " , and where n = 0 to 6 RF meaning fluorinated alkyl
Figure imgf000010_0001
with m = 1-12 and x = 0-7, where for m = 1 x = 0 to 2 and alkyl is a straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 20 carbon atoms.
Die Alkylgruppe in den oben genannten Anionen kann ausgewählt sein aus geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen mit 1 bis 20 C-Atomen, vorzugsweise mit 1 bis 14 C-Atomen und insbesondere bevorzugt mit 1 bis 4 C-Atomen.The alkyl group in the abovementioned anions can be selected from straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 20 C atoms, preferably having 1 to 14 C atoms and especially preferably having 1 to 4 C atoms.
[Alkyl-CH(OH)C(O)O]" ist bevorzugt [CH3-CH(OH)C(O)O]".[Alkyl-CH (OH) C (O) O] " is preferably [CH 3 -CH (OH) C (O) O] " .
Vorzugsweise bedeutet RF CF3, C2F5, C3F7 oder C4F9.Preferably R F is CF 3 , C 2 F 5 , C 3 F 7 or C 4 F 9 .
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Anion um ein Anion einer korrespondierenden starken Säure.Preferably, the anion is an anion of a corresponding strong acid.
Insbesondere sind Anionen der Gruppe Cl", Br", [RFSO3]", [Alkyl-SO3]", [Alkyl-OSO3]", [Alkyl-C(O)O]-, [RFC(O)O]", [(HO)PO3]-2, [(HO)2PO2]", [PO4]"3, [(Alkyl-O)PO3]"2, [(Alkyl-O)(HO)PO2]", [(Alkyl-O)2PO2]", [(Alkyl)2PO2]-, [(Alkyl)PO3]2-, [(RF)2PO2]-, [(RF)PO3]2-, [O(O)C-(CH2)n-C(O)θf, [HO(O)C- (CH2)n-C(O)O]2-, [Alkyl-CH(OH)C(O)O]-, [HO(O)CCH2CH(OH)C(O)O]-, [0(O)CCH2CH(OH)C(O)O]2-, (HOC[CH2C(O)OH]2C(O)O)-,In particular, anions of the group Cl " , Br " , [RFSO 3 ] " , [alkyl-SO 3 ] " , [alkyl-OSO 3 ] " , [alkyl-C (O) O] -, [RFC (O) O ] "[(HO) PO 3] - 2, [(HO) 2 PO 2]", [PO 4] "3, [(alkyl-O) PO 3]" 2, [(alkyl-O) (HO ) PO 2 ] " , [(alkyl-O) 2 PO 2 ] " , [(alkyl) 2 PO 2 ] -, [(alkyl) PO 3 ] 2 -, [(RF) 2 PO 2 ] -, [( R F) PO 3] 2 -, [O (O) C- (CH 2) n -C (O) .theta..sub.F, [HO (O) C- (CH 2) n -C (O) O] 2 -, [Alkyl-CH (OH) C (O) O] -, [HO (O) CCH 2 CH (OH) C (O) O] -, [O (O) CCH 2 CH (OH) C (O) O ] 2 -, (HOC [CH 2 C (O) OH] 2 C (O) O) -,
(HOC[CH2C(O)OH][CH2C(O)O]C(O)O)2- oder (HOC[CH2C(O)O][CH2C(O)O]C(O)O)-3 geeignet, wobei n, RF oder Alkyl eine der zuvor genannten Bedeutungen haben.(HOC [CH 2 C (O) OH] [CH 2 C (O) O] C (O) O) 2 - or (HOC [CH 2 C (O) O] [CH 2 C (O) O] C (O) O) - 3 , where n, R F or alkyl have one of the meanings given above.
Besonders bevorzugt sind Anionen der Gruppe Cl", Br", [RFSO3]", [Alkyl- SO3]-, [Alkyl-OSO3]-, [Alkyl-C(O)O]-, [RFC(O)O]", [(HO)2PO2]-, [(Alkyl- O)PO3]2", [(Alkyl-O)(HO)PO2]" oder [(Alkyl-O)2PO2]' geeignet, wobei RF oder Alkyl eine der zuvor genannten Bedeutungen haben. Ganz besonders bevorzugt sind Anionen der Gruppe Cl", Br', [RFSO3]~, [Alkyl-SO3]", [Alkyl-OSO3]~, [Alkyl-C(O)O]-, [RFC(O)O]- geeignet, wobei RF oder Alkyl eine der zuvor genannten Bedeutungen haben.Particularly preferred are anions of the group Cl " , Br " , [RFSO 3 ] " , [alkyl-SO 3 ] -, [alkyl-OSO 3 ] -, [alkyl-C (O) O] -, [R F C ( O) O] "[(HO) 2 PO 2] -, [(alkyl O) PO 3] 2 ', [(alkyl-O) (HO) PO 2]' or [(alkyl-O) 2 PO 2 ] ' , wherein R F or alkyl have one of the meanings mentioned above. Most particularly preferred are anions of the group Cl ', Br', [R F SO 3] ~, [alkyl-SO 3] ", [alkyl-OSO 3] ~, [alkyl-C (O) O] -, [R F C (O) O] -, wherein R F or alkyl have one of the meanings mentioned above.
In Bezug auf die Wahl des Kations der Ionischen Flüssigkeit gibt es per se keine Einschränkungen. Vorzugsweise handelt es sich aber um organische Kationen, wobei es sich insbesondere bevorzugt um Ammonium-, Phosphonium, Thiouronium-, Guanidiniumkationen oder um heterocyclische Kationen, wie beispielsweise Imidazolium handelt.There are no restrictions per se on the choice of cation of the ionic liquid. Preferably, however, they are organic cations, with particular preference being given to ammonium, phosphonium, thiouronium, guanidinium cations or heterocyclic cations, for example imidazolium.
Ammoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (1)Ammonium cations can be exemplified by the formula (1)
[NR4J+ (1), beschrieben werden, wobei R jeweils unabhängig voneinander H, wobei nicht alle Substituenten R gleichzeitig H sein dürfen, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, - C(O)OH, -C(O)NR' 2, -SO2NR' 2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R >, -C(O)NR'-, - SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen sein kann. Phosphoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (2)[NR 4 J + (1)], where R is in each case independently H, where not all substituents R may simultaneously be H, straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 ° C Atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or completely unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms and containing alkyl groups having 1- 6 C atoms may be substituted, where one or more R partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or partially with -OR ' , -CN, - C (O) OH, -C ( O) NR ' 2 , -SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 , and wherein one or two non-adjacent and non-α-carbon atoms of R, substituted by atoms and or atomic groupings selected from the group -O-, -S-, -S (O) -, -SO 2 -, -N + R>, -C (O) NR ' -, - SO 2 NR ' -, or -P (O) R ' - may be replaced by R' = H, not, partially or perfluorinated Cr to C 6 alkyl, C 3 - to C 7 -cycloalkyl, unsubstituted or substituted phenyl and X = halogen. Phosphonium cations can be exemplified by the formula (2)
[PR2 4]+ (2), beschrieben werden, wobei R2 jeweils unabhängig voneinander H, NR'2 geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R2 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, - C(O)OH, -C(O)NFT2, -SO2NR' 2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R2, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R' 2-, -C(O)NR'-, - SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C-r bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen.[PR 2 4 ] + (2), where R 2 are each independently H, NR ' 2 straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more a plurality of non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms substituted with alkyl groups having 1-6 C atoms wherein one or more R 2 is partially or completely halogen, in particular -F and / or -Cl, or partially -OR ' , -CN, -C (O) OH, -C (O) NFT 2 , -SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 , and wherein one or two non-adjacent and non-α-carbon atoms of R 2 , by atoms and / or atomic groups selected from the group -O-, -S-, -S (O) -, -SO 2 -, -N + R ' 2 -, -C (O) NR ' -, -SO 2 NR ' -, or -P (O) R ' - may be replaced by R ' = H, not, partially or perfluorinated C 1 to C 6 alkyl, C 3 to C 7 cycloalkyl, unsubstituted or substituted phenyl and X = halogen.
Ausgeschlossen sind jedoch Kationen der Formeln (1) und (2), in denen alle vier oder drei Substituenten R und R2 vollständig mit Halogenen substituiert sind, beispielsweise das Tris(trifluormethyl)methylammonium- kation, das Tetra(trifluormethyl)ammoniumkation oder das Tetra(nonafluor- butyl)ammoniumkation.However, cations of the formulas (1) and (2) in which all four or three substituents R and R 2 are completely substituted by halogens are excluded, for example the tris (trifluoromethyl) methylammonium cation, the tetra (trifluoromethyl) ammonium cation or the tetra (nonafluorobutyl) ammonium cation.
Geeignete Thiouroniumkationen können durch die Formel (3), [C(R3R4N)(SR5)(NR6R7)]+ (3), beschrieben werden, wobei R3 bis R7 jeweils unabhängig voneinander H, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R3 bis R7 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', - CN, -C(O)OH, -C(O)NR' 2, -SO2NR' 2l -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α- ständige Kohlenstoffatome von R3 bis R7 durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, - N+R' 2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Ci- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen.Suitable thiouronium cations can be described by the formula (3), [C (R 3 R 4 N) (SR 5 ) (NR 6 R 7 )] + (3), wherein R 3 to R 7 are each independently H, straight-chain or branched alkyl having 1 to 20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated Is triple bonds, saturated, partially or completely unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms, which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, where one or more of the substituents R 3 to R 7 is partially or completely halogenated, especially -F and / or -Cl, or partially with -OH, -OR ' , - CN, -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR ' 2l -SO 2 OH, - SO 2 X, -NO 2 , and wherein one or two nonadjacent and non-α-carbon atoms of R 3 to R 7 are substituted by atoms and / or atomic groups selected from the group -O-, -S-, - S (O) -, -SO 2 -, - N + R ' 2 -, -C (O) NR ' -, -SO 2 NR ' -, or -P (O) R ' - may be replaced by R ' = H, not t, partially or perfluorinated Ci- to C 6 -alkyl, C 3 - to C 7 -cycloalkyl, unsubstituted or substituted phenyl and X = halogen.
Guanidiniumkationen können durch die Formel (4) [C(NR8R9)(NR10R11)(NR12R13)]+ (4), beschrieben werden, wobeiGuanidinium cations can be described by the formula (4) [C (NR 8 R 9 ) (NR 10 R 11 ) (NR 12 R 13 )] + (4) wherein
R8 bis R13 jeweils unabhängig voneinanderR 8 to R 13 are each independently
H, -CN, NR' 2, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R8 bis R13 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR 2, -SO2NR 2, -SO2OH, -SO2X, - NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome von R8 bis R13 durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, - SO2-, -N+RV, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H1 nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis Cβ-Alkyl, C3- bis C7- Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.H, -CN, NR ' 2 , straight-chain or branched alkyl having 1 to 20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C Atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms, which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, wherein one or more of the substituents R 8 to R 13 partially or completely with halogens, especially -F and / or -Cl, or may be partially substituted with -OR ' , -CN, -C (O) OH, -C (O) NR 2 , -SO 2 NR 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, - NO 2 , and wherein one or two non-adjacent and non-α-carbon atoms of R 8 to R 13 through atoms and / or atomic groups selected from the group -O-, -S-, -S (O) -, -SO 2 -, -N + RV, -C (O) NR ' -, -SO 2 NR ' -, or -P (O) R ' - may be replaced with R ' = H 1 not, partially or perfluorinated C 1 - to Cβ-alkyl, C 3 - to C 7 - cycloalkyl, unsubstituted or substituted phenyl and X = halogen.
Darüber hinaus können Kationen der allgemeinen Formel (5)In addition, cations of the general formula (5)
[HetN]+ (5) eingesetzt werden, wobei HetN+ ein heterocyclisches Kation, ausgewählt aus der Gruppe[HetN] + (5), wherein HetN + is a heterocyclic cation selected from the group
Imidazolium 1 H-Pyrazolιum 3H-Pyrazolιum 4H-Pyrazolιum 1-PyrazolιnιumImidazolium 1 H-Pyrazolιum 3H-Pyrazolιum 4H-Pyrazolιum 1-Pyrazolιnιum
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0001
2-Pyrazolιnιum 3-Pyrazolιnιum 2,3-Dιhydro-lmιdazolιnιum 4,5-Dιhydro-lmιdazolιnιum2-Pyrazolιnιum 3-Pyrazolιnιum 2,3-Dιhydro-lmιdazolιnιum 4,5-Dιhydro-lmιdazolιnιum
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0002
2,5-Dιhydro-lmιdazolιπιum Pyrrolidinium2,5-Dιhydro-lmιdazolιπιum pyrrolidinium
1 2,4-Tπazolιum 1 2 4-Tπazolιum1 2,4-Tπazolιum 1 2 4-Tπazolιum
Figure imgf000014_0003
Figure imgf000015_0001
oder
Figure imgf000014_0003
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or
bedeutet, wobei die Substituentenmeans, wherein the substituents
R1' bis R4' jeweils unabhängig voneinanderR 1 'to R 4 ' are each independently
H, -CN, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen, gerad kettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-H, -CN, straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and a or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or completely unsaturated cycloalkyl having 3-7 C
Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Heteroaryl,Atoms which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, saturated, partially or completely unsaturated heteroaryl,
Heteroaryl-CrC6-alkyl oder Aryl-CrC6-alkyl bedeutet, wobei die Substituenten R1 , R2 , R3 und/oder R4 zusammen auch einHeteroaryl-C r C 6 alkyl or aryl-C 1 -C 6 -alkyl, wherein the substituents R 1 , R 2 , R 3 and / or R 4 taken together also
Ringsystem bilden können, wobei ein oder mehrere Substituenten R1' bis R4' teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -Cl und/oder -F, oder -OR', -CN, -C(O)OH, - C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, wobei jedoch nicht gleichzeitig R1 und R4 vollständig mit Halogenen substituiert sein dürfen, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht am Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome der Substituenten R1' bis R4', durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen.Can form ring system, where one or more substituents R 1 'to R 4 ' partially or completely with halogens, in particular -Cl and / or -F, or -OR ', -CN, -C (O) OH, - C (O) NR' 2 , -SO 2 NR ' 2 , -C (O) X, -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 , may be substituted, but not simultaneously R 1 and R 4 may be completely substituted with halogens, and where one or two nonadjacent and not heteroatom-bonded carbon atoms of the substituents R 1 'to R 4 ' are substituted by atoms and / or atomic groups selected from among the -O-, -S-, -S (O) -, -SO 2 - , -N + R ' 2 -, -C (O) NR'-, -SO 2 NR'-, or -P (O) R'- may be replaced with R' = H, not, partially or perfluorinated Cr to C 6 alkyl, C 3 - to C 7 cycloalkyl, unsubstituted or substituted phenyl and X = halogen.
Als Substituent R2 eignen sich insbesondere auch Atomgruppierungen ausgewählt aus -OR',-NR'2) -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, - SO2X oder -NO2.As substituent R 2 are in particular also atomic groups selected from -OR ', - NR' 2) -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR' 2 , -SO 2 OH, - SO 2 X or -NO 2 .
Unter vollständig ungesättigten Substituenten werden auch aromatische Substituenten verstanden.Fully unsaturated substituents also mean aromatic substituents.
Als Substituenten R und R2 bis R13 der Verbindungen der Formeln (1) bis (4) kommen dabei neben H auch in Frage: Ci- bis C20-, insbesondere d- bis C14-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C3- bis C7-Cycloalkylgruppen, die mit C-i- bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.Suitable substituents R and R 2 to R 13 of the compounds of the formulas (1) to (4) include, in addition to H: C 1 to C 20 -, in particular C 1 to C 14 alkyl groups, and saturated or unsaturated, ie also aromatic, C 3 - to C 7 -cycloalkyl groups which may be substituted by C 1 - to C 6 -alkyl groups, in particular phenyl.
Die Substituenten R und R2 in den Verbindungen der Formel (1) oder (2) können dabei gleich oder verschieden sein.The substituents R and R 2 in the compounds of formula (1) or (2) may be the same or different.
Die Substituenten R und R2 können Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl oder Tetradecyl sein. Bis zu vier Substituenten des Guanidinium-Kations [C(NR8R9)(NR10R11)(NR12R13)]+ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.The substituents R and R 2 may be methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl or tetradecyl. Up to four substituents of the guanidinium cation [C (NR 8 R 9 ) (NR 10 R 11 ) (NR 12 R 13 )] + may also be linked in pairs to form mono-, bi-, or polycyclic cations.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Guanidinium-Kationen:Without restriction of generality, examples of such guanidinium cations are:
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Guanidinium-Kationen noch durch d- bis Cβ-Alkyl, C1- bis Ce-Alkenyl, NO2, CN, NR'2, F, Cl, Br, I, C1-C6-AIkOXy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2l SO2X' oder SO3H substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben, substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein. Bis zu vier Substituenten des Thiouroniumkations [C(R3R4N)(SR5)(NR6R7)]+ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.Optionally, the carbocycles or heterocycles of the above-mentioned guanidinium cations can still by d- to Cβ-alkyl, C 1 - to Ce-alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 -alkyl, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 NR ' 2l SO 2 X' or SO 3 H be substituted, where X and R 'have the meaning given above, substituted or unsubstituted phenyl or unsubstituted or substituted heterocycle be substituted. Up to four substituents of the thiouronium cation [C (R 3 R 4 N) (SR 5 ) (NR 6 R 7 )] + may also be linked in pairs in such a way that mono-, bi- or polycyclic cations are formed.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Kationen im Folgenden angegeben, wobei Y = S bedeutet:Without restricting generality, examples of such cations are given below, where Y = S:
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Figure imgf000018_0001
Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Kationen noch durch d- bis C6-Alkyl, C1- bis C6-Alkenyl, NO2, CN, NR'2, F, Cl, Br, I, C1-C6-AIkOXy, SCF3, SO2CF3, COOH1 SO2NR'2, SO2X oder SO3H oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.Optionally, the carbocycles or heterocycles of the cations specified above can also be replaced by C 1 - to C 6 -alkyl, C 1 - to C 6 -alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 -alkyl, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH 1 SO 2 NR ' 2 , SO 2 X or SO 3 H or substituted or unsubstituted phenyl or unsubstituted or substituted heterocycle may be substituted, wherein X and R' have the meaning given above ,
Die Substituenten R3 bis R13 können jeweils unabhängig voneinander eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen sein. Die Substituenten R3 und R4, R6 und R7, R8 und R9, R10 und R11 und R12 und R13 in Verbindungen der Formeln (3) bis (4) können dabei gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind R3 bis R13 jeweils unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.-Butyl, sek.- Butyl, Phenyl oder Cyclohexyl.The substituents R 3 to R 13 may each independently be a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 10 C atoms. The Substituents R 3 and R 4 , R 6 and R 7 , R 8 and R 9 , R 10 and R 11 and R 12 and R 13 in compounds of formulas (3) to (4) may be the same or different. Preferably, R 3 to R 13 are each independently methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, sec-butyl, phenyl or cyclohexyl.
Als Substituenten R1 bis R4 von Verbindungen der Formel (5) kommen neben H auch in Frage: Cr bis C2o> insbesondere Cr bis Ci2-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C3- bis C7- Cycloalkylgruppen, die mit C1- bis Cβ-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.As the substituents R 1 to R 4 of compounds of the formula (5) are in addition to H in question: Cr to C2o> in particular Cr to Ci2-alkyl groups, and saturated or unsaturated, ie also aromatic, C 3 to C 7 - cycloalkyl groups with C 1 - to Cβ-alkyl groups may be substituted, in particular phenyl.
Die Substituenten R1 und R4 können jeweils unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl sein. In Pyrrolidinium-, Piperidinium- oder Indolinium-Verbindungen sind die beiden Substituenten R1 und R4 bevorzugt unterschiedlich.The substituents R 1 and R 4 may each independently be methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl, cyclohexyl, phenyl or benzyl. In pyrrolidinium, piperidinium or indolinium compounds, the two substituents R 1 and R 4 are preferably different.
Der Substituent R2 oder R3 ist jeweils unabhängig voneinander insbesondere H, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, tert.- Butyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl.The substituent R 2 or R 3 is in each case independently of one another in particular H, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, cyclohexyl, phenyl or benzyl.
Die CrCi2-Alkylgruppe ist beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3- Methylbutyl, 1 ,1-, 1 ,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl oder Dodecyl. Gegebenenfalls Difluormethyl, Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Heptafluorpropyl oder Nonafluorbutyl.The C 1 -C 12 -alkyl group is, for example, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl or tert-butyl, and also pentyl, 1-, 2- or 3-methylbutyl, 1, 1, 1, 2 or 3 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl or dodecyl. Optionally, difluoromethyl, trifluoromethyl, pentafluoroethyl, heptafluoropropyl or nonafluorobutyl.
Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Doppelbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise AIIyI, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner 4-Pentenyl, iso- Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, -C9H17, -Ci0H19 bis -C2oH39; vorzugsweise AIIyI, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner bevorzugt ist 4-Pentenyl, iso-Pentenyl oder Hexenyl.A straight-chain or branched alkenyl having 2 to 20 C atoms, wherein a plurality of double bonds may also be present, is, for example, allyl, 2- or 3-butenyl, isobutenyl, sec-butenyl, furthermore 4-pentenyl, isobutyl, Pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, -C 9 H 17 , -Ci 0 H 19 to -C 2 oH 39 ; preferably allyl, 2- or 3-butenyl, isobutenyl, sec-butenyl, furthermore preferred is 4-pentenyl, iso-pentenyl or hexenyl.
Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Dreifachbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, ferner 4- Pentinyl, 3-Pentinyl, Hexinyl, Heptinyl, Octinyl, -C9H15, -Ci0H17 bis -C20H37, vorzugsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, 4-Pentinyl, 3- Pentinyl oder Hexinyl.A straight-chain or branched alkynyl having 2 to 20 C atoms, wherein a plurality of triple bonds may also be present, is, for example, ethynyl, 1- or 2-propynyl, 2- or 3-butynyl, furthermore 4-pentynyl, 3-pentynyl, hexynyl, Heptynyl, octynyl, -C 9 H 15 , -Ci 0 H 17 to -C 20 H 37 , preferably ethynyl, 1- or 2-propynyl, 2- or 3-butynyl, 4-pentynyl, 3-pentynyl or hexynyl.
Aryl-d-Cβ-alkyl bedeutet beispielsweise Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl, Phenylbutyl, Phenylpentyl oder Phenylhexyl, wobei sowohl der Phenylring als auch die Alkylenkette, wie zuvor beschrieben teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', - NR'2, -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2> -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein können.Aryl-d-Cβ-alkyl is, for example, benzyl, phenylethyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl or phenylhexyl, where both the phenyl ring and the alkylene chain, as described above, partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or partially with -OR ', - NR' 2 , -CN, -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR'2> -C (O) X, -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 may be substituted.
Unsubstituierte gesättigte oder teilweise oder vollständig ungesättigte Cycloalkylgruppen mit 3-7 C-Atomen sind daher Cyclopropyl, Cyclobutyl,Unsubstituted saturated or partially or fully unsaturated cycloalkyl groups having 3-7 C atoms are therefore cyclopropyl, cyclobutyl,
Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Phenyl,Cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, phenyl,
Cycloheptenyl, welche mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, wobei wiederum die Cycloalkylgruppe oder die mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituierte Cycloalkylgruppe auch mit Halogenatomen wie F, Cl, Br oder I, insbesondere F oder Cl oder mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -Cycloheptenyl, which may be substituted by C 1 - to C 6 alkyl groups, in turn, the cycloalkyl group or substituted with C 1 - to C 6 alkyl cycloalkyl group with halogen atoms such as F, Cl, Br or I, in particular F or Cl or with -OR ', -CN, -C (O) OH, -C (O) NR' 2 , -
SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein kann.SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 may be substituted.
In den Substituenten R, R2 bis R13 oder R1 bis R4 können auch ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständig zum Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder - P(O)R'- ersetzt werden, mit R' = nicht, teilweise oder perfluoriertes Ci- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl.In the substituents R, R 2 to R 13 or R 1 to R 4 , one or two non-adjacent and not α-bonded to the heteroatom carbon atoms, by atoms and / or atomic groups selected from the group -O-, -S- , -S (O) -, -SO 2 -, -N + R ' 2 -, -C (O) NR', -SO 2 NR '-, or - P (O) R'- be replaced, with R '= not, partially or perfluorinated Ci- to C 6 alkyl, C 3 - to C 7 cycloalkyl, unsubstituted or substituted phenyl.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für derart modifizierte Substituenten R, R2 bis R13 und R1' bis R4':Without restriction of generality, examples of such modified substituents R, R 2 to R 13 and R 1 ' to R 4' are :
-OCH3, -OCH(CHs)2, -CH2OCH3, -CH2-CH2-O-CH3, -C2H4OCH(CH3)2, - C2H4SC2H5, -C2H4SCH(CH3)2, -S(O)CH3, -SO2CH3, -SO2C6H5, -SO2C3H7, - SO2CH(CH3) 2, -SO2CH2CF3, -CH2SO2CH3, -0-C4H8-O-C4H9, -CF3, -C2F5, - C3F7, -C4F9, -C(CFs)3, -CF2SO2CF3, -C2F4N(C2F5)C2F5, -CHF2, -CH2CF3, - C2F2H3, -C3FH6, -CH2C3F7, -C(CFH2)3) -CH2C(O)OH, -CH2C6H5 oder P(O)(C2H5)2.-OCH 3 , -OCH (CHs) 2 , -CH 2 OCH 3 , -CH 2 -CH 2 -O-CH 3 , -C 2 H 4 OCH (CH 3 ) 2 , - C 2 H 4 SC 2 H 5 , -C 2 H 4 SCH (CH 3 ) 2 , -S (O) CH 3 , -SO 2 CH 3 , -SO 2 C 6 H 5 , -SO 2 C 3 H 7 , -SO 2 CH (CH 3 ) 2 , -SO 2 CH 2 CF 3 , -CH 2 SO 2 CH 3 , -O-C 4 H 8 -OC 4 H 9 , -CF 3 , -C 2 F 5 , -C 3 F 7 , -C 4 F 9 , -C (CFs) 3 , -CF 2 SO 2 CF 3 , -C 2 F 4 N (C 2 F 5 ) C 2 F 5 , -CHF 2 , -CH 2 CF 3 , -C 2 F 2 H 3 , -C 3 FH 6 , -CH 2 C 3 F 7 , -C (CFH 2 ) 3) -CH 2 C (O) OH, -CH 2 C 6 H 5 or P (O) (C 2 H 5 ) 2 .
In R' ist C3- bis C7-Cycloalkyl beispielsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.In R ', C 3 - to C 7 -cycloalkyl is, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
In R1 bedeutet substituiertes Phenyl, durch d- bis C6-Alkyl, d- bis C6- Alkenyl, NO2, CN, NR'2, F, Cl, Br, I, Ci-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR"2 oder SO3H substituiertes Phenyl, wobei X' F, Cl oder Br und R" ein nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis C6-Alkyl oder C3- bis C7-Cycloalkyl wie für R' definiert bedeutet, beispielsweise, o-, m- oder p- Methylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, o-, m- oder p-Propylphenyl, o-, m- oder p-lsopropylphenyl, o-, m- oder p-tert.-Butylphenyl, o-, m- oder p- Nitrophenyl, o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder p-Ethoxyphenyl, o-, m-, p-(Trifluormethyl)phenyl, o-, m-, p-(Trifluormethoxy)phenyl, o-, m-, p- (Trifluormethylsulfonyl)phenyl, o-, m- oder p-Fluorphenyl, o-, m- oder p- Chlorphenyl, o-, m- oder p-Bromphenyl, o-, m- oder p-lodphenyl, weiter bevorzugt 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethylphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5- , 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dihydroxyphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5- Difluorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dichlorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dibromphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5- Dimethoxyphenyl, 5-Fluor-2-methylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl oder 2,4,5-Trimethylphenyl. In R1 bis R4 wird als Heteroaryl ein gesättigter oder ungesättigter mono- oder bicyclischer heterocyclischer Rest mit 5 bis 13 Ringgliedern verstanden, wobei 1 , 2 oder 3 N- und/oder 1 oder 2 S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder mehrfach durchIn R 1 , substituted phenyl, by C 1 - to C 6 alkyl, C 1 - to C 6 - alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, Ci-C 6 alkoxy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 X ', SO 2 NR " 2 or SO 3 H substituted phenyl, wherein X' is F, Cl or Br and R" is a non, partially or perfluorinated Cr to C 6 alkyl or C 3 to C 7 -cycloalkyl as defined for R ', for example, o-, m- or p-methylphenyl, o-, m- or p-ethylphenyl, o-, m- or p-propylphenyl, o-, m - or p-isopropylphenyl, o-, m- or p-tert-butylphenyl, o-, m- or p-nitrophenyl, o-, m- or p-methoxyphenyl, o-, m- or p-ethoxyphenyl, o -, m-, p- (trifluoromethyl) phenyl, o-, m-, p- (trifluoromethoxy) phenyl, o-, m-, p- (trifluoromethylsulfonyl) phenyl, o-, m- or p-fluorophenyl, o- , m- or p-chlorophenyl, o-, m- or p-bromophenyl, o-, m- or p-iodophenyl, more preferably 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- or 3,5-dimethylphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- or 3,5-dihydroxyphenyl, 2,3-, 2,4 -, 2,5-, 2,6-, 3,4- or 3,5- Difluorophenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- or 3,5-dichlorophenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2, 6-, 3,4- or 3,5-dibromophenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- or 3,5-dimethoxyphenyl, 5-fluoro-2 -methylphenyl, 3,4,5-trimethoxyphenyl or 2,4,5-trimethylphenyl. In R 1 to R 4 as heteroaryl is a saturated or unsaturated mono- or bicyclic heterocyclic radical having 5 to 13 ring members understood, wherein 1, 2 or 3 N and / or 1 or 2 S or O atoms may be present and the heterocyclic radical one or more times
C1- bis Cβ-Alkyl, d- bis C6-Alkenyl, NO2, CN, NR'2,F, Cl, Br, I, C1-C6- Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR'2 oder SO3H substituiert sein kann, wobei X' und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.C 1 to C 6 alkyl, C 1 to C 6 alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 alkoxy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH , SO 2 X ', SO 2 NR' 2 or SO 3 H may be substituted, wherein X 'and R' have a meaning given above.
Der heterocyclische Rest ist beispielweise substituiertes oder unsubstituiertes 2- oder 3-Furyl, 2- oder 3-Thienyl, 1-, 2- oder 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-lmidazolyl, 3-, 4- oder 5-Pyrazolyl, 2-, 4- oder 5-Oxazolyl, 3-, 4- oder 5-lsoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Thiazolyl, 3-, 4- oder 5-lsothiazolyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, 2-, 4-, 5- oder 6-Pyrimidinyl, weiterhin bevorzugt 1 ,2,3- Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1 ,2,4-TriazoM-, -4- oder -5-yl, 1- oder 5- Tetrazolyl, 1,2,3-Oxadiazol-4- oder -5-yl 1 ,2,4-Oxadiazol-3- oder -5-yl, 1 ,3,4-Thiadiazol-2- oder -5-yl, 1 ,2,4-Thiadiazol-3- oder -5-yl, 1 ,2,3- Thiadiazol-4- oder -5-yl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-2H-Thiopyranyl, 2-, 3- oder 4- 4H-Thiopyranyl, 3- oder 4-Pyridazinyl, Pyrazinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7- Benzofuryl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzothienyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7- 1 H-lndolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-Benzimidazolyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7- Benzopyrazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzoxazolyl, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7- Benzisoxazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzthiazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7- Benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- oder 7-Benz-2,1 ,3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinolinyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-lsochinolinyl, 1-, 2-, 3-, 4- oder 9-Carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 9-Acridinyl, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinazolinyl oder 1-, 2- oder 3- Pyrrolidinyl.The heterocyclic radical is, for example, substituted or unsubstituted 2- or 3-furyl, 2- or 3-thienyl, 1-, 2- or 3-pyrrolyl, 1-, 2-, 4- or 5-imidazolyl, 3-, 4- or 5-pyrazolyl, 2-, 4- or 5-oxazolyl, 3-, 4- or 5-isoxazolyl, 2-, 4- or 5-thiazolyl, 3-, 4- or 5-isothiazolyl, 2-, 3- or 4-pyridyl, 2-, 4-, 5- or 6-pyrimidinyl, more preferably 1, 2,3-triazole-1, -4- or -5-yl, 1, 2,4-triazoM-, - 4- or 5-yl, 1- or 5-tetrazolyl, 1,2,3-oxadiazol-4 or 5-yl 1, 2,4-oxadiazol-3 or -5-yl, 1, 3, 4-thiadiazol-2 or -5-yl, 1, 2,4-thiadiazol-3 or -5-yl, 1, 2,3-thiadiazol-4 or -5-yl, 2, 3, 4-, 5- or 6-2H-thiopyranyl, 2-, 3- or 4- 4H-thiopyranyl, 3- or 4-pyridazinyl, pyrazinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- or 7- Benzofuryl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- or 7-benzothienyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- or 7-1H-indolyl, 1-, 2 , 4- or 5-benzimidazolyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- or 7- benzopyrazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- or 7-benzoxazolyl, 3-, 4-, 5, 6 or 7 benzisoxazole yl, 2-, 4-, 5-, 6- or 7-benzthiazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- or 7- benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- or 7-benz-2.1 , 3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- or 8-quinolinyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- or 8- isoquinolinyl, 1-, 2-, 3-, 4- or 9-carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- or 9-acridinyl, 3, 4 -, 5-, 6-, 7- or 8-cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- or 8-quinazolinyl or 1-, 2- or 3-pyrrolidinyl.
Unter Heteroaryl-C-i-C6-alkyl wird in Analogie zu Aryl-d -C6-alkyl beispielsweise Pyridinyl-methyl, Pyridinyl-ethyl, Pyridinyl-propyl, Pyridinyl- butyl, Pyridinyl-pentyl, Pyridinyl-hexyl verstanden, wobei weiterhin die zuvor beschriebenen Heterocyclen in dieser Weise mit der Alkylenkette verknüpft werden können.Heteroaryl-C 1 -C 6 -alkyl is analogous to aryl-C -C 6 -alkyl, for example, pyridinyl-methyl, pyridinyl-ethyl, pyridinyl-propyl, pyridinyl-butyl, pyridinyl-pentyl, pyridinyl-hexyl understood, wherein further heterocycles described in this way can be linked to the alkylene chain.
HetN+ kann sein:HetN + can be:
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0001
Indolinium Pipeπdinium
Figure imgf000023_0002
wobei die Substituenten R1 bis R4 jeweils unabhängig voneinander eine zuvor beschriebene Bedeutung haben.Indolinium Pipeπdinium
Figure imgf000023_0002
wherein the substituents R 1 to R 4 each independently have a meaning as described above.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Kationen der ionischen Flüssigkeit um Imidazolium-, Morpholinium- oder Pyrrolidinium-Kationen, wie in den zuvor stehenden zugehörigen Formeln und den zugehörigen Substituenten beschrieben. Diese zeigen in Verbindung mit den als bevorzugt oder besonders bevorzugt angegebenen Anionen eine besonders hohe Zellulaseaktivität der aus Aspergillus spec. isolierten Enzyme oder Proteingemische.Preferably, the cations of the ionic liquid are imidazolium, morpholinium or pyrrolidinium cations, as described in the preceding accompanying formulas and the associated substituents. These show, in conjunction with the anions indicated as preferred or particularly preferred, a particularly high cellulase activity of Aspergillus spec. isolated enzymes or protein mixtures.
Es können aber auch die Ionischen Flüssigkeiten Ammonium-, Phosphonium-, Imidazolium-, Morpholinium- oder Pyrrolidinium-Acetat, - Trifluoracetat, -Hydrogensulfat, -Alkylsulfat, -Alkylsulfonat, Perfluoralkylsulfonat, -Phosphat, -Hydrogenphosphat, -Alkylphosphat, - Alkyl- und Perfluoralkyl-phosphinat, -Alkyl- und Perfluoroalkyl-phosphonat oder -Perfluoralkylcarboxylat, mit Substituenten, wie zuvor beschrieben, für enzymatisch katalytische Verfahren genannt werden.However, it is also possible to use the ionic liquids ammonium, phosphonium, imidazolium, morpholinium or pyrrolidinium acetate, trifluoroacetate, hydrogensulfate, alkylsulfate, alkylsulfonate, perfluoroalkylsulfonate, phosphate, hydrogenphosphate, alkylphosphate, alkyl- and - Perfluoroalkyl phosphinate, alkyl and perfluoroalkyl phosphonate or perfluoroalkylcarboxylate, with substituents as described above, for enzymatically catalytic processes.
Ganz besonders bevorzugte Ionische Flüssigkeiten für das erfindungsgemäße Verfahren sind 1-Butyl-3-methylimidazolium ChloridVery particularly preferred ionic liquids for the process according to the invention are 1-butyl-3-methylimidazolium chloride
(BMIM Cl), 1-Butyl-3-methylimidazolium Trifluoromethansulfonat (BMIM OTF), 1-Butyl-2,3-dimethylimidazolium Chlorid (BMMIM CI), 1-Ethyl-3- methylimidazolium Trifluoracetat (EMIM ATF), 1-Butyl-1-methyl- pyrrolidinium Trifluormethansulfonat (BMPL OTF), 1-Allyl-3- methylimidazolium Chlorid (AMIM CI) oder 1-Ethyl-3-methylimidazolium Trifluoromethansulfonat (EMIM OTF), ganz besonders bevorzugt sind 1- Butyl-3-methylimidazolium Chlorid, 1-Ethyl-3-methylimidazolium(BMIM Cl), 1-butyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate (BMIM OTF), 1-butyl-2,3-dimethylimidazolium chloride (BMMIM CI), 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoroacetate (EMIM ATF), 1-butyl 1-methylpyrrolidinium trifluoromethanesulfonate (BMPL OTF), 1-allyl-3-methylimidazolium chloride (AMIM CI) or 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate (EMIM OTF), very particular preference is given to 1-butyl-3-methylimidazolium chloride, 1-ethyl-3-methylimidazolium
Trifluoracetat oder 1-Butyl-1-methylpyrrolidinium Trifluormethansulfonat.Trifluoroacetate or 1-butyl-1-methylpyrrolidinium trifluoromethanesulfonate.
Vorzugsweise können in den beschriebenen Ionischen Flüssigkeiten, Dioder Trisaccharide oder Polysaccharide oder es kann Polysaccharid- haltiges Material gelöst werden und mit dem aus Aspergillus spec. isolierten Enzym oder mit mindestens einer aus Aspergillus spec. isolierten Enzym- oder Proteinmischung enzymatisch in Saccharide- oder Polysaccharid-Gemische umgesetzt werden, die in biochemischen und/oder chemischen Prozessen verwendet werden. So können beispielsweise aus Zellulose mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Enzym-katalytisch effektiv im großen Umfang Ausgangsmaterialien für Arzneimittel und für die Feinchemie hergestellt werden. Es ist aber auch erstmals denkbar Enzym-katalytisch effektiv Bio-Kraftstoffe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus den beschriebenen Materialien zu gewinnen.Preferably, in the described ionic liquids, diioder trisaccharides or polysaccharides or polysaccharide-containing material can be dissolved and with the Aspergillus spec. isolated enzyme or with at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture are enzymatically converted into saccharide or polysaccharide mixtures, which are used in biochemical and / or chemical processes. Thus, for example, from cellulose with the method according to the invention enzyme-catalytically effective in a large extent starting materials for pharmaceuticals and fine chemicals can be produced. However, it is also conceivable for the first time to obtain enzyme-catalytically effective biofuels with the process according to the invention from the materials described.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung enthaltend a) mindestens eine Ionische Flüssigkeit und b) mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung. Die Ausführungen zu den als bevorzugt beschriebenen Ionischen Flüssigkeiten oder mit anderen Worten den möglichen Anion-Kation- Kombinationen, wie zuvor beschrieben, oder der bevorzugten Ausführungsform des isolierten Enzyms oder Enzym-Proteingemischs, gelten entsprechend auch für die Zusammensetzung. Besondere Kombinationen an Merkmalen für die Zusammensetzung sind in den Ansprüchen offenbart.Another object of the invention is a composition comprising a) at least one ionic liquid and b) at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture. The statements on the ionic liquids described as preferred or in other words the possible anion-cation combinations, as described above, or the preferred embodiment of the isolated enzyme or enzyme-protein mixture, apply correspondingly also to the composition. Particular combinations of features for the composition are disclosed in the claims.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines aus Aspergillus spec. isolierten Enzyms oder mindestens einer aus Aspergillus spec. isolierten Enzym- oder Proteinmischung zur Enzym-katalytischen Umsetzung von in Ionischer Flüssigkeit gelöstem Dioder Trisacchahd, gelöstem Polysaccharid, gelöstem Polysaccharid- haltigen Material oder gelösten Mischungen dieser Verbindungen.Another object of the invention is also the use of at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for enzyme-catalytic reaction of dissolved in ionic liquid Dioder Trisacchahd, dissolved polysaccharide, dissolved polysaccharide-containing material or dissolved mixtures of these compounds.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Kit, enthaltend eine Ionische Flüssigkeit oder mindestens eine Mischung aus Ionischen Flüssigkeiten und enthaltend mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung.Another object of the invention is also a kit containing an ionic liquid or at least a mixture of ionic liquids and containing at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture.
Bezüglich der Zusammensetzung enthaltend mindestens eine Ionische Flüssigkeit und mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung und bezüglich der beanspruchten Verwendung mindestens eines aus Aspergillus spec. isolierten Enzyms oder mindestens einer aus Aspergillus spec. isolierten Enzym- . oder Proteinmischung sowie in Bezug auf das beanspruchte Kit, wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die Ausführungen und die Vorteilsangaben zu dem beanspruchten Enzymkatalysierten Verfahren verwiesen. Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Beispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Verwendung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert, ohne die Lehre darauf einzuschränken.With regard to the composition containing at least one ionic liquid and at least one from Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture and with respect to the claimed use of at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme. or protein mixture, as well as with respect to the claimed kit, reference is made to the statements and the advantages of the claimed enzyme-catalyzed process to avoid repetition. There are now various possibilities for designing and developing the teaching of the present invention in an advantageous manner. For this purpose, on the one hand to the subordinate claims, on the other hand to refer to the following explanation of a preferred example of the method according to the invention and the use of the invention with reference to the drawings. In conjunction with the explanation of the preferred embodiment, generally preferred embodiments and further developments of the teaching are explained without restricting the teaching thereto.
Figurenbeschreibung In der Zeichnung zeigtDescription of the figures In the drawing shows
Fig. 1 in einer Grafik ein Ergebnis der spezifischen Aktivität von Enzymen (Zellulasen) aus Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich,1 is a graph showing a result of the specific activity of enzymes (cellulases) from Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich,
Germany; Artikelnummer C8546; 2008) nach Inkubationszeiten von 0h, 2h und 17h in verschiedenen Ionischen Flüssigkeiten gegen Kontrolle in Mclllvaine-Puffer undGermany; Article number C8546; 2008) after incubation times of 0h, 2h and 17h in various ionic liquids against control in Mclllvaine buffer and
Fig. 2 in einer Grafik ein Ergebnis der spezifischen Aktivität vonFig. 2 is a graph showing a result of the specific activity of
Enzymen (Zellulasen) aus Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich,Enzymes (cellulases) from Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich,
Germany; Artikelnummer C2605; 2008) nachGermany; Article number C2605; 2008)
Inkubationszeiten von 0h, 2h und 17h in verschiedenen Ionischen Flüssigkeiten gegen Kontrolle in Mclllvaine-Puffer.Incubation times of 0h, 2h and 17h in various ionic liquids against control in Mclllvaine buffer.
Figur 1 zeigt das Ergebnis eines DNSA-Referenz-Aktivitätstests des erfindungsgemäßen Verfahrens, allerdings unter Verwendung von Enzymen (Zellulasen) aus Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany; Artikelnummer C8546; 2008). MIP bezeichnet die Kontrolle in Mclllvaine- Puffer ohne Ionische Flüssigkeit. In der Kontrolle ist eine Reduzierung der Aktivität der Zellulasen um die Hälfte innerhalb von 2 h Inkubation erreicht. Danach (17 h Inkubation) sinkt die Zellulaseaktivität nicht mehr merklich ab. Im Gegensatz dazu, zeigen die in den Ionischen Lösungen IL1 (1-Butyl-3- methylimidazolium Chlorid = BMIM CI), IL2 (1-Butyl-3-methylimidazolium Trifluoromethansulfonat = BMIM OTF), IL4 (1-Butyl-2,3- dimethylimidazolium Chlorid = BMMIM CI), IL6 (1-Ethyl-3- methylimidazolium Trifluoracetat = EMIM ATF), IL7 (1-Butyl-1-methyl- pyrrolidinium Trifluormethansulfonat = BMPL OTF) und ILIO (1-Allyl-3- methylimidazolium Chlorid = AMIM Cl) gelösten Enzyme maximal noch bei Inkubation von Oh eine Aktivität der Zellulasen. In IL8 (1-Ethyl-3- methylimidazolium Trifluoromethansulfonat = EMIM OTF) ist eine geringe, aber gleichbleibende Aktivität, allerdings in einem Bereich von 0,1 bis 0,2 über alle Inkubationzeiträume zu ermitteln. Insbesondere die Messung für IL1 , bei der als Ionische Flüssigkeit BMIM CI verwendet wird, zeigt keine Aktivität. Das bedeutet, dass schon bei Zugabe von BMIM CI zu der Enzymmischung aus Trichoderma reesei alle Zellulasen durch die stark polare halogenhaltige Ionische Flüssigkeit inaktiviert werden.1 shows the result of a DNAA reference activity test of the method according to the invention, albeit using enzymes (cellulases) from Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany, article number C8546, 2008). MIP refers to the control in Mclllvaine buffer without ionic liquid. In the control, a reduction of the activity of the cellulases is achieved by half within 2 h of incubation. Afterwards (17 h incubation), the cellulase activity no longer decreases noticeably. In contrast, in the ionic solutions IL1 (1-butyl-3-methylimidazolium chloride = BMIM CI), IL2 (1-butyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate = BMIM OTF), IL4 (1-butyl-2,3- dimethylimidazolium chloride = BMMIM CI), IL6 (1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoroacetate = EMIM ATF), IL7 (1-butyl-1-methylpyrrolidinium trifluoromethanesulfonate = BMPL OTF) and ILIO (1-allyl-3-methylimidazolium chloride AMIM Cl) enzymes maximally still on incubation of Oh an activity of Zellulasen. In IL8 (1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate = EMIM OTF) is a low but consistent activity, but to be found in a range of 0.1 to 0.2 over all incubation periods. In particular, the measurement for IL1, which uses BMIM CI as the ionic liquid, shows no activity. This means that even with the addition of BMIM CI to the enzyme mixture from Trichoderma reesei all cellulases are inactivated by the highly polar halogen-containing ionic liquid.
Figur 2 zeigt das Ergebnis eines DNSA-Aktivitätstests des erfindungsgemäßen Verfahrens, unter Verwendung von Enzymen (Zellulasen) aus Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany; Artikelnummer C2605; 2008). MIP zeigt die Kontrolle in Mclllvaine-Puffer ohne Ionische Flüssigkeit. In der Kontrolle ist eine Reduzierung der Aktivität der Zellulasen auf 2 Drittel innerhalb von 2 h Inkubation erreicht. Danach (17 h Inkubation) sinkt die Zellulaseaktivität knapp auf die Hälfte gemessen an dem Ausgangswert 0h. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Enzymaktivität zu den aus Trichoderma reesei isolierten Enzymen (s. Figur 1) zeigen die Enzyme aus Aspergillus spec. in allen Ionischen Flüssigkeiten IL1 , IL2, IL4, IL6, IL7, und IL8 nach allen Inkubationszeiten (Oh, 2h und 17h) spezifische Aktivität, die sogar im Schnitt höher als die für die Kontrolle gemessene spezifische Aktivität liegt, mit Ausnahme von IL10. Figur 2 zeigt demnach, dass durch Zugabe von Ionischen Flüssigkeiten die spezifische Enzymaktivität, der aus Aspergillus spec. isolierten Enzyme, nicht nennenswert sinkt.Figure 2 shows the result of a DNSA activity test of the method according to the invention, using enzymes (cellulases) from Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany, article number C2605, 2008). MIP shows control in Mclllvaine buffer without ionic liquid. In the control, a reduction of the activity of the cellulases to 2-thirds within 2 h of incubation is achieved. Thereafter (17 h incubation) the cellulase activity drops to just under half measured at the initial value 0 h. In contrast to the results of enzyme activity on the enzymes isolated from Trichoderma reesei (see Figure 1), the enzymes from Aspergillus spec. specific activity in all ionic liquids IL1, IL2, IL4, IL6, IL7, and IL8 after all incubation times (Oh, 2h and 17h), even higher than the specific activity measured for the control, except for IL10. FIG. 2 therefore shows that the addition of ionic liquids causes the specific Enzyme activity derived from Aspergillus spec. isolated enzymes, not appreciably decreases.
Das nachfolgende Ausführungsbeispiel zeigt die Versuchsanordnung für die DNSA-Aktivitätstests.The following embodiment shows the experimental setup for the DNAA activity tests.
Beispielexample
Herstellung/Verdünnung Zellulase-GemischPreparation / dilution of cellulase mixture
Für die Aktivitätstests wird je ein Zellulase-Gemisch aus Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany; Artikelnummer C8546; 2008) und Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany; Artikelnummer C2605; 2008) 1 :1000 mit 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0, verdünnt. Für jeden Messansatz bei den DNSA-Tests werden 100μl der 1 :1000 Verdünnung eingesetzt.For the activity tests, a cellulase mixture of Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany, article number C8546, 2008) and Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany, article number C2605, 2008) diluted 1: 1000 with 50 mM Tris buffer, pH 8.0. For each measurement in the DNSA tests, 100 μl of the 1: 1000 dilution are used.
Das Zellulase-Gemisch aus Aspergillus spec. besteht hauptsächlich aus verschiedenen aus Aspergillus spec. isolierten Enzymen, mit folgenden Aktivitäten: ß-1 ,4-Glycosylhydrolase (5 - 70 %), ß-1 ,3-Glycosylhydrolase (5 - 30 %) und ß-1 ,6-Glycosylhydrolase (5 - 30 %). Diese Aktivitäten werden mithilfe des DNSA-Tests nach Bergemeyer, 1974, mod., wie später beschrieben, bestimmt.The cellulase mixture from Aspergillus spec. consists mainly of different from Aspergillus spec. isolated enzymes, with the following activities: ß-1, 4-Glycosylhydrolase (5-70%), ß-1, 3-Glycosylhydrolase (5 - 30%) and ß-1, 6-Glycosylhydrolase (5 - 30%). These activities are determined by the DNSA test according to Bergemeyer, 1974, mod., As described later.
Herstellung CM-Komplett AgarManufacturing CM-Complete Agar
CM-Komplett Agar nach Leach et. AI. J. Gen. Microbiol., 10982 wird hergestellt ausCM complete agar according to Leach et. AI. J. Gen. Microbiol., 10982 is made from
10 ml Lösung A (100g/L Ca(NO3)2 x 4 H2O, sterilfiltriert), 10 ml Lösung B (20 g/L KH2PO4; 25 g/L MgSO4 x 7H2O und 15 g/L NaCI, pH 5,3; sterilfiltriert), 50 ml Yeast-Casein-Mix für CM-Komplett Agar (1 g Yeastextrakt; 0,5 g saures hydrolysiertes Casein; 0,5 g enzymatisch hydrolysiertes Casein; ad 50 ml H2Odest), 50 ml Glucose-Lösung (10 g Glucose in 50 ml H2Odest; sterilfiltriert), 1 ml MNS (60 mg/L H3BO3; 390 mg/L CuSO4 x 5 H2O; 13 mg/L Kl; 60 mg/L MnSO4 x H2O; 51 mg/L (NH4)6MO7O24 x 4 H2O; 5,48 g/L ZnSO4 x H2O und 932 mg/L FeCI3 x 6 H2O. Die Lösung wird durch Zugabe von 2 ml Chloroform sterilisiert. 15 mg Agar und 900 ml H2O werden zu der Lösung gegeben.10 ml solution A (100 g / L Ca (NO 3 ) 2 × 4 H 2 O, sterile filtered), 10 ml solution B (20 g / L KH 2 PO 4 , 25 g / L MgSO 4 × 7H 2 O and 15 g / L NaCl, pH 5.3, sterile filtered), 50 ml Yeast-Casein mix for complete CM agar (1 g yeast extract, 0.5 g acid hydrolyzed casein, 0.5 g enzymatically hydrolyzed casein, ad 50 ml H 2 O d e st ), 50 ml of glucose solution (10 g of glucose in 50 ml of H 2 O dest , sterile-filtered), 1 ml of MNS (60 mg / LH 3 BO 3 , 390 mg / L CuSO 4 × 5 H 2 O; 13 mg / L Kl; 60 mg / L MnSO 4 × H 2 O; 51 mg / L (NH 4 ) 6 MO 7 O 24 x 4 H 2 O; 5.48 g / L ZnSO 4 × H 2 O and 932 mg / L FeCl 3 × 6 H 2 O. The solution is sterilized by adding 2 ml of chloroform. 15 mg agar and 900 ml H 2 O are added to the solution.
Herstellung Glucose-Rich-MediumProduction of glucose-rich medium
Glucose-Rich-Medium wird aus 1 Gew.-% Glucose; 0,05 Gew.-% Hefeextrakt und 1 x Hefe Stickstoffbasen w/AA hergestellt.Glucose rich medium is made up of 1% by weight of glucose; 0.05 wt% yeast extract and 1 x yeast nitrogen bases w / AA.
Herstellung Salz-Minimal-MediumPreparation of salt-minimal medium
Für die Induktionskultur wird ein Salz-Minimal-Medium aus 10 ml Salzlösung (300g NaNO3; 50 g KCl; 50 g MgSo4 x 7 H2O; 1g FeSO4 x 7 H2O; mit H2Odest auf 1 Liter aufgefüllt mit 0,5 g K2HPO4; 5 g Cellulose mit H2O auf 50 ml aufgefüllt, hergestellt.For the induction culture, add a minimum of salt to 10 ml of brine (300 g NaNO 3 , 50 g KCl, 50 g MgSO 4 .7H 2 O, 1 g FeSO 4 .7H 2 O, with H 2 O dest to 1 liter made up with 0.5 g K 2 HPO 4 , 5 g cellulose with H 2 O made up to 50 ml.
Isolierung des Zellulasen-Gemisches aus Aspergillus spec. und eines Zellulasen-Gemisches aus Trichoderma reesei als ReferenzgemischIsolation of the cellulase mixture from Aspergillus spec. and a cellulase mixture of Trichoderma reesei as a reference mixture
Für den Aktivitätstest werden Pilz-Überstände hergestellt. CM-Komplett Agarplatten werden mit Aspergillus spec. (Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger) bzw. Trichoderma reesei beimpft. Nach Bewachsen der Agarplatten, werden kleine Agarstücke aus der Agarplatte gestanzt. Die Agarstücke werden jeweils mit 50 ml Glucose-Rich-Medium beimpft und bei 28 0C und 150 rpm über 3 Tage inkubiert. An die Inkubation schließt sich ein Zentrifugationsschritt bei Raumtemperatur und 5000 rpm an. Das bei dem Zentrifugationsschritt entstehende Pellet wird 3 x mit H2Odest gewaschen. Mit dem gewaschenen Pellet wird eine Induktionskultur angesetzt, wofür das Pellet zunächst in 50 ml Salz- Minimalmedium resuspendiert wird und die entstehende Flüssigkultur bei 28 0C und 150 rpm über 1 Tag inkubiert. Es folgt die Abzentrifugation dieser Kultur bei Raumtemperatur und 5000 rpm. Der Zentrifugationsüberstand (PiIz- Überstände) dient der Durchführung der Aktivitätstests (DNSA Tests).Mushroom supernatants are prepared for the activity test. Complete CM agar plates are labeled with Aspergillus spec. (Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger) or Trichoderma reesei. After growing on the agar plates, small agar pieces are punched out of the agar plate. The agar pieces are each inoculated with 50 ml of glucose rich medium and incubated at 28 0 C and 150 rpm for 3 days. The incubation is followed by a centrifugation step at room temperature and 5000 rpm. The pellet produced during the centrifugation step is washed 3 times with H 2 O de st. With the washed pellet, an induction culture is set, for which the pellet is first resuspended in 50 ml of salt minimal medium and the resulting liquid culture incubated at 28 0 C and 150 rpm for 1 day. This is followed by the centrifugation of this culture Room temperature and 5000 rpm. The centrifugation supernatant (PiIz supernatants) is used to carry out the activity tests (DNSA tests).
Bestimmung der cellulolytischen Aktivitäten der Pilz-GemischeDetermination of Cellulolytic Activities of Mushroom Mixtures
Die cellulolytischen Aktivitäten der Zenrtrifugationsüberstände der PiIz- Cellulasen-Gemische werden mittels DNSA Tests nach Bergemeyer, 1974; mod. bestimmt. Eine DNSA-Lösung (10 g 3,5-Dinitrosalicylsäure; 10 g NaOH; 200 g Kalium-Natirum-Tatrat; 0,5 g Na2So3 und 2g Phenol, aufgefüllt mit H2Odest) ; Mclllvaine Puffer (0,2 M Na2HPO4 mit 0,1 M Zitronensäure auf einen pH von 6,5 eingestellt) und eine Carboxymethylcellulose-Lösung (2 % Carboxymethylcellulose durch Aufkochen in H2Odest gelöst) werden hergestellt. Zur Erstellung einer Eichgrade wird 10 mM Glucose-Lösung (10 mM Glucose in H2Odest) verwendet. Die Eichgrade wird in Mclllvaine Puffer und in allen verwendeten ionischen Flüssigkeiten angefertigt. Dazu werden für die Leerwerte folgende Mischungen wie gemischt: 150 μl Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit und 350 μl H2Odest- Für die Messwerte der Eichgrade werden entsprechend 150 μl Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit und 0,2 μM, 0,4 μM, 0,6 μM, 0,8 μM, 1 ,0 μM, 1 ,2 μM, 1 ,4μM bzw. 1 ,6 μM Glucose- Lösung jeweils auf 500 μl mit H2O aufgefüllt. Für jede Konzentration erfolgt eine Doppelbestimmung. Zu den Ansätzen für die Messwerte werden jeweils 750 μl DNSA-Lösung gegeben und bei 100 0C für 15 min inkubiert. Nach der Inkubation werden die Ansätze mit Eis gekühlt gefolgt von einem Zentrifugationsschritt mit 13000 rpm bei Raumtemperatur und gefolgt von der Extinktion bei 546 nm gegen die Leerwerte.The cellulolytic activities of the centrifugation supernatants of the PiIz cellulase mixtures are determined by DNSA tests according to Bergemeyer, 1974; mod. certainly. A DNSA solution (10 g of 3,5-dinitrosalicylic acid, 10 g of NaOH, 200 g of potassium Natirum Tatrat, 0.5 g of Na 2 SO 3 and 2 g of phenol, made up with H 2 O de st); Mclllvaine buffer (0.2 M Na 2 HPO 4 adjusted to pH 6.5 with 0.1 M citric acid) and a carboxymethyl cellulose solution (2% carboxymethylcellulose dissolved by boiling in H 2 Odest) are prepared. To establish a calibration level, 10 mM glucose solution (10 mM glucose in H 2 O of t) is used. Calibration degrees are prepared in Mclllvaine buffer and in all ionic liquids used. For the blank values, the following mixtures are mixed as follows: 150 μl buffer or 150 μl ionic liquid and 350 μl H 2 O dest . For the measurement values of the calibration degrees, respectively 150 μl buffer and 150 μl ionic liquid and 0.2 μM, 0 , 4 μM, 0.6 μM, 0.8 μM, 1, 0 μM, 1, 2 μM, 1, 4 μM or 1, 6 μM glucose solution each filled to 500 μL with H 2 O. For each concentration, a double determination is made. To the batches for the measured values in each case 750 .mu.l DNAA solution are added and incubated at 100 0 C for 15 min. After incubation, the batches are cooled with ice followed by a centrifugation step at 13000 rpm at room temperature and followed by absorbance at 546 nm against blank.
Für die Messung der cellulolytischen Aktivität der Pilz-Überstände werden jeweils 150 μl Mclllvaine Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit mit 250 μl Carboxymethylcellulose-Lösung und 100 μl Pilz-Überstand gemischt. Für sämtliche Proben werden Doppelbestimmungen durchgeführt. Für den Leerwert werden 150 μl Mclllvaine Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit mit 250 μl Carboxymethylcellulose-Lösung mit 100 μl H2Odest angesetzt. Die Ansätze werden bei 37 0C für 30 min inkubiert, mit 750 μl DNSA-Lösung versetzt und bei 100 0C für weitere 15 min inkubiert. Nach der Inkubation werden die Ansätze auf Eis gekühlt und mit 13000 rpm für 2 min zentrifugiert und die Extinktion gegen die Leerwerte bei 546 nm gemessen.To measure the cellulolytic activity of the fungal supernatants, 150 μl each of Mclllvaine buffer or 150 μl of ionic liquid are mixed with 250 μl of carboxymethylcellulose solution and 100 μl of fungal supernatant. For all samples duplicate determinations are carried out. For the blank, 150 μl of Mclllvaine buffer or 150 μl of ionic liquid with 250 .mu.l of carboxymethylcellulose solution with 100 .mu.l of H 2 O least . The mixtures are incubated at 37 ° C. for 30 min, treated with 750 μl of DNSA solution and incubated at 100 ° C. for a further 15 min. After incubation, the batches are cooled on ice and centrifuged at 13,000 rpm for 2 min and the absorbance against blank values measured at 546 nm.
Kolorimetrische MessungColorimetric measurement
Die Cellulose wird durch die in den Pilz-Überständen enthaltenden Cellulasen zu Bruchstücken hydrolysiert, deren reduzierendeThe cellulose is hydrolyzed by the cellulases contained in the mushroom supernatants into fragments whose reducing
Hemiacetalgruppen mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (gelb) bei 100 0C braunroteHemiacetal with 3,5-dinitrosalicylic acid (yellow) at 100 0 C red-brown
3-Amino-5-Nitrosalicylsäure bilden. Der Farbumschlag lässt sich bei 546 nm bestimmen. Die bei der Umsetzung gebildete Menge 3-Amino-5-Form 3-amino-5-nitrosalicylic acid. The color change can be determined at 546 nm. The amount of 3-amino-5 formed in the reaction
Nitrosalicylsäure bzw. die gemessene Extinktion bei 546 nm ist äquimolar zu der Anzahl der reduzierenden Hemiacetalgruppen.Nitrosalicylic acid or the measured absorbance at 546 nm is equimolar to the number of reducing hemiacetal groups.
Übernacht InkubationsansatzOvernight incubation approach
150 μl Mclllvaine Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit werden mit 100 μl Pilz-Überstand versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die Ansätze mit 250 μl Carboxymethylcellulose versetzt und die Restaktivität wie oben beschrieben durch Extinktion bei 546 nm gemessen.150 μl of Mclllvaine buffer or 150 μl of ionic liquid are mixed with 100 μl of fungal supernatant and incubated overnight at room temperature. After incubation, 250 μl of carboxymethylcellulose are added to the batches and the residual activity is measured by extinction at 546 nm as described above.
Bestimmung des Proteingehalts der Pilz-GemischeDetermination of the protein content of the mushroom mixtures
Die Proteinbestimmung der Pilz-Überstände erfolgt nach Bradford mit Roti- Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) nach Angaben des Herstellers. The protein determination of the mushroom supernatants is carried out according to Bradford with Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) according to the manufacturer.

Claims

Patentansprüche claims
1. Enzym-katalysiertes Verfahren in Anwesenheit mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als Lösungsmittel, wobei mindestens ein aus1. enzyme-catalyzed process in the presence of at least one ionic liquid as solvent, wherein at least one of
Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung zur Enzym-katalytischenAspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for enzyme-catalytic
Umsetzung eines im Lösungsmittel gelösten Stoffes verwendet wird.Implementation of a substance dissolved in the solvent is used.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel eine Mischung aus Ionischen Flüssigkeiten verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a mixture of ionic liquids is used as the solvent.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anion der mindestens einen Ionischen Flüssigkeit oder mindestens ein Anion einer Ionischen Flüssigkeit der Mischung ausgewählt wird aus der Gruppe Halogenid, [RFSO3]", [Alkyl-SO3]~, [Alkyl-OSOa]', [Alkyl-C(O)O]-, [RFC(O)O]-, wobei RF die Bedeutung fluoriertes Alkyl3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the anion of the at least one ionic liquid or at least one anion of an ionic liquid of the mixture is selected from the group halide, [RFSO 3 ] " , [alkyl-SO 3 ] ~ , [Alkyl-OSOa] ' , [alkyl-C (O) O] -, [R F C (O) O] -, where R F is fluorinated alkyl
(CmF2m-x+iHx) mit m = 1-12 und x = 0- 7 hat, wobei für m = 1 x = 0 bis 2 sein soll, Alkyl eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C- Atomen bedeutet.(C m F 2m-x + iH x ) with m = 1-12 and x = 0- 7, where for m = 1 x = 0 to 2, alkyl is a straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 20 carbon atoms means.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der gelöste Stoff ausgewählt wird aus mindestens einem Di- oder Trisacchahd, einem Polysaccharid, einem Polysaccharid-haltigen Material oder Mischungen dieser Verbindungen. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the solute is selected from at least one di- or Trisacchahd, a polysaccharide, a polysaccharide-containing material or mixtures of these compounds.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der gelöste Stoff ausgewählt wird aus Zellulose, modifizierter Zellulose oder einem Zellulose-haltigem Material.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the solute is selected from cellulose, modified cellulose or a cellulose-containing material.
cc
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein cellulolytisch aktives Enzym aus Aspergillus spec. oder ein Enzym- oder Proteingemisch, enthaltend mindestens ein cellulolytisch aktives Enzym aus Aspergillus spec, verwendet wird.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that at least one cellulolytically active enzyme from Aspergillus spec. or an enzyme or protein mixture containing at least one cellulolytic active enzyme from Aspergillus spec.
1010
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als cellulolytisch aktives Enzym mindestens eine Zellulase verwendet wird.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that as cellulolytically active enzyme at least one cellulase is used.
^ c c
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Zellulase, die in dem Enzym- oder Proteingemisch enthalten ist, in einer Menge, die durch das Verhältnis zur Gesamtmenge des Enzym- oder Proteingemisches zu der Menge des Enzyms bestimmt wird, von 0,1 % bis 99 % eingesetzt wird.8. The method according to claim 7, characterized in that the at least one cellulase, which is contained in the enzyme or protein mixture, in an amount which is determined by the ratio to the total amount of the enzyme or protein mixture to the amount of the enzyme of 0.1% to 99% is used.
2020
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionischen Flüssigkeit oder der Mischung enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit Wasser zugegeben wird.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the ionic liquid or the mixture containing at least one ionic liquid is added to water.
2525
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionischen Flüssigkeit oder der Mischung enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit kein Wasser zugegeben wird.10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the ionic liquid or the mixture containing at least one ionic liquid, no water is added.
3030
11. Zusammensetzung enthaltend a) mindestens eine Ionische Flüssigkeit und b) mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung.11. A composition comprising a) at least one ionic liquid and b) at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Anion der mindestens eine Ionischen Flüssigkeit ausgewählt wird aus der Gruppe Halogenid, [RFSO3]', [Alkyl-SO3]~, [Alkyl-OSO3]',12. The composition according to claim 11, characterized in that the anion of the at least one ionic liquid is selected from the group halide, [R F SO 3 ] ' , [alkyl-SO 3 ] ~ , [alkyl-OSO 3 ] ' ,
[Alkyl-C(O)O]-, [RFC(O)O]", wobei[Alkyl-C (O) O] -, [RFC (O) O] "where
RF die Bedeutung fluoriertes Alkyl
Figure imgf000034_0001
mit m = 1-12 und x = 0- 7 hat, wobei für m = 1 x = 0 bis 2 sein soll undRF meaning fluorinated alkyl
Figure imgf000034_0001
with m = 1-12 and x = 0- 7, where for m = 1 x = 0 to 2 and should be
Alkyl eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C-Alkyl is a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 20 C
Atomen bedeutet.Atoms means.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, die mindestens ein cellulolytisch aktives Enzym aus Aspergillus spec. oder ein Enzymoder Proteingemisch, enthaltend mindestens ein cellulolytisch aktives Enzym aus Aspergillus spec. enthält.13. The composition of claim 11 or 12, which comprises at least one cellulolytically active enzyme from Aspergillus spec. or an enzyme or protein mixture containing at least one cellulolytically active enzyme from Aspergillus spec. contains.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das cellulolytisch aktive Enzym mindestens eine Zellulase oder ein Gemisch von Zellulasen ist.14. The composition according to claim 13, characterized in that the cellulolytically active enzyme is at least one cellulase or a mixture of cellulases.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Zellulase, die in dem Enzym- oderComposition according to Claim 14, characterized in that the at least one cellulase present in the enzyme or
Proteingemisch enthalten ist, in einer Menge von 0,1 % bis 99 % einsetzbar ist, die durch das Verhältnis zur Gesamtmenge des Enzym- oder Proteingemisches zu der Menge des Enzyms bestimmt ist.Protein mixture is used in an amount of 0.1% to 99%, which is determined by the ratio of the total amount of the enzyme or protein mixture to the amount of the enzyme.
16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, enthaltend c) Wasser. 16. The composition according to any one of claims 11 to 15, comprising c) water.
17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 16 ohne Zusatz von Wasser.17. The composition according to any one of claims 11 to 16 without the addition of water.
18. Verwendung mindestens eines aus Aspergillus spec. isolierten18. Use of at least one of Aspergillus spec. isolated
Enzyms oder mindestens einer aus Aspergillus spec. isolierten Enzym- oder Proteinmischung zur Enzym-katalytischen Umsetzung von in Ionischer Flüssigkeit gelöstem Di- oder Trisaccharid, gelöstem Polysaccharid, gelöstem Polysaccharid-haltigen Material oder gelösten Mischungen dieser Verbindungen.Enzyme or at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture for the enzyme-catalytic reaction of dissolved in ionic liquid di- or trisaccharide, dissolved polysaccharide, dissolved polysaccharide-containing material or dissolved mixtures of these compounds.
19. Kit, enthaltend mindestens eine Ionische Flüssigkeit oder mindestens eine Mischung aus Ionischen Flüssigkeiten und enthaltend mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung. 19. Kit comprising at least one ionic liquid or at least one mixture of ionic liquids and containing at least one of Aspergillus spec. isolated enzyme or one from Aspergillus spec. isolated enzyme or protein mixture.
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