WO2010040872A1 - Método para determinar la contribución de la biomasa a la dqo - Google Patents

Método para determinar la contribución de la biomasa a la dqo Download PDF

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WO2010040872A1 PCT/ES2009/000488 ES2009000488W WO2010040872A1 WO 2010040872 A1 WO2010040872 A1 WO 2010040872A1 ES 2009000488 W ES2009000488 W ES 2009000488W WO 2010040872 A1 WO2010040872 A1 WO 2010040872A1
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bacteria
bacterial
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inert
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Jose Luis Alonso Molina
Luís BORRÁS FALOMIR
José FERRER POLO
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Universidad Politecnica de Valencia
Universitat de Valencia
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Universidad Politecnica de Valencia
Universitat de Valencia
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G01N33/1806—Biological oxygen demand [BOD] or chemical oxygen demand [COD]
    • G—PHYSICS
    • G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
    • G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
    • G09B25/00—Models for purposes not provided for in G09B23/00, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
    • G09B25/02—Models for purposes not provided for in G09B23/00, e.g. full-sized devices for demonstration purposes of industrial processes; of machinery

Definitions

  • the method comprises the application of molecular microbiological techniques of in situ hybridization (FISH), staining with DAPI and cell viability, to determine the contribution to the chemical oxygen demand (COD), of the specific groups of bacteria present in purification processes Biological wastewater (heterotrophic, autotrophic bacteria and polyphosphate accumulating bacteria, PAO).
  • FISH in situ hybridization
  • COD chemical oxygen demand
  • This method allows to carry out the calibration of the mathematical methods of activated sludge in a direct way, and without the need to resort to an optimization of the results, thus reducing the uncertainty when finding the calibration parameters for a given system of wastewater treatment.
  • the main objectives in the operation of wastewater treatment plants are compliance with the discharge limits set by the legislation and the minimization of energy consumption. This implies the correct design of the current wastewater treatment plants and, in many cases, the increased performance of many of the wastewater treatment plants already built to adapt them to current needs.
  • the large number of factors that influence the operation of these processes makes an exhaustive study of each case necessary, taking into account both the characteristics of the wastewater to be treated and the type of purification process for which the sewage treatment plant has been designed. sewage water. This type of studies allows diagnosing the operation of existing plants and optimizing their operation, adapting the purification process to the tributary wastewater.
  • the conversion of microbiological data into usable data in biological process models is one of the weak points that have traditionally been associated with these models. This obstacle is overcome by the proposed invention.
  • the developed technique allows to quantify precisely the microorganisms of importance in these processes and the parameters that must be completed in the mathematical models to perform an analysis of the process with a mathematical simulator, and therefore, be able to act on problems in the Biological processes of treatment plants with a rush of time that until now was not available.
  • the present invention provides a method that, through the combination of chemical analysis and molecular microbiological methods, allows obtaining, in a direct way, the contribution to the COD, of each of the bacterial groups that take into account mathematical models cited. By this method, uncertainty in the calculation of parameters is reduced, and the need to use optimization methods to obtain them is avoided. This methodology has been developed and validated in activated sludge systems with elimination Biological phosphorus.
  • the method of the present invention comprises the application of molecular microbiological techniques of in situ hybridization (FISH), DAPI staining and cell viability tests, to determine the contribution to the chemical oxygen demand (COD), of the specific groups of Bacteria present in processes of biological purification of wastewater (heterotrophic, autotrophic bacteria and polyphosphate accumulating bacteria, PAO) mainly.
  • FISH in situ hybridization
  • COD chemical oxygen demand
  • the method combines conventional chemical COD analyzes and microbiological techniques. This method allows to carry out the calibration of the mathematical methods of activated sludge in a direct way, and without the need to resort to an optimization of the results, thus reducing the uncertainty when finding the calibration parameters for a given system of wastewater treatment.
  • the present invention has a clear objective with a great interest of application: the development of a method for the estimation of bacterial populations with interest in the processes of biological wastewater treatment, and its parameterization so that it can be used in the models Mathematicians who are typically used to design these processes and to analyze their functioning.
  • These types of biological processes are the most complemented in the treatment of urban wastewater (Wastewater Treatment Plants, WWTP), even though knowledge about their operation continues to have important gaps, especially in what refers to The dynamics of microbial populations, of vital importance when justifying the operational results of the WWTP.
  • Mathematical models capable of simulating and predicting operating situations in wastewater treatment plants are highly widespread. These models are very useful, but their main drawback lies in the large number of parameters to be calibrated with real tests. Some of these parameters cannot be analytically calibrated. For example, it will not be possible to determine Ia amount of phosphorus eliminating biomass, XPAO, because it is not possible to perform a laboratory test completely inhibiting the rest of bacteria.
  • a method capable of quantifying the different microbial populations is described by combining molecular techniques such as DAPI staining, and in situ hybridization, FISH, with which the percentage in area (or volume or mass) of bacteria can be obtained of a specific type in the biomass of a reactor. Through the use of various techniques, it will be possible to convert these mass percentages of specific bacteria content into COD units per milliliter, units used mostly in mathematical models of active sludge.
  • the proposed method represents an important improvement in the certainty of the calibration process of the mathematical model, since the number of unknown variables is reduced to the point that it is not necessary to optimize the errors of the mathematical solutions, but it can be done a direct calculation of the model parameters. This avoids obtaining results that may make mathematical but not biological sense.
  • All the bacteria present in the wastewater treatment systems can be identified by means of the in situ hybridization technique (FISH).
  • FISH in situ hybridization technique
  • all bacterial groups heterotrophic, autotrophic bacteria and polyphosphate accumulating bacteria, PAO
  • PAO polyphosphate accumulating bacteria
  • the main aspect of the present invention is a method for determining the contribution of biomass to the COD balance in water comprising: a. get a sample of water, b. determine the percentages of the bacterial groups and inert matter of the sample obtained in (a) by molecular microbiological techniques, c. determine the following parameters of the water sample obtained in (a); Total COD (COD T ), soluble COD (DQOSOL), suspended COD (CODssp), total limit BOD (BOD LT ), soluble BOD limit (BOD L SOL), solids retention time
  • biomass refers to the total matter of microorganisms present in a water sample. These microorganisms may be viable or non-viable.
  • int matter refers to the non-viable bacteria of the water sample.
  • the determination of the percentages of the bacterial groups and inert matter of the water sample is carried out by molecular microbiological techniques.
  • the present invention is based on the identification of the groups bacterial by the use of molecular biology techniques.
  • the molecular biology techniques that can be carried out should allow the obtaining of data and / or images by means of which the representation of the different bacterial groups can be estimated.
  • traditional culture techniques and / or molecular biology techniques can be used for this, such as marking with specific probes coupled to fluorophores (FISH technique; Fluorescence In Situ Hybridization), marking with 4,6-diamidino-2-phenylindole ( DAPI), detection by antibodies, PCR, DNA sequencing, optical microscopy, epifluorescence or confocal without excluding other molecular biology techniques that allow identifying and determining the percentage of bacterial groups in a water sample. If you proceed to obtain images, your analysis can be carried out by any manual or computerized procedure that allows you to calculate the areas occupied by each of the bacterial groups that you want to determine.
  • the determination of the total COD (COD T ), soluble COD (CODOSOL), suspended COD (COD S U S P), total limit BOD (BOD LT ), soluble BOD limit (BOD L SO L), can be carried out according to the Standard methods forthe examination of water and wastewater or by any other analytical technique that allows its determination.
  • the solids retention time (SRT) and hydraulic resistance time (HRT) can be calculated by.
  • the SS are analyzed according to the Standard methods for the examination of water and wastewater, section 2540 D.
  • COD balance refers to all COD generated in the aquatic system.
  • the COD value may increase by a new water supply, remain unchanged, increase inside the activated sludge reactor or decrease.
  • the COD balance is the study of the factors involved in the purification process, carried out by the different groups of bacteria, to try to predict its evolution.
  • the determination of the COD balance of step (d) and the determination of the contribution of each bacterial group and inert matter to the COD balance are carried out by means of an equation comprising,
  • the parameters XH, XA and XPAO represent the COD due to the presence of heterotrophic, autotrophic and PAO bacteria, respectively.
  • the parameter X represents the inert suspended matter (also in COD units), mainly due to the death of heterotrophic, autotrophic and PAO bacteria.
  • the parameter Xio- (SRTYH RT) refers to the inert suspended matter that enters with the water flowing into the reactor of the purification system.
  • the DQOSU S P, SRT and HRT parameters are calculated as described above.
  • water entering a system is meant the tributary or incoming water to a system in which a water purification process is carried out (for example in a reactor of wastewater treatment facilities).
  • Xio is the amount of suspended inert matter that enters with the tributary water into the system. This parameter can be calculated, according to the traditional procedure, from the total COD (COD T ), soluble COD (COD SO L), total limit BOD (BOD L ⁇ ) and soluble limit BOD (BOD L SOL) according to the following equation:
  • XH, XA and XPA O represent the COD due to the presence of heterotrophic, autotrophic, ODP and suspended inert matter, respectively.
  • Xi 0 is the COD due to the inert suspended matter provided by the water entering a system.
  • parameters can be introduced, for example, the COD due to GAO bacteria (glycogen accumulating bacteria).
  • the water sample is wastewater.
  • wastewater refers to a type of water that, having been used, is contaminated with fecal substances and urine, from human or animal organic wastes, industrial discharges or other types of contaminants.
  • the wastewater comes from the entrance to an installation where wastewater treatment is carried out based on an activated sludge system.
  • the water must come from the entrance (tributary water) to the activated sludge process.
  • the different parameters that are analyzed in the present invention require samples of water of different origin, thus, for example, the sample from which the Xio is obtained is tributary wastewater. On this one they are realized the analytics described for obtaining parameter Xi 0 .
  • the systems of activated sludge or active sludge consist of an aeration tank with active sludge and another tank for secondary clarification.
  • the tributary wastewater enters the aeration tank.
  • the clear water of the surface of this tank passes to the secondary clarification tank.
  • Most of the sludge that has settled in the secondary clarification tank returns to the aeration tank thus ensuring a continuous process of biological purification with high rates of decomposition of organic matter (up to 99%).
  • the biological purification of wastewater in activated sludge systems is carried out by microorganisms (mainly bacteria), which break down the organic components of wastewater.
  • the most widely used aerators in this type of purification systems are submersibles and are responsible for supplying oxygen to favor the purifying action of aerobic bacteria.
  • the determination of the percentages of bacterial groups and inert matter comprises: a. mark the bacteria in the sample using FISH techniques, DAPI staining and cell viability techniques, b. Acquire images of the fluorescence emitted by the bacteria marked with the techniques described in (a) and c. determine the areas occupied by bacterial groups and inert matter.
  • the bacterial screening by FISH techniques is carried out with the probes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, with the probes SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 5 and with the probes SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 8.
  • DNA probes labeled with a fluorophore are used to detect the different groups of bacteria.
  • the DNA probes used are specific sequences of autotrophic bacteria in the case of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (of ammonia oxidizing Betaproteobacteria and Nitrobacter spp respectively), of bacteria from the Eubacteria domain in the case of SEQ ID NO : 3 to SEQ ID NO: 5 (primer with consensus sequences of most eubacteria, Planctomycetales and Verrucomicrobials respectively) and polyphosphate accumulating bacteria (PAO) in the case of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (from Rhizophagus tenuis, Accumulibacter phosphatis and Rhizophagus tenuis respectively).
  • PEO polyphosphate accumulating bacteria
  • FISH Fluorescent In situ hybridization
  • probes single-stranded DNA sequences, called probes, that are complementary to the DNA sequences that you want to mark and examine.
  • probes are labeled with fluorescent molecules (TAMRA; tetramethyl-rhodamine, fluorescein, or other fluorescent molecules).
  • TAMRA fluorescent molecules
  • the probes hybridize to the complementary DNA and, being labeled with fluorescent molecules, allow to locate the bacteria to which these specific sequences belong.
  • the fluorophore emits a specific wavelength that allows, by using a fluorescence microscope with the appropriate filters, to detect the labeled cells.
  • DAPI has great affinity for DNA. This fluorophore crosses the cell membrane and binds to the nucleus DNA in a non-specific way. It is excited with ultraviolet light. By means of the cellular staining with DAPI all the cells present in the water sample are marked. In the present invention, to carry out the mapping of all the cells of a water sample, other fluorophores other than DAPI can also be used and have the same effect.
  • Cell viability techniques are those that allow determining the mass percentage of viable (live) and non-viable (non-live) bacteria in a sample.
  • the L-7012 LIVE / DEAD® BaclightTM kit by Molecular Probes has been used, which is based on the integrity of the cell membrane, so that the bacteria with the intact membrane are classified as viable, and the bacteria with the membrane damaged as not viable.
  • Viable bacteria are marked with a fluorophore that emits green light and non-viable bacteria are marked with a different fluoride that emits red light. It was assumed that the mass percentage of inert bacteria coincided with that of non-viable bacteria.
  • the use of this kit to determine cell viability does not limit the use of other techniques or kits with which the same information is obtained.
  • the acquisition of images of the fluorescence emitted by the bacteria marked with the techniques described above is carried out by means of a photographic system capable of being coupled to the fluorescence microscope.
  • the fluorescence microscope or the confocal laser microscope with the appropriate filters according to the fluorochromes used, allows to visualize the marked cells that are excited with the appropriate wavelength, so that all the probes can be used in the same sample and select the emission wavelengths of the respective fluorophores that mark the bacterial groups, in this way images are obtained with overlapping of the same sample that allows to determine the percentages of each group of bacteria.
  • the determination of the areas occupied by the bacterial groups and inert matter is carried out by means of any manual or computerized procedure that allows the calculation of the areas occupied by each of the bacterial groups and the inert matter to be determined.
  • the computerized procedure consists of a computer program that allows the processing and analysis of the images in the following steps: a. Acquisition of images in the image processing and analysis program.
  • the software allows the treatment of the images based not only on the appearance of the images, but also on the numerical information contained therein, the information of each individual pixel.
  • the different channels red, green or blue
  • Each color corresponds to a bacterial group (red and green) or total cells of the sample (blue).
  • the determination of the areas occupied by bacterial groups and inert matter is carried out by analyzing the images of at least 20 fields per sample.
  • field refers to a region of the slide in which the marked sample has been deposited by any of the techniques described above. This region is defined by the increases at which the viewing is carried out and the size of the image it acquires. The greater the number of fields analyzed, the closer the surface percentage value of each of the bacterial groups will be to the real percentage.
  • the determination of the percentages of area occupied by the autotrophic bacteria and by the PAO bacteria is carried out directly since each of the two bacterial groups is marked by specific FISH probes, as described previously.
  • FISH FISH technique
  • the percentage of area occupied by autotrophic bacteria versus the area occupied by the bacteria of the Eubacteria domain was obtained.
  • the percentage obtained by FISH was corrected because the probes currently described for the Euhacteria domain proved not to cover the total bacteria present in the sample.
  • the percentage of inert matter can also be calculated directly by the described tide.
  • the percentage of heterotrophic bacteria in the water sample must be calculated indirectly because it would be necessary to design a large number of specific probes for the bacterial species belonging to this group.
  • the percentage of autotrophic bacteria, the percentage of polyphosphate accumulating bacteria (ODP) and the inert matter must be subtracted from the total percentage (100%) to result in the percentage of bacteria remaining that, with a minimum error, It belongs to heterotrophic bacteria.
  • Another aspect of the present invention is a computer program characterized in that it comprises program instructions to cause a computer system to perform a method comprising: a. Acquire images of fluorescence emitted according to claim 6 (b) of at least 20 fields per sample, b. determine the middle areas of the groups of bacteria and inert matter of the images acquired in (a) and c. determine the COD balance and the contribution of each bacterial group and inert matter to the COD balance.
  • This program allows the acquisition of fluorescence images emitted after irradiating the sample with an optimum absorption wavelength for the fluorophore used in the bacterial group mapping.
  • This program allows the acquisition of a minimum number of 20 fields for each slide and for each channel (image resulting from the fluorescence emitted by each fluorophore).
  • the acquisition of the images can be carried out randomly or with established sampling patterns.
  • the average of the areas obtained for each field and channel can also be determined.
  • the measurement of the areas is based on the number of pixels that form the surface of marked bacteria.
  • the treatment and analysis of the images is carried out as described above, that is, by binarizing the images and obtaining the area automatically.
  • the COD balance and the contribution of each bacterial group and inert matter to the COD balance are determined. This determination is carried out by means of a direct calculation by means of orders established in said computer program.
  • the determination of the COD balance and the contribution of each bacterial group and inert matter to the COD balance is carried out by means of the equation comprising:
  • COD SUSP X H + X A + Xp A or + x i + x io
  • the invention extends to computer programs, more particularly to computer programs in or on carrier means, adapted to put the invention into practice.
  • the computer program may be in the form of source code, object code or intermediate code between source code and object code, such as partially compiled form, or in any other form suitable for use in the implementation of the agreement processes.
  • the carrier means can be any entity or device capable of carrying the program.
  • the computer program described above is characterized in that it is stored in recording media and, in yet another preferred embodiment, the computer program is carried by an electric carrier signal.
  • the carrier medium may comprise a storage medium, such as a ROM, for example a CD ROM or a semiconductor ROM, or a magnetic recording medium, for example a floppy disc or a hard disk.
  • the carrier means may be a transmissible carrier medium such as an electrical or optical signal that can be transmitted via electrical or optical cable or by radio or other means.
  • the carrier means may be constituted by said cable or other device or medium.
  • the carrier means may be an integrated circuit in which the computer program is encapsulated (embedded), said integrated circuit being adapted to perform the relevant processes or to be used in the realization of said processes.
  • FIG 1. Shows the comparison of quantification methods by areas and by number of bacteria to obtain the percentage of non-viable bacteria by means of the Cell Viability technique. Samples of the Pilot Plant.
  • FIG. Shows binarized images of cells labeled with red and green fluorophore.
  • FIG 3. Shows the result of a quantification of 22 fields.
  • the bars represent the percentage obtained in each field.
  • the blue line is a cumulative average to see if the percentage becomes stabilized.
  • FIG 4. Shows the diagram of techniques and results of the method validation.
  • Solutions 1 and 2 were mixed well in a microcentrifuge tube, and stored at 4.0 ° C.
  • a volume of 5 ⁇ l of the stained sample was taken and placed on a slide treated with poly-L-lysine to achieve rapid adhesion, and covered with an 18 mm coverslip.
  • the 1000x epifluorescence microscope was examined with immersion oil without fluorescence.
  • the excitation filter for SYTO 9 is 480nm, and the emission filter is 500 nm.
  • the excitation filter is 490 nm, and the emission filter is 635 nm.
  • the value of Xi represents the percentage of inert bacteria present in the biomass.
  • the Molecular Probes LIVE / DEAD® BaclightTM Cell Viability detection kit allows you to obtain the mass percentage of viable (live) and non-viable (non-live) bacteria in a sample. This method of viability is based on the integrity of the cell membrane, so that the bacteria with the intact membrane are classified as viable, and the bacteria with the damaged membrane as non-viable. It was assumed that the mass percentage of inert bacteria coincides with that of non-viable bacteria.
  • the percentage of inert matter was measured as described in the following section.
  • gelatin 100 mg of gelatin + 10 mg of chromate-12H 2 O salt
  • 100 ml of distilled water 100 mg of gelatin + 10 mg of chromate-12H 2 O salt
  • A- FISH slide cleaning solution Ethanol with 10% KOH.
  • Ethanol 100 ml of absolute ethanol and 100 ml of distilled water.
  • Ethanol 100 ml of absolute ethanol and 100 ml of distilled water.
  • the NaCI was dissolved in 800 ml of distilled water and the volume was adjusted to one liter.
  • the TRIS was weighed and added to 800 ml of distilled water. S added the concentrated HCI and was completed with distilled water up to 1 liter. It was sterilized in autoclave at 121 0 C for 15 minutes and by filtration.
  • Formamide (Hybridization buffer and wash buffer): Formamide volumes and percentage depending on the probe. They were stored at room temperature.
  • Slides were purchased with a tefion sheet in which 10 wells of 8 mm diameter are perforated.
  • the stock solution was stored at -2O 0 C, and the working solution at 4 0 C. It was sterilized by filtration.
  • Citrate buffer for DAPI Reagent to be mixed with fluoroguard when using DAPI to avoid interference from fluoroguard with fluorochrome.
  • the percentage of total bacteria in a given sample is made up of different bacterial groups. In the following equation, each of the groups is shown, whose sum is equal to the total number of bacteria in the sample, this being considered 100%.
  • the mass percentage of autotrophic bacteria present in the biomass was obtained.
  • the FISH technique and the DAPI staining were combined.
  • the percentage of area occupied by autotrophic bacteria versus the area occupied by the bacteria of the Eubacteria domain was obtained.
  • the percentage obtained by FISH was corrected because the probes currently described for the Eubacteria domain proved not to cover the total bacteria present in the sample.
  • the percentage of bacteria hybridized with the EUBmix probe (probes of table 4 used together) against bacteria stained with DAPI has been found to be 90 ⁇ 3% for the Pilot Plant, and 91 ⁇ 1% for the Sequencing Batch Reactors (SBR) . Due to the little variability that these results present, it is advisable to use said range of values as typical values for the calibration of the model by the method set forth herein.
  • SEQ ID NO: 1 35 Appl Environ Microbiol. ammonium oxidizer
  • EUB338 SEQ ID NO: 3 Consensus Eubacteria 0-50 Appl. Environ. Microbiol
  • the ASM2 model assumes that the content of autotrophic bacteria is due solely to the presence of nitrosomonas or nitrohacter nitrifying bacteria. However, some other autotrophic species may become important in biological wastewater treatment systems. These include:
  • Thiobacteria such as Thiotrix, Beggiatoas, capable of oxidizing SH 2 and sulfur to sulfuric acid.
  • Hydrogen oxidizing bacteria such as Hydrogenomonas, which oxidize the hydrogen produced by heterotrophic bacteria in the fermentation of carbohydrates, producing water.
  • the value of XA in COD units per liter was obtained by the mass percentage of autotrophic bacteria against bacteria in the Euhacteria domain, corrected by the EUB / DAPl ratio, and multiplied by the COD value.
  • the procedure consisted of obtaining the percentage of autotrophic bacteria against total bacteria (represented by the domain eubacteria):% A.
  • the percentage of bacteria hybridized with the EUBmix probe is obtained against the total bacteria present in the sample (obtained by staining with DAPI):% EUB / DAPI.
  • % A x (% EUB / DAPI) / 100 is multiplied, obtaining the percentage of autotrophic bacteria against the total number of bacteria marked by DAPI:% A '.
  • COD balance equation :
  • the value of Xp A or will be obtained as the result of correcting the value of the PAOmix / EUB percentage by means of the EUB / DAPI ratio, and multiplying the result by the COD balance value, as in the case of the calculation of X P AO-
  • SEQ ID NO: 7 35 Microbe Environ!., 66, 1175-651 phosphatis 1182.
  • the probes can be designed in the laboratory itself, or acquired through centers that are dedicated to it, and in which probes labeled with a specific fluorochrome, or even unlabeled, can be purchased. In the case of this study, it has been decided to acquire the probes already marked, so that the possible source of errors is reduced.
  • the probes have been acquired through TIB MOLBIOL (Germany). There are databases to check sequences and specificity of the probes through the Internet in pages such as:
  • Sample taking Samples were taken from a representative part of the sludge or bacteria culture. For this, it was necessary that the reactor be completely mixed.
  • the calculation of the area can also be carried out through cell viability experiments. Viable cells are labeled with a fluorophore and non-viable with a different fluorophore.
  • FIG 1 we can observe the comparison of the methods of quantification by areas and by number of bacteria to obtain the percentage of non-viable bacteria by means of the Cell Viability technique.
  • the image processing is carried out in several steps: a. Acquisition of images in the image processing and analysis program.
  • a mathematical calculation program such as MATLAB ⁇ was used for image processing. This software allowed the treatment of the images based not only on the appearance of the images, but on the numerical information contained therein, the information of each individual pixel.
  • the inventors focused on the independent treatment of the different channels (red, green or blue). Each color corresponds to a bacterial group, autotrophs and PAO, as well as viable and non-viable.
  • Binarizing an image consists of passing it to black and white (not grayscale) so that the information contained in the pixels consists only of zeros and ones. Black pixels will be represented by a "0", while white pixels will be assigned a "1".
  • the quantification software is able to quantify the pixels corresponding to each of the classes, "white” or “black” and therefore, their corresponding areas (FIG 2).
  • the quantification software returned a detailed report of the percentages of areas occupied by the bacteria present in the hybridized sample.
  • the final result is a number that represents the percentage in area of a bacterial species in the sample.
  • the quantification software allows to obtain an accurate, reliable and fast result without the need for the intervention of an expert operator.
  • the following table shows the number of pixels obtained in each of the red and green channels and the calculation of the percentage of ODP bacteria.
  • the proposed method has been validated for the particular case of an SBR system enriched in bacteria with a PAO (Polyphosphate Accumulating Organisms) phenotype for biological phosphorus removal.
  • PAO Polyphosphate Accumulating Organisms
  • populations of bacteria with a PAO phenotype with abundances close to one hundred percent are obtained.
  • the values of the parameters obtained by means of a conventional calibration have been compared with those obtained by the method proposed in this invention, using the data of three calibrations carried out by Dr. Ramón Barat in his thesis "Study of precipitation of biologically induced phosphorus in wastewater treatment ", presented in 2004 at the Polytechnic University of Valencia (Barat, R. (2004). Study of the precipitation of biologically induced phosphorus in wastewater treatment. Polytechnic University of Valencia, Department of Hydraulic Engineering and Environment, Valencia).
  • a system enriched in bacteria with a PAO phenotype was used for the biological elimination of phosphorus.
  • the reactor was operating for a period of eight months under the conditions shown in Table 7.
  • the analyzed samples belong to the three different initial stationary states described in Table 8.
  • Acetic acid (mg COD / I) 112.0 138.7 138.7
  • the total COD of the sludge, DQOT was measured at the end of the aerobic stage of each of these experiments. Taking into account that all the acetate (VFA) supplied at the beginning of each experiment was fully consumed during the anaerobic stage, it can be assumed that the total COD of the sludge at the end of the aerobic stage corresponded only to the COD of the biomass, or COD suspended (DQOSU S P). Table 9 shows the COD values obtained in each of the experiments.
  • the DQOSUSP can be assimilated to the contribution of the different types of bacteria present, X s , and to the inert fraction thereof, X
  • DQOSUSP ⁇ PAO + X ⁇ 0
  • ⁇ COD susp Xp A or + ⁇ GAO + X l
  • FIG. 4 summarizes the workflow to perform a determination of this type. 5
  • the bacterial populations studied by FISH were the relevant populations in the biological Enhanced processes! Renoval phosphorus (EBPR), that is, populations with PAO and GAO phenotypes.
  • EBPR Renoval phosphorus
  • the probes of table 10 were used.
  • GAOQ431 SEQ ID NO: 9 35 Competibacter Microbiology.
  • GAOQ989 SEQ ID NO: 10 35 Competibacter Microbiology.
  • TFO DF218 SEQ ID NO: 11 a Defluviicoccus 25-35 Microbiology.
  • TFO DF618 SEQ ID NO: 12 a Defluviicoccus 25-35 Microbiology.
  • Table 11 Distribution of microbial populations, in mass percentages, related to EBPR processes for the three experiments performed.
  • the XGAO fraction, I fraction of non-viable GAO bacteria
  • the XP A O, I fraction was associated with damaged or dead PAO bacteria, that is, non-viable bacteria. Therefore, it was possible to calculate the parameter (X P A O , I) by applying the percentage of non-viable bacteria on the DQOSUSP, which in this case corresponded to the DQOTOTAL- This will be true provided it is a system like the one studied , in which the fraction of X ] or input is null, since the food provided to the system is a totally soluble food.
  • the model is able to reproduce with great accuracy the evolution of the concentration of phosphorus and acetic acid in all experiments, which validates the method of obtaining X PA or by molecular microbiological techniques.
  • both circles and squares represent the points obtained experimentally, that is, by means of analytics performed on water samples taken from the reactor during the experiment.
  • the lines represent the simulation performed after the calibration of the model for these specific cases. Therefore, the lines (values calculated using the calibrated model) perfectly describe the behavior shown by the points (values obtained experimentally through direct analytics). That is, the model, calibrated by means of the aid of the proposed microbiological method, represents reality perfectly.

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Abstract

El método comprende la aplicación de las técnicas microbiológicas moleculares de hibridación in situ (FISH), tinción con DAPI y viabilidad celular, para determinar la contribución a la demanda química de oxígeno (DQO), de los grupos específicos de bacterias presentes en procesos de depuración biológica de aguas residuales (bacterias heterótrofas, autótrofas y bacterias acumuladoras de poli-fosfatos, PAO). Este método permite llevar a cabo la calibración de los métodos matemáticos de fangos activados de una forma directa, y sin la necesidad de recurrir a una optimización de los resultados, reduciendo así la incertidumbre a la hora de hallar los parámetros de calibración para un determinado sistema de tratamiento de aguas residuales.

Description

Método para determinar Ia contribución de Ia biomasa a Ia DQO.
El método comprende Ia aplicación de las técnicas microbiológicas moleculares de hibridación in situ (FISH), tinción con DAPI y viabilidad celular, para determinar Ia contribución a Ia demanda química de oxígeno (DQO), de los grupos específicos de bacterias presentes en procesos de depuración biológica de aguas residuales (bacterias heterótrofas, autótrofas y bacterias acumuladoras de poli-fosfatos, PAO). Este método permite llevar a cabo Ia calibración de los métodos matemáticos de fangos activados de una forma directa, y sin Ia necesidad de recurrir a una optimización de los resultados, reduciendo así Ia incertidumbre a Ia hora de hallar los parámetros de calibración para un determinado sistema de tratamiento de aguas residuales.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los principales objetivos en Ia explotación de las estaciones depuradoras de aguas residuales son, el cumplimiento de los límites de vertido marcados por Ia legislación y Ia minimización del consumo de energía. Esto implica el correcto diseño de las actuales estaciones depuradoras de aguas residuales y, en muchos casos, el incremento del rendimiento de muchas de las estaciones depuradoras de aguas residuales ya construidas para adaptarlas a las actuales necesidades. La gran cantidad de factores que influyen en el funcionamiento de estos procesos hace necesario un estudio exhaustivo de cada caso, teniendo en cuenta tanto las características del agua residual a tratar como el tipo de proceso de depuración para el cual ha sido diseñada Ia estación depuradora de aguas residuales. Este tipo de estudios permite diagnosticar el funcionamiento de plantas existentes y optimizar su operación, adecuando el proceso de depuración al agua residual afluente. Sin embargo, dada Ia alta complejidad de los procesos biológicos involucrados, no es posible realizar estos estudios sin Ia ayuda de un modelo matemático que sea capaz de representar fielmente las transformaciones que se producen en una estación depuradora de aguas residuales. En Ia actualidad, existe una necesidad en Ia simplificación de los modelos y protocolos de simulación de los diferentes sistemas de tratamiento de aguas residuales y puede constituir uno de los aspectos con mayor potencial de desarrollo en el futuro para Ia mejora en el tratamiento de aguas residuales.
De todos los modelos existentes en Ia bibliografía, los más ampliamente utilizados y aceptados por Ia comunidad científica son los propuestos por Ia IWA (del inglés International Water Association), en concreto los modelos ASM1 y ASM2d (Henze ef ai, (2000). IWA Scientific and Technical Report No. 9, IWA Publishing, London, UK).
El elevado número de parámetros que presentan estos modelos, más de 60 parámetros, y el alto nivel de correlación existente entre ellos, hace especialmente difícil Ia obtención de todos ellos para un determinado sistema. Por este motivo, se ha dedicado un gran esfuerzo para encontrar un método de obtener dichos parámetros con Ia mínima incertidumbre.
La conversión de los datos microbiológicos en datos utilizables en los modelos de procesos biológicos es uno de los puntos débiles que tradicionalmente se han asociado a estos modelos. Este obstáculo queda superado mediante Ia invención propuesta. La técnica desarrollada permite cuantificar de forma precisa los microorganismos de importancia en estos procesos y los parámetros que hay que cumplimentar en los modelos matemáticos para realizar un análisis del proceso con un simulador matemático, y por tanto, estar en condiciones de actuar sobre problemas en los procesos biológicos de depuradoras con una premura de tiempo de Ia que hasta ahora no se disponía.
En la presente invención se provee de un método que, mediante Ia combinación de análisis químicos y métodos microbiológicos moleculares, permite obtener, de una forma directa, la contribución a la DQO, de cada uno de los grupos bacterianos que tienen en cuenta los modelos matemáticos citados. Mediante este método, se reduce Ia incertidumbre en el cálculo de parámetros, y se evita Ia necesidad de utilizar métodos de optimización para Ia obtención de los mismos. Esta metodología ha sido desarrollada y validada en sistemas de fangos activados con eliminación biológica de fósforo.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
El método de Ia presente invención comprende Ia aplicación de las técnicas microbiológicas moleculares de hibridación in situ (FISH), tinción con DAPI y pruebas de viabilidad celular, para determinar Ia contribución a Ia demanda química de oxígeno (DQO), de los grupos específicos de bacterias presentes en procesos de depuración biológica de aguas residuales (bacterias heterótrofas, autótrofas y bacterias acumuladoras de poli-fosfatos, PAO) fundamentalmente. El método combina los análisis químicos convencionales de DQO y las técnicas microbiológicas. Este método permite llevar a cabo Ia calibración de los métodos matemáticos de fangos activados de una forma directa, y sin Ia necesidad de recurrir a una optimización de los resultados, reduciendo así Ia incertidumbre a Ia hora de hallar los parámetros de calibración para un determinado sistema de tratamiento de aguas residuales.
La presente invención tiene un objetivo claro con un gran interés de aplicación: el desarrollo de un método para Ia estimación de las poblaciones bacterianas con interés en los procesos de tratamiento biológico de aguas residuales, y su parametrización de forma que pueda ser utilizado en los modelos matemáticos que se emplean típicamente para diseñar estos procesos y para analizar su funcionamiento. Este tipo de procesos biológicos son los más ¡mplementados en el tratamiento de aguas residuales urbanas (Estaciones Depuradoras de Agua Residual, EDAR), aun cuando el conocimiento sobre Ia operación de los mismos sigue teniendo lagunas importantes, en especial en Io que se refiere a Ia dinámica de poblaciones microbianas, de vital importancia a Ia hora de justificar los resultados operativos de las EDAR.
Los modelos matemáticos capaces de simular y predecir situaciones de operación en las plantas de tratamiento de aguas residuales están altamente extendidos. Estos modelos son de mucha utilidad, pero su principal inconveniente reside en el gran número de parámetros a calibrar con ensayos reales. Algunos de estos parámetros no pueden ser calibrados analíticamente. Por ejemplo, no será posible determinar Ia cantidad de biomasa eliminadora de fósforo, XPAO, porque no es posible realizar un ensayo en laboratorio inhibiendo completamente el resto de bacterias. En Ia presente invención se describe un método capaz de cuantificar las distintas poblaciones microbianas combinando técnicas moleculares como Ia tinción con DAPI, y Ia hibridación in situ, FISH, con el que se puede obtener el porcentaje en área (o volumen o masa) de bacterias de un tipo específico en Ia biomasa de un reactor. Mediante el uso de diversas técnicas será posible convertir estos porcentajes másicos de contenido de bacterias específicas, en unidades de DQO por mililitro, unidades utilizadas mayoritariamente en los modelos matemáticos de fangos activos.
El método propuesto supone una importante mejora en Ia certidumbre del proceso de calibración del modelo matemático, ya que se reduce el número de variables desconocidas hasta el punto de que no es necesaria una optimización de los errores de las soluciones matemáticas, sino que se puede realizar un cálculo directo de los parámetros del modelo. Esto evita Ia obtención de resultados que pueden tener sentido matemático pero no biológico.
La buena correlación de los datos obtenidos valida completamente Ia metodología y Ia coloca en disposición de ser utilizada masivamente en plantas de tratamiento de aguas residuales a escala real.
La combinación de las técnicas microbiológicas moleculares, el análisis químico de las muestras de agua y las ecuaciones que incorporan los modelos matemáticos existentes,. supone un gran avance en cuanto a Ia forma de utilizar estos recursos. La incorporación de datos obtenidos directamente de medidas microbiológicas en Ia ecuación del balance de DQO, supone una importante reducción en el número de parámetros a determinar en el modelo matemático ASM2. De otra forma, estos parámetros (XH, XA, XPAO y Xi) habrían de ser estimados mediante métodos matemáticos de optimización, reduciendo considerablemente Ia certidumbre del proceso de calibración del modelo. El parámetro XH hace referencia al porcentaje de bacterias heterótrofas, XA hace referencia al porcentaje de bacterias autótrofas, XPAO hace referencia al porcentaje de bacterias acumuladoras de poli-fosfatos y X| hace referencia al porcentaje de bacterias no viables en Ia muestra.
Todas las bacterias presentes en los sistemas de tratamiento de aguas residuales pueden ser identificadas mediante Ia técnica de hibridación ¡n situ (FISH). En Ia presente invención, todos los grupos bacterianos (bacterias heterótrofas, autótrofas y bacterias acumuladoras de poli- fosfatos, PAO) tienen el mismo peso específico en Ia determinación de la DQO.
En este sentido, el principal aspecto de Ia presente invención es un método para determinar Ia contribución de Ia biomasa al balance de DQO en agua que comprende: a. obtener una muestra de agua, b. determinar los porcentajes de los grupos bacterianos y materia inerte de Ia muestra obtenida en (a) mediante técnicas microbiológicas moleculares, c. determinar los siguientes parámetros de Ia muestra de agua obtenida en (a); DQO total (DQOT), DQO soluble (DQOSOL), DQO suspendida (DQOsυsp), DBO límite total (DBOLT), DBO límite soluble (DBOL SOL), tiempo de retención de sólidos
(SRT) y tiempo de resistencia hidráulico (HRT), d. determinar el balance de DQO utilizando los parámetros obtenidos en (c) y e. determinar Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte según (b) ai balance de DQO calculado en (d).
El término "biomasa" según se utiliza en Ia presente invención hace referencia a Ia materia total de microorganismos presentes en una muestra de agua. Estos microorganismos pueden ser viables o no viables.
El término "materia inerte" se refiere a las bacterias no viables de Ia muestra de agua.
La determinación de los porcentajes de los grupos bacterianos y materia inerte de Ia muestra de agua se lleva a cabo mediante técnicas microbiológicas moleculares. Las técnicas microbiológicas moleculares de
Ia presente invención están basadas en Ia identificación de los grupos bacterianos mediante el empleo de técnicas de biología molecular. Las técnicas de biología molecular que se pueden llevar a cabo deben permitir Ia obtención de datos y/o imágenes mediante los cuales se pueda estimar Ia representación de los diferentes grupos bacterianos. Así pues, para ello se pueden emplear técnicas tradicionales de cultivo y/o técnicas de biología molecular como, mareaje con sondas específicas acopladas a fluoróforos (técnica FISH; Fluorescence In Situ Hybridization), mareaje con 4,6- diamidino-2-fenlindol (DAPI), detección mediante anticuerpos, PCR, secuenciación de ADN, microscopía óptica, de epifluorescencia o confocal sin excluir otras técnicas de biología molecular que permitan identificar y determinar el porcentaje de grupos bacterianos de una muestra de agua. Si se procede a obtener imágenes, su análisis se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento manual o informatizado que permita calcular las áreas ocupadas por cada uno de los grupos bacterianos que se desee determinar.
La determinación de Ia DQO total (DQOT), DQO soluble (DQOSOL), DQO suspendida (DQOSUSP), DBO límite total (DBOLT), DBO límite soluble (DBOL SOL), se puede llevar a cabo según el Standard methods forthe examination of water and wastewater o mediante cualquier otra técnica analítica que permita su determinación.
El tiempo de retención de sólidos (SRT) y tiempo de resistencia hidráulico (HRT) se pueden calcular mediante. El cálculo del HRT y SRT es directo: HRT= Volumen/Caudal, SRT = (volumen x sólidos suspendidos (SS) en el reactor)/(caudal de purga x SS en Ia purga). Los SS se analizan según el Standard methods for the examination of water and wastewater, sección 2540 D.
El término "balance de DQO" hace referencia a toda Ia DQO generada en el sistema acuático. El valor de Ia DQO puede aumentar por un nuevo aporte de agua, permanecer invariable, aumentar en el interior del reactor de fangos activados o disminuir. En definitiva, el balance de DQO es el estudio de los factores que intervienen en el proceso de depuración, llevado a cabo por los diferentes grupos de bacterias, para tratar de prever su evolución. Según una realización preferida del método anterior, Ia determinación del balance de DQO del paso (d) y Ia determinación de Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte al balance de DQO se llevan a cabo mediante una ecuación que comprende,
XH + XA + XPAO + XI + XI0 HRT = DQO SUSP
Donde los parámetros XH, XA y XPAO representan Ia DQO debida a Ia presencia de bacterias heterótrofas, autótrofas y PAO, respectivamente. El parámetro X| representa Ia materia suspendida inerte (también en unidades de DQO), debida principalmente a Ia muerte de las bacterias heterótrofas, autótrofas y PAO. El parámetro Xio- (SRTYH RT) se refiere a Ia materia suspendida inerte que entra con el agua afluente al reactor del sistema de depuración. Los parámetros DQOSUSP, SRT y HRT se calculan según Io descrito anteriormente.
Por el término "agua que entra a un sistema" tal como se utiliza en Ia presente invención, se entiende el agua afluente o entrante a un sistema en el cual se lleva a cabo un proceso de depuración del agua (por ejemplo en un reactor de unas instalaciones de depuración de aguas residuales).
Xio es Ia cantidad de materia inerte suspendida que entra con el agua afluente al sistema. Este parámetro se puede calcular, según el procedimiento tradicional, a partir de Ia DQO total (DQOT), DQO soluble (DQOSOL), DBO límite total (DBOLτ) y DBO límite soluble (DBOL SOL) según Ia siguiente ecuación:
X10 =DQQ -DBQT -(DQQOL-DBqsoi)
XH, XA y XPAO representan Ia DQO debida a Ia presencia de bacterias heterótrofas, autótrofas, PAO y materia suspendida inerte, respectivamente. Xi0 es Ia DQO debida a Ia materia suspendida inerte aportada por el agua que entra a un sistema.
Para resolver esta ecuación, es necesario conocer los parámetros X. Sin embargo, no existe ningún método para el cálculo directo de dichos parámetros (el parámetro Xi0 sí que es calculable mediante el método descrito en una ecuación anterior). Para obtener los valores de estos parámetros se deben resolver el conjunto de ecuaciones que conforman el modelo matemático (ASM2 en este caso). Esto quiere decir, que se obtienen de una forma indirecta y "ciega". El método que propone esta invención es un método directo y "real", ya que cuantifica directamente las diferentes poblaciones de microorganismos.
En las ecuaciones descritas pueden introducirse parámetros, como por ejemplo, Ia DQO debida a bacterias GAO (bacterias acumuladoras de glicógeno).
Esta determinación se lleva a cabo asumiendo que todos los grupos bacterianos y materia inerte presentes en Ia muestra de agua tienen el mismo peso específico en términos de DQO y, por tanto, Ia contribución de cada uno de ellos será proporcional a su abundancia en Ia muestra, representada ésta en forma de porcentaje respecto a Ia masa total o respecto al área analizada en las imágenes adquiridas. Así pues, y a modo de ejemplo, supongamos que el valor del balance de DQO fuese 1000 mg DQO/I, los porcentajes de bacterias heterótrofas y materia inerte tuviesen un valor de 0 y las bacterias autótrofas y PAO representasen un 20% y 80% respectivamente. En este caso particular, el valor de XA sería 200 mg/I y el valor de XPAO de 800 mg/I.
En una realización más preferida, Ia muestra de agua es agua residual.
El término agua "residual" se refiere a un tipo de agua que, por haber sido usada, está contaminada con sustancias fecales y orina, procedentes de desechos orgánicos humanos o animales, vertidos industriales u otro tipo de contaminantes.
En una realización aún más preferida, el agua residual procede de Ia entrada a una instalación donde se lleva a cabo el tratamiento de aguas residuales basado en un sistema de fangos activados. El agua debe proceder de Ia entrada (agua afluente) al proceso de fangos activados. Los diferentes parámetros que se analizan en Ia presente invención requieren muestras de agua de origen diferente, así, por ejemplo, Ia muestra de donde se obtiene Ia Xio es agua residual afluente. Sobre ésta se realizan las analíticas descritas para Ia obtención del parámetro Xi0. Para el análisis del resto de parámetros (DQOSUSP, SRT1 HRT y X) se requieren muestras del fango (reactor biológico), que es donde se encuentran en su mayor parte las bacterias en el reactor así como mezcla de agua afluente y fango del reactor, también conocido como licor mezcla.
Los sistemas de fangos activados o fangos activos, consisten en un tanque de aireación con fangos activos y otro tanque para Ia clarificación secundaria. El agua residual afluente entra en el tanque de aireación. El agua clara de Ia superficie de este tanque pasa al tanque de clarificación secundaria. La mayor parte de los fangos que se han sedimentado en el tanque de clarificación secundaria vuelve al tanque de aireación asegurando así un proceso continuo de depuración biológica con altas tasas de descomposición de materia orgánica (de hasta un 99%). La depuración biológica de aguas residuales en los sistemas de fangos activados se realiza por microorganismos (fundamentalmente bacterias), que descomponen los componentes orgánicos de las aguas residuales. Los aireadores más utilizados en este tipo de sistemas de depuración son los sumergibles y se encargan de suministrar oxígeno para favorecer Ia acción depuradora de las bacterias aerobias.
En otra realización preferida, Ia determinación de los porcentajes de los grupos bacterianos y materia inerte comprende: a. marcar las bacterias de Ia muestra mediante técnicas FISH, tinción con DAPI y técnicas de viabilidad celular, b. adquirir imágenes de Ia fluorescencia emitida por las bacterias marcadas con las técnicas descritas en (a) y c. determinar las áreas ocupadas por los grupos bacterianos y materia inerte.
Según otra realización más preferida, el mareaje de las bacterias mediante técnicas FISH se lleva a cabo con las sondas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, con las sondas SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5 y con las sondas SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
En Ia técnica FISH de Ia presente invención se utilizan sondas de DNA marcadas con un fluoróforo para detectar los distintos grupos de bacterias. Las sondas de DNA utilizadas son secuencias específicas de bacterias autótrofas en el caso de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (de Betaproteobacteria oxidante de amonio y Nitrobacter spp respectivamente), de bacterias del dominio Eubacteria en el caso de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5 (cebador con secuencias consenso de Ia mayor parte de eubacterias, Planctomycetales y Verrucomicrobiales respectivamente) y de bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) en el caso de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (de Rhizophagus tenuis, Accumulibacter phosphatis y Rhizophagus tenuis respectivamente).
Para llevar a cabo Ia hibridación fluorescente in situ (FISH; del inglés Fluorescent In Situ Hybridization) se utilizan moléculas fluorescentes para localizar genes o fragmentos de DNA. La técnica consiste en preparar secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de DNA que se quieren marcar y examinar. Estas sondas se marcan con moléculas fluorescentes (TAMRA; tetrametil-rhodamina, fluoresceína, u otras moléculas fluorescentes). Las sondas se hibridan al DNA complementario y, al estar marcadas con moléculas fluorescentes, permiten localizar las bacterias a las que pertenecen esas secuencias específicas. El fluoróforo emite una longitud de onda específica que permite, mediante el uso de un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados, detectar las células marcadas.
El DAPI tiene gran afinidad por el DNA. Este fluoróforo atraviesa Ia membrana celular y se une al DNA del núcleo de forma inespecífica. Se excita con luz ultravioleta. Mediante Ia tinción celular con DAPI se marcan todas las células presentes en Ia muestra de agua. En Ia presente invención, para llevar a cabo el mareaje de todas las células de una muestra de agua también pueden emplearse otros fluoróforos diferentes al DAPI y que consigan el mismo efecto.
Las técnicas de viabilidad celular son aquellas que permiten determinar el porcentaje másico de bacterias viables (vivas) y no viables (no vivas) en una muestra. En Ia presente invención se ha empleado el kit L-7012 LIVE/DEAD® BaclightTM de Molecular Probes que se basa en Ia integridad de Ia membrana celular, de modo que las bacterias con Ia membrana intacta son clasificadas como viables, y las bacterias con Ia membrana dañada como no viables. Las bacterias viables son marcadas con un fluoróroro que emite luz verde y las no viables se marcan con un fluoruro distinto que emite luz roja. Se asumió que el porcentaje másico de bacterias inertes coincidía con el de bacterias no viables. La utilización de este kit para determinar Ia viabilidad celular no limita el empleo de otras técnicas o kits con los que se consiga Ia misma información.
La adquisición de imágenes de Ia fluorescencia emitida por las bacterias marcadas con las técnicas descritas anteriormente se lleva a cabo mediante un sistema de fotografiado capaz de acoplarse al microscopio de fluorescencia. El microscopio de fluorescencia o el microscopio confocal láser, con los filtros adecuados según los fluorocromos utilizados, permite visualizar las células marcadas que son excitadas con Ia longitud de onda adecuada, de modo que se pueden usar todas las sondas en una misma muestra y seleccionar las longitudes de onda de emisión de los respectivos fluoróforos que marcan los grupos bacterianos, de este modo se obtienen imágenes con solapamiento de mareaje en una misma muestra que permite determinar los porcentajes de cada grupo de bacterias.
La determinación de las áreas ocupadas por los grupos bacterianos y materia inerte se lleva a cabo mediante cualquier procedimiento manual o informatizado que permita calcular las áreas ocupadas por cada uno de los grupos bacterianos y Ia materia inerte que se desee determinar.
El procedimiento informatizado consiste en un programa informático que permite el procesamiento y análisis de las imágenes en los siguientes pasos: a. Adquisición de las imágenes en el programa de procesado y análisis de imágenes. El software permite el tratamiento de las imágenes basándose no sólo en Ia apariencia de las imágenes, sino también en Ia información numérica que en ella se contiene, Ia información de cada píxel individual. Se deben tratar de forma independiente los diferentes canales (rojo, verde o azul). Cada color corresponde a un grupo bacteriano (rojo y verde) o células totales de Ia muestra (azul).
b. binarización de Ia imagen. Se debe convertir la imagen en blanco y negro, de forma que Ia señal positiva está representada por los píxeles blancos, y Ia negativa o "background" por los píxeles negros. De esta forma el software es capaz de cuantificar los píxeles correspondientes a cada una de las clases, "blanco" o "negro" y por tanto, sus áreas correspondientes.
Según otra realización más preferida, Ia determinación de las áreas ocupadas por los grupos bacterianos y materia inerte se lleva a cabo analizando las imágenes de, al menos, 20 campos por muestra.
El término "campo" se refiere a una región del portaobjetos en el que se ha depositado Ia muestra marcada mediante alguna de las técnicas descritas anteriormente. Esta región está definida por los aumentos a los que se realiza el visionado y el tamaño de Ia imagen que adquiere. A mayor número de campos analizados, más cercano será el valor del porcentaje de superficie de cada uno de los grupos bacterianos al porcentaje real.
En Ia presente invención, Ia determinación de los porcentajes de área ocupada por las bacterias autótrofas y por las bacterias PAO se lleva a cabo de forma directa ya que cada uno de los dos grupos bacterianos está marcado mediante sondas específicas FISH, tal como se ha descrito anteriormente. Mediante Ia técnica FISH, se obtuvo el porcentaje de área ocupado por bacterias autótrofas frente al área ocupada por las bacterias del dominio Eubacteria. Con Ia tinción con DAPI se corrigió el porcentaje obtenido mediante FISH debido a que las sondas actualmente descritas para el dominio Euhacteria demostraron no cubrir el total de bacterias presentes en Ia muestra.
El porcentaje de materia inerte (bacterias no viables) también se puede calcular de forma directa mediante el mareaje descrito. El porcentaje de bacterias heterótrofas de Ia muestra de agua ha de calcularse de forma indirecta porque sería necesario diseñar una gran cantidad de sondas específicas para las especies bacterianas pertenecientes a este grupo. De este modo, al porcentaje total (100%) ha de restarse el porcentaje de bacterias autótrofas, el porcentaje de bacterias acumuladoras de poli- fosfatos (PAO) y Ia materia inerte para resultar el porcentaje de bacterias restante que, con un error mínimo, pertenece a las bacterias heterótrofas.
Otro aspecto de Ia presente invención es un programa de ordenador caracterizado porque comprende instrucciones de programa para provocar que un sistema de computación realice un método que comprende: a. adquirir imágenes de fluorescencia emitida según Ia reivindicación 6 (b) de, al menos, 20 campos por muestra, b. determinar las áreas medias de los grupos de bacterias y materia inerte de las imágenes adquiridas en (a) y c. determinar el balance de DQO y Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte al balance de DQO.
Mediante este programa de ordenador se facilita Ia adquisición de imágenes de fluorescencia emitida tras irradiar Ia muestra con una longitud de onda de absorción óptima para el fluoróforo empleado en el mareaje del grupo bacteriano. Este programa permite Ia adquisición de un número mínimo de 20 campos por cada portaobjetos y por cada canal (imagen resultante de Ia fluorescencia emitida por cada fluoróforo). La adquisición de las imágenes puede llevarse a cabo de forma aleatoria o con patrones de muestreo establecido. Asimismo también se puede determinar Ia media de las áreas obtenidas para cada campo y canal. La medida de las áreas está basada en el número de píxeles que forma Ia superficie de bacterias marcadas. El tratamiento y análisis de las imágenes se lleva a cabo tal como se ha descrito anteriormente, es decir, binarizando las imágenes y obteniendo de forma automática el área. Además, tras Ia introducción de los parámetros de DQO de Ia biomasa, DQO total, DQO soluble, DQO suspendida (DQOSUSP), DBO límite total, DBO límite soluble, tiempo de retención de sólidos (SRT) y tiempo de resistencia hidráulico (HRT), en el programa de ordenador, se determina el balance de DQO y Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte al balance de DQO. Esta determinación se lleva a cabo mediante un cálculo directo por medio de órdenes establecidas en el citado programa de ordenador.
Según una realización preferida del programa de ordenador anterior, Ia determinación del balance de DQO y Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte al balance de DQO se lleva a cabo mediante Ia ecuación que comprende:
DQO SUSP = XH + XA + XpAo + xi + xio
HRT Los parámetros de cada una de las ecuaciones han sido descritos anteriormente.
La invención se extiende a programas de ordenador, más particularmente a programas de ordenador en o sobre unos medios portadores, adaptados para poner Ia invención en práctica. El programa de ordenador puede estar en forma de código fuente, de código objeto o en un código intermedio entre código fuente y código objeto, tal como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para usar en Ia implementación de los procesos de acuerdo con Ia invención El medio portador puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de portar el programa.
En otra realización preferida, el programa de ordenador descrito anteriormente está caracterizado porque se almacena en unos medios de grabación y, en otra realización preferida más, el programa de ordenador es portado por una señal portadora eléctrica.
Por ejemplo, el medio portador puede comprender un medio de almacenamiento, tal como una ROM, por ejemplo un CD ROM o una ROM semiconductora, o un medio de grabación magnético, por ejemplo un floppy disc o un disco duro. Además, el medio portador puede ser un medio portador transmisible tal como una señal eléctrica u óptica que puede transmitirse vía cable eléctrico u óptico o mediante radio u otros medios.
Cuando el programa de ordenador está contenido en una señal que puede transmitirse directamente mediante un cable u otro dispositivo o medio, el medio portador puede estar constituido por dicho cable u otro dispositivo o medio.
Alternativamente, el medio portador puede ser un circuito integrado en el que está encapsulado (embedded) el programa de ordenador, estando adaptado dicho circuito integrado para realizar los procesos relevantes o para usarse en Ia realización de dichos procesos.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Muestra Ia comparación de los métodos de cuantificación por áreas y por número de bacterias para Ia obtención del porcentaje de bacterias no viables mediante Ia técnica de Viabilidad Celular. Muestras de Ia Planta Piloto.
FIG 2. Muestra las imágenes binarizadas de células marcadas con fluoróforo rojo y verde.
FIG 3. Muestra el resultado de una cuantificación de 22 campos.
Las barras representan el porcentaje obtenido en cada campo. La línea azul es una media acumulada para observar si el porcentaje llega a estabilizarse.
FIG 4. Muestra el diagrama de técnicas y resultados de Ia validación del método.
Figura 5. Resultados experimentales y simulados (fósforo y ácido acético) del modelo ASM2, utilizando los valores de XPAo determinados microbiológicamente para los experimentos 1, 2 y 3.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 A continuación se expone el procedimiento en cada una de las etapas del método propuesto en Ia presente invención.
1.1. Aplicación de Ia técnica de Ia viabilidad celular.
Reactivos:
Se utilizó el kit "L-7012 LIVE/DEAD® Backlight™ Bacterial Viability Kit for microscopy and quantitative assays", de Molecular Probes.
Solución 1 :
- Fluorocromo SYTO 9: 300 μl de solución 3.34 mM en DMSO (Dimetil Sulfóxido)
Solución 2:
- Fluorocromo loduro de Propidio: 300 μl de solución 20 mM en DMSO
Se mezclaron bien las soluciones 1 y 2 en un tubo de microcentrífuga, y se conservaron a 40C.
Procedimiento:
1. Se añadieron 0.75 μl de Ia mezcla de solución 1 + 2 a 250 μl de muestra. Se mezcló bien en el vortex. Esta dilución recomendada supone una concentración de DMSO del 0.3% de Ia solución de tinción.
2. Se incubó a temperatura ambiente y en oscuridad durante 10 - 50 minutos manteniendo en agitación.
3. Se tomó un volumen de 5 μl de Ia muestra teñida y se puso en un portaobjetos tratado con poli-L-lisina para conseguir una adherencia rápida, y se tapó con un cubreobjetos de 18 mm.
4. Se examinó al microscopio de epifluorescencia a 1000x con aceite de inmersión sin fluorescencia. El filtro de excitación para el SYTO 9 es de 480nm, y el de emisión de 500 nm. Para el Yoduro de propidio, el filtro de excitación es de 490 nm, y el de emisión de 635 nm.
Resultados:
Las células vivas aparecieron de color verde. Las células dañadas aparecieron de color rojo-verde, y las células muertas de color rojo.
1.2. Cálculo del porcentaje de materia inerte (Xi)
El valor de Xi representa el porcentaje de bacterias inertes presentes en Ia biomasa. El kit para detección de Viabilidad Celular LIVE/DEAD® BaclightTM de Molecular Probes permite obtener el porcentaje másico de bacterias viables (vivas) y no viables (no vivas) en una muestra. Este método de viabilidad se basa en Ia integridad de Ia membrana celular, de modo que las bacterias con Ia membrana intacta son clasificadas como viables, y las bacterias con la membrana dañada como no viables. Se asumió que el porcentaje másico de bacterias inertes coincide con el de bacterias no viables.
Para Ia obtención del porcentaje de materia inerte se midió el porcentaje de área ocupado por las bacterias no viables tal como se describe en el apartado siguiente.
1.3. Detección de grupos bacterianos mediante técnicas FISH.
Reactivos
1- Paraformaldehido (Para llevar a cabo Ia fijación).
1. Se calentaron 65 mi de agua bidestilada hasta 6O0C.
2. Se añadieron 4 g de paraformaldehido (PFA). 3. Se añadió 1 gota de solución de NaOH 2M y se agitó rápidamente hasta que la solución se clarificó Ia solución. 4. Se quitó de la fuente de calor y se añadieron 33 mi de PBS 3X. 5. Se ajustó el pH a 7.2 con HCI.
6. Se eliminó cualquier resto de cristales por filtración a través de 0.2 μm.
7. Se enfrió rápidamente a 40C y se conservó a esa temperatura. - Tampón fosfato salino (XPBS) (Para llevar a cabo Ia fijación).
1. Se esterilizó por filtración a 0.45 μm ó 0.2 μm.
2. Se conservó a 40C.
Para preparar 3X PBS para el reactivo de paraformaldehido se mezclaron: 22.8 g de NaCI 3 g de NaH2PO4 2.88 g de Na2HPO4 1000 mi Agua destilada
Se ajustó a pH 7.4
3- Solución de gelatina (preparación portaobjetos)
Gelatina al 0.1 %.
Sulfato potásico cromato al 0.01 % (Sigma ref. C-5926, 12H2O).
1. Se calentó agua destilada a 6O0C.
2. Se fundió Ia gelatina (100 mg de gelatina + 10 mg de sal de cromato- 12H2O) en 100 mi de agua destilada.
3. Se enfrió a 5O0C para sumergir los portas.
A- Solución de limpieza de portaobjetos FISH: Etanol con 10 % KOH.
5- Etanol 100% (Fijación y lavado): Reactivo etanol absoluto grado PRS. Guardar a temperatura ambiente para lavados, y a 40C para fijación.
6.- Etanol 80% (Lavado): 160 mi de etanol absoluto y 40 mi de agua destilada.
7- Etanol 50% (Lavado): 100 mi de etanol absoluto y 100 mi de agua destilada. 8- Cloruro Sódico 5M (Tampón de hibridación y tampón de lavado): 292.2 g de cloruro sódico y 1000 mi de agua destilada.
1. Se disolvió el NaCI en 800 mi de agua destilada y se ajustó el volumen hasta un litro.
2. Se esterilizó en autoclave a 1210C durante 15 minutos y por filtración.
9- EDTA 0.5M (cuando Ia concentración de formamida es > al 20%): Se esterilizó en autoclave a 1210C durante 15 minutos y por filtración.
10- Tris-HCI 1M pH 8.0 (Tampón de hibridación y tampón de lavado): 121.1 g de tris base, 42 mi de HCI concentrado y se llevó hasta 1 litro con agua destilada.
Se pesó el TRIS y se añadió a 800 mi de agua destilada. S añadió el HCI concentrado y se completó con agua destilada hasta 1 litro. Se esterilizó en autoclave a 1210C durante 15 minutos y por filtración.
11- Agua MiIi-Q (Tampón de hibridación y tampón de lavado): 200 mi de agua MiIi-Q. Se esterilizó en autoclave a 1210C durante 15 minutos y por filtración.
12- SDS 10% (Tampón de hibridación y tampón de lavado): 10 g de SDS. Se llevó hasta 100 mi con agua destilada. Se esterilizó en autoclave a 1210C durante 15 minutos y por filtración.
13- Formamida (Tampón de hibridación y tampón de lavado): Volúmenes de formamida y porcentaje en función de Ia sonda. Se guardaron a temperatura ambiente.
14- Tampón de hibridación:
Tabla 1. Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para Ia preparación del tampón de hibridación en Ia técnica FISH. Reactivo % de Formamida
10 20 25 30 35 40 45
NaCI 5M (μl) 360 360 360 360 360 360 360
HCI-Tris 1M (μl) 40 40 40 40 40 40 40
Formamida (μl) 200 400 500 600 700 800 900
Agua MiIi-Q (μl) 1398 1198 1098 998 898 798 698
SDS 10% (μl) 2 2 2 2 2 2 2
Volumen Final
Figure imgf000021_0001
15- Tampón de lavado: Se precalentó a 46 0C en un tubo de 50 mi.
Tabla 2. Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para Ia preparación del tampón de lavado en Ia técnica FISH.
Reactivo % de Formamida
10 20 25 30 35 40 45
NaCI 5M (μl) 4500 2150 1490 1020 700 460 300
EDTA 0.5M (μl) 500 500 500 500 500 500 500
HCI-Tris 1 M (μl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Agua MiIi-Q (mi) 44.45 46.3 46.96 47.43 47.75 47.99 48.15
SDS 10% (μl) 50 50 50 50 50 50 50
Volumen Final (mi) 50 50 50 50 50 50 50
17- Citifluor: Reactivo para evitar pérdida de fluorescencia.
Procedimiento
Tratamiento de los portaobjetos FISH cubiertos con Teflón
Se compraron portaobjetos con una lámina de tefión en Ia que están perforados 10 pocilios de 8 mm de diámetro.
1. Se lavaron con solución de limpieza.
2. Se enjuagaron con agua destilada. 3. Se secaron al aire (proteger del polvo ambiental). 4. Se cubrieron con gelatina por inmersión en Ia solución de gelatina 0.1 % con sulfato potásico cromato 0.01% (preparada en el momento, T = 6O0C).
5. Se secaron al aire.
Fijación de las bacterias GRAM negativas de las muestras
1. Se lavó 1 mi de floculo con 500 μl de PBS 1X (6000 rpm durante
3 minutos). 2. Se añadieron 3 volúmenes de paraformaldehido (PFA) (750 μl) a
1 volumen (250 μl) de muestra y mantener a 40C durante 1-3 h (mínimo 1 h y máximo 18 h). 3. Se centrifugaron las muestras para recoger las células (6000 rpm durante 3 minutos) y eliminar el fijador. 4. Se lavaron las células con PBS 1X (500 μl).
5. Se resuspendieron en PBS 1X (500 μl) (para tener una concentración de 108 - 109 células/ml) y se añadió 1 volumen (500 μl) de etanol absoluto frío (40C).
6. Se guardaron a -2O0C (las muestras se pueden conservar en estas condiciones durante varios meses).
Fijación de las bacterias GRAM negativas de las muestras
1. Se añadió 1 volumen de etanol absoluto (500 μl) a 1 volumen (500 μl) de muestra y mantener a 4°C durante 4 - 16 h.
2. Se centrifugaron las muestras para recoger las células (6000 rpm durante 3 minutos) y eliminar el fijador.
3. Se lavaron las células con PBS 1X (500 μl).
4. Se resuspendieron en PBS 1X (500 μl) (para tener una concentración de 108 - 109 células/ml) y se añadió 1 volumen
(500 μl) de etanol absoluto frío (40C) y mezclar.
5. Se guardaron a -2O0C (las muestras se pueden conservar en estas condiciones durante varios meses).
Aplicación de las muestras a los portaobjetos FISH
1. Se puso un volumen de 3 μl de muestra fijada en el portaobjetos. 2. Se secó al aire.
3. Se deshidrató en EtOH al 50% durante 3 minutos (por inmersión).
4. Se deshidrató en EtOH al 80% durante 3 minutos (por inmersión).
5. Se deshidrató en EtOH absoluto durante 3 minutos (por inmersión).
6. Tras Ia deshidratación, los portaobjetos pueden ser conservados indefinidamente.
Hibridación "in situ"
1. Se preparará Ia solución de hibridación con formamida Tabla en un eppendorf de 2 mi.
2. De Ia solución de hibridación con formamida, se reservó en un eppendorf 6 x (10-n) μl, siendo n el volumen de sonda utilizada en cada pocilio. Es decir:
N0 de pocilios en un porta: 6
Volumen total por pocilio (μl): 10
Si n = 1 μl se guardarán 54 μl. Si n = 2 μl se guardarán 48 μl. Si n =
3 μl se guardarán 42 μl
3. Se añadió al eppendorf reservado 6 μl de sonda (6 pocilios por porta -> 6 μl de sonda)
4. Se puso un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Sarstedt de 50 mi y se echó sobre el papel Ia solución de hibridación sin sonda.
5. Se pusieron 9 μl de Ia solución de hibridación + 1 μl de sonda en cada pocilio y se repartió homogéneamente por todo el campo.
6. Se introdujo el portaobjetos dentro del tubo Sarstedt, manteniendo siempre Ia posición horizontal. 7. Se incubó a 46 0C durante una hora y media.
8. Se prepararon 50 mi de Ia solución de lavado, y se atemperó a 48 0C.
9. Se sacó del horno y rápidamente se lavaron e introdujo dentro del tubo con Ia solución de lavado. 10. Se incubó en un baño a 48 0C durante 15 - 20 minutos.
11. Se lavó con agua destilada. 12. Se secó al aire en Ia oscuridad. 13.Se observó al microscopio.
1.4. Detección de grupos bacterianos mediante tinción con DAPI (diclorhidrato de 4",6-diamidino~2-fenilindol).
Reactivos
Reactivo DAPI (Kawaharasaki et al. (1999). Water Res. 33: 257-256). 5 mg de DAPI sobre 100 mi de PBS (1x, pH = 7.2). Concentración de trabajo: 50 μg/ml (solución de trabajo).
Se almacenó Ia solución de stock a -2O0C, y Ia de trabajo a 40C. Se esterilizó por filtración.
Tampón Citrato para DAPI: Reactivo a mezclar con fluoroguard cuando se utiliza DAPI para evitar interferencias del fluoroguard con el fluorocromo.
Procedimiento
1. Tras hibridar, se añadieron 50 μl de solución DAPI de trabajo por pocilio.
2. Se dejó durante 5 minutos en Ia oscuridad, y a temperatura ambiente.
3. Se lavó con agua destilada. 4. Se dejó secar al aire.
5. Se observó en el microscopio de epifluorescencia.
1.5. Obtención del porcentaje de bacterias.
El porcentaje de bacterias totales de una muestra determinada está compuesto por distintos grupos bacterianos. En Ia siguiente ecuación se muestran cada uno de los grupos, cuya suma se iguala al total de bacterias de Ia muestra, considerándose éste el 100%.
X7, = X1 +XA +XPAO+XH La determinación del porcentaje de bacterias no viables o materia inerte (X¡) se ha explicado en el apartado 1.2.
Obtención del porcentaje de bacterias autótrofas (XA).
Se obtuvo el porcentaje másico de bacterias autótrofas presentes en Ia biomasa. Para ello, se combinó Ia técnica FISH y Ia tinción con DAPI.
Mediante Ia técnica FISH, se obtuvo el porcentaje de área ocupado por bacterias autótrofas frente al área ocupada por las bacterias del dominio Eubacteria. Con Ia tinción con DAPI se corrigió el porcentaje obtenido mediante FISH debido a que las sondas actualmente descritas para el dominio Eubacteria demostraron no cubrir el total de bacterias presentes en Ia muestra. El porcentaje de bacterias hibridadas con Ia sonda EUBmix (sondas de Ia tabla 4 utilizadas conjuntamente) frente a bacterias teñidas con DAPI ha resultado ser 90 ± 3 % para Ia Planta Piloto, y de 91 ± 1% para el Sequencing Batch Reactors (SBR). Debido a Ia poca variabilidad que presentan estos resultados, se aconseja Ia utilización de dicho rango de valores como valores típicos para Ia calibración del modelo mediante el método aquí expuesto.
Tabla 3. Sondas FISH asociadas a bacterias autótrofas:
Sonda Secuencia (5'- 3') Bacteria diana % FA Referencia
Mobarry et al., (1996).
Nso122 Betaproteobacteria
SEQ ID NO: 1 35 Appl Environ Microbiol. oxidante de amonio
62: 2156-2162. Mobarry ef a/., (1996).
NIT3+ SEQ ID NO: 2 Nitrobacter spp. 40 Appl Environ Microbiol.
62: 2156-2162.
+ Necesita sonda competidora
Tabla 4. Sondas FISH asociadas al dominio eubacteria (sondas EUBmix):
Sonda Secuencia (51- 3') Bacteria diana % FA Referencia
Ammán ef al., (1990).
EUB338 SEQ ID NO: 3 Consenso Eubacteria 0-50 Appl. Environ. Microbiol.
56, 1919-1925 (1990). Daims ef a/., (1999).
EUB338
SEQ lD NO: 4 Planctomycetales 0-50 Svst. ADDI. Microbiol.
H
22: 434-444.
Daims ef a/., (1999).
EUB338
SEQ ID NO: 5 Verrucomicrobiales 0-50 Svst. Appl. Microbiol.
ItI
22: 434-444.
El modelo ASM2 supone que el contenido en bacterias autótrofas es debido únicamente a Ia presencia de bacterias nitrificantes Nitrosomonas o Nitrohacter. Sin embargo, en los sistemas biológicos de tratamiento de aguas residuales podrían cobrar importancia algunas otras especies autótrofas. Entre ellas cabe destacar:
- Bacterias que extraen su energía de procesos de oxidación de sales ferrosas o manganosas, pertenecientes a los géneros Clonothrix, Leptothrix, etc.
- Tiobacterias, como Thiotríx, Beggiatoas, capaces de oxidar el SH2 y el azufre a ácido sulfúrico.
- Bacterias oxidadoras de hidrógeno como las Hydrogenomonas, que oxidan el hidrógeno producido por las bacterias heterótrofas en las fermentaciones de los glúcidos, produciendo agua.
En general, en sistemas de tratamiento de aguas residuales convencionales, Ia cantidad de dichas bacterias suele ser despreciable, con Io que no se comete un error importante asumiendo que las Nitrosomonas y las Nitrobacter son las únicas bacterias autótrofas del sistema.
La cuantificación de las especies se realizó siguiendo el procedimiento explicado en el ejemplo 1.6.
El valor de XA en unidades de DQO por litro se obtuvo mediante el porcentaje másico de bacterias autótrofas frente a bacterias del dominio Euhacteria, corregido mediante Ia relación EUB/DAPl, y multiplicado por el valor de DQO. El procedimiento consistió en obtener el porcentaje de bacterias autótrofas frente a bacterias totales (representadas por el dominio eubacteria): %A. Para ello se obtiene el porcentaje de bacterias hibridadas con Ia sonda EUBmix frente al total de bacterias presentes en Ia muestra (obtenidas por Ia tinción con DAPI): %EUB/DAPI. A continuación se multiplica %A x (%EUB/DAPI)/100, obteniéndose el porcentaje de bacterias autótrofas frente al total de bacterias marcadas por DAPI: %A'. De acuerdo con Ia ecuación del balance de DQO:
SRT
X H + XA + XPAO + X I + X I0 TJP^ = DQO SUSP
JnLKl el lado derecho de Ia igualdad es conocido, ya que Ia DQO se habrá determinado analíticamente, Ia Xi0 Ia obtendremos según los parámetros del agua afluente, y el HRT y el SRT son variables de operación conocidas. Suponiendo que este valor (lado derecho de Ia ecuación) fuera 100 mg DQO/I, Ia DQO debida a las bacterias autótrofas se podría calcular como 100 x (%A'). El valor de %A' debe utilizarse en porcentaje sobre 1. Es decir, si %A'= 80, Ia DQO debida a estas bacterias será 100 x 0,8 = 80 mg DQO/I.
Obtención del porcentaje de bacterias PAO (XPAO)-
En este caso, se procede del mismo modo que en el caso de Ia determinación de XA- Sin embargo, para la determinación de bacterias con fenotipo PAO mediante Ia técnica FISH, Ia variedad bacteriana está mucho más definida. Además de Ia combinación de sondas EUBmix, para Ia cuantificación de las bacterias con fenotipo PAO habrá que aplicar las sondas que se describen en Ia tabla 5.
El valor de XpAo se obtendrá como el resultado de corregir mediante Ia relación EUB/DAPI el valor del porcentaje PAOmix/EUB, y multiplicar el resultado por el valor del balance de Ia DQO, al igual que en caso del cálculo de XPAO-
Tabla 5. Sondas FISH asociadas a bacterias con fenotipo PAO (sondas PAOmix).
Sonda Secuencia (5'- 3') Bacteria diana % FA Referencia
PAO Subgrupo Crocetti ef a/.,(2000)..4pσ/
SEQ ID NO: 6 a H 35 Λ > rv
462 Rhizophagus tenuis Environ Microbiol., 66, 1115- 1182.
Crocett¡ ef a/.,(2000). Appl
PAO Accumulibacter
SEQ ID NO: 7 35 Environ Microbio!., 66, 1175- 651 phosphatis 1182.
Crocetti ef a/.,(2000). Appl
PAD
SEQ ID NO: 8 Subgrupo R. tenuis 35 Environ Microbiol., 66, 1175-
1182.
Las sondas pueden ser diseñadas en el propio laboratorio, o adquiridas a través de centros que se dedican ello, y en los que se pueden adquirir las sondas marcadas con un fluorocromo específico, o incluso sin marcar. En el caso de este estudio, se ha optado por adquirir las sondas ya marcadas, de forma que se reduce Ia posible fuente de errores.
Las sondas se han adquirido a través de TIB MOLBIOL (Alemania). Existen bases de datos para consultar secuencias y especificidad de las sondas a través de Internet en páginas como:
http://www.tib-molbiol.com: Empresa dedicada al diseño y distribución de sondas. http://www.microbial-ecology.net: Base de datos online de sondas marcadas para ARN ribosómico http://www.ncbi.nlm.nih.gov: Centro Nacional de Información
Biotecnológica. http://www.wga.bv.tum.de: Aquí podemos acceder al fichero en pdf/word del cuestionario sobre biografía de una muestra para Ia técnica FISH. Institute of Water Quality Control and Waste Managment, Universidad
Técnica de Munich.
Obtención del porcentaje de bacterias heterótrofas (XH)-
Debido a la gran diversidad de bacterias heterótrofas presentes en Ia biomasa de un proceso de fangos activos, sería inviable Ia aplicación de sondas para Ia obtención del porcentaje de bacterias heterótrofas. Sin embargo, volviendo a Ia ecuación en Ia que se iguala el porcentaje de bacterias totales a Ia suma de bacterias no viables, autótrofas, PAO y heterótrofas, podemos observar que Ia XH es el único parámetro que queda por determinar en esta ecuación. Así, el valor de XH puede obtenerse despejándolo de dicha ecuación, quedando así resueltas todas las incógnitas del sistema mediante un cálculo directo.
XH = 100 % - (XA + XPAO + Xi)
1.6. Cálculo del área ocupada por bacterias.
El método desarrollado para Ia cuantificación de las distintas especies microbianas presentes en las muestras se dividió en cinco etapas básicas:
1. Toma de muestra. Las muestras se tomaron de una parte representativa del fango o cultivo de bacterias. Para ello, fue necesario que el reactor estuviese completamente mezclado.
2. Aplicación de Ia técnica de hibridación in situ, FISH.
- Fijación. Se paraliza toda actividad bacteriana presente en una muestra con un contenido en bacterias de aproximadamente 108 - 109 bacterias por mililitro. - Hibridación con las sondas pertinentes según el protocolo descrito en el ejemplo 1.5.
- En este punto, el cálculo del área también se puede llevar a cabo mediante experimentos de viabilidad celular. Las células viables se marcan con un fluoróforo y las no viables con otro fluoróforo diferente. En Ia FIG 1 podemos observar Ia comparación de los métodos de cuantificación por áreas y por número de bacterias para Ia obtención del porcentaje de bacterias no viables mediante Ia técnica de Viabilidad Celular.
3. Observación en el microscopio y toma de imágenes. Una vez realizada Ia hibridación, los portaobjetos se examinaron bajo un microscopio de epifluorescencia o un microscopio confocal láser, con los filtros adecuados según los fluorocromos utilizados. Mediante una cámara digital acoplada al microscopio se tomaron imágenes de entre 20 y 40 campos representativos de Ia muestra hibridada. Se utilizó Ia cámara digital DP-12 de Olympus acoplada a un microscopio modelo BX-50 también de Olympus. Las imágenes fueron captadas en color, aunque en función del tipo de análisis a realizar, también podrían ser captadas en escala de grises. Las imágenes tomadas corresponden a muestras hibridadas según Ia metodología de Ia técnica FISH, de modo que se trata de imágenes de fluorescencia en las que en general Ia intensidad no es muy alta. Es importante tomar las imágenes con un tiempo de exposición elevado de manera que Ia intensidad de las mismas sea Io más alta posible, sin llegar a saturar las áreas de interés de Ia imagen, Io que provocaría Ia pérdida de Ia información de intensidad de Ia señal. De este modo llegamos a obtener una imagen con Ia máxima información posible.
4. Cuantificación de los datos mediante software.
El procesado de Ia imagen se lleva a cabo en varios pasos: a. Adquisición de las imágenes en el programa de procesado y análisis de imágenes. En Ia presente invención se utilizó un programa de cálculo matemático como el MATLAB© para el procesado de las imágenes. Este software permitió el tratamiento de las imágenes basándose no sólo en Ia apariencia de las imágenes, sino en Ia información numérica que en ella se contiene, Ia información de cada píxel individual.
Una vez Ia imagen fue adquirida, los inventores se centraron en el tratamiento independiente de los diferentes canales (rojo, verde o azul). Cada color corresponde a un grupo bacteriano, autótrofas y PAO, así como viables y no viables.
b. El siguiente paso fue Ia binarización y selección del valor umbral.
Para poder cuantificar un área en una imagen, fue necesario que existiera una diferenciación clara entre los grupos de píxeles que conforman Ia imagen. Por ello, se convirtió Ia imagen en blanco y negro, de forma que Ia señal positiva estuviera representada por los píxeles blancos, y Ia negativa o "background" por los píxeles negros. Binarizar una imagen consiste en pasarla a blanco y negro (no a escala de grises) de forma que Ia información contenida en los píxeles conste únicamente de ceros y unos. Los píxeles negros se representarán por un "0", mientras que a los píxeles blancos se les asignará un "1". De esta forma el software de cuantificación es capaz de cuantificar los píxeles correspondientes a cada una de las clases, "blanco" o "negro" y por tanto, sus áreas correspondientes (FIG 2). El software de cuantificación devolvió un informe detallado de los porcentajes de áreas ocupadas por las bacterias presentes en Ia muestra hibridada.
Este proceso se repitió para cada uno de los campos fotografiados, al menos 20. Con todos los resultados obtenidos se construyó una gráfica, en Ia que se representó el porcentaje obtenido en cada imagen, y una media acumulada de todos los campos (FIG 3).
5. Análisis de los resultados. El informe debe ser revisado cuidadosamente con el fin de filtrar posibles resultados erróneos o estadísticamente incoherentes.
El resultado final es un número que representa el porcentaje en área de una especie bacteriana en Ia muestra. El software de cuantificación permite obtener un resultado preciso, fiable y rápido sin Ia necesidad de Ia intervención de un operador experto. La siguiente tabla muestra el número de píxeles obtenido en cada uno de los canales rojo y verde y el cálculo del porcentaje de bacterias PAO.
Tabla 6. Resultados de los recuentos bacterianos realizados mediante el software de cuantificación.
Figure imgf000031_0001
Una de las ventajas importantes del método de cuantificación desarrollado es que puede ser aplicado perfectamente utilizando un microscopio de fluorescencia convencional, Io que supone un importante ahorro económico y de recursos.
1.7. Determinación de Ia demanda química de oxígeno (DQO)
Para Ia determinación de Ia (DQO) se utilizaron dos métodos analíticos dependiendo de Ia concentración esperada en Ia muestra:
- 50 < DQO esperada < 900 (mg DQO/I): Se utilizó el método estándar de oxidación de Ia materia orgánica con dicromato mediante digestión con reflujo abierto (APHA, (2005). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st edition. American Public Health Association, Washington, DC). Este test se llevó a cabo por calentamiento bajo condiciones de reflujo total de un determinado volumen de muestra de agua con un exceso conocido de dicromato, en presencia de ácido sulfúrico del 96%. El periodo de reflujo estándar fue de dos horas. El exceso de dicromato se determina mediante una valoración redox.
- 10 < DQO esperada < 150 (mg DQO/I): Se utilizó el test de Ia firma comercial Merck (Spectroquant®). Consistió en una digestión con reflujo cerrado y determinación colorimétrica del exceso de dicromato.
1.8. Obtención de los valores absolutos de DQO de cada grupo bacteriano.
La contribución de cada uno de los grupos bacterianos a Ia determinación de Ia DQO se lleva a cabo aplicando Ia siguiente ecuación;
HRT
Figure imgf000032_0001
En el siguiente apartado de validación del método se describe más concretamente cómo se lleva a cabo el cálculo y Ia asignación de cada uno de los parámetros.
EJEMPLO 2. Validación del método
El método propuesto ha sido validado para el caso particular de un sistema SBR enriquecido en bacterias con fenotipo PAO (Organismos Acumuladores de Poli-fosfato) para eliminación biológica de fósforo. En este tipo de sistemas se obtienen poblaciones de bacterias con fenotipo PAO con abundancias cercanas al cien por cien. Para ello, se han comparado los valores de los parámetros obtenidos mediante una calibración convencional, con los obtenidos mediante el método propuesto en esta invención, utilizando los datos de tres calibraciones llevadas a cabo por el Doctor Ramón Barat en su tesis "Estudio de Ia precipitación de fósforo inducida biológicamente en el tratamiento de aguas residuales", presentada en el año 2004 en Ia Universidad Politécnica de Valencia (Barat, R. (2004). Estudio de Ia precipitación de fósforo inducida biológicamente en el tratamiento de aguas residuales. Universidad Politécnica de Valencia, Dpto. Ingeniería Hidráulica y Medio Ambiente. Valencia).
2.1. Descripción del proceso
Se utilizó un sistema enriquecido en bacterias con fenotipo PAO para Ia eliminación biológica de fósforo. El reactor fue operando durante un periodo de ocho meses bajo las condiciones mostradas en Ia tabla 7. Las muestras analizadas pertenecen a los tres estados estacionarios iniciales distintos descritos en Ia tabla 8.
Tabla 7. Condiciones de operación de los tres experimentos (Barat, R. (2004) Estudio de Ia precipitación de fósforo inducida biológicamente en el tratamiento de aguas residuales. Universidad Politécnica de Valencia, Depto. Ingeniería Hidráulica y Medio Ambiente. Valencia). TRC "alimento HACaHmento P/DQOalimento Caa|¡mento
Experimento
(días) (mg/l) (mg DQO/I) (gP/ gDQO) (mg/l)
1 9 10 218 0.046 10
2 10 15 268 0.056 90
3 10 15 268 0.056 60
Tabla 8. Condiciones iniciales para cada uno de los experimentos (Barat 2004).
Experimento 1 2 3
Sólidos suspendidos (mg/l) 1050 2438 1588
% sólidos suspendidos volátiles 72.0 62.5 65.1
DQO total (mg/l) 1200 2300 1300
P total (mg P/l) 111 308 180
P precipitado (mg P/l) n.d. 20.9 20.3
P soluble (mg P/l) 4.2 7.3 11.9
Calcio (mg Ca/I) 10 90 60
Ácido acético (mg DQO/I) 112.0 138.7 138.7
PH 7.33 7.50 7.60
2.2. Medida de Ia DQO del fango
La DQO total del fango, DQOT, fue medida al final de Ia etapa aerobia de cada uno de estos experimentos. Teniendo en cuenta que todo el acetato (VFA) suministrado al inicio de cada experimento fue totalmente consumido durante Ia etapa anaerobia, se puede asumir que Ia DQO total del fango al final de Ia etapa aerobia correspondió únicamente a Ia DQO de Ia biomasa, o DQO suspendida (DQOSUSP). En Ia tabla 9 se muestran ios valores de DQO obtenidos en cada uno de los experimentos.
Tabla 9. DQO del fango al final de Ia etapa aerobia (Barat 2004).
Experimento
DQOTOTAL (mg/l) 1200 2300 1300
Por otra parte, es importante remarcar que debido a que el reactor de laboratorio utiliza un agua residual sintética, y ésta no contiene sólidos suspendidos, el parámetro Xi0 es cero. De este modo, Ia ecuación para determinar la DQO total quedaría escrita para este caso concreto del siguiente modo:
5 DQOTOTAL = XH + XA + XPA0 + X1
Consideraciones sobre el balance de DQO
En un sistema biológico convencional de tratamiento de aguas residuales,0 Ia DQOSUSP puede asimilarse a Ia contribución de los distintos tipos de bacterias presentes, Xs, y a Ia fracción inerte de las mismas, X|.
Sin embargo, en el caso concreto de estudio, con una muestra enriquecida en bacterias con fenotipo PAO, se asumió que Ia contribución de bacterias5 heterótrofas y autótrofas a Ia DQO total del fango es despreciable. Así pues, Ia ecuación quedaría como sigue;
DQOSUSP = ^ PAO + Xι 0 Por otra parte, en un sistema de estas características, se podría esperar Ia presencia de bacterias con fenotipo GAO (bacterias acumuladoras de glicógeno), así que habría que tener en cuenta Ia contribución de estas al valor de Ia DQO del fango. La ecuación quedaría de Ia siguiente forma; ^ DQOsusp = XpAo + ^GAO +Xl
En este caso concreto, para poder calibrar los parámetros del modelo ASM2 se resolvieron los parámetros de Ia ecuación anterior. Como el valor de Ia DQO del fango era conocida, tan solo fue necesario determinar0 mediante los métodos microbiológicos propuestos, los porcentajes de bacterias con fenotipos PAO y GAO, y bacterias inertes.
En Ia FIG 4 se muestra resumidamente el flujo de trabajo para realizar una determinación de éste tipo. 5
2.3. Obtención microbiológica de los porcentajes de PAO, GAO y bacterias inertes. Siguiendo el procedimiento experimental descrito en el ejemplo 1 de Ia presente invención, se ha obtenido Ia distribución de las poblaciones microbianas para cada uno de los experimentos (tabla 11). Para el porcentaje de bacterias hibridadas con las sondas EUBmix (combinación de las sondas EUB338 I, Il y III, que híbrida sobre el dominio Eubacteria), frente al número total de bacterias teñidas con DAPI, se ha utilizado el valor obtenido de los experimentos descritos en Ia obtención del porcentaje de bacterias autótrofas (XA) del ejemplo 1.5, es decir, %EUB/DAPl = 91 + 1 %. Esta relación permitió corregir los porcentajes obtenidos mediante Ia técnica FISH.
Las poblaciones bacterianas estudiadas mediante FISH fueron las poblaciones relevantes en los procesos de Enhanced biológica! phosphorus renoval (EBPR), es decir, poblaciones con fenotipos PAO y GAO. Para las poblaciones bacterianas con fenotipo PAO se utilizó Ia combinación de sondas PAO descritas en Ia determinación de bacterias PAO (XPAO) del ejemplo 1.5.
Para Ia detección de las poblaciones de bacterias con fenotipo GAO, se utilizaron las sondas de Ia tabla 10.
Tabla 10. Sondas FlSH asociadas a bacterias con fenotipo GAO.
Sonda Secuencia (5'- 3') Bacteria diana % FA Referencia
Crocetti et al.
(2002).
Algunas
GAOQ431 SEQ ID NO: 9 35 Competibacter Microbiology.
148: 3353-
3364 Crocetti et a/.
(2002).
Algunas
GAOQ989 SEQ ID NO: 10 35 Competibacter Microbiology.
148: 3353-
3364 Wong et al.
(2004).
Organismos relativos
TFO DF218 SEQ ID NO: 11 a Defluviicoccus 25-35 Microbiology.
150: 3741-
3748 Wong et al.
(2004).
Organismos relativos
TFO DF618 SEQ ID NO: 12 a Defluviicoccus 25-35 Microbiology.
150: 3741-
3748 Meyer ef a/. DEF988+ SEQ.DNO: 13 «?%£££» 35 m }ogy
152:419-429 Meyer et a/.
DEF1020* SE Q,DNO:14 ^ T 3δ Mi ,oβy. 152:419-429
+ Necesita sonda competidora
Para Ia cuantificación de las poblaciones bacterianas hibridadas mediante Ia técnica FISH se utilizó el software de cuantificación descrito en el ejemplo 1.6 de Ia presente invención.
Para Ia obtención de los valores de Viabilidad Celular, Ia técnica fue aplicada según Io descrito en el ejemplo 1.1. Los valores de los porcentajes másicos de bacterias con fenotipos PAO y GAO, y los resultados de Ia aplicación de Ia técnica de Viabilidad Celular para los tres experimentos, quedan reflejados en Ia tabla 11.
Tabla 11. Distribución de las poblaciones microbianas, en porcentajes másicos, relativas a procesos de EBPR para los tres experimentos realizados.
Experimento 1 2 3
% PAO/EUB 89 ±8 90 ±7 90 ±6
% GAO/EUB 0 <1 <1
% DEF/EUB 5±2 <1 4±2
% PAO/DAPI 81 ±7 82 + 6 82 ±5
% GAO/DAPI 0 <1 <1
% DEF/DAPI 5±2 <1 4±2
Total cels/ml 10"
8 3.20 3.29 3.05
% Viables 84 90 88
% No viables 16 10 12
En Ia tabla 11 se puede apreciar que las bacterias con fenotipo GAO estuvieron prácticamente ausentes durante todo el periodo de operación del SBR. Tan sólo se llegó a observar una ligera presencia de bacterias con fenotipo GAO que no llegó a superar el 5% en masa de Ia población bacteriana total en ninguno de los casos. Por esta razón, se ha decidido despreciar Ia contribución de las bacterias GAO a Ia DQO del fango para posteriores cálculos.
2.4. Cálculo de los valores de XPAo y Xi
Como se muestra en Ia tabla 11 , el porcentaje de bacterias con fenotipo PAO en todos los experimentos fue muy elevado, por tanto se puede afirmar que se trata de un cultivo altamente enriquecido en bacterias PAO. De esta forma, se confirma que no se cometió un error importante al suponer que Ia contribución de las bacterias heterótrofas y autótrofas a Ia DQO total del fango era despreciable.
Asumiendo que el área total ocupada por las bacterias representa Ia fracción (XPAO + XGAO), conocido el porcentaje de bacterias PAO en Ia muestra, y teniendo en cuenta que Ia cantidad de bacterias GAO fue prácticamente despreciable en los tres experimentos (siempre menor al 5 %), es posible calcular Ia XPAO multiplicando Ia DQOSUSP por el porcentaje de PAO en cada experimento. Los resultados se muestran en Ia tabla 12.
Por otra parte, ya que se despreció Ia presencia de bacterias GAO, Ia fracción XGAO, I (fracción de bacterias GAO no viables), también fue despreciable. Así pues Ia fracción XPAO, I se asoció a bacterias PAO dañadas o muertas, es decir, bacterias no viables. Por tanto, fue posible calcular el parámetro (XPAO, I) aplicando el porcentaje de bacterias no viables sobre Ia DQOSUSP, que en este caso se correspondía con Ia DQOTOTAL- Esto será cierto siempre que se trate de un sistema como el estudiado, en el que Ia fracción de X]o de entrada es nula, ya que el alimento proporcionado al sistema es un alimento totalmente soluble.
La determinación directa del valor de X| (en este caso XPAO, I), supone una importante disminución en Ia incertidumbre del proceso de cálculo a Ia hora de calibrar los parámetros del modelo ASM2.
Tabla 12. Fracciones de Ia DQO obtenidas en cada experimento. Experimento 1 2 3
DQOTOTAL (mg/l) 1200 2300 1300
% PAO/DAPI 81 82 82
XPAO (mg/l) 972 1884 1065
% No viables 16 10 12
XPAO, i (mg/l) 192 230 156
La determinación de los valores de XPAO y XPAO, I está sujeta a algunas simplificaciones:
- Se despreció Ia cantidad de bacterias con fenotipo GAO presentes en Ia biomasa.
- Se asumió que en un sistema de EBPR enriquecido como éste, Ia cantidad de bacterias heterótrofas y autótrofas presentes en Ia biomasa es despreciable, XH = 0 y XA = 0. - Se supuso que, debido a Ia homogeneidad de Ia población bacteriana, era posible relacionar de forma directa el valor de Ia DQO y el porcentaje de área que ocupan las bacterias PAO. En un sistema heterogéneo, con bacterias de diferentes tamaños (PAO, GAO, filamentosa, etc.), los porcentajes de área deberían normalizarse para poder ser aplicados sobre el valor de Ia DQO.
- Se despreció Ia presencia de fracciones inertes en el fango o el agua de entrada a Ia planta, que podrían aportar una fracción de DQO al parámetro X1
Es importante remarcar que este valor se obtiene directamente del examen de Ia biomasa, y no como resultado de técnicas de calibración convencionales que no aseguran un resultado debido exclusivamente al tipo de bacterias a calibrar. De modo que se podría decir que el resultado obtenido mediante Ia combinación de técnicas microbiológicas proporciona un valor "real" del contenido en bacterias (de un grupo específico) en Ia biomasa del fango activo.
2,5. Comparación de los valores de XPAo determinados mediante calibración y mediante el método microbiológico propuesto. Con el fin de validar el método propuesto de determinación del valor de XPAO, se compararon los valores obtenidos mediante una calibración convencional (ajuste matemático para Ia minimización de errores), y los obtenidos con ayuda de las técnicas microbiológicas moleculares mediante el método propuesto. En Ia tabla 13 se muestran los valores obtenidos mediante el método de calibración tradicional (calib.) y el método de calibración microbiológico propuesto (micro.)
Tabla 13. Valores de XpAo obtenidos por calibración y microbiológicamente.
Experimento 1 2 3
DQOTOTAL (mg/l) 1200 2300 1300
XPAO (mg/l) calib. 1016 1916 1083
% XPAO / DQOT calib. 85 83 83
XPAO (mg/l) micro. 972 1884 1065
% XPAO/DQOT micro. 81 82 82
Como se puede observar en la tabla 13, los valores de XPAo obtenidos mediante el método microbiológico coinciden casi a Ia perfección con los valores utilizados en Ia calibración del modelo por Barat, (2004). En el peor de los casos, Ia desviación entre el valor obtenido mediante Ia calibración y el obtenido microbiológicamente, es del 4 %. Por ello, es posible concluir que el método propuesto para Ia obtención de XPAo es válido, y permitiría llevar a cabo Ia calibración del modelo ASM2 para un SBR con un proceso de EBPR, sin necesidad de realizar un ajuste matemático para Ia minimización de errores para su obtención. Esto supone una importante disminución en el esfuerzo y el tiempo de cálculo, así como en Ia fiabilidad del resultado, ya que se trata de una medición directa de los parámetros.
En Ia FIG 5 se comparan los resultados de las simulaciones utilizando los valores de XPAo obtenidos microbiológicamente, de Ia evolución en Ia concentración de fósforo soluble y de ácido acético, con los resultados experimentales.
Tal y como se puede observar en la FIG 5, el modelo es capaz de reproducir con gran exactitud Ia evolución de la concentración de fósforo y ácido acético en todos ios experimentos, con lo que se valida el método de obtención de XPAo mediante técnicas microbiológicas moleculares. En esta figura, tanto círculos como cuadrados representan los puntos obtenidos experimentalmente, es decir, por medio de analíticas realizadas a muestras de agua extraídas del reactor durante el experimento. Por el contrario, las líneas representan Ia simulación realizada tras Ia calibración del modelo para esos casos concretos. Por tanto, las líneas (valores calculados mediante el modelo calibrado) describen perfectamente el comportamiento que muestran los puntos (valores obtenidos experimentalmente mediante analíticas directas). Es decir, que el modelo, calibrado mediante Ia ayuda del método microbiológico propuesto, representa Ia realidad a Ia perfección.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para determinar Ia contribución de Ia biomasa al balance de DQO en agua que comprende: a. obtener una muestra de agua, b. determinar los porcentajes de los grupos bacterianos y materia inerte de Ia muestra obtenida en (a) mediante técnicas microbiológicas moleculares, c. determinar los siguientes parámetros de Ia muestra de agua obtenida en (a); DQO total (DQOT), DQO soluble (DQOSOL),
DQO suspendida (DQOSUSP), DBO límite total (DBOLT), DBO límite soluble (DBOL SOL), tiempo de retención de sólidos (SRT) y tiempo de resistencia hidráulico (HRT), d. determinar el balance de DQO utilizando los parámetros obtenidos en (c) y e. determinar Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte según (b) al balance de DQO calculado en (d).
2. Método según Ia reivindicación 1 donde Ia determinación del balance de DQO del paso (d) y Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte se lleva a cabo mediante una ecuación que comprende,
SRT DQ° SUSP = XH + XA + XPAO + XI + XI0 JTΏJ XH, XA y XPAO representan Ia DQO debida a Ia presencia de bacterias heterótrofas, autótrofas, PAO y materia suspendida inerte, respectivamente. Xio es Ia DQO debida a Ia materia suspendida inerte aportada por el agua que entra a un sistema.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde Ia muestra de agua es agua residual.
4. Método según Ia reivindicación 3 donde el agua residual procede de instalaciones para el tratamiento de aguas residuales basado en un sistema de fangos activados.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde Ia determinación de los porcentajes de los grupos bacterianos y materia inerte comprende: a. marcar las bacterias de Ia muestra mediante técnicas FISH, tinción con DAPI y técnicas de viabilidad celular, b. adquirir imágenes de Ia fluorescencia emitida por las bacterias marcadas con las técnicas descritas en (a) y c. determinar las áreas ocupadas por los grupos bacterianos y materia inerte.
6. Método según Ia reivindicación 5 donde el mareaje de las bacterias mediante técnicas FISH se lleva a cabo con las sondas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, con las sondas SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5 y con las sondas SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
7. Método según Ia reivindicación 5 donde, Ia determinación de las áreas ocupadas por los grupos bacterianos y materia inerte se lleva a cabo analizando las imágenes de, al menos, 20 campos por muestra.
8. Programa de ordenador caracterizado porque comprende instrucciones de programa para provocar que un sistema de computación realice un método que comprende: a. adquirir imágenes de fluorescencia emitida según Ia reivindicación 6 (b) de, al menos, 20 campos por muestra, b. determinar las áreas medias de los grupos de bacterias y materia inerte de las imágenes adquiridas en (a) y c. determinar el balance de DQO y Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte al balance de DQO.
9. Programa de ordenador según Ia reivindicación 8 donde Ia determinación del balance de DQO y Ia contribución de cada grupo bacteriano y materia inerte al balance de DQO se lleva a cabo según la ecuación de la reivindicación 2.
10. Programa de ordenador según Ia reivindicación 9, caracterizado porque está almacenado en unos medios de grabación.
11. Programa de ordenador según Ia reivindicación 10, caracterizado porque es portado por una señal portadora eléctrica.
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