WO2010024711A1 - Method for treating oncological diseases - Google Patents

Method for treating oncological diseases Download PDF

Info

Publication number
WO2010024711A1
WO2010024711A1 PCT/RU2008/000680 RU2008000680W WO2010024711A1 WO 2010024711 A1 WO2010024711 A1 WO 2010024711A1 RU 2008000680 W RU2008000680 W RU 2008000680W WO 2010024711 A1 WO2010024711 A1 WO 2010024711A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
protamine
fragments
cells
fragmented
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000680
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Михаил Аркадьевич ШУРДОВ
Сергей Станиславович БОГАЧЕВ
Владимир Алексеевич РОГАЧЕВ
Валерий Петрович НИКОЛИН
Нелли Александровна ПОПОВА
Анастасия Сергеевна ЛИХАЧЕВА
Тамара Егоровна СЕБЕЛЕВА
Дмитрий Николаевич СТРУНКИН
Александр Геннадьевич ШИЛОВ
Елена Рэмовна ЧЕРНЫХ
Евгений Львович ГЕЛЬФГАТ
Екатерина Анатольевна АЛЯМКИНА
Евгения Владимировна ДОЛГОВА
Original Assignee
Shurdov Mihail Arkad Evich
Bogachev Sergei Stanislavovich
Rogachev Vladimir Alekseevich
Nikolin Valery Petrovich
Popova Nelli Aleksandrovna
Lihacheva Anastasiya Sergeevna
Sebeleva Tamara Egorovna
Strunkin Dmitry Nikolaevich
Shilov Aleksandr Gennad Evich
Chernyh Elena Removna
Gel Fgat Evgeny L Vovich
Alymkina Ekaterina Anatol Evna
Dolgova Evgeniya Vladimirovna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shurdov Mihail Arkad Evich, Bogachev Sergei Stanislavovich, Rogachev Vladimir Alekseevich, Nikolin Valery Petrovich, Popova Nelli Aleksandrovna, Lihacheva Anastasiya Sergeevna, Sebeleva Tamara Egorovna, Strunkin Dmitry Nikolaevich, Shilov Aleksandr Gennad Evich, Chernyh Elena Removna, Gel Fgat Evgeny L Vovich, Alymkina Ekaterina Anatol Evna, Dolgova Evgeniya Vladimirovna filed Critical Shurdov Mihail Arkad Evich
Publication of WO2010024711A1 publication Critical patent/WO2010024711A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0031—Rectum, anus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to medicine and can be used in the treatment of patients with preparations of fragmented human DNA in injectable form or in the form of microclysters in a nucleolytically stable complex with histone-like protamine protein, which is used as a leukostimulating drug in cancer treatment regimens and as an anti-cancer agent.
  • a known method of treating patients using a drug with antitumor, antitoxic and radioprotective effects which is a fragmented up to 200-2000 pairs of nucleotides nucleoprotein complex with a content, wt.%: Double-stranded DNA 60-80 and nuclear matrix proteins 20-40, upon receipt of which use species-specific biological raw materials - human placenta [RU 2234323, A 61 K 48/00, 2004, 05.27.2003.
  • a drug with antitumor, antitoxic and radioprotective effects is a fragmented up to 200-2000 pairs of nucleotides nucleoprotein complex with a content, wt.%: Double-stranded DNA 60-80 and nuclear matrix proteins 20-40
  • the disadvantage of this method is the relatively low treatment efficiency.
  • the closest in essence to the proposed one is a method of treating oncological diseases based on introducing fragmented DNA into the patient’s body, using homologous DNA having a biologically active size, comprising the whole genome of a physiologically and genetically healthy donor, while the DNA is administered in a dose creating such the concentration of DNA in the blood plasma, which is equal to or higher than the concentration of the DNA of the blood plasma itself, but does not exceed the maximum permissible concentration of 30 ⁇ g / ml [RU 2313349, A 61 K 48/00, 2006, 01/16/2006. A method of treating cancer].
  • fragmented DNA is not protected from the action of human blood nucleases and predominantly short DNA fragments are delivered to the cells.
  • the maximum allowable doses of fragmented DNA (approaching 1500 ng / ml) are used. Only in this case, a certain number of full-sized DNA fragments are delivered to the cell, which are able to repair damage zones associated with the loss of one nucleotide or a fragment of chromosomal DNA.
  • the desired result is achieved by the fact that, according to the method of treating patients with leukopenia caused by programmed chemotherapy and patients with cancer, based on the introduction of fragmented human DNA into the body, fragmented human DNA is administered in combination with non-histamine protamine protein.
  • the desired result is achieved by the fact that the introduction into the body of fragmented human DNA in combination with a non-histone protamine protein is carried out parenterally or by microclysis.
  • the desired result is achieved in that the ratio of fragmented DNA / non-histone protein protamine is 1 / 0.8.
  • the desired result is achieved by the fact that the introduction of fragmented human DNA in complex with non-histone protein protamine is carried out at a concentration of fragmented human DNA of 25 ng / ml. - 1000 ng / ml.
  • the effect of fragmented human DNA in combination with non-histone protein protamine at a concentration of 25 ng / ml means that it is 1000 times less than the maximum permissible concentration of 30 ⁇ g / ml, and 10 times less than the concentration of fragmented DNA not associated with protamine, at which first appears the effect of exposure. More broadly, it is an object of the present invention to provide an experimentally proven method for co-exposure of a fragmented human DNA preparation and a non-histamine protamine protein in the treatment of patients with leukopenia caused by chemotherapy used in cancer treatment regimens and patients with cancer when fragments of therapeutic DNA are protected by a protamine complex from the action of blood nucleases.
  • FIG. 1 electrophoretic characterization of exogenous therapeutic DNA of human placenta used for injection into the body of experimental mice, where M (1) is the molecular weight marker of BssTP phage ⁇ hydrolyzate, the fragments of the corresponding molecular weight in kp; in FIG. 2 - nuclease activity of mouse blood serum, where M are molecular weight markers, the numbers indicate the sizes of the corresponding fragments in TPN; 2 - the original human DNA, fragmented hydrodynamically to fragments ranging in size from 200 to> 6000 bp; 3 - human DNA incubated with 1% mouse serum, 4 - with 10% mouse serum, 5 - with 50% and 6 - with 97% mouse serum; in FIG.
  • FIG. 4 is a comparison of the leukostimulating activity of exogenous human DNA (8) and human DNA associated with protamine (9) introduced into mice after exposure to the cyclophosphamide cytostatic; 7-control group of mice, without exposure to DNA, expressed in the number of leukocytes in 1 mm 3 relative to the time elapsed after the introduction of CF (day); in FIG. 5 - the amount of labeled material (9 - DNA associated with protamine, or 8 - unprotected DNA) located in the tumor at different times after injection, expressed in% included from the 1 ml tumor added to the mouse relative to the time elapsed after administration of the labeled DNA (min); in FIG.
  • FIG. 6 is an electrophoregram of ⁇ Hipd III labeled DNA isolated from the interchromosomal fraction of mouse tumor cells in solid (11) and ascites (12) form after its intravenous administration; (10), (13) - labeled DNA isolated from the blood of tumor-bearing mice after its intravenous administration; (10) - DNA unprotected with protamine at 0 point in time after injection; (13) —protamine protected DNA 60 min after injection; M - molecular weight marker, ⁇ i ⁇ d III DNA phage ⁇ hydrolyzate. DNA associated with protamine is present in the blood after 60 minutes in a high molecular weight form. Unprotected DNA already at the zero point degrades under the influence of blood nucleases; in FIG.
  • FIG. 8 morphological differences of fragmented exogenous DNA delivered to the interchromosomal space of MCF-7 cells in combination with protamine (b) and without protamine (a).
  • FIG. 9 shows the dynamics of the delivery of exogenous DNA fragments associated with protamine (9) and unprotected protamine (8) into the cytoplasm (a) and interchromosome space (b) of MCF-7 cell nuclei.
  • M is a molecular weight marker, the numbers to the left of the block indicate fragments of the corresponding molecular weight in bp.
  • apoptosis is induced in the presence of exogenous DNA in the culture medium and a ladder of DNA fragments is formed that characterizes apoptotic degradation of nuclear chromatin; in FIG.
  • the proposed method for the treatment of patients with leukopenia caused by programmed chemotherapy in cancer treatment regimens (leukostimulating agent) and cancer patients (anticancer agent) is implemented as follows.
  • the fragmented human DNA preparation used as a single drug as a leukostimulating and anti-cancer drug in the injectable form or in the form of microclysters, is mixed immediately before administration with a solution of non-histone protein of protamine in the ratio of 1 part of DNA / 0.8 parts of protamine to form a nucleolytically stable complex.
  • the effective concentration of DNA in the protected protamine complex can be significantly lower than fragmented DNA in unprotected form (at least 4 times), and the leukostimulating and anti-cancer effect of the preparation of fragmented human DNA remains unchanged.
  • DNA fragments Panagen drug
  • non-histone protein protamine its therapeutic possibilities are expanded, which, when homologous recombination is carried out, captures longer segments of the genome, which increases the likelihood of mutations entering the substitution zone leading to failure in proliferative activity in non-transformed cells, or defects in the CKK genome, formed as a result of harsh chemotherapy or gamma radiation.
  • a fragmented DNA preparation used as a leukostimulating or anti-cancer agent, is injected into the patient's body in the form of injections of sludge and microclysters 2-6 times a day, 5 mg of the active substance (fragmented human DNA).
  • a 5 mg fragmented DNA preparation (in solution) and 4 mg of protamine protein (in solution) are mixed in one vial.
  • a nucleolytically stable complex is formed immediately (several seconds) at room temperature. After mixing and complex formation, the drug is introduced into the patient's body.
  • Nikolin B.P. Popova HA, Sebeleva T.E., Strunkin D.H., Rogachev BA, Semenov D. B., Bogachev CC, Yakubov L.A., Shurdov M.A.
  • mice of the CBA line of vivarium wiring of the Institute of Cytology and Genetics SB RAS were kept in plastic cages of 10 animals each with free access to food and water.
  • DNA preparations were obtained from placentas of healthy women in childbirth. To isolate the DNA, the phenolic-free method was used, which allows one to obtain a complete genome, preserving those DNA fragments that are strongly associated with proteins of the nuclear matrix (scaffold). DNA fragmentation was carried out by an ultrasonic disintegrator at a frequency of 22 kHz, resulting in a mixture of DNA fragments ranging in size from 200 to> 6000 bp. (Fig. 1). The obtained DNA preparations were stored in a freezer at -18 0 C.
  • CF cyclophosphamide
  • Blood for counting leukocytes was taken from the tip of the tail individually from each mouse immediately before administration and on days 4, 7, and 11 after cyclophosphamide was administered. Each experimental group consisted of 4 mice. Blood was diluted 20 times in a 3% solution of acetic acid, and the number of leukocytes in 1 mm 3 was counted in the Goryaev’s chamber. The significance of differences between the data was determined using t-student test.
  • the RLS tumor is obtained from LS by successive intramuscular inoculations of its relapses that occurred after exposure to increasing doses of cyclophosphamide, as a result of which it acquired cross-resistance to the induction of apoptosis and the antitumor effect of alkylating drugs.
  • the antitumor effect of one or another effect was evaluated by inhibition of tumor growth and an increase in the life expectancy of tumor carriers. The significance of differences between the data was determined using Student's t-test.
  • the MCF-7 human breast adenocarcinoma cell culture was cultured in RPMI 1640 medium with HMM L-glutamine and 50 ⁇ g / ml Sigma streptomycin, (USA) at 37 ° C in the presence of 5% Biolot bovine serum (PBS), (USD) in an atmosphere with 5% CO 2 to a density of 0.7x10 7 cells per 4 wells in a 24 well plate.
  • PBS Biolot bovine serum
  • DNA and the precursor 10 ⁇ g of human placenta DNA fragmented to 200-6000 bp was labeled by nick translation in the presence of a Klenov fragment, three cold and one hot dNTP. To remove the not included precursors, DNA was reprecipitated 2 times with isopropanol according to the procedure described in Glover [DNA cloning. Methods Per. from English Ed. D. Glover. M .: Mir, 1988. 538 s]. DNA was diluted in an appropriate volume of distilled water. DNA and protamine were mixed in a ratio of 1: 1 by weight.
  • DNA samples were added to each well of the plate (in a volume not exceeding 20 ⁇ l per well). Each well contained 25-35 ml of medium. An aliquot of 1 ⁇ l from the working volume was taken into account radioactivity. Labeled DNA processed as described above was added to the culture medium, to the well where the cells were cultured. Cells were incubated with DNA at 37 ° C for the required time in an air thermostat. The incubation time was chosen: 0 '(labeled DNA was added to the medium contained on the ice of the titrator, immediately after this, the medium was taken and Triton X-IOO was added), 30'; 60 ';120'; 180 '.
  • Centrifugation was carried out in conical tubes (25 ml) in a bucket-rotor on a K23 centrifuge at 60Og (2000 rpm) for 20 minutes.
  • the supernatant representing the cytoplasmic fraction was collected in a separate tube and precipitated with isopropanol.
  • the nuclear pellet was washed twice with 250 ⁇ l of lysis buffer (buffer A 3 containing 2 mm CaCl 2 , 0.5% Triton X-100). After each washing, the preparation was centrifuged 10 'in a bucket-rotor in a K23 centrifuge at 60Og (2000 rpm).
  • Nuclei were resuspended in 500 ⁇ l of buffer A containing 2 mM CaCl 2 , analyzed cytologically and transferred to tubes from the JA-21 rotor of the J2-21 centrifuge. Up to 2M NaCl and up to 1% SDS were added to the core suspension. The nuclear lysate was incubated at 65 ° C 15 ′ until the reaction mixture was completely clarified without any shaking. Nuclear lysate centrifuged at 21,000 rpm (52,000 g) for 20 minutes at 35 ° C. The supernatant, representing nuclear juice or interchromosomal material, was taken with a yellow nose to dryness and transferred to another tube.
  • a 1: 10 volume of NaAc was added to the supernatant and 0.6 volumes of isopropanol were precipitated.
  • the amount of labeled material was determined in a standard way in Eppendorf tubes, dropped into counting bottles on a Rac Vetta counter. Samples were fractionated on a 0.7% agarose gel. After electrophoresis, the agarose block was dried on a substrate under a stream of hot air. The gel was exposed with an x-ray film overnight or depending on the amount of labeled material.
  • MCF-7 cells were incubated for 24 hours at 37 ° C in the presence of OD ⁇ g / ml TNF- ⁇ and 10 ⁇ g / ml cycloheximide in RPMI 1640 medium containing 10 mM L-glutamine, 50 ⁇ g / ml streptomycin and 5% EBS.
  • SDS up to 1%
  • EDTA up to 20 mM
  • PrK up to 200 ⁇ g / ml were added to the cells resuspended in water and incubated at 60 0 C for 1 h.
  • DNA was precipitated with isopropanol, dissolved in water and EDTA was added again up to 20 mM and PrK up to 200 ⁇ g / ml and incubated at 60 ° C for 1 h. Samples were analyzed on a 2% agarose gel by electrophoresis.
  • Protamine is a low molecular weight nuclear protein with a molecular weight of 4-12 kDa. Protamine is characterized by a high content of alkaline amino acids, especially arginine (70 - 80%), which determines the main properties of protamine. It is highly soluble in water, acidic and neutral, precipitated with alkalis, does not denature when heated. In many animals, protamine, along with histones, is found in sperm, and in some (for example, in fish) it completely replaces histones. In the nuclei of cells, protamine, like histones, is associated with deoxyribonucleic acids into nucleoprotamines.
  • protamine chain is wound as a third strand around the double helix of DNA.
  • the presence of protamine protects DNA from the action of nucleases and gives chromatin a compact form.
  • Protamine is formed by salts with acids and complexes with acidic proteins (a poorly soluble complex of protamine with insulin is used in medical practice to extend the duration of the latter) [Braver L, Conset M, Lau EY, Baloch R. Dynamics of protamine I binding to single DNA molecules. J Biol Schem. 2003 Oct 24; 278 (43): 42403-42408; Vilfan ID, Sopwell CC, Nud NV. Formiatop Of Pative-Like Mammaliap Sprm Cell ⁇ hromatip with Fould Bull Bull Rotamipe. J Biol Schem. 2004 Mau 7; 279 (19): 20088-20095].
  • protamine / DNA complex 2 ⁇ g of ⁇ ⁇ Nipd III DNA and 15 ⁇ g of human DNA were incubated for several minutes with various (from 10 to 150% by weight) amounts of protamine.
  • protamine / DNA complexes obtained for different ratios of counterparties were incubated for 60 minutes in 10% mouse serum.
  • protamine in a ratio of 80% to DNA by weight almost completely protects DNA from degradation (Fig. 3).
  • Cyclophosphamide is one of the most widely used drugs in oncological practice.
  • the antitumor effect of CF is currently associated with its genotoxic alkylating derivative phosphoramide mustard (FM), which is spontaneous formed from aldophosphamide, a derivative of 4-hydroxy-Cf.
  • FM forms adducts with purine bases of the DNA molecule, especially adjacent to the guanine residues, and leads to the appearance of cross-linking in the double chain of the DNA molecule [Yu LJ, Dreves P, Gustafsson K, Brain EG, Hesh JE, Waxmap DJ.
  • Cyclophosphamide induces the formation of interchain cross-linking in actively dividing cells, resulting in the death of not only tumor cells, but also, for example, blood cells. As a result, leukopenia is observed at the body level, the severity of which depends on the dose of cyclophosphamide.
  • mice 200 mg / kg of cyclophosphamide was administered to male CBA mice.
  • blood sampling was performed on days 4, 7, and 11 after the administration of CF.
  • One group of mice served as a control (physiological saline), and two others, the next 3 days after the administration of CF, were injected intraperitoneally with 50 mcg of human DNA - in one group, the other - human DNA in complex with protamine.
  • the number of leukocytes in mice that were driven with human DNA or human DNA associated with protamine is significantly higher than in the control group and even exceeds the initial level.
  • Exogenous DNA fragments are delivered into the interchromosomal space of actively proliferating cells, including all the precursors of leukopoiesis [Histology, cytology and embryology. Ed. Afanasyeva Yu.I., Kuznetsova S.L., Yurina N.A. M .: Medicine, 2004. 768 s] and the repair of interchain cross-linking (MCC) arising from exposure to CF occurs with their participation.
  • MCC interchain cross-linking
  • the repair process may be hindered by steric problems that arise when searching for homologous sequences and pairing chains.
  • Exogenous fragments located in close proximity to the repaired MCC that have homology with the repair sites can be used as donor sequences and can take part in the homologous recombination necessary to complete the repair process. With such participation of exogenous DNA extrachromosomal localization, a greater number of repaired lesions are served, which certainly should affect the viability of progenitor cells.
  • each stage of leukocyte maturation is characterized by chromatin reorganization and activation of a new ensemble of expressed genes.
  • the mechanism that determines the increased survival of progenitor cells after treatment with CF and exogenous DNA is as follows. Leukocyte precursor cell after the last repair of the MDC in the presence of exogenous DNA of extrachromosomal localization with or without it retains a certain amount chromatin defects resulting from aberrations during the formation and implementation of intermediates.
  • Sigl-apd dubble-daped DNA buildipg and trigger of ATR-tedied DNA datagres. Gepes Dev. 2007 Arr 15; 21 (8): 879-885].
  • certain programs are included that position the cell as being arrested at the corresponding stage of the cell cycle. After activation of such programs, the cell is no longer able to block the cascade of events associated with such activation, and the cell at rest before this begins to divide.
  • fragments of exogenous DNA each time enter the internal compartments of the progenitor cell, it will divide without rest until the stress factor is removed from its environment.
  • mice with an alkylating cytostatic cyclophosphamide and a fragmented exogenous DNA preparation bound to protamine a protein that protects DNA from the action of blood nucleases, an effective recovery of leukopoiesis is observed.
  • DNA The binding of DNA to protamine reduces the amount of DNA introduced and maintains the original size of the fragments, which contributes to the involvement of longer sections of chromatin in reparative homologous recombination, ultimately increasing the chance of the cell to get rid of the numerous injuries that have occurred.
  • the morphology of labeled DNA secreted from the blood plasma of tumor-bearing mice indicates that almost instantaneous degradation of the original DNA occurs in the bloodstream (Fig. 6, lane 1). In degraded form, exogenous DNA is delivered to the internal compartments of the cancer cell (FIG. 6, lanes 2 and 3).
  • the injected DNA After association with protamine, the injected DNA is protected from the action of blood nucleases and after 60 minutes high molecular weight fragments of labeled DNA can still be detected in the blood (Fig. 6, lane 4).
  • 1 ⁇ l of the tumor contains 10 cells; the DNA mass in the mouse cell is 6 pg (6 * 10 " g); the mouse haploid genome is 2.7 * 10 9 bp
  • Gepe targetg ip ueast is iptiad bu two ipredept strapd ipasiops. Rros Natl Acad S conservei US A. 2004 Ott 26; 101 (43): 15392-15397].
  • the longer the fragment participating in the GR the greater the likelihood of replacing the oncolocus by not mutant allele and changes in the cancerous status of cells.
  • the length of the delivered fragments is an important factor for such inhibition.
  • FIG. 8 presents the results of DNA electrophoresis of the extrachromosomal fraction isolated from the nuclei of MCF-7 cells.
  • Table 4 The amount of labeled DNA detected in the culture medium and in the internal compartments of the cell after incubation of the MCF-7 cell culture with intact and protamine-bound DNA for different times.
  • the labeled material In the chromatin fraction using unprotected exogenous DNA, the labeled material is found in significant quantities already at the zero point. At points 30 - 120 ', the amount of labeled material increases slightly and reaches a plateau. At 180 ′, the amount of labeled material in the chromatin fraction drops sharply. In the case of protamine-protected DNA, the process has a clear cumulative character. With practically no absence at the zero point, the labeled material accumulates and at 120 'reaches its maximum value, which coincides with the DNA sample without protamine. Then, the amount of labeled material drops sharply to the same values as in the DNA sample used without association with protamine.
  • the observed difference in the amount of DNA material delivered to the interchromosomal fraction can be explained by the fact that receptors that bind DNA on the cell surface have more specificity for chromatin-shaped DNA than for unprotected DNA.
  • Two peaks in the amount of labeled material detected in the cytoplasm 30 'and 120' and the interchromosomal fraction 60 'and 180' may indicate that the number of receptors is finite, that they, along with DNA, are internalized in the cell compartments, that the turnover of the receptors occurs during approximately one hour and that the penetration of labeled fragments from the cytoplasm into the inner space of the nucleus takes about 30 minutes.
  • This fact may indicate that the protected DNA is also able to enter into reparative homologous recombination, correcting the mutant allele, while its effective amount in the culture medium can be significantly lower.
  • Unprotected DNA and protamine-bound DNA were added to the MCF-7 cell culture at concentrations of 25, 2.5, 0.25, and 0.025 ⁇ g / ml medium. The number of cells for all experimental points was the same - 10 7 . After 17 days of constant incubation of cells with DNA, cell cultures were induced to apoptosis, DNA was isolated and the appearance of nucleosome chromatin fragmentation was observed (Fig. 11).
  • Protamine protecting DNA from the action of nucleases, contributes to the fact that more DNA enters the cell in an undegraded form and, accordingly, is able to participate in the recombination process. From this it can be assumed that a larger number of cells restores the caspase 3 gene, and with induction of apoptosis, we can observe a more pronounced nucleosome fragmentation of chromatin.
  • binding to protamine provides DNA molecules with resistance to the action of nucleases in the culture medium.
  • exogenous DNA fragments are able to reach the main cellular compartments in their original form.
  • the caspase 3 gene is restored, which phenotypically manifests itself in the appearance of nucleosome chromatin degradation upon apoptosis induction.
  • Protamine protecting DNA from the action of nucleases, ensures that exogenous DNA molecules enter the cell in a non-degraded form, which makes them possible to participate in the recombination process.
  • DNA is bound to protamine, it becomes possible to lower the concentration of DNA without affecting the effectiveness of exogenous DNA.
  • the desired result is achieved, which consists in increasing the effectiveness of the treatment of patients undergoing programmed chemotherapy, and patients with cancer.
  • the results of this study allow us to say that the protection of fragmented exogenous DNA with a histone-like protein protamine does not affect the ability of the fragmented exogenous DNA to exhibit a leukostimulating effect, inhibit the growth of an experimental mouse tumor and take part in the repair of the mutant allele of the caspase 3 gene of human breast adenocarcinoma MCF-7 cells.
  • Association fragmented exogenous DNA with protamine allows you to save the original size of therapeutic fragments and significantly reduce the effective concentration of exogenous DNA in the pericellular fluids.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to medicine and can be used in the treatment of patients with fragmented human DNA preparations in the form of an injection or in the form of micro-enemas in a nucleolytically stable complex with the histone-like protein protamine, which is used as a leuco-stimulant in treatment regimens for oncological diseases and as an anticarcinogenic agent. The desired result, which consists in increasing the effectiveness of the treatment, is achieved in that the fragmented human DNA is administered in a complex with the nonhistone protein protamine.

Description

Способ лечения онкологических заболеваний A method of treating cancer
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении пациентов препаратами фрагментированной ДНК человека в инъекционной форме или в форме микроклизм в нуклеолитически стабильном комплексе с гистоноподобным белком протамином, использующимся как лейкостимулирующее в схемах лечения онкологических заболеваний и как противораковое средство.The invention relates to medicine and can be used in the treatment of patients with preparations of fragmented human DNA in injectable form or in the form of microclysters in a nucleolytically stable complex with histone-like protamine protein, which is used as a leukostimulating drug in cancer treatment regimens and as an anti-cancer agent.
Известен способ лечения пациентов с использованием препарата, обладающего противоопухолевым, антитоксическим и радиопротекторным действием, представляющим собой фрагментированный до 200-2000 пар нуклеотидов нуклеопротеидный комплекс с содержанием, мac.%: двухспиральной ДНК 60-80 и белков ядерного матрикса 20-40, при получении которого используют видоспецифическое биологическое сырье — плаценту человека [RU 2234323, А 61 К 48/00, 2004, 27.05.2003. Препарат, обладающий противоопухолевым, антитоксическим и радиопротекторным действием].A known method of treating patients using a drug with antitumor, antitoxic and radioprotective effects, which is a fragmented up to 200-2000 pairs of nucleotides nucleoprotein complex with a content, wt.%: Double-stranded DNA 60-80 and nuclear matrix proteins 20-40, upon receipt of which use species-specific biological raw materials - human placenta [RU 2234323, A 61 K 48/00, 2004, 05.27.2003. A drug with antitumor, antitoxic and radioprotective effects].
Недостатком способа является относительно низкая эффективность лечения.The disadvantage of this method is the relatively low treatment efficiency.
Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ лечения онкологических заболеваний, основанный на введении в организм пациента фрагментированной ДНК, в качестве какой используют гомологичную ДНК, имеющую биологически активный размер, составляющий полный геном физиологически и генетически здорового донора, при этом ДНК вводят в дозе, создающей такую концентрацию ДНК в плазме крови, которая равна или превышает концентрацию собственно ДНК плазмы крови, но не превышает максимально допустимую концентрацию, равную 30 мкг/мл [RU 2313349, А 61 К 48/00, 2006, 16.01.2006. Способ лечения онкологических заболеваний].The closest in essence to the proposed one is a method of treating oncological diseases based on introducing fragmented DNA into the patient’s body, using homologous DNA having a biologically active size, comprising the whole genome of a physiologically and genetically healthy donor, while the DNA is administered in a dose creating such the concentration of DNA in the blood plasma, which is equal to or higher than the concentration of the DNA of the blood plasma itself, but does not exceed the maximum permissible concentration of 30 μg / ml [RU 2313349, A 61 K 48/00, 2006, 01/16/2006. A method of treating cancer].
В этом способе фрагментированная ДНК не защищена от действия нуклеаз крови человека и в клетки доставляются преимущественно короткие фрагменты ДНК. Для доставки более крупных фрагментов экзогенной ДНК используют максимально допустимые дозы фрагментированной ДНК (приближающейся к 1500 нг/мл). Только в этом случае в клетку доставляется некоторое количество полноразмерных фрагментов ДНК, которые в состоянии репарировать зоны повреждения, связанные с утратой одного нуклеотида или фрагмента хромосомной ДНК.In this method, fragmented DNA is not protected from the action of human blood nucleases and predominantly short DNA fragments are delivered to the cells. For delivery of larger fragments of exogenous DNA, the maximum allowable doses of fragmented DNA (approaching 1500 ng / ml) are used. Only in this case, a certain number of full-sized DNA fragments are delivered to the cell, which are able to repair damage zones associated with the loss of one nucleotide or a fragment of chromosomal DNA.
В этом проявляется недостаточная эффективность способа лечения, поскольку даже при максимально возможных концентрациях терапевтической ДНК в крови, равной 1500 нг/мл, не на все клетки, где произошло выпадение генетического материала, хватит сохранивших свой полный размер фрагментов экзогенной ДНК.This shows the lack of effectiveness of the treatment method, since even at the highest possible concentrations of therapeutic DNA in the blood equal to 1500 ng / ml, not all cells where the genetic material was precipitated will have enough fragments of exogenous DNA that have retained their full size.
Все это снижает эффективность лечения лейкопений, вызванных применением цитостатических препаратов, и эффективность лечения пациентов с онкологическим заболеваниями, поскольку действующее начало - фрагментированная ДНК подвергается незамедлительной нуклеолитической деградации нуклеазами плазмы крови, и для достижения терапевтического эффекта приходится применять максимально допустимые концентрации препарата. Требуемый результат заключается в повышении эффективности лечения пациентов, проходящих программную химиотерапию, и пациентов с онкологическими заболеваниями.All this reduces the effectiveness of treating leukopenia caused by the use of cytostatic drugs and the effectiveness of treating patients with cancer, since the active principle - fragmented DNA undergoes immediate nucleolytic degradation by blood plasma nucleases, and to achieve a therapeutic effect, it is necessary to use the maximum allowable concentration of the drug. The required result is to increase the effectiveness of the treatment of patients undergoing programmed chemotherapy and patients with cancer.
Требуемый результат достигается тем, что по способу лечения пациентов с лейкопениями, вызванными программной химиотерапией, и пациентов, больных онкологическими заболеваниями, основанном на введении в организм фрагментированной ДНК человека, фрагментированную ДНК человека вводят в комплексе с негистоновым белком протамина.The desired result is achieved by the fact that, according to the method of treating patients with leukopenia caused by programmed chemotherapy and patients with cancer, based on the introduction of fragmented human DNA into the body, fragmented human DNA is administered in combination with non-histamine protamine protein.
Кроме того, требуемый результат достигается тем, что, введение в организм фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамина производят парентерально или микроклизмированием.In addition, the desired result is achieved by the fact that the introduction into the body of fragmented human DNA in combination with a non-histone protamine protein is carried out parenterally or by microclysis.
Кроме того, требуемый результат достигается тем, что соотношение фрагментированная ДНК / негистоновый белок протамин составляет 1 / 0,8.In addition, the desired result is achieved in that the ratio of fragmented DNA / non-histone protein protamine is 1 / 0.8.
Кроме того, требуемый результат достигается тем, что введение фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамином производят при концентрации фрагментированной ДНК человека равной 25 нг/мл. - 1000 нг/мл.In addition, the desired result is achieved by the fact that the introduction of fragmented human DNA in complex with non-histone protein protamine is carried out at a concentration of fragmented human DNA of 25 ng / ml. - 1000 ng / ml.
Воздействие фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамином при концентрации 25 нг/мл, означает, что это в 1000 раз меньше предельно допустимой концентрации, равной 30 мкг/мл, и в 10 раз меньше концентрации фрагментированной ДНК, не ассоциированной с протамином, при которой впервые появляется эффект воздействия. В более широком плане задачей настоящего изобретения является разработка экспериментально подтвержденного способа совместного воздействия препарата фрагментированной ДНК человека и негистонового белка протамина при лечении пациентов с лейкопениями, вызванными химиотерапиями, применяемыми в схемах лечения онкозаболеваний, и пациентов с онкологическими заболеваниями, когда фрагменты терапевтической ДНК защищаются комплексом протамина от действия нуклеаз крови. Стабилизация фрагментов фрагментированной ДНК человека, в качестве которой может быть использован препарат «Пaнaгeн», негистоновым белком протамином расширяет его терапевтические возможности, выражающиеся в том, что при осуществлении гомологичной рекомбинации происходит захват более протяженных участков генома, что повышает вероятность попадания в зону замещения мутаций, приведших к сбою в пролиферативной активности у неотрансформированных клеток, или дефектов в геноме CKK, сформированных в результате жесткой химиотерапии или гамма облучения.The effect of fragmented human DNA in combination with non-histone protein protamine at a concentration of 25 ng / ml means that it is 1000 times less than the maximum permissible concentration of 30 μg / ml, and 10 times less than the concentration of fragmented DNA not associated with protamine, at which first appears the effect of exposure. More broadly, it is an object of the present invention to provide an experimentally proven method for co-exposure of a fragmented human DNA preparation and a non-histamine protamine protein in the treatment of patients with leukopenia caused by chemotherapy used in cancer treatment regimens and patients with cancer when fragments of therapeutic DNA are protected by a protamine complex from the action of blood nucleases. Stabilization of fragments of fragmented human DNA, which can be used as a Panagen drug, with non-histone protein protamine expands its therapeutic capabilities, which are expressed in the fact that, when homologous recombination is carried out, more extended sections of the genome are captured, which increases the likelihood of mutations entering the substitution zone, leading to a malfunction in proliferative activity in non-transformed cells, or defects in the CKK genome formed as a result of harsh chemotherapy or gamma blucheniya.
В современной литературе отсутствуют указания на предлагаемый способ лечения пациентов с лейкопениями, вызванными программными химиотерапиями, и пациентов с онкозаболеваниями, при котором используется комплекс фрагментированной ДНК человека с негистоновым белком протамином.In the modern literature, there is no indication of the proposed method for the treatment of patients with leukopenia caused by program chemotherapy and patients with cancer, which uses a complex of fragmented human DNA with non-histamine protein protamine.
Следовательно, предложение отвечает критериям новизны и изобретательского уровня. Ниже приводятся теоретические и экспериментальные данные, подтверждающие, что изобретение отвечает и критерию промышленной применяемости.Therefore, the proposal meets the criteria of novelty and inventive step. The following are theoretical and experimental data confirming that the invention meets the criterion of industrial applicability.
На чертеже представлены: на фиг. 1 - электрофоретическая характеристика экзогенной терапевтической ДНК плаценты человека, используемой для инъекций в организм опытных мышей, где M (1) - маркер молекулярного веса ВssТП гидролизат фага λ, цифрами слева от блока отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в т.п.н.; на фиг. 2 - нуклеазная активность сыворотки крови мыши, где M - маркеры молекулярных весов, цифрами указаны размеры соответствующих фрагментов в т.п.н.; 2 - исходная ДНК человека, фрагментированная гидродинамическим способом до фрагментов размером от 200 до > 6000 п.о.; 3 - ДНК человека, инкубированная с 1% сывороткой крови мыши, 4 - с 10% сывороткой крови мыши, 5 - с 50% и 6 — с 97% сывороткой крови мыши; на фиг. 3 - защита ДНК, ассоциированной с различным (по массе) количеством протамина, от действия нуклеаз при инкубации в 10% сыворотке крови мыши, где а) - НiпdΙII гидролизат ДНК фага λ, b) - фрагментированная ДНК человека. Сверху геля указано содержание протамина в комплексе по отношению к ДНК в %. Слева отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в т.п.н.; на фиг. 4 - сравнение лейкостимулирующей активности экзогенной ДНК человека (8) и ДНК человека, ассоциированной с протамином (9), введенной мышам после воздействия цитостатика циклофосфана; 7 -контрольная группа мышей, без воздействия ДНК , выраженное в количестве лейкоцитов в 1 мм3 относительно времени, прошедшего после введения ЦФ (сутки); на фиг. 5 - количество меченого материала (9 - ДНК, ассоциированной с протамином, или 8 - незащищенной ДНК), находящееся в опухоли в различное время после инъекции, выраженное в % включающегося от добавленного в мышь на 1 мл опухоли относительно времени, прошедшего после введения меченой ДНК (мин); на фиг. 6 — электрофореграмма меченой λ Нiпd III ДНК, выделенной из межхромосомной фракции клеток опухоли мышей в солидной (11) и асцитной (12) форме после ее внутривенного введения; (10), (13) — меченая ДНК, выделенная из крови мышей опухоленосителей после ее внутривенного введения; (10) - ДНК, незащищенная протамином, в 0 момент времени после инъекции; (13) - ДНК, защищенная протамином, через 60 мин после инъекции; M - маркер молекулярного веса, Нiпd III гидролизат ДНК фага λ. ДНК, ассоциированная с протамином, присутствует в крови через 60 мин в высокомолекулярной форме. Незащищенная ДНК уже в нулевой точке деградирует под воздействием нуклеаз крови; на фиг. 7 - действие на рост экспериментальной опухоли мыши экзогенной ДНК в незащищенной форме (8) и ассоциированной с протамином (9), выраженное в среднем объеме опухоли (см3), относительно времени, прошедшего после воздействия (сутки); на фиг. 8 - морфологические отличия фрагментированной экзогенной ДНК, доставляемой в межхромосомное пространство клеток MCF-7 в комплексе с протамином (b) и без протамина (а). Сверху - электрофоретическая характеристика в 0,7% агарозном геле экзогенной ДНК, обнаруживаемой в межхромосомном пространстве ядра клеток MCF-7 после их культивирования в среде, содержащей экзогенную ДНК в концентрациях: для незащищенной ДНК - 100 мкг/мл, для защищенной протамином ДНК - 25 мкг/мл. Снизу - рентгенограмма агарозного блока после высушивания. Цифры над блоками указывают время инкубации (мин) культуры клеток с меченой α32P экстраклеточной ДНК человека и α-P32dATP (180α); цифрами слева от блока отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в т.п.н.; на фиг. 9 — динамика доставки фрагментов экзогенной ДНК, ассоциированных с протамином (9) и незащищенных протамином (8), в цитоплазму (а) и межхромосомное пространство (b) ядер клеток MCF-7. Динамика появления меченого материала во фракции хроматина ядер клеток MCF-7 (с); на фиг. 10 — анализ индукции апоптоза клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, инкубированных в присутствии 100 мкг/мл незащищенной протамином фрагментированной ДНК плаценты человека (16), 25 мкг/мл ДНК человека, ассоциированной с протамином (17), в отсутствие ДНК (15). Культуры (15, 16, 17) индуцировали к апоптозу ФНО-α в концентрации 100 мкг/мл в течение 24 часов в среде, содержащей 10 мкг/мл циклогексимида. (14) - ДНК, выделенная из необработанных клеток MCF-7. M - маркер молекулярного веса, цифрами слева от блока отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в п.н.. В обоих случаях (16 и 17) в присутствии в культуральной среде экзогенной ДНК индуцируется апоптоз и формируется лестница фрагментов ДНК, характеризующая апоптотическую деградацию ядерного хроматина; на фиг. 11 - анализ индукции апоптоза клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, инкубированных в присутствии незащищенной протамином фрагментированной ДНК плаценты человека в концентрациях 25 мкг/мл (18 дорожка 1), 2.5 мкг/мл (19 дорожка 2), 0.25 мкг/мл (20 дорожка 3) и 0.025 мкг/мл (21 дорожка 4) и ДНК человека, ассоциированной с протамином в концентрациях 25 мкг/мл (17 дорожка 5), 2.5 мкг/мл (22 дорожка 6), 0.25 мкг/мл (23 дорожка 7) и 0.025 мкг/мл (24 дорожка 8); цифрами слева от блока отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в п.н..The drawing shows: in FIG. 1 - electrophoretic characterization of exogenous therapeutic DNA of human placenta used for injection into the body of experimental mice, where M (1) is the molecular weight marker of BssTP phage λ hydrolyzate, the fragments of the corresponding molecular weight in kp; in FIG. 2 - nuclease activity of mouse blood serum, where M are molecular weight markers, the numbers indicate the sizes of the corresponding fragments in TPN; 2 - the original human DNA, fragmented hydrodynamically to fragments ranging in size from 200 to> 6000 bp; 3 - human DNA incubated with 1% mouse serum, 4 - with 10% mouse serum, 5 - with 50% and 6 - with 97% mouse serum; in FIG. 3 - protection of DNA associated with various (by weight) amounts of protamine from the action of nucleases during incubation in 10% mouse serum, where a) - НіpdΙII DNA phage λ hydrolyzate, b) - fragmented human DNA. On top of the gel is the protamine content in the complex with respect to DNA in%. On the left are fragments of the corresponding molecular weight in TPN; in FIG. 4 is a comparison of the leukostimulating activity of exogenous human DNA (8) and human DNA associated with protamine (9) introduced into mice after exposure to the cyclophosphamide cytostatic; 7-control group of mice, without exposure to DNA, expressed in the number of leukocytes in 1 mm 3 relative to the time elapsed after the introduction of CF (day); in FIG. 5 - the amount of labeled material (9 - DNA associated with protamine, or 8 - unprotected DNA) located in the tumor at different times after injection, expressed in% included from the 1 ml tumor added to the mouse relative to the time elapsed after administration of the labeled DNA (min); in FIG. 6 is an electrophoregram of λ Hipd III labeled DNA isolated from the interchromosomal fraction of mouse tumor cells in solid (11) and ascites (12) form after its intravenous administration; (10), (13) - labeled DNA isolated from the blood of tumor-bearing mice after its intravenous administration; (10) - DNA unprotected with protamine at 0 point in time after injection; (13) —protamine protected DNA 60 min after injection; M - molecular weight marker, Нiпd III DNA phage λ hydrolyzate. DNA associated with protamine is present in the blood after 60 minutes in a high molecular weight form. Unprotected DNA already at the zero point degrades under the influence of blood nucleases; in FIG. 7 - effect on the growth of an experimental mouse tumor of exogenous DNA in unprotected form (8) and associated with protamine (9), expressed in the average tumor volume (cm 3 ), relative to the time elapsed after exposure (day); in FIG. 8 - morphological differences of fragmented exogenous DNA delivered to the interchromosomal space of MCF-7 cells in combination with protamine (b) and without protamine (a). Above is the electrophoretic characteristic in 0.7% exogenous agarose gel DNA detected in the interchromosomal space of the nucleus of MCF-7 cells after their cultivation in a medium containing exogenous DNA in concentrations: for unprotected DNA - 100 μg / ml, for protamine-protected DNA - 25 μg / ml. Below is a radiograph of the agarose block after drying. The numbers above the blocks indicate the incubation time (min) of the cell culture labeled with α 32 P extracellular human DNA and α-P 32 dATP (180α); the numbers to the left of the block indicate fragments of the corresponding molecular weight in TPN; in FIG. 9 shows the dynamics of the delivery of exogenous DNA fragments associated with protamine (9) and unprotected protamine (8) into the cytoplasm (a) and interchromosome space (b) of MCF-7 cell nuclei. The dynamics of the appearance of labeled material in the chromatin fraction of MCF-7 cell nuclei (c); in FIG. 10 - analysis of the induction of apoptosis of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells incubated in the presence of 100 μg / ml of protamine unprotected fragmented human placenta DNA (16), 25 μg / ml of human protamine-associated DNA (17) in the absence of DNA (15 ) Cultures (15, 16, 17) induced apoptosis of TNF-α at a concentration of 100 μg / ml for 24 hours in a medium containing 10 μg / ml cycloheximide. (14) - DNA isolated from untreated MCF-7 cells. M is a molecular weight marker, the numbers to the left of the block indicate fragments of the corresponding molecular weight in bp. In both cases (16 and 17), apoptosis is induced in the presence of exogenous DNA in the culture medium and a ladder of DNA fragments is formed that characterizes apoptotic degradation of nuclear chromatin; in FIG. 11 - analysis of the induction of apoptosis of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells incubated in the presence of protamine unprotected fragmented human placenta DNA at concentrations of 25 μg / ml (18 lane 1), 2.5 μg / ml (19 lane 2), 0.25 μg / ml ( 20 lane 3) and 0.025 μg / ml (21 lane 4) and human DNA associated with protamine at concentrations of 25 μg / ml (17 lane 5), 2.5 μg / ml (22 lane 6), 0.25 μg / ml (23 lane 7) and 0.025 μg / ml (24 lane 8); the numbers to the left of the block indicate fragments of the corresponding molecular weight in bp.
Предложенный способ лечения пациентов с лейкопениями, вызванными программными химиотерапиями в схемах лечения онкологических заболеваний, (лейкостимулирующее средство) и пациентов с онкологическими заболеваниями (противораковое средство) реализуется следующим образом.The proposed method for the treatment of patients with leukopenia caused by programmed chemotherapy in cancer treatment regimens (leukostimulating agent) and cancer patients (anticancer agent) is implemented as follows.
Препарат фрагментированной ДНК человека, используемый в качестве монопрепарата как лейкостимулирующее и как противораковое средство в инъекционной форме или в форме микроклизм, смешивается непосредственно перед введением в организм с раствором негистонового белка протамина в соотношении 1 часть ДНК / 0.8 частей протамина для формирования нуклеолитически стабильного комплекса.The fragmented human DNA preparation, used as a single drug as a leukostimulating and anti-cancer drug in the injectable form or in the form of microclysters, is mixed immediately before administration with a solution of non-histone protein of protamine in the ratio of 1 part of DNA / 0.8 parts of protamine to form a nucleolytically stable complex.
Эффективная концентрация ДНК в защищенном протамином комплексе может быть существенно ниже, чем фрагментированная ДНК в незащищенной форме (минимально в 4 раза), причем лейкостимулирующее и противораковое действие препарата фрагментированной ДНК человека остается без изменений. Кроме того, при стабилизации фрагментов ДНК (препарат «Пaнaгeн») негистоновым белком протамином расширяются его терапевтические возможности, выражающиеся в том, что при осуществлении гомологичной рекомбинации происходит захват более протяженных участков генома, что повышает вероятность попадания в зону замещения мутаций, приведших к сбою в пролиферативной активности у неотрансформированных клеток, или дефектов в геноме CKK, сформированных в результате жесткой химиотерапии или гамма облучения.The effective concentration of DNA in the protected protamine complex can be significantly lower than fragmented DNA in unprotected form (at least 4 times), and the leukostimulating and anti-cancer effect of the preparation of fragmented human DNA remains unchanged. In addition, upon stabilization of DNA fragments (Panagen drug) with non-histone protein protamine, its therapeutic possibilities are expanded, which, when homologous recombination is carried out, captures longer segments of the genome, which increases the likelihood of mutations entering the substitution zone leading to failure in proliferative activity in non-transformed cells, or defects in the CKK genome, formed as a result of harsh chemotherapy or gamma radiation.
Пример реализации способа.An example implementation of the method.
Препарат фрагментированной ДНК, используемый как лейкостимулирующее или противораковое средство, вводят в организм пациента в виде инъекций ил и микроклизм 2 -6 раз в сутки по 5 мг активного вещества (фрагментированной ДНК человека). Непосредственно перед введением в одном флаконе смешиваются препарат фрагментированной ДНК 5 мг (в растворе) и 4 мг белка протамина (в растворе). Нуклеолитически стабильный комплекс формируется немедленно (несколько секунд) при комнатной температуре. После смешения и формирования комплекса препарат вводится в организм пациента.A fragmented DNA preparation, used as a leukostimulating or anti-cancer agent, is injected into the patient's body in the form of injections of sludge and microclysters 2-6 times a day, 5 mg of the active substance (fragmented human DNA). Immediately prior to administration, a 5 mg fragmented DNA preparation (in solution) and 4 mg of protamine protein (in solution) are mixed in one vial. A nucleolytically stable complex is formed immediately (several seconds) at room temperature. After mixing and complex formation, the drug is introduced into the patient's body.
Для подтверждения того, что предложенный способ позволяет достигнуть требуемого результата, приведем его теоретическое и экспериментальное обоснование.To confirm that the proposed method allows to achieve the desired result, we present its theoretical and experimental justification.
В наших ранних работах [Yаkubоv LA3 Ророvа NA, Nikolin VP, Sеmепоv DV, Воgасhеv SS, Оs'kiпа IN. Ехtrасеllulаr genomic DNA рrоtесts miсе аgаiпst rаdiаtiоп апd сhеmiсаl mutаgепs. Gепоmе Вiоl. 2003; 5: 3; Khegai H5 Воgасhеv SS, Оs'kiпа IN5 Ророvа NA5 Sеmепоv DV, Shurdоv MA, Yаkubоv LA. Сhапgеs iп thе sуmрtоms оf hуроthаlаmiс diаbеtеs iпsiрidus аftеr trеаtmепt with hоmоlоgоus ехоgепоus DNA. Dоkl Вiоl Sсi. 2004 Мау-Juп; 396: 233-235; Николин BTL, Попова H.A., Себелева Т.Е., Стрункин Д.H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC5 Якубов Л.A., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, N° 1, с. 66-69; Николин B.П., Попова H.A., Себелева Т.Е., Стрункин Д.H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC, Якубов Л.A., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, JN° 3, с. 336-340; Rоgасhеv VA, Likhасhеvа А, Vrаtskikh О, Mechetina LV, Sеbеlеvа ТЕ, Воgасhеv SS, Yаkubоv LA, Shurdоv MA. Quаlitаtivе апd quапtitаtivе сhаrасtеristiсs оf thе ехtrасеllulаr DNA dеlivеrеd tо thе пuсlеus оf а liviпg сеll. Cancer CeIl Iпt. 2006 Осt 11; 6:23; Likhасhеvа AS, Nikоliп VP, Ророvа NA, Dubаtоlоvа TD, Strunkin DN, Rоgасhеv VA, Sеbеlеvа TE5 Еrоfееv IS5 Воgасhеv SS, Yаkubоv LA5 Shurdоv MA. Iпtеgrаtiоп оf human DNA frаgmепts iпtо thе сеll gепоmеs оf сеrtаiп tissuеs frоm аdult miсе trеаtеd with суtоstаtiс сусlорhоsрhаmidе iп соmbiпаtiоп with hшпап DNA. Gепе Тhеr MoI Вiоl. 2007; 11 : 185-202; Likhасhеvа AS, Nikolin VP, Ророvа NA5 Rоgасhеv VA5 Рrоkhоrоviсh MA, Sеbеlеvа TE5 Воgасhеv SS5 Shurdоv MA. Ехоgепоus DNA сап bе сарturеd bу stеm сеlls апd bе iпvоlvеd iп thеir rеsсuе frоm dеаth аftеr lеthаl-dоsе γ-rаdiаtiоп. Gепе Тhеr MoI Вiоl. 2007; 11 : 305-314; Yаkubоv LA, Rоgасhеv VA5 Likhасhеvа AC5 Воgасhеv SS5 Sеbеlеvа ТЕ, Shilоv AG, Ваibоrоdiп SI, Реtrоvа NA5 Mechetina LV, Shurdоv MA5 Wiсkstrоm E. Nаturаl humап gепе соrrесtiоп bу smаll ехtrасеllulаr gепоmiс DNA frаgmепts. Сеll Сусlе. 2007 JuI; 6(18): 2293-2301] мы описали плейотропное воздействие фрагментированной экзогенной ДНК на живую клетку. Были выделены в отдельные группы несколько отличающихся по механизму типов ее воздействия, которые проявлялись как следующие описанные явления:In our early works [Yakubov LA 3 Porova NA, Nikolin VP, Symepov DV, Vogashev SS, Os'kipa IN. Extracellular genomic DNA processes mixtures agaipst radiopath apd chemil mutageps. Hypotheme Biol. 2003; 5: 3; Khegai H 5 Vogashev SS, Os'kipa IN 5 Roorova NA 5 Symepov DV, Shurdov MA, Yakubov LA. Сhapgеs іt thе sіmрtоms оf hurothalamis diаbеtes іspsіridus аftеr triеtmеpt with hаmоlоgоus exogepous DNA. Dokl Biol Sсi. 2004 Mau-Jup; 396: 233-235; Nikolin BTL, Popova HA, Sebeleva T.E., Strunkin D.H., Rogachev BA, Semenov D. B., Bogachev CC 5 Yakubov L.A., Shurdov M.A. The effect of exogenous DNA on the growth of experimental tumors. Oncology issues. 2006. T. 52, N ° 1, p. 66-69; Nikolin B.P., Popova HA, Sebeleva T.E., Strunkin D.H., Rogachev BA, Semenov D. B., Bogachev CC, Yakubov L.A., Shurdov M.A. The effect of exogenous DNA on the restoration of leukopoiesis and the antitumor effect of cyclophosphamide. Oncology issues. 2006.V. 52, JN ° 3, p. 336-340; Rogasheva VA, Likhasheva A, Vratskikh O, Mechetina LV, Sebelieva TE, Vogashev SS, Yakubov LA, Shurdov MA. Qualitiv apd quaptitivist сhаrаstеristісs оf thе еxtracellulаr DNA delivеrd tо thе puslеus оf а liviпell sell. Cancer CeIl IPt. 2006 Ott 11; 6:23; Likhasheva AS, Nikolip VP, Rorava NA, Dubolova TD, Strunkin DN, Rogasheva VA, Sebelova TE 5 Erofeev IS 5 Vegashev SS, Yakubov LA 5 Shurdov MA. IPTEGRATIOP OF HUMAN DNA FRAGMEPTS IPTO THE SELL GEPOMETS OF OF SERTAP TIP FROM ADULT MICE TRETATED WITH SOSTOSTATIS SUSLORCHOSPHAMIDE IP COMBIPATIOP WITH HSPAP DNA. Gepe Ther MoI Biol. 2007; 11: 185-202; Likhasheva AS, Nikolin VP, Rorava NA 5 Rogasheva VA 5 Rohorova MA, Sébelova TE 5 Voices SS 5 Shurdo MA. Excepus DNA Sap Be Sartured Bu Stem Cells Apd Be IPvolved Thеir Resource From Deаt Аftеr Леthаl-dosе γ-radiotiop. Gepe Ther MoI Biol. 2007; 11: 305-314; Yakubov LA, Rogashev VA 5 Likhasheva AC 5 Vegas SS 5 Sebelova TE, Shilov AG, Baiborod SI, Retrova NA 5 Mechetina LV, Shurdov MA 5 Wi-Fi Urgel DNA frags. Sell Susle. 2007 JuI; 6 (18): 2293-2301] we described the pleiotropic effect of fragmented exogenous DNA on a living cell. Several types of its effects, differing in the mechanism, were distinguished into separate groups, which manifested themselves as the following described phenomena:
1. Лейкостимуляция при миелосупрессии, вызванной цитостатическим препаратом циклофосфаном.1. Leukostimulation with myelosuppression caused by the cytostatic drug cyclophosphamide.
2. Радиопротекторый и радиотерапевтический эффект.2. Radioprotective and radiotherapeutic effect.
3. Ингибирующее воздействие на рост экспериментальных опухолей мышей.3. Inhibitory effect on the growth of experimental tumors of mice.
4. Участие в репарации мутантного аллеля гена каспазы 3 клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.4. Participation in the repair of the mutant allele of the caspase gene 3 cells of human breast adenocarcinoma MCF-7.
5. Способность интегрировать в реципиентный геном (фрагменты ДНК человека интегрируют в геном мыши) в ходе репарации межцепочечных сшивок, вызванных действием цитостатика циклофосфана.5. The ability to integrate into the recipient genome (human DNA fragments are integrated into the mouse genome) during the repair of interchain cross-linking caused by the action of the cyclophosphamide cytostatic.
В проведенных экспериментах при анализе указанных явлений использовалось большое количество экзогенной ДНК, что гарантировало ее участие в молекулярных процессах, определяющих указанные явления.In the experiments performed, when analyzing these phenomena, a large amount of exogenous DNA was used, which guaranteed its participation in the molecular processes that determine these phenomena.
В настоящей работе мы использовали гистоноподобный белок протамин для защиты фрагментированной экзогенной ДНК от действия нуклеаз плазмы крови и культуральной среды во время роста культуры клеток. Как следует из результатов проведенных экспериментов, способность фрагментированной экз огенной ДНК, асе оциированной с протамином, проявлять лейкостимулирующее действие, ингибировать рост экспериментальной опухоли мыши и принимать участие в репарации мутантного аллеля гена каспазы 3 клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 сохраняется. Фрагменты экзогенной ДНК, защищенной протамином, не деградируют как в организме, так и в культуральной среде. Это позволяет использовать существенно меньшее количество экзогенной ДНК для определения указанных типов ее плейотропного действия.In this work, we used the histone-like protamine protein to protect fragmented exogenous DNA from the action of blood plasma nucleases and culture medium during cell culture growth. As follows from the results of the experiments, the ability of fragmented ex-fire DNA, associated with protamine, to exhibit leukostimulating effect, inhibit the growth of an experimental mouse tumor and to participate in the repair of the mutant allele of the caspase gene of 3 cells of the human breast adenocarcinoma MCF-7 is maintained. Fragments of exogenous DNA protected by protamine do not degrade both in the body and in the culture medium. This allows you to use a significantly smaller amount of exogenous DNA to determine the indicated types of its pleiotropic effect.
Используемые методики.Used techniques.
Исследования проводились на мышах-самцах линии CBA разводки вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Мышей содержали в пластиковых клетках по 10 особей в каждой со свободным доступом к пище и воде.The studies were conducted on male mice of the CBA line of vivarium wiring of the Institute of Cytology and Genetics SB RAS. Mice were kept in plastic cages of 10 animals each with free access to food and water.
Препараты человеческой ДНК получали из плацент здоровых рожениц. Для выделения ДНК использовали безфенольный метод, который позволяет получить полноценный геном, сохраняя те фрагменты ДНК, которые iп vivо прочно ассоциированы с белками ядерного матрикса (скафолда). Фрагментация ДНК осуществлялась ультразвуковым дезинтегратором при частоте 22 КГц, в результате чего получали смесь фрагментов ДНК размером от 200 до > 6000 п.н. (Фиг. 1). Полученные препараты ДНК хранили в морозильной камере при - 180C.Human DNA preparations were obtained from placentas of healthy women in childbirth. To isolate the DNA, the phenolic-free method was used, which allows one to obtain a complete genome, preserving those DNA fragments that are strongly associated with proteins of the nuclear matrix (scaffold). DNA fragmentation was carried out by an ultrasonic disintegrator at a frequency of 22 kHz, resulting in a mixture of DNA fragments ranging in size from 200 to> 6000 bp. (Fig. 1). The obtained DNA preparations were stored in a freezer at -18 0 C.
Для формирования комплекса с ДНК использовали раствор протамина сульфата 1% или 10 мкг/мкл для инъекций (Ферейн, Москва) и ДНК бактериофага λ, гидролизованную Нiпd III («Meдигeн», Новосибирск), или ДНК плаценты человека, фрагментированную до размеров от 200 до > 6000 п. о.. При исследовании нуклеазной активности сыворотки крови мышей после совместной инкубации ДНК и сыворотки крови мышей добавляли протеиназу К и инкубировали 1 ч при 650C. После экстракции фенол/хлороформом ДНК переосаждали 0,6 V изопропанола в присутствии линейного акриламида и проводили электрофорез в агарозных блоках.To form a complex with DNA, we used a solution of protamine sulfate 1% or 10 μg / μl for injection (Ferein, Moscow) and bacteriophage λ DNA hydrolyzed by NiPd III (Medigen, Novosibirsk), or human placenta DNA fragmented to sizes from 200 to > 6000 bp In the study of the nuclease activity of the blood serum of mice, after joint incubation of the DNA and blood serum of mice, proteinase K was added and incubated for 1 h at 65 ° C. After extraction with phenol / chloroform, 0.6 V of isopropanol was reprecipitated in the presence of linear acrylamide and electrophoresis was performed in agarose blocks.
В экспериментах использовали циклофосфан (ЦФ) производства ОАО «Биoxимик» (г. Саранск). ЦФ перед применением растворяли в физ. растворе и вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мкг/кг веса животного.In the experiments we used cyclophosphamide (CF) produced by JSC “Bioksimik” (Saransk). CF before use was dissolved in physical. solution and was administered intraperitoneally at a dose of 200 μg / kg of animal weight.
Кровь для подсчета лейкоцитов брали из кончика хвоста индивидуально у каждой мыши непосредственно перед введением и на 4, 7 и 11 сутки после введения циклофосфана. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 мышей. Кровь разводили в 20 раз в 3% растворе уксусной кислоты, и в камере Горяева подсчитывали количество лейкоцитов в 1 мм3. Достоверность различий между данными определяли, используя t-критерий Стьюдента.Blood for counting leukocytes was taken from the tip of the tail individually from each mouse immediately before administration and on days 4, 7, and 11 after cyclophosphamide was administered. Each experimental group consisted of 4 mice. Blood was diluted 20 times in a 3% solution of acetic acid, and the number of leukocytes in 1 mm 3 was counted in the Goryaev’s chamber. The significance of differences between the data was determined using t-student test.
Исследование влияния ДНК на противоопухолевый эффект циклофосфана проводили на перевиваемой мышиной лимфосаркоме LS и ее субштамме RLS. LS была получена сотрудником ИЦиГ В. И. Калединым индукцией нитрозометилмочевиной у мыши линии CBA, переведена в асцитную форму и поддерживается на мышах этой линии. Эта опухоль является высокочувствительной к индукции апоптоза циклофосфаном и некоторыми другими алкилирующими агентами. Опухоль RLS получена из LS путем последовательных внутримышечных перевивок ее рецидивов, возникавших после воздействия возрастающими дозами циклофосфана, вследствие чего она приобрела перекрестную резистентность к индукции апоптоза и противоопухолевому действию алкилирующих препаратов. Противоопухолевый эффект того или иного воздействия оценивали по торможению роста опухоли и увеличению продолжительности жизни опухоленосителей. Достоверность различий между данными определяли, используя t-критерий Стъюдента.Investigation of the effect of DNA on the antitumor effect of cyclophosphamide was carried out on transplantable mouse LS lymphosarcoma and its RLS sub-strain. LS was obtained by ICG researcher V.I. Kaledin by nitrosomethylurea induction in a CBA mouse, transferred to ascites form and maintained on mice of this line. This tumor is highly sensitive to the induction of apoptosis by cyclophosphamide and some other alkylating agents. The RLS tumor is obtained from LS by successive intramuscular inoculations of its relapses that occurred after exposure to increasing doses of cyclophosphamide, as a result of which it acquired cross-resistance to the induction of apoptosis and the antitumor effect of alkylating drugs. The antitumor effect of one or another effect was evaluated by inhibition of tumor growth and an increase in the life expectancy of tumor carriers. The significance of differences between the data was determined using Student's t-test.
Культуру клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 культивировали в среде RPMI 1640 с ЮмМ L-глутамина и 50 мкг/мл стрептомицина "Sigmа", (США) при 370C в присутствии 5% эмбриональной бычьей сыворотки (ФБС) «Биoлoт», (Россия) в атмосфере с 5% CO2 до плотности 0.7x107 клеток на 4 лунки в 24 луночном планшете.The MCF-7 human breast adenocarcinoma cell culture was cultured in RPMI 1640 medium with HMM L-glutamine and 50 μg / ml Sigma streptomycin, (USA) at 37 ° C in the presence of 5% Biolot bovine serum (PBS), (Russia) in an atmosphere with 5% CO 2 to a density of 0.7x10 7 cells per 4 wells in a 24 well plate.
Для приготовления ДНК и предшественника 10 мкг ДНК плаценты человека, фрагментированной до размеров 200 - 6000 п.о., метили ник- трансляцией в присутствии фрагмента Кленова, трех холодных и одного горячего dNТР. Для удаления не включившихся предшественников ДНК переосаждали 2 раза изопропанолом, согласно процедуре, описанной у Гловера [Клонирование ДНК. Методы. Пер. с англ. Под ред. Д. Гловера. M.: Мир, 1988. 538 с]. ДНК разводили в соответствующем объеме дистиллированной воды. ДНК и протамин смешивали в пропорции 1:1 по массе.To prepare DNA and the precursor, 10 μg of human placenta DNA fragmented to 200-6000 bp was labeled by nick translation in the presence of a Klenov fragment, three cold and one hot dNTP. To remove the not included precursors, DNA was reprecipitated 2 times with isopropanol according to the procedure described in Glover [DNA cloning. Methods Per. from English Ed. D. Glover. M .: Mir, 1988. 538 s]. DNA was diluted in an appropriate volume of distilled water. DNA and protamine were mixed in a ratio of 1: 1 by weight.
Образцы ДНК добавляли в каждую лунку планшета (в объеме, не превышающем 20 мкл на лунку). В каждой лунке находилось 25-35 мл среды. Аликвоту, 1 мкл из рабочего объема отбирали на счет радиоактивности. В культуральную среду, в лунку, где культивировались клетки, добавляли меченую ДНК, обработанную как описано выше. Клетки инкубировали с ДНК при 37°C, в течение необходимого времени в воздушном термостате. Время инкубации было выбрано: 0' (меченую ДНК добавляли в среду, содержащегося на льду титратора, сразу после этого среду отбирали и добавляли Тритон X-IOO), 30'; 60';120'; 180'.DNA samples were added to each well of the plate (in a volume not exceeding 20 μl per well). Each well contained 25-35 ml of medium. An aliquot of 1 μl from the working volume was taken into account radioactivity. Labeled DNA processed as described above was added to the culture medium, to the well where the cells were cultured. Cells were incubated with DNA at 37 ° C for the required time in an air thermostat. The incubation time was chosen: 0 '(labeled DNA was added to the medium contained on the ice of the titrator, immediately after this, the medium was taken and Triton X-IOO was added), 30'; 60 ';120'; 180 '.
По завершению времени инкубации планшет помещали на лед. Среду количественно отбирали и немедленно добавляли Тритон X-100 в буфере А [Rоbеrts DB. Drоsорhilа: А Рrасtiсаl Аррrоасh. IRL Рrеss, Охfоrd, 1986] (буфер А содержал 2 мМ CaCl2, 0.5% Тритона X-100). В каждую лунку добавляли 250 мкл лизирующего буфера. Клетки оставляли с лизирующим буфером на льду в течение 10'. Лизированные клетки ресуспендировали несколько раз и наносили на 1 мл градиента 10% сахарозы на буфере А, содержащем 2 мМ CaCl2. Центрифугирование проводилось в конических пробирках (25мл) в бакет-роторе на центрфуге K23 при 60Og (2000 об/мин) в течение 20 минут. Супернатант, представляющий цитоплазматичекую фракцию, отбирали в отдельную пробирку и осаждали изопропанолом. Осадок ядер промывали дважды 250 мкл лизирующего буфера (буфер A3 содержащий 2 мМ CaCl2, 0.5% Тритона X-100). После каждой промывки препарат центрифугировали 10' в бакет-роторе на центрифуге K23 при 60Og ( 2000 об/мин). Ядра ресуспендировали в 500 мкл буфера А, содержащего 2 мМ CaCl2, анализировали цитологически и переносили в пробирки от ротора JA-21 центрифуги J2-21. К суспензии ядер добавляли до 2M NaCl и до 1% SDS. Лизат ядер инкубировали при 650C 15' до полного просветления реакционной смеси без какого либо встряхивания. Лизат ядер центрифугировали при 21 000 об/мин (52 000 g) в течение 20 минут при 350C. Супернатант, представляющий ядерный сок или межхромосомный материал отбирали желтым носиком до суха и переносили в другую пробирку. К супернатанту добавляли 1 :10 объема NaAc и осаждали 0.6 объема изопропанола. Количество меченого материала определяли стандартным способом в эппендорфовских пробирках, опущенных в счетные флаконы на счетчике Rас Веttа. Образцы фракционировали в 0.7% агарозном геле. После проведения электрофореза агарозный блок высушивали на подложке под струей горячего воздуха. Гель экспонировали с рентгеновской пленкой в течение ночи или в зависимости от количества меченого материала.At the end of the incubation time, the plate was placed on ice. The medium was quantitatively taken and Triton X-100 was immediately added in buffer A [Roberts DB. Drosorhila: A Rastisal Arrroasch. IRL Press, Oxford, 1986] (buffer A contained 2 mM CaCl 2 , 0.5% Triton X-100). 250 μl of lysis buffer was added to each well. Cells were left with lysis buffer on ice for 10 '. Lysed cells were resuspended several times and applied to a 1 ml gradient of 10% sucrose in buffer A containing 2 mM CaCl 2 . Centrifugation was carried out in conical tubes (25 ml) in a bucket-rotor on a K23 centrifuge at 60Og (2000 rpm) for 20 minutes. The supernatant representing the cytoplasmic fraction was collected in a separate tube and precipitated with isopropanol. The nuclear pellet was washed twice with 250 μl of lysis buffer (buffer A 3 containing 2 mm CaCl 2 , 0.5% Triton X-100). After each washing, the preparation was centrifuged 10 'in a bucket-rotor in a K23 centrifuge at 60Og (2000 rpm). Nuclei were resuspended in 500 μl of buffer A containing 2 mM CaCl 2 , analyzed cytologically and transferred to tubes from the JA-21 rotor of the J2-21 centrifuge. Up to 2M NaCl and up to 1% SDS were added to the core suspension. The nuclear lysate was incubated at 65 ° C 15 ′ until the reaction mixture was completely clarified without any shaking. Nuclear lysate centrifuged at 21,000 rpm (52,000 g) for 20 minutes at 35 ° C. The supernatant, representing nuclear juice or interchromosomal material, was taken with a yellow nose to dryness and transferred to another tube. A 1: 10 volume of NaAc was added to the supernatant and 0.6 volumes of isopropanol were precipitated. The amount of labeled material was determined in a standard way in Eppendorf tubes, dropped into counting bottles on a Rac Vetta counter. Samples were fractionated on a 0.7% agarose gel. After electrophoresis, the agarose block was dried on a substrate under a stream of hot air. The gel was exposed with an x-ray film overnight or depending on the amount of labeled material.
Для анализа фрагментации ДНК при апоптозе клетки MCF-7 инкубировали 24 ч при 37°C в присутствии ОД мкг/мл ФНО-α и 10 мкг/мл циклогексимида в среде RPMI 1640, содержавшей 10 мМ L- глутамина, 50 мкг/мл стрептомицина и 5% ЭБС. Для выделения ДНК к ресуспендированным в воде клеткам добавляли SDS до 1%, ЭДТА до 20 mМ и PrK до 200 мкг/мл и инкубировали при 600C в течение 1 ч. ДНК Осаждали изопропанолом, растворяли в воде и вновь добавляли ЭДТА до 20 mМ и PrK до 200 мкг/мл и инкубировали при 600C в течение 1 ч. Образцы анализировали в 2% агарозном геле электрофорезом.To analyze DNA fragmentation during apoptosis, MCF-7 cells were incubated for 24 hours at 37 ° C in the presence of OD μg / ml TNF-α and 10 μg / ml cycloheximide in RPMI 1640 medium containing 10 mM L-glutamine, 50 μg / ml streptomycin and 5% EBS. To isolate DNA, SDS up to 1%, EDTA up to 20 mM and PrK up to 200 μg / ml were added to the cells resuspended in water and incubated at 60 0 C for 1 h. DNA was precipitated with isopropanol, dissolved in water and EDTA was added again up to 20 mM and PrK up to 200 μg / ml and incubated at 60 ° C for 1 h. Samples were analyzed on a 2% agarose gel by electrophoresis.
Рассмотрим лейкостимулирующее действие фрагментов экзогенной ДНК, защищенных протамином, при экспериментально вызванной ЦФ миелосупрессии мышей.Consider the leuko-stimulating effect of exogenous DNA fragments protected by protamine in experimentally induced CF myelosuppression in mice.
Остановимся на динамике деградации экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, и без него при воздействии нуклеаз сыворотки крови. Любая незащищенная ДНК, попавшая в кровь, практически мгновенно подвергается воздействию нуклеаз, что приводит к ее деградации до фрагментов размером, кратным 1-2 нуклеосомным мономерам и составляющим ~ 200 п.о. [Черепанова A.B., Тамкович C.H., Власов В. В., Лактионов П.П. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии. Биомедицинская химия. 2007. T. 53, N° 5, с. 488- 496]. Для достижения плейотропного [Николин В. П., Попова H. А., Себелева Т.Е., Стрункин Д.H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC, Якубов Л.A., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, N° 1, с. 66-69; Николин В. П., Попова H. А., Себелева Т.Е., Стрункин Д. H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC, Якубов Л.A., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, JNe 3, с. 336-340; Likhасhеvа AS, Nikolin VP, Ророvа NA, Dubаtоlоvа TD, Strunkin DN, Rоgасhеv VA, Sеbеlеvа ТЕ, Еrоfееv IS, Воgасhеv SS, Yаkubоv LA, Shurdоv MA. Integration of human DNA frаgmепts iпtо thе сеll gепоmеs оf сеrtаiп tissuеs frоm аdult miсе trеаtеd with суtоstаtiс сусlорhоsрhаmidе iп соmbiпаtiоп with human DNA. Gene Ther MoI Вiоl. 2007; 11: 185-202; Likhасhеvа AS, Nikolin VP, Ророvа NA, Rоgасhеv VA, Рrоkhоrоviсh MA, Sеbеlеvа ТЕ, Воgасhеv SS, Shurdоv MA. Ехоgепоus DNA сап bе сарturеd bу stеm сеlls апd bе iпvоlvеd iп thеir rеsсuе frоm dеаth аftеr lеthаl-dоsе γ-rаdiаtiоп. Gene Ther MoI Вiоl. 2007; 11 : 305-314; Yаkubоv LA, Rоgасhеv VA, Likhасhеvа AC, Воgасhеv SS, Sеbеlеvа ТЕ, Shilоv AG, Ваibоrоdiп SI, Реtrоvа NA, Месhеtiпа LV, Shurdоv MA, Wiсkstrоm E. Nаturаl humап gепе соrrесtiоп bу smаll ехtrасеllulаr gепоmiс DNA frаgmепts. Сеll Сусlе. 2007 JuI; 6(18): 2293-2301] терапевтического эффекта, связанного с размером вводимой ДНК, участвующей затем в различных типах репаративной гомологичной рекомбинации, количество экзогенной ДНК, вводимой в организм, составляло суммарно от 0,3 до 6,25 мг на животное, что многократно превышало физиологическую норму.Let us dwell on the dynamics of degradation of exogenous DNA associated with protamine, and without it when exposed to serum nucleases. Any unprotected DNA that enters the bloodstream is almost instantly exposed to nucleases, which leads to its degradation to fragments of a size that is a multiple of 1-2 nucleosome monomers and constitutes ~ 200 bp. [Cherepanova AB, Tamkovich CH, Vlasov V.V., Laktionov P.P. The activity of blood deoxyribonucleases is normal and with pathology. Biomedical chemistry. 2007.V. 53, N ° 5, p. 488- 496]. To achieve pleiotropic [Nikolin V.P., Popova H.A., Sebeleva T.E., Strunkin D.H., Rogachev BA, Semenov D.B., Bogachev CC, Yakubov L.A., Shurdov M.A. . The effect of exogenous DNA on the growth of experimental tumors. Oncology issues. 2006. T. 52, N ° 1, p. 66-69; Nikolin V.P., Popova H.A., Sebeleva T.E., Strunkin D. H., Rogachev BA, Semenov D. B., Bogachev CC, Yakubov L.A., Shurdov M.A. The effect of exogenous DNA on the restoration of leukopoiesis and the antitumor effect of cyclophosphamide. Oncology issues. 2006. T. 52, JNe 3, p. 336-340; Likhasheva AS, Nikolin VP, Rorava NA, Dubolova TD, Strunkin DN, Rogasheva VA, Sebelova TE, Erofeev IS, Vegashev SS, Yakubov LA, Shurdov MA. Integration of human DNA fragsmpts thеll gepos оf sertаіp tissuеs from adult miсrеtеd with сutostatis сuslorhosphamide ip humanity with human DNA. Gene Ther MoI Biol. 2007; 11: 185-202; Likhasheva AS, Nikolin VP, Porova NA, Rogasheva VA, Rokhorovis MA, Cebelova TE, Vogashev SS, Shurdov MA. Excepus DNA Sap Be Sartured Bu Stem Cells Apd Be IPvolved Thеir Resource From Deаt Аftеr Леthаl-dosе γ-radiotiop. Gene Ther MoI Biol. 2007; 11: 305-314; Yakubov LA, Rogasheva VA, Likhasheva AC, Vegasheva SS, Cebelova TE, Shilov AG, Baiborod SI, Retrova NA, Meschetipa LV, Shurdov MA, Wipestrulu humler DNA frags. Sell Susle. 2007 JuI; 6 (18): 2293-2301] therapeutic effect associated with the size of the introduced DNA, which is then involved in various types of reparative homologous recombination, the amount of exogenous DNA introduced into the body ranged from 0.3 to 6.25 mg per animal, which many times exceeded the physiological norm.
Первоначально мы оценили нуклеазную активность сыворотки крови. В качестве субстрата использовалась геномная ДНК человека, выделенная из плацент здоровых рожениц, фрагментированная до размеров от 200 до > 6000 п.н. Была исследована динамика деградации ДНК человека в сыворотке мышиной крови в концентрациях - 1, 10, 50 и 97%. Смесь инкубировали 10 мин при 370C.Initially, we evaluated the nuclease activity of blood serum. As a substrate, human genomic DNA was used, isolated from the placenta of healthy women in labor, fragmented to sizes from 200 to> 6000 bp. The dynamics of degradation of human DNA in mouse serum was studied at concentrations of 1, 10, 50 and 97%. The mixture was incubated for 10 min at 37 ° C.
Как видно из полученных результатов, уже через 10 мин инкубации в 1% сыворотке крови заметна деградация исходной ДНК. При всех остальных концентрациях сыворотки, находящейся в реакционной смеси, исходная ДНК деградирует до фрагментов размером ~ 200 п.о. (Фиг. 2).As can be seen from the results obtained, after 10 min of incubation in 1% serum, degradation of the original DNA is noticeable. At all other concentrations of serum in the reaction mixture, the original DNA degrades to fragments of ~ 200 bp in size. (Fig. 2).
Для предотвращения деградации в настоящее время активно разрабатываются различные методы доставки ДНК в клетку, например, применение ДНК-связывающих белков в сочетании с лигандами, избирательно взаимодействующими с рецепторами на поверхности клеток-мишеней, опосредующими эндоцитоз. Так же для защиты ДНК от действия нуклеаз крови используются вирусные векторы, липосомы и др. [Анисимова В. А. Адресная доставка ДНК-вакцин. 8-ая Международная конференция Вакцина против ВИЧ. 2000]. Мы предположили, что комплекс ДНК с протамином позволит защитить ДНК от действия нуклеаз крови и при этом не снизит лейкостимулирующей активности препарата экзогенной ДНК, охарактеризованной в нашей предыдущей работе [Николин В. П., Попова H.A., Себелева Т.Е., Стрункин Д.H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC, Якубов Л.A., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, N° 3, с. 336-340].To prevent degradation, various methods are currently being actively developed for delivering DNA to a cell, for example, the use of DNA-binding proteins in combination with ligands that selectively interact with receptors on the surface of target cells that mediate endocytosis. Also, to protect DNA from the action of blood nucleases, viral vectors, liposomes, etc. are used [Anisimova V. A. Address delivery of DNA vaccines. 8th International HIV Vaccine Conference. 2000]. We suggested that the complex of DNA with protamine will protect the DNA from the action of blood nucleases and at the same time it will not reduce the leukostimulating activity of the exogenous DNA preparation described in our previous work [Nikolin V.P., Popova HA, Sebeleva T.E., Strunkin D. H., Rogachev BA, Semenov D. B., Bogachev CC, Yakubov L.A., Shurdov M.A. The effect of exogenous DNA on the restoration of leukopoiesis and the antitumor effect of cyclophosphamide. Oncology issues. 2006. T. 52, N ° 3, p. 336-340].
Протамин — низкомолекулярный ядерный белок, молекулярная масса 4-12 кДа. Для протамина характерно высокое содержание щелочных аминокислот, особенно аргинина (70 — 80%), что обусловливает основные свойства протамина. Он хорошо растворим в воде, кислой и нейтральной среде, осаждается щелочами, не денатурирует при нагревании. У многих животных протамин наряду с гистонами содержится в сперматозоидах, а у некоторых (например, у рыб) полностью замещает гистоны. В ядрах клеток протамин, подобно гистонам, ассоциирован с дезоксирибонуклеиновыми кислотами в нуклеопротамины. Методом рентгеноструктурного анализа показано, что цепочка протамина обматывается как третья нить вокруг двойной спирали ДНК. Присутствие протамина защищает ДНК от действия нуклеаз и придает хроматину компактную форму. Протамин образуют соли с кислотами и комплексы с кислыми белками (малорастворимый комплекс протамина с инсулином используют в медицинской практике для продления срока действия последнего) [Вrеwеr L, Соrzеtt M, Lаu EY, Ваlhоrп R. Dynamics of protamine I binding to single DNA mоlесulеs. J Вiоl Сhеm. 2003 Осt 24; 278(43):42403-42408; Vilfan ID, Сопwеll CC, Нud NV. Fоrmаtiоп оf паtivе-liке mаmmаliап sреrm сеll сhrоmаtiп with fоldеd bull рrоtаmiпе. J Вiоl Сhеm. 2004 Мау 7; 279(19):20088-20095].Protamine is a low molecular weight nuclear protein with a molecular weight of 4-12 kDa. Protamine is characterized by a high content of alkaline amino acids, especially arginine (70 - 80%), which determines the main properties of protamine. It is highly soluble in water, acidic and neutral, precipitated with alkalis, does not denature when heated. In many animals, protamine, along with histones, is found in sperm, and in some (for example, in fish) it completely replaces histones. In the nuclei of cells, protamine, like histones, is associated with deoxyribonucleic acids into nucleoprotamines. By the method of X-ray diffraction analysis it was shown that the protamine chain is wound as a third strand around the double helix of DNA. The presence of protamine protects DNA from the action of nucleases and gives chromatin a compact form. Protamine is formed by salts with acids and complexes with acidic proteins (a poorly soluble complex of protamine with insulin is used in medical practice to extend the duration of the latter) [Braver L, Conset M, Lau EY, Baloch R. Dynamics of protamine I binding to single DNA molecules. J Biol Schem. 2003 Oct 24; 278 (43): 42403-42408; Vilfan ID, Sopwell CC, Nud NV. Formiatop Of Pative-Like Mammaliap Sprm Cell Сhromatip with Fould Bull Bull Rotamipe. J Biol Schem. 2004 Mau 7; 279 (19): 20088-20095].
Для выяснения соотношения ДНК и протамина, при котором молекулы ДНК полностью защищаются от деградации, λ Нiпd III ДНК и ДНК человека, связанные с протамином в различных соотношениях, инкубировали в 10% сыворотке крови мыши.To determine the ratio of DNA and protamine, in which DNA molecules are completely protected from degradation, λ Нiпd III DNA and human DNA associated with protamine in various ratios were incubated in 10% mouse serum.
Первоначально для формирования комплекса протамин/ДНК 2 мкг ДНК λ Нiпd III и 15 мкг ДНК человека инкубировали несколько минут с различным (от 10 до 150% по массе) количеством протамина. Далее комплексы протамин/ДНК, полученные для различных соотношений контрагентов, инкубировали 60 минут в 10% сыворотке крови мыши. Как следует из полученных данных, протамин в соотношении 80% к ДНК по массе практически абсолютно защищает ДНК от деградации (Фиг. 3).Initially, for the formation of the protamine / DNA complex, 2 μg of λ λ Nipd III DNA and 15 μg of human DNA were incubated for several minutes with various (from 10 to 150% by weight) amounts of protamine. Next, the protamine / DNA complexes obtained for different ratios of counterparties were incubated for 60 minutes in 10% mouse serum. As follows from the data obtained, protamine in a ratio of 80% to DNA by weight almost completely protects DNA from degradation (Fig. 3).
Остановимся на стимуляции восстановления лейкопоэза экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, в соотношении протамин/ДНК - 0.8/1.0.Let us dwell on the stimulation of the recovery of leukopoiesis of exogenous DNA associated with protamine in the ratio of protamine / DNA - 0.8 / 1.0.
В данной работе были проведены эксперименты, в которых для инъекций мышам использовали ДНК, связанную с протамином. Исследовалась стимуляция восстановления лейкопоэза после введения мышам алкилирующего цитостатика циклофосфана, угнетающего кроветворение.In this work, experiments were conducted in which DNA associated with protamine was used for injection into mice. We studied the stimulation of the restoration of leukopoiesis after administration to mice of an alkylating cytostatic cyclophosphamide that inhibits hematopoiesis.
Циклофосфамид (ЦФ) - один из наиболее широко применяемых препаратов в онкологической практике. Противоопухолевый эффект ЦФ в настоящее время связывают с его генотоксическим алкилирующим производным фосфорамид мустардом (ФМ), который спонтанно образуется из альдофосфамида, производного 4-гидpoкcи-Цф. ФМ образует аддукты с пуриновыми основаниями молекулы ДНК, в особенности соседствующими с остатками гуанина, и приводит к возникновению перекрестных сшивок в двойной цепи молекулы ДНК [Yu LJ, Drеwеs P, Gustafsson K, Brain EG, Несht JE, Wахmап DJ. In vivо mоdulаtiоп оf аltеrпаtivе раthwауs оf P-450-catalyzed сусlорhоsрhаmidе mеtаbоlism: imрасt on рhаrmасоkiпеtiсs апd апtitumоr асtivitу. J Рhаrmасоl Ехр Тhеr. 1999 Маг; 288(3):928-937; De Silvа IU, МсНugh PJ, Сliпgеп PH, Наrtlеу JA. Dеfmiпg thе rоlеs оf пuсlеоtidе ехсisiоп rераir апd rесоmbiпаtiоп iп thе rераir оf DNA iпtеrstrапd сrоss-liпks iп mаmmаliап сеlls. MoI CeIl Вiоl. 2000 Nоv; 20(21):7980-7990; Каrlе P, Rеппеr M, Sаlmопs В, Gϋпzburg WH. Nесrоtiс, rаthеr thап арорtоtiс, сеll dеаth саusеd bу суtосhrоmе P450-activated ifоsfаmidе. Сапсеr Gепе Тhеr. 2001 Маг; 8(3):220-230].Cyclophosphamide (CF) is one of the most widely used drugs in oncological practice. The antitumor effect of CF is currently associated with its genotoxic alkylating derivative phosphoramide mustard (FM), which is spontaneous formed from aldophosphamide, a derivative of 4-hydroxy-Cf. FM forms adducts with purine bases of the DNA molecule, especially adjacent to the guanine residues, and leads to the appearance of cross-linking in the double chain of the DNA molecule [Yu LJ, Dreves P, Gustafsson K, Brain EG, Hesh JE, Waxmap DJ. In vivo moduliop оf alterpativа patthаvаs оf P-450-catalyzed souslоrhosphamidé metabolism: imаrt on раrmасокипетісс apd aptumor аtivitu. J PHARMACOL EXP THER. 1999 Mage; 288 (3): 928-937; De Silva IU, McHugh PJ, slip PH, Nartle JA. Dеfmiпg thе rоlеs оf pusleotide ессісiоп рераир адр resorbiпіп ip Те rerair оf DNA Ipterstrapd сross-lipks ip mammaliap sells. MoI CeIl Biol. 2000 Nov; 20 (21): 7980-7990; Karl P, Repper M, Salmops B, Gözburg WH. Nestrotis, rather thap arortotis, bell deat saused bu sutochrote P450-activated ifosfamide. Sapser Gepe Ther. 2001 Mage; 8 (3): 220-230].
Циклофосфан индуцирует образование межцепочечных сшивок в активно делящихся клетках, в результате чего гибнут не только опухолевые клетки, но и, например, клетки крови. В результате на организменном уровне наблюдается лейкопения, степень выраженности которой зависит от дозы циклофосфана.Cyclophosphamide induces the formation of interchain cross-linking in actively dividing cells, resulting in the death of not only tumor cells, but also, for example, blood cells. As a result, leukopenia is observed at the body level, the severity of which depends on the dose of cyclophosphamide.
Мышам-самцам CBA в/б был введен циклофосфан по 200 мг/кг веса. Для подсчета количества лейкоцитов за 30 мин до этого у всех мышей брали кровь из кончика хвоста по 10 мкл. Аналогично забор крови проводили на 4, 7 и 11 сутки после введения ЦФ. Одна группа мышей служила контролем (физиологический раствор), а двум другим следующие 3 дня после введения ЦФ внутрибрюшинно вводили по 50 мкг ДНК человека - одной группе, другой — ДНК человека в комплексе с протамином.200 mg / kg of cyclophosphamide was administered to male CBA mice. To calculate the number of leukocytes 30 minutes before, all mice were bled from the tip of the tail, 10 μl. Similarly, blood sampling was performed on days 4, 7, and 11 after the administration of CF. One group of mice served as a control (physiological saline), and two others, the next 3 days after the administration of CF, were injected intraperitoneally with 50 mcg of human DNA - in one group, the other - human DNA in complex with protamine.
Как демонстрируют результаты эксперимента (Фиг. 4), на 4 сутки, несмотря на полное подавление активности белого ростка крови, лейкоцитов сохраняется в 2 раза больше, чем в контрольной группе.As the results of the experiment demonstrate (Fig. 4), on day 4, despite the complete suppression of the activity of the white blood sprout, there are 2 times more leukocytes than in the control group.
На 7 сутки после введения ЦФ количество лейкоцитов у мышей, которым водили ДНК человека или ДНК человека, связанную с протамином, достоверно выше, чем в контрольной группе, и даже превышает исходный уровень.On the 7th day after the administration of CF, the number of leukocytes in mice that were driven with human DNA or human DNA associated with protamine is significantly higher than in the control group and even exceeds the initial level.
На 11 сутки наблюдается незначительное естественное снижение числа лейкоцитов, однако, по-прежнему восстановление лейкопоэза в группах мышей, получавших дополнительно инъекции экзогенной ДНК, более эффективное, чем в контроле.On day 11, there was a slight natural decrease in the number of leukocytes, however, the recovery of leukopoiesis in groups of mice that received additional exogenous DNA injections was still more effective than in the control.
Такое свойство экзогенной ДНК стимулировать лейкопоэз связано с несколькими механизмами ее воздействия на клетку-предшественницу лейкоцитов.This property of exogenous DNA to stimulate leukopoiesis is associated with several mechanisms of its effect on the leukocyte progenitor cell.
1. Экзогенные фрагменты ДНК доставляются в межхромосомное пространство активно пролиферирующих клеток, включая всех предшественников лейкопоэза [Гистология, цитология и эмбриология. Под ред. Афанасьева Ю.И., Кузнецова С. Л., Юриной Н.А. M.: Медицина, 2004. 768 с] и репарация межцепочечных сшивок (МЦС), возникших при воздействии ЦФ, происходит с их участием. На завершающем этапе репарации МЦС требуется гомологичная рекомбинация, для которой донорными последовательностями в обычных условиях служат гомологичные участки сестринской хроматиды или гомологичной хромосомы. При множественных МЦС процесс репарации может быть затруднен стерическими проблемами, возникающими при поиске гомологичных последовательностей и спаривании цепей. Расположенные в непосредственной близости с репарируемыми МЦС экзогенные фрагменты, имеющие гомологию с участками репарации, могут быть использованы в качестве донорных последовательностей и могут принимать участие в гомологичной рекомбинации, необходимой для завершения репарационного процесса. При таком участии экзогенной ДНК экстрахромосомальной локализации обслуживается большее количество репарируемых повреждений, что безусловно должно отразится на жизнеспособности прогениторных клеток. Факт интеграции экзогенной ДНК в ходе репарации МЦС был описан в работе [Likhасhеvа AS, Nikolin VP, Ророvа NA, Dubаtоlоvа TD, Strunkin DN, Rоgасhеv VA, Sеbеlеvа ТЕ, Еrоfееv IS, Воgасhеv SS, Yаkubоv LA, Shurdоv MA. Iпtеgrаtiоп оf human DNA frаgmепts iпtо thе сеll gепоmеs оf сеrtаiп tissuеs frоm аdult miсе trеаtеd with суtоstаtiс сусlорhоsрhаmidе iп соmbiпаtiоп with hшпап DNA. Gene Ther MoI Вiоl. 2007; 11 : 185-202].1. Exogenous DNA fragments are delivered into the interchromosomal space of actively proliferating cells, including all the precursors of leukopoiesis [Histology, cytology and embryology. Ed. Afanasyeva Yu.I., Kuznetsova S.L., Yurina N.A. M .: Medicine, 2004. 768 s] and the repair of interchain cross-linking (MCC) arising from exposure to CF occurs with their participation. At the final stage of the repair of the MCC, homologous recombination is required, for which homologous regions of the sister chromatid or homologous chromosome serve as donor sequences under normal conditions. With multiple MDC the repair process may be hindered by steric problems that arise when searching for homologous sequences and pairing chains. Exogenous fragments located in close proximity to the repaired MCC that have homology with the repair sites can be used as donor sequences and can take part in the homologous recombination necessary to complete the repair process. With such participation of exogenous DNA extrachromosomal localization, a greater number of repaired lesions are served, which certainly should affect the viability of progenitor cells. The fact of integration of exogenous DNA during the repair of the MCC was described in [Likhasheva AS, Nikolin VP, Rorava NA, Dubolova TD, Strunkin DN, Rogasheva VA, Celeva TE, Erofeev IS, Vegas SS, Yakubov, LA. IPTEGRATIOP OF HUMAN DNA FRAGMEPTS IPTO THE SELL GEPOMETS OF OF SERTAP TIP FROM ADULT MICE TRETATED WITH SOSTOSTATIS SUSLORCHOSPHAMIDE IP COMBIPATIOP WITH HSPAP DNA. Gene Ther MoI Biol. 2007; 11: 185-202].
2. Следующим фактором, влияющим на выживаемость созревающих клеток-предшественников лейкоцитов после воздействия ЦФ и обработки экзогенной ДНК, является описанный в литературе феномен «вcкpытия гeнoмa», свойственный для созревающих прогениторных клеток-предшественников лейкоцитов или CK, вступивших на путь терминальной дифференцировки. Это явление связано с возникновением многочисленных функциональных одноцепочечных разрывов хроматина, что предполагает вовлечение генетического материала в реорганизацию, которая является обязательной и неотъемлемой частью дифференцировки и изменения паттерна экспрессии генов [Fаrzапеh F, Zalin R5 Вrill D, Shаll S. DNA strапd brеаks апd АDР-iϊbоsуl trапsfеrаsе асtivаtiоп duriпg сеll diffеrепtiаtiоп. Nаturе. 1982 Nоv 25; 300(5890): 362-366; Jоhпstопе AP, Williаms GT. RoIe оf DNA brеаks апd АDР-ribоsуl trапsfеrаsе асtivitу iп еukаrуоtiс diffеrепtiаtiоп dеmопstrаtеd iп hшпап lуmрhосуtеs. Nаturе. 1982 Nоv 25; 300(5890): 368-370; Vаtоliп SY, Оkhарkiпа EV, Маtvееvа NM, Shilоv AG, Ваibоrоdiп SI, Рhilimопепkо VV, Zhdапоvа NS, Sеrоv OL. Sсhеdulеd реrturbаtiоп iп DNA duriпg iп vitrо diffеrепtiаtiоп оf mоusе еmbrуо-dеrivеd сеlls. MoI Rерrоd Dеv. 1997 Мау; 47(1): 1-10]. Всплеск никирования ДНК совпадает с первым-третьим митозом дифференцирующихся клеток и определяет резкое увеличение (в 5-6 раз) частоты сестринских хроматидных обменов. Предполагаемый механизм для такого рода обменов в геноме - это гомологичная рекомбинация [Vаtоliп SY, Оkhарkiпа EV, Маtvееvа NM, Shilоv AG, Ваibоrоdiп SI, Рhilimопепkо VV, Zhdапоvа NS, Sеrоv OL. Sсhеdulеd реrturbаtiоп iп DNA duriпg iп vitrо diffеrепtiаtiоп оf mоusе еmbrуо- dеrivеd сеlls. MoI Rерrоd Dеv. 1997 Мау; 47(1): 1-10]. По-видимому, каждая стадия созревания лейкоцитов характеризуется реорганизацией хроматина и активацией нового ансамбля экспрессирующихся генов. Предположительно, механизм, определяющий повышенную выживаемость прогениторных клеток после обработки ЦФ и экзогенной ДНК, состоит в следующем. Клетка-предшественник лейкоцитов после прошедшей репарации МЦС в 'присутствии экзогенной ДНК экстрахромосомальной локализации или без нее сохраняет определенное количество дефектов хроматина, возникших в результате аберраций при формировании и реализации интермедиатов. Покоящаяся, спасенная клетка с оставшимися дефектами хроматина после репарации МЦС приступает к делению. Если при этом в клетке не начинается реорганизация хроматина, связанная с переходом клетки в следующую стадию созревания, то она неминуемо гибнет вследствие дефектного митоза. Если деление сопровождается одновременным переходом клетки в следующую стадию созревания, характеризующуюся реорганизацией хроматина и появлением множественных одноцепочечных разрывов, то присутствие в ядре фрагментов экзогенной ДНК позволяет клетке исправить оставшиеся дефекты и полностью восстановить свою жизнеспособность. По- видимому, существует некая согласованность между системами контроля прогрессии клеточного цикла и рекомбинационно- репарационными системами клетки. Предполагается, что контроль сhесkроiпt систем на время появления функциональных разрывов генома прекращен или каким-то образом изменен. Это позволяет фрагментам экзогенной ДНК остаться незамеченными системами контроля и быть вовлеченными в репаративно-рекомбинационные процессы, связанные с восстановлением целостности хроматина после произошедшей реорганизации генома в качестве донорных гомологичных последовательностей.2. The next factor affecting the survival of maturing leukocyte progenitor cells after exposure to CF and exogenous DNA processing is the “genome opening” phenomenon described in the literature, which is characteristic of maturing progenitor leukocyte or CK progenitor cells that have entered the path of terminal differentiation. This phenomenon is associated with the emergence of numerous functional single-chain chromatin breaks, which suggests the involvement of genetic material in the reorganization, which is an indispensable and integral part of differentiating and changing the pattern of gene expression [Farzapheh F, Zalin R 5 Brill D, Shall S. DNA strapd breaks apd ADP-iϊbosul trapsfеrе asivatiop duriпg sell differeptiatiop. NATURE. 1982 Nov 25; 300 (5890): 362-366; Johnsstope AP, Williams GT. RoIe оf DNA BREAKS APD ADP-ribosul trаspеrаѕе аtivitу іp еukаrуоtіс diffеrеptiаtiop demopstrаtеd аnпshpap lіmrhosutеs. NATURE. 1982 Nov 25; 300 (5890): 368-370; Vatolip SY, Okarkipa EV, Matveeva NM, Shilov AG, Viborodip SI, Philips VV, Zhdapova NS, Serv OL. SCHEDULED RETURBATTIOP IP DNA DURIP IP VITRO DIFFEREPTIATIOP OF MOUSE EMBRU-DERIVED SELLS. MoI Relative Dev. 1997 Mau; 47 (1): 1-10]. The burst of DNA nickeling coincides with the first or third mitosis of differentiating cells and determines a sharp increase (5-6 times) in the frequency of sister chromatid exchanges. The proposed mechanism for this kind of exchange in the genome is homologous recombination [Vatolip SY, Okharkiva EV, Matveeva NM, Shilov AG, Baivorod SI, Philips VV, Zhidonova NS, Serov OL. SCHEDULED RETURBATTIOP IP DNA DURIP IP VITRO DIFFEREPTIATIOP OF MOUSE EMBRU-DERIVED SELLS. MoI Relative Dev. 1997 Mau; 47 (1): 1-10]. Apparently, each stage of leukocyte maturation is characterized by chromatin reorganization and activation of a new ensemble of expressed genes. Presumably, the mechanism that determines the increased survival of progenitor cells after treatment with CF and exogenous DNA is as follows. Leukocyte precursor cell after the last repair of the MDC in the presence of exogenous DNA of extrachromosomal localization with or without it retains a certain amount chromatin defects resulting from aberrations during the formation and implementation of intermediates. The resting, rescued cell with remaining chromatin defects after the repair of the MCC begins division. If, at the same time, chromatin reorganization does not begin in the cell associated with the transition of the cell to the next stage of maturation, then it will inevitably die due to defective mitosis. If division is accompanied by a simultaneous transition of the cell to the next stage of maturation, characterized by chromatin reorganization and the appearance of multiple single-stranded breaks, then the presence of exogenous DNA fragments in the nucleus allows the cell to correct the remaining defects and completely restore its viability. Apparently, there is some agreement between the control systems for the progression of the cell cycle and the recombination-repair systems of the cell. It is assumed that the control of cheskipt systems at the time of the appearance of functional genome breaks is terminated or is somehow changed. This allows fragments of exogenous DNA to remain unnoticed by control systems and to be involved in reparative-recombination processes associated with the restoration of chromatin integrity after the genome reorganization as donor homologous sequences.
3. Присутствие экзогенной ДНК экстрахромосомальной локализации в межхромосомном пространстве ядра стимулирует непрерывную пролиферацию прогениторных клеток-предшественников лейкоцитов на всех стадиях созревания. Предполагаемый механизм такой стимуляции заключается в следующем. В результате попадания в покоящуюся клетку экзогенных фрагментов ДНК происходит активация систем сhесkроiпt, контролирующих прогрессию клеточного цикла [МасDоugаll CA, Byun TS, Van C, Yее MC, Сimрriсh KA. Тhе struсturаl dеtеrmiпапts оf сhесkроiпt асtivаtiоп. Gепеs Dеv. 2007 Арr 15; 21(8): 898-903; Yоо HY, Jеопg SY5 Dшiрhу WG. Sitе-sресifiс рhоsрhоrуlаtiоп оf а сhесkроiпt mеdiаtоr рrоtеiп сопtгоls its rеsропsеs tо diffеrепt DNA struсturеs. Gепеs Dеv. 2006 Арr 1; 20(7): 772-783; Yоо HY, Shеvсhепkо А, Shеvсhепkо A5 Duпрhу WG. Mcm2 is а dirесt substrаtе оf ATM апd ATR duriпg DNA dатаgе апd DNA rерliсаtiоп сhесkроiпt rеsропsеs. J Вiоl Сhет. 2004 Dес 17; 279(51): 53353-53364; Zоu L. Siпglе- апd dоublе-strапdеd DNA: buildiпg а triggеr оf АТR-теdiаtеd DNA dатаgе rеsропsе. Gепеs Dеv. 2007 Арr 15; 21(8): 879-885]. При этом включаются определенные программы, позиционирующие клетку как арестованную на соответствующей стадии клеточного цикла. После активации таких программ клетка уже не в состоянии блокировать каскад событий, связанных с такой активацией, и покоящаяся до этого клетка начинает делиться. При этом если фрагменты экзогенной ДНК каждый раз попадают во внутренние компартменты клетки-предшественницы, то она будет без отдыха делиться до того времени, пока стрессовый фактор не будет удален из ее окружения.3. The presence of exogenous DNA of extrachromosomal localization in the interchromosomal space of the nucleus stimulates the continuous proliferation of progenitor leukocyte progenitor cells at all stages of maturation. The proposed mechanism is stimulation is as follows. As a result of exogenous DNA fragments entering a resting cell, activation of the scrpt systems controlling the cell cycle progression occurs [MacDougall CA, Byun TS, Van C, Yee MC, Simprich KA. The struсtural оеthermiapapts оf сheskroipttivatiop. Gepes Dev. 2007 Arr 15; 21 (8): 898-903; Yoo HY, Jeopg SY 5 Dshirhu WG. Sit-sresifiсs rhosrhululiopof of sheskroipt mediator rorotiop soptgls its resrpos to differp DNA struc tures. Gepes Dev. 2006 Arr 1; 20 (7): 772-783; Yoo HY, Shevshepko A, Shevshepko A 5 Dupru WG. Mcm2 is a substitute subst of ATM ATM ATR durіng DNA dаt add DNA rеlаstiop ссhkroіpt tresropes. J Biol Chet. 2004 Dec 17; 279 (51): 53353-53364; Zou L. Sigl-apd dubble-daped DNA: buildipg and trigger of ATR-tedied DNA datagres. Gepes Dev. 2007 Arr 15; 21 (8): 879-885]. In this case, certain programs are included that position the cell as being arrested at the corresponding stage of the cell cycle. After activation of such programs, the cell is no longer able to block the cascade of events associated with such activation, and the cell at rest before this begins to divide. Moreover, if fragments of exogenous DNA each time enter the internal compartments of the progenitor cell, it will divide without rest until the stress factor is removed from its environment.
4. И последнее. Фрагменты экзогенной экстраклеточной ДНК действуют на все стадии созревания предшественников терминально дифференцированных клеток крови во всех зонах костного мозга и тимуса, в 3-х из которых происходит формирование T- лимфоцитов, а в 4 идет созревание В-лимфоцитов. На каждой из стадий происходит определенное количество делений клеток соответствующего клона, приводящее к увеличению популяции этих клеток. После воздействия цитостатика клеткам всех стадий зрелости требуется время для завершения репаративных процессов и продолжения созревания до выхода терминально дифференцированных клеток в кровь. В том случае, когда репарация межцепочечных сшивок проходила без участия экзогенной ДНК, основная масса предшественников на всех стадиях созревания погибает. И восстановление количества форменных элементов крови начинается с выжившей CKK. При этом требуется время и силы организма для прохождения всех стадий созревания и всех групп предшественников форменных элементов крови. Воздействие экзогенной ДНК спасает популяции клеток на всех стадиях зрелости. Мы полагаем, что именно этим фактом объясняется сильный и быстро развивающийся лейкостимулирующий эффект при воздействии кросслинкирующего цитостатика и терапии экзогенной ДНК.4. And the last. Fragments of exogenous extracellular DNA act on all stages of maturation of the precursors of terminally differentiated blood cells in all areas of the bone marrow and thymus, in 3 of which T-lymphocytes form, and in 4 is the maturation of b-lymphocytes. At each stage, a certain number of cell divisions of the corresponding clone occurs, leading to an increase in the population of these cells. After exposure to cytostatics, cells at all stages of maturity take time to complete reparative processes and continue to mature until terminally differentiated cells enter the bloodstream. In the case when the repair of interchain cross-links took place without the participation of exogenous DNA, the bulk of the precursors die at all stages of maturation. And the restoration of the number of blood cells begins with the surviving CKK. At the same time, it takes time and strength of the body to go through all stages of maturation and all groups of predecessors of blood cells. Exogenous DNA exposure saves cell populations at all stages of maturity. We believe that this very fact explains the strong and rapidly developing leukostimulating effect when exposed to crosslinked cytostatics and exogenous DNA therapy.
В проделанной работе показано, что после совместного введения мышам алкилирующего цитостатика циклофосфана и препарата фрагментированной экзогенной ДНК, связанной с протамином - белком, который защищает ДНК от действия нуклеаз крови, наблюдается эффективное восстановление лейкопоэза.In the work done, it was shown that after the joint administration of mice with an alkylating cytostatic cyclophosphamide and a fragmented exogenous DNA preparation bound to protamine, a protein that protects DNA from the action of blood nucleases, an effective recovery of leukopoiesis is observed.
Полученные данные свидетельствуют о том, что применение комплексов ДНК с протамином позволяет защитить ДНК от действия нуклеаз крови без изменения терапевтической активности препаратаThe data obtained indicate that the use of DNA complexes with protamine allows you to protect DNA from the action of blood nucleases without changing the therapeutic activity of the drug
ДНК. Связывание ДНК с протамином позволяет уменьшить количества вводимой ДНК и сохранить исходный размер фрагментов, что способствует вовлечению более продолжительных участков хроматина в репаративную гомологичную рекомбинацию, в конечном счете, увеличивая шанс клетки избавиться от возникших многочисленных повреждений.DNA The binding of DNA to protamine reduces the amount of DNA introduced and maintains the original size of the fragments, which contributes to the involvement of longer sections of chromatin in reparative homologous recombination, ultimately increasing the chance of the cell to get rid of the numerous injuries that have occurred.
Рассмотрим действие экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, на экспериментальные опухоли мыши.Consider the effect of exogenous DNA associated with protamine on experimental mouse tumors.
Остановимся на анализе некоторые количественных и качественных характеристиках экзогенной ДНК (незащищенной протамином и ассоциированной с ним), доставляемой в экспериментальные опухоли.Let us dwell on the analysis of some quantitative and qualitative characteristics of exogenous DNA (unprotected protamine and associated with it) delivered to experimental tumors.
Для оценки количества поглощенной опухолью ДНК и морфологии ДНК, доставленной в межхромосомное пространство клеток солидной и асцитной формы опухоли RLS, были проведены инъекции либо ДНК фага лябда, гидролизованного Нiпd III, либо ДНК человека, фрагментированной до размеров 200 - 6 000 п. о., мышам с перевитыми экспериментальными опухолями. Как следует из полученных данных, в опухоль доставляется незначительный процент от инъецированной ДНК. При пересчете на п. о. приблизительно 1 фрагмент размером около 1.3 т.п.о. может присутствовать в одной клетке опухоли при инъекции до 5 мкг экзогенной ДНК (Фиг. 5, Таблицы 1 - 3).In order to estimate the amount of DNA absorbed by the tumor and the morphology of DNA delivered to the interchromosomal space of the cells of the solid and ascites form of the RLS tumor, either DNA phage of Lyabdum hydrolyzed by NiPd III or human DNA fragmented to 200-6000 bp were injected. mice with transplanted experimental tumors. As follows from the data obtained, a small percentage of the injected DNA is delivered to the tumor. When converted to par. about 1 fragment about 1.3 kbp in size may be present in a single tumor cell with injection of up to 5 μg of exogenous DNA (Fig. 5, Tables 1-3).
Морфология меченой ДНК, выделяемой из плазмы крови мышей опухоленосителей, свидетельствует о том, что в кровяном русле происходит практически мгновенная деградация исходной ДНК (Фиг. 6, дорожка 1). В деградированной форме экзогенная ДНК доставляется во внутренние компартменты раковой клетки (Фиг. 6, дорожки 2 и 3).The morphology of labeled DNA secreted from the blood plasma of tumor-bearing mice indicates that almost instantaneous degradation of the original DNA occurs in the bloodstream (Fig. 6, lane 1). In degraded form, exogenous DNA is delivered to the internal compartments of the cancer cell (FIG. 6, lanes 2 and 3).
После ассоциации с протамином инъецированная ДНК защищается от действия нуклеаз крови и через 60 мин в крови все еще можно обнаружить высокомолекулярные фрагменты меченой ДНК (Фиг. 6, дорожка 4).After association with protamine, the injected DNA is protected from the action of blood nucleases and after 60 minutes high molecular weight fragments of labeled DNA can still be detected in the blood (Fig. 6, lane 4).
Таблица 1. Количество ДНК, которое вводили в мышь.Table 1. The amount of DNA that was introduced into the mouse.
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0001
Таблица 2. Количественные характеристики доставляемого в некоторые органы мыши меченого материала (незащищенная протамином ДНК) при его внутривенном введении.Table 2. Quantitative characteristics of labeled material delivered to some organs of the mouse (unprotected protamine DNA) when administered intravenously.
UJ о
Figure imgf000031_0001
Uj o
Figure imgf000031_0001
Таблица 3. Количество ДНК, доставляемое в клетку опухоли, в пересчете на п.о.Table 3. The amount of DNA delivered to the tumor cell, calculated in terms of bp
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0001
в 1 мкл опухоли содержится 10 клеток масса ДНК в клетке мыши 6 рg (6* 10" g) гаплоидный геном мыши составляет 2.7*109 п.о. 1 μl of the tumor contains 10 cells; the DNA mass in the mouse cell is 6 pg (6 * 10 " g); the mouse haploid genome is 2.7 * 10 9 bp
Остановимся на действии фрагментов экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, на рост экспериментальной опухоли RLS.Let us dwell on the effect of fragments of exogenous DNA associated with protamine on the growth of an experimental RLS tumor.
Как следует из данных, полученных в первой части исследования, в опухоль доставляется крайне незначительное количество ДНК. Это позволяет считать, что эффект ингибирования роста опухоли, показанный в наших ранних работах [Yаkubоv LA, Ророvа NA, Nikоliп VP, Sеmепоv DV, Воgасhеv SS, Оs'kiпа IN. Ехtrасеllulаr genomic DNA рrоtесts miсе аgаiпst rаdiаtiоп апd сhеmiсаl mutаgепs. Gепоmе Вiоl. 2003; 5: 3; Николин B.П., Попова H.A.,. Ceбeлeвa Т.Е., Стрункин Д.H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC, Якубов Л.A., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, JYs 1, с. 66-69] и в настоящем исследовании, не связан с прямым воздействием фрагментов экзогенной ДНК на геном, как это описано для раковых клеток MCF-7, растущих в культуре [Yаkubоv LA, Rоgасhеv VA, Likhасhеvа AC, Воgасhеv SS, Sеbеlеvа ТЕ, Shilоv AG, Baiborodin SI, Реtrоvа NA, Mechetina LV, Shurdоv MA, Wiсkstrоm E. Nаturаl humап gепе соrrесtiоп bу smаll ехtrасеllulаr genomic DNA frаgmепts. CeIl Сусlе. 2007 JuI; 6(18): 2293-2301]. Более вероятно воздействие фрагментов экзогенной ДНК через определенны звенья иммунной системы.As follows from the data obtained in the first part of the study, an extremely small amount of DNA is delivered to the tumor. This suggests that the effect of inhibition of tumor growth, shown in our earlier works [Yakubov LA, Porova NA, Nikolip VP, Family DV, Vogashev SS, Os'kipa IN. Extracellular genomic DNA processes mixtures agaipst radiopath apd chemil mutageps. Hypotheme Biol. 2003; 5: 3; Nikolin B.P., Popova H.A.,. Cebelova T.E., Strunkin D.N., Rogachev B.A., Semenov D. B., Bogachev CC, Yakubov L.A., Shurdov M.A. The effect of exogenous DNA on the growth of experimental tumors. Oncology issues. 2006. T. 52, JYs 1, p. 66-69] and in the present study, it is not associated with the direct action of exogenous DNA fragments on the genome, as described for MCF-7 cancer cells growing in culture [Yakubov LA, Rogasheva VA, Likhasheva AC, Vegas SS, Sebel TE, Shil AG, Baiborodin SI, Retrova NA, Mechetina LV, Shurdov MA, Wiсststrоm E. NATURAL HUME HEPE CORRESTIOP BU SMALL EXTRATECELLULAR GENOMIC DNA FRAGMEPTS. CeIl Susle. 2007 JuI; 6 (18): 2293-2301]. Exogenous DNA fragments are more likely to act through certain parts of the immune system.
Известно, что фрагменты экзогенной ДНК или олигонуклеотиды, обогащенные GC мотивами активируют созревание ДК и индуцируют иммунный ответ по Т-клеточному типу. По-видимому, даже очень короткие фрагменты ДНК, обладающие определенной структурой, способны воздействовать на антигенпрезентирующие дендритные клетки и активировать Т-клеточный иммунный ответ [Кriеg AM. CpG mоtifs: thе асtivе iпgrеdiепt iп bасtеriаl ехtrасts? Nаt Меd. 2003 JuI; 9(7): 831-835; Оlishеvsку S5 Коzак V, Yanish Y. Immшiоstimulаtоrу CpG DNA iп сапсеr vассiпоthеrару. Ехр Опсоl. 2003; 25: 85-92]. Мы полагаем, что именно по такому пути идет ингибирование роста опухоли, наблюдаемое при инъекции мышам с перевитыми опухолями, фрагментированной экзогенной ДНК. В случае прямого действия на геном с использованием гомологичной рекомбинации как механизма замещения онколокусов на здоровые аллели предполагается, что только длинные фрагменты (не менее 1 т.п.о.) могут осуществлять такого рода рекомбинацию (двойной реципрокный обмен концевых гомологии) [Оrr- Wеаvеr TL, Szоstаk JW, Rothstein RJ. Yеаst trапsfоrmаtiоп: а mоdеl sуstеm fоr thе studу оf rесоmbiпаtiоп. Рrос Nаtl Асаd Sсi USA. 1981 Осt; 78(10): 6354-6358; Кuсhеrlараti RS, Еvеs EM, Song KY, Моrsе BS, Smithiеs О. Ноmоlоgоus rесоmbiпаtiоп bеtwееп рlаsmids iп mаmmаliап сеlls сап bе епhапсеd bу trеаtmепt оf iпрut DNA. Рrос Nаtl Асаd Sсi U S A. 1984 Мау; 81(10): 3153-3157; Dепg С, Сарессhi MR. Rеехаmiпаtiоп оf gепе tаrgеtiпg frеquепсу аs а fuпсtiоп оf thе ехtепt оf hоmоlоgу bеtwееп thе tаrgеtiпg vесtоr апd thе tаrgеt lосus. MoI CeIl Вiоl. 1992 Аug; 12(8): 3365-3371; Тhоmаs KR, Dепg С, Сарессhi MR. Нigh-fidеlitу gепе tаrgеtiпg iп еmbrуопiс stеm сеlls bу usiпg sеquепсе rерlасеmепt vесtоrs. MoI CeIl Вiоl. 1992 JuI; 12(7): 2919-2923; Наstiпgs PJ, McGiIl С, Shаfеr В, Strаthеrп JN. Епds-iп vs. епds-оut rесоmbiпаtiоп iп уеаst. Gепеtiсs. 1993 Dес; 135(4): 973-980; Lапgstоп LD, Sуmiпgtоп LS. Gепе tаrgеtiпg iп уеаst is iпitiаtеd bу twо iпdерепdепt strапd iпvаsiопs. Рrос Nаtl Асаd Sсi U S A. 2004 Осt 26; 101(43): 15392-15397]. По-видимому, в этом случае существует прямая зависимость, выражающаяся в том, что чем длиннее фрагмент, участвующий в ГР, то тем больше вероятность замещения онколокуса на не мутантный аллель и изменения ракового статуса клетки. Если предположить, что оба указанных механизма используются одновременно для подавления роста раковых клеток, то длина доставляемых фрагментов является важным фактором для такого ингибирования.It is known that fragments of exogenous DNA or oligonucleotides enriched in GC motifs activate DC maturation and induce an immune response according to the T-cell type. Apparently, even very short DNA fragments with a certain structure are able to act on antigen-presenting dendritic cells and activate the T-cell immune response [Krieg AM. Cpg motifs: thе active ipgеdiept ip basterial expac? Nat Med. 2003 JuI; 9 (7): 831-835; Olishеvsku S 5 Kozak V, Yanish Y. Immosto stimulatory DNA DNA and sapper vassipotheter. Exp Opsol. 2003; 25: 85-92]. We believe that this is the path to the inhibition of tumor growth observed upon injection of fragmented exogenous DNA into mice with transplanted tumors. In the case of a direct action on the genome using homologous recombination as a mechanism for replacing oncological loci with healthy alleles, it is assumed that only long fragments (at least 1 kb) can carry out this kind of recombination (double reciprocal exchange of terminal homology) [Orr-Weaver TL, Szostak JW, Rothstein RJ. Fresh trapsformatiop: and model sustem fort studu оf resombipatiop. Rros Natl Acad Sсi USA. 1981 Ott; 78 (10): 6354-6358; Kusherlarati RS, EVES EM, Song KY, Morse BS, Smithis O. Nomologous resombipatiopwetlapmids ip mammaliap slls befaped bt triatmpt of ip DNA DNA. Rros Natl Acad Sсi US A. 1984 Mau; 81 (10): 3153-3157; Depg C, Saresshi MR. Reechamiptiop of gepe targetg fréquepsu as a functiop of the exept of homologous beta tepter apt thargetus. MoI CeIl Biol. 1992 Aug; 12 (8): 3365-3371; Thomas KR, Depg C, Saresshi MR. High-fidelity gepargetig ip embopis stell sells usgepsekepse rlacetep test. MoI CeIl Biol. 1992 JuI; 12 (7): 2919-2923; Nastgs PJ, McGiIl C, Shafer B, Sträther JN. Eps-ip vs. ep-out resombipipiop ip west. Gepetis. 1993 Dec; 135 (4): 973-980; Lapgstop LD, Sumpgtop LS. Gepe targetg ip ueast is iptiad bu two ipredept strapd ipasiops. Rros Natl Acad Sсi US A. 2004 Ott 26; 101 (43): 15392-15397]. Apparently, in this case there is a direct dependence, expressed in the fact that the longer the fragment participating in the GR, the greater the likelihood of replacing the oncolocus by not mutant allele and changes in the cancerous status of cells. Assuming that both of these mechanisms are used simultaneously to inhibit the growth of cancer cells, the length of the delivered fragments is an important factor for such inhibition.
В наших работах для терапии экспериментальных раков мы использовали большое количество однократно вводимой ДНК [Yаkubоv LA, Ророvа NA, Nikolin VP, Sеmепоv DV, Воgасhеv SS, Оs'kiпа IN. Ехtrасеllulаr genomic DNA рrоtесts miсе аgаiпst rаdiаtiоп апd сhеmiсаl mutаgепs. Gепоmе Вiоl. 2003; 5: 3; Николин B.П., Попова H.A., Себелева Т.Е., Стрункин Д.H., Рогачев B.A., Семенов Д.B., Богачев CC, Якубов Л. А., Шурдов M. А. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана. Вопросы онкологии. 2006. T. 52, JNз 3, с. 336-340]. Это было связано с быстрой ее деградацией в кровяном русле и, как следствие, невозможности попадания в опухоль протяженных фрагментов ДНК, которые, как предполагается, наряду с индукцией иммунного ответа, могут замещать неотрансформированные гомологичные участки генома и изменять генетику раковой клетки. Ассоциация фрагментов ДНК с протамином защищает фрагменты от нуклеазной деградации. При этом высокомолекулярные фрагменты достигают межхромосомного пространства ядер раковых клеток и могут быть использованы клеткой в качестве субстрата для гомологичной рекомбинации.In our work for the treatment of experimental cancers, we used a large amount of once-injected DNA [Yakubov LA, Porova NA, Nikolin VP, FamilyV DV, Vegashev SS, Os'kipa IN. Extracellular genomic DNA processes mixtures agaipst radiopath apd chemil mutageps. Hypotheme Biol. 2003; 5: 3; Nikolin B.P., Popova HA, Sebeleva T.E., Strunkin D.N., Rogachev BA, Semenov D. B., Bogachev CC, Yakubov L. A., Shurdov M. A. Effect of exogenous DNA on the recovery of leukopoiesis and antitumor effect of cyclophosphamide. Oncology issues. 2006.V. 52, JN3, p. 336-340]. This was due to its rapid degradation in the bloodstream and, as a consequence, the inability to get extended DNA fragments into the tumor, which, as is assumed, along with the induction of the immune response, can replace non-transformed homologous parts of the genome and change the genetics of cancer cells. The association of DNA fragments with protamine protects the fragments from nuclease degradation. In this case, high molecular weight fragments reach the interchromosomal space of the nuclei of cancer cells and can be used by the cell as a substrate for homologous recombination.
Тем не менее, мы установили, что при количестве вводимой ДНК, равном суммарно 120 мкг на мышь, в клетки опухоли будет доставлено не более нескольких фрагментов размером 1 т.п.о. (см. предыдущий раздел). Этого количества, скорее всего, недостаточно для того, что бы повлиять на генетику раковой клетки. Мы полагаем, что действие на опухоль в данном случае происходило через активацию определенных звеньев иммунной системы. Важным оказался тот факт, что ассоциированная с протамином и сохранившая в связи с этим свой размер экзогенная ДНК ингибирует рост опухоли в той же степени, что и незащищенная протамином ДНК (Фиг. 7).Nevertheless, we found that when the amount of DNA introduced was equal to a total of 120 μg per mouse, no more than a few fragments of 1 kb in size would be delivered to the tumor cells. (see previous section). This amount is probably not enough to affect the genetics of cancer cells. We believe that the effect on the tumor in this case occurred through the activation of certain parts of the immune system. Important was the fact that exogenous DNA associated with protamine and retaining its size inhibited tumor growth to the same extent as protamine unprotected DNA (Fig. 7).
То есть основной механизм ингибирования роста опухоли при ассоциации терапевтической ДНК с протамином сохраняется. При этом появляется возможность использования второго механизма воздействия на опухоль, когда протяженный фрагмент ДНК, защищенный протамином, попадая внутрь раковой клетки, вступает в гомологичный обмен с геномной ДНК, что при определенных условиях может повлиять на генетику раковой клетки.That is, the main mechanism of inhibition of tumor growth during the association of therapeutic DNA with protamine is maintained. In this case, it becomes possible to use the second mechanism of action on the tumor, when an extended fragment of DNA protected by protamine, entering the cancer cell, enters into a homologous exchange with genomic DNA, which under certain conditions can affect the genetics of the cancer cell.
Рассмотрим интернализацию в клетках MCF-7 экзогенных фрагментов ДНК, защищенными протамином и индукцию ими апоптоза.Consider the internalization in MCF-7 cells of exogenous DNA fragments protected by protamine and their induction of apoptosis.
Остановимся на сравнительных морфологических особенностях фрагментов экзогенной ДНК, интернализованных в основных клеточных компартментах клеток MCF-7 из культуральной среды в незащищенном виде и ассоциированных с протамином.Let us dwell on the comparative morphological features of exogenous DNA fragments internalized in the main cellular compartments of MCF-7 cells from the culture medium in unprotected form and associated with protamine.
На Фиг. 8 представлены результаты электрофореза ДНК экстрахромосомальной фракции, выделенной из ядер клеток MCF-7.In FIG. 8 presents the results of DNA electrophoresis of the extrachromosomal fraction isolated from the nuclei of MCF-7 cells.
Как следует из представленной электрофореграммы образцов ДНК, при ассоциации добавляемой в среду экзогенной ДНК с протамином, в межхромосомном пространстве ядер клеток обнаруживается шлейф меченой ДНК, простирающийся от низкомолекулярной фракции до высокомолекулярной, что может свидетельствовать о доставке в ядерное пространство всего спектра (200 - 6000 п.о.) фрагментов из находящихся в культуральной среде. Высокомолекулярный фрагмент в части эксперимента с незащищенной ДНК, выявляемый в межхромосомной фракции, представляет собой результат лигирования коротких деградированных фрагментов, доставленных в ядерное пространство [Rоgасhеv VA, Likhасhеvа А, Vrаtskikh О, Mechetina LV, Sеbеlеvа ТЕ, Воgасhеv SS5 Yаkubоv LA, Shurdоv MA. Quаlitаtivе апd quапtitаtivе сhаrасtеristiсs оf thе ехtrасеllulаr DNA dеlivеrеd tо thе пuсlеus оf а Нviпg сеll. Cancer CeIl Iпt. 2006 Осt 11; 6:23]. Также на электрофореграмме образцов ДНК, выделенных из культуральной среды после различных времен инкубации, при ее ассоциации с протамином в среде присутствует высокомолекулярная форма ДНК (данные не приводятся). При этом в образцах с ДНК, добавленной в среду в форме, неассоциированной с протамином, она полостью деградирует [Rоgасhеv VA, Likhасhеvа А, Vrаtskikh О, Mechetina LV, Sеbеlеvа ТЕ, Воgасhеv SS, Yаkubоv LA, Shurdоv MA. Quаlitаtivе апd quапtitаtivе сhаrасtеristiсs оf thе ехtrасеllulаr DNA dеlivеrеd tо thе пuсlеus оf а liviпg сеll. Cancer CeIl Iпt. 2006 Осt 11; 6:23].As follows from the presented electrophoregram of DNA samples, when an exogenous DNA added to the medium is associated with protamine, a loop of labeled DNA is found in the interchromosomal space of the cell nuclei, extending from the low molecular weight fraction to the high molecular weight fraction, which may indicate the delivery of the entire spectrum to the nuclear space (200 - 6000 n .o.) fragments from in the culture medium. High molecular fragment in part experiment unprotected DNA detectable in the interchromosomal fraction, it is the result of ligation of short degraded fragments delivered to the nuclear space [Rogashev VA, Likhasheva A Vratskikh O, Mechetina LV, Sebeleva TE Vogashev SS 5 Yakubov LA, Shurdov MA . Qualitiv apd quaptitivist сhаrаstеristісs оf thе еxtracellulаr DNA delеvеd tо thе puslеus оf а Нviпg сell. Cancer CeIl IPt. 2006 Ott 11; 6:23]. Also on the electrophoregram of DNA samples isolated from the culture medium after different incubation times, when it is associated with protamine, a high molecular weight form of DNA is present in the medium (data not shown). Moreover, in samples with DNA added to the medium in a form not associated with protamine, it degrades the cavity [Rogashev VA, Likhasheva A, Vratskikh O, Mechetina LV, Cebelova TE, Vogasheva SS, Yakubova LA, Shurdova MA. Qualitiv apd quaptitivist сhаrаstеristісs оf thе еxtracellulаr DNA delivеrd tо thе puslеus оf а liviпell sell. Cancer CeIl IPt. 2006 Ott 11; 6:23].
Динамика доставки фрагментов экзогенной ДНК во внутренние компартменты клетки представлена в Таблице 4 и на Фиг. 9. The dynamics of the delivery of exogenous DNA fragments to the internal compartments of the cell is presented in Table 4 and in FIG. 9.
Таблица 4. Количество меченой ДНК, детектируемое в культуральной среде и во внутренних компартментах клетки, после инкубации культуры клеток MCF-7 с интактной и связанной с протамином ДНК в течение различного времени.Table 4. The amount of labeled DNA detected in the culture medium and in the internal compartments of the cell after incubation of the MCF-7 cell culture with intact and protamine-bound DNA for different times.
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0001
Можно отметить несколько особенностей интернализации экзогенной фрагментированной ДНК, защищенной протамином:Several features of the internalization of exogenous fragmented DNA protected by protamine can be noted:
1. Прослеживается два пика интернализации фрагментов экзогенной ДНК в цитоплазме в точках 30' и 120'.1. There are two peaks of internalization of exogenous DNA fragments in the cytoplasm at points 30 'and 120'.
2. В межхромосомное фракции эти пики смещены к точкам 60' и 180' . 3. В межхромосомное пространство доставляется практически в 10 раз большее количество экзогенной ДНК, защищенной протамином, по сравнению с незащищенной ДНК.2. In the interchromosomal fraction, these peaks are shifted to points 60 'and 180'. 3. Almost 10 times more exogenous DNA protected by protamine is delivered to the interchromosomal space compared to unprotected DNA.
4. Динамика появления меченого материала во фракции хроматина значительно отличается в случае ДНК, ассоциированной с протамином, и без него.4. The dynamics of the appearance of labeled material in the chromatin fraction are significantly different in the case of DNA associated with protamine, and without it.
Во фракции хроматина при использовании незащищенной экзогенной ДНК меченый материал обнаруживается в значительном количестве уже в нулевой точке. В точках 30 - 120' количество меченого материала незначительно возрастает и выходит на плато. В точке 180' количество меченого материала во фракции хроматина резко падает. В случае защищенной протамином ДНК процесс имеет явный накопительный характер. С практически отсутствия в нулевой точке меченый материал накапливается и в точке 120' достигает своего максимального значения, совпадающего с образцом ДНК без протамина. Затем количество меченого материала резко падает до тех же самых значений, что и в образце ДНК, используемой без ассоциации с протамином.In the chromatin fraction using unprotected exogenous DNA, the labeled material is found in significant quantities already at the zero point. At points 30 - 120 ', the amount of labeled material increases slightly and reaches a plateau. At 180 ′, the amount of labeled material in the chromatin fraction drops sharply. In the case of protamine-protected DNA, the process has a clear cumulative character. With practically no absence at the zero point, the labeled material accumulates and at 120 'reaches its maximum value, which coincides with the DNA sample without protamine. Then, the amount of labeled material drops sharply to the same values as in the DNA sample used without association with protamine.
Обнаруженную разницу в количестве доставляемого материала ДНК в межхромосомную фракцию можно объяснить тем, что рецепторы, связывающие ДНК на поверхности клетки, обладают большей специфичности к ДНК в форме хроматина, чем к незащищенной ДНК. Два пика в количестве меченого материала, выявляемых в цитоплазме 30' и 120' и межхромосомной фракции 60' и 180', могут свидетельствовать о том, что количество рецепторов конечное, что они вместе с ДНК интернализируются в клеточных компартментах, что оборот рецепторов происходит в течение ориентировочно одного часа и что проникновение меченых фрагментов из цитоплазмы во внутреннее пространство ядра занимает порядка 30 минут. Различия в динамике появления меченого материала во фракции хроматина можно объяснить тем, что при использовании незащищенной ДНК проникшие в ядерное пространство меченые фрагменты быстро подвергаются гидролизу и меченые предшественники участвуют в процессе репликации. В случае использования ДНК в защищенной протамином форме, несмотря на то, что в межхромосомном пространстве скапливается большое количество фрагментов экзогенной ДНК, сохраняющееся на протяжении всего анализируемого времени 0 - 180', в хроматине обнаруживается последовательно увеличивающееся количество меченого материала. Можно полагать, что в такой динамике могут быть задействованы два процесса, которые могут действовать по раздельности или накладываться один на другой. Один из них, аналогичный описанному для незащищенной ДНК и связанный с деградацией меченых фрагментов и использовании меченых предшественников в синтетических процессах, проходящих в клетке. Так же можно предполагать, что фрагменты экзогенной ДНК, защищенные протамином и депонированные в межхромосомном пространстве, постепенно рекомбинируют с гомологичными участками хромом, что и приводит к постепенному накоплению метки в хроматине.The observed difference in the amount of DNA material delivered to the interchromosomal fraction can be explained by the fact that receptors that bind DNA on the cell surface have more specificity for chromatin-shaped DNA than for unprotected DNA. Two peaks in the amount of labeled material detected in the cytoplasm 30 'and 120' and the interchromosomal fraction 60 'and 180' may indicate that the number of receptors is finite, that they, along with DNA, are internalized in the cell compartments, that the turnover of the receptors occurs during approximately one hour and that the penetration of labeled fragments from the cytoplasm into the inner space of the nucleus takes about 30 minutes. The differences in the dynamics of the appearance of labeled material in the chromatin fraction can be explained by the fact that, using unprotected DNA, labeled fragments that have entered the nuclear space are rapidly hydrolyzed and labeled precursors participate in the replication process. In the case of using DNA in a protected protamine form, despite the fact that a large number of exogenous DNA fragments accumulate in the interchromosomal space, which remains throughout the entire analyzed time 0 - 180 ', a sequentially increasing amount of labeled material is detected in chromatin. It can be assumed that in such dynamics two processes can be involved that can act separately or overlap one another. One of them, similar to that described for unprotected DNA and associated with the degradation of labeled fragments and the use of labeled precursors in synthetic processes that take place in the cell. It can also be assumed that fragments of exogenous DNA protected by protamine and deposited in the interchromosomal space gradually recombine with homologous regions of chromium, which leads to the gradual accumulation of the label in chromatin.
Остановимся на анализе индукции апоптоза фрагментами экзогенной ДНК, незащищенной протамином и в комплексе с ним.Let us dwell on the analysis of the induction of apoptosis by fragments of exogenous DNA, unprotected by protamine and in combination with it.
Мы провели эксперименты по индукции апоптоза клеток MCF-7, обработанных ДНК, защищенной протамином в концентрации 25 мкг/мл и незащищенной ДНК в концентрации 100 мкг/мл. Как следует из Фиг. 10, ДНК, защищенная протамином, в такой же степени индуцирует апоптоз, как и не защищенная ДНК.We conducted experiments on the induction of apoptosis of MCF-7 cells treated with protamine protected at a concentration of 25 μg / ml and unprotected DNA at a concentration of 100 μg / ml. As follows from FIG. 10, protamine protected DNA induces apoptosis to the same extent as unprotected DNA.
Этот факт может свидетельствовать о том, что защищенная ДНК так же способна вступать в репаративную гомологичную рекомбинацию, исправляя мутантный аллель, при этом ее эффективное количество в культуральной среде может быть существенно ниже.This fact may indicate that the protected DNA is also able to enter into reparative homologous recombination, correcting the mutant allele, while its effective amount in the culture medium can be significantly lower.
Кроме проведенного анализа индукции апоптоза фрагментами ДНК, защищенной протамином, в сравнении с незащищенной ДНК, мы провели эксперименты, в которых концентрация защищенной ДНК в культуральной среде была уменьшена до таковой, определяемой для плазмы крови высших эукариот 30 - 100 нг/мл [Апkеr P, Мulсаhу H, Chen XQ , Stroun M. Dеtесtiоп оf с irculating tumour DNA iп thе blооd (рlаsmа/sеrum) оf сапсеr раtiепts. Сапсеr Меtаstаsis Rеv. 1999; 18(1):65-73].In addition to the analysis of the induction of apoptosis by protamine-protected DNA fragments in comparison with unprotected DNA, we conducted experiments in which the concentration of protected DNA in the culture medium was reduced to that determined for higher eukaryotic blood plasma from 30 to 100 ng / ml [Apker P, Mulshahu H, Chen XQ, Stroun M. Detestiоf о with circulating tumor DNA іtе blоd (рlasma / srum) оf sapper rapepts. Sapser Metastasis Rev. 1999; 18 (1): 65-73].
В культуру клеток MCF-7 добавлялась незащищенная ДНК и ДНК, связанная с протамином, в концентрациях 25, 2.5, 0.25 и 0.025 мкг/мл среды. Количество клеток для всех экспериментальных точек было одинаковым - 107. Через 17 дней постоянной инкубации клеток с ДНК, культуры клеток индуцировали к апоптозу, выделяли ДНК и смотрели появление нуклеосомной фрагментации хроматина (Фиг. 11).Unprotected DNA and protamine-bound DNA were added to the MCF-7 cell culture at concentrations of 25, 2.5, 0.25, and 0.025 μg / ml medium. The number of cells for all experimental points was the same - 10 7 . After 17 days of constant incubation of cells with DNA, cell cultures were induced to apoptosis, DNA was isolated and the appearance of nucleosome chromatin fragmentation was observed (Fig. 11).
Было обнаружено, что концентрация ДНК, связанной с протамином, 25 нг/мл среды уже способна приводить к появлению нуклеосомной фрагментации хроматина.It was found that the concentration of DNA associated with protamine, 25 ng / ml of the medium is already capable of leading to the appearance of nucleosomal chromatin fragmentation.
Протамин, защищая ДНК от действия нуклеаз, способствует тому, что большее количество ДНК попадает в клетку в недеградированном виде и, соответственно, оказывается способным участвовать в рекомбинационном процессе. Отсюда можно предположить, что большее количество клеток восстанавливает ген каспазы 3, и при индукции апоптоза мы можем наблюдать более ярко выраженную нуклеосомную фрагментацию хроматина.Protamine, protecting DNA from the action of nucleases, contributes to the fact that more DNA enters the cell in an undegraded form and, accordingly, is able to participate in the recombination process. From this it can be assumed that a larger number of cells restores the caspase 3 gene, and with induction of apoptosis, we can observe a more pronounced nucleosome fragmentation of chromatin.
Таким образом, связывание с протамином обеспечивает молекулам ДНК устойчивость к действию нуклеаз, находящихся в культуральной среде. В результате этого фрагменты экзогенной ДНК способны достигать основных клеточных компартментов в исходной форме. При культивировании клеток MCF-7 совместно с ДНК, ассоциированной с протамином, наблюдается восстановление гена каспазы 3, что фенотипически проявляется в появлении нуклеосомной деградации хроматина при индукции апоптоза. Протамин, защищая ДНК от действия нуклеаз, обеспечивает попадание молекул экзогенной ДНК в клетку в недеградированном виде, что делает возможным участие их в рекомбинационном процессе. При связывании ДНК с протамином появляется возможность снизить концентрацию ДНК, не повлияв на эффективность действия экзогенной ДНК.Thus, binding to protamine provides DNA molecules with resistance to the action of nucleases in the culture medium. As a result, exogenous DNA fragments are able to reach the main cellular compartments in their original form. During the cultivation of MCF-7 cells together with the DNA associated with protamine, the caspase 3 gene is restored, which phenotypically manifests itself in the appearance of nucleosome chromatin degradation upon apoptosis induction. Protamine, protecting DNA from the action of nucleases, ensures that exogenous DNA molecules enter the cell in a non-degraded form, which makes them possible to participate in the recombination process. When DNA is bound to protamine, it becomes possible to lower the concentration of DNA without affecting the effectiveness of exogenous DNA.
Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа достигается требуемый результат, заключающийся в повышении эффективности лечения пациентов, проходящих программную химиотерапию, и пациентов с онкологическими заболеваниями. Результаты проделанного исследования позволяют сказать, что защита фрагментированной экзогенной ДНК гистоноподобным белком протамином не влияет на способность фрагментированной экзогенной ДНК проявлять лейкостимулирующее действие, ингибировать рост экспериментальной опухоли мыши и принимать участие в репарации мутантного аллеля гена каспазы 3 клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Ассоциация фрагментированной экзогенной ДНК с протамином позволяет сохранить исходный размер терапевтических фрагментов и существенно уменьшить эффективную концентрацию экзогенной ДНК в околоклеточных жидкостях. Thus, by improving the known method, the desired result is achieved, which consists in increasing the effectiveness of the treatment of patients undergoing programmed chemotherapy, and patients with cancer. The results of this study allow us to say that the protection of fragmented exogenous DNA with a histone-like protein protamine does not affect the ability of the fragmented exogenous DNA to exhibit a leukostimulating effect, inhibit the growth of an experimental mouse tumor and take part in the repair of the mutant allele of the caspase 3 gene of human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. Association fragmented exogenous DNA with protamine allows you to save the original size of therapeutic fragments and significantly reduce the effective concentration of exogenous DNA in the pericellular fluids.

Claims

Формула изобретения Claim
1. Способ лечения онкологических заболеваний, основанный на введении в организм пациента фрагментированной ДНК человека, отличающийся тем, что, фрагментированную ДНК человека вводят в комплексе с негистоновым белком протамина.1. A method of treating cancer based on the introduction of fragmented human DNA into the patient’s body, characterized in that the fragmented human DNA is administered in combination with a non-histamine protamine protein.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, введение в организм пациента фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамином производят парентерально или микроклизмированием.2. The method according to p. 1, characterized in that the introduction into the patient’s body of fragmented human DNA in combination with a non-histone protamine protein is carried out parenterally or by microclysis.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, соотношение фрагментированная ДНК / негистоновый белок протамин составляет 1 / 0,8.3. The method according to p. 1, characterized in that the ratio of fragmented DNA / non-histone protamine protein is 1 / 0.8.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамином производят при концентрации фрагментированной ДНК человека равной 25 нг/мл.- 1000 нг/мл.4. The method according to p. 1, characterized in that the introduction of fragmented human DNA in complex with non-histone protamine protein is carried out at a concentration of fragmented human DNA of 25 ng / ml. - 1000 ng / ml.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, максимально допустимая концентрация фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамина составляет 7,5 мкг/мл. 5. The method according to p. 1, characterized in that the maximum permissible concentration of fragmented human DNA in combination with a non-histone protamine protein is 7.5 μg / ml.
PCT/RU2008/000680 2008-08-28 2008-10-30 Method for treating oncological diseases WO2010024711A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008134783 2008-08-28
RU2008134783/14A RU2387456C1 (en) 2008-08-28 2008-08-28 Oncotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010024711A1 true WO2010024711A1 (en) 2010-03-04

Family

ID=41721693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000680 WO2010024711A1 (en) 2008-08-28 2008-10-30 Method for treating oncological diseases

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2387456C1 (en)
WO (1) WO2010024711A1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2489169C2 (en) * 2010-10-12 2013-08-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) Method of treating oncological diseases

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2313349C2 (en) * 2006-01-16 2007-12-27 Михаил Аркадьевич Шурдов Method for treating oncological diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2313349C2 (en) * 2006-01-16 2007-12-27 Михаил Аркадьевич Шурдов Method for treating oncological diseases

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALHORN R. ET AL.: "DNA condensation by protamine and arginine-rich peptides: analysis of toroid stability using single DNA molecules.", MOL REPROD DEV, vol. 56, no. 2 SUPP, June 2000 (2000-06-01), pages 230 - 4, Retrieved from the Internet <URL:www.pubmed.com> [retrieved on 20090505] *
NIKOLIN VP ET AL.: "Effect of exogenous dna injection on leukopoietic repair and antitumor action of cyclophosphamide", VOPR ONKOL, vol. 52, no. 3, 2006, pages 336 - 40, Retrieved from the Internet <URL:www.pubmed.com> [retrieved on 20090505] *
SCHEEL B. ET AL.: "Therapeutic anti-tumor immunity triggered by injections of immunostimulating single-stranded RNA.", EUR J IMMUNOL, vol. 36, no. 10, October 2006 (2006-10-01), pages 2807 - 16, Retrieved from the Internet <URL:www.pubmed.com> [retrieved on 20090505] *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2387456C1 (en) 2010-04-27
RU2008134783A (en) 2010-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7395483B2 (en) Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of mRNA
JP6621409B2 (en) C / EBPα small molecule activated RNA composition
KR101835018B1 (en) Composition for preventing or treating of hepatic fibrosis comprising exosome or exosomal RNAs
WO2018049077A1 (en) Methods and compositions for modulating gene expression
JP2017537611A5 (en)
TWI723363B (en) Pharmaceutical composition for treating cancers comprising guide rna and endonuclease
KR101310511B1 (en) A thymus-specific protein
JP2021504343A (en) A polynucleotide encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
CN111315885A (en) Methods and compositions for enhancing tumor immunogenicity
JP2023053338A5 (en)
US8372969B2 (en) RNA interference methods using DNA-RNA duplex constructs
US20210052630A1 (en) Methods and Compositions for Preventing or Treating Heart Disease
RU2387456C1 (en) Oncotherapy
JP7362156B2 (en) Pharmaceutical compositions, kits and methods for treating tumors
JP7154238B2 (en) Composition for producing extracellular matrix using MAST4 gene and method for producing the same
KR20180137435A (en) Pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer
US20220220169A1 (en) Modular Therapeutics for the Treatment of Inflammatory Diseases and Cancer
WO2008121016A1 (en) Oncological disease treating method
RU2313349C2 (en) Method for treating oncological diseases
WO1998042722A1 (en) Antisense inhibition of angiogenin expression
US20050032714A1 (en) Methods of treatment of a bcl-2 disorder using bcl-2 antisense oligomers
JPH10512155A (en) Drugs to treat cancer and other hyperplasia
US20210403519A1 (en) Methods and compositions to induce or suppress immune responses through the use of membrane bound complement split products
EP2931375B1 (en) Use of active substance combinations for inducing tumour senescence
JP2024515113A (en) Engineering B-cell-based protein factories to treat serious diseases

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08876850

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 29/09/2011)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08876850

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1