WO2010007723A1 - Peptide capable of binding to ceramic material - Google Patents

Peptide capable of binding to ceramic material Download PDF

Info

Publication number
WO2010007723A1
WO2010007723A1 PCT/JP2009/002624 JP2009002624W WO2010007723A1 WO 2010007723 A1 WO2010007723 A1 WO 2010007723A1 JP 2009002624 W JP2009002624 W JP 2009002624W WO 2010007723 A1 WO2010007723 A1 WO 2010007723A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
binding
ceramic
dissociation
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/002624
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
河村秀樹
芝清隆
柏木健司
Original Assignee
株式会社村田製作所
財団法人癌研究会
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社村田製作所, 財団法人癌研究会 filed Critical 株式会社村田製作所
Publication of WO2010007723A1 publication Critical patent/WO2010007723A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Disclosed is a method which can regulate the binding or dissociation of a protein or cell of interest to or from the surface of a ceramic material conveniently.  Also disclosed is a novel peptide which can be used in the aforementioned regulation method and can bind to or dissociate from the surface of a ceramic material reversibly.  Further disclosed is a method for utilizing the peptide.  A phage clone capable of specifically binding to barium titanate (BT) particles can be produced by repeatedly carrying out a panning procedure comprising the steps of: contacting BT particles with a set of phages which can present various peptide sequences on the phage particles; collecting phage particles bound to the BT particles; proliferating the resulting phage particles in Escherichia coli; and contacting the proliferated phage particles with the BT particles again.  Further, it is found that the peptide presented by the phage clone can also bind to the surfaces of other several types of ceramic materials, and it is also found that the bond between the peptide and each of the surfaces of the ceramic materials can be dissociated by controlling the concentration of a metal ion such as a barium ion.

Description

セラミックス結合ペプチドCeramics binding peptide
　本発明は、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドや、かかるペプチドを用いたセラミックス表面への目的タンパク質の結合・解離を制御するセラミックス表面の修飾方法や、表面修飾されたセラミックス等に関する。 The present invention relates to a peptide having reversible binding / dissociation ability to a ceramic surface, a method for modifying a ceramic surface using such peptide to control binding / dissociation of a target protein to the ceramic surface, and a surface-modified ceramic. Etc.
　ファージとは大腸菌などバクテリアに感染するウイルスであり、自身のＤＮＡがタンパク質の殻で包み込まれた構造をしている。この外皮タンパク質はファージのＤＮＡを設計図として構築されるため、このファージＤＮＡに任意のＤＮＡ配列を挿入することで、「さや」のタンパク質に任意のアミノ酸(ペプチド)を付加することができる。このような性質を利用して、多様なペプチドがファージの外皮タンパク質に付加されたファージ集団が、ファージライブラリとして市販されている。通常のファージライブラリの多様性は１０９種類にもなる。 A phage is a virus that infects bacteria such as Escherichia coli, and has a structure in which its own DNA is wrapped in a protein shell. Since this coat protein is constructed using the DNA of the phage as a design drawing, an arbitrary amino acid (peptide) can be added to the “sheath” protein by inserting an arbitrary DNA sequence into the phage DNA. Using such properties, a phage population in which various peptides are added to the coat protein of the phage is commercially available as a phage library. Diversity of normal phage library is also in 10 nine.
　ファージディスプレイ法は、ファージライブラリを用いて生体分子に結合するペプチド配列を同定するための手法であったが、近年、金属等の無機物質を認識するペプチド配列を特定するためにも用いられるようになってきている。これまでに、チタン（特許文献１）、ナノ黒鉛構造体（特許文献２）、ＧａＡｓ（非特許文献１）等に結合するペプチドがファージディスプレイ法により同定されている。 The phage display method has been a method for identifying peptide sequences that bind to biomolecules using a phage library, but has recently been used to identify peptide sequences that recognize inorganic substances such as metals. It has become to. So far, peptides that bind to titanium (patent document 1), nanographite structure (patent document 2), GaAs (non-patent document 1) and the like have been identified by the phage display method.
　さらに、非特許文献２は、ファージディスプレイ法を用いたスクリーニングにより、水溶性前駆体溶液からチタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）の結晶形成を促進するペプチドを同定している。しかし、非特許文献２では、スクリーニングによりチタン酸バリウム結晶に結合するファージクローンを取得しているに過ぎず、これらのファージクローンの提示するペプチド自体が実際にチタン酸バリウム結晶に結合するかどうかについては明らかにしていない。 Furthermore, Non-Patent Document 2 identifies a peptide that promotes crystal formation of barium titanate (BaTiO 3 ) from an aqueous precursor solution by screening using a phage display method. However, in Non-Patent Document 2, only phage clones that bind to barium titanate crystals are obtained by screening, and whether or not the peptides themselves displayed by these phage clones actually bind to barium titanate crystals. Is not revealed.
　セラミックスは、歯科インプラント材料をはじめとして様々な医療用デバイスとして応用の可能性が考えられている。このような医療用デバイスでは、表面を修飾することにより、生体適合性を高めることが重要である。また、セラミックス表面を機能性成分により修飾することにより、分子認識を行うナノデバイスの開発なども可能である。しかし、セラミックス表面に対する詳細な結合特性の解析がなされたペプチドは、未だ報告されていない。 Ceramics are considered to be applicable as various medical devices including dental implant materials. In such a medical device, it is important to improve biocompatibility by modifying the surface. It is also possible to develop nanodevices that perform molecular recognition by modifying the ceramic surface with functional components. However, peptides that have been analyzed for detailed binding properties to the ceramic surface have not yet been reported.
国際公開第０５／０１００３１号パンフレットInternational Publication No. 05/010031 Pamphlet 特開２００４－１２１１５４号公報JP 2004-121154 A
　本発明の課題は、セラミックス表面への目的とするタンパク質や細胞の結合（複合）・解離を簡便に制御しうる方法や、当該制御方法に用いることができる、セラミックス表面に可逆的な結合・解離能を有する新規のペプチド及びその利用方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method that can easily control the binding (composite) / dissociation of a target protein or cell to a ceramic surface, and a reversible binding / dissociation to a ceramic surface that can be used in the control method. It is an object of the present invention to provide a novel peptide having an ability and a method for using the same.
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、チタン酸バリウム（以下「ＢａＴｉＯ３」又は「ＢＴ」ということもある）粒子に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示するファージ集団を接触させ、ＢＴ粒子に結合したファージ粒子を回収し、得られたファージ粒子を大腸菌中で増殖させ、次いで、この増殖させたファージ粒子を、再度ＢＴ粒子に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、まずＢＴ粒子に特異的に結合するファージクローンを得ることに成功した。次に、このファージクローンの提示するペプチドについて解析し、このペプチドが他の数種類のセラミックス表面にも結合すること、また、その結合がバリウムイオン等の金属イオンにより解離することを見い出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and a phage population displaying various peptide sequences on phage particles on barium titanate (hereinafter also referred to as “BaTiO 3 ” or “BT”) particles. The phage particles bound to the BT particles are recovered, the obtained phage particles are propagated in E. coli, and then the expanded phage particles are contacted with the BT particles again by repeating a panning operation. First, we succeeded in obtaining phage clones that specifically bind to BT particles. Next, the peptide presented by this phage clone was analyzed, and it was found that this peptide binds to several other types of ceramic surfaces, and that the bond is dissociated by metal ions such as barium ions. It came to be completed.
　すなわち本発明は、（１）配列番号１１又は１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、（２）セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドであって、配列番号１１又は１９に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列や、（３）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が、配列番号１、１４又は１６に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする上記（２）記載のペプチドや、（４）セラミックス表面への可逆的な結合・解離が、金属イオンにより制御されることを特徴とする上記（２）記載のペプチドや、（５）金属イオンが、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋から選択される少なくとも１以上の金属イオンであることを特徴とする上記（２）記載のペプチドに関する。 That is, the present invention relates to (1) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 19, and (2) a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface, An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown, or (3) one or several amino acids are deleted, substituted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 The added amino acid sequence is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 14 or 16, and the peptide according to (2) above, or (4) reversible binding / dissociation to the ceramic surface, peptides and (2) above, wherein the controlled by metal ions, (5) a metal ion, Ba 2+, Ni 2+, Zn 2+ Is at least one or more metal ions selected from finely Ca 2+ relates to peptides of (2), wherein.
　また本発明は、（６）セラミックスが、金属酸化物を主成分とするセラミックスであることを特徴とする上記（２）記載のペプチドや、（７）金属酸化物が、遷移金属酸化物であることを特徴とする上記（６）記載のペプチドや、（８）遷移金属酸化物が、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、又はそれらの混合物であることを特徴とする上記（７）記載のペプチドや、（９）検出可能なマーカーで標識された上記（１）～（８）のいずれか記載のペプチドや、（１０）上記（１）～（８）のいずれか記載のペプチドと、機能性ペプチド又は機能性タンパク質とを結合させた融合ペプチドや、（１１）上記（１）～（８）のいずれか記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とする、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するファージや、（１２）上記（１）～（８）のいずれか記載のペプチドを認識する抗体や、（１３）上記（１）～（８）のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡや、（１４）上記（１３）記載のＤＮＡを含み、かつセラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターや、（１５）上記（１４）記載の組換えベクターが導入された形質転換体に関する。 In the present invention, (6) the ceramic is a ceramic mainly composed of a metal oxide, the peptide according to (2) above, or (7) the metal oxide is a transition metal oxide. The peptide according to (6) above, or (8) the peptide according to (7) above, wherein the transition metal oxide is titanium oxide, zirconium oxide, or a mixture thereof. (9) the peptide according to any one of (1) to (8) labeled with a detectable marker, (10) the peptide according to any one of (1) to (8) above, and a functional peptide Or a fusion peptide conjugated with a functional protein, or (11) the peptide according to any one of (1) to (8) above, which is presented on the particle surface, and is reversible to the ceramic surface. Combination and solution (12) an antibody that recognizes the peptide according to any one of (1) to (8) above, (13) a DNA encoding the peptide according to any one of (1) to (8) above Or (14) a recombinant vector comprising the DNA described in (13) above and capable of expressing a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface; (15) described in (14) above The present invention relates to a transformant introduced with a recombinant vector.
　さらに本発明は、（１６）セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチド、又は該ペプチドと機能性タンパク質との融合ペプチドを介しての、セラミックス表面と目的とするタンパク質との結合又は解離を、所定の金属イオンの濃度を調整することによって行うことを特徴とするセラミックス表面とタンパク質との結合・解離を制御する方法や、（１７）セラミックス表面と、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドと目的とするタンパク質との融合ペプチドとの結合又は解離を、所定の金属イオンの濃度を調整することによって行うことを特徴とするセラミックス表面と融合ペプチドとの結合・解離を制御する方法や、（１８）セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドとして、上記（１）～（９）のいずれか記載のペプチドを用いることを特徴とする上記（１５）又は（１６）記載の方法や、（１９）融合ペプチドとして、上記（１０）記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする上記（１５）又は（１６）記載の方法や、（２０）金属イオンが、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、及びＣａ２＋から選択される少なくとも１以上の金属イオンであることを特徴とする上記（１６）～（１９）記載の方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to (16) binding of a ceramic surface to a target protein or a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface, or a fusion peptide of the peptide and a functional protein. Dissociation is performed by adjusting the concentration of a predetermined metal ion, a method for controlling the binding / dissociation between a ceramic surface and a protein, or (17) reversible binding to the ceramic surface and the ceramic surface -Binding or dissociation between a fusion peptide and a ceramic surface characterized by adjusting the concentration of a predetermined metal ion to bind or dissociate a peptide having dissociation ability and a fusion peptide of the target protein. As a control method, and (18) as a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface, The method according to (15) or (16) above, wherein the peptide according to any one of (1) to (9) is used, or (19) the fusion peptide according to (10) above is used as the fusion peptide The method according to (15) or (16) above, or (20) the metal ion is at least one metal ion selected from Ba 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , and Ca 2+. (16) to (19) above.
　また本発明は、（２１）セラミックスが、金属酸化物を主成分とするセラミックスであることを特徴とする上記（１６）～（２０）のいずれか記載の方法や、（２２）金属酸化物が、遷移金属酸化物であることを特徴とする上記（２１）記載の方法や、（２３）遷移金属酸化物が、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、又はそれらの混合物であることを特徴とする上記（２２）記載の方法や、（２４）上記（１６）～（２３）のいずれか記載の方法により、セラミックス表面に所定のタンパク質又は所定の細胞を脱着する方法や、（２５）上記（１）～（９）のいずれか記載のペプチド、又は上記（１０）記載の融合ペプチドで表面修飾されたセラミックスや、（２６）上記（１）～（９）のいずれか記載のペプチド、又は上記（１０）記載の融合ペプチドを介して、表面に所定のタンパク質又は所定の細胞が結合したセラミックスに関する。 Further, the present invention provides the method according to any one of (16) to (20) above, wherein (21) the ceramic is a ceramic mainly composed of a metal oxide; The method according to (21) above, which is a transition metal oxide, or (23) the transition metal oxide is titanium oxide, zirconium oxide, or a mixture thereof. (22) the method according to (24), (24) the method according to any one of (16) to (23) above, a method of detaching a predetermined protein or a predetermined cell from the ceramic surface, or (25) the above (1) Ceramics surface-modified with the peptide according to any one of (9) or (10) above, (26) the peptide according to any of (1) to (9) above, or (10 )Record Through the fusion peptide, to a ceramics given protein or a predetermined cell surface bound.
　本発明のセラミック表面に特異的に結合するペプチドは、簡単に化学合成することができ、また、遺伝子工学的手法を用いることで他のタンパク質等と融合させた融合ペプチドを作製することができ、セラミックス表面の修飾に用いることができる。また、本発明のペプチドや融合ペプチドと、セラミックス表面との結合・解離は、金属イオンによって制御することが可能であるため、タンパク質精製など幅広い分野での応用が可能である。 Peptides that specifically bind to the ceramic surface of the present invention can be easily chemically synthesized, and by using genetic engineering techniques, fusion peptides fused with other proteins can be prepared, It can be used to modify the ceramic surface. Moreover, since the binding / dissociation between the peptide or fusion peptide of the present invention and the ceramic surface can be controlled by metal ions, it can be applied in a wide range of fields such as protein purification.
ファージクローンφ４０３Ｎ、φ４０４Ｎ及びφ４１０Ｎのチタン酸バリウム（ＢＴ）への結合力を調べた結果を示す図である。結合率とは、溶出して回収されたファージ量を、投入したファージ量で除したものであり、φＭ１３ＫＥとは、ペプチドを提示していない(野生型の)ファージである。It is a figure which shows the result of having investigated the binding strength to phage clone (phi) 403N, (phi) 404N, and (phi) 410N to barium titanate (BT). The binding rate is the amount of phage recovered after elution and divided by the amount of input phage. ΦM13KE is a (wild-type) phage that does not display a peptide. 本発明のファージクローンφ４０３Ｎの提示ペプチドを示す図である。ランダムなペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が３つタンデムに連なって挿入された配列となっている。It is a figure which shows the display peptide of phage clone (phi) 403N of this invention. This is a sequence in which three DNA fragments encoding random peptide sequences are inserted in tandem. 本発明のファージクローンφ４０３Ｎの提示ペプチド（配列番号１）と、９種類の変異ペプチド（配列番号４～１２）の配列を示す図である。It is a figure which shows the arrangement | sequence of the display peptide (sequence number 1) of the phage clone (phi) 403N of this invention, and nine types of mutant peptides (sequence number 4-12). Ｓｉ基板上に全面成膜されたＢＴスパッタ薄膜上にＡｕとＴｉ薄膜がパターニングされているチップを用いて、φ１５９９、φ１６０３、φ１６０５、φ１６１１、及びφ１６１２の特異的結合を調べた結果を示す図である。The figure which shows the result of having investigated the specific coupling | bonding of (phi) 1599, (phi) 1603, (phi) 1605, (phi) 1611, and (phi) 1612 using the chip | tip with which the Au and Ti thin film were patterned on the BT sputtered thin film formed entirely on the Si substrate. is there. 本発明のＢＴＢＰ－１（配列番号１１）とその３つの変異ペプチドΔ(１８－２２)（配列番号１３）、Δ(１－５)（配列番号１４）、Δ(１－５、１８－２２)（配列番号１５）のＢＴへの特異的結合を調べた結果を示す図である。BTBP-1 of the present invention (SEQ ID NO: 11) and its three mutant peptides Δ (18-22) (SEQ ID NO: 13), Δ (1-5) (SEQ ID NO: 14), Δ (1-5, 18-22 ) (Sequence No. 15) is a diagram showing the results of examining the specific binding to BT. 本発明の融合ペプチドＺＺ＋ＢＴＢＰ－１がＢＴに特異的に結合するとともに、抗体を補足することができることを示す図である。FIG. 3 is a view showing that the fusion peptide ZZ + BTBP-1 of the present invention specifically binds to BT and can supplement an antibody. ＢＴＢＰ－１の２つのグルタミン酸(Ｅ)をグルタミン(Ｑ)に置き換えたペプチドＢＴＢＰ－１(Ｅ→Ｑ)（配列番号１６）、（ＤＫ）６（配列番号１７）、（ＤＡ）６（配列番号１８）、及び（ＫＡ）６（配列番号１９）の４種類のペプチドのＢＴへの特異的結合を示す図である。Peptides BTBP-1 (E → Q) (SEQ ID NO: 16), (DK) 6 (SEQ ID NO: 17), (DA) 6 (SEQ ID NO: 6 ) in which two glutamic acids (E) of BTBP-1 are replaced with glutamine (Q) It is a figure which shows the specific binding to BT of 4 types of peptides of 18) and (KA) 6 (sequence number 19). ＢＴＢＰ－１及び（ＫＡ）６ペプチドのＢＴへの結合に及ぼす、金属イオン（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋）の影響を示す図である。On binding to BTBP-1 and (KA) 6 peptide BT, metal ions (Mg 2+, Ca 2+, Ba 2+, Ni 2+, Zn 2+) is a diagram showing the effect of. 既に結合しているペプチドが、金属イオンを含む溶液によって解離するかどうかを調べた結果を示す図である。「解離処理あり」は、ペプチドを結合させた後、１ｍＭのＢａＣｌ２を含むＴＢＳＴに１５分間浸漬した後に、ストレプトアビジンを反応させた結果である。また、「解離処理なし」は、ペプチドを結合させた後、Ｂａ２＋を含まない液に１５分間浸した後にストレプトアビジンを反応させた結果である。It is a figure which shows the result of having investigated whether the peptide already couple | bonded is dissociated by the solution containing a metal ion. “With dissociation treatment” is a result of reacting streptavidin after binding the peptide and immersing in TBST containing 1 mM BaCl 2 for 15 minutes. “No dissociation treatment” is a result of reacting streptavidin after binding the peptide and immersing in a solution not containing Ba 2+ for 15 minutes. 既に結合しているペプチドが、金属イオンを含む溶液によって解離するかどうかを調べた結果を示す図である。あらかじめチップに結合したペプチドにあらかじめストレプトアビジンを反応させた後、１ｍＭのＢａＣｌ２を含むＴＢＳＴに一晩浸漬した後に結合を調べたものである。It is a figure which shows the result of having investigated whether the peptide already couple | bonded is dissociated by the solution containing a metal ion. Streptavidin was reacted in advance with a peptide previously bound to a chip, and then immersed in TBST containing 1 mM BaCl 2 overnight, and then the binding was examined. 硫酸イオンの存在下／非存在下での、ＢＴＢＰ－１とＢＴとの結合におけるペプチド濃度の影響を調査した結果である。It is the result of having investigated the influence of the peptide concentration in the coupling | bonding of BTBP-1 and BT in presence / absence of a sulfate ion. （ａ）ビオチン標識ＢＴＢＰ－１とQdotとを予め結合させた後、チップに吸着させた結果、及び（ｂ）ビオチン標識ＢＴＢＰ－１を先にチップに吸着させた後に、Qdotを反応させた結果を示す図である。(A) The result of pre-binding biotin-labeled BTBP-1 and Qdot and then adsorbing to the chip, and (b) The result of reacting Qdot after the biotin-labeled BTBP-1 was first adsorbed to the chip FIG. １ μＭのＢＴＢＰ－１溶液に、ＢａＣｌ２を０、０．０３、０．１、０．３、１．０ｍＭとなるように加え、チップへの結合を調べた結果を示す図である。To 1 BTBP-1 solution of [mu] M, added BaCl 2 so that 0,0.03,0.1,0.3,1.0MM, is a diagram showing the results of examining the binding to the chip. 様々なセラミックへのＢＴＢＰ－１及び（ＫＡ）６の結合を調べた結果を示す図である。It is a diagram showing the results of examining the binding of BTBP-1 and (KA) 6 to various ceramic. ファージライブラリＤ－１２のｌｏｔ３及びｌｏｔ６、ファージライブラリＤ－Ｃ７Ｃからのスクリーニングにより得られたファージ結合率を示す図である。末尾のＳはＤ－１２ライブラリのＬｏｔ６、ＴはＤ－１２ライブラリのＬｏｔ３、ＣはＤ－Ｃ７Ｃライブラリから得られたものであることを示す。It is a figure which shows the phage binding rate obtained by the screening from the lot 3 and lot6 of phage library D-12, and phage library D-C7C. S at the end indicates that it was obtained from Lot 6 of the D-12 library, T is obtained from Lot 3 of the D-12 library, and C is obtained from the D-C7C library. 図１３に示されるファージクローンの提示アミノ酸配列（配列番号２０～２６）を示す図である。FIG. 14 is a view showing the displayed amino acid sequences (SEQ ID NOs: 20 to 26) of the phage clone shown in FIG. φ６０３Ｃの提示ペプチドを合成し、その結合特性を確認した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having synthesize | combined the presentation peptide of (phi) 603C, and confirming the binding characteristic. チタン酸バリウムの粗い粉末を用いたスクリーニングにより得られたファージクローンのＢＴへの結合を調べた結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having investigated the coupling | bonding to BT of the phage clone obtained by the screening using the coarse powder of barium titanate. １ｍＭ ＢａＣｌ２非存在下／存在下での、ファージクローンのＢＴへの結合を調べた結果を示す図である。1 mM BaCl 2 in the absence / presence is a graph showing a result of examining the binding of BT phage clones.
　本発明のペプチドとしては、配列番号１１に示されるアミノ酸配列Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（ＡＥＰＨＰＳＡＡＨＫＫＫＱＳＳＰＫＳＥＮＲＫ；以下、「ＢＴＢＰ－１」ということもある）や、配列番号１９に示されるアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ（ＫＡＫＡＫＡＫＡＫＡＫＡ；以下「（ＫＡ）６」ということもある）からなるペプチドや、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドであって、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列や、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであれば特に制限されるものではなく、ここで「セラミックスへの可逆的な結合・解離能を有する」とは、セラミックスへの結合量のペプチド濃度依存性を調べたとき、結合量が平衡濃度１０μＭ以上では飽和傾向を示し、０．１μＭ以下では飽和量の１／２以下に低下する程度の結合能を持っていることを意味する。上記の配列番号１１に示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するペプチドとして、例えば、Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１）や、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ａｒｇ（配列番号１４）や、Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（配列番号１６）等を具体的に挙げることができる。上記セラミックスとしては、特に制限されるものではないが、好ましくは金属酸化物を主成分とするセラミックス、より好ましくは遷移金属酸化物を主成分とするセラミックスであり、なかでも、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、又はそれらの混合物を主成分とするセラミックス等であることが特に好ましい。より具体的には、上記セラミックスとして、チタン酸化物系（チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化チタン（ＴｉＯ２）など）、ジルコニウム酸化物系（酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）など）、スズ酸化物系（スズ酸バリウム（ＢａＳｎＯ３）など）等を好適に例示することができる。 The peptide of the present invention includes the amino acid sequence Ala-Glu-Pro-His-Pro-Ser-Ala-Ala-His-Lys-Lys-Lys-Gln-Ser-Ser-Pro-Lys-Ser shown in SEQ ID NO: 11. -Glu-Asn-Arg-Lys (AEPHPSAAAHKKKQSSPKSENSRK; hereinafter also referred to as "BTBP-1") and the amino acid sequence Lys-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Lys shown in SEQ ID NO: 19 A peptide consisting of -Ala-Lys-Ala (KAKAKAKAKAKA; hereinafter also referred to as “(KA) 6 ”), and a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface, which is represented by SEQ ID NO: 11 1 or several amino acids in the amino acid sequence A peptide comprising an amino acid sequence in which no acid is deleted, substituted or added, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19. However, the term “has reversible binding / dissociation ability to ceramics” means that the binding amount is equal to the equilibrium concentration when the peptide concentration dependence of the binding amount to ceramics is examined. When it is 10 μM or more, it indicates a tendency to saturate, and when it is 0.1 μM or less, it means that it has a binding ability that is reduced to ½ or less of the saturation amount. As a peptide having an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and having reversible binding / dissociating ability to ceramics, for example, Ala-Val-Gly-Leu-Ser-Pro-Asp-Gly-Ser-Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-His-Pro-Ser-Ala-Ala-His -Lys-Lys-Lys-Gln-Ser-Ser-Pro-Lys-Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Thr -Ser-Arg-Thr-Pro-Ile-Leu-Gly (SEQ ID NO: Ser-Ala-Ala-His-Lys-Lys-Lys-Gln-Ser-Ser-Pro-Lys-Ser-Glu-Asn-Arg (SEQ ID NO: 14) and Ala-Gln-Pro-His-Pro Specific examples include -Ser-Ala-Ala-His-Lys-Lys-Lys-Gln-Ser-Ser-Pro-Lys-Ser-Gln-Asn-Arg-Lys (SEQ ID NO: 16). The ceramic is not particularly limited, but is preferably a ceramic mainly composed of a metal oxide, more preferably a ceramic mainly composed of a transition metal oxide. Among them, titanium oxide, zirconium It is particularly preferable to use ceramics mainly containing an oxide or a mixture thereof. More specifically, examples of the ceramic include titanium oxide (barium titanate (BaTiO 3 ), strontium titanate (SrTiO 3 ), titanium oxide (TiO 2 ), etc.), zirconium oxide (zirconium oxide (ZrO 2 )). )), Tin oxide (barium stannate (BaSnO 3 ), etc.) and the like can be suitably exemplified.
　また、本発明のペプチドのセラミックス表面への可逆的な結合・解離は、金属イオンにより制御することができる。上記金属イオンとしては、本発明のペプチドのセラミックス表面への結合・解離を制御するものであれば特に制限されるものではないが、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋等を例として挙げることができる。本発明のペプチドのセラミックス表面への可逆的な結合・解離は、水溶液中に含まれる上記金属イオンの濃度により制御することが可能である。すなわち、セラミックスと本発明のペプチドとを解離用金属イオン非存在下又は結合用金属イオンの存在下に（金属イオンを含む溶液により）結合させ、次に、セラミックスに結合した本発明のペプチドを、解離用金属イオンの存在下に解離させることができる。また、上記解離用金属イオンを含む溶液の金属イオン濃度を低下させることにより、解離しているセラミックスと本発明のペプチドとを再結合させることもできる。上記解離用金属イオンや結合用金属イオンは、本発明のペプチドの種類やセラミックスの種類により異なる。 The reversible binding / dissociation of the peptide of the present invention to the ceramic surface can be controlled by metal ions. The metal ion is not particularly limited as long as it controls the binding / dissociation of the peptide of the present invention to the ceramic surface, but examples include Ba 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Ca 2+ and the like. be able to. The reversible binding / dissociation of the peptide of the present invention on the ceramic surface can be controlled by the concentration of the metal ion contained in the aqueous solution. That is, the ceramic and the peptide of the present invention are bonded in the absence of a metal ion for dissociation or in the presence of a metal ion for binding (by a solution containing the metal ion), and then the peptide of the present invention bonded to the ceramic is It can be dissociated in the presence of a metal ion for dissociation. Moreover, the dissociated ceramics and the peptide of the present invention can be recombined by reducing the metal ion concentration of the solution containing the metal ions for dissociation. The metal ion for dissociation and the metal ion for binding differ depending on the type of peptide of the present invention and the type of ceramic.
　アミノ配列が異なる本発明のペプチドは、それぞれ異なる種類のセラミックスに対して、可逆的な結合・解離能を有する。例えば、本発明のペプチドＢＴＢＰ－１は、チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化チタン（ＴｉＯ２）及び酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）に対して優れた結合・解離能を有するが、本発明のペプチド（ＫＡ）６は、チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）及びスズ酸バリウム（ＢａＳｎＯ３）に対して優れた結合・解離能を有する。また、本発明のペプチドとセラミックとの可逆的な結合・解離は、異なる種類の金属イオンにより制御される。例えば、ＢＴＢＰ－１とチタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）はＭｇ２＋やＮｉ２＋やＺｎ２＋の存在下に結合する（結合を阻害しない）が、チタン酸バリウムに結合したＢＴＢＰ－１はＢａ２＋の存在下に解離する。一方、（ＫＡ）６とチタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）はＭｇ２＋の存在下に結合する（結合を阻害しない）が、チタン酸バリウムに結合した（ＫＡ）６はＢａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋のいずれによっても解離する。以上のように、本発明のペプチドをセラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドとして使用する方法も本発明の一形態として包含される。 The peptides of the present invention having different amino sequences have reversible binding / dissociation ability with respect to different types of ceramics. For example, the peptide BTBP-1 of the present invention has excellent binding / dissociation ability with respect to barium titanate (BaTiO 3 ), strontium titanate (SrTiO 3 ), titanium oxide (TiO 2 ), and zirconium oxide (ZrO 2 ). However, the peptide (KA) 6 of the present invention has an excellent binding / dissociation ability with respect to barium titanate (BaTiO 3 ), strontium titanate (SrTiO 3 ), and barium stannate (BaSnO 3 ). Further, reversible binding / dissociation between the peptide of the present invention and the ceramic is controlled by different kinds of metal ions. For example, BTBP-1 and barium titanate (BaTiO 3 ) bind in the presence of Mg 2+ , Ni 2+, and Zn 2+ (does not inhibit binding), but BTBP-1 bound to barium titanate has the presence of Ba 2+ . Dissociate down. On the other hand, (KA) 6 and barium titanate (BaTiO 3 ) are bonded in the presence of Mg 2+ (does not inhibit the binding), but (KA) 6 bonded to barium titanate is Ba 2+ , Ni 2+ , Zn 2+. Dissociate by any of the above. As described above, a method of using the peptide of the present invention as a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface is also included as one embodiment of the present invention.
　上記本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。化学合成法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含され、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とが包含される。本発明のペプチドを合成するには、そのいずれの方法をも採用することができる。上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ－ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができ、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。 The peptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to the amino acid sequence. Chemical synthesis methods include peptide synthesis methods using ordinary liquid-phase methods and solid-phase methods. More specifically, the step of extending the chain by sequentially binding each amino acid one by one based on amino acid sequence information. The wise erosion method and a fragment condensation method in which a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance and then each fragment is subjected to a coupling reaction are included. Any method can be employed to synthesize the peptide of the present invention. The condensation methods employed for the peptide synthesis can also follow various known methods. Specific examples thereof include, for example, azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide) N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, etc.), Woodward method and the like. Solvents that can be used in each of these methods can also be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in this type of peptide condensation reaction, such as dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexa Examples include phosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
　さらに、上記本発明のペプチドは、本発明のセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られる本発明のセラミックスに結合能を有するペプチド、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。 Furthermore, the peptide of the present invention can be prepared by a conventional method using genetic engineering techniques based on the base sequence information of DNA encoding a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic of the present invention. . Peptides having binding ability to the ceramic of the present invention thus obtained, according to ordinary methods, for example, ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), countercurrent distribution According to a method widely used in the field of peptide chemistry such as a method, the purification can be appropriately performed.
　上記本発明のペプチドは、検出可能なマーカーで標識されていてもよく、上記検出可能なマーカーとしては、従来知られているペプチド標識用のマーカーであれば特に制限されるものではなく、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ等の放射性同位体や、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質や、ビオチン、ジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造や、生物発光化合物や、化学発光化合物や、金属キレート等を具体的に挙げることができる。なかでも、本発明のペプチドＢＴＢＰ－１、（ＫＡ）６をそれぞれビオチンで標識した、ビオチン標識ＢＴＢＰ－１やビオチン標識（ＫＡ）６は、後述の実施例でも示されているように、セラミックスへの可逆的な結合・解離能を有しており、特に好例として挙げることができる。また、ビオチン標識ＢＴＢＰ－１やビオチン標識（ＫＡ）６は、ストレプトアビジン修飾抗体と併用することにより、標的となる所定の抗原タンパク質（目的タンパク質）を着脱自在に操作しうることから、例えば、抗原タンパク質の分離・精製に有利に用いることができる。 The peptide of the present invention may be labeled with a detectable marker, and the detectable marker is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker for peptide labeling, for example, Radioisotopes such as 3 H, 14 C, 125 I, fluorescent materials such as dansyl chloride, tetramethylrhodamine isothiocyanate, biologically relevant binding structures such as biotin and digoxigenin, bioluminescent compounds, Specific examples include chemiluminescent compounds and metal chelates. In particular, the peptides BTBP-1 and (KA) 6 of the present invention are labeled with biotin, and the biotin-labeled BTBP-1 and biotin-labeled (KA) 6 are applied to ceramics as shown in the examples described later. It has a reversible binding / dissociation ability, and can be cited as a particularly good example. In addition, biotin-labeled BTBP-1 and biotin-labeled (KA) 6 can be used in combination with a streptavidin-modified antibody to detachably operate a predetermined target antigen protein (target protein). It can be advantageously used for separation and purification of proteins.
　また、本発明のペプチドは、機能性ペプチド又は機能性タンパク質に結合した融合ペプチドであってもよい。本発明の融合ペプチドとしては、本発明のペプチドと、機能性ペプチド又は機能性タンパク質とが結合しているものであればどのようなものでもよく、上記機能性タンパク質としては、例えば、抗体、抗原、プロテインＡ（特にプロテインＡのＺＺドメイン）等の免疫関連タンパク質や、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などのマーカータンパク質や、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、レクチン、アビジン等の結合能を有する結合性タンパク質を具体的に挙げることができ、また、上記機能性ペプチドとしては、例えば、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ビオチン化ペプチド
、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどを具体的に例示することができる。なかでも、本発明のセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するペプチドとプロテインＡのＺＺドメインとを結合させた融合ペプチドは、セラミックスへの優れた結合能を有するとともに、抗体との結合能も有していることから、生物学的解析ツールとして広く応用が可能であり、さらに、金属イオンによりセラミックス表面から解離させることが可能であるため、前記抗体が認識する標的抗原タンパク質等の精製にも非常に有用である。また、本発明のセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するペプチドとＢＭＰとを結合させた融合ペプチドは、この融合ペプチドを介して、ＢＭＰと結合するＢＭＰレセプターを表面に発現する間葉系細胞や繊維芽細胞等をセラミックス材料表面に集積するとともに骨芽細胞への分化が促進し、その結果、セラミックス材料表面への骨の形成が促進され、セラミックスと骨を良好に定着させる上で有用である。 The peptide of the present invention may be a functional peptide or a fusion peptide bound to a functional protein. The fusion peptide of the present invention may be any peptide as long as the peptide of the present invention is bound to a functional peptide or functional protein. Examples of the functional protein include antibodies and antigens. , Immune-related proteins such as protein A (especially ZZ domain of protein A), enzymes such as alkaline phosphatase and HRP, antibody Fc region, marker proteins such as fluorescent substances such as GFP, maltose binding protein (MBP), lectin Specific examples include binding proteins having binding ability such as avidin. Examples of the functional peptides include epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, GST, and maltose binding protein (MBP). Affinity tags such as biotinylated peptide and oligohistidine It can be exemplarily. Among them, the fusion peptide obtained by binding a peptide having reversible binding / dissociating ability to ceramics of the present invention and the ZZ domain of protein A has excellent binding ability to ceramics and binding ability to an antibody. Therefore, it can be widely applied as a biological analysis tool, and further, it can be dissociated from the ceramic surface with metal ions, so that the target antigen protein recognized by the antibody can be purified. Is also very useful. Further, the fusion peptide obtained by binding a peptide having reversible binding / dissociation ability to ceramics of the present invention and BMP is a mesenchymal system that expresses a BMP receptor binding to BMP on the surface via this fusion peptide. Accumulate cells and fibroblasts on the surface of ceramic materials and promote differentiation into osteoblasts. As a result, bone formation on the surface of ceramic materials is promoted, which is useful for establishing ceramics and bones well. It is.
　本発明のセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するファージとしては、本発明のセラミックスに結合能を有するペプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるセラミックスに結合能を有するファージは、ファージライブラリスクリーニングの過程で、セラミックスに強く結合したペプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより得られる他、本発明のセラミックスに結合有するペプチドをコードするＤＮＡを、常法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、ヘルパーファージを感染させることで得ることもできる。 The phage having reversible binding / dissociation ability to the ceramic of the present invention may be any phage as long as it displays a peptide capable of binding to the ceramic of the present invention on the particle surface. A phage having a binding ability to DNA is obtained by separating peptide-displayed phages that are strongly bound to ceramics from other phage populations in the process of phage library screening, and also a DNA encoding a peptide having a binding ability to the ceramics of the present invention. Can also be obtained by infecting a helper phage by transforming a host cell such as Escherichia coli by incorporating it into a phagemid vector by a conventional method.
　本発明のペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、なかでもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかる本発明のペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のペプチド又はその断片を免疫することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ法（MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss,
Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に、本発明のペプチドのひとつであるＢＴＢＰ－１に対して特異的に結合するマウスのモノクローナル抗体、すなわち抗ＢＴＢＰ－１モノクローナル抗体の作製方法を説明する。 Specific examples of antibodies that recognize the peptides of the present invention include immunospecific antibodies such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies, and the like. Although it can be prepared by a conventional method using a peptide as an antigen, a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity. Such an antibody against the peptide of the present invention is produced by immunizing an animal (preferably non-human) with the peptide of the present invention or a fragment thereof using a conventional protocol. For example, for preparation of a monoclonal antibody, a continuous cell line is used. Hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), trioma method, human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (MONOCLONAL)
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss,
Inc., 1985) can be used. A method for producing a mouse monoclonal antibody that specifically binds to BTBP-1, which is one of the peptides of the present invention, that is, an anti-BTBP-1 monoclonal antibody will be described below.
　上記抗ＢＴＢＰ－１モノクローナル抗体は、抗ＢＴＢＰ－１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。抗ＢＴＢＰ－１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ＢＴＢＰ－１を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ－１細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ－１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ＢＴＢＰ－１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。 The anti-BTBP-1 monoclonal antibody can be produced by culturing an anti-BTBP-1 monoclonal antibody-producing hybridoma in vivo or in vitro by a conventional method. For example, in an in vivo system, it can be obtained by culturing in the abdominal cavity of a rodent, preferably a mouse or a rat. In an in vitro system, it can be obtained by culturing in an animal cell culture medium. As a medium for culturing a hybridoma in an in vitro system, a cell culture medium such as RPMI 1640 or MEM containing an antibiotic such as streptomycin or penicillin can be exemplified. The anti-BTBP-1 monoclonal antibody-producing hybridoma can be obtained by, for example, immunizing a BALB / c mouse with BTBP-1 and then spleen cells of the immunized mice and mouse NS-1 cells (ATCC).
The anti-BTBP-1 monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced by cell fusion with TIB-18) by a conventional method and screening with an immunofluorescent staining pattern. In addition, as a method for separating and purifying the monoclonal antibody, any method can be used as long as it is a method generally used for protein purification, and liquid chromatography such as affinity chromatography can be specifically exemplified. .
　また、上記ＢＴＢＰ－１に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのＢＴＢＰ－１を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。さらに、上記抗ＢＴＢＰ－１モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記ＢＴＢＰ－１を検出・定量等を行うことができる。上記抗体を用いた免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。 Further, in order to produce a single chain antibody against BTBP-1, a method for preparing a single chain antibody (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. In addition, in order to express a humanized antibody, a transgenic mouse or other mammal is used, a clone expressing BTBP-1 is isolated and identified using the above antibody, affinity chromatography The polypeptide can also be purified. In addition, antibodies such as the above anti-BTBP-1 monoclonal antibody include fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, and radioisotopes such as 125 I, 32 P, 14 C, 35 S or 3 H. BTBP-1 can be detected by using a fusion protein that is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase or phycoerythrin, or a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP).・ Quantitative analysis can be performed. Examples of the immunological measurement method using the above antibody include RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination method, and octalony method.
　本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切に挿入することにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡが転写できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。 The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a recombinant vector containing the DNA of the present invention and capable of expressing a peptide having reversible binding / dissociation ability to ceramics. This recombinant vector can be constructed by appropriately inserting the DNA of the present invention into an expression vector, preferably an expression plasmid vector. Such an expression vector is preferably one that is capable of autonomous replication in a host cell, or one that can be integrated into the host cell chromosome, such as a promoter, enhancer, terminator, etc. at a position where the DNA of the present invention can be transcribed. Those containing a control sequence can be preferably used.
　上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６－ＸＬ３（OriGeneTechnologies Inc.社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ－９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology,
3,133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101,
1307,1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Cyan
Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescence
Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦＰ））、ルシフェラーゼ（luciferase）を例示することができる。 Examples of the expression vector include pCMV6-XL3 (OriGene Technologies Inc.), EGFP-C1 (Clontech), pGBT-9 (Clontech), pcDNAI (Funakoshi), pcDM8 (Funakoshi), pAGE107 (Cytotechnology,
3,133, 1990), pCDM8 (Nature, 329, 840, 1987), pcDNAI / AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J.Blochem., 101,
1307, 1987), pAGE210 and the like. Examples of promoters include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter, and the like. . Furthermore, a reporter gene such as a gene encoding a fluorescent protein can be fused downstream of the promoter. Fluorescent proteins include green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent protein (Cyan
Fluorescence Protein (CFP)), Blue Fluorescence Protein (Blue Fluorescence)
Protein (BFP)), yellow fluorescent protein (YFP), and luciferase can be exemplified.
　また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつ本発明のセラミックスへの可逆的な結合・解離能を有するペプチドを発現する形質転換体であれば特に制限されるものではなく、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）等を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。 In addition, the transformant of the present invention may be a transformant in which the above recombinant vector of the present invention is introduced into a host cell and expresses a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic of the present invention. For example, transformed yeast, transformed plant (cell, tissue, individual), transformed bacterium, transformed animal (cell, tissue, individual) and the like can be mentioned. Is preferred.
　本発明のセラミックス表面とタンパク質との結合・解離を制御する方法としては、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチド（以下「本結合・解離ペプチド」ということがある）、又は該ペプチドと機能性タンパク質との融合ペプチドを介しての、セラミックス表面と目的とするタンパク質（又は目的とする細胞）との結合又は解離を、所定の金属イオンの濃度を調整することによって制御する方法［制御方法Ｉ］や、セラミックス表面と、本結合・解離ペプチドと目的とするタンパク質との融合ペプチドとの結合又は解離を、所定の金属イオンの濃度を調整することによって制御する方法［制御方法II］であれば特に制限されず、かかる本発明の制御方法により、セラミックス表面に所定のタンパク質（目的タンパク質）又は所定の細胞（目的細胞）を脱着、すなわち修飾することができる。上記本結合・解離ペプチドとしては、前記本発明のペプチドの他、ＢＴＢＰ－１と同様にファージライブラリを用いたスクリーニングにより、また（ＫＡ）６と同様に塩基性アミノ酸に富むペプチドを用いたスクリーニングにより見出すことができる。
　また、機能性タンパク質については前述したタンパク質を用いることができ、この機能性タンパク質が目的タンパク質になることもある。例えば、本結合・解離ペプチド－プロテインＡのＺＺドメインとの融合ペプチドのとき、目的タンパク質はこの融合ペプチドを介してセラミックス表面に結合・解離する抗体ということになり、同様に、本結合・解離ペプチド－抗体との融合ペプチドのとき、目的タンパク質はこの融合ペプチドを介してセラミックス表面に結合・解離する抗原タンパク質ということになる。他方、目的とするタンパク質が抗体のとき、本結合・解離ペプチド－抗体との融合ペプチドにおける構成成分である抗体が目的タンパク質となる。 As a method for controlling the binding / dissociation between the ceramic surface and protein of the present invention, a peptide having reversible binding / dissociating ability to the ceramic surface (hereinafter sometimes referred to as “the present binding / dissociating peptide”), or A method for controlling the binding or dissociation between a ceramic surface and a target protein (or target cell) through a fusion peptide of a peptide and a functional protein by adjusting the concentration of a predetermined metal ion [ Control method I] or a method of controlling the binding or dissociation of the ceramic surface and the fusion peptide of the binding / dissociating peptide and the target protein by adjusting the concentration of a predetermined metal ion [control method II] If it is, it will not restrict | limit in particular, By the control method of this invention, predetermined protein (target protein) on the ceramic surface Or a predetermined cells (target cells) desorption, i.e. can be modified. As the above binding / dissociating peptide, in addition to the peptide of the present invention, screening using a phage library as in BTBP-1 and screening using a peptide rich in basic amino acids as in (KA) 6 Can be found.
Moreover, the protein mentioned above can be used about a functional protein, and this functional protein may become a target protein. For example, in the case of a fusion peptide of this binding / dissociation peptide-ZZ domain of protein A, the target protein is an antibody that binds / dissociates to the ceramic surface via this fusion peptide. -In the case of a fusion peptide with an antibody, the target protein is an antigenic protein that binds to and dissociates from the ceramic surface via this fusion peptide. On the other hand, when the target protein is an antibody, the antibody that is a component in the fusion peptide of this binding / dissociating peptide-antibody is the target protein.
　本発明の制御方法Ｉとして、本結合・解離ペプチド又は融合ペプチドを含む溶液と、セラミックスとを解離用金属イオン非存在下又は結合用金属イオンの存在下に（あるいは、結合用金属イオン濃度を高くして）反応させることにより、セラミックス表面に本結合・解離ペプチド又は融合ペプチドを結合させ、次いで本結合・解離ペプチド又は融合ペプチドと目的タンパク質とを結合させる方法や、目的タンパク質が結合した本結合・解離ペプチド又は融合ペプチドが結合したセラミックスから、解離用金属イオンの存在下（あるいは、解離用金属イオン濃度を高くして）又は結合用金属イオンの非存在下に、目的タンパク質が結合した本結合・解離ペプチド又は融合ペプチドを解離させる方法を例示することができ、具体的には、本結合・解離ペプチドとしてビオチン標識ペプチドを使用するとき、目的タンパク質としてストレプトアビジン結合目的タンパク質を用いる方法や、融合ペプチドとしてプロテインＡのＺＺドメインとの融合ペプチドを使用するとき、目的タンパク質として抗体を用いる方法や、融合ペプチドとしてＢＭＰ融合ペプチドを使用するとき、目的とする細胞をＢＭＰレセプター発現間葉系細胞とする方法を挙げることができる。
また、本発明の制御方法IIとして、目的タンパク質を構成成分とする融合ペプチドを含む溶液と、セラミックスとを解離用金属イオン非存在下又は結合用金属イオンの存在下（あるいは、結合用金属イオン濃度を高くして）に反応させることにより、セラミックス表面に融合ペプチドを結合させる方法や、融合ペプチドが結合したセラミックスから、解離用金属イオンの存在下（あるいは、解離用金属イオン濃度を高くして）又は結合用金属イオンの非存在下に、融合ペプチドを解離させる方法を例示することができる。本発明の制御方法や脱着（修飾）方法により、本発明のペプチド又は融合ペプチドが表面に結合したセラミックスや、目的とするタンパク質や細胞が表面に結合したセラミックス、すなわち本発明の表面修飾セラミックスを得ることができる。 As the control method I of the present invention, a solution containing the present binding / dissociation peptide or fusion peptide and ceramics are present in the absence of dissociating metal ions or in the presence of binding metal ions (or the concentration of binding metal ions is increased). By binding) the binding / dissociation peptide or fusion peptide to the ceramic surface and then binding the binding / dissociation peptide or fusion peptide to the target protein, From the ceramics to which the dissociation peptide or fusion peptide is bound, the target protein is bound to the target protein in the presence of dissociating metal ions (or at a higher concentration of dissociating metal ions) or in the absence of binding metal ions. Examples of the method of dissociating the dissociated peptide or the fusion peptide can be exemplified. When using a biotin-labeled peptide as the release peptide, using a streptavidin-binding target protein as the target protein, using a fusion peptide with the ZZ domain of protein A as the fusion peptide, using an antibody as the target protein, When a BMP fusion peptide is used as the fusion peptide, a method in which the target cell is a BMP receptor-expressing mesenchymal cell can be mentioned.
In addition, as the control method II of the present invention, a solution containing a fusion peptide containing a target protein as a constituent component and ceramics are used in the absence of dissociating metal ions or in the presence of binding metal ions (or the concentration of binding metal ions). The fusion peptide is bound to the surface of the ceramic by the reaction or the presence of the metal ion for dissociation from the ceramic to which the fusion peptide is bound (or the concentration of the metal ion for dissociation is increased). Alternatively, a method of dissociating the fusion peptide in the absence of a binding metal ion can be exemplified. By the control method or desorption (modification) method of the present invention, ceramics in which the peptide or fusion peptide of the present invention is bound to the surface, or ceramics in which the target protein or cell is bound to the surface, that is, the surface-modified ceramics of the present invention are obtained. be able to.
　上記セラミックスとしては、特に制限されるものではないが、好ましくは金属酸化物を主成分とするセラミックス、より好ましくは遷移金属酸化物を主成分とするセラミックスであり、なかでも、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、又はそれらの混合物を主成分とするセラミックス等であることが特に好ましい。より具体的には、上記セラミックスとして、チタン酸化物系（チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化チタン（ＴｉＯ２）など）、ジルコニウム酸化物系（酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）など）、スズ酸化物系（スズ酸バリウム（ＢａＳｎＯ３）など）等を好適に例示することができる。また、上記溶液に含まれる本発明のペプチド又は融合ペプチドの濃度としては、好ましくは０．１μＭ以上、より好ましくは０．５μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上である。発明の修飾方法により、セラミックス表面に結合した本発明のペプチド又は融合ペプチドは、金属イオンにより解離させることができ、上記金属イオンとしては、特に制限されないが、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋等を好例として挙げることができる。上記本発明の修飾方法により表面修飾されたセラミックスは、例えば、歯科インプラント材料などの移植用医療デバイス、分子認識を行うナノデバイスやバイオセンサ、タンパク質精製や細胞単離用の担体などに利用できる他、セラミックスの機械的な特性、電子材料としての機能（圧電性、強誘電性など）、ナノメートルオーダーの微粉末が安価に大量に合成できる等の製造的な利点を活かして、種々の用途に用いることができる。 The ceramic is not particularly limited, but is preferably a ceramic mainly composed of a metal oxide, more preferably a ceramic mainly composed of a transition metal oxide. Among them, titanium oxide, zirconium It is particularly preferable to use ceramics mainly containing an oxide or a mixture thereof. More specifically, examples of the ceramic include titanium oxide (barium titanate (BaTiO 3 ), strontium titanate (SrTiO 3 ), titanium oxide (TiO 2 ), etc.), zirconium oxide (zirconium oxide (ZrO 2 )). )), Tin oxide (barium stannate (BaSnO 3 ), etc.) and the like can be suitably exemplified. In addition, the concentration of the peptide or fusion peptide of the present invention contained in the above solution is preferably 0.1 μM or more, more preferably 0.5 μM or more, and further preferably 1 μM or more. According to the modification method of the present invention, the peptide or fusion peptide of the present invention bonded to the ceramic surface can be dissociated by metal ions, and the metal ions are not particularly limited, but Ba 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Ca 2+ etc. can be mentioned as a good example. Ceramics surface-modified by the above-described modification method of the present invention can be used for, for example, medical devices for transplantation such as dental implant materials, nanodevices and biosensors for molecular recognition, and carriers for protein purification and cell isolation. Taking advantage of manufacturing advantages such as the mechanical properties of ceramics, functions as electronic materials (piezoelectricity, ferroelectricity, etc.) and the ability to synthesize nanometer-order fine powders in large quantities at low cost Can be used.
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
［ファージディスプレイ法によるチタン酸バリウム結合ペプチドの取得］
１．使用したファージライブラリ
　スクリーニングには、Ph.D-12 peptide phage display kit（New England Biolabs社製；以下Ｄ－１２という）及びPh.D-C7C peptide phage display kit (BioLabs社製；以下Ｄ－Ｃ７Ｃという)を用いた。また、同じ製品でも製造ロットによって違う配列の集団となっている可能性があるため、Ｄ－１２については異なる３つのロット（ｌｏｔ３、ｌｏｔ５、ｌｏｔ６）を実験に用いた。Ｄ－１２は、１２残基の直線状ランダムペプチド配列を提示するライブラリであり、Ｄ－Ｃ７Ｃは２つのシステイン間に７つのランダム配列が挿入されているライブラリである。 [Acquisition of barium titanate-binding peptide by phage display method]
1. The phage library used was screened for Ph.D-12 peptide phage display kit (New England Biolabs; hereinafter referred to as D-12) and Ph.D-C7C peptide phage display kit (available from BioLabs; hereinafter referred to as D-C7C). ) Was used. In addition, since there is a possibility that the same product may be a group having a different arrangement depending on the production lot, three different lots (lot 3, lot 5, lot 6) were used for the experiment for D-12. D-12 is a library that presents a 12-residue linear random peptide sequence, and D-C7C is a library in which seven random sequences are inserted between two cysteines.
２．ファージライブラリを用いたスクリーニング
　スクリーニング実験や、ファージの力価(濃度)測定等は、メーカーが提示しているプロコトルに従って行った。以下にその概略を示す。
　ファージを構成するタンパク質のうち、提示ペプチド以外のタンパク質が非特異的にチタン酸バリウム（ＢＴ）に結合することを防ぐため、あらかじめＢＴ表面にウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を吸着させ、ブロッキングを行った。２ｍｇのＢＴ粉末を、２％のＢＳＡを含むＴＢＳ(５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン(トリス)、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液、ｐＨ７．５)１０ｍＬに懸濁した。分散状態にある懸濁液１ｍＬを分取し、遠心分離機によりＢＴ粉末を沈殿させた後、上清を捨て、再び２％ＢＳＡを含むＴＢＳ
１ｍＬで懸濁し３０分間攪拌した。攪拌後、遠心分離でＢＴ粉末を沈殿させて上清を除去し、界面活性剤ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含むＴＢＳ(ＴＢＳＴ)１ｍＬを加えて懸濁する洗浄操作を１回行った。 2. Screening Using Phage Library Screening experiments, phage titer (concentration) measurements, etc. were performed according to the protocol presented by the manufacturer. The outline is shown below.
In order to prevent proteins other than the displayed peptide from binding nonspecifically to barium titanate (BT) among the proteins constituting the phage, bovine serum albumin (BSA) was adsorbed on the BT surface in advance to perform blocking. . 2 mg of BT powder was suspended in 10 mL of TBS containing 2% BSA (50 mM trishydroxymethylaminomethane (Tris), aqueous solution containing 150 mM sodium chloride, pH 7.5). 1 mL of the suspension in a dispersed state is collected, and after BT powder is precipitated by a centrifuge, the supernatant is discarded and TBS containing 2% BSA is again discarded.
Suspended in 1 mL and stirred for 30 minutes. After stirring, BT powder was precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and 1 mL of TBS (TBST) containing 0.1% of surfactant tween 20 was added and suspended once.
　ブロッキング済みのＢＴ粉末懸濁液１ｍＬに、ペプチドファージライブラリ１０μＬを投入し２時間攪拌した。攪拌後、ＴＢＳＴでの洗浄操作を３回行った。遠心分離でＢＴ粉末を沈殿させた後、今度は０．２Ｍグリシン塩酸水溶液（ｐＨ２．２）１ｍＬを加え、１０分間回転攪拌し、ＢＴに結合しているファージを溶出させた。溶出液を遠心してＢＴ粉末を沈殿させた後、上清を回収し、１Ｍのトリス水溶液（ｐＨ９．１）１５０μＬで中和した。
　得られたファージは大腸菌に感染させ増幅させた。ファージの溶出液を対数増殖中のＥＲ２７３８株を含む培地２０ｍＬに添加し、３７℃で４．５時間振盪培養した。その後、培養液を遠心分離し大腸菌を沈殿させ、ファージを含む上清を回収した。増幅したファージのうち約１０１２ｐｆｕ分を、再び、ブロッキング済みのＢＴ粉末に投与し、２時間のインキュベートの後、ＴＢＳＴで洗浄、グリシン塩酸（ｐＨ２．２）で溶出、中和するという一連の実験(パニング)を６回繰り返した。 To 1 mL of the blocked BT powder suspension, 10 μL of a peptide phage library was added and stirred for 2 hours. After stirring, the washing operation with TBST was performed 3 times. After BT powder was precipitated by centrifugation, 1 mL of 0.2 M glycine hydrochloric acid aqueous solution (pH 2.2) was added, and the mixture was stirred for 10 minutes to elute phages bound to BT. The eluate was centrifuged to precipitate BT powder, and then the supernatant was collected and neutralized with 150 μL of 1M Tris aqueous solution (pH 9.1).
The obtained phage was infected with E. coli and amplified. The phage eluate was added to 20 mL of medium containing logarithmically growing ER2738 strain, and cultured with shaking at 37 ° C. for 4.5 hours. Thereafter, the culture solution was centrifuged to precipitate E. coli, and the supernatant containing the phages was collected. About 10 12 pfu of the amplified phage is again administered to the blocked BT powder, incubated for 2 hours, washed with TBST, eluted with glycine hydrochloride (pH 2.2), and neutralized. The experiment (panning) was repeated 6 times.
３．ＢＴ結合ペプチドの取得
　Ｄ－１２ファージライブラリのｌｏｔ５を用いた実験において、４ラウンド目のファージ溶出液に含まれるファージをクローン化し、ランダムにピックアップした２８種類についてＤＮＡ解析を行った。ＤＮＡ解析は、ベックマンコールター社製のシーケンサーＣＥＱ２０００と、試薬DTCS Quick start kitを使用した。実験方法はメーカー提示のプロコトルに従った。この解析結果によると、２８クローンのうち１８が同じ配列を示しており、このクローンをφ４０３Ｎと命名した。そのほかに、２個以上同じ配列を示したクローンが２種類あり、それぞれφ４０４Ｎ、φ４１０Ｎと命名した。これらのクローン化ファージのＢＴへの結合力を調べた結果を図１に示す。結合率とは、溶出して回収されたファージ量を、投入したファージ量で除したものであり、φＭ１３ＫＥとは、ペプチドを提示していない(野生型の)ファージである。φ４０３Ｎは他より際立って高いＢＴへの結合率を示すことが明らかとなった。
　一方、他のライブラリ（Ｄ－１２のｌｏｔ３及びｌｏｔ６、Ｄ－Ｃ７Ｃ）を実験に用いたスクリーニングでは、ＢＴＢＰ－１と同一の配列が取得できた場合もあれば、異なる配列が取得された場合もあった。これら他のライブラリーによるスクリーニングの結果の詳細に関しては、参考例として後述する。 3. Acquisition of BT-binding peptide In an experiment using lot 12 of the D-12 phage library, the phage contained in the 4th round phage eluate was cloned, and DNA analysis was performed on 28 types randomly picked up. For DNA analysis, a sequencer CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter and a reagent DTCS Quick start kit were used. The experimental method followed the manufacturer's protocol. According to this analysis result, 18 out of 28 clones showed the same sequence, and this clone was named φ403N. In addition, there were two types of clones showing the same sequence in two or more, and they were named φ404N and φ410N, respectively. The results of examining the binding power of these cloned phages to BT are shown in FIG. The binding rate is the amount of phage recovered after elution and divided by the amount of input phage. ΦM13KE is a (wild-type) phage that does not display a peptide. It has been clarified that φ403N shows a significantly higher binding rate to BT than others.
On the other hand, in screening using other libraries (D-12 lot3 and lot6, D-C7C), the same sequence as BTBP-1 may be obtained, or a different sequence may be obtained. there were. Details of the results of screening with these other libraries will be described later as reference examples.
［ＢＴ結合クローンφ４０３Ｎのペプチド配列解析］
１．φ４０３ＮのＤＮＡ及びアミノ酸配列の決定　実施例１でＤ－１２ライブラリより取得されたファージクローンφ４０３Ｎ、φ４０４Ｎ及びφ４１０Ｎについてファージの持つＤＮＡを解析した。それぞれのその提示ペプチドのアミノ酸配列は、φ４０３Ｎは配列番号１に示される５７残基のアミノ酸配列、φ４０４Ｎは配列番号２に示される１１残基のアミノ酸配列、φ４１０Ｎは配列番号３に示される１２残基のアミノ配列であることが明らかとなった。Ｄ－１２ライブラリは１２残基のペプチドを提示するよう設計されたものであるため、このφ４０３Ｎは、何らかの理由で長い配列が挿入されてできたものである。図２にこの理由についての仮説を示す。ファージライブラリは、ファージの先端のタンパク質ｇ３ｐ(シグナル配列の部分は、ファージが形成される際に切り離される)をコードするＤＮＡに、ランダムなペプチドをコードするランダムなＤＮＡ配列を挿入することで形成される。図２の通常の配列では、Ｘで表されるランダムな１２残基のペプチドがｇ３ｐタンパク質のＮ末端側にＧＧＧＳという４残基のアミノ酸のリンカーを介して接続されていることを示している。しかし、今回取得されてきたφ４０３Ｎのアミノ酸配列は、図２に示すように、ランダムなペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が３つタンデムに連なって挿入されている。これはファージライブラリの製造上、ある一定の確率で起こりえる現象であると思われる。このため、ＤＮＡ配列上は、シグナル配列とリンカーの間の５７残基がｇ３ｐの末端に提示されていることになる。 [Peptide sequence analysis of BT binding clone φ403N]
1. Determination of DNA and amino acid sequence of φ403N Phage clones φ403N, φ404N and φ410N obtained from the D-12 library in Example 1 were analyzed for DNA possessed by the phage. The amino acid sequence of each of the presented peptides is as follows: φ403N is the 57-residue amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, φ404N is the 11-residue amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, φ410N is the 12 residues shown in SEQ ID NO: 3 The amino sequence of the group was revealed. Since the D-12 library was designed to present a 12-residue peptide, this φ403N was created by inserting a long sequence for some reason. FIG. 2 shows a hypothesis about this reason. The phage library is formed by inserting a random DNA sequence encoding a random peptide into DNA encoding the protein g3p at the tip of the phage (a portion of the signal sequence is cleaved when the phage is formed). The The normal sequence in FIG. 2 shows that a random 12-residue peptide represented by X is connected to the N-terminal side of the g3p protein via a 4-residue amino acid linker called GGGS. However, in the φ403N amino acid sequence obtained this time, as shown in FIG. 2, three DNA fragments encoding random peptide sequences are inserted in tandem. This seems to be a phenomenon that can occur with a certain probability in the production of phage libraries. For this reason, on the DNA sequence, 57 residues between the signal sequence and the linker are presented at the end of g3p.
２．φ４０３Ｎ提示ペプチドのＢＴ結合領域の決定
　このＤＮＡ配列から予想される５７残基のペプチドが、実際に発現しているかどうかを確認するため、ファージを構成するタンパク質をＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動して、想定分子量付近のバンドを切り取り、アミノ酸配列分析した。この結果では、５７残基のうちＮ末端のＡＶＧ～１６残基、および、ＡＶＧ～３７残基が削られたタンパク質が検出された。しかし、これらのうち、どちらがＢＴに強く結合しているかは区別できないし、アミノ酸配列分析では検出できないほど微量のタンパク質が結合に寄与していることも否定できない。また、ペプチド配列が５７残基と長いと応用上使用しにくいため、ペプチド配列のうちＢＴとの結合に寄与している部分の配列を同定して絞り込む必要がある。φ４０３Ｎのファージをベースに遺伝子を組み替え、図３に示すようなペプチド配列を持つファージ９種類を作製した。それぞれのファージクローンのアミノ酸配列は、以下の配列番号と対応する。
φ４０３Ｎ：配列番号１
φ１５８１：配列番号４
φ１５８３：配列番号５
φ１５９７：配列番号６
φ１５９９：配列番号７
φ１６０１：配列番号８
φ１６０３：配列番号９
φ１６０５：配列番号１０
φ１６１１：配列番号１１
φ１６１２：配列番号１２ 2. Determination of BT binding region of φ403N-displayed peptide To confirm whether the 57-residue peptide predicted from this DNA sequence is actually expressed, the protein constituting the phage was subjected to SDS acrylamide gel electrophoresis and assumed. A band around the molecular weight was cut out and analyzed for amino acid sequence. In this result, a protein in which N-terminal AVG-16 residues and AVG-37 residues were deleted from 57 residues was detected. However, it cannot be distinguished which of these is strongly bound to BT, and it cannot be denied that a trace amount of protein contributes to the binding that cannot be detected by amino acid sequence analysis. Moreover, since a peptide sequence as long as 57 residues is difficult to use in application, it is necessary to identify and narrow down the sequence of the peptide sequence that contributes to the binding to BT. Genes were recombined based on φ403N phages, and nine types of phages having peptide sequences as shown in FIG. 3 were prepared. The amino acid sequence of each phage clone corresponds to the following SEQ ID NO:
φ403N: SEQ ID NO: 1
φ1581: SEQ ID NO: 4
φ1583: SEQ ID NO: 5
φ1597: SEQ ID NO: 6
φ1599: SEQ ID NO: 7
φ1601: SEQ ID NO: 8
φ1603: SEQ ID NO: 9
φ1605: SEQ ID NO: 10
φ1611: SEQ ID NO: 11
φ1612: SEQ ID NO: 12
　これらの遺伝子を大腸菌に導入してファージを形成させ、それぞれのＢＴ結合能をしらべた。結合実験には、Ｓｉ基板上に全面成膜されたＢＴスパッタ薄膜上にＡｕとＴｉ薄膜がパターニングされているチップを用いた（図４、左上パネル）。φ１５８１、φ１５８３、φ１５９７、及びφ１６０１は、ファージが形成されないか、ＤＮＡに意図しない変異が入ったファージしか得られなかった。このため実験には、φ１５９９、φ１６０３、φ１６０５、φ１６１１、及びφ１６１２を用いた。実験は次の手順で行った。チップを２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴでブロッキングし、約１０１０ｐｆｕ／ｍＬのファージを含むＴＢＳＴ中で３０ｍｉｎインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。さらに、anti-fd bacteriophagebiotin
conjugate(Sigma-Aldrich社製)を含むＴＢＳＴ中で１５分間インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗浄した。続いて、ストレプトアビジンつき蛍光体(Qdot（登録商標）655 streptavidin conjugate、Invitrogen社製)を含むＴＢＳＴで１５分間インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗浄した。このチップを水溶液に浸した状態で顕微鏡で蛍光観察した。その結果、図４に示すように、φ１６１１が２２残基という短い配列でもＢＴへ特異的に結合すること分かった。このφ１６１１の提示ペプチドをＢＴＢＰ－１(ＡＥＰＨＰＳＡＡＨＫＫＫＱＳＳＰＫＳＥＮＲＫ：配列番号１１)と命名した。 These genes were introduced into Escherichia coli to form phages, and each BT binding ability was examined. In the bonding experiment, a chip in which Au and Ti thin films were patterned on a BT sputtered thin film formed on the entire surface of a Si substrate was used (FIG. 4, upper left panel). As for φ1581, φ1583, φ1597, and φ1601, no phages were formed or only phages with unintended mutations in DNA were obtained. Therefore, φ1599, φ1603, φ1605, φ1611, and φ1612 were used in the experiment. The experiment was performed according to the following procedure. The chip was blocked with TBST containing 2% BSA, incubated for 30 min in TBST containing about 10 10 pfu / mL of phage, and washed with TBST. In addition, anti-fd bacteriophagebiotin
After incubation for 15 minutes in TBST containing conjugate (Sigma-Aldrich), the plate was washed with TBST. Subsequently, the plate was incubated for 15 minutes with TBST containing a streptavidin-containing phosphor (Qdot (registered trademark) 655 streptavidin conjugate, manufactured by Invitrogen), and then washed with TBST. The chip was immersed in an aqueous solution and observed with a microscope. As a result, as shown in FIG. 4, it was found that φ1611 specifically binds to BT even with a short sequence of 22 residues. This presented peptide of φ1611 was named BTBP-1 (AEPHPSAAHKKKQSPPKSNRK: SEQ ID NO: 11).
［ＢＴＢＰ－１ペプチドのＢＴ結合能の確認］
　これまでの実験により、ＢＴＢＰ－１はファージに提示された状態で結合能力を持つことは確認されたので、次に、化学合成によって作製したＢＴＢＰ－１単独でＢＴ結合能力を持つかどうかを確認する実験を行った。完全長ＢＴＢＰ－１（配列番号１１）の合成ペプチドを作製するとともに、ＢＴＢＰ－１のＮ末端側から１８番目から２２番目までのアミノ酸を削ったペプチドΔ(１８－２２)（配列番号１３）、１番目から５番目のアミノ酸を削ったペプチドΔ(１－５)（配列番号１４）、及び両末端の５残基のアミノ酸を削ったペプチドΔ(１－５、１８－２２) （配列番号１５）の３つ変異ペプチドを作製した。実験には、実施例２（図４）と同様のチップを用い、Ｎ末端側がビオチン分子で修飾された合成ペプチドを使用した。実験手順としては、まずチップを２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴでブロッキングし、４０μＭのビオチン化ペプチドを含むＴＢＳＴで１５分間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した後、ストレプトアビジンつき蛍光体を含むＴＢＳＴで１５分間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。このチップを水溶液に浸した状態で顕微鏡で蛍光観察した。結果を図５に示す。この結果から、ＢＴＢＰ－１単独の状態でもＢＴに結合すること、１－５番目を削った場合（Δ（１－５））でもＢＴに結合することが確認できた。なお、１８－２２番目を削った場合に大きく結合力が低下しているが、ここには塩基性アミノ酸(Ｒ、Ｋ)が２つ含まれている。このため、結合には塩基性のアミノ酸が重要であると推測できる。 [Confirmation of BT binding ability of BTBP-1 peptide]
As a result of previous experiments, it was confirmed that BTBP-1 has binding ability in the state displayed on the phage. Next, it was confirmed whether BTBP-1 produced by chemical synthesis alone had BT binding ability. An experiment was conducted. A synthetic peptide of full-length BTBP-1 (SEQ ID NO: 11) was prepared, and a peptide Δ (18-22) (SEQ ID NO: 13) in which amino acids from the 18th to 22nd from the N-terminal side of BTBP-1 were deleted, Peptide Δ (1-5) from which the first to fifth amino acids were deleted (SEQ ID NO: 14), and peptide Δ (1-5, 18-22) from which amino acids at both ends were deleted (SEQ ID NO: 15) ) Three mutant peptides were prepared. In the experiment, the same chip as in Example 2 (FIG. 4) was used, and a synthetic peptide in which the N-terminal side was modified with a biotin molecule was used. As an experimental procedure, the chip was first blocked with TBST containing 2% BSA, incubated with TBST containing 40 μM biotinylated peptide for 15 minutes, washed with TBST, and then incubated with TBST containing a fluorophore with streptavidin for 15 minutes. And washed with TBST. The chip was immersed in an aqueous solution and observed with a microscope. The results are shown in FIG. From this result, it was confirmed that even when BTBP-1 alone was bound to BT, it was bound to BT even when the 1-5th was removed (Δ (1-5)). Incidentally, when the 18th to 22nd positions are cut, the binding force is greatly reduced, but here, two basic amino acids (R, K) are contained. For this reason, it can be assumed that basic amino acids are important for binding.
［ＢＴＢＰ－１とプロテインＡとの融合タンパク質の作製］
　プロテインＡ（Protein A）は抗体と結合する能力があるタンパク質である。このタンパクの抗体と結合する部位(Ｚドメイン)２つから構成されるタンパク質とＢＴＢＰ－１の融合タンパク質（ＺＺ＋ＢＴＢＰ－１）を作製し、ＢＴへの結合能力と抗体の捕捉能力を確認する実験を行った。実験手順は、実施例２と同じチップを、２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴでブロッキングした後、融合タンパク質（ＺＺ＋ＢＴＢＰ－１）を０．５μＭを含むＴＢＳＴをインキュベートさせた。ＴＢＳＴで洗浄した後、抗体(anti-fd bacteriophagebiotinconjugate)を含むＴＢＳＴでインキュベートし、さらにＴＢＳＴで洗浄した。最後に、ストレプトアビジンつき蛍光体を含むＴＢＳＴで１５分間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄後、純水で洗浄し、チップを乾燥状態で観察した。結果を図６に示す。ＢＴＢＰ－１とＺＺの融合タンパク（ＺＺ＋ＢＴＢＰ－１）が、ＢＴ表面に吸着し、さらに抗体を捕捉していることが確認された。一方、ＺＺのみ（ＢＴＢＰ－１を融合していないＺＺ）やいずれのタンパクを含まないＴＢＳＴ中でインキュベートした場合には、ＢＴへの抗体の結合は融合タンパクに比べて小さかった。 [Production of fusion protein of BTBP-1 and protein A]
Protein A is a protein capable of binding to an antibody. An experiment was conducted to create a fusion protein (ZZ + BTBP-1) of a protein composed of two sites (Z domain) that binds to the antibody of this protein and BTBP-1, and confirm the binding ability to BT and the ability to capture the antibody. went. In the experimental procedure, the same chip as in Example 2 was blocked with TBST containing 2% BSA, and then TBST containing 0.5 μM of the fusion protein (ZZ + BTBP-1) was incubated. After washing with TBST, the plate was incubated with TBST containing an antibody (anti-fd bacteriophagebiotinconjugate), and further washed with TBST. Finally, it was incubated for 15 minutes in TBST containing a phosphor with streptavidin, washed with TBST, then washed with pure water, and the chip was observed in a dry state. The results are shown in FIG. It was confirmed that the fusion protein of BTBP-1 and ZZ (ZZ + BTBP-1) was adsorbed on the BT surface and further captured the antibody. On the other hand, when incubated in TBST alone (ZZ not fused with BTBP-1) or in any protein-free TBST, antibody binding to BT was small compared to the fusion protein.
［ＢＴＢＰ－１の配列特異性］
　ＢＴＢＰ－１の配列の特異性を調査するため、いくつかの種類のペプチドを合成し、それらの結合能力を調査した。ＢＴＢＰ－１の２つのグルタミン酸(Ｅ)をグルタミン(Ｑ)に置き換えたペプチドＢＴＢＰ－１(Ｅ→Ｑ)（配列番号１６）、（ＤＫ）６（配列番号１７）、（ＤＡ）６（配列番号１８）、及び（ＫＡ）６（配列番号１９）の４種類のペプチドを合成し、それぞれのＮ末端側をビオチン分子で修飾した。実施例２と同じチップを、２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴでブロッキングし、１μＭのビオチン化ペプチドを含むＴＢＳＴで１５分間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、ストレプトアビジンつき蛍光体を含むＴＢＳＴで１５分間インキュベートし、さらにＴＢＳＴで洗浄した。最後に純水で洗浄し、チップを乾燥状態で観察した。結果を図７に示す。ＢＴＢＰ－１(Ｅ→Ｑ)は、ＢＴＢＰ－１と同様に結合したことから、ＢＴとの結合に２つの負電荷は重要でないことが分かった。また、リジン(Ｋ)とアラニン(Ａ)が交互に６個ずつ並んだ配列（ＫＡ）６もＢＴに結合することが明らかとなった。このことから、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸よりも多く含まれることが結合に重要であることが示唆された。ただし、動的光散乱測定により（ＫＡ）６、（ＤＡ）６、（ＤＫ）６のペプチドの粒子径(分子サイズ)を計測してみたところ、１００ｎｍ程度のクラスターとして存在していることが分かった（粒子系はバッファーに依存して変化する）。これにより、（ＫＡ）６については多価提示と同様な効果が発生し、結合能力が増強されている可能性もある。 [Sequence specificity of BTBP-1]
In order to investigate the specificity of the BTBP-1 sequence, several types of peptides were synthesized and their binding ability was investigated. Peptides BTBP-1 (E → Q) (SEQ ID NO: 16), (DK) 6 (SEQ ID NO: 17), (DA) 6 (SEQ ID NO: 6 ) in which two glutamic acids (E) of BTBP-1 are replaced with glutamine (Q) 18) and (KA) 6 (SEQ ID NO: 19) were synthesized, and each N-terminal side was modified with a biotin molecule. The same chip as in Example 2 was blocked with TBST containing 2% BSA and incubated with TBST containing 1 μM biotinylated peptide for 15 minutes. After washing with TBST, the plate was incubated for 15 minutes with TBST containing a fluorescent substance with streptavidin, and further washed with TBST. Finally, it was washed with pure water, and the chip was observed in a dry state. The results are shown in FIG. Since BTBP-1 (E → Q) was bound in the same manner as BTBP-1, it was found that the two negative charges were not important for binding to BT. It was also revealed that the sequence (KA) 6 in which 6 lysine (K) and 6 alanine (A) are arranged alternately binds to BT. From this, it was suggested that it is important for a coupling | bonding that basic amino acid is contained more than acidic amino acid. However, when the particle diameter (molecular size) of the peptides (KA) 6 , (DA) 6 , and (DK) 6 was measured by dynamic light scattering measurement, it was found that they existed as clusters of about 100 nm. (The particle system varies depending on the buffer). Thereby, about (KA) 6 , the effect similar to multivalent presentation generate | occur | produces and there exists a possibility that the binding ability is reinforced.
［金属イオンによるＢＴ結合ペプチドへの阻害作用］
　ＢＴＢＰ－１のＢＴ結合に及ぼす、水溶液中の金属イオンの影響を検討した。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋の各イオンが１ｍＭの濃度で含まれる溶液中でＢＴＢＰ－１及び（ＫＡ）６ペプチドをＢＴと結合させた。用いたチップは実施例２と同じもので、ストレプトアビジンつきの蛍光体でラベルしたものを蛍光顕微鏡で観察した。その蛍光の強さを数値化して表した結果を図８に示す。Ｂａ２＋により、蛍光強度が落ちており、ＢＴＢＰ－１及び（ＫＡ）６ペプチドとＢＴとの結合を阻害していることが明らかとなった。また、ＢＴＢＰ－１と（ＫＡ）６では、Ｎｉ２＋又はＺｎ２＋を投入したときの挙動が異なっており、ここにＢＴＢＰ‐１の配列特異性が現れている。 [Inhibition of BT binding peptide by metal ions]
The effect of metal ions in aqueous solution on BTBP-1 BT binding was investigated. BTBP-1 and (KA) 6 peptides were combined with BT in a solution containing Mg 2+ , Ca 2+ , Ba 2+ , Ni 2+ , and Zn 2+ ions at a concentration of 1 mM. The chip used was the same as in Example 2, and the one labeled with a phosphor with streptavidin was observed with a fluorescence microscope. The result of quantifying the intensity of the fluorescence is shown in FIG. The fluorescence intensity decreased due to Ba 2+ , and it was revealed that the binding of BTBP-1 and (KA) 6 peptide to BT was inhibited. Further, BTBP-1 and (KA) 6 have different behaviors when Ni 2+ or Zn 2+ is added, and the sequence specificity of BTBP-1 appears here.
　さらに、上記のような金属イオンによる結合阻害作用により、既に結合しているペプチドを、金属イオンを含む溶液によって解離できるかを調査した。図９の「解離処理あり」は、ＢＴＢＰ－１を結合させた後、１ｍＭのＢａＣｌ２を含むＴＢＳＴに１５分間浸漬した後、ストレプトアビジンつき蛍光体をつけたものである。「解離処理なし」は、ペプチドを結合させた後、Ｂａ２＋を含まない液に１５分間浸した後、ストレプトアビジンつき蛍光体をつけたものである。この結果から、ペプチドはＢａ２＋を含む液に浸すことによって解離を促進できることが分かった。なお、チップは実施例２のものとは異なり、光っている部分がＢＴの領域で、その他の部分はＴｉである。また、図１０は、同じチップにペプチドを結合させ、先にストレプトアビジン付き蛍光体を結合させて一旦蛍光顕微鏡で観察した後、再び１０ｍＭのＢａＣｌ２を含むＴＢＳＴ中に浸して解離するかどうかを調べた結果である。ペプチドにストレプトアビジンが結合することによって解離のスピードは低下しているが、Ｂａ２＋による解離の促進効果は明らかに確認できる。 Furthermore, it was investigated whether the already bound peptide can be dissociated by a solution containing metal ions due to the binding inhibitory action by metal ions as described above. “With dissociation treatment” in FIG. 9 is obtained by binding BTBP-1 and immersing in TBST containing 1 mM BaCl 2 for 15 minutes, and then attaching a phosphor with streptavidin. “No dissociation treatment” is obtained by binding a peptide, immersing it in a solution not containing Ba 2+ for 15 minutes, and attaching a fluorescent substance with streptavidin. From this result, it was found that dissociation can be promoted by immersing the peptide in a solution containing Ba 2+ . Note that the chip is different from that of Example 2 in that the shining part is a BT region and the other part is Ti. FIG. 10 shows whether the peptide is bound to the same chip, the fluorescent substance with streptavidin is bound first, and once observed with a fluorescence microscope, it is then immersed again in TBST containing 10 mM BaCl 2 to dissociate. It is the result of investigation. Although the speed of dissociation decreases due to the binding of streptavidin to the peptide, the effect of promoting dissociation by Ba 2+ can be clearly confirmed.
［ペプチド濃度の結合量に及ぼす影響］
　ＢＴＢＰ－１とＢＴとの結合におけるペプチド濃度の影響を調査した。ＢＴの粉末(粒径１μｍ弱)１０ｍｇを用意し、１～１６μＭのＢＴＢＰ－１を含む１ｍＬのＨＢＳＴ溶液（５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）と混合し、２時間回転攪拌した。その後、遠心分離で粉末を沈殿させ、上清のペプチド濃度を測定した。濃度の測定は、アミノ基と反応して蛍光を発する試薬(ＣＢＱＣＡ、invitrogen社製)をペプチドと反応させ、蛍光分光測定計(FP-6500、日本分光社製)で測定した。ＢＴと混合していない８μＭのＢＴＢＰ－１溶液も合わせて測定した。また、ＢＴは水溶液中に置くと、最表面に存在するＢａ２＋が溶出することが知られている。これまでのようなチップを用いた実験では表面積が小さいために溶出するＢａ２＋の量も少なく問題はなかったが、今回の実験では溶液中のＢａ２＋イオンの量は無視できないレベルになる。そこで、Ｂａ２＋を除去するためＳＯ４ ２－を加えてＢａＳＯ４として沈殿させることにした。ＨＢＳＴに対して、２ｍＭのＮａ２ＳＯ４を加えた実験を合わせて行った。なお、ＢＴには若干の光触媒作用がある可能性がり、ペプチドや界面活性剤が分解される恐れがあるので、２時間の回転攪拌は遮光した状態で行っている。結果を図１１に示す。まず、硫酸イオンを添加しないと、Ｂａ２＋の影響で結合がかなり阻害されていることが分かる。硫酸イオンを添加した状態では、０．１μＭ程度の低い値から立ち上がりが見られ、３μＭからは濃度依存的な結合量の増加が確認された。 [Effect of peptide concentration on the amount of binding]
The effect of peptide concentration on the binding of BTBP-1 and BT was investigated. Prepare 10 mg of BT powder (particle size less than 1 μm) and prepare 1 mL of HBST solution (50 mM) containing 1-16 μM BTBP-1.
HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% tween 20), and stirred with rotation for 2 hours. Thereafter, the powder was precipitated by centrifugation, and the peptide concentration of the supernatant was measured. The concentration was measured with a fluorescence spectrometer (FP-6500, manufactured by JASCO Corporation) after reacting a reagent (CBQCA, manufactured by Invitrogen) that reacts with an amino group to emit fluorescence. An 8 μM BTBP-1 solution not mixed with BT was also measured. In addition, it is known that when BT is placed in an aqueous solution, Ba 2+ present on the outermost surface is eluted. In experiments using chips as described above, there was no problem because the amount of Ba 2+ eluted was small because the surface area was small, but in this experiment, the amount of Ba 2+ ions in the solution was at a level that cannot be ignored. Therefore, in order to remove Ba 2+ , SO 4 2− was added to precipitate as BaSO 4 . An experiment was performed in which 2 mM Na 2 SO 4 was added to HBST. In addition, since BT may have a slight photocatalytic action, and there is a possibility that peptides and surfactants may be decomposed, the rotation stirring for 2 hours is performed in a light-shielded state. The results are shown in FIG. First, it can be seen that the binding is considerably inhibited by the influence of Ba 2+ when sulfate ions are not added. In the state where sulfate ions were added, a rise was observed from a low value of about 0.1 μM, and a concentration-dependent increase in binding amount was confirmed from 3 μM.
［ペプチドの多価提示］
　１分子のタンパク質に複数のペプチドを提示させることで、タンパク質の無機材料(セラミックス)に対する結合力を向上させることができるかどうかについて検討した。１０ｎＭのストレプトアビジン付きの蛍光体(Qdot、Invitorogen社製)と２００ｎＭのビオチン標識ＢＴＢＰ－１を予め混合し、先にビオチン－アビジン複合体の形成させた。ストレプトアビジン付きの蛍光体は１粒子に対して、４量体を形成するストレプトアビジン分子が複数結合している。このため、１粒子のQdotに対して十数個～数十個程度のペプチドが提示されていると考えられる。この複合体をチップに結合させた結果を図１２に示す。図１２（ａ）に示すように、Qdotの濃度が１０ｎＭと薄くてもチップ上での結合が確認することができた。一方（ｂ）は、ペプチド２００ｎＭをチップに対して予め結合させておき、その後、ストレプトアビジン付きの蛍光体でラベルしたものである。この場合、（ａ）に比べるとペプチド濃度が同じにも関わらず結合量は（ａ）よりも極端に小さかった。すなわち、タンパク質の固相化にあたり、先にペプチドを無機材料に対して結合させた後、ビオチンアビジン等の結合を利用して固相化する場合は、ペプチドの濃度を０．１～１μＭ程度以上にする必要があるが、タンパク質に先にペプチドを複数結合しておき(手法は化学結合でもビオチン－アビジンでもよい)それを固相化する場合には、タンパク質濃度は１０ｎＭ程度でも結合させることが可能であることが分かった。どちらの方法を適用するかは、アプリケーションによって異なると考えられる。 [Multivalent presentation of peptides]
We examined whether the binding force of proteins to inorganic materials (ceramics) can be improved by presenting multiple peptides to one molecule of protein. A phosphor with 10 nM streptavidin (Qdot, manufactured by Invitorogen) and 200 nM biotin-labeled BTBP-1 were mixed in advance to form a biotin-avidin complex first. In the phosphor with streptavidin, a plurality of streptavidin molecules forming a tetramer are bound to one particle. For this reason, it is considered that about 10 to several tens of peptides are presented for one Qdot. The result of binding this complex to the chip is shown in FIG. As shown in FIG. 12A, the binding on the chip could be confirmed even when the Qdot concentration was as thin as 10 nM. On the other hand, in (b), peptide 200 nM was previously bound to the chip, and then labeled with a fluorescent substance with streptavidin. In this case, compared with (a), the amount of binding was extremely smaller than (a) despite the same peptide concentration. That is, when solidifying a protein, when the peptide is first bound to an inorganic material and then solidified using a bond such as biotin avidin, the peptide concentration is about 0.1 to 1 μM or more. However, when a plurality of peptides are bound to the protein in advance (the method may be chemical binding or biotin-avidin), the protein may be bound even at a protein concentration of about 10 nM. I found it possible. Which method is applied may vary depending on the application.
［結合の阻害に必要な金属イオンの濃度］
　結合の阻害に必要な金属イオンの濃度を検討した。１μＭのＢＴＢＰ－１溶液に、ＢａＣｌ２を０、０．０３、０．１、０．３、１．０ｍＭとなるように加え、チップを浸し、ストレプトアビジン付き蛍光体でラベルし、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光強度とバリウム濃度の関係を図１３に示す。結合の阻害には３００μＭ程度の濃度が必要であることが分かった。ただし、ペプチドの濃度、結合させたい無機材料の表面積によっては、この値は変化する可能性がある。 [Concentration of metal ions required for binding inhibition]
The concentration of metal ions necessary for binding inhibition was examined. BaCl 2 is added to 1 μM BTBP-1 solution to 0, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 mM, the chip is immersed, labeled with a streptavidin-containing phosphor, and fluorescent microscope is used. Observed. The relationship between the fluorescence intensity and the barium concentration is shown in FIG. It was found that a concentration of about 300 μM was necessary for inhibition of binding. However, this value may vary depending on the peptide concentration and the surface area of the inorganic material to be bound.
［他のセラミックス表面への結合］
　これまでの実験結果により、ＢＴＢＰ－１と（ＫＡ）６は、Ａｕ等と比較してＢＴに優先的に結合することが示された。次に、ＢＴ以外のセラミックス材料(ＳｒＴｉＯ３、ＴｉＯ２、ＢａＳｎＯ３、ＺｒＯ２)に対する結合について調査した。各種セラミックスの粉末(粒径１μｍ弱)１０ｍｇを用意し、８μＭのＢＴＢＰ－１又は（ＫＡ）６を含むＨＢＳＴ溶液と混合し、２時間回転攪拌した。その後、遠心分離で粉末を沈殿させ、上清のペプチド濃度を測定した。濃度の測定は、ペプチドをアミノ基と反応して蛍光を発する試薬(CBQCA、Invitrogen社製)と反応させ、蛍光分光測定計(FP-6500、日本分光社製)で測定した。セラミックスと混合していない８μＭ濃度のペプチド溶液も合わせて測定した。
　また、同時に、Ｂａ２＋の影響についても検討するため、ＳｒＴｉＯ３(比表面積４．３４ｍ２／ｇ)、ＴｉＯ２(比表面積２．７５ｍ２／ｇ)、ＺｒＯ２(比表面積２１．２ｍ２／ｇ)に対しては、ペプチド溶液に１ｍＭのＢａＣｌ２を添加し、その効果を見た。ＢａＳｎＯ３(比表面積２．１１ｍ２／ｇ)については自身からＢａ２＋が溶出し、それだけで４．２ｍＭ程度の濃度に達していたため、Ｎａ２ＳＯ４を２ｍＭおよび１０ｍＭ添加し、ＢａＳＯ４の形でＢａ２＋を除去し、その影響を見た。ＢａＴｉＯ３(比表面積３．４３ｍ２／ｇ)については、既出のデータ(吸着量－平衡濃度グラフ)の再掲であるが、溶出したＢａ２＋の濃度は０．５ｍＭ程度であり、添加したＮａ２ＳＯ４は２ｍＭである。これらの実験の結果を図１４に示す。ＢＴＢＰ－１は、（ＫＡ）６と比較して、ＺｒＯ２への結合量が４倍、ＴｉＯ２への結合量が２倍ほど高かった。また、各材料により程度の差はあるがＢａ２＋イオンの結合阻害効果は認められた。
　ＢＴＢＰ－１のＢａＳｎＯ３への結合量はＮａ２ＳＯ４を添加することによるＢａ２＋イオン除去によっても大きくは増加しなかった。（ＫＡ）６のＢａＳｎＯ３への結合量はＮａ２ＳＯ４を添加することによって増加した。このように、金属イオンの添加効果は材料によって一様ではないので、金属イオンはペプチドに直接作用する可能性のほか、材料表面の方に結合することで、ペプチドの吸着挙動に影響を与えている可能性も示唆された。 [Bonding to other ceramic surfaces]
The experimental results thus far indicate that BTBP-1 and (KA) 6 bind preferentially to BT compared to Au or the like. Next, the bonding to ceramic materials other than BT (SrTiO 3 , TiO 2 , BaSnO 3 , ZrO 2 ) was investigated. 10 mg of various ceramic powders (particle size of less than 1 μm) were prepared, mixed with an HBST solution containing 8 μM BTBP-1 or (KA) 6 , and rotated and stirred for 2 hours. Thereafter, the powder was precipitated by centrifugation, and the peptide concentration of the supernatant was measured. The concentration was measured by reacting the peptide with an amino group and reacting with a reagent that emits fluorescence (CBQCA, manufactured by Invitrogen) and measuring with a fluorescence spectrometer (FP-6500, manufactured by JASCO). An 8 μM concentration peptide solution not mixed with ceramics was also measured.
At the same time, in order to consider the effect of Ba 2+, SrTiO 3 (specific surface area 4.34m 2 / g), TiO 2 ( specific surface area 2.75m 2 / g), ZrO 2 ( specific surface area 21.2m 2 / For g), 1 mM BaCl 2 was added to the peptide solution and the effect was observed. As for BaSnO 3 (specific surface area 2.11 m 2 / g), Ba 2+ eluted from itself and reached a concentration of about 4.2 mM by itself, so that Na 2 SO 4 was added at 2 mM and 10 mM to form BaSO 4 To remove Ba 2+ and see the effect. Regarding BaTiO 3 (specific surface area: 3.43 m 2 / g), the previously presented data (adsorption amount-equilibrium concentration graph) is shown again, but the concentration of eluted Ba 2+ is about 0.5 mM, and added Na 2 SO 4 is 2 mM. The results of these experiments are shown in FIG. BTBP-1 had a 4-fold higher binding amount to ZrO 2 and a 2-fold higher binding amount to TiO 2 than (KA) 6 . In addition, the Ba 2+ ion binding inhibitory effect was recognized to some extent depending on the material.
The amount of binding of BTBP-1 to BaSnO 3 was not greatly increased even by removing Ba 2+ ions by adding Na 2 SO 4 . The amount of (KA) 6 bound to BaSnO 3 was increased by adding Na 2 SO 4 . In this way, the effect of metal ion addition is not uniform depending on the material. In addition to the possibility that the metal ion directly acts on the peptide, binding to the surface of the material affects the adsorption behavior of the peptide. It was also suggested that there is a possibility.
［参考例１：他のライブラリからのスクリーニング結果］
　実施例１において、Ｄ－１２ファージライブラリのｌｏｔ５から、ＢＴ結合ファージクローンのスクリーニングに成功した。一方、その他のライブラリ（Ｄ－１２のｌｏｔ３及びｌｏｔ６、Ｄ－Ｃ７Ｃ）からは、ＢＴＢＰ－１と同一の配列が取得できた場合もあれば、異なる配列が取得された場合もあった。以下にその詳細を示す。実施例１に記載の方法で、スクリーニングを行い、得られたファージをクローン化した。それぞれの配列を提示したファージの結合率を図１５に示す。末尾のＳはＤ－１２ライブラリのｌｏｔ６、ＴはＤ－１２ライブラリのｌｏｔ３、ＣはＤ－Ｃ７Ｃライブラリから得られたものであることを示す。Ｌｏｔ６では、φ４０３Ｎと同じ配列のファージも同時にスクリーニングされていたが（図１５では示していない）、ｌｏｔ３ではφ４０３Ｎと同じものはスクリーニングされなかった。 [Reference Example 1: Screening results from other libraries]
In Example 1, the BT-binding phage clone was successfully screened from lot5 of the D-12 phage library. On the other hand, from other libraries (D-12 lot3 and lot6, D-C7C), the same sequence as BTBP-1 could be obtained or a different sequence was obtained. The details are shown below. Screening was performed by the method described in Example 1, and the obtained phage was cloned. FIG. 15 shows the binding rates of the phages displaying the respective sequences. S at the end indicates that it is obtained from lot6 of the D-12 library, T is obtained from lot3 of the D-12 library, and C is obtained from the D-C7C library. In Lot6, phages having the same sequence as φ403N were simultaneously screened (not shown in FIG. 15), but in Lot3, the same phage as φ403N was not screened.
　各アミノ酸配列を、図１６及び配列番号２０～２６に示す。φ４１１Ｓ、φ４２１Ｓは正常に１２残基のペプチドを提示していたが、ＢＴへの結合率は低かった。φ６０１Ｔはφ４０３Ｎと同様にＤＮＡ断片が３つ挿入された配列であり、塩基性のアミノ酸が比較的多いと言える。φ６０７Ｔは正常に１２残基のペプチドとなっていたが、ＢＴへの結合率は中程度であった。φ６０３Ｃは何らかの異常によって、２番目の位置に本来システインであるべきアミノ酸がセリンに変わっているが、短い配列でも比較的高い結合率を示している。φ６０６Ｃは、これもＤＮＡ断片が複数入っている配列であったが、ＢＴへの結合力は高かった。φ６１６Ｃは、本来Ｃ７Ｃとなるべき配列から大きく異なっており、ＢＴへの結合率も小さかった。 The amino acid sequences are shown in FIG. 16 and SEQ ID NOs: 20 to 26. φ411S and φ421S normally presented a 12-residue peptide, but the binding rate to BT was low. Like φ403N, φ601T is a sequence in which three DNA fragments are inserted, and it can be said that there are relatively many basic amino acids. φ607T was normally a 12-residue peptide, but the binding rate to BT was moderate. In φ603C, the amino acid that should originally be cysteine is changed to serine at the second position due to some abnormality, but even a short sequence shows a relatively high binding rate. φ606C was also a sequence containing a plurality of DNA fragments, but its binding power to BT was high. φ616C was significantly different from the sequence that should originally be C7C, and the binding rate to BT was also small.
　φ６０３Ｃは短い配列でもＢＴへの高い結合力が観測されたので、φ６０３Ｃが提示していた配列の合成ペプチドを作製し、パターニングチップを用いてペプチド単体での結合特性を確認した。その結果、図１７に示すように、ペプチドとチップのインキュベート時間が１５分ではほとんど結合が見られず、１０時間のインキュベートでようやく結合が確認できた。ＢＴＢＰ－１は１５分でも十分な結合が確認できていたので、φ６０３Ｃが提示するペプチドはＢＴＢＰ－１に比べると結合力が劣ることが判った。ただし、１０残基という配列の短さの割には結合力が高いと言える。 Since high binding force to BT was observed even with a short sequence of φ603C, a synthetic peptide having the sequence presented by φ603C was prepared, and the binding characteristics of the peptide alone were confirmed using a patterning chip. As a result, as shown in FIG. 17, almost no binding was observed when the incubation time of the peptide and the chip was 15 minutes, and the binding was finally confirmed after 10 hours of incubation. Since BTBP-1 was confirmed to have sufficient binding even after 15 minutes, it was found that the peptide presented by φ603C was inferior in binding force compared to BTBP-1. However, it can be said that the binding force is high for the short sequence of 10 residues.
［参考例２：チタン酸バリウムの粗い粉末を用いたスクリーニング結果］
　前述のように、φ４０３Ｎ(ＢＴＢＰ－１)のスクリーニングの際には、溶液１ｍＬ中に粒径約１μｍのチタン酸バリウム粉末約０．２ｍｇを分散させ用いた。これに対し、粒の粗いチタン酸バリウム粉末(チタン酸バリウムの焼結体を粗く砕いて７５－３００μｍに粒径を揃えたもの)１０ｍｇを１ｍＬ中に分散させたものに対するパニング実験を行った。スクリーニングされたものをＤＮＡ解析すると、配列番号２７～３１に示す５種類のアミノ配列が得られた。それぞれのファージクローンを作製し、結合率を調べた結果、φＢＴ４０１とφＢＴ４０３が高い結合率を示した（図１８）。しかし、チップを用いた蛍光観察実験での結果は、図１８の結果と異なっていた(図１９、ＢａＣｌ２なし)。φＢＴ４０１は若干結合しているように見えるが、ＢａＴｉＯ３の領域と、Ａｕの領域と同じように結合しており、φ４０３Ｎのような材料特異性がみられない。φＢＴ４０３はペプチド非提示のφＭ１３ＫＥとほとんど結合量が変わらなかった。これには、スクリーニング時とチップの実験時で溶液中のバリウムイオンの濃度が異なることが影響していると考えられた。チップの場合、ＢａＴｉＯ３の表面積は粉末１０ｍｇに比べて５桁程度小さく、さらにチップを作製する工程で表面のバリウムはすでに溶出している可能性がある。そのため、粉末とは異なる結果になったと考えられる。そこで、バリウムイオンを添加した状態で、チップへの結合特性を調べた(図１９、１ｍＭ ＢａＣｌ２)。すると、ＢａＴｉＯ３部位への結合が回復することが確認された。興味深いことに、Ｔｉ金属部位への結合も確認され、ＢａＴｉＯ３への結合量よりもむしろ多かった。これは、チタン金属の表面が酸化しており、この酸化チタン表面に対してバリウムイオンが吸着し、そこを認識しているのだと思われる。よって、φＢＴ４０１とφＢＴ４０３の提示する配列は、バリウムなどの金属イオンが吸着したチタン酸化物表面を認識するペプチド配列である可能性があると考えられる。これらは、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｑなどのルイス塩基となるアミノ酸が多いのが特徴で、電荷をもつアミノ酸は比較的少ない。塩基性のアミノ酸は吸着したバリウムイオンと親和性が低く、酸性のアミノ酸は不可逆的な吸着となり得るので(K. Imamura et al., J Biosci Bioeng 1: 7-12 2007)ファージからのセレクションのときに溶出しなかった可能性がある。チタンに吸着するイオンとして、Ｂｉ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇｅ、Ｉｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｓｂ、Ｓｎ、Ｔｅ、Ｔｌ、Ｖ、Ｚｎ（E. Vassileva et al., Analyst 121: 607-612,
1996）、Ｂａ、Ｃａ、Ｓｒ（MA. Malati and
E. Smith, Power Technol 22: 279-282, 1979）が知られている。 [Reference Example 2: Screening result using coarse powder of barium titanate]
As described above, when screening for φ403N (BTBP-1), about 0.2 mg of barium titanate powder having a particle size of about 1 μm was dispersed in 1 mL of the solution. On the other hand, a panning experiment was conducted on 10 mg of coarse barium titanate powder (a coarsely pulverized barium titanate sintered body having a particle size of 75-300 μm) dispersed in 1 mL. DNA analysis of the screened products yielded five amino sequences shown in SEQ ID NOs: 27-31. As a result of preparing each phage clone and examining the binding rate, φBT401 and φBT403 showed a high binding rate (FIG. 18). However, the result of the fluorescence observation experiment using the chip was different from the result of FIG. 18 (FIG. 19, no BaCl 2 ). Although φBT401 seems to be slightly bonded, it is bonded in the same manner as the BaTiO 3 region and the Au region, and no material specificity like φ403N is observed. The binding amount of φBT403 was almost the same as that of φM13KE without peptide. This was thought to be due to the fact that the concentration of barium ions in the solution was different between screening and chip experiments. In the case of a chip, the surface area of BaTiO 3 is about five orders of magnitude smaller than 10 mg of powder, and barium on the surface may have already eluted in the process of manufacturing the chip. Therefore, it is thought that the result was different from the powder. Therefore, the binding characteristics to the chip were examined with barium ions added (FIG. 19, 1 mM BaCl 2 ). Then, it was confirmed that the binding to the BaTiO 3 site was recovered. Interestingly, binding to Ti metal sites was also observed, more than the amount bound to BaTiO 3 . This is because the surface of titanium metal is oxidized, and barium ions are adsorbed on the titanium oxide surface and recognized. Therefore, it is considered that the sequences presented by φBT401 and φBT403 may be peptide sequences that recognize the surface of titanium oxide adsorbed with metal ions such as barium. These are characterized by a large number of amino acids serving as Lewis bases such as S, T, Y, and Q, and relatively few amino acids are charged. Basic amino acids have a low affinity for adsorbed barium ions, and acidic amino acids can be irreversible (K. Imamura et al., J Biosci Bioeng 1: 7-12 2007) May not have eluted. As ions adsorbed on titanium, Bi, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ge, In, Mn, Ni, Pb, Sb, Sn, Te, Tl, V, Zn (E. Vassileva et al., Analyst 121 : 607-612,
1996), Ba, Ca, Sr (MA. Malati and
E. Smith, Power Technol 22: 279-282, 1979) is known.

Claims (26)

  1. 以下の（ａ）又は（ｂ）からなるペプチド。
    （ａ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列；     A peptide comprising the following (a) or (b).
    (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11;
    (B) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19;
  2. セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドであって、以下の（ｃ）又は（ｄ）からなるペプチド。
    （ｃ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；     A peptide having reversible binding / dissociation ability to a ceramic surface, the peptide comprising the following (c) or (d):
    (C) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11;
    (D) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19;
  3. （ｃ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が、配列番号１、１４又は１６に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２記載のペプチド。 (C) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 14 or 16 The peptide according to claim 2.
  4. セラミックス表面への可逆的な結合・解離が、金属イオンにより制御されることを特徴とする請求項２記載のペプチド。 The peptide according to claim 2, wherein reversible binding / dissociation to the ceramic surface is controlled by metal ions.
  5. 金属イオンが、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋から選択される少なくとも１以上の金属イオンであることを特徴とする請求項２記載のペプチド。 The peptide according to claim 2, wherein the metal ion is at least one metal ion selected from Ba 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ and Ca 2+ .
  6. セラミックスが、金属酸化物を主成分とするセラミックスであることを特徴とする請求項２記載のペプチド。 The peptide according to claim 2, wherein the ceramic is a ceramic mainly composed of a metal oxide.
  7. 金属酸化物が、遷移金属酸化物であることを特徴とする請求項６記載のペプチド。 The peptide according to claim 6, wherein the metal oxide is a transition metal oxide.
  8. 遷移金属酸化物が、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項７記載のペプチド。 The peptide according to claim 7, wherein the transition metal oxide is titanium oxide, zirconium oxide, or a mixture thereof.
  9. 検出可能なマーカーで標識された請求項１～８のいずれか記載のペプチド。 The peptide according to any one of claims 1 to 8, which is labeled with a detectable marker.
  10. 請求項１～８のいずれか記載のペプチドと、機能性ペプチド又は機能性タンパク質とを結合させた融合ペプチド。 A fusion peptide comprising the peptide according to any one of claims 1 to 8 and a functional peptide or protein.
  11. 請求項１～８のいずれか記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とする、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するファージ。 A phage having reversible binding / dissociation ability to a ceramic surface, wherein the peptide according to any one of claims 1 to 8 is displayed on the particle surface.
  12. 請求項１～８のいずれか記載のペプチドを認識する抗体。 An antibody that recognizes the peptide according to any one of claims 1 to 8.
  13. 請求項１～８のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡ。 A DNA encoding the peptide according to any one of claims 1 to 8.
  14. 請求項１３記載のＤＮＡを含み、かつセラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドを発現することができる組換えベクター。 A recombinant vector comprising the DNA according to claim 13 and capable of expressing a peptide having reversible binding / dissociating ability to a ceramic surface.
  15. 請求項１４記載の組換えベクターが導入された形質転換体。 A transformant into which the recombinant vector according to claim 14 has been introduced.
  16. セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチド、又は該ペプチドと機能性タンパク質との融合ペプチドを介しての、セラミックス表面と目的とするタンパク質との結合又は解離を、所定の金属イオンの濃度を調整することによって行うことを特徴とするセラミックス表面とタンパク質との結合・解離を制御する方法。 The binding or dissociation between the ceramic surface and the target protein via a peptide having reversible binding / dissociation ability to the ceramic surface or a fusion peptide of the peptide and a functional protein is carried out by a predetermined metal ion. A method for controlling the binding / dissociation between a ceramic surface and a protein, characterized by adjusting the concentration.
  17. セラミックス表面と、セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドと目的とするタンパク質との融合ペプチドとの結合又は解離を、所定の金属イオンの濃度を調整することによって行うことを特徴とするセラミックス表面と融合ペプチドとの結合・解離を制御する方法。 The bonding or dissociation of a ceramic surface and a fusion peptide of a target protein and a peptide having reversible binding / dissociating ability to the ceramic surface is performed by adjusting the concentration of a predetermined metal ion. To control the binding and dissociation between the ceramic surface and the fusion peptide.
  18. セラミックス表面への可逆的な結合・解離能を有するペプチドとして、請求項１～９のいずれか記載のペプチドを用いることを特徴とする請求項１６又は１７記載の方法。 The method according to claim 16 or 17, wherein the peptide according to any one of claims 1 to 9 is used as a peptide having reversible binding / dissociation ability to a ceramic surface.
  19. 融合ペプチドとして、請求項１０記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする請求項１６又は１７記載の方法。 The method according to claim 16 or 17, wherein the fusion peptide according to claim 10 is used as the fusion peptide.
  20. 金属イオンが、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、及びＣａ２＋から選択される少なくとも１以上の金属イオンであることを特徴とする請求項１６～１９記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19, wherein the metal ion is at least one metal ion selected from Ba 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , and Ca 2+ .
  21. セラミックスが、金属酸化物を主成分とするセラミックスであることを特徴とする請求項１６～２０のいずれか記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 20, wherein the ceramic is a ceramic mainly composed of a metal oxide.
  22. 金属酸化物が、遷移金属酸化物であることを特徴とする請求項２１記載の方法。 The method of claim 21, wherein the metal oxide is a transition metal oxide.
  23. 遷移金属酸化物が、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項２２記載の方法。 The method of claim 22, wherein the transition metal oxide is titanium oxide, zirconium oxide, or a mixture thereof.
  24. 請求項１６～２３のいずれか記載の方法により、セラミックス表面に所定のタンパク質又は所定の細胞を脱着する方法。 A method for desorbing a predetermined protein or a predetermined cell on a ceramic surface by the method according to any one of claims 16 to 23.
  25. 請求項１～９のいずれか記載のペプチド、又は請求項１０記載の融合ペプチドで表面修飾されたセラミックス。 A ceramic surface-modified with the peptide according to any one of claims 1 to 9, or the fusion peptide according to claim 10.
  26. 請求項１～９のいずれか記載のペプチド、又は請求項１０記載の融合ペプチドを介して、表面に所定のタンパク質又は所定の細胞が結合したセラミックス。 A ceramic in which a predetermined protein or a predetermined cell is bound to a surface via the peptide according to any one of claims 1 to 9 or the fusion peptide according to claim 10.
PCT/JP2009/002624 2008-07-17 2009-06-10 Peptide capable of binding to ceramic material WO2010007723A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-185845 2008-07-17
JP2008185845A JP2011217608A (en) 2008-07-17 2008-07-17 Peptide binding to ceramic material

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010007723A1 true WO2010007723A1 (en) 2010-01-21

Family

ID=41550135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/002624 WO2010007723A1 (en) 2008-07-17 2009-06-10 Peptide capable of binding to ceramic material

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2011217608A (en)
WO (1) WO2010007723A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5863045B2 (en) * 2010-03-11 2016-02-16 国立研究開発法人理化学研究所 Method for selecting polypeptide sequence, metal oxide or silicon-containing compound binding peptide and use thereof
WO2020240176A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Loughborough University Dispersion

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013157410A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-24 Hoya株式会社 Fzd10-binding peptide

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10338700A (en) * 1997-06-09 1998-12-22 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd New peptide compound
WO2005010031A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Japan Science And Technology Agency Peptides capable of binding to titanium, silver and silicone

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10338700A (en) * 1997-06-09 1998-12-22 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd New peptide compound
WO2005010031A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Japan Science And Technology Agency Peptides capable of binding to titanium, silver and silicone

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, H. ET AL.: "Probing the interaction between peptides and metal oxides using point mutants of a Ti02-binding peptide.", LANGMUIR, vol. 24, no. 13, June 2008 (2008-06-01), pages 6852 - 6857 *
IMAMURA, K. ET AL.: "Adsorption characteristics of oligopeptides composed of acidic and basic amino acids on titanium surface.", J. BIOSCI. BIOENG., vol. 103, no. 1, January 2007 (2007-01-01), pages 7 - 12 *
NORDSTROM, T. ET AL.: "Generation of a new protein purification matrix by loading ceramic hydroxyapatite with metal ions - demonstration with poly-histidine tagged green fluorescent protein.", J. BIOTECHNOL., vol. 69, no. 2-3, 15 April 1999 (1999-04-15), pages 125 - 133 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5863045B2 (en) * 2010-03-11 2016-02-16 国立研究開発法人理化学研究所 Method for selecting polypeptide sequence, metal oxide or silicon-containing compound binding peptide and use thereof
WO2020240176A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Loughborough University Dispersion

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011217608A (en) 2011-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6475630B2 (en) Streptavidin muteins and methods of using them
Gebauer et al. Anticalins: small engineered binding proteins based on the lipocalin scaffold
US20220372076A1 (en) Peptide library and use thereof
KR100923828B1 (en) Gold-binding protein
US8293522B2 (en) Device for binding a target entity to a bait entity and detection methods using the same
JP4885542B2 (en) Peptides capable of binding to titanium, silver and silicon
JP6246128B2 (en) Peptides that bind to EpCAM
CA2628388C (en) Detection of antigens in living cells using the variable region of a camelidae heavy chain antibody
JP4095622B2 (en) Gold-binding complex protein
JP2005312446A5 (en)
WO2010007723A1 (en) Peptide capable of binding to ceramic material
WO2010007724A1 (en) Peptide capable of binding to epcam
US8158588B2 (en) Loop-variant PDZ domains as biotherapeutics, diagnostics and research reagents
CA2554410A1 (en) Biotherapeutics, diagnostics and research reagents
KR101257491B1 (en) Antibody-binding peptides, their preparation method and use
JP4095652B2 (en) Gold binding protein
EP2604624A1 (en) Bowman-Birk protease Inhibitor (BBI) binding peptides, and uses thereof in the separation, detection or purification of BBI.
JP4095653B2 (en) Target substance capture structure
JP2004020547A (en) Target sensor, and target bonding substance and target bonding material with affinity to target substance

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09797652

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09797652

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1